JP5221248B2 - 高発現遺伝子由来のcDNAクローンの含有率を低減させたcDNAライブラリーの作製方法 - Google Patents
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Description
(i)5’端にキャップ構造を有するmRNAを含むRNA混合物に、二本鎖DNAプライマーをアニールし、さらに前記標的遺伝子のmRNAに結合して逆転写酵素の反応を阻害する少なくとも1つのプローブをアニールする工程、
(ii)二本鎖DNAプライマーから逆転写酵素により第一鎖cDNAを合成してmRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖DNAプライマーの連結体を調製する工程、及び
(iii)mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖DNAプライマーの連結体のcDNAを含むDNA鎖の3’端と5’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。標的遺伝子としては、高発現遺伝子を用いることができ、標的遺伝子は遺伝子データベースに基づいて選択することができる。
(1) 基本構造
当該プローブの基本構造は、標的遺伝子のmRNA配列の部分配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、その3’末端は逆転写酵素による伸長反応の開始点とならないように、修飾される。例えば、水酸基を欠くジデオキシリボ核酸(ddNTP)や3’末端の塩基の水酸基をビオチンなどの化合物と結合させた構造を有する。
プローブが相補的に結合する標的遺伝子のmRNAの塩基配列は、対象とする遺伝子の配列の実データや公開データベースによる塩基配列情報を基に設計する。その際、一つの遺伝子座から、プロモーターの違い、スプライシングの違い、ポリ(A)付加部位の違いなどにより、複数の転写産物バリアントが生成することが知られているので、プローブの結合部位を各バリアントに共通の領域に設定するのが好ましい。
相補鎖塩基配列の塩基長は、標的遺伝子のmRNAに安定に結合できる長さとし特に限定するものでないが、20〜50塩基、好ましくは20〜40塩基、さらに好ましくは20〜35塩基である。
非天然型核酸とは、天然の核酸が有しない構造を有する核酸をいい、天然に存在しない構造の塩基を有する。本発明においては、プローブに1つ又は複数の天然の核酸に存在しない塩基を導入する場合、非天然型核酸を導入するという。本発明のプローブは、非天然型核酸を含有するオリゴヌクレオチドである。
工程(i)においては、標的遺伝子のmRNA(A)、非標的遺伝子mRNA(B)を含有するサンプルRNAに対して標的遺伝子のmRNA(A)に結合するプローブ(C)及びオリゴdTを有する二本鎖DNAプライマー(D)をアニールさせる。これにより、当該プローブ(C)と二本鎖DNAプライマー(D)とが結合した標的遺伝子のmRNA(E)及び二本鎖DNAプライマー(D)の結合した非標的遺伝子のmRNA(F)が生成される。当該サンプルRNA量は、1μg未満でもcDNAの合成は可能であるが、好ましくは1μg以上を使用すると良い。標的遺伝子は単一又は2種以上で使用できるので、上記特徴を有するプローブ(C)を標的遺伝子の数に応じて必要数作製する。当該プローブ(C)の使用量は、mRNA(A)、(B)の50〜100倍量(モル比)とするのが好ましいが、特に限定するものではない。また、上記二本鎖DNAプライマー(D)におけるプライマー配列を構成する連続するdTの数は、30〜70個が好ましい。二本鎖DNAプライマー(D)は、特に限定するものでないが、複製オリジン、又は複製オリジンとcDNA発現用プロモーターを含むものでも良い。二本鎖DNAプライマーには当該cDNAの使用目的に応じて予め制限酵素サイトを導入しても良い。アニールの温度は、プローブ(C)のTm値を基準に決めればよく、プローブ(C)のTm値より低くする。
プローブ結合によるcDNA伸長反応の抑制
(1)標的遺伝子の決定
実験効果の確認が容易である発現量の多い遺伝子を標的遺伝子とするために、以下の実験を行った。マウスのオスとメスの肝臓から取得した全RNA各10μg、pGCAP10ベクタープライマー(国際公開第W02004/087916号パンフレット)300ngを用いてcDNA合成を行い、cDNAクローンを取得した。作製方法は国際公開第W02004/087916号パンフレットの記載に従った。取得したcDNAクローンの5’端塩基配列解析を行った。配列決定ができたオス肝臓由来の3,217クローン、メス肝臓由来の2,325クローンについて、GenBankの核酸データベースを用いてBLAST検索を行った。その結果、取得したオス肝臓由来のcDNAクローンで最も重複が見られた遺伝子はMajor Urinary Protein 2(MUP2)遺伝子213クローン(6.6%)、メス肝臓由来のcDNAクローンではAlbumin1(Alb1)遺伝子174クローン(7.5%)であった(図2)。これらの結果から、標的遺伝子をAlb1遺伝子とMUP 2遺伝子に決定した。
pGCAP10ベクターのcDNAクローニング部位の上流にはT7RNAポリメラーゼプロモーターが、また下流にはNotI部位が存在する。そこで、取得したAlb1遺伝子、MUP2遺伝子のcDNAクローンをNot I消化により直鎖状にした後、これを鋳型にしてT7RNAポリメラーゼを用いるインビトロ転写キット(Ambion社製)を用いてmRNAを調製した。
cDNA合成反応である逆転写反応を途中で止めるためのプローブを設計した。
プローブの配列としては標的遺伝子mRNAの翻訳領域の配列を採用した。また、非天然型核酸として、プローブの配列中に架橋化核酸(Bridged Nucleic Acid、BNA)を配置した。ただ、逆転写反応やその他の伸長反応を止める用途として、BNAやPNAなどの特殊核酸を使用した実施例や詳細情報が無いため、BNAの個数を1〜5個の範囲で変えて検討した。また、プローブが伸長反応のためのプライマーとして機能しないように3’末端はビオチンで修飾した。設計したプローブの配列は図3の通りである。図3中の配列において、小文字が架橋化核酸を示す。Alb1-0、Mup-0で表わされる配列は、天然型の核酸である。配列表の配列番号1、2及び3は、Alb1-0、Mup2-0及びMup2-1の配列を表わしている。また、プローブの合成は株式会社ジーンデザインに依頼した。
前記(3)で作製したプローブを用いて逆転写反応の反応抑制効果を調べた。Alb1 mRNAを鋳型にする場合にはAlb1の名称をもつプローブを、MUP2 mRNAを鋳型にする場合にはMUP2の名称をもつプローブを添加して、それぞれ別々にcDNA合成を行った。反応溶液はmRNA 500ng, poly dT20 primer 100pmol, dNTP 10nmol, 前記(3)プローブ100pmolを混合し合計13μlの溶液を調製した。コントロールとして、前記(3)プローブを含まない反応溶液を調製した。この反応溶液を65℃5分保温、氷上で2分急冷し、SuperScript II RNase H- 逆転写酵素(インビトロジェン社製)200U、付属している反応バッファー4μl、DTT 100nmol、リボヌクレアーゼインヒビター40Uを添加し、反応液量を20μlにした。そして、42℃1時間反応し第一鎖cDNAを合成した。反応液をフェノール抽出し、エタノール沈殿によりmRNA/cDNAヘテロデュプレックスを回収し、RNase Aを含む水10μlに溶解しmRNAを分解し、アガロースゲル電気泳動によって各反応液におけるcDNAの鎖長を確認した。その結果、コントロールと比較し、Alb1-1プローブ、Alb1-2プローブ、Mup 2-1では逆転写反応の停止は見られなかった。しかし、Alb1-5プローブではおよそ88%、Alb1-4プローブでおよそ66%、Alb1-3プローブでおよそ25%、Mup2-3プローブ、Mup2-2プローブでおよそ50%のcDNA合成量の減少がみられた。この実験結果から、逆転写反応を抑制するために必要なプローブ内に含まれるBNAの配置と数量の条件は、GCが豊富な配列の場合、連続して3塩基以上が効果的であることが示唆された。また、BNAにATが多いMUP2プローブはAlb1プローブと比較して効果が小さいことから、どちらの配列でも同様な効果が得られる条件検討が必要であると考えられた。
Alb1-5のプローブを使用し、Alb1 mRNAのcDNA合成を抑制する条件検討を行った。プローブの使用量、アニール温度、アニール時間に関して検討を行った。反応は前述した反応系で、プローブの使用量のみを変化させた。また、アニール温度は付属している反応バッファー4μl、DTT 100nmol、リボヌクレアーゼインヒビター40Uを添加し、反応液量を19μlにし、42℃、57℃で30分から2時間保温し、急冷後、SuperScript II RNase H- 逆転写酵素(インビトロジェン社製)200Uを加え、42℃1時間反応しcDNAを合成した。検出方法は前述の(4)と同様に行った。その結果、プローブ使用量は、200pmol、アニール温度57℃、アニール時間2時間が、もっとも効果が高く、95%以上の反応抑制効果があることがわかった。しかし、RNAの安定性と未結合プローブの量などを考慮し、90%以上の反応抑制効果が得られる条件として、(i)プローブ使用量50〜100pmol、(ii)アニール温度57℃、(iii)アニール時間30分の3つの条件が最適であると判断した。
高発現遺伝子の含有率を低減したcDNAライブラリーの作製
(1)第一鎖cDNA合成
前記プローブを用いて、全RNAからcDNA合成を行った。使用したプローブはAlb1-5, Mup2-3である。マウスのオスの肝臓から取得した全RNA各10μg、pGCAP10ベクタープライマー(特開平4-108385号公報)150ng、dNTP 25nmol、100pmolプローブを混合し、合計8μlの混合液を作製した。この混合溶液を65℃5分加熱後、2分氷冷した。SuperScript II RNase H- 逆転写酵素(インビトロジェン社製)の添付緩衝液を4μl加え、57℃30分間保温した。その後、2分氷冷しDTT 100nmol、リボヌクレアーゼインヒビター40U、SuperScript II RNase H- 逆転写酵素(インビトロジェン社製)200Uを混合し、全量20μlに調整した。この混合溶液を42℃1時間反応し、第一鎖cDNAを合成した。反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿により、mRNA/cDNAヘテロデュプレックスとベクタープライマーの連結体を回収し水80μlに溶解した。
mRNA/cDNAヘテロデュプレックスとベクタープライマーの連結体溶液80μlに10×H buffer(タカラ酒造)と制限酵素EcoRI(タカラ酒造)50Uを加え、合計100μlとし、37℃1時間反応した。この溶液をフェノール抽出後、エタノール沈殿により、制限酵素処理したmRNA/cDNAヘテロデュプレックスとベクタープライマーの連結体を回収し、水24μlに溶解した。この溶液を反応液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 5mM MgCl2, 10mM 2-メルカプトエタノール, 0.5mM ATP, 2mM DTT)に混合し、120UのT4 RNAリガーゼ(タカラ酒造)を添加し、20℃16時間反応させ、mRNA/cDNAヘテロデュプレックスとベクタープライマーのEcoR I末端とをライゲーションさせて環状化した(セルフライゲーション反応)。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈殿によりセルフライゲーション産物を回収し、水50μlに溶解し、cDNAベクター溶液とした。
作製したcDNAベクター溶液1μlをDH10Bエレクトロ細胞(インビトロジェン社製)20μlと混合し、エレクトロポレーション法による形質転換を行った。エレクトロポレーションはMicroPulser(バイオラッド社製)を用いて行った。得られた形質転換体をSOC培地に懸濁したのち、50μg/mlアンピシリン含有LB寒天培地上にまいて、35℃16〜18時間培養し、cDNAクローンの形質転換大腸菌を得た。
次の4種のライブラリーを作製した。
C: プローブの添加がないライブラリー(C)
Alb: プローブAlb1-5を添加したライブラリー(Alb)
MUP: プローブMup2-3を添加したライブラリー(MUP)
W: プローブAlb1-5とMup2-3を添加したライブラリー(W)
作製したcDNAライブラリーに含まれるAlb1遺伝子(GenBankアクセッション番号 NP_033784)とMUP 2遺伝子(GenBankアクセッション番号 NP_032673)の含有率を求めるために、各ライブラリーからおよそ4000クローンを拾って、コロニーハイブリダイゼーションを実施した。
Mup2遺伝子塩基配列の構造遺伝子領域は他のMup遺伝子(Mup1, Mup3)と8割以上の相同性がある。このため、ハイブリダイゼーションによる検出はMup 2遺伝子だけではなく、Mupグループ全体を検出する。そこで、より正確な含有率を求めるために、CとWに関して、約1000クローンの塩基配列を解析し、クローン数、含有率、減少率を求めた(図5)。その結果、Alb1、Mup2の低減率は87%となった。
Claims (12)
- 標的遺伝子由来のcDNAクローンの含有率を低減したcDNAライブラリーを作製する方法であって、
(i)5’端にキャップ構造を有するmRNAを含むRNA混合物に、二本鎖DNAプライマーをアニールし、さらに前記標的遺伝子のmRNAに結合して逆転写酵素の反応を阻害する少なくとも1つのプローブであって、5’端側から連続する2塩基以上が非天然型核酸で構成されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプローブをアニールする工程、
(ii)二本鎖DNAプライマーから逆転写酵素により第一鎖cDNAを合成してmRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖DNAプライマーの連結体を調製する工程、及び
(iii)mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖DNAプライマーの連結体のcDNAを含むDNA鎖の3’端と5’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 標的遺伝子が高発現遺伝子である、請求項1記載の方法。
- 標的遺伝子を遺伝子データベースに基づいて選択する工程を含む、請求項1記載の方法。
- キャップ構造を有するmRNAが細胞抽出物中に含まれている請求項1記載の方法。
- 二本鎖DNAプライマーのプライマー配列が、キャップ構造を有するmRNAのポリ(A)配列に相補的な配列を含む請求項1記載の方法。
- リガーゼがT4RNAリガーゼである請求項1記載の方法。
- 工程(ii)と工程(iii)の間に、以下の工程:
(ii’)mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖DNAプライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖DNAプライマーの端部に5’突出末端又は平滑末端を生成する工程、
を含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 工程(iii)の後に、さらに以下の工程:
(iv)mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖DNAプライマーの連結体のRNA鎖をDNA鎖に置換する工程、
を含む請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 二本鎖DNAプライマーが複製オリジン、又は複製オリジンとcDNA発現用プロモーターを含んでいる請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 標的遺伝子のmRNAに結合して逆転写酵素の反応を阻害するプローブが、非天然型核酸を含有し、標的遺伝子の部分配列の相補配列の融解温度(Tm値)より2℃以上高いオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 非天然型核酸がロックド核酸(Locked Nucleic Acid)、ポリアミド核酸(Polyamide Nucleic Acid)又は架橋化核酸(Bridged Nucleic Acid)であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 標的遺伝子のmRNAに結合して逆転写酵素の反応を阻害するプローブが、それぞれ別の種類の標的遺伝子のmRNAを対象とすることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
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