CN115997018A

CN115997018A - 自身环化rna构建体

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Publication number: CN115997018A
Application number: CN202280003225.5A
Authority: CN
Inventors: 李城旭; 李京炫; 韩升烈; 金智贤; 金圣�
Original assignee: Erzhimiansi Co ltd
Current assignee: Erzhimiansi Co ltd
Priority date: 2021-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2023-04-21
Also published as: US11939580B2; IL304263A; JP2023521290A; WO2022191642A1; AU2022234607A1; CA3178127A1; EP4116421A1; KR102442946B1; US20230212574A1

Abstract

本发明的自身环化RNA构建体可在DNA载体中表达，并同时通过自我靶向和剪接(self‑targeting&splicing)反应被环化(circularization)以形成环状RNA，所述环状RNA可以仅由目的基因组成，所述目的基因包括IRES区域、起始密码子及终止密码子，由此可以快速表达肽或蛋白质。

Description

自身环化RNA构建体

【技术领域】

本发明涉及一种自身环化RNA构建体等。

【背景技术】

环状RNA(circRNA)是一种共价连接的单链转录本(transcript)，通过RNA-seq数据和新开发的生物信息学方法，已在各种活生物体中鉴定出数以万计的环状RNA类型。在真核生物中，已知环状RNA是通过从mRNA反向剪接(back-splicing)产生的，并且可以通过在体内执行microRNA海绵(sponge)功能来调节基因表达。环状RNA是否诱导免疫原性尚不清楚，然而由于其结构特征，其在体内非常稳定地存在。

同时，最近使用信使(messenger)RNA(mRNA)的治疗剂的开发非常活跃。然而，mRNA的局限性在于其在体内容易被降解并具有相对较短的半衰期。为了克服这一限制，将poly(A)tail连接到mRNA以提高稳定性等研究正在进行中。同样地，US10953033公开了一种基于环状RNA结构特征的用于体内基因表达目的的环状RNA。

【发明内容】

【要解决的技术问题】

本发明要解决的技术问题是提供一种通过进行自我靶向及剪接反应来实现环化的RNA构建体。

然而，本发明中要解决的技术问题并不限于上述问题，本领域技术人员可以从下面的描述中清楚地理解本文未提及的其他技术问题。

【解决问题的技术方法】

为了解决上述问题，本发明提供一种自身环化RNA构建体，其包括以下结构：

5'-内部引导序列(IGS，internal guide sequence)-核酶(Ribozyme)-目的基因(gene of interest)-靶位点(target site)-3'。

作为本发明的一实施例，所述IGS区域形成靶位点和鸟嘌呤(Guanine，G)：尿嘧啶(Uricail，U)摆动碱基对(wobble base pair)，形成所述摆动碱基对的鸟嘌呤可以位于IGS区域的5'端，并且形成所述摆动碱基对的尿嘧啶可以位于靶位点区域的3'端。

作为本发明的另一实施例，所述IGS区域可以包括5'-GNNNNN-3'的核苷酸序列或由5'-GNNNNN-3'的核苷酸序列组成，所述靶位点区域可以包括5'-N'N'N'N'U-3'的核苷酸序列或由5'-N'N'N'N'U-3'的核苷酸序列组成。所述IGS区域的N和靶位点区域的N'可以各自独立地为A、G、C或U，但优选地，一个或多个核苷酸可以使IGS区域与靶位点区域互补地结合。

作为本发明的又另一实施例，所述IGS区域的核苷酸序列与除所述鸟嘌呤之外的靶位点区域的核苷酸序列可以反向互补。

作为本发明的另一实施例，所述核酶可以为I型内含子核酶(Group I intronribozyme)，并且所述核酶可以包括序列号6的核苷酸序列或由序列号6的核苷酸序列组成。

作为本发明的又另一实施例，所述构建体可以包括在IGS区域的5'方向上延伸的核苷酸，以形成P1螺旋(helix)及P10螺旋。此时，P1螺旋可以与在靶位点的3'方向上延伸的核苷酸一起被形成在IGS区域和靶位点互补结合的区域；P10螺旋则可以被形成在：在IGS区域的5'方向上延伸的核苷酸与位于核酶和GOI区域之间的所述延伸核苷酸的反向互补序列互补结合的区域。形成所述P1螺旋的延伸核苷酸的长度可以为3-nt，而形成P10螺旋的延伸核苷酸的长度可以为6-nt。

作为本发明的又另一实施例，所述构建体可以形成P1螺旋但不形成P10螺旋。

作为本发明的又另一实施例，所述构建体可以包括与5'端及3'端互补结合的反义序列(AS，antisense sequence)区域和反义结合序列(ABS，antisense binding sequence)区域。

作为本发明的又另一实施例，所述ABS区域可以由与AS区域反向互补(reversecomplementary)的序列组成。

作为本发明的又另一实施例，所述AS序列区域的长度可以根据GOI而变化，但可为10至500-nt，优选地，可以大于50-nt且小于400-nt，更优选地，可以150至350nt。

作为本发明的又另一实施例，所述GOI区域可以包括位于5'端的内部核糖体进入位点(IRES，internal ribosome entry site)区域，并且可以包括起始密码子和终止密码子。

作为本发明的又另一实施例，所述构建体还可以包括由随机核苷酸序列组成的间隔区域(Spacer)，所述间隔区域可以位于IGS区域与目标基因区域之间和/或目标基因区域与靶位点区域之间。

作为本发明的又另一实施例，所述间隔区域可以包括聚(poly)(A)或由聚(A)组成，并且聚(A)是腺嘌呤(A)在其中重复连接的多核苷酸，其中所述A可以重复连接10至50次，优选地，可以通过重复30次连接。

【发明的效果】

本发明的自身环化RNA构建体可在DNA载体中表达，并同时通过自我靶向和剪接(self-targeting&splicing)反应而不需单独的GTP处理被环化(circularization)，以形成环状RNA，其中所述环状RNA可以仅由目的基因组成，并且所述目的基因包括IRES区域、起始密码子及终止密码子，由此可以快速表达肽或蛋白质。另外，由于环状RNA具有圆形结构，其5'端及3'端没有被暴露，因此其具有稳定及高半衰期。通过将功能性RNA(如miRNA、抗-miRNA、shRNA、适体、mRNA疫苗、mRNA治疗剂、抗体、疫苗佐剂及CAR-T mRNA等)制备成环状RNA，由此可在细胞中具有高稳定性。

【附图说明】

图1a及图1b为本发明的自身环化RNA构建体(仅包括IGS、核酶、目的基因及靶位点区域)通过自我靶向和剪接(STS，self-targeting and splicing)反应形成环状RNA的过程的示意图。

图2a为本发明的自身环化RNA构建体(包括AS、IGS、核酶、目的基因、靶位点及ABS区域)通过STS反应形成环状RNA的过程的示意图。

图2b为本发明的自身环化RNA构建体及其通过STS反应形成环状RNA的过程的示意图，其中所述构建体包括在目的基因区域中包括IRES和终止密码子，以实现转基因(transgene)翻译，并进一步包括在5'方向延伸以形成P1螺旋和P10螺旋的核苷酸。

图2c为本发明的自身环化RNA构建体的一实施例。

图2d为用于制备本发明自身环化RNA构建体表达载体的DNA模板(template)碱基序列。

图3示出聚丙烯酰胺凝胶上的电泳结果，以确认在本发明的自身环化RNA构建体表达载体体外转录后立即生成环状RNA，无需额外的GTP处理。使用了转录后立即(直接STS)获得的样品和第一及第二STS反应步骤后获得的样品(通过处理额外的GTP诱导一级和二级环化反应)，并且每个样品的一部分是通过处理RNA酶R去除线性RNA，从而将样品中的环状RNA浓缩并电泳。

图4确认从图3的结果中估计为环状RNA的候选(Candidate)1是环状RNA，其中图4a示出从所述候选1条带中提取RNA并执行RT-PCR的结果；图4b示出从所述候选1条带提取的RNA测序的结果。

图5确认图4结果中候选1条带的RNA是单体(monomer)，其示出从图3的结果中估计为环状RNA的候选1和候选2条带中提取RNA，处理Mg²⁺并诱导缺口(nick)后进行电泳的结果。

图6为确认本发明的自身环化RNA构建体表达载体在细胞中产生环状RNA并表达包括在环状RNA中的转基因的结果。具体地，图6a示出所述自身环化RNA构建体表达载体的结构；图6b示出通过荧光素酶活性测定(luciferase activity assay)确认转基因表达的结果；图6c及图6d示出确认所述转基因是从环状RNA表达的RP-PCR及核苷酸序列分析的结果。

图7及图8为通过HPLC的环状RNA纯化条件及纯化结果。

具体地，图7a为使用超高效液相色谱系统的高效液相色谱分析条件；图7b为体外转录后立即获得的样品的柱纯化结果；图7c为在所述样品处理RNA酶R后的柱纯化结果。此外，图8a为确认通过柱纯化获得的馏分(fraction)中的峰(peak)的结果；图8b为峰在图8a中突出馏分7、10、11、12及13的电泳结果。

图9及图10为确认AS区域对本发明自身环化RNA构建体中STS反应及环化造成的影响，其中图9为包括不同长度的AS区域的自身环化RNA的结构；图10为表达所述RNA的载体体外转录后获得的样品的电泳结果。

图11及图12为确认间隔区域对本发明自身环化和RNA构建体中STS反应和环化造成的影响，其中图11示出包括对照间隔区域(control spacer)和不同长度的聚(A)间隔区域的自身环化RNA的结构；图12示出表达所述RNA的载体体外转录后获得的样品的电泳结果。

图13示出区域附近的核苷酸序列及每个区域，其中所述区域由仅包括P1区域的自身环化RNA；仅包括P1及P10区域的自身环化RNA；以及包括P1区域、P10区域及AS区域的自身环化RNA的核酶被切割(cleavage)。

图14为DNA模板的碱基序列，其用于构建仅包括P1区域而不包括P10及AS区域的自身环化RNA表达载体。

图15为图13的每个自身环化RNA表达载体体外转录后获得的样品的电泳结果。

图16a及图16b为通过电泳确认的结果，即自身环化RNA构建体是在仅包括P1区域而不包括P10及AS区域的自身环化RNA表达载体中体外转录后由环状RNA所形成。

图17至图19为确认P1区域的核苷酸序列对本发明的自身环化和RNA构建体中STS反应和环化造成的影响。具体地，图17示出不同核苷酸序列的P1区域的设计；图18示出在具有所述图17的P1区域的自身环化RNA表达载体的体外转录后获得的样品的电泳结果；图19示出确认环状RNA的RT-PCR电泳结果，即在具有富金(AU-rich)P1区域的自身环化RNA表达载体和具有2位点(2-site)P1区域的自身环化RNA表达载体的体外转录后获得的样品的电泳结果。

图20为仅简单地示出自身环化RNA构建体的基本配置的附图，其中图20a示出可以通过仅包括IGS、核酶和GOI区域以及3'端的尿嘧啶碱基的RNA构建体就可产生环状RNA；图20b示出若GOI的3'端包括尿嘧啶碱基，则表明仅通过IGS、核酶及GOI区域的RNA构建体就才可产生环状RNA，并此时生成的环状RNA仅由GOI组成的示意图。换言之，图20b示出，当尿嘧啶被包括在GOI任何位点的5个独特核苷酸序列之后时，可将该部分用作3'端将GOI的3'端的其余部分直接发送到核酶后面，从而仅通过不含额外尿嘧啶的GOI就可组成环状RNA的示意图。

【实施发明的最佳方式】

本发明者使用反式剪接核酶(T/S核酶，trans-splicing ribozyme)产生环状RNA，并设计了一种系统，其携带目的基因的RNA执行自我靶向和剪接反应以环化(以下称为“通过自我靶向和剪接反应的环化系统(Circularization system byself-targeting&splicing reaction)”)(图1a及图1b)。

I型内含子核酶(Group I intron ribozyme)可以通过两个连续的酯基转移(trans-esterification)反应来切割靶RNA，然后在切割的3'端连接单独的转录物，由此诱导反式剪接。

因此，在本发明的系统中，在目的基因(GOI)的5'方向上配置内部引导序列(IGS，internal guide sequence)，在3'方向上配置靶位点(target site)，由此使所述IGS与靶位点互补结合，并通过形成鸟嘌呤(G，guanine)：尿嘧啶(U，uracil)摆动碱基对，从而可通过位于GOI与IGS之间的核酶诱导切割及剪接，以制备环状RNA(图2a和2b)。

另外，本发明者专注于用于提高I型内含子核酶的反式剪接效率的先前的研究(Mol Ther.2005年11月；12(5)：824-34)，如图2c所示，设计一种自身环化RNA构建体，使得其在自身环化RNA构建体的5'端和3'端具有可相互互补的反义序列(AS，antisensesequence)区域反义结合序列(ABS，antisense binding sequence)，并在核酶二级结构之前/之后形成P1及P10螺旋，并制备了能够在T7启动子下表达所述RNA构建体的DNA模板(实施例1)。

然后，制备插入所述DNA模板的载体并在体外转录(IVT，in vitrotranscription)，然后确认环状RNA的形成。结果发现，所述载体表达自身环化RNA构建体，并且所述RNA构建体在转录后立即通过自我靶向及剪接(STS)反应形成单体的环状RNA，而无需添加GTP(实施例2)。

此外，本发明者试图确认所述自身环化RNA构建体表达载体是否能够在细胞中表达本发明的RNA构建体，以及所表达的RNA是否能够表达以环状RNA的形式加载的当前基因。具体地，通过在目标基因中包括IRES及终止密码子以使基因(转基因)能够在细胞中翻译，并将高斯荧光素酶作为目标基因中的转基因来制备质粒载体，并且将所述质粒载体转化到细胞中，从而确认环状RNA的产生和荧光素酶的活性。结果，可在分子水平上证实，所制备的质粒载体在细胞中表达自身环化RNA构建体，所述构建体通过核酶环化成环状RNA，并且目标基因在所述环状RNA中表达(实施例3)。

接下来，本发明者试图优化RNA构建体，以通过直接STS(direct STS)反应有效地在IVT上形成环状RNA。

首先，通过具体实验确认了根据IVT上AS区域长度的直接STS的响应率。具体地，制备自身环化RNA表达载体，使得所述AS区域和ABS区域的长度为50、100、150、200、250或300-nt，并且在所述载体经受IVT后确认直接STS效率。结果表明，当长度大于等于200-nt时，自身环化效率显著降低。另外，尽管在50、100及150-nt长度下的自身环化效率相似，但已证实当包括50或100-nt长度的AS区域和ABS区域时，体外转录反应本身减少，由此确认就制造环状RNA效率而言，AS区域和ABS区域的长度优选为150-nt(实施例5)。

另外，与根据AS区域和ABS区域的长度确认环状RNA生产效率类似，根据IVT上间隔区的长度和核苷酸序列确认环状RNA生产效率的结果表明，虽然其长度和核苷酸序列对环状RNA生产效率并未有显着影响，但在核酶和EMCV IRES的情况下，30个腺嘌呤(A)的连接足以不产生由于核酶与IRES之间的狭窄间隙而可能发生的结构冲突。(实施例6)

在本发明中，核酶用作能够连续酯基转移(trans-esterification)反应的I型内含子核酶。I型内含子核酶通过在靶位点切割后相互连接在切割的3'端单独存在的转录物来诱导反式剪接，而由于在自身环化RNA构建体中将GOI的5'区域与切割的3'端相连而不是单独的转录本，由此想确认被视为可提高反式剪接效率的P1及P10螺旋区域以及自身环化RNA构建体两端的AS区域和ABS区域是否对环化效率带来积极影响。

具体地，本发明者制备了仅包括P1螺旋区域、或仅包括P1及P10螺旋区域、或同时包括P1及P10螺旋和AS区域的自身环化RNA表达载体，并且经所述IVT载体后，确认了直接STS效率。结果令人惊讶的是，发现自身环化RNA构建体中的P10螺旋区域在P1螺旋及P10螺旋区域存在的情况下降低了环状RNA的生产效率。另外，即使仅包括P1螺旋区域而不包括AS区域，也表现出优异的环状RNA生产效率(实施例7)。

此外，本发明者设计了一种自身环化RNA构建体，使得只有IGS形成P1螺旋，从而只有目标基因可以留在最终产物环状RNA中，并确认了STS反应是否在各种IGS序列中发生。结果令人惊讶的是，确认了即使只有IGS区域形成P1螺旋，DNA中表达的自身环化RNA构建体的STS反应也被诱导，并且即使IGS区域和靶位点区域彼此不互补，也可形成环状RNA。然而，当IGS区域和靶位点区域彼此不互补时，可能会在不期望的位点发生非特异性反应，从而产生不想要的产物。5'-GNNNNN-3'的IGS区域和5'-N'N'N'N'U-3'的靶位点区域表明，随着能够互补结合的核苷酸序列的比率增加，环状RNA的生成效率增加，并发现特定序列表现出更高的环状RNA生产效率(实施例8)。

综上所述，本发明者仅使用图1a所示的RNA构建体即可通过STS反应获得环状RNA，并且如图20b的示意图所示，确认了如图20a所示的自身环化RNA构建体可以形成仅由包括在环状RNA前体中的GOI 3'端的U碱基的目的基因组成的环状RNA。

另外，P1螺旋是指当I型内含子核酶的二级结构形成时，连接到核酶前端(5'方向)方向的核苷酸序列和由核酶诱导剪接的转录本的3'方向的核苷酸序列通过互补结合而形成的螺旋结构；P10螺旋是指所述核酶前端区域和核酶切割的转录物的5'方向的核苷酸序列通过互补结合而形成的螺旋结构。

在本发明中，P1螺旋可以通过本发明自身环化RNA构建体中5'端IGS和3'端靶位点之间的互补结合而形成，P10螺旋则指在5'端延伸的核苷酸序列和连接到核酶后端(3'方向)的核苷酸序列通过互补结合而形成的螺旋结构。

在本说明书中，将形成P1螺旋的核苷酸序列称为P1区或P1螺旋区域，同样地，将形成P10螺旋的核苷酸序列称为P10区或P10螺旋区域。

在本发明中，IGS区域的核苷酸序列为5'-GNNNNN-3'，靶位点区域的核苷酸序列为5'-N'N'N'N'N'N'U-3'，并且P1螺旋可以通过IGS区域和靶位点区域互补结合而形成。在这种情况下，为了排除重叠表达，可以将P1螺旋区域的技术与IGS区域的核苷酸序列结合使用。

在本发明中，可以形成P1螺旋，其包括在所述IGS区域的5'方向延伸的核苷酸序列，并且自然延伸的核苷酸序列和反向互补序列的核苷酸序列在靶位点的3'方向延伸，从而构成P1螺旋。在这种情况下，当存在所述延伸的核苷酸序列时，在本说明书中，将所述延伸的核苷酸序列区域表示为P1以将其与IGS区域区分开来。P10螺旋也是如此。

另外，在本发明中，靶位点区域旨在表示与IGS区域互补的核苷酸序列，可以根据IGS区域的核苷酸序列设计与目标基因(GOI)区域重叠，此时为了指定与IGS区域互补的区域，将目标基因中与IGS区域互补的区域分类并命名为靶位点。换言之，在本发明中，靶位点可以与目的基因区域的一部分或全部重叠，或者可以与目的基因分开存在。

在本发明中，反义序列(AS)区域位于自身环化RNA构建体的5'端，旨在与位于所述RNA构建体3'端的反义结合序列(ABS)区域的碱基序列形成氢键。在本发明中，AS区域基本上与ABS区域共存，因此可以将AS区域的缺失理解为包括ABS区域的缺失；同样地，可以将包括AS区域的RNA构建体理解为包括ABS区域。

另外，本发明者确认了P1区域、P10区域及AS区域的三种构型的存在与否对自身环化RNA构建体的STS反应的环化效率造成的影响。在这种情况下，已确认环状RNA的产生量按同时包括P1及P10区域和AS区域、仅包括P1区域、仅包括P1及P10区域的顺序高，并已确认当仅包括P1区域时，自身环化RNA构建体以足够的效率环化以产生环状RNA。由此本发明提供一种仅包括P1区域的情况下的自身环化RNA构建体。

因此，在本说明书中，仅包括P1区域的自身环化RNA构建体意味着P10区域和AS区域不存在，并且不用于排除其他配置的意义。同样地，仅包括P1区域和AS区域的自身环化RNA构建体意味着P10区域不存在，并且不用于排除除P10区域以外的其他配置的意义。

【具体实施方式】

以下，将参照附图对实施例进行详细说明。然而，能够对实施例进行多种变更，本发明的权利范围并非受到实施例的限制或限定。对于实施例的全部应变、等同物或替代物均包括在权利范围内。

实施例中使用的术语仅用于说明特定实施例，并非用于限定实施例。在内容中没有特别说明的情况下，单数表达包括复数含义。在本说明书中，“包括”或者“具有”等术语用于表达存在说明书中所记载的特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，并不排除还具有一个或以上的其他特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，或者附加功能。

在没有其他定义的情况下，包括技术或者科学术语在内的在此使用的全部术语，都具有本领域普通技术人员所理解的通常的含义。通常使用的与词典定义相同的术语，应理解为与相关技术的通常的内容相一致的含义，在本申请中没有明确言及的情况下，不能过度理想化或解释为形式上的含义。

并且，在参照附图进行说明的过程中，与附图标记无关，相同的构成要素赋予相同的附图标记，并省略对此的重复的说明。在说明实施例的过程中，当判断对于相关公知技术的具体说明会不必要地混淆实施例时，省略对其详细说明。

【实施例】

【实施例1：自身环化RNA的设计及所述RNA表达载体的制备】

自身环化RNA的设计如图2c所示，此外还包括T7启动子(T7 promoter)序列，用于在DNA模板中进行体外转录反应以进行表达(图2d)。使用T7循环正向引物(CircularForward primer)：5'-GGGATCGAAC ATCGATATAT ACACTCACTA GGGCATCGAT CGATCGACTCACTAGAGGGC ATCGATTCGA ATGTCGA-3'(Tm＝77.5℃)及T7循环反向引物(Circular Reverseprimer)：5'-AGATTCGAGC CAGCCTGCGA GCAAGCTT-3'(Tm＝79.4℃)，通过PCR扩增所述DNA模板，并且使用PstI限制性内切酶将所述DNA模板扩增产物插入至pTOP TA V2克隆载体(cloning vector)(酶学)中，以制备自身环化RNA表达载体。

【实施例2：体外转录及自动环化的确认】

【2-1.体外转录(IVT，In vitro transcription)】

根据制造商的方案，使用NEB的HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒在体外转录上述实施例1中制备的自身环化RNA表达载体。具体地，在37℃下以20μL的标度(1μg的T7 DNA模板、1×反应缓冲液、10mM的每个ATP、UTP、CTP及GTP、T7 RNA聚合酶混合物2μL)反应3小时后，添加29μL的无核酸酶水后，加入1μL的无RNA酶DNA酶I(10U/μL)，并在37℃下反应30分钟，以诱导转录后立即环化(直接STS)反应。

然后，诱导额外的环化反应以确认完成自身环化反应的步骤。具体地，为了诱导第一自我靶向及剪接(第一STS)反应，添加28μL的无核酸酶水和20μL的5×STS缓冲液(50mMHepes(pH 7.0)、150mM NaCl、5mM MgCl₂)及2μL的100mM GTP(最终2mM)，使体积达到100μL，然后在37℃下进行自动环化反应1小时。然后，在55℃下加热15分钟后，使用Monar RNA净化试剂盒(NEB)进行柱纯化。再次将20μL的5×STS缓冲液、100mM GTP(最终2mM)及28μL的无核酸酶水添加到纯化的50μL的样品柱中，得到最终100μL，并在37℃下反应3小时，诱导第二STS。反应后，在55℃下加热8分钟后，使用Monar RNA净化试剂盒(NEB)进行柱纯化，并使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific产品)设备测量了浓度。

另外，为了从反应产物中去除线性RNA，在第一和第二STS反应后的一些柱纯化样品中对RNA酶R进行了处理。具体地，将10μL的10×RNA酶R反应缓冲液(10×：0.2M Tris-HClpH8.0，1M KCl，1mM MgCl₂)和RNA酶R 20单位添加到以最大100μg的程度纯化的IVT RNA柱，用水调节体积至100μL，在37℃下反应30分钟，然后额外添加RNA酶R10单位并再反应30分钟，然后使用Monarch RNA净化试剂盒(NEB)进行柱纯化，并使用Nanodrop测量了浓度。

将对从每个STS步骤获得的RNA和从每个步骤获得的RNA中处理RNA酶R的样品的每个250ng与10M的尿素BPB(1×TBE)染料1:1混合，在75℃下加热5分钟，然后进行4％聚丙烯酰胺-7M尿素变性PAGE(在50W下进行2小时电泳，同时将温度保持在50℃)，并使用SYBR金核酸染色产品(Thermo Fisher Scientific)对凝胶进行染色，并使用ImageQuant 800(Cytiva产品)进行了分析。

结果，如图3所示，当RNA酶R被处理时，出现由于不被RNA酶R切割而被富集的RNA条带(候选1)，此外，尽管RNA酶R被处理，但仍能清晰观察到条带(被视为候选2和有缺口的环状RNA的条带)。此外，即使没有额外执行第一和第二STS反应，也可以确认仅通过直接STS反应(即，体外转录反应)充分制备出推测为环状RNA的物质。

【2-2.自身环化的确认】

接着，进行RT-PCR测序以验证候选1是PAGE结果中未被RNA酶R切割的RNA条带中的环状RNA。具体地，在所述PAGE中切割并压碎候选1位置的条带后，将在37℃下水中洗脱3至16小时并通过乙醇沉淀纯化的环状RNA样品和由于未存在核酶位点和反义位点而无法环化的线性RNA作为对照，使用只有在制备环状RNA时才可进行PCR扩增的引物来进行了RT-PCR。

对于逆转录(RT)，使用了OneScript Plus RTase(Abm产品)，在70℃下将125ng的每种RNA(在推测为对照RNA和环状RNA的RNA上经或不经RNA酶R处理的样品)加热5分钟，然后将其放置在冰上，并按顺序添加5×RT缓冲液4μL、10mM的dNTP混合物1μL、2μM的反向引物(环状STS R)1μL及OneScript Plus RTase 200U，最终以20μL的体积在50℃下反应15分钟，并在95℃下加热5分钟以使酶失活，然后将其储存在冰上。

然后，使用AccuPower Taq PCR预混合(Bioneer产品)进行了PCR，并添加2μL的RT样品、20μM的环状STS F(5'-CCCTGAGTGC TGTGTGTCAG G-3')及环状STS R(5'-CAGCAGCATAATTGCCAG-3')1μL，用水调节至20μL的体积，在95℃1分钟、[95℃30秒、65℃30秒、72℃30秒]35个循环、72℃5分钟的条件下进行PCR扩增。将5μL的PCR产物放入1μL的6×DNA负载染料中，在150V下电泳35分钟，并使用凝胶成像系统(Young-in科学的Davinch-Gel产品)分析了图像。STS PCR产物的预期长度为479bp，当在1.5％琼脂糖凝胶上使用GeneRuler 50bp的DNA梯形图(Thermo Fisher Scientific产品)进行分析时(含有Intron Bio产品的RedSafe核酸染色溶液1×浓度)，只有在推测为环状RNA的RNA样品的情况下，无论RNA酶R处理如何，均观察到预测大小的特定PCR产物(图4a)。

此外，在获得的预期大小的条带中使用凝胶提取试剂盒(由cosmogene tech制造)根据制造商的方案分离并纯化PCR产物，并使用TOPcloner TA-Blunt试剂盒(由enzynomics制造)进行克隆并转化到DH5α大肠杆菌(化学活性大肠杆菌，由enzynomics制造)，从LB-琼脂(含卡那霉素)平板中获取大肠杆菌菌落，并使用DNA纯化试剂盒(由cosmogene tech制造)根据制造商的方案提取并纯化质粒DNA，并对核苷酸序列进行了分析(cosmogene tech的Sanger测序服务，使用M13R(-40)或M13F(-20)通用引物)，从而确认了高斯萤光素酶的3'和IRES的5'在STS连接位点精确连接(图4b)。

从以上结果可以看出，候选1为环状RNA。

【2-3.自身环化的再验证】

通过RT-PCR已确认候选1为环状RNA，但从理论上不能排除候选1以二聚体(dimer)形式存在的可能性。因此，进行缺口测试(nicking test)以重新验证候选1为环状RNA。

将MgCl2与纯化的环状RNA候选1和2(100ng)分别混合至最终的0、2.5及5mM，并将最后10微升水中的样品在65℃下加热30分钟，并在冰上储存一段时间后，混合10微升的10M尿素-BPB(1×TEB)负载染料(loading dye)。

在75℃加热5分钟后，进行4％聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)-7M的尿素变性(Ureadenature)PAGE(在50W条件下进行2小时的电泳，同时将温度保持在50℃)，并使用SYBR金核酸染色()产品(Thermo Fisher Scientific)染色(staining)凝胶(Gel)，并使用ImageQuant 800(Cytiva制造)进行分析的结果如图5所示。

在候选1的情况下，已确认在没有Mg²⁺的情况下包括相当于约带缺口的环状RNA的大小的条带(1092-nt)；在2.5mM Mg²⁺的情况下视为环状RNA的位置的候选1位置处的条带被减少，并且仍然存在带缺口的环状(nicked circualr)RNA大小的条带。在5mM的Mg²⁺条件下，已确认连带有缺口的环状RNA条带也因水解而消失。由此观察到，当候选1即环状RNA出现缺口时，其通过预期作为单体的1092-nt大小(2.5mM Mg²⁺)最终完全被降解(5mM Mg²⁺)，由此可以再次确认候选1为环状RNA，是单体。

另外，候选2的大小类似于完整RNA大小1874-nt(约为标记的2000-nt)，与候选1不同，在2.5mM Mg²⁺的温和(mild)的缺口条件下，1092-nt条带(即带缺口的环状RNA的大小)没有产生反而消失，这表明其不是环状RNA。

【实施例3：细胞内转录及自身环化的确认】

在实施例2中，已确认实施例1中制备的自身环化RNA表达载体在体外转录形成环状RNA，由此，想要确认所述载体在细胞中的作用是否相同，进而，环状RNA中所含的目的基因是否在细胞中顺利表达。

为了在细胞中表达目的基因，将目的基因的结构设计为5'-EMCV IRES-转基因-终止密码子-3'，并且为了便于识别表达的目的基因，使用高斯荧光素酶(G.luci)作为转基因。

设计出包括上述目的基因的自身环化RNA构建体，并将能够表达其的DNA模板插入到质粒中以在pCMV启动子下表达(图6a)。将所述质粒载体转染到293A细胞中，通过RT-PCR和测序分析确认环状RNA的生成，并通过荧光素酶活性测定确认转基因的表达。

具体地，将293A细胞以2×10⁵/孔(well)接种在6孔板中，并在24小时后使用lipofectamine 2000转染试剂转化为所述质粒载体。转化6小时后更换培养基。然后，在转化后12、24及48小时中回收100μL培养基，并测量高斯荧光素酶活性。在培养基中检测到了高斯荧光素酶活性，并证实了活性随时间增加，由此确认了转基因高斯荧光素酶基因在导入细胞的载体中表达(图6b)。

通过RT-PCR和测序在分子水平上确认了转基因表达是否是由环状RNA的形成引起的。转化48小时后，使用trizol试剂从导入所述质粒载体的293A细胞中提取总RNA，然后通过RT-PCR确认生成环状RNA。

对于逆转录(RT)，使用了OneScript Plus RTase(Abm产品)，在70℃下加热1μg的总RNA 5分钟，然后依次放置在冰上，并添加5×RT缓冲液4μL、10mM的dNTP混合物1μL、2μM的反向引物(环状STS R)1μL及OneScript Plus RTase 200U，最终以20μL的体积在50℃下反应15分钟，并在95℃下加热5分钟以使酶失活，然后将其储存在冰上。

然后，使用AccuPower Taq PCR预混合(Bioneer产品)进行了PCR，并添加2μL的RT样品、20μM的环状STS引物F(5'-caaggacttg gagccatgga gag-3')和引物R(5'-tgtgcccttgcaggt)1μL，用水调节至20μL的体积，在95℃1分钟、[95℃30秒、65℃30秒、72℃30秒]35个循环、72℃5分钟的条件下进行PCR扩增。STS PCR产物的预期长度为479bp，当在1.5％琼脂糖凝胶上使用GeneRuler 50bp的DNA梯形图(Thermo Fisher Scientific产品)进行分析时(含有Intron Bio产品的RedSafe核酸染色溶液1×浓度)，只有当存在环状RNA时，才有可能确认预测大小的特定PCR产物。此时，将5μL的PCR产物放入1μL的6×DNA负载染料中，在150V下电泳35分钟，并使用凝胶成像系统(Young-in科学的Davinch-凝胶产品)分析了图像(图6c)。

此外，在获得的预期大小的条带中使用凝胶提取试剂盒(由cosmogene tech制造)根据制造商的方案分离并纯化PCR产物，并使用TOPcloner TA-Blunt试剂盒(由enzynomics制造)进行克隆并转化到DH5α大肠杆菌(化学活性大肠杆菌，enzynomics)，从LB-琼脂(含卡那霉素)平板中获取大肠杆菌菌落，并使用DNA纯化试剂盒(由cosmogene tech制造)和手册(cosmogene tech的Sanger测序服务，使用M13R(-40)或M13F(-20)通用引物)，提取并纯化质粒DNA，并对核苷酸序列进行了分析，从而确认了高斯萤光素酶的3'和IRES的5'在STS连接位点精确连接(图6d)。

综上所述，在分子水平上证实，制备的质粒载体在细胞中表达自身环化RNA构建体，并且所述构建体通过核酶环化成环状RNA，而目的基因在所述环状RNA中表达。

【实施例4：环状RNA的纯化】

【4-1.通过高效液相色谱法(HPLC)确认环状RNA的纯化潜力】

为了尽量减少制备用于人体注射的环状RNA时出现的免疫原性，使用HPLC进行了分析及纯化。具体地，使用了安捷伦(agilent)1290Infinity II Bio UHPLC系统，分析条件如图7A所示。对于分析，使用了[分析(Analytical)]的梯度条件，并使用[馏分收集(Fraction collection)]的条件进行样品收集。

当在IVT后使用Monarch RNA清除试剂盒(NEB)分析RNA(图7b)和经RNA酶R处理的RNA(图7c)时，经RNA酶R处理的样品中存在增加的峰值。由此可以看出，无需RNA酶R处理即可通过HPLC分离环状RNA。

【4-2.通过HPLC纯化环状RNA】

通过HPLC，使用馏分收集条件中所示的梯度收集馏分，并如图8a所示获得了各个馏分。以与先前方法相同的方式进行电泳，在4％变性PAGE上取峰清晰的馏分7及10至13各200ng。

结果，如图8b所示，从馏分12中分离并纯化了干净的环状RNA。

【实施例5：AS(反义序列)区域优化】

本研究旨在确认AS(反义序列)区域和反向互补(reverse complementary)反义结合序列(ABS)区域的长度对体外转录过程中即时环化反应造成的影响。因此，制备了具有50、100、150、200、250或300-nt的不同长度的AS区域和ABS区域的DNA模板(图9)，并以与实施例1相同的方式制备可表达每个RNA构建体的载体，并以与实施例2相同的方式在3℃下进行体外转录3小时，并通过在4％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶(20×20cm，1mm)上进行PAGE，以相对条带强度(relative band intensity)比较并确认即时STS反应的程度。

每个AS区域的核苷酸序列如下表1所示。

【表1】

因此，如下图10和下表2所示，在AS50、AS100及AS150的情况下，与AS200以上的长度相比，自身环化效率相对较好。另外，AS50和AS100在体外转录反应后产生的总RNA显著减少。由此可以看出，AS150是自身环化RNA构建体表达和循环RNA生产的最佳长度。

【表2】

【实施例6：间隔区域的优化】

接着，为了确认间隔区域的长度或类型对体外转录过程中立即环化反应造成的影响，制备了包括不同长度和核苷酸序列的间隔区域的DNA模板(图11)，并以与实施例1相同的方式制备了能够表达每个RNA构建体的载体，并以与实施例2相同的方式在37℃下进行体外转录3小时，通过在4％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶(20×20cm，1mm)上进行PAGE，以相对条带强度(relative band intensity)比较并确认即时STS反应的程度。每个间隔区域的核苷酸序列如下表3所示。在本实验中，A10、A30及A30的间隔区域是通过在3'端添加限制位点(restriction site)来使用，其用于在间隔区域之后立即插入IRES。在本实验中，将AatII位点(GACGTC)添加到间隔区域的3'端并使用。

【表3】

分类	核苷酸序列(5'→3')
		A10	AAAAAAAAAA
A30	AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
		A50	AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA
对照间隔区域1	GGTAGTGGTG CTACTAACTT CAGCCTGCTG AAGCA
		对照间隔区域2	GGTAGTAAAC TACTAACTAC AACCTGCTGA AGCA

由此可以看出，如下图12及下表4所示，尽管间隔区域的长度和序列不同，但体外转录过程中的即时环化效率并没有显著差异，但A30在自身环化RNA构建体的表达和原始RNA的生产方面起到最佳间隔区域的作用。

【表4】

【实施例7：自身环化RNA构建体的优化】

【7-1.AS区域、P1螺旋及P10螺旋区域】

实施例1中设计的自身环化RNA构建体包括AS区域、P1螺旋和P10螺旋区域。下文中，为了确定每个构建体在体外转录过程中对立即环化反应造成的影响，如图13所示，制备仅包括P1螺旋区域、仅包括P1和P10螺旋区域或同时包括P1和P10螺旋和AS区域的DNA模板，并以与实施例1相同的方式制备能够表达每种RNA构建体的载体，并以与实施例2相同的方式在37℃下进行体外转录3小时，然后在4％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶(20×20cm，1mm)上进行即时STS反应PAGE，以确定相对条带强度的程度。

仅包括P1螺旋区的T7 DNA模板的核苷酸序列如图14所示。

结果，如下图15及表5所示，在体外每个载体中转录和生成的总RNA没有显著差异，但环状RNA的产生量按同时包括P1和P10螺旋以及AS区域的情况、仅包括P1螺旋区域的情况、仅包括P1及P10区域的顺序大。

【表5】

AS150	P1(无AS)	P1&P10(无AS)	P1&P10(AS150)
				A：总RNA浓度(μg)	200	196	182
B：环状RNA的相对条带强度(％)	3.2	0.5	5.1
				相对系数(A*B)	640	98	928

【7-2.不包括P10及AS区域的自身环化RNA构建体的环化的验证】

从实施例7-1的结果可以看出，不包括P10和AS区域的DNA模板(P1构建体)在体外转录过程中无需额外的环化步骤即可制备出足够的环状RNA。为了验证这一点，将实施例7-1的STS反应后的产物用RNA酶R处理去除线性RNA，并与先前实验同样进行PAGE，并以与实施例2-2相同的方式执行RT-PCR和测序分析。

结果，如图16A及图16B所示，即使使用P1构建体进行自身环化，也可观察到当处理RNA酶R时不易被RNA酶R切割而被富集的RNA条带，并且通过对所述条带中的STS反应产物执行RT-PCR和测序，确认其为环状RNA。

【实施例8：P1螺旋区域的优化】

根据实施例7的结果确认了不包括P10、AS及ABS的自身环化构建体也可以充分生成环状RNA。因此，假设将仅存在于形成P1螺旋的5'端的内部引导序列(IGS)和存在于3'端的靶位点的碱基序列彼此互补(U和G是摆动碱基对)，就可生成环状RNA，并试图验证它。

由于IGS区域为GNNNNN，靶位点序列为N'N'N'N'U，因此若仅向GOI添加一个U核苷酸，则最终生成的环状RNA仅由一个U碱基和GOI区域组成。(图1A及图1B)。此外，当GOI的3'端以U碱基结束时，可以通过将IGS区域的核苷酸序列设计为与GOI反向互补，使得最终生成的环状RNA仅包括GOI区域(图20A和20B)。

如图17所示，设计了IGS和靶位点的各种序列，并通过实施例1的方法制备载体，然后进行实施例2-1的体外转录。

结果，如图18-19及以下表6所示，当两端都有互补序列时，可以确认在体外转录后通过即时STS反应产生的环状RNA有所增加，而包括无互补IGS区域的环状RNA的载体产生非常低水平的环状RNA。由此可以看出，如果IGS和靶位点互补，则都可以有效地诱导自身环化反应。

【表6】

综上，通过有限的附图对实施例进行了说明，本领域普通技术人员能够基于所述记载进行多种更改与应变。例如，所说明的技术按照与说明的方法不同的顺序执行，和/或所说明的系统、结构、装置、电路等构成要素按照与说明的方法不同的形态进行结合或组合，或者由其他构成要素或者等同物置换或代替，也能得到适当的结果。

由此，其他体现，其他实施例以及权利要求范围的等同物，均属于本发明的权利要求范围。

【产业应用性】

本发明可用于制备用于体外、细胞内及体内蛋白质的表达的circRNA，并且，其可用于制备功能性RNA，如miRNA、抗-miRNA、shRNA、适体、mRNA疫苗、mRNA治疗剂、抗体、疫苗佐剂及CAR-T mRNA等。

序列表

<110> Rznomics Inc.

<120> 自身环化RNA构建体

<130> FPC-2022-0122-PCT

<150> KR 10-2021-0031225

<151> 2021-03-10

<160> 43

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身环化RNA的IGS区

<220>

<221> 变异

<222> (2)..(6)

<223> N以下之任一个：A、G、U和C

<400> 1

gnnnnn 6

<210> 2

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身环化RNA的靶位点区

<220>

<221> 变异

<222> (1)..(5)

<223> N以下之任一个：A、G、U和C

<400> 2

nnnnnu 6

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7启动子

<400> 3

taatacgact cactataggg 20

<210> 4

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于自身环化RNA的表达载体的AS 150: AS区

<400> 4

ggcggccagc atggagaact gccatggctc agccaggtag tactgtgggt actcgaagtg 62

gctgcgtacc acacccgtcg cattggagaa gggcacgtag aagttagggc cttctgtgcc 122

attcatggct gtggcccttg tggctgaccc 152

<210> 5

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于自身环化RNA的表达载体的IGS区

<400> 5

gcccaa 6

<210> 6

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于自身环化RNA的表达载体的核酶区

<400> 6

aaaagttatc aggcatgcac ctggtagcta gtctttaaac caatagattg catcggttta 60

aaaggcaaga ccgtcaaatt gcgggaaagg ggtcaacagc cgttcagtac caagtctcag 120

gggaaacttt gagatggcct tgcaaagggt atggtaataa gctgacggac atggtcctaa 180

ccacgcagcc aagtcctaag tcaacagatc ttctgttgat atggatgcag ttcacagact 240

aaatgtcggt cggggaagat gtattcttct cataagatat agtcggacct ctccttaatg 300

ggagctagcg gatgaagtga tgcaacactg gagccgctgg gaactaattt gtatgcgaaa 360

gtatattgat tagttttgga gtactcg 387

<210> 7

<211> 463

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于自身环化RNA的表达载体的EMCV IRES区

<400> 7

gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 60

cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 120

ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 180

caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 240

ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 300

attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 360

gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc 420

gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taa 463

<210> 8

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于自身环化RNA的表达载体的转基因区: Gaussia荧光素酶

<400> 8

atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60

gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120

gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180

gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240

aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300

aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360

ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420

acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480

ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540

ggggccggtg gtgactaa 558

<210> 9

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于自身环化RNA的表达载体的ABS区

<400> 9

gggtcagcca caagggccac agccatgaat ggcacagaag gccctaactt ctacgtgccc 60

ttctccaatg cgacgggtgt ggtacgcagc cacttcgagt acccacagta ctacctggct 120

gagccatggc agttctccat gctggccgcc 150

<210> 10

<211> 1908

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例1的编码自身环化RNA的DNA模板

<400> 10

gggattcgaa catcgattaa tacgactcac tataggggca tcgattgaat tgtcgacgaa 60

ttcggcggcc agcatggaga actgccatgg ctcagccagg tagtactgtg ggtactcgaa 120

gtggctgcgt accacacccg tcgcattgga gaagggcacg tagaagttag ggccttctgt 180

gccattcatg gctgtggccc ttgtggctga cccgaattcc gtactccgcc caaaaaagtt 240

atcaggcatg cacctggtag ctagtcttta aaccaataga ttgcatcggt ttaaaaggca 300

agaccgtcaa attgcgggaa aggggtcaac agccgttcag taccaagtct caggggaaac 360

tttgagatgg ccttgcaaag ggtatggtaa taagctgacg gacatggtcc taaccacgca 420

gccaagtcct aagtcaacag atcttctgtt gatatggatg cagttcacag actaaatgtc 480

ggtcggggaa gatgtattct tctcataaga tatagtcgga cctctcctta atgggagcta 540

gcggatgaag tgatgcaaca ctggagccgc tgggaactaa tttgtatgcg aaagtatatt 600

gattagtttt ggagtactcg cgagtacgct taagaaaaaa aaaagagggc ccggaaacct 660

ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa 720

ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg 780

tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc 840

caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg 900

agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg 960

aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc 1020

tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg 1080

gttttccttt gaaaaacacg atgataagct tgccacaacc cttaagaccg gtatgggagt 1140

caaagttctg tttgccctga tctgcatcgc tgtggccgag gccaagccca ccgagaacaa 1200

cgaagacttc aacatcgtgg ccgtggccag caacttcgcg accacggatc tcgatgctga 1260

ccgcgggaag ttgcccggca agaagctgcc gctggaggtg ctcaaagaga tggaagccaa 1320

tgcccggaaa gctggctgca ccaggggctg tctgatctgc ctgtcccaca tcaagtgcac 1380

gcccaagatg aagaagttca tcccaggacg ctgccacacc tacgaaggcg acaaagagtc 1440

cgcacagggc ggcataggcg aggcgatcgt cgacattcct gagattcctg ggttcaagga 1500

cttggagccc atggagcagt tcatcgcaca ggtcgatctg tgtgtggact gcacaactgg 1560

ctgcctcaaa gggcttgcca acgtgcagtg ttctgacctg ctcaagaagt ggctgccgca 1620

acgctgtgcg acctttgcca gcaagatcca gggccaggtg gacaagatca agggggccgg 1680

tggtgactaa aaaaaaaaaa accggtttgg gtgggagcag ccacgggtca gccacaaggg 1740

ccacagccat gaatggcaca gaaggcccta acttctacgt gcccttctcc aatgcgacgg 1800

gtgtggtacg cagccacttc gagtacccac agtactacct ggctgagcca tggcagttct 1860

ccatgctggc cgccaagctt gcctcgagca gcgctgctcg agagatct 1908

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7环状正向引物

<400> 11

gggattcgaa catcgattaa tacgactcac tataggggca tcgattgaat tgtcga 56

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7环状反向引物

<400> 12

agatctctcg agcagcgctg ctcgaggcaa gctt 34

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例2-2的环状STS正向引物

<400> 13

ccctgagtgg ctgagctcag g 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例2-2的环状STS反向引物

<400> 14

cagcaagcat actaaattgc cag 23

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例3的环状STS正向引物

<400> 15

caaggacttg gagcccatgg agcag 25

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例3的环状STS反向引物2

<400> 16

tgtgccgcct ttgcaggtgt atc 23

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AS50区的DNA序列

<400> 17

aagttagggc cttctgtgcc attcatggct gtggcccttg tggctgaccc 50

<210> 18

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AS100区的DNA序列

<400> 18

actcgaagtg gctgcgtacc acacccgtcg cattggagaa gggcacgtag aagttagggc 60

cttctgtgcc attcatggct gtggcccttg tggctgaccc 100

<210> 19

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AS150区的DNA序列

<400> 19

ggcggccagc atggagaact gccatggctc agccaggtag tactgtgggt actcgaagtg 60

gctgcgtacc acacccgtcg cattggagaa gggcacgtag aagttagggc cttctgtgcc 120

attcatggct gtggcccttg tggctgaccc 150

<210> 20

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AS200区的DNA序列

<400> 20

agcgtgagga agttgatggg gaagcccagc acgatcagca gaaacatgta ggcggccagc 60

atggagaact gccatggctc agccaggtag tactgtgggt actcgaagtg gctgcgtacc 120

acacccgtcg cattggagaa gggcacgtag aagttagggc cttctgtgcc attcatggct 180

gtggcccttg tggctgaccc 200

<210> 21

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AS250区的DNA序列

<400> 21

ggatgtagtt gagaggcgtg cgcagcttct tgtgctggac ggtgacgtag agcgtgagga 60

agttgatggg gaagcccagc acgatcagca gaaacatgta ggcggccagc atggagaact 120

gccatggctc agccaggtag tactgtgggt actcgaagtg gctgcgtacc acacccgtcg 180

cattggagaa gggcacgtag aagttagggc cttctgtgcc attcatggct gtggcccttg 240

tggctgaccc 250

<210> 22

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AS300区的DNA序列

<400> 22

ggtgaagcca cctaggacca tgaagaggtc agccacggct aggttgagca ggatgtagtt 60

gagaggcgtg cgcagcttct tgtgctggac ggtgacgtag agcgtgagga agttgatggg 120

gaagcccagc acgatcagca gaaacatgta ggcggccagc atggagaact gccatggctc 180

agccaggtag tactgtgggt actcgaagtg gctgcgtacc acacccgtcg cattggagaa 240

gggcacgtag aagttagggc cttctgtgcc attcatggct gtggcccttg tggctgaccc 300

300

<210> 23

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A10:间隔区域的DNA序列

<400> 23

aaaaaaaaaa 10

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A30:间隔区域的DNA序列

<400> 24

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 30

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A50:间隔区域的DNA序列

<400> 25

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 39

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照1:间隔区域的DNA序列

<400> 26

ggtagtggtg ctactaactt cagcctgctg aagca 35

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照2:间隔区域的DNA序列

<400> 27

ggtagtaaac tactaactac aacctgctga agca 34

<210> 28

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Aat2位点

<400> 28

gacgtc 6

<210> 29

<211> 1522

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例7的编码自身环化RNA的DNA模板

<400> 29

gggattcgaa catcgattaa tacgactcac tataggggcc caaaaaagtt atcaggcatg 60

cacctggtag ctagtcttta aaccaataga ttgcatcggt ttaaaaggca agaccgtcaa 120

attgcgggaa aggggtcaac agccgttcag taccaagtct caggggaaac tttgagatgg 180

ccttgcaaag ggtatggtaa taagctgacg gacatggtcc taaccacgca gccaagtcct 240

aagtcaacag atcttctgtt gatatggatg cagttcacag actaaatgtc ggtcggggaa 300

gatgtattct tctcataaga tatagtcgga cctctcctta atgggagcta gcggatgaag 360

tgatgcaaca ctggagccgc tgggaactaa tttgtatgcg aaagtatatt gattagtttt 420

ggagtactcg cgagtacgct taagaaaaaa aaaagagggc ccggaaacct ggccctgtct 480

tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga 540

atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga 600

ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac 660

gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag 720

ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc 780

agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg 840

tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt 900

gaaaaacacg atgataagct tgccacaacc cttaagaccg gtatgggagt caaagttctg 960

tttgccctga tctgcatcgc tgtggccgag gccaagccca ccgagaacaa cgaagacttc 1020

aacatcgtgg ccgtggccag caacttcgcg accacggatc tcgatgctga ccgcgggaag 1080

ttgcccggca agaagctgcc gctggaggtg ctcaaagaga tggaagccaa tgcccggaaa 1140

gctggctgca ccaggggctg tctgatctgc ctgtcccaca tcaagtgcac gcccaagatg 1200

aagaagttca tcccaggacg ctgccacacc tacgaaggcg acaaagagtc cgcacagggc 1260

ggcataggcg aggcgatcgt cgacattcct gagattcctg ggttcaagga cttggagccc 1320

atggagcagt tcatcgcaca ggtcgatctg tgtgtggact gcacaactgg ctgcctcaaa 1380

gggcttgcca acgtgcagtg ttctgacctg ctcaagaagt ggctgccgca acgctgtgcg 1440

acctttgcca gcaagatcca gggccaggtg gacaagatca agggggccgg tggtgactaa 1500

aaaaaaaaaa accggtttgg gt 1522

<210> 30

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的RZ004变体：包含P1螺旋的内部引导序列

<400> 30

gcccaa 6

<210> 31

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的RZ004变体：包含P1螺旋的靶位点

<400> 31

uugggu 6

<210> 32

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的RZ001变体：包含P1螺旋的内部引导序列

<400> 32

ggcagg 6

<210> 33

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的RZ001变体：包含P1螺旋的靶位点

<400> 33

ccugcu 6

<210> 34

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的RZ003变体：包含P1螺旋的内部引导序列

<400> 34

gcgucc 6

<210> 35

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的RZ003变体：包含P1螺旋的靶位点

<400> 35

ggacgu 6

<210> 36

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的富含GC的变体：包含P1螺旋的内部引导序列

<400> 36

gcgcgc 6

<210> 37

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的富含GC的变体：包含P1螺旋的靶位点

<400> 37

gcgcgu 6

<210> 38

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的富含AU的变体：包含P1螺旋的内部引导序列

<400> 38

guaaau 6

<210> 39

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的富含AU的变体：包含P1螺旋的靶位点

<400> 39

auuuau 6

<210> 40

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的2个位点变体：包含P1螺旋的内部引导序列

<400> 40

guguug 6

<210> 41

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的2个位点变体：包含P1螺旋的靶位点

<400> 41

caacau 6

<210> 42

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的无互补变体：包含P1螺旋的内部引导序列

<400> 42

gcccaa 6

<210> 43

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1区的无互补变体：包含P1螺旋的靶位点

<400> 43

aacccg 6

Claims

1.一种自身环化RNA构建体，其特征在于，

所述构建体具有5'-内部引导序列(IGS)-核酶-目的基因-靶位点-3'的结构，

所述IGS区域形成靶位点和鸟嘌呤：尿嘧啶摆动碱基对，

形成所述摆动碱基对的鸟嘌呤位于IGS区域的5'端，

形成所述摆动碱基对的尿嘧啶位于靶位点区域的3'端。

2.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述靶位点区域与目的基因区域重叠。

3.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述IGS区域的核苷酸序列与除所述鸟嘌呤之外的靶位点区域的核苷酸序列反向互补。

4.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述核酶为I型内含子核酶。

5.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述核酶包括序列号6的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述构建体包括在IGS区域的5'方向上延伸的核苷酸，以形成P10螺旋。

7.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述构建体包括在IGS区域的5'方向及靶位点的3'方向上延伸的核苷酸，以形成P1螺旋。

8.根据权利要求7所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述构建体不形成P10螺旋。

9.根据权利要求1或6所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述构建体还包括IGS区域的5'方向的反义序列区域和可在靶位点的3'方向与所述反义序列区域互补结合的反义结合序列区域。

10.根据权利要求9所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述反义序列区域的长度为50至400nt。

11.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述目的基因区域在其5'端包括内部核糖体进入位点区域。

12.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，所述构建体是核酶区域及目的基因区域通过由随机核苷酸序列组成的间隔区域连接。

13.根据权利要求1所述的自身环化RNA构建体，其特征在于，在所述构建体中，目标基因区域及靶位点区域通过由随机核苷酸序列组成的间隔区域连接。

14.一种载体，其特征在于，表达权利要求1的自身环化RNA构建体。

15.根据权利要求14所述的载体，其特征在于，所述载体包括与编码自身环化和RNA的基因可操作地连接的启动子。