CN114174510A - 添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导rna - Google Patents

添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导rna Download PDF

Info

Publication number
CN114174510A
CN114174510A CN202080054392.3A CN202080054392A CN114174510A CN 114174510 A CN114174510 A CN 114174510A CN 202080054392 A CN202080054392 A CN 202080054392A CN 114174510 A CN114174510 A CN 114174510A
Authority
CN
China
Prior art keywords
base sequence
sequence
guide rna
adar
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080054392.3A
Other languages
English (en)
Inventor
吉见英治
森家由香里
万田茉莉子
福田将虎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Astellas Pharma Inc
Fukuoka University
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Fukuoka University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astellas Pharma Inc, Fukuoka University filed Critical Astellas Pharma Inc
Publication of CN114174510A publication Critical patent/CN114174510A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供指导RNA。一种指导RNA，其是用于编辑靶标RNA序列的指导RNA，其包含与该靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。

Description

添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导RNA
技术领域
本发明涉及用于诱导ADAR、进行靶标RNA编辑的指导RNA，特别是添加了功能性碱基序列的指导RNA。
背景技术
在生物体内存在基于单碱基突变的RNA编辑机制。特别是通过腺苷(A)的脱氨基化而转变为肌苷(I)的RNA编辑最为常见，靶标数高达400万。作为以双链RNA为底物进行由腺苷向肌苷的编辑的酶，已知有ADAR(Adenosine deaminases acting on RNA，RNA特异性腺苷脱氨酶)。ADAR存在基因不同的3种亚型(ADAR1、ADAR2、ADAR3)，任一亚型均在其N末端具有双链RNA结合结构域、在其C末端具有脱氨酶结构域。
ADAR2特别是在中枢神经系统中高效率地编辑构成3-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异
Figure BDA0003491900150000011
唑丙酸(AMPA)型谷氨酸受体的亚单位2(GluR2)(Nature、1996、Vol.379、p.460-464(非专利文献1))。
由腺苷转变而成的肌苷与鸟苷结构类似，因此在翻译阶段被识别为鸟苷并置换编码区的氨基酸。还报道了作为非编码区的逆转录转座子(FEBS Letters、2006、Vol.580、p.2301-2305)、微小RNA(miRNA)前体也会成为ADAR的底物，暗示了在生物体内承担着多种功能的可能性(Ann.Rev.Biochem.、2010、Vol.79、p.321-349)。
ADAR的改造体也有报道，例如，报道了一种ADAR的改造体，其通过在ADAR中引入突变而不仅能够识别腺苷、也能够识别胞苷，还能够进行通过胞苷的脱氨基化变为尿苷的、由C向U的RNA编辑(Science、2019、Vol.365、p.382-386)。
近年来报道了使用野生型ADAR和人工指导RNA的RNA编辑。
例如，作为将作为人工合成核酸的反义寡核苷酸用作指导RNA的RNA编辑技术，使用与包含编辑靶标腺苷的mRNA互补的35个碱基长度以上的单链RNA、与mRNA形成不完全螺旋结构的双链并募集ADAR的技术是已知的，已有报道(国际公开第2017/220751号、国际公开第2018/041973号、国际公开第2018/134301号)。另外，报道了一种靶标RNA编辑指导RNA，其包含：含有与靶标RNA的一部分互补的反义序列的靶向区域及来源于GluR2的ADAR募集区域这2个区域的寡核苷酸构建体(专利文献1)。另外报道了：通过在野生型ADAR2表达细胞株中表达基于GluR2序列设计的指导RNA而诱导了一定的RNA编辑(Nucleic Acids Research、2017、Vol.45、p.2797-2808(非专利文献2)、专利文献2及3)；使用由修饰寡核苷酸构成的指导RNA编辑了内源性靶标(Nat.Biotechnol.、2019、Vol.37、p.133-138(非专利文献3))。
进而报道了一种指导RNA，其为包含与靶标RNA结合的反义区域及ADAR募集区域的位点特异性靶标RNA编辑指导RNA，其中，ADAR募集区域为49个碱基长度或40个碱基长度(Scientific Reports、2017、Vol.7、p.41478(非专利文献4)、专利文献4)。最近报道了一种靶标编辑指导RNA，其具备用于确定靶标RNA的第一寡核苷酸和连接在第一寡核苷酸的3’侧的2～34个碱基长度的第二寡核苷酸(专利文献5)。根据该专利文献5认为，若第二寡核苷酸的残基数为14以上，则形成稳定的茎环结构、可维持编辑活性。
对于在指导RNA等RNA中添加碱基序列，已经有一些报道。
例如，已知可被小分子RNA(small RNA)识别的作为核酸高级结构的茎环结构有助于翻译调节功能(Cell.Mol.LifeSci.、2006、Vol.63、p.901-908)。来源于λ噬菌体的BoxB序列采取茎环结构，与λN蛋白显示出强亲和性(Biol.Cell.、2008、Vol.100、p.125-138、J.Am.Chem.Soc.、2002、Vol.124、p.10966-10967)。报道了：为了利用该性质将ADAR募集到指导RNA，在指导RNA中添加BoxB序列，使λN蛋白与ADAR融合(Nucleic Acids Research、2016、Vol.44、p.e157(非专利文献6))。专利文献2记载了：为了使基于GluR2序列设计的指导RNA稳定化，可以在指导RNA的3’末端添加BoxB序列，但是非专利文献2记载了通过向指导RNA中添加BoxB序列而带来的稳定化效果较为微弱。
鸟嘌呤四链体(Gq：G-quadruplex)结构是作为在生物体内的环境中热力学稳定的DNA或RNA高级结构而已知的、包含鸟嘌呤的重复序列。高级结构的形成中需要一价阳离子。Gq原本是作为在端粒中可见的序列而进行报道的(Cell、1989、Vol.59、p.871-880)。作为Gq的功能，已知转录、翻译、表观基因组控制等(EMBO Reports、2015、Vol.16、p.910-922)。据报道，通过对Cas9的指导RNA的3’末端添加Gq，基因组编辑效率提高(Chem.Commun.、2018、Vol.54、p.2377-2380(非专利文献5))。
U6核内小分子RNA(small nuclear(sn)RNA)为在全部人类细胞中稳定且大量表达的小分子RNA(small RNA)，在核内形成核糖核蛋白U6snRNP。U6 snRNP构成剪接体，控制RNA前体中的剪接。已知U6上游的转录起始元件为能够使任意RNA(核酶、反义核糖核酸、RNA适配体等)表达的强力的polIII型启动子(Gene Ther.、1997、Vol.4、p.45-54)。据报道，由U6所编码的序列制作的small RNA表达盒中，U6序列的高级结构发挥作用，使插入的RNA局部存在于核内(Gene Ther.、1997、Vol.4、p.45-54(非专利文献7)、Nat.Biotechnol.、2002、Vol.20、p.505-508(非专利文献8)、Mol.Ther.、2003、Vol.7、p.237-247(非专利文献9))。
可见，关于使用人工指导RNA的RNA编辑，已有一些报道。但是，为了将靶标RNA编辑指导RNA用作药品，需要在细胞中显示出一定的编辑效率，但是对于指导RNA编辑效率的改善尚未进行充分研究。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2016/097212号
专利文献2：国际公开第2017/050306号
专利文献3：德国专利第102015012522号
专利文献4：国际公开第2017/010556号
专利文献5：国际公开第2019/111957号
非专利文献
非专利文献1：Nature、1996、Vol.379、p.460-464
非专利文献2：Nucleic Acids Research、2017、Vol.45、p.2797-2808
非专利文献3：Nat.Biotechnol.、2019、Vol.37、p.133-138
非专利文献4：Scientific Reports、2017、Vol.7、p.41478
非专利文献5：Chem.Commun.、2018、Vol.54、p.2377-2380
非专利文献6：Nucleic Acids Research、2016、Vol.44、p.e157
非专利文献7：Gene Ther.、1997、Vol.4、p.45-54
非专利文献8：Nat.Biotechnol.、2002、Vol.20、p.505-508
非专利文献9：Mol.Ther.、2003、Vol.7、p.237-247
发明内容
发明所要解决的问题
提供用于诱导ADAR、进行靶标RNA编辑的指导RNA及编码该指导RNA的核酸。
用于解决问题的方法
本发明人对用于诱导ADAR、进行靶标RNA编辑的指导RNA进行了深入研究，结果发现添加了功能性碱基序列的指导RNA在细胞中显示出高的编辑效率，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下的[1]～[31]。
[1]一种指导RNA，其是用于编辑靶标RNA序列的指导RNA，其包含与该靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。
[2]根据[1]所述的指导RNA，其中，反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接。
[3]根据[2]所述的指导RNA，其中，在反义碱基序列的5’侧还连接有至少1个功能性碱基序列。
[4]根据[1]所述的指导RNA，其还包含接头碱基序列。
[5]根据[4]所述的指导RNA，其中，在短链型ADAR募集碱基序列上通过接头碱基序列连接有至少1个功能性碱基序列。
[6]根据[5]所述的指导RNA，其中，反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接。
[7]根据[6]所述的指导RNA，其中，在反义碱基序列的5’侧还连接有至少1个功能性碱基序列。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为与指导RNA的细胞内稳定化和/或细胞内的局部存在有关的碱基序列。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为选自形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列和形成茎环结构的碱基序列中的1种以上碱基序列。
[10]根据[1]～[8]中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为U6 snRNA序列。
[11]根据[9]所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为形成1～4层的鸟嘌呤四链体结构的碱基序列。
[12]根据[9]所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为形成茎环结构的碱基序列。
[13]根据[12]所述的指导RNA，其中，形成茎环结构的碱基序列为来源于BoxB序列的碱基序列。
[14]根据[1]～[13]中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列由序列号6、7、8或9所示的碱基序列或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有功能的碱基序列构成。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列为由14～34个碱基构成的碱基序列。
[16]根据[15]所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列为由16个碱基构成的序列。
[17]根据[15]或[16]所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列的茎环结构的环部分为由4～5个碱基构成的碱基序列。
[18]根据[15]～[17]中任一项所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列的茎环结构的茎部分具有形成错配碱基对的碱基。
[19]根据[1]～[18]中任一项所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列由序列号1、2、3或4所示的碱基序列或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成。
[20]根据[4]～[19]中任一项所述的指导RNA，其中，接头碱基序列为由15～25个碱基构成的碱基序列。
[21]一种靶标RNA序列编辑系统，其包含[1]～[20]中任一项所述的指导RNA和ADAR。
[22]一种核酸，其编码[1]～[20]中任一项所述的指导RNA。
[23]一种表达载体，其包含编码[1]～[20]中任一项所述的指导RNA的核酸。
[24]根据[23]所述的表达载体，其还包含编码ADAR的核酸。
[25]一种宿主细胞，其被导入了[23]或[24]所述的表达载体。
[26]一种生产表达载体的方法，其包括对[25]所述的宿主细胞进行培养的步骤。
[27]一种药物组合物，其包含[23]或[24]所述的表达载体和药学上可接受的赋形剂。
[28]一种药物组合物，其包含[23]所述的表达载体、包含编码ADAR的核酸的表达载体和药学上可接受的赋形剂。
[29]根据[27]或[28]所述的药物组合物，其中，ADAR为人ADAR1或人ADAR2。
[30]根据[28]或[29]所述的药物组合物，其中，编码ADAR的核酸为由编码序列号12所示的氨基酸序列的碱基序列、或者编码由与该氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性的多肽的碱基序列构成的核酸。
[31]一种靶标RNA编辑方法，其包括：(i)将[1]～[20]中任一项所述的指导RNA或[22]所述的核酸导入到细胞中的步骤；(ii)该指导RNA募集ADAR的步骤；(iii)靶标RNA序列与该指导RNA形成复合物的步骤；(iv)被该指导RNA募集的ADAR将靶标RNA序列的腺苷转变为肌苷的步骤。
发明效果
添加了功能性碱基序列的指导RNA能够作为细胞内靶标RNA编辑用指导RNA使用。
附图说明
图1为本发明的指导RNA的示意图。
图2示出荧光素酶分析的两次实验中的代表例(转染后3天的RNA编辑活性)。纵轴表示将对照用指导RNA的Rluc/Fluc值设为1时的各指导RNA的Rluc/Fluc值的相对值。横轴表示质粒的编号(#)。需要说明的是，实验以各3孔来进行。图由3孔的算术平均值和标准偏差表示。
图3示出荧光素酶分析的两次实验中的代表例(转染后6天的RNA编辑活性)。纵轴表示将对照用指导RNA的Rluc/Fluc值设为1时的各指导RNA的Rluc/Fluc值的相对值。横轴表示质粒的编号(#)。需要说明的是，实验以各3孔来进行。图由3孔的算术平均值和标准偏差表示。
图4示出荧光素酶分析中得到的Rluc/Fluc值(转染后3天的RNA编辑活性)。纵轴表示Rluc/Fluc值。横轴表示质粒的编号(#)。需要说明的是，实验进行了三次。图由三次试验的算术平均值和标准偏差表示。图表示各试验中的每3个样品的算术平均值。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明，但是本发明不受这些说明限定。本说明书中使用的术语未进行具体定义的情况下，该术语以本领域技术人员通常所接受的含义来使用。
＜概要＞
本发明涉及用于编辑靶标RNA序列的指导RNA。RNA编辑例如可通过将靶标序列的特定碱基置换为其它碱基来调节(例如提高或降低)由靶标序列编码的蛋白质的功能、表达。
图1为本发明的指导RNA(1)的示意图，如图1A所示，其基本结构由与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列(10)、短链型ADAR募集碱基序列(20)和至少1个功能性碱基序列(30)构成。
与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列(10)具有与靶标RNA序列的一部分的区域的序列互补的序列。因此，如图1B所示，上述反义碱基序列(10)能够与靶标RNA序列(40)杂交。短链型ADAR募集碱基序列(20)为诱导(募集)ADAR(50)、形成与ADAR(50)的复合物的碱基序列。通过该募集到的ADAR能够对靶标RNA序列中的碱基进行置换。至少1个功能性碱基序列(30)对指导RNA添加细胞内稳定化、细胞内的局部存在等中的任一功能。
如图1C所示，本发明中，通过在上述序列中进一步添加接头(60)，本发明的指导RNA能够在细胞内更有效地提高ADAR的功能。
图1为用于示出本发明的指导RNA的基本概念的例示，并不限定于该方式。
＜本发明的指导RNA＞
本发明中，用于编辑靶标RNA序列的指导RNA(以下也称为“本发明的指导RNA”)是指与ADAR结合、并将ADAR募集至靶标RNA序列的RNA分子。本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列。
本发明中，RNA中可以包含含有经修饰的核酸的RNA和/或核酸类似物。本发明中可使用的修饰例如为碱基修饰、骨架修饰等，在该技术领域中本领域技术人员所周知的。
作为本发明中使用的经修饰的核酸的例子，可列举2’-O-烷基核糖、2’-O-甲基核糖、2’-氟核糖、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、亚磷酰胺吗啉代寡聚物(PMO)、5-甲基-dC、2-氨基-dA、C5-嘧啶等修饰核苷酸。稳定的修饰核苷酸的1个优选例为2’-O-甲基修饰核苷酸。
作为本发明中使用的核酸类似物的例子，可列举锁核酸(LNA)核苷酸和/或肽核酸(PNA)等。
另外，本发明中，指导RNA中可以包含核苷酸间的硫代磷酸酯键。
1.靶标RNA序列
本发明中，“靶标RNA序列”是指作为本发明的指导RNA所编辑的靶标的RNA序列。在一个方式中，靶标RNA序列为包含腺苷、可通过将该腺苷转变(编辑)为肌苷而控制细胞功能、基因表达的任意的RNA序列。在另一方式中，靶标RNA序列为包含胞苷、可通过将该胞苷转变(编辑)为尿苷而控制细胞功能、基因表达的任意的RNA序列。靶标RNA序列可存在于包括外显子(exon)、内含子(intron)、外显子中的编码区或各种非翻译区、例如逆转录转座子、微小RNA(miRNA：microRNA)、转运RNA(tRNA：transfer RNA)、核糖体RNA(rRNA：ribosomal RNA)等在内的RNA中。靶标RNA序列也可存在于来源于病毒的RNA中。
2.反义碱基序列
本发明的指导RNA包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列(也简称为“反义碱基序列”)。本发明中，“反义碱基序列”是指具有与靶标RNA序列的一部分互补的碱基序列、并且与靶标RNA序列形成双链的序列。在一个方式中，反义碱基序列的长度为10个碱基～100个碱基、10个碱基～80个碱基、10个碱基～60个碱基、10个碱基～40个碱基、10个碱基～30个碱基，在一个方式中为15～25个碱基，在一个方式中为18～25个碱基，在一个方式中为35个碱基～40个碱基，在一个方式中为70个碱基～100个碱基。在一个方式中，反义碱基序列可包含与靶标RNA序列形成错配碱基对的碱基或与靶标RNA序列形成摇摆碱基对的碱基。
本说明书的“错配碱基对”是指G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U碱基对。本说明书的“摇摆碱基对”是指G-U、I-U、I-A、I-C碱基对。
在一个方式中，反义碱基序列为具有与靶标RNA的腺苷形成错配碱基对的碱基且与靶标RNA形成互补碱基对的、由18～25个碱基构成的碱基序列。
反义碱基序列可由本领域技术人员考虑靶标RNA的序列、碱基长度、与靶标RNA的腺苷或胞苷形成的错配碱基的位置、脱靶效应等来适宜设计。
3.短链型ADAR募集碱基序列
本发明中，“ADAR募集碱基序列”是指募集ADAR的形成茎环结构的碱基序列。“短链型ADAR募集碱基序列”是指：比由来源于GluR2的49个碱基的ADAR募集碱基序列制作的40个碱基的ADAR募集碱基序列(ARR(40)、序列号5)(专利文献4)短的ADAR募集碱基序列。短链型ADAR募集碱基序列的长度例如为14～34个碱基，在一个方式中为14、16、24或34个碱基，在一个方式中为14或16个碱基，在另一方式中为16个碱基。
本说明书中，“募集”ADAR是指与ADAR结合并将ADAR诱导至靶标RNA。本发明的短链型ADAR募集碱基序列只要可形成与ADAR结合的结构，则碱基序列没有特别限定。茎环结构也称为发夹结构，在该技术领域中是周知的。如该技术领域所熟知那样，茎环结构不需要形成完全互补的碱基对，因此茎结构部分可包含1个以上的错配碱基对、摇摆碱基对。在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列为在形成茎的双链RNA部分具有用于形成错配碱基对或摇摆碱基对的碱基且形成茎环结构的碱基序列。
短链型ADAR募集碱基序列例如可基于GluR2的mRNA前体的茎环结构(专利文献4及非专利文献4)来设计。在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列也可以通过使GluR2的mRNA前体的形成茎环结构的碱基序列中募集ADAR的碱基序列的茎部分在保持该募集功能的状态下缩短来制作。
在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列可以为从上述缩短了茎部分的碱基序列中将环部分的碱基序列替换为形成环的其它碱基序列的碱基序列。在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列也可以以GluR2的mRNA前体以外的ADAR的底物为来源。ADAR募集碱基序列的设计中可使用的ADAR的底物在该技术领域中是本领域技术人员所周知的(Biochemistry、2018、Vol.57、p.1640-1651、RNA、2011、Vol.2、p.761-771)。
短链型ADAR募集碱基序列的环结构部分的碱基序列只要是从核酸化学的观点考虑稳定地维持环结构的序列即可。在一个方式中，为由在GluR2中系统上保守的GCUMA(在此，M表示A或C)构成的碱基序列，在一个方式中为由GCUAA构成的碱基序列(BiophysicalChemistry、2013、Vol.180-181、p.110-118)。在一个方式中，环结构部分的碱基序列为形成四环折叠的碱基序列即可，在另一方式中为UUCG(ACS Chemical Biology、2006、Vol.1、p.761-765、Biophysical J.、2017、Vol.113、p.257-267)。在一个方式中环结构部分的长度为5个碱基，在一个方式中环结构部分的长度为4个碱基。
在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列由下述碱基序列构成：序列号1所示的碱基序列(ARR(14))；与序列号1所示的碱基序列的一致性为90％以上且形成茎环结构的碱基序列；或在序列号1所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～2个碱基且形成茎环结构的碱基序列。在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列由下述碱基序列构成：序列号2所示的碱基序列(ARR(16))；与序列号2所示的碱基序列的一致性为90％以上且形成茎环结构的碱基序列；或在序列号2所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～2个碱基且形成茎环结构的碱基序列。在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列由下述碱基序列构成：序列号3所示的碱基序列(ARR(24))；与序列号3所示的碱基序列的一致性为90％以上且形成茎环结构的碱基序列；或在序列号3所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列。在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列由下述碱基序列构成：序列号4所示的碱基序列(ARR(34))；与序列号4所示的碱基序列的一致性为90％以上且形成茎环结构的碱基序列；或在序列号4所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～4个碱基且形成茎环结构的碱基序列。
本说明书中，“ARR”是指ADAR募集碱基序列(ADAR Recruiting Region)。ARR后的括号内的数字表示ARR的碱基长度，例如ARR(14)表示14个碱基长度的ADAR募集碱基序列。“ASR”是指反义碱基序列(Antisense Resion)。
本说明书中，“一致性”是指通过EMBOSS NEEDLE程序(J.Mol.Biol.、1970、Vol.48、p.443-453)检索使用默认中准备的参数得到的值Identity。上述参数如下所述。
Gap Open penalty＝10
Gap Extend penalty＝0.5
Matrix＝EBLOSUM62
4.接头碱基序列
本发明的指导RNA可包含接头碱基序列。例如，通过包含接头碱基序列，能够提高后述的功能性碱基序列的功能或效率。
接头碱基序列是指连接某一碱基序列与其它碱基序列的碱基序列，可列举例如连接短链型ADAR募集碱基序列与功能性碱基序列的碱基序列等。在一个方式中，本发明的指导RNA包括选自连接短链型ADAR募集碱基序列与功能性碱基序列的接头碱基序列、连接功能性碱基序列与反义碱基序列的接头碱基序列和连接多个功能性碱基序列之间的接头碱基序列中的1种以上接头碱基序列。
在一个方式中，接头碱基序列为不与靶标RNA序列形成碱基对的碱基序列。在一个方式中，接头碱基序列为不与短链型ADAR募集碱基序列发生相互作用的碱基序列。在一个方式中，接头碱基序列为不与靶标RNA序列形成碱基对且不与短链型ADAR募集碱基序列发生相互作用的碱基序列。在一个方式中，接头碱基序列为在接头碱基序列内形成茎环结构的碱基序列。在一个方式中，接头碱基序列为具有适度的热稳定性的碱基序列。在一个方式中，接头碱基序列为能够以能够稳定地将ADAR诱导至靶标RNA序列的程度将反义碱基序列和短链型ADAR募集碱基序列固定的碱基序列。接头碱基序列可由本领域技术人员基于构成指导RNA的序列适宜地设计。例如，本发明中使用的接头碱基序列可以以不与靶标RNA序列形成互补链的方式来设计碱基序列，另外也可以以由4个～5个碱基形成小环的方式来设计。
在一个方式中，接头碱基序列的长度为15～25个碱基，在一个方式中，接头碱基序列的长度为20个碱基。在一个方式中，接头碱基序列由下述碱基序列构成：序列号10所示的碱基序列(add(20))；与序列号10所示的碱基序列的一致性为90％以上的碱基序列；或在序列号10所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～2个碱基的碱基序列。
本说明书中，“add”表示接头碱基序列。
在一个方式中，接头碱基序列为短的接头碱基序列(14个碱基以下)。在一个方式中，本发明的指导RNA可以在功能性碱基序列与反义碱基序列之间、短链型ADAR募集碱基序列与功能性碱基序列之间和/或2个以上功能性碱基序列之间包含短的接头碱基序列。在一个方式中，本发明的指导RNA可以在短链型ADAR募集碱基序列与功能性碱基序列之间包含接头碱基序列且在功能性碱基序列与反义碱基序列之间、该接头碱基序列与功能性碱基序列之间和/或2个以上功能性碱基序列之间还包含其它短的接头碱基序列。在一个方式中，短的接头碱基序列由不在同一分子内形成茎环结构的碱基序列构成。在一个方式中，短的接头碱基序列由不与靶标RNA形成互补链的碱基序列构成。在一个方式中，短的接头碱基序列的长度为1～10个碱基，在一个方式中为1～5个碱基，在一个方式中为1～3个碱基，在一个方式中为3～5个碱基，在一个方式中为3个碱基。在一个方式中，短的接头碱基序列为“UCU”。短的接头碱基序列可由本领域技术人员基于构成指导RNA的序列来适宜设计。例如，本发明中使用的短的接头碱基序列可以以不与靶标RNA形成互补链的方式及以不在接头同一分子内形成茎环结构的方式来设计。
5.功能性碱基序列
本发明的指导RNA包含至少1个功能性碱基序列。在一个方式中，本发明的指导RNA可以包含至少2个同种的功能性碱基序列，在另一方式中，可以包含至少2个不同的2种以上的功能性碱基序列。
本发明中，“功能性碱基序列”是指能够添加指导RNA的细胞内稳定化和/或细胞内的局部存在等中的任一功能的碱基序列。作为功能性碱基序列，可列举促进指导RNA的细胞内稳定化的碱基序列、促进指导RNA向核中的局部存在的碱基序列、或具有这两种功能的碱基序列。在一个方式中，本发明的指导RNA包含促进指导RNA的细胞内稳定化的碱基序列、促进指导RNA向核中的局部存在的碱基序列或这两者作为功能性碱基序列。在一个方式中，促进指导RNA的细胞内稳定化的碱基序列包含形成热力学上稳定的高级结构的碱基序列。在一个方式中，促进指导RNA向核中的局部存在的碱基序列包含来源于small RNA(小分子RNA)且促进向核中的局部存在的碱基序列。在一个方式中，功能性碱基序列包含形成热力学上稳定的高级结构的碱基序列和/或来源于small RNA且促进向核中的局部存在的碱基序列。
在一个方式中，本发明的指导RNA包含形成热力学上稳定的高级结构的碱基序列和/或来源于small RNA的碱基序列作为功能性碱基序列。热力学上稳定的高级结构只要是抑制该指导RNA的核酸酶所致的分解的结构就没有特别限定，可列举例如双链体、三链体、四链体、茎环结构。在一个方式中，作为功能性碱基序列，可列举形成鸟嘌呤四链体(Gq：G-quadroplex)结构的碱基序列(Gq序列)和/或形成茎环结构的碱基序列。在一个方式中，本发明的指导RNA包含选自Gq序列及形成茎环结构的碱基序列中的1种以上作为功能性碱基序列。Gq序列的一般结构是本领域技术人员所周知的。茎环结构也称为发夹结构，在该技术领域中是周知的。形成茎环结构的碱基序列可列举适配体序列(Int.J.Biochem.Mol.Biol.、2013、Vol.4、p.27-40)、来源于BoxB序列的碱基序列、来源于MS2序列的碱基序列、来源于PP7序列的碱基序列(Integr.Biol.、2009、Vol.1、p.499-505、Nucleic Acids Research、2016、Vol.44、p.9555-9564)等。在一个方式中，本发明的指导RNA包含来源于BoxB序列的碱基序列作为功能性碱基序列。在一个方式中，来源于smallRNA的碱基序列包括U6核内小分子(sn：small nuclear)RNA序列。
在一个方式中，本发明中使用的功能性碱基序列为Gq序列、U6 snRNA序列、来源于BoxB序列的碱基序列、来源于MS2序列的碱基序列、来源于PP7序列的碱基序列、或它们的任意一种组合。在一个方式中，本发明中使用的功能性碱基序列为Gq序列、U6 snRNA序列和/或来源于BoxB序列的碱基序列、或它们的任意一种组合。
本发明中使用的Gq序列为包含4个连续的由鸟嘌呤构成的重复单元的序列，4个鸟嘌呤形成平面上的四链体(Gq)结构。只要维持Gq结构，则在由鸟嘌呤构成的重复单元彼此之间可以包含鸟嘌呤以外的碱基。在一个方式中，Gq序列包含1、2、3或4个由鸟嘌呤构成的重复单元，分别形成1、2、3或4层的Gq。在一个方式中，Gq序列包含3个由鸟嘌呤构成的重复单元，形成3层的Gq。将其称为“3层的鸟嘌呤四链体结构”(本说明书中也称为“3Gq”)。在一个方式中，本发明的指导RNA包含3Gq作为功能性碱基序列，在一个方式中，形成3Gq的碱基序列由下述碱基序列构成：序列号6所示的碱基序列；或在序列号6所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成Gq结构的碱基序列。
本发明中使用的U6 snRNA序列为由U6 snRNA的碱基序列构成的序列。本发明的指导RNA中，U6 snRNA序列只要具有促进指导RNA向核中的局部存在的功能则可以将U6 snRNA序列连接于短链型ADAR募集碱基序列和/或反义碱基序列来使用、或者将短链型ADAR募集碱基序列及反义碱基序列插入U6 snRNA序列中来使用。在将反义碱基序列及短链型ADAR募集碱基序列插入U6 snRNA序列中来使用的情况下，将U6 snRNA序列分为任意的2个区域(将5’侧称为“上游区域”、将3’侧称为“下游区域”)并且在其间插入反义碱基序列及短链型ADAR募集碱基序列来使用。包含U6 snRNA序列的本发明的指导RNA的一个方式中，在U6snRNA序列的上游区域与U6 snRNA序列的下游区域之间配置反义碱基序列及ADAR募集碱基序列，将U6 snRNA序列的上游区域、反义碱基序列及ADAR募集碱基序列、以及U6 nRNA序列的下游区域按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接。在一个方式中，本发明中使用的U6snRNA序列的上游区域的碱基序列由下述碱基序列构成：序列号8所示的碱基序列(也称为“U6 upstream”)；或包含在序列号8所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基的碱基序列、并且在与U6 snRNA序列的下游区域的序列一起使用时具有促进指导RNA向核中的局部存在的功能的碱基序列。在一个方式中，本发明中使用的U6 snRNA序列的下游区域的碱基序列由下述碱基序列构成：序列号9所示的碱基序列(也称为“U6downstream”)；或在序列号9所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基、并且在与U6 snRNA序列的上游区域的序列一起使用时具有促进指导RNA向核中的局部存在的功能的碱基序列。
在一个方式中，本发明中使用的来源于BoxB序列的序列由下述碱基序列构成：序列号7所示的碱基序列(也称为“BoxB”)；与序列号7所示的碱基序列的一致性为90％以上且形成茎环结构的碱基序列；或在序列号7所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列。
对于功能性碱基序列，有时将形成Gq结构、形成茎环结构以及在与U6 snRNA序列的上游区域或下游区域的序列一起使用时具有促进指导RNA向核中的局部存在的功能统称为“具有功能”。
功能性碱基序列对指导RNA的功能可以通过公知的方法来确认。指导RNA的稳定化例如可以通过参考实施例1及2中记载的方法来确认，但是没有特别限定。可认为，指导RNA的稳定化能够使包含该指导RNA、编码该指导RNA的核酸、表达载体的药物组合物的用量低。
6.用于编辑靶标RNA序列的指导RNA
本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA是包含与该靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA。构成指导RNA的各序列可以分别直接连接或者也可以通过接头碱基序列间接连接。
在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列与至少1个功能性碱基序列通过接头碱基序列连接。在一个方式中，至少1个功能性碱基序列与反义碱基序列通过接头碱基序列连接。在一个方式中，2个以上的功能性碱基序列通过接头碱基序列连接。在一个方式中，可以是短链型ADAR募集碱基序列与至少1个功能性碱基序列通过接头碱基序列连接，并且功能性碱基序列与反义碱基序列、该接头碱基序列与功能性碱基序列、和/或2个以上的功能性碱基序列通过其它短的接头碱基序列连接。
在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA为以下的任一指导RNA：
与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接的指导RNA；
与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接且在反义碱基序列的5’侧还连接有至少1个功能性碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列且在短链型ADAR募集碱基序列上通过接头碱基序列连接有至少1个功能性碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列且反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接的指导RNA；或者
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列且反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接、且在反义碱基序列的5’侧还连接有至少1个功能性碱基序列的指导RNA。
在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA为以下的任一指导RNA：
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个与指导RNA的细胞内稳定化和/或细胞内的局部存在有关的碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列和/或形成茎环结构的碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个U6 snRNA序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个形成1～4层的鸟嘌呤四链体结构的碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个形成茎环结构的碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个来源于BoxB序列的碱基序列的指导RNA；或者
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个由序列号6、7、8或9所示的碱基序列或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有功能的碱基序列构成的功能性碱基序列的指导RNA。
在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA为以下的任一指导RNA：
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、由14～34个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、由16个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、包含由4～5个碱基构成的环部分的由14～34个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、包含由4～5个碱基构成的环部分的由16个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、茎部分具有形成错配碱基对的碱基的由14～34个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA；
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、茎部分具有形成错配碱基对的碱基的由16个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA。
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、环部分由4～5个碱基构成且茎部分具有形成错配碱基对的碱基的由14～34个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA；或者
包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、环部分由4～5个碱基构成且茎部分具有形成错配碱基对的碱基的由16个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA。
在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA是包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、由序列号1、2、3或4所示的碱基序列、或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成的短链型ADAR募集碱基序列、以及至少1个功能性碱基序列的指导RNA。
在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA是包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、由15～25个碱基构成的接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA。在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA是包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、由15～25个碱基构成且可具有茎环结构的接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA。
在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA是包含如下碱基序列的指导RNA：与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列；由序列号1(ARR14)、序列号2(ARR16)、序列号3(ARR24)或序列号4(ARR34)所示的碱基序列、或者在序列号1、2、3或4所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成的短链型ADAR募集碱基序列；以及由序列号6(3Gq)、序列号7(BoxB)或序列号8(U6 upstream)及序列号9(U6 downstream)所示的碱基序列、或者在序列号6、7、8或9所示的碱基序列中的任一碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有功能的碱基序列构成的至少1个功能性碱基序列。
在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA是包含如下碱基序列的指导RNA：与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列；由序列号1(ARR14)、序列号2(ARR16)、序列号3(ARR24)或序列号4(ARR34)所示的碱基序列、或者在序列号1、2、3或4所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成的短链型ADAR募集碱基序列；由序列号10所示的碱基序列(add(20))、或者在序列号10所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成的接头碱基序列；以及由序列号6(3Gq)、序列号7(BoxB)或序列号8(U6 upstream)及序列号9(U6downstream)所示的碱基序列、或者在序列号6、7、8或9所示的碱基序列中的任一碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有功能的碱基序列构成的至少1个功能性碱基序列。
在一个方式中，本发明的用于编辑靶标RNA序列的指导RNA是包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA，其具有以下的任一特征：
(1)与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列连接于短链型ADAR募集碱基序列的5’侧；
(2)与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列连接于短链型ADAR募集碱基序列的5’侧，功能性碱基序列连接于短链型ADAR募集碱基序列的3’侧；
(3)与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列连接于短链型ADAR募集碱基序列的5’侧，功能性碱基序列连接于该反义碱基序列的5’侧；或者
(4)与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列连接于短链型ADAR募集碱基序列的5’侧，功能性碱基序列连接于该反义碱基序列的5’侧和短链型ADAR募集碱基序列的3’侧这两侧。
具有上述(1)～(4)的任一特征的本发明的指导RNA可包含接头碱基序列，本发明的指导RNA中，反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列及功能性碱基序列彼此可以直接连接或通过接头碱基序列连接。在一个方式中，短链型ADAR募集碱基序列和功能性碱基序列通过接头碱基序列连接。
具有上述(1)～(4)的任一特征的本发明的指导RNA中，短链型ADAR募集碱基序列在一个方式中为由14～34个碱基构成的ADAR募集碱基序列，在一个方式中为由16个碱基构成的ADAR募集碱基序列，在一个方式中由序列号1、2、3或4所示的碱基序列、或者在序列号1、2、3或4所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成。
在一个方式中，具有上述(1)～(4)的任一特征的本发明的指导RNA包含选自Gq序列、来源于BoxB序列的序列及U6 snRNA序列中的至少1个功能性碱基序列。在一个方式中，具有上述(1)～(4)的任一特征的本发明的指导RNA包含选自下述中的至少1个功能性碱基序列作为功能性碱基序列：由序列号6所示的碱基序列、或者在序列号6所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成Gq结构的碱基序列构成的Gq序列；由序列号7所示的碱基序列、或者在序列号7所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成的来源于BoxB序列的序列；或者包含由序列号8所示的碱基序列或者在序列号8所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且在与U6 snRNA序列的下游区域的序列一起使用时具有促进指导RNA向核中的局部存在的功能的碱基序列、以及由序列号9所示的碱基序列或者在序列号9所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且在与U6 snRNA序列的上游区域的序列一起使用时具有促进指导RNA向核中的局部存在的功能的碱基序列的组合的U6 snRNA序列。
＜制造本发明的指导RNA的方法＞
本发明的指导RNA可以基于序列信息使用该领域中公知的标准的多核苷酸合成法来合成。另外，若取得本发明的某一指导RNA，则也可以使用定点诱变法(CurrentProtocols in Molecular Biology、1987、John Wiley&Sons Section)等本领域技术人员公知的方法向规定位点导入突变，从而制作维持了向靶标RNA序列的诱导功能及靶标RNA序列编辑功能的其它的本发明的指导RNA。本发明的指导RNA也可以使用经化学修饰的核酸来制造。
＜本发明中使用的ADAR＞
本发明中使用的ADAR包括天然存在的ADAR，只要具有脱氨酶活性则也包括其改造体。本发明中使用的ADAR在一个方式中为来源于真核生物的ADAR，在另一方式中为来源于哺乳动物的ADAR。本发明中使用的ADAR在一个方式中为人ADAR，在一个方式中为ADAR1或ADAR2，在一个方式中为ADAR2。ADAR1包括两种剪接变体ADAR1 p110、ADAR1 p150，本发明中使用的ADAR在一个方式中为ADAR1 p110或ADAR1 p150。本发明中使用的ADAR在一个方式中为人ADAR1或人ADAR2，在一个方式中为人ADAR2。
本发明中使用的ADAR在一个方式中为包含双链RNA结合区域(dsRBD)且具有脱氨酶活性的多肽(Trends in Biochemical Sciences、2001、Vol.26、p.376-384、RNA、2001、Vol.7、p.846-858)。
在一个方式中，本发明中使用的ADAR为包含腺苷脱氨酶结构域且被本发明的指导RNA募集的多肽。在另一方式中，本发明中使用的ADAR为包含脱氨酶结构域且能够将靶标RNA的胞苷转变为尿苷的多肽。
本发明中使用的ADAR可以为与其它因子的融合蛋白。本发明中使用的ADAR的改造体包括具有腺苷脱氨酶活性的改造体、具有胞苷脱氨酶活性的改造体、具有识别腺苷和胞苷两者且将其分别转变为肌苷和尿苷的脱氨酶活性的改造体。本发明中使用的ADAR的改造体可以为与其它因子的融合蛋白。
在一个方式中，本发明中使用的ADAR为由登录号[NP_001103.1]、登录号[NP_056648.1]或登录号[NP_001102.3]所示的氨基酸序列构成的多肽、或者由与这些氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列或在这些氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性的多肽。在一个方式中，本发明中使用的ADAR为由序列号12所示的氨基酸序列(人ADAR2)构成的多肽、或者由与该序列的一致性为90％以上的氨基酸序列或在该序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性的多肽。在一个方式中，本发明中使用的ADAR为真核细胞中内源性存在的ADAR，在一个方式中，可以为外源性导入到真核细胞中的ADAR。ADAR向真核细胞的导入既可以直接导入ADAR多肽，也可以导入包含编码ADAR的核酸的表达载体。
＜本发明的靶标RNA序列编辑系统＞
另外，本发明提供包含本发明的指导RNA及ADAR的编辑靶标RNA序列的系统。包含本发明的指导RNA及ADAR的编辑靶标RNA序列的系统包括包含本发明的指导RNA及ADAR的用于编辑靶标RNA序列的试剂盒、或使用本发明的指导RNA及ADAR编辑靶标RNA序列的方法。本发明的靶标RNA序列编辑系统为包含指导RNA和ADAR的系统，所述指导RNA包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。在一个方式中，本发明的靶标RNA序列编辑系统为包含指导RNA以及人ADAR1或人ADAR2的系统，所述指导RNA包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。本发明的靶标RNA序列编辑系统可以在细胞内使用，也可以在细胞外使用。在一个方式中，可以在真核细胞内使用。
＜编码本发明的指导RNA的核酸＞
编码本发明的指导RNA的核酸是编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸。指导RNA中所含的各序列可以直接连接，或者，也可以通过接头碱基序列间接连接。
在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为以下的任一核酸：
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接的指导RNA的核酸；
编码与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接、进一步在反义碱基序列的5’侧还连接有至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列且在短链型ADAR募集碱基序列上通过接头碱基序列连接有至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列且反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接的指导RNA的核酸；或者
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列且反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接、进一步在反义碱基序列的5’侧连接有至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸。
在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为以下的任一核酸：
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个与指导RNA的细胞内稳定化和/或细胞内的局部存在有关的碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列和/或形成茎环结构的碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个U6 snRNA序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个形成1～4层的鸟嘌呤四链体结构的碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个形成茎环结构的碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个来源于BoxB序列的碱基序列的指导RNA的核酸；或者
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列以及至少1个由序列号6、7、8或9所示的碱基序列或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有功能的碱基序列构成的功能性碱基序列的指导RNA的核酸。
在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为以下的任一编码指导RNA的核酸：
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、由14～34个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、由16个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、包含由4～5个碱基构成的环部分的由14～34个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、包含由4～5个碱基构成的环部分的由16个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；或者
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、茎部分具有形成错配碱基对的碱基的由14～34个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、茎部分具有形成错配碱基对的碱基的由16个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、环部分由4～5个碱基构成且茎部分具有形成错配碱基对的碱基的由14～34个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸；或者
编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、环部分由4～5个碱基构成且茎部分具有形成错配碱基对的碱基的由16个碱基构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸。
在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、由序列号1、2、3或4所示的碱基序列、或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成的短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸。
在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、由15～25个碱基构成且可具有茎环结构的接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸。
在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为编码下述指导RNA的核酸，所述指导RNA包含：与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列；由序列号1、2、3或4所示的碱基序列、或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成的短链型ADAR募集碱基序列；作为由序列号10所示的碱基序列、或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基的碱基序列的接头碱基序列；以及至少1个由序列号6、7、8或9所示的碱基序列、或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有功能的碱基序列构成的功能性碱基序列。
在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为含有编码包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA的核酸、并且编码短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列的核酸分别由以下所示的碱基序列、或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基的碱基序列构成的核酸。
编码短链型ADAR募集碱基序列的核酸序列
编码ARR(16)的核酸：序列号13
编码接头碱基序列的核酸序列
编码add(20)的核酸：序列号14
编码功能性碱基序列的核酸
编码3Gq的核酸：序列号15
编码BoxB的核酸：序列号16
编码U6 upstream的核酸：序列号17
编码U6 downstream的核酸：序列号18
编码本发明的指导RNA的核酸例如为DNA或经改造的DNA，在一个方式中为DNA。
在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为整合到表达载体中的核酸。在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为整合到质粒载体中的核酸。在一个方式中，编码本发明的指导RNA的核酸为整合到病毒载体中的核酸。
＜编码本发明中使用的ADAR的核酸＞
编码本发明中使用的ADAR的核酸为编码上述＜本发明中使用的ADAR＞中记载的ADAR的核酸。在一个方式中，编码本发明中使用的ADAR的核酸为由编码登录号[NP_001103.1]、登录号[NP_056648.1]或登录号[NP_001102.3]所示的氨基酸序列的碱基序列构成的核酸或者由编码下述多肽的碱基序列构成的核酸，所述多肽由与这些中的至少1个序列的一致性为90％以上的氨基酸序列或在这些中的至少1个序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性。在一个方式中，编码本发明中使用的ADAR的核酸为由序列号11所示的碱基序列构成的核酸、或者由与该序列的一致性为90％以上的碱基序列或在该序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～10个碱基的碱基序列构成且编码具有腺苷脱氨酶活性的多肽的核酸。
＜本发明的表达载体＞
另外，本发明提供包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体(也称为“本发明的表达载体”)。本发明的表达载体中可以还包含编码ADAR的核酸。编码本发明的指导RNA的核酸及编码本发明中使用的ADAR的核酸可以搭载于同一表达载体中，也可以搭载于不同的表达载体中。在一个方式中，本发明的表达载体为包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体与包含编码ADAR的核酸的表达载体的组合。在一个方式中，本发明的表达载体为包含编码本发明的指导RNA的核酸及编码ADAR的核酸的表达载体。
1.本发明中使用的表达载体
作为本发明中使用的表达载体，只要是能够由编码本发明的指导RNA的核酸表达本发明的指导RNA的表达载体和/或能够表达本发明中使用的ADAR的表达载体就没有特别限制。在一个方式中，本发明中使用的表达载体为能够用于在人细胞中表达本发明的指导RNA和/或能够用于表达本发明中使用的ADAR的表达载体。在一个方式中，作为本发明中使用的表达载体的例子，可列举质粒载体、病毒载体(例如腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体)等。
2.启动子
本发明的表达载体可包含以可操作方式连接于编码本发明的指导RNA的核酸和/或编码本发明中使用的ADAR的核酸的启动子。本说明书中，“以可操作方式连接”是指：至少1个启动子以能够在宿主细胞中表达核酸所编码的多肽或RNA的方式连接于核酸。
作为本发明的表达载体中所含的启动子，没有特别限定，可使用与适合于表达编码本发明的指导RNA或本发明中使用的ADAR的核酸的RNA聚合酶(例如polII、polIII)对应的启动子。为了表达本发明的指导RNA，作为一个方式，可使用与polII或polIII对应的启动子，作为另一方式，可使用与polIII对应的启动子。为了表达本发明中使用的ADAR，作为一个方式，可使用与polII对应的启动子。
作为与polII对应的启动子，可列举例如来源于CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)的启动子、SV40(simian virus 40，猴病毒40)启动子、RSV(respiratory syncytialvirus，呼吸道合胞病毒)启动子、EF1α(Elongation factor 1α，延伸因子1α)启动子、CAG启动子等。作为与polIII对应的启动子，可列举例如人U6核内小分子RNA(snRNA)启动子(U6)(Nat.Biotechnol.、2002、Vol.20、p.497-500)、高灵敏度U6启动子(Nucleic AcidsResearch、2003、Vol.31、p.e100)、人H1启动子、以及本领域技术人员公知的其它的病毒及真核细胞启动子，但是不限于这些。
本发明的表达载体可根据所使用的启动子、宿主细胞等还包含翻译起始密码子、翻译终止密码子、polIII的转录起始位点所优选的嘌呤碱基(G或A)、polyA信号、用于polIII的连续T的终止子序列、增强子、非翻译区、剪接接合部等。
3.本发明的表达载体
本发明的表达载体为包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体。在一个方式中，本发明的表达载体为包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体与包含编码ADAR的核酸的表达载体的组合。在一个方式中，本发明的表达载体为包含编码本发明的指导RNA的核酸及编码ADAR的核酸的表达载体。
本发明的表达载体为包含编码指导RNA的核酸的表达载体，所述指导RNA包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。
在一个方式中，本发明的表达载体为包含编码指导RNA的核酸的表达载体，所述指导RNA包含与靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列。
＜本发明的宿主细胞＞
另外，本发明提供被导入了编码本发明的指导RNA的核酸的宿主细胞(也称为“本发明的宿主细胞”)。在一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体的宿主细胞。在一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了包含编码本发明的指导RNA的核酸及编码ADAR的核酸的表达载体的宿主细胞。在一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体及包含编码ADAR的核酸的表达载体的宿主细胞。在一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了作为质粒载体的本发明的表达载体的宿主细胞。在一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了用于制造作为病毒载体的本发明的表达载体的质粒载体的宿主细胞。
作为被导入本发明的表达载体的宿主细胞，没有特别限定，只要是在编码本发明的指导RNA的核酸的复制中能够使用的细胞则可以选择该领域中公知的细胞。作为在载体的复制中能够使用的宿主细胞，可列举例如本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞。作为在载体的复制中能够使用的宿主细胞，可列举例如动物细胞(例如CHO细胞、HEK293细胞等)、昆虫细胞(例如Sf9细胞等)、细菌(大肠杆菌等)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)等)。作为一个方式，可以使用大肠杆菌作为宿主细胞。导入本身可以通过公知的方法来实施(Green,M.R.and Sambrook,J.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,4th Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)。
＜编码本发明的指导RNA的核酸及本发明的表达载体的制造方法＞
编码本发明的指导RNA的核酸(以下也称为本发明的核酸)可以基于本说明书中记载的序列或可以公用的序列信息使用该领域中公知的标准的多核苷酸合成法来合成。另外，若取得某一本发明的核酸，则还可以通过使用定点诱变法(Current Protocols inMolecular Biology、1987、John Wiley&Sons Section)等本领域技术人员公知的方法向规定位点导入突变而制作其它本发明的核酸。
本发明包括生产核酸或表达载体的方法，其包括对导入了本发明的核酸或包含本发明的核酸的表达载体的宿主细胞进行培养的步骤。在一个方式中，生产本发明的核酸的方法包括对导入了本发明的核酸的宿主细胞进行培养而复制本发明的核酸的步骤。在一个方式中，生产本发明的核酸及表达载体的方法包括对导入了包含本发明的核酸的表达载体的宿主细胞进行培养而复制本发明的表达载体的步骤。在本发明的表达载体为病毒载体的情况下，制造本发明的表达载体的方法包括如下步骤：对导入了用于产生包含本发明的核酸的病毒载体的质粒载体的宿主细胞或导入了包含本发明的核酸的病毒载体的宿主细胞进行培养，对宿主细胞内制作的病毒载体进行纯化。病毒载体可通过本领域技术人员公知的方法来制作。
生产本发明的核酸及本发明的表达载体的方法可包括回收宿主细胞的培养液、得到裂解物(溶菌液)的步骤。裂解物例如可通过用碱溶解法或煮沸法对回收的培养液进行处理而得到。生产本发明的核酸及表达载体的方法可包括进一步从裂解物中纯化核酸或表达载体的步骤。从裂解物中纯化核酸或表达载体时，可使用离子交换色谱和/或疏水相互作用色谱。
在本发明的表达载体为病毒载体的情况下，从裂解物中纯化病毒载体时，也可使用氯化铯密度梯度离心分离法、蔗糖梯度离心分离法、碘克沙醇(Iodixanol)密度梯度离心分离法、超滤法、透滤法、亲和色谱法、离子交换色谱法、聚乙二醇沉淀法、硫酸铵沉淀法等。
＜本发明的药物组合物＞
另外，本发明提供一种药物组合物(也称为“本发明的药物组合物”)，其包含本发明的指导RNA、本发明的核酸或本发明的表达载体、以及药学上可接受的赋形剂。
在一个方式中，本发明的药物组合物为包含本发明的指导RNA及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个方式中，本发明的药物组合物为包含本发明的指导RNA、ADAR及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一个方式中，本发明的药物组合物为包含本发明的核酸及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个方式中，本发明的药物组合物为包含本发明的核酸、ADAR及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一个方式中，本发明的药物组合物为包含本发明的表达载体及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个方式中，本发明的药物组合物为包含含有编码本发明的指导RNA的核酸及编码ADAR的核酸的表达载体、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个方式中，本发明的药物组合物为包含含有编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体、含有编码ADAR的核酸的载体及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一个方式中，本发明的药物组合物为包含含有编码本发明的指导RNA的核酸及编码人ADAR1或人ADAR2的核酸的表达载体、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个方式中，本发明的药物组合物为包含含有编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体、含有编码人ADAR1或人ADAR2的核酸的载体及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个方式中，本发明的药物组合物为包含含有编码本发明的指导RNA的核酸和编码ADAR的核酸的表达载体、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述编码ADAR的核酸由编码序列号12所示的氨基酸序列的碱基序列、或者编码由与该氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性的多肽的碱基序列构成。在一个方式中，本发明的药物组合物为含有包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体、包含编码ADAR的核酸的表达载体、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述编码ADAR的核酸由编码序列号12所示的氨基酸序列的碱基序列、或者编码由与该氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性的多肽的碱基序列构成。
本发明的药物组合物可以使用该领域中通常使用的赋形剂、即药剂用赋形剂、药剂用载体等利用通常使用的方法来制备。作为这些药物组合物的剂型的例子，可列举例如注射剂、点滴用剂等非经口剂，可以通过静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药等进行给药。在制剂化时，可以以药学上可接受的范围使用与这些剂型对应的赋形剂、载体、添加剂等。
本发明的指导RNA、本发明的核酸、包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体、或包含编码本发明的指导RNA的核酸及编码ADAR的核酸的表达载体的给药量根据患者的症状程度、年龄、使用的制剂的剂型等而不同，可以使用例如0.001mg/kg～100mg/kg左右。另外，可以添加与这样的给药量对应的量的本发明的指导RNA、本发明的核酸、包含编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体、或包含编码本发明的指导RNA的核酸及编码ADAR的核酸的表达载体并制剂化。
本发明中使用的ADAR或包含编码ADAR的核酸的表达载体可根据靶标RNA所在的细胞等来适宜调整给药量。例如，可以使用0.001mg/kg～100mg/kg左右。
关于能够用本发明的指导RNA、核酸或表达载体预防或治疗的疾病，一个方式为遗传性疾病，一个方式为靶标RNA中的1个以上腺苷或胞苷的修饰带来有益变化的任意疾病。本发明的药物组合物可用作靶标RNA中的1个以上腺苷或胞苷的修饰带来有益变化的任意疾病的预防或治疗剂。另外，本发明的药物组合物可用作靶标RNA中的1个以上腺苷的修饰带来有益变化的任意疾病的预防或治疗剂。
本发明包括一种靶标RNA中的1个以上腺苷或胞苷的修饰带来有益变化的任意疾病的预防或治疗用药物组合物，其包含本发明的指导RNA、本发明的核酸或本发明的表达载体。另外，本发明包括一种预防或治疗靶标RNA中的1个以上腺苷或胞苷的修饰带来有益变化的任意疾病的方法，其包括给药预防有效量或治疗有效量的本发明的指导RNA、本发明的核酸或本发明的表达载体的步骤。另外，本发明包括用于预防或治疗靶标RNA中的1个以上腺苷或胞苷的修饰带来有益变化的任意疾病的、本发明的指导RNA、本发明的核酸或本发明的表达载体。另外，本发明包括本发明的指导RNA、本发明的核酸或本发明的表达载体在制造靶标RNA中的1个以上腺苷或胞苷的修饰带来有益变化的任意疾病的预防或治疗用药物组合物中的应用。
＜使用本发明的指导RNA的靶标RNA序列的编辑方法＞
另外，本发明提供一种编辑靶标RNA的方法(也称为“本发明的编辑方法”)，其使用本发明的指导RNA。在一个方式中，本发明的编辑方法包括下述方法：使靶标RNA序列与本发明的指导RNA反应而形成复合物，被该指导RNA募集的ADAR将靶标RNA序列的腺苷转变为肌苷。在此，被转变为肌苷的靶标RNA序列上的腺苷可以与反义碱基序列形成错配碱基对。在一个方式中，本发明的编辑方法包括下述方法：使靶标RNA序列与本发明的指导RNA反应而形成复合物，被该指导RNA募集的ADAR将靶标RNA序列的胞苷转变为尿苷。在此，被转变为尿苷的靶标RNA序列上的胞苷可以与反义碱基序列形成错配碱基对。
该编辑方法包括：(i)将包含与该靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列的指导RNA或编码该指导RNA的核酸导入到细胞中的步骤；(ii)该指导RNA募集ADAR的步骤；(iii)靶标RNA序列与该指导RNA形成复合物的步骤；(iv)被该指导RNA募集的ADAR将靶标RNA序列的腺苷转变为肌苷的步骤或将靶标RNA序列的胞苷转变为尿苷的步骤。该编辑方法可以包括将ADAR或编码ADAR的核酸与该指导RNA或编码该指导RNA的核酸同时或分别导入到细胞中的步骤。
该编辑方法包括在细胞中、一个方式中在真核细胞中、一个方式中在哺乳动物细胞中将靶标RNA序列的腺苷转变为肌苷的方法或将靶标RNA序列的胞苷转变为尿苷的方法。另外，在靶标RNA序列位于编码区的情况下，可以包括在翻译时将肌苷读取为鸟苷的步骤。
实施例
在没有特别声明的情况下，以下的实施例中记载的步骤可按照公知方法来实施。另外，只要没有特别声明则使用市售的试剂盒或试剂等的步骤按照所附带的规程来进行实验。
实施例1包含Gq序列和/或来源于BoxB序列的序列作为功能性碱基序列的指导RNA表达质粒的制作
以下述方式制作包含Gq序列和/或来源于BoxB序列的序列作为功能性碱基序列且包含ARR(16)作为ADAR募集碱基序列的指导RNA表达质粒。使用限制酶BglII(5’侧)及HindIII(3’侧)在pSUPER.neo载体(Oligoengine公司、产品目录编号VEC-PBS-0004)的H1RNA聚合酶III启动子(以下称为“H1启动子”)的下游插入6种编码指导RNA的DNA序列(参照后述的＜指导RNA的名称和编码其的DNA序列号＞)。在制作要插入的DNA序列时，利用DNA合成(ファスマック公司、Thermo Fisher Scientific公司)或对以形成限制酶末端的方式合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(下述)进行退火的方法中的任一种来制作。
正向寡核苷酸：5’-GATC-除限制酶识别序列以外的编码指导RNA的DNA序列-3’
反向寡核苷酸：5’-AGCT-除限制酶识别序列以外的编码指导RNA的DNA序列的反向互补序列-3’
将制作的指导RNA表达质粒统称为pSUPERneo_H1ADg。
＜指导RNA的名称和编码其的DNA序列号＞
ASR(24)-ARR(16)add-3Gq：序列号19
ASR(24)-ARR(16)add-BoxB：序列号20
BoxB-ASR(24)-ARR(16)add-3Gq：序列号21
ASR(24)-ARR(16)-3Gq：序列号22
ASR(24)-ARR(16)-BoxB：序列号23
BoxB-ASR(24)-ARR(16)-3Gq：序列号24
DNA序列中，在5’侧包含polIII的转录起始位点所优选的嘌呤碱基(G或A)且在3’侧包含polIII的终止子序列。另外，DNA序列中，分别在5’末端和3’末端包含用于载体克隆的限制酶BglII识别序列(AGATCT)和限制酶HindII识别序列(AAGCTT)。
在此，ASR(24)表示与实施例3中使用的检测用报告基因mRNA(Rluc-W104X)的一部分互补的由24个碱基构成的反义碱基序列，由序列号19所示的序列的碱基编号10至33的DNA序列所编码的RNA序列构成。ARR(16)由序列号2所示的RNA序列构成，编码ARR(16)的核酸由序列号13所示的DNA序列构成。add由序列号10所示的RNA序列构成，编码add的核酸由序列号14所示的DNA序列构成。3Gq由序列号6所示的RNA序列构成，编码3Gq的核酸由序列号15所示的DNA序列构成。BoxB由序列号7所示的RNA序列构成，编码BoxB的核酸由序列号16所示的DNA序列构成。
将编码各指导RNA的DNA序列的概要示于表1。表1中，“5’-”表示5’侧功能性碱基序列，“3’-”表示3’侧功能性碱基序列。序列号表示编码指导RNA的DNA序列号。
用pSUPERneo_H1ADg质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物公司、产品目录编号9057、以下称为“DH5α大肠杆菌株”。)或OneShot Stbl3化学感受态大肠杆菌(ThermoFisher Scientific公司、产品目录编号C737303、以下称为“Stbl3大肠杆菌株”。)，进行液体培养。对培养液进行离心，回收菌体，用NucleoBond(注册商标)Xtra Midi Plus EF(宝生物公司、产品目录编号U0422B)进行质粒提取纯化，得到经扩增的pSUPERneo_H1ADg质粒。
需要说明的是，对照用或比较例用的指导RNA表达质粒也使用编码指导RNA的DNA序列(下述)与上述同样地制作。
＜指导RNA的名称和编码其的DNA序列号(对照)＞
ASR(24)-ARR(40)：序列号27
＜指导RNA的名称和编码其的DNA序列号(比较例)＞
ASR(24)-ARR(16)add：序列号28
ASR(24)-ARR(16)：序列号29
ASR(24)-ARR(40)add：序列号30
ASR(24)-ARR(40)add-3Gq：序列号31
ASR(24)-ARR(40)add-BoxB：序列号32
BoxB-ASR(24)-ARR(40)add-3Gq：序列号33
ASR(24)-ARR(40)-3Gq：序列号35
ASR(24)-ARR(40)-BoxB：序列号36
BoxB-ASR(24)-ARR(40)-3Gq：序列号37
DNA序列中，在5’侧包含polIII的转录起始位点所优选的嘌呤碱基(G或A)且在3’侧包含polIII的终止子序列。另外，DNA序列中，分别在5’末端和3’末端包含用于载体克隆的限制酶BglII识别序列(AGATCT)和限制酶HindIII识别序列(AAGCTT)。
将编码各指导RNA的DNA序列的概要示于表1。
实施例2添加了U6 snRNA序列的指导RNA表达质粒的制作
构建将pSUPER.neo载体的H1启动子序列置换为人U6 RNA聚合酶III(hU6)启动子序列(序列号39)的载体(以下称为pSUPER.neo-U6载体)。对于包含hU6启动子序列的片段，以具有hU6启动子的pBAsi-hU6 Neo DNA(宝生物公司、产品目录编号3227)为模板，使用在5’侧添加了EcoRI且在3’侧添加了BglII的各限制酶位点的引物，使用标准PCR法进行扩增。反应中使用Tks Gflex DNA聚合酶(宝生物公司、产品目录编号R060A)。使用限制酶EcoRI(5’侧)及BglII(3’侧)将得到的hU6启动子片段插入到pSUPER.neo载体中。将构建的pSUPER.neo-U6载体用DH5α大肠杆菌株或Stbl3大肠杆菌株扩增。
以下述方式构建添加了U6 snRNA序列的指导RNA表达质粒。使用限制酶BglII(5’侧)及HindIII(3’侧)在pSUPER.neo-U6载体的hU6启动子下游插入2种编码指导RNA的DNA序列(下述)。插入的DNA序列使用与实施例1相同的方法来制作。
＜指导RNA的名称和编码其的DNA序列号＞
U6 upstream-ASR(24)-ARR(16)add-U6 downstream：序列号25
U6 upstream-ASR(24)-ARR(16)-U6 downstream：序列号26
DNA序列中，在5’侧包含polIII的转录起始位点所优选的嘌呤碱基(G或A)且在3’侧包含polIII的终止子序列。另外，DNA序列中，分别在5’末端和3’末端包含用于载体克隆的限制酶BglII识别序列(AGATCT)和限制酶HindIII识别序列(AAGCTT)。
U6 upstream由序列号8所示的RNA序列构成，编码U6 upstream的核酸由序列号17所示的DNA序列构成。U6 downstream由序列号9所示的RNA序列构成，编码U6 downstream的核酸由序列号18所示的DNA序列构成。
将得到的质粒统称为pSUPERneo_U6ADg。将构建的pSUPERneo_U6ADg质粒使用DH5α大肠杆菌株或Stbl3大肠杆菌株利用与实施例1相同的方法进行扩增。
将编码各指导RNA的DNA序列的概要示于表1。
需要说明的是，比较用的指导RNA表达质粒也使用编码指导RNA的DNA序列(下述)与上述同样地制作。
＜指导RNA序列的名称和编码其的DNA序列号(比较例)＞
U6 upstream-ASR(24)-ARR(40)add-U6 downstream：序列号34
U6 upstream-ASR(24)-ARR(40)-U6 downstream：序列号38
DNA序列中，在5’侧包含polIII的转录起始位点所优选的嘌呤碱基(G或A)且在3’侧包含polIII的终止子序列。另外，DNA序列中，分别在5’末端和3’末端包含用于载体克隆的限制酶BglII识别序列(AGATCT)和限制酶HindIII识别序列(AAGCTT)。
将编码各指导RNA的DNA序列的概要示于表1。
[表1]
Figure BDA0003491900150000431
实施例3细胞内靶标RNA编辑活性检测用报告基因mRNA表达质粒的制作
作为用于检测细胞内靶标RNA编辑活性的报告基因mRNA，使用海肾荧光素酶(Renilla Luciferase：Rluc)mRNA。细胞内靶标RNA编辑活性检测用报告Rluc mRNA(Rluc-W104X)基于psiCHECK-2载体(プロメガ公司、产品目录编号C8021)中搭载的Rluc基因所编码的Rluc mRNA序列来设计。具体而言，Rluc-W104X以编码Rluc的第104位的氨基酸Trp的UGG的第311位的G被置换为A、从而编码翻译终止密码子(UAG)来代替编码Trp的方式来设计。在psiCHECK-2载体(プロメガ公司、产品目录编号C8021)中，使用限制酶DraIII(5’侧)及AatII(3’侧)来置换包含突变点G311A的DNA序列(序列号40)，从而制作Rluc-W104X表达质粒。将得到的质粒称为psiCHECK-2_Rluc-W104X。使用DH5α大肠杆菌株或Stbl3大肠杆菌株，通过与实施例1相同的方法使构建的psiCHECK-2_Rluc-W104X载体扩增。
实施例4ADAR2表达质粒的制作
使用限制酶EcoRI(5’侧)及BglII(3’侧)，将编码ADAR2(序列号12)的DNA序列(序列号11)插入到AAVpro(注册商标)Helper Free System(宝生物公司、产品目录编号6230)中所含的pAAV-CMV载体的来源于CMV的启动子下游的限制酶EcoRI(5’侧)及BamHI(3’侧)位点处，由此制作ADAR2表达质粒。将得到的质粒称为pAAV-CMV-ADAR2。在插入的DNA序列中，在翻译起始密码子上游配置Kozak序列，在ADAR2基因下游配置终止密码子。使用DH5α大肠杆菌株或Stbl3大肠杆菌株使构建的pAAV-CMV-ADAR2质粒扩增。
实施例5转染
其一(用于在图2及3中示出结果的荧光素酶分析及在表2中示出结果的利用桑格测序进行的RNA编辑效率的研究的转染)
将来源于人胎肾的细胞株HEK293细胞(ATCC产品目录编号CRL-1573)在添加了5％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM；Thermo Fisher Scientific公司、产品目录编号10569-010)中进行培养，以2.5×104细胞/100μL播种于96孔板，在5％CO2存在下在37℃下培养一晚。次日，将实施例3中制作的细胞内靶标RNA编辑活性检测用报告基因表达质粒(psiCHECK-2_Rluc-W104X)、实施例4中制作的ADAR2表达质粒(pAAV-CMV-ADAR2)、以及实施例1及2中制作的指导RNA表达质粒(后述的3种pSUPERneo_H1ADg及1种pSUPERneo_U6ADg)及载体质粒分别以1：35：35：9的重量比混合，使得总量达到100ng/孔。作为载体质粒，使用pHelper Vector(宝生物公司、产品目录编号6230)。使用Lipofectamine3000转染试剂(Thermo Fisher Scientific公司、产品目录编号L3000015)转染于HEK293细胞。
＜pSUPERneo_H1ADg或pSUPERneo_U6ADg各自表达的指导RNA名称＞
ASR(24)-ARR(16)add-3Gq
ASR(24)-ARR(16)add-BoxB
U6 upstream-ASR(24)-ARR(16)add-U6 downstream
BoxB-ASR(24)-ARR(16)add-3Gq
对于各质粒，各以3孔进行实验。转染后，在5％CO2存在下在37℃下培养，回收培养3天及6天的细胞，供于实施例6记载的利用荧光素酶分析进行的RNA编辑活性的检测及实施例7记载的利用桑格测序进行的RNA编辑效率的研究。
对照用或比较用的指导RNA表达质粒也与其一同样地制备，并转染于HEK293细胞。
其二(用于在图4中示出结果的荧光素酶分析及在表2中示出结果的利用桑格测序进行的RNA编辑效率的研究的转染)
将细胞内靶标RNA编辑活性检测用报告基因表达质粒(psiCHECK-2_Rluc-W104X)、ADAR2表达质粒(pAAV-CMV-ADAR2)、以及实施例1及2中制作的8种指导RNA表达质粒(后述的6种pSUPERneo_H1ADg及2种pSUPERneo_U6ADg)、载体质粒(pHelper Vector)分别以1：30：40：9的重量比混合，使得总量达到100ng/孔，使用与其一相同的方法进行向HEK293细胞的转染。需要说明的是，以2.0×104细胞/100μL播种细胞。转染后培养3天并回收细胞。
＜pSUPERneo_H1ADg或pSUPERneo_U6ADg各自表达的指导RNA名称＞
ASR(24)-ARR(16)add-3Gq
ASR(24)-ARR(16)add-BoxB
U6 upstream-ASR(24)-ARR(16)add-U6 downstream
BoxB-ASR(24)-ARR(16)add-3Gq
ASR(24)-ARR(16)-3Gq
ASR(24)-ARR(16)-BoxB
U6 upstream-ASR(24)-ARR(16)-U6 downstream
BoxB-ASR(24)-ARR(16)-3Gq
对照用或比较用的指导RNA表达质粒也与其二同样地进行转染。
实施例6利用荧光素酶分析进行的RNA编辑活性的检测使用Dual-Glo(注册商标)荧光素酶分析系统(プロメガ公司、产品目录编号E2940)和EnVision(PerkinElmer公司)，按照附带的规程测定实施例5中转染后的细胞的各孔的萤火虫荧光素酶发光强度(Fluc)和海肾荧光素酶发光强度(Rluc)。
图2及图3中，为了对样品间的转染效率进行修正，计算出Rluc/Fluc值，以相对值示出将对照用指导RNA的Rluc/Fluc值设为1时的、各指导RNA样品的Rluc/Fluc值。柱状图中以误差棒和标准偏差示出3孔的算术平均值。两次试验中显示出同样的倾向，将代表例的结果示于图2(培养3天)及图3(培养6天)。
将图2及图3中#1～#11的各编号与指导RNA名称的对应关系示于以下。下述指导RNA名称与表1所示的“指导RNA名称”对应。
#1ASR(24)-ARR(40)
#2ASR(24)-ARR(40)-3Gq
#3ASR(24)-ARR(40)add-3Gq
#4ASR(24)-ARR(16)add-3Gq
#5ASR(24)-ARR(40)-BoxB
#6ASR(24)-ARR(40)add-BoxB
#7ASR(24)-ARR(16)add-BoxB
#8U6 upstream-ASR(24)-ARR(40)-U6 downstream
#9U6 upstream-ASR(24)-ARR(40)add-U6 downstream
#10U6 upstream-ASR(24)-ARR(16)add-U6 downstream
#11BoxB-ASR(24)-ARR(16)add-3Gq
图4中以柱状图示出独立进行的三次试验的Rluc/Fluc值的算术平均值，图表示各试验中的每个样品的Rluc/Fluc值的算术平均值，误差棒表示标准偏差。
将图4中#1～#20的各编号与指导RNA名称的对应关系示于以下。下述指导RNA名称与表1所示的“指导RNA名称”对应。
#1ASR(24)-ARR(16)add
#2ASR(24)-ARR(16)add-3Gq
#3ASR(24)-ARR(16)add-BoxB
#4BoxB-ASR(24)-ARR(16)add-3Gq
#5U6 upstream-ASR(24)-ARR(16)add-U6 downstream
#6ASR(24)-ARR(16)
#7ASR(24)-ARR(16)-3Gq
#8ASR(24)-ARR(16)-BoxB
#9BoxB-ASR(24)-ARR(16)-3Gq
#10U6 upstream-ASR(24)-ARR(16)-U6 downstream
#11ASR(24)-ARR(40)add
#12ASR(24)-ARR(40)add-3Gq
#13ASR(24)-ARR(40)add-BoxB
#14BoxB-ASR(24)-ARR(40)add-3Gq
#15U6 upstream-ASR(24)-ARR(40)add-U6 downstream
#16ASR(24)-ARR(40)
#17ASR(24)-ARR(40)-3Gq
#18ASR(24)-ARR(40)-BoxB
#19BoxB-ASR(24)-ARR(40)-3Gq
#20U6 upstream-ASR(24)-ARR(40)-U6 downstream
细胞内靶标RNA编辑活性检测用报告基因(Rluc-W104X)中，编码Rluc的第104位的Trp的UGG已被置换为终止密码子(UAG)。因此，ADAR蛋白质和指导RNA在细胞内诱导靶标RNA的A向I的编辑时，突变导入的翻译终止密码子在由mRNA进行翻译时成为Trp，海肾荧光素酶的发光得以恢复。即，发光强度越高则表示RNA编辑活性越高。
如图2至图4所示，包含功能性碱基序列和短链型ADAR募集碱基序列ARR(16)的指导RNA不论有无接头碱基序列，与对照(图2及3中为#1，图4中为#16)(包含ADAR募集碱基序列ARR(40)的指导RNA)相比均显示出高的RNA编辑活性。另一方面，在对照中通过接头碱基序列添加功能性碱基序列时，与没有接头碱基序列时相比RNA编辑活性下降。
实施例7利用桑格测序进行的RNA编辑效率的研究
分别回收实施例5的其一和其二中转染后的细胞，从回收的细胞中，使用QIAshredder(QIAGEN公司、产品目录编号79656)、RNeasy小型试剂盒(QIAGEN公司、产品目录编号74106)、无RNA酶的DNA酶套装(RNase-free DNase Set)(QIAGEN公司、产品目录编号79254)按照附带的规程提取、纯化总RNA。对于纯化的RNA，使用SuperScript(注册商标)VILO cDNA合成试剂盒(Synthesis kit)(Thermo Fisher Scientific公司、产品目录编号11754-250)按照附带的规程进行逆转录反应，得到cDNA。以cDNA为模板，使用扩增包含编辑点的片段的下述引物和PrimeSTAR(注册商标)GXL DNA聚合酶(宝生物公司、产品目录编号R050A)，按照附带的规程进行PCR反应。
＜表2的实验中使用的引物＞
正向引物：GGTAACGCTGCCTCCAGC(序列号41)
反向引物：TGTAGTTGCGGACAATCTGG(序列号42)
＜表3的实验中使用的引物＞
正向引物：CTCGCTGCAAGCAAATGAAC(序列号43)
反向引物：TCGTCCCAGGACTCGATCAC(序列号44)
使用ExoSAP-IT Express PCR清洁试剂(Cleanup Reagents)(Thermo FisherScientific公司、产品目录编号75001.200.UL)按照附带的规程对PCR扩增片段进行纯化，与PCR扩增中使用的正向引物一起供于利用3730xl(XL)DNA分析仪(Applied Biosystems公司)的桑格测序反应。
表2中，将利用QSVanalyzer软件(Bioinformatics、2009、Vol.25、p.3244-3250)对桑格测序反应中得到的波形数据文件(后缀：.ab1)加以分析，将未编辑的Rluc-W104X的鸟嘌呤(G)的信号强度设为0且将腺嘌呤(A)的信号强度设为1、将Rluc的G的信号强度设为1且将A的信号强度设为0时的、G的存在比(G/(G+A)×100)作为RNA编辑效率(％)。两次试验中显示出同样的倾向，将代表例的结果示于表2。
[表2]
Figure BDA0003491900150000501
对照(control)用指导RNA(包含ADAR募集碱基序列ARR(40)的指导RNA)的情况下，转染后3天时显示出40.7％的RNA编辑效率。另一方面，本发明的指导RNA(包含功能性碱基序列和短链型ADAR募集碱基序列ARR(16)的指导RNA)显示出约60％～约80％的高的RNA编辑效率。
表3中，利用QSVanalyzer软件对桑格测序反应中得到的波形数据文件(后缀：.ab1)加以分析，将鸟嘌呤(G)的信号强度的比(G/(G+A)×100)作为RNA编辑效率(％)。两次试验中显示出同样的倾向，示出代表例的结果。
[表3]
Figure BDA0003491900150000511
对照用指导RNA(ASR(24)-ARR(40))(包含ADAR募集碱基序列ARR(40)的指导RNA)显示出44.6％的RNA编辑效率。另一方面，包含功能性碱基序列和短链型ADAR募集碱基序列ARR(16)的指导RNA显示出约60％～约75％的、高于对照用指导RNA的RNA编辑效率。
实施例8以萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA为靶标的RNA编辑效率的研究
确认本发明的指导RNA对不同的靶标RNA是否也显示高的RNA编辑效率。
与实施例1及2同样地制作以psiCHECK-2载体(プロメガ公司、产品目录编号C8021)中搭载的萤火虫荧光素酶(Fluc)的编码区内的第74位碱基的腺苷为编辑靶标的指导RNA表达质粒。ASRf(24)表示与包含编辑靶标腺苷的Fluc报告基因mRNA互补的由24个碱基构成的反义碱基序列，由序列号45所示的序列的碱基编号9至32的DNA碱基序列所编码的RNA碱基序列构成。制作中使用的编码指导RNA的DNA序列如下所述。
＜指导RNA的名称和编码其的DNA序列号＞
ASRf(24)-ARR(16)add-3Gq：序列号45
ASRf(24)-ARR(16)add-BoxB：序列号46
U6 upstream-ASRf(24)-ARR(16)add-U6 downstream：序列号47
DNA序列中，在5’侧包含polIII的转录起始位点所优选的嘌呤碱基(G或A)且在3’侧包含polIII的终止子序列。另外，DNA序列中，分别在5’末端和3’末端包含含有用于载体克隆的限制酶BglII突出末端的序列(AGATC)和限制酶HindIII识别序列(AAGCTT)。
将得到的质粒统称为pSUPERneo_H1ADg_ASRf24。
需要说明的是，对照用及比较例用的指导RNA表达质粒也同样地使用编码指导RNA的DNA序列(下述)来制作。
＜指导RNA的名称和编码其的DNA序列号(对照)＞
ASRf(24)-ARR(40)：序列号48
＜指导RNA的名称和编码其的DNA序列号(比较例)＞
ASRf(24)-ARR(16)add：序列号49
ASRf(24)-ARR(16)：序列号50
DNA序列中，在5’侧包含polIII的转录起始位点所优选的嘌呤碱基(G或A)且在3’侧包含polIII的终止子序列。另外，DNA序列中，分别在5’末端和3’末端包含含有用于载体克隆的限制酶BglII突出末端的序列(AGATC)和限制酶HindIII识别序列(AAGCTT)。
与实施例5(其二)同样地将Fluc报告基因表达质粒(psiCHECK-2(プロメガ公司、C8021))、实施例4中制作的ADAR2表达质粒(pAAV-CMV-ADAR2)及上述的指导RNA表达质粒(pSUPERneo_H1ADg_ASRf24)转染于HEK293细胞。对照用及比较用的指导RNA表达质粒也同样地进行转染。
与实施例7(表3的情况)同样地进行PCR反应，使用测序引物进行桑格测序反应。由桑格测序反应的波形数据文件来计算以Fluc报告基因mRNA为靶标的RNA编辑效率。将本试验的PCR反应及桑格测序反应中使用的引物示于以下。
正向引物Fluc：GGCCGATGCTAAGAACATTAAGAAG(序列号51)
反向引物Fluc：CCACGGTAGGCTGAGAAATG(序列号52)
测序引物：CTCCGATGAACAGGGCGC(序列号53)
将得到的结果示于表4。
[表4]
Figure BDA0003491900150000541
对照用指导RNA(ASRf(24)-ARR(40))(包含ADAR募集碱基序列ARR(40)的指导RNA)的情况下，转染后3天时显示出1.8％的RNA编辑效率。另一方面，包含功能性碱基序列和短链型ADAR募集碱基序列ARR(16)的指导RNA显示出约3％～约15％的高于对照的RNA编辑效率。
参考实施例1指导RNA的体外稳定性的研究
指导RNA的体外稳定性可以通过所合成的指导RNA的残存量的比较来评价。目标指导RNA的残存量越多，则意味着稳定性越高。
具体而言，通过从双链DNA起的体外转录来合成指导RNA，将得到的指导RNA用核酸外切酶处理，从而对残存的指导RNA进行定量。
作为双链DNA，只要能够通过从该双链DNA起的体外转录来合成本发明的指导RNA就没有特别限定，可列举例如在启动子区域的下游包含编码指导RNA的区域的双链DNA。双链DNA中，也可以赋予用于提高转录效率的序列。例如，可以在要转录的RNA序列的5’末端赋予GG或GGG。作为启动子区域，没有特别限定，可以使用例如包含T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶结合区域的区域。
制作体外转录中使用的双链DNA的方法没有特别限定，可以使用例如：合成处于互补关系的2个寡DNA并对它们进行常规方法的退火反应而得到的双链DNA、质粒DNA、由质粒DNA等模板通过PCR法制作的双链DNA。根据双链DNA的序列，例如可以通过限制酶处理、利用Klenow片段的填补(Fill-in)反应等进行制备。为了达到能够用于体外转录反应的纯度，可以将所制作的双链DNA利用例如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、苯酚/氯仿提取及乙醇沉淀等进行分离、纯化，用于体外转录。
从双链DNA起的体外转录没有特别限定，可以使用例如T7-Scribe标准RNA IVT试剂盒(CELLSCRIPT公司、产品目录编号C-AS2607)、MAXIscript T7转录试剂盒(ThermoFisher公司、产品目录编号AM1312)、T7 RNA聚合酶(宝生物公司、产品目录编号2540A)按照附带的规程来进行。从体外转录后的反应液中纯化RNA的操作可以按照常规方法来进行。例如，可以将反应液用DNA分解酶处理后，通过苯酚/氯仿提取及乙醇沉淀来纯化RNA，将纯化后的RNA进一步用凝胶电泳分离，从目标位置的条带纯化RNA。凝胶电泳例如可以使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。从凝胶中纯化RNA时，可以使用过滤器过滤及凝胶过滤。
指导RNA的核酸外切酶处理中使用的核酸外切酶可使用例如RNaseR(Lucigen公司、产品目录编号RNR07250)、RNaseR(BioVision公司、产品目录编号M1228-500)。核酸外切酶处理中使用的缓冲液、条件没有特别限定，例如可以对250ng指导RNA使用0.1-10U的RNaseR，可以在1x RNase R反应缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.1mM MgCl2)中在37℃、10分钟至2小时的条件下进行反应。在如后述那样使用经放射性同位素(RI)标记或荧光标记的RNA的情况下，也可以使用细胞提取液进行处理，以代替使用核酸外切酶进行处理。
核酸外切酶处理后残存的RNA的定量可以按照常规方法来进行。例如，可以利用凝胶电泳对核酸外切酶处理反应后的溶液进行分离，将凝胶染色，从而对残存的RNA量进行定量。在此，凝胶电泳可以使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶的染色可以使用溴化乙锭、SYBR Gold核酸染料(Nucleic Acid Gel Stain)(Thermo Fisher公司、产品目录编号S11494)。作为除此以外的残存RNA的定量方法，也可以使用生物分析仪(Agilent公司制造的2100BioAnalyzer)。
作为核酸外切酶处理后残存的RNA的其它定量方法，也可以使用对利用RI或荧光等进行了标记的RNA进行定量的方法。作为标记中使用的RI，只要能够标记RNA就没有特别限定，可列举例如γ-32P-ATP。作为RI标记的方法，例如，可以利用脱磷酸化酶使RNA的5’末端脱磷酸化，通过苯酚/氯仿提取进行纯化后，在[γ-32P]-ATP存在下通过利用多核苷酸激酶的磷酸化反应来进行。作为脱磷酸化酶，可使用例如热敏磷酸酶(AntarcticPhosphatase)(New England Biolabs公司、产品目录编号M0289S)。作为ATP，可使用例如[γ-32P]-ATP(PerkinElmer公司、产品目录编号BLU002Z250UC)。作为多核苷酸激酶，可使用例如T4多核苷酸激酶(New England Biolabs公司、产品目录编号M0201S)。作为标记中使用的荧光色素，只要能够标记RNA就没有特别限定。作为荧光标记的方法，可列举例如对5’末端进行标记的方法，可以使用5’EndTagTM核酸标记系统(Nucleic Acid Labeling System)(Vector Laboratories公司、产品目录编号MB-9001)。将利用RI或荧光进行了标记的RNA通过与上述相同的方法进行核酸外切酶处理，通过凝胶电泳对反应后的溶液进行分离。使用图像分析仪检测分离后的凝胶上的放射活性、荧光强度，由此能够对残存RNA进行定量。作为图像分析仪，可以使用例如荧光图像分析仪(Fujifilm公司、产品目录编号FLA-7000)。
将通过所合成的指导RNA的残存量的比较来研究指导RNA的体外稳定性的详细方法的例子在后文进行记载，但是不限于此。
以质粒DNA(例如，可以使用实施例1或2中记载的指导RNA表达质粒(pSUPERneo_H1_gRNA或pSUPERneo_U6_gRNA)。)为模板，使用包含T7 RNA聚合酶结合序列、提高转录活性的序列及编码指导RNA的一部分的序列的正向引物、包含编码指导RNA的一部分的序列的反向引物、Prime Star GXL(宝生物公司、产品目录编号R050B)进行PCR反应，将扩增出的PCR产物通过苯酚/氯仿提取及乙醇沉淀进行纯化，得到模板DNA。以得到的DNA为模板，使用T7-Scribe标准RNA IVT试剂盒(CELLSCRIPT公司制)按照附带的规程通过体外转录(反应条件例如为37℃、3小时)合成RNA。之后，加入DNA分解酶，进行模板DNA的分解反应后，通过苯酚/氯仿提取及乙醇沉淀对RNA进行纯化。将得到的RNA用8M脲PAGE(8％)进行纯化，通过粉碎、浸渍进行提取，通过0.22μm过滤器及凝胶过滤进行纯化，制备各种指导RNA。
使用热敏磷酸酶(New England Biolabs公司、产品目录编号M0289S)对指导RNA进行脱磷酸化反应(例如37℃下1小时)。反应后，通过苯酚氯仿提取、乙醇沉淀对RNA进行纯化。
对于脱磷酸化后的RNA，加入[γ-32P]-ATP(PerkinElmer#BLU002Z250UC)，使用终浓度1U/μl T4多核苷酸激酶(New England Biolabs公司、产品目录编号M0201S)进行磷酸化反应(例如37℃、30分钟)。反应后，通过乙醇沉淀对RNA进行纯化。将RNA用80％甲酰胺溶解，通过8M脲8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)切出，利用与上述相同的方法进行纯化。将得到的RNA用液体闪烁计数器(Perkinelmer公司、产品目录编号Tri-Carb 2910TR)测定放射活性。
对于进行了放射标记的指导RNA，加入例如0.1-10U的RNase R，进行分解反应(例如37℃、10分钟至2小时)。通过8M脲8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对反应后的溶液进行分离。将凝胶的表面用盖板覆盖，在其上重叠富士成像板(Fujifilm公司、产品目录编号)，使其感光6小时以上。感光结束后，利用图像分析仪(Fujifilm公司、产品目录编号FLA-7000)对成像板进行分析。从得到的条带对残存的RNA量进行定量。
参考实施例2指导RNA的细胞内稳定性的研究
指导RNA的细胞内稳定性可以通过转录抑制后的指导RNA的残存量的比较来评价。目标指导RNA的残存量越多，则意味着稳定性越高。
具体而言，使指导RNA表达质粒转染于培养细胞后，在达到指导RNA充分表达的状态后利用转录抑制剂在一定时间内抑制指导RNA的转录。之后，从细胞中提取RNA并纯化，对残存的指导RNA进行定量。在另一方式中，使指导RNA表达质粒转染于培养细胞后，对新转录的RNA进行脉冲标记，回收被标记的RNA，对残存的指导RNA进行定量。
作为指导RNA表达质粒，只要能够表达本发明的指导RNA就没有特别限定，可以使用例如实施例1及2中记载的指导RNA表达质粒(pSUPERneo_H1ADg或pSUPERneo_U6ADg)。可以将实施例3中记载的细胞内靶标RNA编辑活性检测用报告基因表达质粒(psiCHECK-2_Rluc-W104X)、实施例4中记载的ADAR2表达质粒(pAAV-CMV-ADAR2)与指导RNA表达质粒一起进行转染。
作为培养细胞，只要是能够表达指导RNA的细胞就没有特别限定，可使用例如HEK293细胞。
指导RNA表达质粒可以通过常规方法转染于培养细胞。转染方法没有特别限定，例如，可以使用Lipofectamine3000转染试剂按照附带的规程进行转染。转染中使用的指导RNA表达质粒的浓度可以根据培养细胞而设定为适当的浓度。
作为转录抑制剂，没有特别限定，可以使用例如放线菌素D(和光纯药公司、产品目录编号010-21263)、α-鹅膏菌素(和光纯药公司、产品目录编号010-22961)等。已知放线菌素D与双链DNA结合而抑制基于RNA聚合酶的转录。也可以使用Tet诱导性启动子等来代替使用转录抑制剂，由指导RNA表达质粒瞬时性表达指导RNA。
使指导RNA表达质粒转染于培养细胞后，为了达到指导RNA充分表达的状态，例如在转染后需要24小时，但是不限于此。
添加转录抑制剂后，可以在任意时机回收转染后的细胞并纯化RNA。回收细胞的任意时机例如可通过用作阳性对照的稳定性高的RNA的残存得以维持的时间来确定。回收细胞的任意时机没有特别限定，可列举添加转录抑制剂后30分钟至16小时等。
从回收的细胞中提取纯化包含指导RNA的总RNA的操作可通过常规方法来进行。提取RNA的方法没有特别限定，可以使用例如miRNeasy小型试剂盒(QIAGEN公司、产品目录编号217004)、或mirVana miRNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司、产品目录编号AM1560)、NucleoSpin miRNA(宝生物公司、产品目录编号U0971B)等microRNA提取纯化试剂盒。在从提取的总RNA中除去DNA时，可以使用无RNA酶的DNA酶套装等试剂盒。
RNA的定量可以通过常规方法来进行。例如，可以以由提取出的RNA制作的cDNA为模板，按照常规方法进行PCR反应，对目标指导RNA进行定量。cDNA的制作方法没有特别限定，例如可以使用Mir-X miRNA第一链合成试剂盒(First-Strand Synthesis Kit)(宝生物公司、产品目录编号Z8315N)按照附带的规程对small RNA添加poly A后进行逆转录反应，得到cDNA。通过实时PCR反应进行的指导RNA的定量方法没有特别限定，以得到的cDNA为模板，使用Mir-XTM miRNA qRT-PCR TB Green(注册商标)试剂盒(宝生物公司、产品目录编号Z8316N)按照附带的规程利用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(Thermo FisherScientific公司)进行实时PCR反应，从而对指导RNA量进行定量。实时PCR反应中使用的正向引物可基于要定量的指导RNA的序列通过本领域技术人员公知的方法来设计。
作为另一方式，也可以对新转录的RNA进行脉冲标记，回收被标记的RNA并对残存的指导RNA进行定量。进行脉冲标记的试剂没有特别限定，可以使用例如5-溴尿苷(BrU)，具体而言，使用BRIC试剂盒(MBLライフサイエンス公司、产品目录编号RN1007)按照附带的规程将细胞内的新生RNA用BrU进行标记。通过免疫沉淀法回收进行了标记的RNA，通过上述的PCR法对指导RNA量进行定量。
将通过转录抑制后的指导RNA的残存量的比较来研究指导RNA的细胞内稳定性的详细方法的例子在后文进行记载，但是不限于此。
将细胞内靶标RNA编辑活性检测用报告基因表达质粒(psiCHECK-2_Rluc-W104X)、ADAR2表达质粒(pAAV-CMV-ADAR2)及指导RNA表达质粒(pSUPERneo_H1ADg或pSUPERneo_U6ADg)(均记载于实施例1至4)用Lipofectamine3000转染试剂按照附带的规程转染于HEK293细胞，24小时后利用放线菌素D进行处置。已知放线菌素D与双链DNA结合而抑制基于RNA聚合酶的转录。转录抑制后30分钟至16小时回收转染后的细胞，从回收的细胞中，使用miRNeasy小型试剂盒及无RNA酶的DNA酶套装按照附带的规程提取包含指导RNA的总RNA并纯化。对于得到的RNA，使用Mir-X miRNA第一链合成试剂盒(宝生物公司、产品目录编号Z8315N)按照附带的规程向small RNA添加poly A，然后进行逆转录反应，得到cDNA。以得到的cDNA为模板，使用Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green(注册商标)试剂盒按照附带的规程利用QuantStudioTM 12K Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司)进行实时PCR反应，对指导RNA量进行定量。实时PCR反应中使用的正向引物设定为与编码指导RNA的核酸的反义碱基序列相同的序列。
产业上的可利用性
本发明的指导RNA对靶标RNA编辑有用，包含该指导RNA、编码该指导RNA的核酸、本发明的表达载体或本发明的多肽的药物组合物在能够用于以遗传性疾病为代表的可通过编辑靶标RNA来预防或治疗的各种疾病的方面有用。
符号说明
1：指导RNA、10：反义碱基序列、20：短链型ADAR募集碱基序列、30：功能性碱基序列、40：靶标RNA序列、50：ADAR、60：接头
序列表自由文本
序列号1～10：合成RNA
序列号13～53：合成DNA
序列表
<110> 安斯泰来制药株式会社
学校法人福冈大学
<120> 添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导RNA
<130> G2350WO
<150> JP2019-141875
<151> 2019-08-01
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 1
ggguguucgc accu 14
<210> 2
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 2
gggugguucg ccaccu 16
<210> 3
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 3
ggguggaaua uucguauccc accu 24
<210> 4
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 4
ggguggaaua guauauucgu auaguauccc accu 34
<210> 5
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 5
ggguggaaua guauaccauu cgugguauag uaucccaccc 40
<210> 6
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 6
ggguuugggu uuggguuugg guuu 24
<210> 7
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 7
agagggcccu gaagagggcc cuuu 24
<210> 8
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 8
gugcucgcuu cggcagcaca uauacuaguc gac 33
<210> 9
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 9
ucuagagcgg acuucggucc gcuuuu 26
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RNA
<400> 10
caguccugga aacagggacc 20
<210> 11
<211> 2127
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (16)..(2118)
<400> 11
gaattcgccg ccacc atg gat ata gaa gat gaa gaa aac atg agt tcc agc 51
Met Asp Ile Glu Asp Glu Glu Asn Met Ser Ser Ser
1 5 10
agc act gat gtg aag gaa aac cgc aat ctg gac aac gtg tcc ccc aag 99
Ser Thr Asp Val Lys Glu Asn Arg Asn Leu Asp Asn Val Ser Pro Lys
15 20 25
gat ggc agc aca cct ggg cct ggc gag ggc tct cag ctc tcc aat ggg 147
Asp Gly Ser Thr Pro Gly Pro Gly Glu Gly Ser Gln Leu Ser Asn Gly
30 35 40
ggt ggt ggt ggc ccc ggc aga aag cgg ccc ctg gag gag ggc agc aat 195
Gly Gly Gly Gly Pro Gly Arg Lys Arg Pro Leu Glu Glu Gly Ser Asn
45 50 55 60
ggc cac tcc aag tac cgc ctg aag aaa agg agg aaa aca cca ggg ccc 243
Gly His Ser Lys Tyr Arg Leu Lys Lys Arg Arg Lys Thr Pro Gly Pro
65 70 75
gtc ctc ccc aag aac gcc ctg atg cag ctg aat gag atc aag cct ggt 291
Val Leu Pro Lys Asn Ala Leu Met Gln Leu Asn Glu Ile Lys Pro Gly
80 85 90
ttg cag tac aca ctc ctg tcc cag act ggg ccc gtg cac gcg cct ttg 339
Leu Gln Tyr Thr Leu Leu Ser Gln Thr Gly Pro Val His Ala Pro Leu
95 100 105
ttt gtc atg tct gtg gag gtg aat ggc cag gtt ttt gag ggc tct ggt 387
Phe Val Met Ser Val Glu Val Asn Gly Gln Val Phe Glu Gly Ser Gly
110 115 120
ccc aca aag aaa aag gca aaa ctc cat gct gct gag aag gcc ttg agg 435
Pro Thr Lys Lys Lys Ala Lys Leu His Ala Ala Glu Lys Ala Leu Arg
125 130 135 140
tct ttc gtt cag ttt cct aat gcc tct gag gcc cac ctg gcc atg ggg 483
Ser Phe Val Gln Phe Pro Asn Ala Ser Glu Ala His Leu Ala Met Gly
145 150 155
agg acc ctg tct gtc aac acg gac ttc aca tct gac cag gcc gac ttc 531
Arg Thr Leu Ser Val Asn Thr Asp Phe Thr Ser Asp Gln Ala Asp Phe
160 165 170
cct gac acg ctc ttc aat ggt ttt gaa act cct gac aag gcg gag cct 579
Pro Asp Thr Leu Phe Asn Gly Phe Glu Thr Pro Asp Lys Ala Glu Pro
175 180 185
ccc ttt tac gtg ggc tcc aat ggg gat gac tcc ttc agt tcc agc ggg 627
Pro Phe Tyr Val Gly Ser Asn Gly Asp Asp Ser Phe Ser Ser Ser Gly
190 195 200
gac ctc agc ttg tct gct tcc ccg gtg cct gcc agc cta gcc cag cct 675
Asp Leu Ser Leu Ser Ala Ser Pro Val Pro Ala Ser Leu Ala Gln Pro
205 210 215 220
cct ctc cct gtc tta cca cca ttc cca ccc ccg agt ggg aag aat ccc 723
Pro Leu Pro Val Leu Pro Pro Phe Pro Pro Pro Ser Gly Lys Asn Pro
225 230 235
gtg atg atc ttg aac gaa ctg cgc cca gga ctc aag tat gac ttt ctc 771
Val Met Ile Leu Asn Glu Leu Arg Pro Gly Leu Lys Tyr Asp Phe Leu
240 245 250
tcc gag agc ggg gag agc cat gcc aag agc ttc gtc atg tct gtg gtc 819
Ser Glu Ser Gly Glu Ser His Ala Lys Ser Phe Val Met Ser Val Val
255 260 265
gtg gat ggt cag ttc ttt gaa ggc tcg ggg aga aac aag aag ctt gcc 867
Val Asp Gly Gln Phe Phe Glu Gly Ser Gly Arg Asn Lys Lys Leu Ala
270 275 280
aag gcc cgg gct gcg cag tct gcc ctg gcc gcc att ttt aac ttg cac 915
Lys Ala Arg Ala Ala Gln Ser Ala Leu Ala Ala Ile Phe Asn Leu His
285 290 295 300
ttg gat cag acg cca tct cgc cag cct att ccc agt gag ggt ctt cag 963
Leu Asp Gln Thr Pro Ser Arg Gln Pro Ile Pro Ser Glu Gly Leu Gln
305 310 315
ctg cat tta ccg cag gtt tta gct gac gct gtc tca cgc ctg gtc ctg 1011
Leu His Leu Pro Gln Val Leu Ala Asp Ala Val Ser Arg Leu Val Leu
320 325 330
ggt aag ttt ggt gac ctg acc gac aac ttc tcc tcc cct cac gct cgc 1059
Gly Lys Phe Gly Asp Leu Thr Asp Asn Phe Ser Ser Pro His Ala Arg
335 340 345
aga aaa gtg ctg gct gga gtc gtc atg aca aca ggc aca gat gtt aaa 1107
Arg Lys Val Leu Ala Gly Val Val Met Thr Thr Gly Thr Asp Val Lys
350 355 360
gat gcc aag gtg ata agt gtt tct aca gga aca aaa tgt att aat ggt 1155
Asp Ala Lys Val Ile Ser Val Ser Thr Gly Thr Lys Cys Ile Asn Gly
365 370 375 380
gaa tac atg agt gat cgt ggc ctt gca tta aat gac tgc cat gca gaa 1203
Glu Tyr Met Ser Asp Arg Gly Leu Ala Leu Asn Asp Cys His Ala Glu
385 390 395
ata ata tct cgg aga tcc ttg ctc aga ttt ctt tat aca caa ctt gag 1251
Ile Ile Ser Arg Arg Ser Leu Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Gln Leu Glu
400 405 410
ctt tac tta aat aac aaa gat gat caa aaa aga tcc atc ttt cag aaa 1299
Leu Tyr Leu Asn Asn Lys Asp Asp Gln Lys Arg Ser Ile Phe Gln Lys
415 420 425
tca gag cga ggg ggg ttt agg ctg aag gag aat gtc cag ttt cat ctg 1347
Ser Glu Arg Gly Gly Phe Arg Leu Lys Glu Asn Val Gln Phe His Leu
430 435 440
tac atc agc acc tct ccc tgt gga gat gcc aga atc ttc tca cca cat 1395
Tyr Ile Ser Thr Ser Pro Cys Gly Asp Ala Arg Ile Phe Ser Pro His
445 450 455 460
gag cca atc ctg gaa gaa cca gca gat aga cac cca aat cgt aaa gca 1443
Glu Pro Ile Leu Glu Glu Pro Ala Asp Arg His Pro Asn Arg Lys Ala
465 470 475
aga gga cag cta cgg acc aaa ata gag tct ggt gag ggg acg att cca 1491
Arg Gly Gln Leu Arg Thr Lys Ile Glu Ser Gly Glu Gly Thr Ile Pro
480 485 490
gtg cgc tcc aat gcg agc atc caa acg tgg gac ggg gtg ctg caa ggg 1539
Val Arg Ser Asn Ala Ser Ile Gln Thr Trp Asp Gly Val Leu Gln Gly
495 500 505
gag cgg ctg ctc acc atg tcc tgc agt gac aag att gca cgc tgg aac 1587
Glu Arg Leu Leu Thr Met Ser Cys Ser Asp Lys Ile Ala Arg Trp Asn
510 515 520
gtg gtg ggc atc cag gga tcc ctg ctc agc att ttc gtg gag ccc att 1635
Val Val Gly Ile Gln Gly Ser Leu Leu Ser Ile Phe Val Glu Pro Ile
525 530 535 540
tac ttc tcg agc atc atc ctg ggc agc ctt tac cac ggg gac cac ctt 1683
Tyr Phe Ser Ser Ile Ile Leu Gly Ser Leu Tyr His Gly Asp His Leu
545 550 555
tcc agg gcc atg tac cag cgg atc tcc aac ata gag gac ctg cca cct 1731
Ser Arg Ala Met Tyr Gln Arg Ile Ser Asn Ile Glu Asp Leu Pro Pro
560 565 570
ctc tac acc ctc aac aag cct ttg ctc agt ggc atc agc aat gca gaa 1779
Leu Tyr Thr Leu Asn Lys Pro Leu Leu Ser Gly Ile Ser Asn Ala Glu
575 580 585
gca cgg cag cca ggg aag gcc ccc aac ttc agt gtc aac tgg acg gta 1827
Ala Arg Gln Pro Gly Lys Ala Pro Asn Phe Ser Val Asn Trp Thr Val
590 595 600
ggc gac tcc gct att gag gtc atc aac gcc acg act ggg aag gat gag 1875
Gly Asp Ser Ala Ile Glu Val Ile Asn Ala Thr Thr Gly Lys Asp Glu
605 610 615 620
ctg ggc cgc gcg tcc cgc ctg tgt aag cac gcg ttg tac tgt cgc tgg 1923
Leu Gly Arg Ala Ser Arg Leu Cys Lys His Ala Leu Tyr Cys Arg Trp
625 630 635
atg cgt gtg cac ggc aag gtt ccc tcc cac tta cta cgc tcc aag att 1971
Met Arg Val His Gly Lys Val Pro Ser His Leu Leu Arg Ser Lys Ile
640 645 650
acc aag ccc aac gtg tac cat gag tcc aag ctg gcg gca aag gag tac 2019
Thr Lys Pro Asn Val Tyr His Glu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Glu Tyr
655 660 665
cag gcc gcc aag gcg cgt ctg ttc aca gcc ttc atc aag gcg ggg ctg 2067
Gln Ala Ala Lys Ala Arg Leu Phe Thr Ala Phe Ile Lys Ala Gly Leu
670 675 680
ggg gcc tgg gtg gag aag ccc acc gag cag gac cag ttc tca ctc acg 2115
Gly Ala Trp Val Glu Lys Pro Thr Glu Gln Asp Gln Phe Ser Leu Thr
685 690 695 700
ccc tgaagatcc 2127
Pro
<210> 12
<211> 701
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Met Asp Ile Glu Asp Glu Glu Asn Met Ser Ser Ser Ser Thr Asp Val
1 5 10 15
Lys Glu Asn Arg Asn Leu Asp Asn Val Ser Pro Lys Asp Gly Ser Thr
20 25 30
Pro Gly Pro Gly Glu Gly Ser Gln Leu Ser Asn Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Pro Gly Arg Lys Arg Pro Leu Glu Glu Gly Ser Asn Gly His Ser Lys
50 55 60
Tyr Arg Leu Lys Lys Arg Arg Lys Thr Pro Gly Pro Val Leu Pro Lys
65 70 75 80
Asn Ala Leu Met Gln Leu Asn Glu Ile Lys Pro Gly Leu Gln Tyr Thr
85 90 95
Leu Leu Ser Gln Thr Gly Pro Val His Ala Pro Leu Phe Val Met Ser
100 105 110
Val Glu Val Asn Gly Gln Val Phe Glu Gly Ser Gly Pro Thr Lys Lys
115 120 125
Lys Ala Lys Leu His Ala Ala Glu Lys Ala Leu Arg Ser Phe Val Gln
130 135 140
Phe Pro Asn Ala Ser Glu Ala His Leu Ala Met Gly Arg Thr Leu Ser
145 150 155 160
Val Asn Thr Asp Phe Thr Ser Asp Gln Ala Asp Phe Pro Asp Thr Leu
165 170 175
Phe Asn Gly Phe Glu Thr Pro Asp Lys Ala Glu Pro Pro Phe Tyr Val
180 185 190
Gly Ser Asn Gly Asp Asp Ser Phe Ser Ser Ser Gly Asp Leu Ser Leu
195 200 205
Ser Ala Ser Pro Val Pro Ala Ser Leu Ala Gln Pro Pro Leu Pro Val
210 215 220
Leu Pro Pro Phe Pro Pro Pro Ser Gly Lys Asn Pro Val Met Ile Leu
225 230 235 240
Asn Glu Leu Arg Pro Gly Leu Lys Tyr Asp Phe Leu Ser Glu Ser Gly
245 250 255
Glu Ser His Ala Lys Ser Phe Val Met Ser Val Val Val Asp Gly Gln
260 265 270
Phe Phe Glu Gly Ser Gly Arg Asn Lys Lys Leu Ala Lys Ala Arg Ala
275 280 285
Ala Gln Ser Ala Leu Ala Ala Ile Phe Asn Leu His Leu Asp Gln Thr
290 295 300
Pro Ser Arg Gln Pro Ile Pro Ser Glu Gly Leu Gln Leu His Leu Pro
305 310 315 320
Gln Val Leu Ala Asp Ala Val Ser Arg Leu Val Leu Gly Lys Phe Gly
325 330 335
Asp Leu Thr Asp Asn Phe Ser Ser Pro His Ala Arg Arg Lys Val Leu
340 345 350
Ala Gly Val Val Met Thr Thr Gly Thr Asp Val Lys Asp Ala Lys Val
355 360 365
Ile Ser Val Ser Thr Gly Thr Lys Cys Ile Asn Gly Glu Tyr Met Ser
370 375 380
Asp Arg Gly Leu Ala Leu Asn Asp Cys His Ala Glu Ile Ile Ser Arg
385 390 395 400
Arg Ser Leu Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Gln Leu Glu Leu Tyr Leu Asn
405 410 415
Asn Lys Asp Asp Gln Lys Arg Ser Ile Phe Gln Lys Ser Glu Arg Gly
420 425 430
Gly Phe Arg Leu Lys Glu Asn Val Gln Phe His Leu Tyr Ile Ser Thr
435 440 445
Ser Pro Cys Gly Asp Ala Arg Ile Phe Ser Pro His Glu Pro Ile Leu
450 455 460
Glu Glu Pro Ala Asp Arg His Pro Asn Arg Lys Ala Arg Gly Gln Leu
465 470 475 480
Arg Thr Lys Ile Glu Ser Gly Glu Gly Thr Ile Pro Val Arg Ser Asn
485 490 495
Ala Ser Ile Gln Thr Trp Asp Gly Val Leu Gln Gly Glu Arg Leu Leu
500 505 510
Thr Met Ser Cys Ser Asp Lys Ile Ala Arg Trp Asn Val Val Gly Ile
515 520 525
Gln Gly Ser Leu Leu Ser Ile Phe Val Glu Pro Ile Tyr Phe Ser Ser
530 535 540
Ile Ile Leu Gly Ser Leu Tyr His Gly Asp His Leu Ser Arg Ala Met
545 550 555 560
Tyr Gln Arg Ile Ser Asn Ile Glu Asp Leu Pro Pro Leu Tyr Thr Leu
565 570 575
Asn Lys Pro Leu Leu Ser Gly Ile Ser Asn Ala Glu Ala Arg Gln Pro
580 585 590
Gly Lys Ala Pro Asn Phe Ser Val Asn Trp Thr Val Gly Asp Ser Ala
595 600 605
Ile Glu Val Ile Asn Ala Thr Thr Gly Lys Asp Glu Leu Gly Arg Ala
610 615 620
Ser Arg Leu Cys Lys His Ala Leu Tyr Cys Arg Trp Met Arg Val His
625 630 635 640
Gly Lys Val Pro Ser His Leu Leu Arg Ser Lys Ile Thr Lys Pro Asn
645 650 655
Val Tyr His Glu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Glu Tyr Gln Ala Ala Lys
660 665 670
Ala Arg Leu Phe Thr Ala Phe Ile Lys Ala Gly Leu Gly Ala Trp Val
675 680 685
Glu Lys Pro Thr Glu Gln Asp Gln Phe Ser Leu Thr Pro
690 695 700
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 13
gggtggttcg ccacct 16
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 14
cagtcctgga aacagggacc 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 15
gggtttgggt ttgggtttgg gttt 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 16
agagggccct gaagagggcc cttt 24
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 17
gtgctcgctt cggcagcaca tatactagtc gac 33
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 18
tctagagcgg acttcggtcc gctttt 26
<210> 19
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 19
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtggt tcgccacctc agtcctggaa 60
acagggaccg ggtttgggtt tgggtttggg ttttttttta agctt 105
<210> 20
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 20
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtggt tcgccacctc agtcctggaa 60
acagggacct ctagagggcc ctgaagaggg cccttttttt ttaagctt 108
<210> 21
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 21
agatctggga gagggccctg aagagggccc ttttctgaag gttcagcagc tcgaaccaag 60
gggtggttcg ccacctcagt cctggaaaca gggaccgggt ttgggtttgg gtttgggttt 120
ttttttaagc tt 132
<210> 22
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 22
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtggt tcgccacctg ggtttgggtt 60
tgggtttggg ttttttttta agctt 85
<210> 23
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 23
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtggt tcgccacctt ctagagggcc 60
ctgaagaggg cccttttttt ttaagctt 88
<210> 24
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 24
agatctggga gagggccctg aagagggccc ttttctgaag gttcagcagc tcgaaccaag 60
gggtggttcg ccacctgggt ttgggtttgg gtttgggttt ttttttaagc tt 112
<210> 25
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 25
agatctgggt gctcgcttcg gcagcacata tactagtcga cgaaggttca gcagctcgaa 60
ccaaggggtg gttcgccacc tcagtcctgg aaacagggac ctctagagcg gacttcggtc 120
cgcttttttt tttaagctt 139
<210> 26
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 26
agatctgggg tgctcgcttc ggcagcacat atactagtcg acgaaggttc agcagctcga 60
accaaggggt ggttcgccac cttctagagc ggacttcggt ccgctttttt ttttaagctt 120
<210> 27
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 27
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtgga atagtatacc attcgtggta 60
tagtatccca ccctttttta agctt 85
<210> 28
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 28
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtggt tcgccacctc agtcctggaa 60
acagggacct tttttaagct t 81
<210> 29
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 29
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtggt tcgccacctt tttttaagct 60
t 61
<210> 30
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 30
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtgga atagtatacc attcgtggta 60
tagtatccca ccccagtcct ggaaacaggg acctttttta agctt 105
<210> 31
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 31
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtgga atagtatacc attcgtggta 60
tagtatccca ccccagtcct ggaaacaggg accgggtttg ggtttgggtt tgggtttttt 120
tttaagctt 129
<210> 32
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 32
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtgga atagtatacc attcgtggta 60
tagtatccca ccccagtcct ggaaacaggg acctctagag ggccctgaag agggcccttt 120
ttttttttta agctt 135
<210> 33
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 33
agatctggga gagggccctg aagagggccc ttttctgaag gttcagcagc tcgaaccaag 60
gggtggaata gtataccatt cgtggtatag tatcccaccc cagtcctgga aacagggacc 120
gggtttgggt ttgggtttgg gttttttttt aagctt 156
<210> 34
<211> 163
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 34
agatctgggt gctcgcttcg gcagcacata tactagtcga cgaaggttca gcagctcgaa 60
ccaaggggtg gaatagtata ccattcgtgg tatagtatcc caccccagtc ctggaaacag 120
ggacctctag agcggacttc ggtccgcttt tttttttaag ctt 163
<210> 35
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 35
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtgga atagtatacc attcgtggta 60
tagtatccca cccgggtttg ggtttgggtt tgggtttttt tttaagctt 109
<210> 36
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 36
agatctgggg aaggttcagc agctcgaacc aaggggtgga atagtatacc attcgtggta 60
tagtatccca ccctctagag ggccctgaag agggcccttt ttttttaagc tt 112
<210> 37
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 37
agatctggga gagggccctg aagagggccc ttttctgaag gttcagcagc tcgaaccaag 60
gggtggaata gtataccatt cgtggtatag tatcccaccc gggtttgggt ttgggtttgg 120
gttttttttt aagctt 136
<210> 38
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 38
agatctgggt gctcgcttcg gcagcacata tactagtcga cgaaggttca gcagctcgaa 60
ccaaggggtg gaatagtata ccattcgtgg tatagtatcc caccctctag agcggacttc 120
ggtccgcttt tttttttaag ctt 143
<210> 39
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 39
gaattcgagg gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt 60
agagagataa ttagaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga 120
cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac 180
tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg 240
aaaggacaga tct 253
<210> 40
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 40
cacgtcgtgc ctcacatcga gcccgtggct agatgcatca tccctgatct gatcggaatg 60
ggtaagtccg gcaagagcgg gaatggctca tatcgcctcc tggatcacta caagtacctc 120
accgcttagt tcgagctgct gaaccttcca aagaaaatca tctttgtggg ccacgactgg 180
ggggcttgtc tggcctttca ctactcctac gagcaccaag acaagatcaa ggccatcgtc 240
catgctgaga gtgtcgtgga cgtgatcgag tcctgggacg agtggcctga catcgaggag 300
gatatcgccc tgatcaagag cgaagagggc gagaaaatgg tgcttgagaa taacttcttc 360
gtcgagacca tgctcccaag caagatcatg cggaaactgg agcctgagga gttcgctgcc 420
tacctggagc cattcaagga gaagggcgag gttagacggc ctaccctctc ctggcctcgc 480
gagatccctc tcgttaaggg aggcaagccc gacgtc 516
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 41
ggtaacgctg cctccagc 18
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 42
tgtagttgcg gacaatctgg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 43
ctcgctgcaa gcaaatgaac 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 44
tcgtcccagg actcgatcac 20
<210> 45
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 45
agatcgggtc ttcatggcct tgtgcagccg ctgggtggtt cgccacctca gtcctggaaa 60
cagggaccgg gtttgggttt gggtttgggt ttttttttaa gctt 104
<210> 46
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 46
agatcgggtc ttcatggcct tgtgcagccg ctgggtggtt cgccacctca gtcctggaaa 60
cagggacctc tagagggccc tgaagagggc cctttttttt taagctt 107
<210> 47
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 47
agatcgggtg ctcgcttcgg cagcacatat actagtcgac tcttcatggc cttgtgcagc 60
cgctgggtgg ttcgccacct cagtcctgga aacagggacc tctagagcgg acttcggtcc 120
gctttttttt ttaagctt 138
<210> 48
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 48
agatcgggtc ttcatggcct tgtgcagccg ctgggtggaa tagtatacca ttcgtggtat 60
agtatcccac ccttttttaa gctt 84
<210> 49
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 49
agatcgggtc ttcatggcct tgtgcagccg ctgggtggtt cgccacctca gtcctggaaa 60
cagggacctt ttttaagctt 80
<210> 50
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 50
agatcgggtc ttcatggcct tgtgcagccg ctgggtggtt cgccaccttt ttttaagctt 60
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 51
ggccgatgct aagaacatta agaag 25
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 52
ccacggtagg ctgagaaatg 20
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 53
ctccgatgaa cagggcgc 18

Claims (31)

1.一种指导RNA，其是用于编辑靶标RNA序列的指导RNA，其包含与该靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。
2.根据权利要求1所述的指导RNA，其中，反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接。
3.根据权利要求2所述的指导RNA，其中，在反义碱基序列的5’侧还连接有至少1个功能性碱基序列。
4.根据权利要求1所述的指导RNA，其还包含接头碱基序列。
5.根据权利要求4所述的指导RNA，其中，在短链型ADAR募集碱基序列上通过接头碱基序列连接有至少1个功能性碱基序列。
6.根据权利要求5所述的指导RNA，其中，反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接。
7.根据权利要求6所述的指导RNA，其中，在反义碱基序列的5’侧还连接有至少1个功能性碱基序列。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为与指导RNA的细胞内稳定化和/或细胞内的局部存在有关的碱基序列。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为选自形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列和形成茎环结构的碱基序列中的1种以上碱基序列。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为U6 snRNA序列。
11.根据权利要求9所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为形成1～4层的鸟嘌呤四链体结构的碱基序列。
12.根据权利要求9所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为形成茎环结构的碱基序列。
13.根据权利要求12所述的指导RNA，其中，形成茎环结构的碱基序列为来源于BoxB序列的碱基序列。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列由序列号6、7、8或9所示的碱基序列或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有功能的碱基序列构成。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列为由14～34个碱基构成的碱基序列。
16.根据权利要求15所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列为由16个碱基构成的序列。
17.根据权利要求15或16所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列的茎环结构的环部分为由4～5个碱基构成的碱基序列。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列的茎环结构的茎部分具有形成错配碱基对的碱基。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列由序列号1、2、3或4所示的碱基序列或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成。
20.根据权利要求4～19中任一项所述的指导RNA，其中，接头碱基序列为由15～25个碱基构成的碱基序列。
21.一种靶标RNA序列编辑系统，其包含权利要求1～20中任一项所述的指导RNA和ADAR。
22.一种核酸，其编码权利要求1～20中任一项所述的指导RNA。
23.一种表达载体，其包含编码权利要求1～20中任一项所述的指导RNA的核酸。
24.根据权利要求23所述的表达载体，其还包含编码ADAR的核酸。
25.一种宿主细胞，其被导入了权利要求23或24所述的表达载体。
26.一种生产表达载体的方法，其包括对权利要求25所述的宿主细胞进行培养的步骤。
27.一种药物组合物，其包含权利要求23或24所述的表达载体和药学上可接受的赋形剂。
28.一种药物组合物，其包含权利要求23所述的表达载体、包含编码ADAR的核酸的表达载体和药学上可接受的赋形剂。
29.根据权利要求27或28所述的药物组合物，其中，ADAR为人ADAR1或人ADAR2。
30.根据权利要求28或29所述的药物组合物，其中，编码ADAR的核酸为由编码序列号12所示的氨基酸序列的碱基序列、或者编码由与该氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性的多肽的碱基序列构成的核酸。
31.一种靶标RNA编辑方法，其包括：
(i)将权利要求1～20中任一项所述的指导RNA或权利要求22所述的核酸导入到细胞中的步骤；
(ii)该指导RNA募集ADAR的步骤；
(iii)靶标RNA序列与该指导RNA形成复合物的步骤；
(iv)被该指导RNA募集的ADAR将靶标RNA序列的腺苷转变为肌苷的步骤。
CN202080054392.3A 2019-08-01 2020-07-31 添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导rna Pending CN114174510A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019141875 2019-08-01
JP2019-141875 2019-08-01
PCT/JP2020/029386 WO2021020550A1 (ja) 2019-08-01 2020-07-31 機能性塩基配列を付加した標的編集ガイドｒｎａ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114174510A true CN114174510A (zh) 2022-03-11

Family

ID=74229702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080054392.3A Pending CN114174510A (zh) 2019-08-01 2020-07-31 添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导rna

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220275359A1 (zh)
EP (1) EP4008784A1 (zh)
JP (1) JPWO2021020550A1 (zh)
CN (1) CN114174510A (zh)
WO (1) WO2021020550A1 (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017220751A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
CA3159944A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 David HUSS Therapeutic editing
US20240247258A1 (en) * 2020-03-12 2024-07-25 Frest Inc. Oligonucleotide and target rna site-specific editing method
CA3173012A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 Susan BYRNE Compositions and methods using snrna components
US20240150754A1 (en) 2020-12-25 2024-05-09 Astellas Pharma Inc. Guide rna for editing polyadenylation signal sequence of target rna
EP4423266A1 (en) * 2021-10-27 2024-09-04 Shape Therapeutics Inc. Engineered rnas
WO2023150784A2 (en) * 2022-02-07 2023-08-10 The Regents Of The University Of California Method of interfering with repetitive rna
WO2023152371A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Proqr Therapeutics Ii B.V. Guide oligonucleotides for nucleic acid editing in the treatment of hypercholesterolemia
WO2024013360A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified oligonucleotides for adar-mediated rna editing
WO2024013361A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides for adar-mediated rna editing and use thereof
WO2024086650A1 (en) * 2022-10-18 2024-04-25 Locanabio, Inc. Compositions and methods comprising programmable snrnas for rna editing
GB202215614D0 (en) 2022-10-21 2022-12-07 Proqr Therapeutics Ii Bv Heteroduplex rna editing oligonucleotide complexes
WO2024110565A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of hereditary hfe-hemochromatosis
GB202218090D0 (en) 2022-12-01 2023-01-18 Proqr Therapeutics Ii Bv Antisense oligonucleotides for the treatment of aldehyde dehydrogenase 2 deficiency
WO2024121373A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of cardiovascular disease
GB202300865D0 (en) 2023-01-20 2023-03-08 Proqr Therapeutics Ii Bv Delivery of oligonucleotides
WO2024175550A1 (en) 2023-02-20 2024-08-29 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of atherosclerotic cardiovascular disease
GB202304363D0 (en) 2023-03-24 2023-05-10 Proqr Therapeutics Ii Bv Chemically modified antisense oligonucleotides for use in RNA editing
WO2024206175A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of neurological disorders
WO2024200472A1 (en) 2023-03-27 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of liver disease

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106062197A (zh) * 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
CN108291218A (zh) * 2015-07-15 2018-07-17 新泽西鲁特格斯州立大学 核酸酶非依赖性靶向基因编辑平台及其用途
US20190093098A1 (en) * 2015-09-26 2019-03-28 Eberhard Karls Universität Tübingen Methods and substances for directed rna editing
JP2019097555A (ja) * 2017-12-06 2019-06-24 学校法人福岡大学 オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030148519A1 (en) * 2001-11-14 2003-08-07 Engelke David R. Intracellular expression and delivery of siRNAs in mammalian cells
CN107109413B (zh) 2014-12-17 2021-03-09 ProQR治疗上市公司Ⅱ 靶向的rna编辑
EP3323890A4 (en) 2015-07-14 2019-01-30 Fukuoka University METHOD FOR INDUCING SITE SPECIFIC RNA MUTATIONS, TARGET EDITION GUIDING RNA-GUIDE USED IN THE METHOD, AND TARGET EDITING GUID-RNA TARGET RNA COMPLEX
WO2017220751A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
KR102501980B1 (ko) 2016-09-01 2023-02-20 프로큐알 테라퓨틱스 Ⅱ 비.브이. 화학적으로 변형된 단일 가닥 rna-편집 올리고뉴클레오타이드
US11274300B2 (en) 2017-01-19 2022-03-15 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotide complexes for use in RNA editing
WO2019111957A1 (ja) 2017-12-06 2019-06-13 学校法人福岡大学 オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106062197A (zh) * 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
CN108291218A (zh) * 2015-07-15 2018-07-17 新泽西鲁特格斯州立大学 核酸酶非依赖性靶向基因编辑平台及其用途
US20190093098A1 (en) * 2015-09-26 2019-03-28 Eberhard Karls Universität Tübingen Methods and substances for directed rna editing
JP2019097555A (ja) * 2017-12-06 2019-06-24 学校法人福岡大学 オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOOD, PD等: ""Expression of small, therapeutic RNAs in human cell nuclei"", 《GENE THERAPY》, vol. 4, no. 1, pages 3 - 4 *
NAHAR, SMITA等: ""A G-quadruplex motif at the 3\' end of sgRNAs improves CRISPR-Cas9 based genome editing efficiency"", 《CHEMICAL COMMUNICATION》, vol. 54, no. 19, pages 2, XP055789487, DOI: 10.1039/C7CC08893K *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4008784A1 (en) 2022-06-08
JPWO2021020550A1 (zh) 2021-02-04
WO2021020550A1 (ja) 2021-02-04
US20220275359A1 (en) 2022-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114174510A (zh) 添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导rna
CN114787357A (zh) 用于编辑靶标rna的添加了功能性区域的反义型指导rna
US11649454B2 (en) Single-stranded RNA-editing oligonucleotides
KR102666695B1 (ko) Rna를 편집하기 위한 방법 및 조성물
CA2968336C (en) Construct for site directed editing of an adenosine nucleotide in target rna
KR102602047B1 (ko) Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
CN113939591A (zh) 编辑rna的方法和组合物
KR101900962B1 (ko) 섬유아세포 성장 인자 21 (ｆｇｆ21)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 섬유아세포 성장 인자 21 (ｆｇｆ21) 관련된 질환의 치료
JP7432521B2 (ja) 新規小分子活性化ｒｎａ
JPH08502408A (ja) 特定のｒｎａ鎖の切断方法
CA2464626A1 (en) Method for the in vitro synthesis of short double stranded rnas
CA2365984A1 (en) Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
US11939580B2 (en) Construct of self-circularization RNA
US20240229010A1 (en) Tuning crispr/cas9 activity with chemically modified nucleotide substitutions
US11643658B2 (en) Oligonucleotides, manufacturing method for same, and target RNA site-specific editing method
KR20220122727A (ko) Rna의 표적 편집을 위한 신규한 방법
WO2023081311A1 (en) Methods of purifying dna for gene synthesis
CN116897047A (zh) 一种有效沉默细胞中的基因表达的生物稳定的XNAzyme
CN116981773A (zh) 用于编辑靶标rna的多聚腺苷酸化信号序列的指导rna
CN117242184A (zh) 向导RNA设计及用于V型Cas系统的复合物
EP3964582A1 (en) Oligomeric nucleic acid molecule, and application thereof in acute intermittent porphyria treatment
CN114829599A (zh) Scamp3抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
KR20230142365A (ko) 어셔 증후군 치료를 위한 유전자 편집 시스템
CN114829601A (zh) Sbds抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20220311