WO2019111957A1 - オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019111957A1
WO2019111957A1 PCT/JP2018/044751 JP2018044751W WO2019111957A1 WO 2019111957 A1 WO2019111957 A1 WO 2019111957A1 JP 2018044751 W JP2018044751 W JP 2018044751W WO 2019111957 A1 WO2019111957 A1 WO 2019111957A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
target
base sequence
rna
editing
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/044751
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
将虎 福田
Original Assignee
学校法人福岡大学
第一三共株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2018151757A external-priority patent/JP7333508B2/ja
Application filed by 学校法人福岡大学, 第一三共株式会社 filed Critical 学校法人福岡大学
Priority to US16/770,161 priority Critical patent/US11643658B2/en
Priority to EP18886229.6A priority patent/EP3722420A4/en
Publication of WO2019111957A1 publication Critical patent/WO2019111957A1/ja
Priority to US18/187,880 priority patent/US20230265431A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Definitions

  • the present invention relates to oligonucleotides, methods for their preparation and methods for site-specific editing of target RNAs.
  • RNA is a nucleic acid molecule from which DNA information is copied, and unlike DNA, it is a transient genetic information molecule whose synthesis and degradation are repeated. Therefore, modification of RNA information can give the target organism a transient genetic information modification effect that is not permanent. That is, although RNA modification technology is gene modification technology as well as DNA modification, its properties are greatly different.
  • RNA modification technique for example, in WO 2016/097212, a targeting moiety comprising an antisense sequence complementary to a part of a target RNA can be present in a cell and the nucleotide can be edited Oligonucleotide constructs for site-specific editing of nucleotides in target RNA sequences have been described, including a recruitment moiety that can be bound and recruited to an RNA editing entity.
  • WO 2017/010556 describes a site-specific RNA mutation introduction method that causes double-strand-specific adenosine deaminase (ADAR) to act on a complex of target RNA and target editing guide RNA .
  • ADAR double-strand-specific adenosine deaminase
  • the oligonucleotide construct described in WO 2016/097212 has a stem-loop structure having a specific repetitive sequence as a recruitment moiety in addition to the targeting moiety, and the recruitment moiety has 16 or more oligonucleotides. Need.
  • the target editing guide RNA described in WO 2017/010556 requires an ADAR binding region having a stem-loop structure consisting of a specific sequence of 40 or 49 residues.
  • the oligonucleotides applied to the RNA modification techniques described in WO 2016/097212 or WO 2017/010556 all have a certain degree of binding to the ADAR in addition to the site that forms a duplex with the target RNA.
  • the intramolecular double-stranded region having a length of 1 was essential, and the total length of the oligonucleotide necessarily tended to be long.
  • An object of the present invention is to provide a short-type target editing guide RNA capable of inducing site-specific editing despite the small number of nucleotides added to the target recognition site.
  • the specific means for solving the said subject is as follows, and this invention includes the following aspects.
  • the first embodiment comprises a first oligonucleotide specifying a target RNA, and a second oligonucleotide linked to the 3 'side of the first oligonucleotide, wherein the first oligonucleotide comprises an adenosine residue in the target RNA.
  • the second aspect is a method of site-specific editing of target RNA, comprising contacting the target RNA with an oligonucleotide that induces site-specific editing to the target RNA in the presence of adenosine deaminase.
  • the third embodiment comprises: selecting a target RNA containing an adenosine residue which is an editing target; and a first base sequence for 15 to 30 residues 3 'of the adenosine residue possessed by the target RNA, Obtaining a second base sequence of 3 or 4 residues on the 5 'side of an adenosine residue, and a third base sequence of at least 2 residues adjacent to the 5' side of the second base sequence; An oligonucleotide having a base sequence complementary to a first base sequence, a target corresponding nucleotide residue corresponding to an adenosine residue, and an oligonucleotide having a base sequence complementary to the second base sequence; Preparing an oligonucleotide in which the oligonucleotide having a base sequence complementary or non-complementary to the third base sequence is sequentially linked from the 5 'side; It is a production method.
  • RNA capable of inducing site-specific editing despite the small number of nucleotides added to the target recognition site.
  • FIG. 5 is a diagram showing the editing induction activity of target editing guide RNA in cells expressing hADAR. It is a figure which shows the relationship between the number of residues of an ADAR binding region, and edit induction activity. It is a figure which shows the specificity of the edit position of target edit guide RNA.
  • each component in the composition means the total amount of the plurality of substances present in the composition unless a plurality of substances corresponding to each component are present in the composition.
  • Target Editing Guide RNA The oligonucleotide that induces site-specific editing of the target RNA (hereinafter also referred to as target editing guide RNA) comprises a first oligonucleotide specifying the target RNA and a second oligonucleotide linked to the 3 'side of the first oligonucleotide.
  • the first oligonucleotide corresponds to an adenosine residue in the target RNA, and is linked to a target corresponding nucleotide residue corresponding to the adenosine residue and 5 'of the target corresponding nucleotide residue, to the target RNA
  • It consists of
  • the second oligonucleotide consists of 2 to 24 nucleotide residues and has a base sequence complementary or non-complementary to the corresponding base sequence of the target RNA.
  • the target editing guide RNA has a short second oligonucleotide having a sequence complementary or non-complementary to the corresponding base sequence of the target RNA on the 3 'side of the first oligonucleotide specifying the target RNA
  • excellent site-specific editing can be induced. This is because, for example, the ADAR that catalyzes target editing recognizes a double-stranded region consisting of the target RNA and the first oligonucleotide, and does not form a double strand with the target RNA, but in a state released from the target RNA
  • the second oligonucleotide that may be present enhances its editing activity.
  • the first oligonucleotide functions as a complementary region (antisense region; ASR) to the target RNA
  • the second oligonucleotide serves as an editing enhancement region, an ADAR binding region (ADAR recruitment region; ARR) It is considered to function as
  • the target editing guide RNA of the present embodiment since the length is short compared to the conventional target editing guide RNA, the manufacturing cost is simply reduced. In addition to the method of introducing target editing guide RNA into cells by gene expression, chemical synthesis is facilitated, and a method of direct cell introduction of chemically synthesized target editing guide RNA is also facilitated. In addition to that, existing artificial nucleic acids and the like used in nucleic acid drug development and the like can be applied to the target editing guide RNA. As a result, it is possible to provide a more highly functional target editing guide RNA by the improvement of intracellular degradation resistance, the improvement of cell transfer efficiency and the like. Furthermore, by configuring the target editing guide RNA with the minimum number of residues necessary for editing induction, while maintaining the specificity for the target RNA, the off target editing at positions other than the editing target adenosine residue is suppressed be able to.
  • the target editing guide RNA induces site specific editing for the target RNA, for example, by recruiting ADAR to target RNA, which catalyzes the target editing.
  • ADAR is an enzyme that converts adenosine residues in double-stranded RNA into inosine residues by hydrolytic deamination, and is widely present in mammalian cells. Since inosine residues are similar in structure to guanosine residues, they are translated as guanosine residues when translating RNA information, and as a result, RNA information is edited. If such RNA editing occurs in the part encoding the amino acid, amino acid substitution etc. will occur even though there is no DNA mutation on the genome.
  • ADAR1, ADAR2 and ADAR3 which differ in gene are known as ADAR in mammals.
  • the target editing guide RNA enhances the target editing activity of ADAR1 or ADAR2 among these.
  • the target editing guide RNA when introduced into mammalian cells, can recruit ADAR present in the cells to the target RNA to induce site specific editing for the target RNA.
  • the first oligonucleotide contained in the target editing guide RNA identifies the target RNA.
  • the target RNA is not particularly limited as long as it contains an adenosine residue to be edited, and is preferably cellular RNA or viral RNA, and is usually a pre-mRNA or mRNA encoding a protein. Editing sites in the target RNA may be present in untranslated regions, splice regions, exons, introns, or any region that affects the stability, structure or function of RNA.
  • the target RNA may also contain a mutation to be corrected or altered. Alternatively, the target RNA may be one whose sequence has been mutated to encode a phenotype different from that of the native form.
  • the target RNA is preferably an RNA encoding a protein
  • specific examples of the encoded protein include signal transduction such as serotonin receptor, glutamate receptor, membrane voltage-dependent potassium channel, STAT3, NFkBIA, and MAPK14.
  • signal transduction such as serotonin receptor, glutamate receptor, membrane voltage-dependent potassium channel, STAT3, NFkBIA, and MAPK14.
  • Involved phosphorylated proteins can be mentioned.
  • the target editing guide RNA can be applied, for example, to the treatment of hereditary diseases.
  • Hereditary diseases include cystic fibrosis, albinism, alpha-1 antitrypsin deficiency, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, asthma, beta-thalassemia, CADASIL syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, Chronic Obstructive Lung (COPD), Distal Spinal Muscular Atrophy (DSMA), Duchenne / Becker Muscular Dystrophy, Dystrophy Epidermolysis Bullosa, Epidermylosis Bullosa, Fabry's Disease, Factor V Leiden Related Disorders, Familial Adenoma, Polyposis , Galactosemia, Gaucher disease, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, hemophilia, hereditary hemachromatosis, Hunter's syndrome, Huntington's disease, Harrah's syndrome, inflammatory bowel disease (IBD), hereditary
  • the first oligonucleotide is linked to the target corresponding nucleotide residue corresponding to the editing target adenosine residue in the target RNA, corresponding to the editing target adenosine residue, and 5 'of the target corresponding nucleotide residue
  • Oligonucleotides linked respectively to the 5 'side and 3' side of the target corresponding nucleotide residue form a double strand with the target RNA, thereby specifying the target RNA and the editing target site in the target RNA.
  • the target corresponding nucleotide residue is a nucleotide residue corresponding to the editing target adenosine residue, and is, for example, a cytidine residue, a uridine residue, an adenosine residue or a derivative thereof.
  • the target-corresponding nucleotide residue is preferably a base that does not form a base pair with the editing-targeted adenosine residue, more preferably a cytidine residue or a derivative thereof, and still more preferably a cytidine residue.
  • the nucleotide sequence of the oligonucleotide linked to the 5 'side or 3' of the target corresponding nucleotide residue is a nucleotide sequence complementary to the corresponding nucleotide sequence of the target RNA.
  • the number of oligonucleotide residues linked to the 5 'side of the target corresponding nucleotide residue is, for example, 15 to 26, or 15 to 20 in view of the specificity to the target RNA.
  • an additional sequence that controls expression may be separately linked by about 1 to 6 residues on the 5 'side of the oligonucleotide linked to the 5' side of the target corresponding nucleotide residue, as needed.
  • the number of oligonucleotide residues linked to the 3 'side of the target corresponding nucleotide residue is preferably 3, from the viewpoint of editing activity.
  • the second oligonucleotide consists of 2 or more and 24 or less nucleotide residues, and has a base sequence complementary or non-complementary to the corresponding base sequence of the target RNA.
  • the second oligonucleotide does not form a complementary base pair with the target RNA and can be released from the target RNA.
  • the detailed mechanism is unknown, but it is thought that the presence of this free oligonucleotide chain contributes to the enhancement of the editing activity of ADAR.
  • the second oligonucleotide comprises a guanosine residue linked adjacent to the target corresponding nucleotide residue.
  • the editing activity of ADAR is further enhanced if the second oligonucleotide is a two or more residue oligonucleotide containing a guanosine residue linked adjacently to the target corresponding nucleotide residue Tend.
  • the second oligonucleotide (for example, ARR) efficiently induces site-specific editing by linking to the 3 'side of the first oligonucleotide specifying the target RNA, but links to the 5' side. In this case, the inducibility of site-specific editing is reduced.
  • site-specific editing can be induced even if the ADAR binding region (ARR) is linked to either the 3 'side or 5' side of the first oligonucleotide. Therefore, it is considered that the target editing guide RNA according to the present embodiment differs from the conventional target editing guide RNA in the mechanism for inducing site-specific editing.
  • the number of residues of the second oligonucleotide is 2 or more and 24 or less, preferably 20 or less, more preferably 16 or less, still more preferably 15 or less, particularly preferably 14 or less, and for example, 3 or more And 4 or more, 8 or more, 12 or more, or 13 or more.
  • the number of residues of the second oligonucleotide is, for example, 22 or less.
  • the second oligonucleotide When the second oligonucleotide has a sequence non-complementary to the corresponding nucleotide sequence of the target RNA, it only needs to have a non-complementary nucleotide sequence as a whole, and is complementary to the target RNA in the second oligonucleotide. It does not exclude the inclusion of nucleotide residues that can form a basic base pair.
  • the content of the non-complementary base sequence in the base sequence of the second oligonucleotide and the corresponding target RNA is, for example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more.
  • the content rate of the non-complementary base sequence is calculated by dividing the number of nucleotide residues that are combinations of non-complementary bases among the corresponding base pairs by the number of residues of the second oligonucleotide.
  • the base sequence of the second oligonucleotide may be appropriately selected according to the corresponding base sequence of the target RNA, etc. .
  • the corresponding base of the target RNA is a pyrimidine base
  • a purine residue or pyrimidine base that does not form a base pair may be selected as the corresponding base of the second oligonucleotide, and is preferably a pyrimidine base.
  • a pyrimidine residue or a purine base which does not form a base pair may be selected as the corresponding base of the second oligonucleotide, preferably a purine residue.
  • a pyrimidine residue or a purine base which does not form a base pair may be selected as the corresponding base of the second oligonucleotide, preferably a purine residue.
  • the corresponding base of the target RNA is cytosine (C), cytosine (C), uracil (U) or adenine (A)
  • it is C or U.
  • uracil (U), uracil (U), cytosine (C) or guanine (G) may be selected as the corresponding base of the second oligonucleotide, preferably U or C. It is.
  • uracil (U), uracil (U), cytosine (C) or guanine (G) may be selected as the corresponding base of the second oligonucleotide, preferably U or C. It is.
  • adenine (A), adenine (A), guanine (G) or cytosine (C) may be selected as the corresponding base of the second oligonucleotide, preferably A or G. It is.
  • the corresponding base of the target RNA is guanine (G), adenine (A), guanine (G) or uracil (U) may be selected as the corresponding base of the second oligonucleotide, preferably A or G. It is.
  • Specific examples of the second oligonucleotide having a sequence non-complementary to the corresponding base sequence of the target RNA are, for example, GGG, GG, GC, GA, GU, UC, UG, UA, UU, CG, CA , CU, CC, AG, AA, AC, AU, etc.
  • the second oligonucleotide may have a base sequence capable of forming a stem-loop structure in the molecule.
  • the editing activity tends to be further enhanced. This is considered to be because, for example, the second oligonucleotide forms a stem loop structure to make the release from the target RNA more stable.
  • the stem-loop structure includes a stem portion which forms a duplex in the molecule by complementary base pairing, and a loop portion which connects two oligonucleotides constituting the stem portion.
  • the number of nucleotide residue pairs constituting the stem portion is, for example, 2 pairs or more, preferably 3 pairs or more, 4 pairs or more, 5 pairs or more, or 6 pairs or more, and 10 pairs or less, 9 pairs or less, 8 pairs or less, or 7 pairs or less.
  • the number of nucleotide residues constituting the loop portion is, for example, 4 or 5.
  • the base sequence of the second oligonucleotide is not particularly limited as long as it can form a stem loop structure.
  • the case where the second oligonucleotide has a base sequence represented by (RY or YR) n Nm (RY or Y R) n is excluded.
  • R is adenosine or guanosine
  • Y is uridine or cytidine
  • N is adenosine, guanosine, cytidine, uridine or inosine.
  • m is 3 or more
  • n is 4 or more.
  • the base sequences represented by two (RY) n or (Y R) n form a double-stranded stem structure by complementary base pairing.
  • the base sequence of the stem portion contains guanine (G) and cytosine (C) from the viewpoint of the stability of double-stranded structure as the base sequence of the second oligonucleotide forming the stem loop structure preferable.
  • the percentage of GC pairs in the base pairs of the stem portion is, for example, 60% or more, preferably 70% or more.
  • uracil (U) capable of forming a base pair with guanine (G) by tautomerism may be contained.
  • the base sequence of the second oligonucleotide is a sequence consisting of 2 or 3 consecutive guanines (GG or GGG), continuous uracil and guanine in the stem portion on the 5 'side from the viewpoint of target editing activity (UG), and at least one selected from the group consisting of consecutive guanine, a sequence consisting of uracil and guanine (GUG), and a sequence capable of forming a complementary pair with the stem portion on the 3 'side (eg, It is preferred to include CC, CCC, CCU, CA, CAC).
  • the 5 'stem portion contains a sequence (GUG) consisting of guanine, uracil and guanine which is continuous with the loop portion, and a sequence (for example, CAC) capable of forming a complementary pair with this on the 3' stem portion It is also preferred to include.
  • GUIG sequence consisting of guanine, uracil and guanine which is continuous with the loop portion
  • CAC sequence capable of forming a complementary pair with this on the 3' stem portion It is also preferred to include.
  • the loop portion of the second oligonucleotide may be, for example, an arbitrary sequence of 4 or 5 residues.
  • Specific examples of the sequence of the loop portion include UNCU fold types such as GCUAA; UUCG, UACG, UGCG, UCCG and the like; GNAR fold types such as GAAA, GUAA, GCAA, GGAA, GAGA, GUGA, GCGA, GGGA and the like; RNYA fold type such as GCCA, GGCA, GACA, AUCA, ACCA, AACA, GUUA, GCUA, GCUA, GGUA, GAUA, AAUA, ACUA, AGUA, AAUA, etc.
  • Nucleotide residues constituting the target editing guide RNA may be naturally occurring ribonucleotide residues or non-naturally occurring modified nucleotide residues.
  • modified nucleotide residues those modified with phosphodiester bond between nucleosides, those modified with 2 'hydroxyl group of ribose, those containing intramolecularly cross-linked ribose, those modified with at least one of purine base and pyrimidine base Etc. are included.
  • Examples of modification of the phosphodiester binding moiety include, for example, phosphorothioation, methylphosphonate, methylthiophosphonate, phosphorodithioate, phosphoroamidation, peptide bond substitution and the like.
  • Examples of modification of the 2 'hydroxyl group of ribose include 2'-O-methylation, 2'-O-methoxyethylation, 2'-O-aminopropyl (AP) formation, 2'-fluorination, 2'- Examples include O-methylcarbamoylethylation, 3,3-dimethylallylation and the like.
  • Examples of intramolecular crosslinks of ribose include nucleotides (2 ', 4'-BNA) in which 2' and 4 'positions are cross-linked.
  • Examples of 2 ′, 4′-BNA include locked nucleic acid ( ⁇ -L-methyleneoxy (4′-CH 2 —O-2 ′) BNA or ⁇ -D-methyleneoxy (4′-), which is also called LNA.
  • CH 2 -O-2 ') BNA ethyleneoxy (4'-(CH 2 ) 2 -O-2 ') BNA), also called ENA, ⁇ -D-thio (4'-CH 2 -S-2) ') BNA, aminooxy (4'-CH 2 -O-N (R) -2') BNA (R is, H, or CH 3), 2 ', both 4'-BNANC referred oxyamino (4' -CH 2 -N (R) -O-2 ') BNA (R is H or CH 3 ), 2', 4'-BNACOC, 3'amino-2 ', 4'-BNA, 5'-methyl BNA , also referred cEt-BNA (4'-CH ( CH 3) -O
  • modification of the base moiety are halogenation; methylation, ethylation, n-propylation, isopropylation, cyclopropylation, n-butylation, isobutylation, sec-butylation, t-butylation, cyclobutylation Alkylation such as; hydroxylation; amination; deamination; demethylation and the like.
  • a method for producing a target editing guide RNA comprises: a selection step of selecting a target RNA containing an adenosine residue which is an editing target; and 15 on the 3 'side of the adenosine residue possessed by the target RNA.
  • An oligonucleotide having a base sequence complementary to a base sequence and an oligonucleotide having a base sequence non-complementary to the third base sequence are sequentially linked from the 5 'side.
  • target RNAs containing adenosine residues to be edited targets are selected.
  • Target RNA is selected from RNA synthesized by DNA-dependent RNA polymerase depending on the purpose of RNA editing and the like.
  • the target RNA may be any of mRNA transcribed from genomic DNA, mRNA without modification of base, mRNA precursor without splicing, ncRNA and the like, preferably mRNA or mRNA precursor.
  • adenosine residues as editing targets may be untranslated regions, splice regions, exon regions, intron regions, or any region that affects RNA stability, structure or function. It may exist.
  • the base sequence of the selected target RNA is acquired.
  • the obtained base sequence is a first base sequence corresponding to the oligonucleotide 3 'of the adenosine residue as an editing target, and a second base sequence for 3 or 4 residues 5' of the adenosine residue. And a third base sequence for at least two residues adjacent to the 5 'side of the second base sequence.
  • the sequence complementary to the first base sequence is the base sequence of the oligonucleotide linked to the 5 'side of the target corresponding nucleotide residue in the target editing guide RNA to be produced.
  • a sequence obtained by linking a sequence complementary to the second base sequence and a sequence complementary or non-complementary to the third base sequence is a target corresponding nucleotide residue in the target editing guide RNA to be produced. It becomes the base sequence of the oligonucleotide linked to 3 'side.
  • the nucleotide sequence complementary to or non-complementary to the third nucleotide sequence can be appropriately selected with reference to the nucleotide sequence of the second oligonucleotide described above.
  • the number of nucleotide residues for which a base is specified as the first base sequence is 15 or more and 30 or less, preferably 15 or more and 26 or less, and more preferably 15 or more and 20 or less.
  • the number of nucleotide residues for which a base is specified as the second base sequence is 3 or 4, preferably 3.
  • the number of nucleotide residues for which the base is specified as the third base sequence is 2 or more, and for example, 24 or less, preferably 20 or less, more preferably 16 or less, still more preferably 15 or less, particularly preferably 14 It is below.
  • the method for obtaining the base sequence is not particularly limited as long as the base sequence of the target oligonucleotide can be identified, and can be appropriately selected from commonly used methods.
  • the base sequence of the target RNA is known in a database or the like, the base sequence of the necessary part may be extracted and obtained from the known base sequence.
  • the base sequence may be obtained by preparing cDNA from a target RNA and determining the base sequence of the cDNA by a conventional method.
  • an oligonucleotide having a base sequence complementary to the first base sequence an oligo having a base sequence complementary to the target base nucleotide residue corresponding to an adenosine residue, and a second base sequence
  • An oligonucleotide is prepared in which a nucleotide and an oligonucleotide having a base sequence complementary or non-complementary to the third base sequence are sequentially linked from the 5 'side.
  • the oligonucleotide to be prepared will be a target editing guide RNA comprising a first oligonucleotide specifying a target RNA and a second oligonucleotide linked to the 3 'of the first oligonucleotide.
  • An oligonucleotide having a predetermined base sequence can be produced by a known method. For example, with reference to the description of WO 2017/010556 etc., it can be prepared using an appropriate synthetic oligo DNA. It can also be prepared using synthetic oligo DNA having a promoter sequence such as T7 promoter on the 5 'side of the base sequence of the target editing guide RNA. Furthermore, they can be prepared by chemical synthesis by known production methods such as the phosphoroamidite method. Furthermore, cDNA having a base sequence complementary to the oligonucleotide is prepared by a conventional method, plasmid DNA containing the obtained cDNA is constructed, and the obtained plasmid DNA is introduced into appropriate cells and transcribed to RNA. It can also be prepared.
  • Target RNA comprises target RNA and target editing guide RNA, which is an oligonucleotide that induces site-specific editing for target RNA, in the presence of adenosine deaminase Including contacting.
  • the target editing guide RNA partially forms a duplex with the target RNA, and by recruiting adenosine deaminase, it is possible to site-specifically convert an adenosine residue contained in the target RNA into an inosine residue.
  • the site-specific editing method of target RNA can be performed, for example, by introducing or expressing the target editing guide RNA described above in a eukaryotic cell having the target RNA.
  • the method of introducing the target editing guide RNA into eukaryotic cells can be appropriately selected and applied from various methods used in nucleic acid medicine.
  • the target editing guide RNA can be expressed in eukaryotic cells.
  • target editing guide RNA By applying site-directed editing methods of target RNA using target editing guide RNA to mutation of amino acids involved in functional expression of intracellular proteins such as glycosylation site, phosphorylation site, metal coordination site, etc. It becomes possible to provide a new methodology of temporally controlling protein function.
  • generalizing the function control method of protein in vivo by site-specific editing method of target RNA using target editing guide RNA will be a molecular technology that can contribute to the development of research in the life science field.
  • RNA Ribonucleic acid
  • siRNA siRNA
  • aptamer functional RNA
  • medicines that convert mRNA information and modify the function of the target protein encoded by mRNA have not yet been exemplified.
  • target editing guide RNAs have the potential to generate novel nucleic acid drugs that show unprecedented efficacy.
  • a nonsense hereditary disease is a disease caused by the fact that the original protein is not synthesized by the stop codon formed by the point mutation on the gene.
  • nonsense mutant hereditary diseases include muscular dystrophy, multiple sclerosis, Alzheimer's disease, nerve tissue degeneration such as Parkinson's disease, and cancer.
  • target editing guide RNA to edit stop codons such as UAA, UAG, UGA, etc.
  • use as a nucleic acid drug having an unprecedented mechanism for the above-mentioned diseases can be considered.
  • RNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the obtained RNA is purified by 8 M Urea PAGE (8%), extracted by crushing and immersion, and purified by 0.22 mm filter (manufactured by DURAPORE) and gel filtration (manufactured by BIO RAD), and the residue number is 160 nt.
  • Model target RNA sGFP was prepared. The sequences of the primers used and the resulting model target RNA are shown in Table 2.
  • Example 1 Preparation of Target Editing Guide RNA
  • a reaction solution containing 100 mM of synthetic oligo DNA (F) (gRNA3r_T7F) and 100 mM of synthetic oligo DNA (R) (gRNA3r_del02) is treated at 95 ° C. for 3 minutes, then reduced to 25 ° C. for 15 minutes Then, an annealing reaction was performed to obtain a DNA (gRNA3r_del02F / R) in which only the T7 promoter region had formed a double strand.
  • RNA target editing guide RNA
  • T7-Scribe Standard RNA IVT KIT manufactured by CELLSCRIPT
  • RNA was purified by phenol / chloroform extraction, and ethanol precipitation.
  • the obtained RNA is purified by 8 M Urea PAGE (8%), extracted by crushing and immersion, and purified by 0.22 mm filter (manufactured by DURAPORE) and gel filtration (manufactured by BIO RAD) to obtain the target.
  • the target editing guide RNA (del02) was obtained.
  • the sequences of the synthetic oligo DNAs used are shown in Table 3, and the sequences of the obtained target editing guide RNA are shown in Table 4. Also, only the ADAR binding region (ARR; second oligonucleotide) of the target editing guide RNA is shown in Table 6.
  • Example 2 to 9 The target editing guide RNAs of Examples 2 to 9 were obtained in the same manner as in Example 1 except that synthetic oligo DNAs shown in Table 3 were used as synthetic oligo DNAs (R).
  • the sequence of the obtained target editing guide RNA is shown in Table 4. Also, only the ADAR binding region (ARR; second oligonucleotide) of the target editing guide RNA is shown in Table 6.
  • Comparative Examples 1 and 2 The target editing guide RNA of Comparative Example 12 was obtained in the same manner as in Example 1 except that synthetic oligo DNAs shown in Table 3 were used as synthetic oligo DNAs (R). The sequence of the obtained target editing guide RNA is shown in Table 4.
  • Example 2 Referring to the description of Example 1 of WO 2017/010556, a conventional target editing guide in which an ADAR binding region consisting of 49 residues forming a stem-loop structure is linked to the 3 'side of the antisense region RNA (hereinafter also referred to as SL49) was prepared. Specifically, using gRNA3r_Glu_T7F as synthetic oligo DNA (1) and gRNA3r_Glu_conseq_R as synthetic oligo DNA (2), the target editing guide RNA of Reference Example 2 was obtained. The sequence of the synthetic oligo DNA used and the sequence of the obtained target editing guide RNA (SL49) are shown in Table 5.
  • ⁇ Evaluation 1> The editing induction activity of the target editing guide RNA prepared above was evaluated in vitro using a model target RNA. First, complex was formed between the model target RNA and the target editing guide RNA by the annealing reaction, and the purified recombinant hADAR2 was added to perform editing reaction. In order to analyze the editing efficiency of the target site, the cDNA of the target RNA was amplified by RT-PCR, and the editing ratio was calculated from the chromatography chart obtained by direct sequencing. The specific protocol is as follows.
  • RNA complex and 12.5 nM hADAR2 Reaction buffer (20 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 100 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 0.5 mM DTT, 0.01% Triton X-100, 5% glycerol, 1 U / Editing reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour in ⁇ L Murine RNase Inhibitor (manufactured by New England BioLabs). After the reaction, RNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and dissolved in 5 ⁇ L of TE buffer.
  • Murine RNase Inhibitor manufactured by New England BioLabs
  • the recovered RNA sample was subjected to reverse transcription using PrimeScript Reverse Transcriptase II (TaKaRa) to synthesize cDNA.
  • TaKaRa PrimeScript Reverse Transcriptase II
  • amplification of dsDNA was performed by PCR using 0.3 ⁇ M T7GFP_sRNA_F01 primer and 0.3 ⁇ M GFP_sRNA_R01 primer.
  • Direct sequencing of dsDNA amplified with 0.165 ⁇ M T7proGGG primer was performed using Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.
  • the editing ratio (%) was calculated by the ratio G / (G + A) of the peak heights of the obtained chromatogram. The results are shown in Table 8 and FIG.
  • Targeted editing guide RNAs (gRNA) del02, del03 and del03.5 showed editing-inducing activity comparable to conventional type (SL49).
  • target editing guide RNA (gRNA) in which any two residues are added to the 3 'side of the antisense region (ASR) shows enhanced editing-inducing activity substantially as compared to Irdel of only the antisense region.
  • target editing guide RNA (del06) having two consecutive guanosine residues adjacent to the 3 'side of ASR showed more enhanced editing-inducing activity.
  • target editing guide RNA is considered to form a partially double-stranded complex as shown in FIG. 2A with target RNA (Target RNA).
  • the first oligonucleotide portion functions as an antisense region (ASR) to form a duplex with the target RNA
  • the second nucleotide linked to the 3 'side of the first oligonucleotide is the target RNA. It is thought that it exists in a free state.
  • the second nucleotide is a short strand having up to about 4 residues, even if the second nucleotide has a sequence complementary to the corresponding base sequence of the target RNA, it is released due to thermal fluctuation.
  • the second oligonucleotide of the target editing guide RNA may form a stem-loop structure in the molecule as shown in FIG. 2B.
  • a more stable stem-loop structure is formed, which is considered to further improve the editing activity.
  • a 0.3 ⁇ M AcGFP_W58X_F01 primer, a 0.3 ⁇ M AcGFP_RNA_HindIII_R01 primer, and PrimeStar GXL DNA Polymerase were used to generate a 3 ′ template DNA by PCR.
  • the PCR conditions were: 98 ° C./10 seconds, 55 ° C./15 seconds, 68 ° C./40 seconds, 30 cycles.
  • a template DNA was prepared by PCR using 0.3 ⁇ M AcGFP_XhoI_kozF01 primer, 0.3 ⁇ M AcGFP_RNA_HindIII_R01 primer, and PrimeStar GXL DNA Polymerase for each 100-fold diluted sample.
  • the PCR conditions were: 98 ° C./10 seconds, 55 ° C./15 seconds, 68 ° C./60 seconds, 30 cycles.
  • the obtained template DNA and pcDNA3.1 (-) Hygro were digested with XhoI and HindIII at 37 ° C. for 1 hour.
  • the molar ratio of vector: plasmid was made 1: 5 using DNA Ligation Kit (TaKaRa), and Ligation reaction was performed at 16 ° C. for 30 minutes. 2 ⁇ L of the solution after ligation was added to 20 ⁇ L of E. coli. E.
  • coli DH5 ⁇ competent cells (TaKaRa) were added for transformation, and cultured in LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C., day and night. Insert using colony PCR (0.3 ⁇ M pcDNA3_1pro_F01 primer, 0.3 ⁇ M pcDNA3_1-seqR01 primer, 98 ° C./10 sec, 55 ° C./30 sec, 72 ° C./30 sec, 30 cycles) using Ex Taq (TaKaRa) I did a check. Thereafter, colonies in which the plasmid in which the insert is inserted were transformed were cultured in liquid medium to extract the plasmid.
  • Example 10 Construction of short-chain type 5AS-shADg_GFP173 expression plasmid After an annealing reaction (95 ° C, 3 minutes, slope to 25 ° C / 15 minutes) of 2 ⁇ M ADgrGFP173_del3_BglF and ADgrGFP173_del3_HindR, extension reaction was performed using 0.2mM dNTP and Klenow flagment (25.degree. C., 30 minutes). The template DNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. The template DNA and pSuper-neo were digested with BglII and HindIII (37 ° C., 1 hour).
  • aKaRa DNA Ligation Kit
  • Ligation reaction was performed at 16 ° C. for 30 minutes. 2 ⁇ L of the solution after ligation was added to 20 ⁇ L of E. coli. E. coli DH5 ⁇ competent cells (TaKaRa) were added for transformation, and cultured on LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin (37 ° C., day and night).
  • Colony PCR (0.3 ⁇ M pSuper.neo-InsCheck_F01 primer, 0.3 ⁇ M pSuper.neo-InsCheck_R01 primer, 98 ° C./10 sec, 55 ° C./30 sec, 72 ° C./30 sec using Ex Taq (TaKaRa) , 30 cycles) were carried out. Thereafter, colonies in which the insert was inserted and the plasmid was transformed were cultured in liquid medium to extract the plasmid. Finally, Big Dye Terminator, 0.165 ⁇ M pSuper. neo-InsCheck_F01 primer, 0.165 ⁇ M pSuper.
  • Example 11 Construction of short-chain type ADg_rGFP_del035 expression plasmid
  • a plasmid was constructed in the same manner as Example 10 except that grGFP173_del35_BglF and grGFP173_del35_HindR were used as primers.
  • the sequences of the primers used are shown in Table 10.
  • the obtained plasmid (pSuper_ADg_rGFP_del03.5) expresses a target editing guide RNA (ADg_rGFP_del035) corresponding to the target editing guide RNA (del03.5) of Example 3.
  • a plasmid (pcDNA3.1 ( ⁇ ) Hygro_hADAR2) expressing human adenosine deaminase 2 (hADAR2) was constructed as follows. (Reference Example 5) Construction of pcDNA3.1 (-) Hygro_HisADAR2 PCR was carried out under the conditions of an extension reaction of 2 minutes using pYES / NT_A_ADAR2 as a template and the 0.25 ⁇ M HisADAR2_XbaF01 primer and the 0.25 ⁇ M HisADAR2_KpnR01 primer. The insert was amplified by PCR. The insert and pcDNA3.1 (-) Hygro were subjected to enzyme reaction for 1 hour at 37 ° C.
  • E. coli DH5 ⁇ competent cells (TaKaRa) were added for transformation, and cultured overnight on LB ampicillin agar medium. Perform PCR with 2 ⁇ M T7proGGG primer and 0.3 ⁇ M BGH reverse primer using the generated colonies as a template under the condition for 2 minutes of extension reaction, insert check, and the clone that produces the amplification product of the desired fragment length The solution was grown.
  • gRNA target editing guide RNA 1 HEK 293 cells were seeded in a 35 mm glass dish at 1.6 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 48 hours. Then, using X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche), 700 ng of ADAR2 expression plasmid (pcDNA3.1 (-) Hygro_His-ADAR2), 700 ng of substrate RNA expression plasmid (pcDNA3.1 (-) Hygro_AcGFPW58X) and 700 ng Were transduced with the gRNA expression plasmid (pSuper_neo_5AS-ADg_GFP173 or pSuper_neo_5AS-shADg_GFP173) and cultured for 72 hours.
  • gRNA expression plasmid pSuper_neo_5AS-ADg_GFP173 or pSuper_neo_5AS-shADg_GFP173
  • Intracellular editing inducibility evaluation of target editing guide RNA (gRNA) 2 The intracellular editing inducibility was evaluated in the same manner as described above except that pSuper_ADg_rGFP_del03.5 obtained in Example 11 was used as a gRNA expression plasmid. The results are shown in FIG.
  • Example 12 A target editing guide RNA having the base sequence of the second oligonucleotide (ARR) shown in Table 12 was produced according to the method described in Example 1. The editing induction activity of the obtained target editing guide RNA was evaluated together with the target editing guide RNA (ARR_wt) obtained in Example 3 by the same method as the evaluation 1 described above. The results are shown in Table 13 and FIG.
  • the target editing guide RNA is that the first oligonucleotide has a base sequence complementary to the corresponding base sequence of the target RNA on the 5 'side of the target corresponding nucleotide residue (for example, C).
  • a second oligonucleotide having a 30-residue oligonucleotide and a 3-residue oligonucleotide having a base sequence complementary to the corresponding base sequence of the target RNA on the 3 'side of the target corresponding nucleotide residue Via a loop portion consisting of an arbitrary sequence of 4 residues including an arbitrary sequence (NN) of 2 residues as a 5 'stem portion and a sequence (GUG) consisting of continuous guanine, uracil and guanine
  • the 3 'stem portion includes a sequence capable of forming a complementary pair with the 5' stem portion.
  • Such editing guide RNA is schematically represented, for example, in FIG.
  • Luciferase Reporter Assay Using the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), the editing-inducing activity by endogenous ADAR was confirmed as follows.
  • PsiCHECK2_Rluc_K41R_W104X was constructed as a reporter expression plasmid.
  • psiCHECK2_Rluc_K41R_W104X is a commercially available psiCHECK (registered trademark) -2 (Promega), in which 104 W (tryptophan) in the region encoding Renilla luciferase (Rluc) is 104 X (stop codon), and 41 K (lysine) is 41 R Converted to arginine).
  • 311 G corresponding to the 104th tryptophan was mutated to 311 A to set an editing target. Furthermore, although 41K, which is a site independently edited by the target editing guide RNA, is converted to 41R by ADAR, it has been confirmed that this mutation has no influence on the luminescence measurement.
  • the sequence of the target RNA (Rluc_W104X) is shown in Table 14.
  • PSuper_shADg_Rluc_A311 was constructed as a target editing guide RNA expression plasmid.
  • pSuper_shADg_Rluc_A311 targets 311A as an editing target and expresses a target editing guide RNA (shADg_Rluc_A311) having the same sequence of 14 residues as Example 3 as an ADAR binding region (ARR; second oligonucleotide).
  • pSuper_shADg_Rluc_A311 was constructed as a plasmid expressing only the antisense region (ASR; first oligonucleotide; 5AS_Rluc_A311) as a control.
  • ASR antisense region
  • 5AS_Rluc_A311 The sequences of RNA expressed by each plasmid are shown in Table 14.
  • Tet-ADAR2 cells capable of expression control of human ADAR2 were passaged to a 24-well plate at 8.0 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 48 hours in a medium containing 5.0 ⁇ g / mL Dox .
  • the Tet-ADAR2 cells are described in RNA, 18, 1735-1744 (2012).
  • the target RNA was edited by endogenous hADAR2 by ARR expressing a 14-residue target editing guide RNA (shADg_Rluc_A311).
  • Example 24 Target editing having the antisense region (ASR; first oligonucleotide) obtained in Examples 1 to 5 and Reference Example 2 on the 5 'side of the ADAR binding region (ARR; second oligonucleotide; underlined in the table)
  • Editing guide RNA (3'-AS ADg) was prepared as described above. The sequence of the prepared target editing guide RNA is shown in Table 15.
  • target editing guide RNAs having ASR at the 5 'side or 3' of the 40- and 34-residue ARR were prepared in the same manner as described above.
  • the editing induction activity of the prepared target editing guide RNA was evaluated in the same manner as the evaluation 1 described above. The results are shown in FIG.
  • a target RNA in which A serving as an editing target was placed at a set position was designed and synthesized according to the following method.
  • -AAA A in the middle corresponds to GFP_A200
  • -UAUAUAU was introduced into the target RNA when evaluating the selectivity of 2 bases before and after.
  • -A target RNA for evaluating the selectivity at a position separated by 3 bases or more was prepared by fixing a sequence called UAC so as not to change the bases before and after, and arranging at a distant position. For example, UACUACCGUAC was introduced as a target sequence when 3 and 8 were evaluated.
  • sGFP_sRNA_AAA is a target RNA for evaluating the regioselectivity of one base before and after
  • sGFP_sRNA_UAU is a target RNA for evaluating the selectivity at two bases apart
  • sGFP_sRNA_3.8 is apart by 3 bases and 8 bases
  • Target RNA for evaluating the selectivity of position sGFP sRNA 4.9
  • Target RNA for evaluating selectivity sGFP sRNA 6.1.11, target RNA for evaluating selectivity at positions separated by 6 bases and 11 bases
  • sGFP sRNA 7.12 selectivity for positions separated by 7 bases and 12 bases
  • Target editing guide RNAs (shAD-gRNA and AD-gRNA) designed to match the sequences of the respective target RNAs were synthesized.
  • the ARR in shAD-gRNA is a short form of 14 residues identical to that of the target editing guide RNA of Example 3 (SEQ ID NO: 18).
  • the ARR in AD-gRNA which is a comparative example is 49 residues identical to the ARR of SL49 (SEQ ID NO: 29).
  • the sequence of shAD-gRNA is shown in Table 17 with the ASR (first oligonucleotide) that recognizes the target RNA underlined.
  • the editing induction activity was evaluated by the same method as the evaluation 1 mentioned above, and in vitro editing analysis was performed. The editing ratio at each site was calculated, and the relative editing ratio (Aoff-targe / Atarget) of the editing target A and the off-target site was determined. The results are shown in FIG.
  • the target editing guide RNA (shAD-gRNA) having the number of residues of ARR (second oligonucleotide) of 14 and the short type has a target editing guide RNA for the number of residues of ARR of 49 residues (AD- It can be seen that the selectivity of the editing position is higher than that of gRNA).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

標的認識部位に付加するヌクレオチド数が少ないにもかかわらず、部位特異的編集を誘導可能な短鎖型の編集ガイドＲＮＡが提供される。標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３'側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備え、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５'側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３'側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から４残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは、２から２４個のヌクレオチド残基からなり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである。

Description

オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ＲＮＡの部位特異的編集方法
　本発明は、オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ＲＮＡの部位特異的編集方法に関する。
　近年、ゲノム編集技術の開発をきっかけに、生物の設計図である遺伝情報、つまりは細胞内のＤＮＡ情報を改変することで生命現象をコントロールする方法が、疾患治療アプローチとして医療や創薬分野で用いられ始めている。ＤＮＡは細胞内で恒常的且つ不変的な分子であるため、ＤＮＡ改変効果は対象細胞又は対象生物に永続的に残り続ける。一方、ＲＮＡはＤＮＡ情報が写し取られた核酸分子であり、ＤＮＡとは異なり、合成・分解が繰り返される一過的な遺伝情報分子である。従ってＲＮＡ情報の改変は対象生物に永続的ではない一時的な遺伝情報改変効果を与えることができる。つまり、ＲＮＡ改変技術はＤＮＡ改変と同じく遺伝子改変技術ではあるものの、その性質は大きく異なる。
　ＲＮＡ改変技術として、例えば、国際公開第２０１６／０９７２１２号には、標的ＲＮＡの一部に相補的なアンチセンス配列を含む標的指向性部分と、細胞に存在し、ヌクレオチドの編集を行うことができるＲＮＡ編集実体に結合してリクルートすることができるリクルート部分とを含む、標的ＲＮＡ配列中のヌクレオチドの部位特異的編集のためのオリゴヌクレオチド構築物が記載されている。また例えば、国際公開第２０１７／０１０５５６号には、標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとの複合体に二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を作用させる部位特異的ＲＮＡ変異導入方法が記載されている。
　国際公開第２０１６／０９７２１２号に記載のオリゴヌクレオチド構築物は、標的指向性部位に加えて、リクルート部分として特定の反復配列を有するステムループ構造を有しており、リクルート部分には１６以上のオリゴヌクレオチドを必要とする。また国際公開第２０１７／０１０５５６号に記載の標的編集ガイドＲＮＡは、アンチセンス領域に加えて、４０又は４９残基の特定配列からなるステムループ構造を有するＡＤＡＲ結合領域を必要とする。国際公開第２０１６／０９７２１２号又は国際公開第２０１７／０１０５５６号に記載のＲＮＡ改変技術に適用されるオリゴヌクレオチドは、いずれも標的ＲＮＡと二重鎖を形成する部位に加えて、ＡＤＡＲと結合するある程度の長さを有する分子内二本鎖領域が必須であり、必然的にオリゴヌクレオチドとしての全長が長くなる傾向があった。
　本発明は、標的認識部位に付加するヌクレオチド数が少ないにもかかわらず、部位特異的編集を誘導可能な短鎖型の標的編集ガイドＲＮＡを提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。
　第一態様は、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備え、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から４残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは、２から２４個のヌクレオチド残基からなり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである。
　第二態様は、標的ＲＮＡと標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させることを含む標的ＲＮＡの部位特異的編集方法である。
　第三態様は、編集標的であるアデノシン残基を含む標的ＲＮＡを選択することと、前記標的ＲＮＡが有する、前記アデノシン残基の３’側の１５から３０残基分の第一塩基配列、前記アデノシン残基の５’側の３又は４残基分の第二塩基配列、及び前記第二塩基配列の５’側に隣接する少なくとも２残基分の第三塩基配列を取得することと、前記第一塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記第二塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとが５’側から順に連結したオリゴヌクレオチドを準備することと、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
　本発明によれば、標的認識部位に付加するヌクレオチド数が少ないにもかかわらず、部位特異的編集を誘導可能な短鎖型の標的編集ガイドＲＮＡを提供することができる。
標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。 標的編集ガイドＲＮＡと標的ＲＮＡの複合体の一例を示す概略図である。 標的編集ガイドＲＮＡの構造の一例を示す概略図である。 細胞内における標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。 細胞内における標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。 ＡＤＡＲ結合領域の配列が異なる標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。 標的編集ガイドＲＮＡの構造の一例を示す概略図である。 ｈＡＤＡＲを発現する細胞内における標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。 ＡＤＡＲ結合領域の残基数と編集誘導活性の関係を示す図である。 標的編集ガイドＲＮＡの編集位置の特異性を示す図である。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
標的編集ガイドＲＮＡ
　標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド（以下、標的編集ガイドＲＮＡともいう）は、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備える。第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応し、前記アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３又は４残基のオリゴヌクレオチドとからなる。第二オリゴヌクレオチドは、２から２４個のヌクレオチド残基からなり、前記標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有する。
　標的編集ガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドの３’側に、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的又は非相補的な配列を有する短鎖の第２オリゴヌクレオチドを有することで、優れた部位特異的編集を誘導することができる。これは例えば、標的編集を触媒するＡＤＡＲが、標的ＲＮＡと第一オリゴヌクレオチドとからなる二本鎖領域を認識した上で、標的ＲＮＡと二本鎖を形成せず、標的ＲＮＡから遊離した状態で存在し得る第二オリゴヌクレオチドによって、その編集活性が増進されるためと考えられる。すなわち、標的編集ガイドＲＮＡにおいては、第一オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡに対する相補領域（アンチセンス領域；ＡＳＲ）として機能し、第二オリゴヌクレオチドが編集増進領域、ＡＤＡＲ結合領域（ＡＤＡＲリクルーティング領域；ＡＲＲ）等として機能すると考えられる。
　本実施形態の標的編集ガイドＲＮＡにおいては、従来型の標的編集ガイドＲＮＡと比較して長さが短い分、単純に製造コストが削減される。また、化学合成が容易になることから、遺伝子発現により標的編集ガイドＲＮＡを細胞に導入する方法に加えて、化学的に合成した標的編集ガイドＲＮＡを直接細胞導入する方法が容易になる。またそれに付随して、核酸医薬品開発等で用いられる既存の人工核酸等を標的編集ガイドＲＮＡに適用できる。これにより、細胞内分解耐性の向上、細胞導入効率の向上等により、更なる高機能な標的編集ガイドＲＮＡを提供することが可能になる。さらに標的編集ガイドＲＮＡが編集誘導に必要な最小限残基数で構成されることで、標的ＲＮＡに対する特異性を維持しつつ、編集標的であるアデノシン残基以外の位置におけるオフターゲット編集を抑制することができる。
　標的編集ガイドＲＮＡは、例えば、標的編集を触媒するＡＤＡＲを標的ＲＮＡにリクルートすることで、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導する。ＡＤＡＲは二本鎖ＲＮＡ中のアデノシン残基を加水分解的脱アミノ化反応によりイノシン残基に変換する酵素であり、哺乳動物の細胞に広く存在する。イノシン残基は構造がグアノシン残基と類似しているため、ＲＮＡ情報の翻訳時にはグアノシン残基として翻訳され、その結果としてＲＮＡ情報が編集される。アミノ酸をコードしている部分にこのようなＲＮＡ編集が生じると、ゲノム上にＤＮＡ変異がないにも関わらずアミノ酸置換等が生じることになる。なお、哺乳類におけるＡＤＡＲには、遺伝子の異なるＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ３が知られている。標的編集ガイドＲＮＡは、これらのうちＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２の標的編集活性を増進する。
　標的編集ガイドＲＮＡは、哺乳動物の細胞に導入されると、細胞中に存在するＡＤＡＲを標的ＲＮＡにリクルートして、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導することができる。
　標的編集ガイドＲＮＡが含む第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する。標的ＲＮＡは、編集対象となるアデノシン残基を含むものであれば、特に制限はなく、細胞性ＲＮＡ、ウイルス性ＲＮＡのいずれもよく、通常はタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡである。標的ＲＮＡにおける編集部位は、非翻訳領域、スプライス領域、エクソン、イントロン、又はＲＮＡの安定性、構造もしくは機能に影響するいずれの領域に存在してもよい。また標的ＲＮＡは、修正又は変更すべき変異を含むものであってもよい。あるいは標的ＲＮＡはその配列が、天然型とは異なる表現型をコードするように変異されたものであってもよい。
　標的ＲＮＡは、タンパク質をコードするＲＮＡであることが好ましく、コードされるタンパク質として具体的には、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体、膜電位依存型カリウムチャネル、ＳＴＡＴ３、ＮＦｋＢＩＡ、ＭＡＰＫ１４等のシグナル伝達に関わるリン酸化タンパク質などを挙げることができる。
　標的編集ガイドＲＮＡは、例えば遺伝性疾患の治療に適用することができる。遺伝性疾患としては、嚢胞性線維症、白皮症、α－１アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー表皮水疱症、Ｅｐｉｄｅｒｍｙｌｏｓｉｓ水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連する障害、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、血友病、遺伝性ヘマクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュニャン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張型ジストロフィー型Ｉ及びＩＩ、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ、Ｂ及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連膵臓癌、パーキンソン病、ポイツ－ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異のようなプロトロンビン変異関連疾患、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホッフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、癌の様々な形態（例えばＢＲＣＡ１及び２関連乳癌、卵巣癌等）などが挙げられる。
　第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中の編集標的となるアデノシン残基に対応し、編集標的のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する１５から３０残基の５’側オリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する３又は４残基の３’側オリゴヌクレオチドとからなる。標的対応ヌクレオチド残基の５’側と３’側にそれぞれ連結するオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡと二本鎖を形成することで、標的ＲＮＡ、及び標的ＲＮＡにおける編集標的部位が特定される。
　標的対応ヌクレオチド残基は、編集標的となるアデノシン残基に対応するヌクレオチド残基であり、例えばシチジン残基、ウリジン残基、アデノシン残基又はそれらの誘導体である。標的対応ヌクレオチド残基は、好ましくは編集標的となるアデノシン残基と塩基対を形成しない塩基であり、より好ましくはシチジン残基又はその誘導体であり、さらに好ましくはシチジン残基である。
　標的対応ヌクレオチド残基の５’側又は３’側に連結するオリゴヌクレオチドの塩基配列は、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に相補的な塩基配列である。標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチド残基数は、標的ＲＮＡに対する特異性の観点から、例えば１５から２６、又は１５から２０である。なお、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドの５’側には、必要に応じて発現を制御する付加配列が、別途１から６残基程度連結していてもよい。また標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチド残基数は、編集活性の観点から、好ましくは３である。
　第二オリゴヌクレオチドは、２以上２４以下のヌクレオチド残基からなり、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有する。第二オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに対して相補的な塩基対を形成せず、標的ＲＮＡから遊離した状態となり得ることが好ましい。詳細なメカニズムは不明であるが、この遊離状態のオリゴヌクレオチド鎖の存在が、ＡＤＡＲの編集活性の増進に寄与していると考えられる。また第二オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基に隣接して連結するグアノシン残基を含むことが好ましい。詳細な理由は不明であるが、第二オリゴヌクレオチドが、標的対応ヌクレオチド残基に隣接して連結するグアノシン残基を含む２残基以上のオリゴヌクレオチドであるとＡＤＡＲの編集活性がより増進される傾向がある。
　また、第二オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＲＲ）は、標的ＲＮＡを特定する第１オリゴヌクレオチドの３’側に連結することで、部位特異的編集を効率的に誘導するが、５’側に連結する場合には部位特異的編集の誘導能が低下する。一方、従来の標的編集ガイドＲＮＡでは、第１オリゴヌクレオチドの３’側及び５’側のいずれにＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ）が連結しても部位特異的編集を誘導することができる。従って、本実施形態に係る標的編集ガイドＲＮＡは、従来の標的編集ガイドＲＮＡとは、部位特異的編集を誘導するメカニズムが異なるものと考えられる。
　第二オリゴヌクレオチドの残基数は２以上２４以下であるが、好ましくは２０以下、より好ましくは１６以下であり、さらに好ましくは１５以下、特に好ましくは１４以下であり、また、例えば、３以上であり、４以上、８以上、１２以上、又は１３以上である。一方、第二オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な配列を有する場合、第二オリゴヌクレオチドの残基数は、例えば２２以下である。
　第二オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して非相補的な配列を有する場合、全体として非相補的な塩基配列を有していればよく、第二オリゴヌクレオチド中に標的ＲＮＡと相補的な塩基対を形成し得るヌクレオチド残基を含むことを排除するものではない。第二オリゴヌクレオチドとこれに対応する標的ＲＮＡの塩基配列における非相補的な塩基配列の含有率は、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上である。ここで非相補的な塩基配列の含有率は、対応する塩基対のうち非相補的な塩基の組合せとなるヌクレオチド残基数を、第二オリゴヌクレオチドの残基数で除して算出される。
　第二オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して非相補的な配列を有する場合、第二オリゴヌクレオチドの塩基配列は、標的ＲＮＡの対応する塩基配列等に応じて適宜選択されればよい。例えば、標的ＲＮＡの対応する塩基がピリミジン塩基の場合は、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基として、塩基対を形成しないプリン残基又はピリミジン塩基を選択すればよく、好ましくはピリミジン塩基である。また標的ＲＮＡの対応する塩基がプリン残基の場合は、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基として、塩基対を形成しないピリミジン残基又はプリン塩基を選択すればよく、好ましくはプリン残基である。具体的には、標的ＲＮＡの対応する塩基がシトシン（Ｃ）の場合、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基としては、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を選択すればよく、好ましくはＣ又はＵである。標的ＲＮＡの対応する塩基がウラシル（Ｕ）の場合、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基としては、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）を選択すればよく、好ましくはＵ又はＣである。標的ＲＮＡの対応する塩基がアデニン（Ａ）の場合、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）を選択すればよく、好ましくはＡ又はＧである。標的ＲＮＡの対応する塩基がグアニン（Ｇ）の場合、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）又はウラシル（Ｕ）を選択すればよく、好ましくはＡ又はＧである。標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して非相補的な配列を有する第二オリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば、ＧＧＧ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＡ、ＧＵ、ＵＣ、ＵＧ、ＵＡ、ＵＵ、ＣＧ、ＣＡ、ＣＵ、ＣＣ、ＡＧ、ＡＡ、ＡＣ、ＡＵ等を含む配列を挙げることができる
　第二オリゴヌクレオチドは、分子内でステムループ構造を形成し得る塩基配列を有していてもよい。標的編集ガイドＲＮＡがステムループ構造を有することで、編集活性がより増進される傾向がある。これは例えば、第二オリゴヌクレオチドがステムループ構造を形成することによって、標的ＲＮＡからの遊離状態がより安定するためと考えられる。ステムループ構造は、相補的塩基対によって分子内で二重鎖を形成するステム部分と、ステム部分を構成する２つのオリゴヌクレオチドを連結するループ部分とを含む。ステム部分を構成するヌクレオチド残基対の数は、例えば、２対以上であり、好ましくは３対以上、４対以上、５対以上、又は６対以上であり、また、１０対以下であり、９対以下、８対以下、又は７対以下である。またループ部分を構成するヌクレオチド残基数は、例えば４又は５である。
　第二オリゴヌクレオチドがステムループ構造を形成する場合、第二オリゴヌクレオチドの塩基配列は、ステムループ構造を形成し得る限り特に制限はされない。但し、第二オリゴヌクレオチドが、（ＲＹ又はＹＲ）ｎＮｍ（ＲＹ又はＹＲ）ｎで表される塩基配列を有する場合は除かれる。ここで、Ｒはアデノシン又はグアノシンであり、Ｙはウリジン又はシチジンであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン又はイノシンである。ｍは３以上であり、ｎは４以上である。また２つの（ＲＹ）ｎ又は（ＹＲ）ｎで表される塩基配列は、相補塩基対によって二重鎖のステム構造を形成する。
　ステムループ構造を形成する第二オリゴヌクレオチドの塩基配列として具体的には、ステム部分の塩基配列が、二本鎖構造の安定性の観点から、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）を含むことが好ましい。ステム部分の塩基対中のＧ－Ｃ対の割合は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上である。なお、シトシン（Ｃ）に代えて、互変異性によりグアニン（Ｇ）と塩基対を形成可能なウラシル（Ｕ）を含んでいてもよい。
　また、第二オリゴヌクレオチドの塩基配列は、標的編集活性の観点から、５’側のステム部分に、連続する２又は３のグアニンからなる配列（ＧＧ又はＧＧＧ）、連続するウラシル及びグアニンからなる配列（ＵＧ）、及び連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる配列（ＧＵＧ）からなる群から選択される少なくとも１種を含み、３’側のステム部分にこれらと相補対を形成可能な配列（例えば、ＣＣ、ＣＣＣ、ＣＣＵ、ＣＡ、ＣＡＣ）を含むことが好ましい。また、５’側のステム部分にループ部分と連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる配列（ＧＵＧ）を含み、３’側のステム部分にこれと相補対を形成可能な配列（例えば、ＣＡＣ）を含むこともまた好ましい。
　第二オリゴヌクレオチドのループ部分は、例えば４又は５残基の任意配列であってよい。ループ部分の配列として具体的には、例えば、ＧＣＵＡＡ；ＵＵＣＧ、ＵＡＣＧ、ＵＧＣＧ、ＵＣＣＧ等のＵＮＣＧフォールド型；ＧＡＡＡ、ＧＵＡＡ、ＧＣＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＧＡ、ＧＧＧＡ等のＧＮＲＡフォールド型；ＧＵＣＡ、ＧＣＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＡＣＡ、ＡＵＣＡ、ＡＣＣＡ、ＡＧＣＡ、ＡＡＣＡ、ＧＵＵＡ、ＧＣＵＡ、ＧＧＵＡ、ＧＡＵＡ、ＡＵＵＡ、ＡＣＵＡ、ＡＧＵＡ、ＡＡＵＡ等のＲＮＹＡフォールド型；ＧＧＵＧフォールド型；ＣＵＵＧフォールド型；ＡＧＵＵ、ＡＧＵＣ、ＡＧＵＧ、ＡＧＵＡ、ＡＧＣＵ、ＡＧＣＣ、ＡＧＣＧ、ＡＧＣＡ等のＡＧＮＮフォールド型などが挙げられる。これらのループ構造の詳細については、例えば、Biophys. J.,113, 257-267, 2017を参照することができる。
　以下に、ステムループ構造を形成し得る第二オリゴヌクレオチドの塩基配列の具体例を示すが、本発明はこれらに限定されない。また、ステムループ構造の一例を図２Ｂに併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチド残基は、天然型のリボヌクレオチド残基であっても、非天然型の修飾ヌクレオチド残基であってもよい。修飾ヌクレオチド残基には、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合を修飾したもの、リボースの２’水酸基を修飾したもの、分子内架橋されたリボースを含むもの、プリン塩基及びピリミジン塩基の少なくとも一方を修飾したもの等が含まれる。ホスホジエステル結合部分の修飾の例としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、ペプチド結合置換等が挙げられる。リボースの２’水酸基の修飾の例としては、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化、２’－Ｏ－アミノプロピル（ＡＰ）化、２’－フルオロ化、２’－Ｏ－メチルカルバモイルエチル化、３，３－ジメチルアリル化等が挙げられる。リボースの分子内架橋体の例としては、２’位と４’位が架橋したヌクレオチド（２’，４’－ＢＮＡ）が挙げられる。２’，４’－ＢＮＡには、例えば、ＬＮＡとも称されるロックド核酸（α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ又はβ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ）、β－Ｄ－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ３）、２’，４’－ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ３）、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ－２’，４’－ＢＮＡ，５’－メチルＢＮＡ，ｃＥｔ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ，ｃＭＯＥ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ，ＡｍＮＡとも称されるアミド型ＢＮＡ（４’－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ３）等が挙げられる。塩基部分の修飾の例としては、ハロゲン化；メチル化、エチル化、ｎ－プロピル化、イソプロピル化、シクロプロピル化、ｎ－ブチル化、イソブチル化、ｓ－ブチル化、ｔ－ブチル化、シクロブチル化等のアルキル化；水酸化；アミノ化；脱アミノ化；デメチル化等が挙げられる。
標的編集ガイドＲＮＡの製造方法
　標的編集ガイドＲＮＡの製造方法は、編集標的であるアデノシン残基を含む標的ＲＮＡを選択する選択工程と、前記標的ＲＮＡが有する、前記アデノシン残基の３’側の１５から３０残基分の第一塩基配列、前記アデノシン残基の５’側の３又は４残基分の第二塩基配列、及び前記第二塩基配列の５’側に隣接する少なくとも２残基分の第三塩基配列を取得する塩基配列取得工程と、前記第一塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記第二塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記第三塩基配列に対して非相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとが、５’側から順に連結したオリゴヌクレオチドを準備する準備工程と、を含む。
　標的ＲＮＡの選択工程では、編集標的となるアデノシン残基を含む標的ＲＮＡを選択する。標的ＲＮＡはＲＮＡ編集の目的等に応じて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるＲＮＡから選択される。標的ＲＮＡは、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡ、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体、ｎｃＲＮＡ等のいずれであってもよく、好ましくはｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体である。また編集標的となるアデノシン残基は、ＲＮＡ編集の目的等に応じて、非翻訳領域、スプライス領域、エクソン領域、イントロン領域、又はＲＮＡの安定性、構造もしくは機能に影響する領域のいずれの領域に存在していてもよい。
　塩基配列取得工程では、選択した標的ＲＮＡの塩基配列を取得する。取得される塩基配列は、編集標的となるアデノシン残基の３’側のオリゴヌクレオチドに対応する第一塩基配列と、前記アデノシン残基の５’側の３又は４残基分の第二塩基配列と、前記第二塩基配列の５’側に隣接する少なくとも２残基分の第三塩基配列である。第一塩基配列に対して相補的な配列が、製造される標的編集ガイドＲＮＡにおける標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドの塩基配列となる。また第二塩基配列に対して相補的な配列と、第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な配列とを連結した配列が、製造される標的編集ガイドＲＮＡにおける標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドの塩基配列となる。ここで第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列は、上述した第二オリゴヌクレオチドの塩基配列を参照して、その塩基配列を適宜選択することができる。
　第一塩基配列として塩基が特定されるヌクレオチド残基数は、１５以上３０以下であり、好ましくは１５以上２６以下であり、より好ましくは１５以上２０以下である。第二塩基配列として塩基が特定されるヌクレオチド残基数は、３又は４であり、好ましくは３である。第三塩基配列として塩基が特定されるヌクレオチド残基数は２以上であり、また例えば２４以下であり、好ましくは２０以下、より好ましくは１６以下であり、さらに好ましくは１５以下、特に好ましくは１４以下である。
　塩基配列の取得方法は、対象となるオリゴヌクレオチドの塩基配列を特定可能であれば特に制限されず、通常用いられる手法から適宜選択することができる。例えば、標的ＲＮＡの塩基配列がデータベース等で公知であれば、公知の塩基配列から必要な部分の塩基配列を抽出して取得すればよい。また標的ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により決定することで塩基配列を取得してもよい。
　準備工程では、第一塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、第二塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとが、５’側から順に連結したオリゴヌクレオチドを準備する。準備されるオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備える標的編集ガイドＲＮＡとなる。
　所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、公知の方法で製造することができる。例えば、国際公開第２０１７／０１０５５６号等の記載を参照して、適当な合成オリゴＤＮＡを用いて調製することができる。また標的編集ガイドＲＮＡの塩基配列の５’側にＴ７プロモーター等のプロモーター配列を有する合成オリゴＤＮＡを用いて調製することもできる。さらにはホスホロアミダイト法等の公知の製造方法によって化学合成的に調製することもできる。さらに当該オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するｃＤＮＡを常法により調製し、得られるｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを構築して、得られるプラスミドＤＮＡを適当な細胞に導入してＲＮＡに転写することで調製することもできる。
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法
　標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的ＲＮＡと、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである標的編集ガイドＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させることを含む。標的編集ガイドＲＮＡが標的ＲＮＡと部分的に二本鎖を形成し、アデノシンデアミナーゼをリクルートすることで、標的ＲＮＡが含むアデノシン残基を部位特異的にイノシン残基に変換することができる。
　標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、例えば、標的ＲＮＡを有する真核細胞に、上述した標的編集ガイドＲＮＡを導入又は発現させることで行うことができる。標的編集ガイドＲＮＡの真核細胞への導入方法には、核酸医薬で用いられる種々の手法から適宜選択して適用することができる。また標的編集ガイドＲＮＡを発現可能なプラスミド等を真核細胞に導入することで、真核細胞中に標的編集ガイドＲＮＡを発現させることができる。
　標的編集ガイドＲＮＡを用いる標的ＲＮＡの部位特異的編集方法を、糖鎖修飾部位、リン酸化部位、金属配位部位等の細胞内タンパク質の機能発現に関わるアミノ酸の変異に適用することで、細胞内タンパク質機能を一時的に制御するという新たな方法論を提供することが可能になる。また標的編集ガイドＲＮＡを用いる標的ＲＮＡの部位特異的編集方法による生体内タンパク質の機能制御方法を一般化することで、生命科学分野の研究の発展に貢献できる分子技術となる。
　従来、ｓｉＲＮＡによる標的タンパク質発現の抑制、又はアプタマーと呼ばれる機能性ＲＮＡによる標的タンパク質の機能制御を利用した核酸医薬が開発されている。しかしながら、ｍＲＮＡの情報を変換し、ｍＲＮＡがコードする標的タンパク質の機能を改変する医薬は未だ例を見ない。従って、標的編集ガイドＲＮＡは、これまでない薬効を示す新規核酸医薬品を生み出す可能性を秘めている。
　例えば、ナンセンス変異型遺伝性疾患は、遺伝子上の点変異によって形成された終止コドンにより、本来のタンパク質が合成されなくことに起因する疾患である。ナンセンス変異型遺伝性疾患としては、例えば、筋ジストロフィー、多発性硬化症、アルツハイマー病、神経組織変性、パーキンソン病などの神経疾患、癌などが挙げられる。例えば、標的編集ガイドＲＮＡによって、ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ等の終止コドンを編集することにより、上記疾患に対するこれまでにないメカニズムを有する核酸医薬としての用途が考えられる。具体的には例えば、終止コドンであるＵＡＧをトリプトファンコドンであるＵＩＧへと編集することで、タンパク質合成を制御することが考えられる。
　また例えば、細胞内で重要な働きを持つタンパク質の多くは、リン酸化・脱リン酸化によって機能のＯＮ／ＯＦＦが精密に制御されており、リン酸化・脱リン酸化の異常が癌を含む様々な疾患に深く関与していることが示唆されている。タンパク質のリン酸化部位としてはＴｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ等を挙げることができる。標的編集ガイドＲＮＡによってこれらのアミノ酸をコードするコドンを他のアミノ酸をコードするコドンへと編集することにより、タンパク質のリン酸化を抑制することが可能になる。具体的には例えば、ＴｙｒコドンであるＵＡＣを、ＣｙｓコドンであるＵＩＣへと編集することで細胞内タンパク質のリン酸化を制御することができる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（参考例１）
モデル標的ＲＮＡの調製
　ＧＦＰ－Ｇｑ－ＴＫ　Ｐｌａｓｍｉｄを鋳型とし、１００ｍＭ　ＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２＿Ｔ７Ｆ０１プライマー、１００ｍＭ　ＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２＿Ｒ０１プライマー、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ、１．２５Ｕ／ｍＬ　Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒ　ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を含む反応溶液中でＰＣＲ（１サイクル（９８℃１０秒間、５５℃３０秒間、６８℃３０秒間）、３０サイクル）によって増幅した（終濃度：ＧＦＰ－Ｇｑ－ＴＫ　Ｐｌａｓｍｉｄ　４．０ｐｇ／ｍＬ、ＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２＿Ｔ７　Ｆ／Ｒ　０．３ｍＭ、ｄＮＴＰ　０．２ｍＭ、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　２．５Ｕ）。増幅したＰＣＲ製品をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを鋳型とし、Ｔ７－Ｓｃｒｉｂｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＮＡ　ＩＶＴ　ＫＩＴ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写（３７℃、３時間）によりＲＮＡを合成した。その後、ＤＮＡｓｅ（終濃度：２Ｕ）を加えて処理し（３７℃、１５分間）、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によってＲＮＡを精製した。得られたＲＮＡを８Ｍ　Ｕｒｅａ　ＰＡＧＥ　（８％）で精製して、粉砕・浸漬によって抽出し、０．２２ｍｍフィルター（ＤＵＲＡＰＯＲＥ社製）及びゲル濾過（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）によって精製して残基数１６０ｎｔのモデル標的ＲＮＡ（ｓＧＦＰ）を調製した。使用したプライマー及び得られたモデル標的ＲＮＡの配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例１）
標的編集ガイドＲＮＡの調製
　合成オリゴＤＮＡ（Ｆ）（ｇＲＮＡ３ｒ＿Ｔ７Ｆ）１００ｍＭと合成オリゴＤＮＡ（Ｒ）（ｇＲＮＡ３ｒ＿ｄｅｌ０２）１００ｍＭを含む反応溶液を９５℃で３分間、続いて２５度に減温して１５分間処理してアニーリング反応を行って、Ｔ７プロモーター領域のみが２本鎖を形成したＤＮＡ（ｇＲＮＡ３ｒ＿ｄｅｌ０２Ｆ／Ｒ）を得た。続いて、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰと５０００　Ｕ／ｍＬ　Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔを加え（終濃度：ｇＲＮＡ３ｒ＿ｄｅｌ０２Ｆ／Ｒ　２ｍＭ、ｄＮＴＰ　０．２ｍＭ、Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　２．５Ｕ）を２５℃で３０分間伸長し、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿によりＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを鋳型とし、Ｔ７－Ｓｃｒｉｂｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＮＡ　ＩＶＴ　ＫＩＴ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写（３７℃、３時間）によりＲＮＡ（標的編集ガイドＲＮＡ）を合成した。その後、ＤＮＡｓｅ（終濃度：２Ｕ）を加え、３７℃で１５分間処理し、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿によってＲＮＡを精製した。得られたＲＮＡを８Ｍ　Ｕｒｅａ　ＰＡＧＥ　（８％）で精製して、粉砕・浸漬によって抽出し、０．２２ｍｍフィルター（ＤＵＲＡＰＯＲＥ社製）及びゲル濾過（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）によって精製して、目的とする標的編集ガイドＲＮＡ（ｄｅｌ０２）を得た。使用した合成オリゴＤＮＡの配列を表３に、得られた標的編集ガイドＲＮＡの配列を表４に示す。また、標的編集ガイドＲＮＡのＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；第二オリゴヌクレオチド）のみを表６に示す。
（実施例２から９）
　合成オリゴＤＮＡ（Ｒ）として、表３に示す合成オリゴＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、実施例２から９の標的編集ガイドＲＮＡを得た。得られた標的編集ガイドＲＮＡの配列を表４に示す。また、標的編集ガイドＲＮＡのＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；第二オリゴヌクレオチド）のみを表６に示す。
（比較例１、２）
　合成オリゴＤＮＡ（Ｒ）として、表３に示す合成オリゴＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、比較例１２の標的編集ガイドＲＮＡを得た。得られた標的編集ガイドＲＮＡの配列を表４に示す。
（参考例２）
　国際公開第２０１７／０１０５５６号の実施例１の記載を参照して、アンチセンス領域の３’側にステムループ構造を形成する４９残基からなるＡＤＡＲ結合領域が連結した、従来型の標的編集ガイドＲＮＡ（以下、ＳＬ４９ともいう）を調製した。具体的には合成オリゴＤＮＡ（１）としてｇＲＮＡ３ｒ＿Ｇｌｕ＿Ｔ７Ｆを、合成オリゴＤＮＡ（２）としてｇＲＮＡ３ｒ＿Ｇｌｕ＿ｃｏｎｓｅｑ＿Ｒを用いて、参考例２の標的編集ガイドＲＮＡを得た。使用した合成オリゴＤＮＡの配列と、得られた標的編集ガイドＲＮＡ（ＳＬ４９）の配列を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜評価１＞
　上記で調製した標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を、モデル標的ＲＮＡを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価した。まず、モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとをアニーリング反応により複合体を形成させ、精製した組換えｈＡＤＡＲ２を加えて編集反応を行った。標的部位の編集効率を解析するため、ＲＴ－ＰＣＲにより標的ＲＮＡのｃＤＮＡを増幅し、ダイレクトシークエンシングにより得られるクロマトチャートから編集割合を算出した。具体的なプロトコールは以下の通りである。
標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の編集誘導能評価（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
　０．３μＭのモデル標的ＲＮＡと０．９μＭのｇＲＮＡをアニーリングバッファー（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６））中で熱変性（８０℃、３分間）させ、２５℃まで１５分間かけて冷却することでアニーリング反応を行った。５ｎＭ　ＲＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘと１２．５ｎＭ　ｈＡＤＡＲ２を編集反応緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ［ｐＨ７．５］、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、０．０１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１Ｕ／μＬ　Ｍｕｒｉｎｅ　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製））中で、３７℃、１時間、編集反応を行った。反応後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりＲＮＡを精製し、５μＬのＴＥ　ｂｕｆｆｅｒで溶解した。回収したＲＮＡサンプルをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＩＩ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型に、０．３μＭ　Ｔ７ＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー、０．３μＭ　ＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマーを用いてＰＣＲによりｄｓＤＮＡの増幅を行った。Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて、０．１６５μＭ　Ｔ７ｐｒｏＧＧＧプライマーにより増幅したｄｓＤＮＡのダイレクトシークエンシングを行った。最後に、得られたクロマトチャートのピークの高さの比Ｇ／（Ｇ＋Ａ）により編集割合（％）を算出した。結果を表８及び図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ｄｅｌ０２、ｄｅｌ０３及びｄｅｌ０３．５が、従来型（ＳＬ４９）と遜色のない編集誘導活性を示した。またアンチセンス領域（ＡＳＲ）の３’側に任意の２残基を付加した標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、実質的にアンチセンス領域のみのＩｒｄｅｌと比べて、増強された編集誘導活性を示した。特にＡＳＲの３’側に隣接して連続する２つのグアノシン残基を有する標的編集ガイドＲＮＡ（ｄｅｌ０６）がより増強された編集誘導活性を示した。
　例えば、標的編集ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡ（ＴａｒｇｅｔＲＮＡ）と図２Ａに示すような部分的に２重鎖が形成された複合体を形成すると考えられる。図２Ａの複合体では第一オリゴヌクレオチド部分がアンチセンス領域（ＡＳＲ）として機能して標的ＲＮＡと２重鎖を形成し、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二ヌクレオチドが、標的ＲＮＡから遊離した状態で存在すると考えられる。特に第二ヌクレオチドが４残基程度までの短鎖の場合には、標的ＲＮＡの対応する塩基配列と相補的な配列を第二ヌクレオチドが有していても、熱的揺らぎによって遊離した状態を取り得ると考えられる。この遊離状態によって第二オリゴヌクレオチド部分が編集増進領域として機能すると考えられる。なお、上記の標的編集ガイドＲＮＡの調製においては、Ｔ７プロモーターの３’側に、発現を調整するための付加配列ＧＧＧが付加された合成オリゴＤＮＡ（Ｆ）を用いているため、標的編集ガイドＲＮＡの５’末端にＧＧＧが付加されている。
　標的編集ガイドＲＮＡの第二オリゴヌクレオチドは、図２Ｂに示すように分子内でステムループ構造を形成してもよい。例えば、第二オリゴヌクレオチドの残基数が１４以上であると、より安定したステムループ構造が形成され、これにより編集活性がより向上すると考えられる。
＜評価２＞
　次に標的編集ガイドＲＮＡの培養細胞内における編集誘導活性について、編集蛍光レポーター（ＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘ）を用いて検証した。標的ＲＮＡであるＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘでは、野生型（ＷＴ）ＧＦＰのＴｒｐ５８のコドン（ＵＧＧ）が終止コドン（ＵＡＧ）に変異している。そのため、そのままでは成熟型ＧＦＰを発現しないが、終止コドンのアデノシン残基がイノシン残基にＲＮＡレベルで編集され、イノシン残基がグアノシン残基として翻訳されることにより、成熟型ＧＦＰを発現するようになる。具体的なプロトコールは以下の通りである。
（参考例３）
基質ＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘ発現プラスミドの構築
　ｐＵＣ１９ベクターにＡｃＧＦＰをクローニングしたプラスミドであるｐＵＣ１９－ＧＦＰ－ＴＫプラスミドを鋳型に、０．３μＭ　ＡｃＧＦＰ＿ＸｈｏＩ＿ｋｏｚＦ０１プライマー、０．３μＭ　ＡｃＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘ＿Ｒ０１プライマー、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲにより５’側の鋳型ＤＮＡを作製した。ＰＣＲ条件は、９８℃／１０秒、５５℃／１５秒、６８℃／２０秒、３０サイクルであった。次に、ｐＵＣ１９－ＧＦＰ－ＴＫプラスミドを鋳型に、０．３μＭ　ＡｃＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘ＿Ｆ０１プライマー及び０．３μＭ　ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡ＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｒ０１プライマー、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲにより３’側の鋳型ＤＮＡを作製した。ＰＣＲ条件は、９８℃／１０秒、５５℃／１５秒、６８℃／４０秒、３０サイクルであった。それぞれを１００倍希釈したＳａｍｐｌｅに対して０．３μＭ　ＡｃＧＦＰ＿ＸｈｏＩ＿ｋｏｚＦ０１プライマー、０．３μＭ　ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡ＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｒ０１プライマー、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲにより鋳型ＤＮＡを作製した。ＰＣＲ条件は、９８℃／１０秒、５５℃／１５秒、６８℃／６０秒、３０サイクルであった。得られた鋳型ＤＮＡ及びｐｃＤＮＡ３．１（－）ＨｙｇｒｏをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて、３７℃、１時間で制限酵素処理を行った。ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＴａＫａＲａ社製）を用いてベクター：プラスミドのモル比を１：５にし、１６℃、３０分でＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った。Ｌｉｇａｔｉｏｎ後の溶液２μＬを２０μＬのＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ（ＴａＫａＲａ社製）に加え形質転換を行い、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中、３７℃、昼夜で培養した。Ｅｘ　Ｔａｑ　（ＴａＫａＲａ社製）を用いてコロニーＰＣＲ（０．３μＭ　ｐｃＤＮＡ３＿１ｐｒｏ＿Ｆ０１プライマー、０．３μＭ　ｐｃＤＮＡ３＿１－ｓｅｑＲ０１プライマー、９８℃／１０秒、５５℃／３０秒、７２℃／３０秒、３０サイクル）によりインサートチェックを行った。その後、インサートが挿入されているプラスミドが形質転換されているコロニーを液体培地で培養し、プラスミドを抽出した。最終的に、Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、０．１６５μＭ　ｐｃＤＮＡ３＿１ｐｒｏ＿Ｆ０１プライマー、０．１６５μＭ　ｐｃＤＮＡ３＿１－ｓｅｑＲ０１プライマーを用いて塩基配列解析を行い、挿入されたインサートが正しい配列であることを確認した。以上により、基質ＲＮＡであるＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ－ＡｃＧＦＰＷ５８Ｘ）を構築した。構築に用いたプライマーの配列を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（実施例１０）
短鎖型５ＡＳ－ｓｈＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３発現プラスミドの構築
　２μＭ　ＡＤｇｒＧＦＰ１７３＿ｄｅｌ３＿ＢｇｌＦ及びＡＤｇｒＧＦＰ１７３＿ｄｅｌ３＿ＨｉｎｄＲをアニ－リング反応後（９５℃、３分、ｓｌｏｐｅ　ｔｏ　２５℃／１５分）、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ及びＫｌｅｎｏｗ　ｆｌａｇｍｅｎｔを用いて伸長反応を行った（２５℃、３０分）。フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿により鋳型ＤＮＡを精製した。鋳型ＤＮＡ及びｐＳｕｐｅｒ－ｎｅｏをＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限酵素処理を行った（３７℃、１時間）。ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＴａＫａＲａ社製）を用いてベクター：プラスミドのモル比を１：５にし、１６℃　３０分でＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った。Ｌｉｇａｔｉｏｎ後の溶液２μＬを２０μＬのＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ（ＴａＫａＲａ社製）に加え形質転換を行い、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で培養した（３７℃、昼夜）。Ｅｘ　Ｔａｑ　（ＴａＫａＲａ社製）を用いてコロニーＰＣＲ（０．３μＭ　ｐＳｕｐｅｒ．ｎｅｏ－ＩｎｓＣｈｅｃｋ＿Ｆ０１プライマー、０．３μＭ　ｐＳｕｐｅｒ．ｎｅｏ－ＩｎｓＣｈｅｃｋ＿Ｒ０１プライマー、９８℃／１０秒、５５℃／３０秒、７２℃／３０秒、３０サイクル）によりインサートチェックを行った。その後、インサートが挿入されプラスミドが形質転換されているコロニーを液体培地で培養し、プラスミドを抽出した。最終的に、Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、０．１６５μＭ　ｐＳｕｐｅｒ．ｎｅｏ－ＩｎｓＣｈｅｃｋ＿Ｆ０１プライマー、０．１６５μＭ　ｐＳｕｐｅｒ．ｎｅｏ－ＩｎｓＣｈｅｃｋ＿Ｒ０１プライマーを用いて塩基配列解析を行い、挿入されたインサートが正しい配列であることを確認して、プラスミド（ｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏ＿５ＡＳ－ｓｈＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３）を得た。プラスミドの構築に用いたプライマーの配列を表１０に示す。また得られたプラスミドは、実施例２の標的編集ガイドＲＮＡ（ｄｅｌ０３）に相当する標的編集ガイドＲＮＡ（５ＡＳ－ｓｈＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３）を発現する。
（実施例１１）
短鎖型ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ＿ｄｅｌ０３５発現プラスミドの構築
　プライマーとして、ｇｒＧＦＰ１７３＿ｄｅｌ３５＿ＢｇｌＦ及びｇｒＧＦＰ１７３＿ｄｅｌ３５＿ＨｉｎｄＲを用いたこと以外は実施例１０と同様にして、プラスミドを構築した。用いたプライマーの配列を表１０に示す。また得られたプラスミド（ｐＳｕｐｅｒ＿ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ＿ｄｅｌ０３．５）は、実施例３の標的編集ガイドＲＮＡ（ｄｅｌ０３．５）に相当する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ＿ｄｅｌ０３５）を発現する。
（参考例４）
従来型５ＡＳ－ＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３発現プラスミドの構築
　プライマーとして、ｇＲ３ｒｍｉｎｉＧＷ５８Ｘ＿ＢｇｌＦ及びｇＲＮＡ３ｒｍｉｎｉＵ５＿ＨｉｎｄＲ０１を用いたこと以外は実施例１０と同様にして、プラスミド（ｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏ＿５ＡＳ－ＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３）を構築した。用いたプライマーの配列を表１０に示す。また得られたプラスミドは、参考例２の標的編集ガイドＲＮＡ（ＳＬ４９）に相当する標的編集ガイドＲＮＡ（５ＡＳ－ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ１７３）を発現する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　また、ヒトアデノシンデアミナーゼ２（ｈＡＤＡＲ２）を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ｈＡＤＡＲ２）を以下のようにして構築した。
（参考例５）
ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＨｉｓＡＤＡＲ２の構築
　ｐＹＥＳ／ＮＴ＿Ａ＿ＡＤＡＲ２を鋳型とし、０．２５μＭ　ＨｉｓＡＤＡＲ２＿ＸｂａＦ０１プライマー、０．２５μＭ　ＨｉｓＡＤＡＲ２＿ＫｐｎＲ０１プライマーを用いて伸長反応２分の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲでインサートを増幅した。インサートとｐｃＤＮＡ３．１（－）ＨｙｇｒｏをＸｂａＩ及びＫｐｎＩを用いて３７℃で１時間酵素反応を行った。フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿により精製した後、２μＬを２０μＬのＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　（ＴａＫａＲａ）に加えて形質転換を行い、ＬＢアンピシリン寒天培地で一晩培養した。生じたコロニーを鋳型とし、０．３μＭ　Ｔ７ｐｒｏＧＧＧプライマー、０．３μＭ　ＢＧＨ　ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて、伸長反応２分の条件でＰＣＲをし、インサートチェックを行い、目的断片長の増幅産物を生じたクローンを液培した。抽出したプラスミドの配列を０．１６５μＭ　Ｔ７ｐｒｏＧＧＧプライマー、０．１６５μＭ　ＢＧＨ　ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、０．１６５μＭ　ＨｉｓＡＤＡＲ２＿ｓｅｑｆｗプライマーを用いてＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてシークエンシング反応し、塩基配列解析を行った。用いたプライマーの配列を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の細胞内編集誘導能評価１
　３５ｍｍガラス皿にＨＥＫ２９３細胞を１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、４８時間培養した。その後、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ　ＨＰ　ＤＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、７００ｎｇのＡＤＡＲ２発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿Ｈｉｓ－ＡＤＡＲ２）、７００ｎｇの基質ＲＮＡ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡｃＧＦＰＷ５８Ｘ）及び７００ｎｇのｇＲＮＡ発現プラスミド（ｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏ＿５ＡＳ－ＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３又はｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏ＿５ＡＳ－ｓｈＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３）を形質導入し７２時間培養した。培地を除去しＤ－ＰＢＳ（－）で置換した後、共焦点蛍光顕微鏡を用いた観察を行った。結果を図３に示す。図３におけるＰｈａｓｅは位相差観察の結果であり、ＧＦＰは蛍光観察の結果であり、Ｍｅｒｇｅはそれらの合成である。
　また編集効率の解析については以下の通りである。細胞を回収後、１０００μＬのセパゾール　ＲＮＡ　Ｉ　Ｓｕｐｅｒ　Ｇ（ナカライ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉを１０Ｕ用いてＤＮａｓｅ処理を行い、フェノール／クロロホルム抽出、及び酢酸ナトリウム存在下のエタノール沈殿によりＲＮＡを精製した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　（Ｒｏｃｈｅ社製）、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇ、０．２５μＭ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１７を用いた逆転写反応（変性：８０℃、３分、ｈｅａｔ－ｃｈｉｌｌ；アニーリング：６５℃、１０分；伸長：５５℃、３０分；加熱処理：８５℃、５分）を行い、ｃＤＮＡを増幅した。０．２５Ｕ　ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２５μＭ　ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡｆ＿Ｔ７Ｆ０１プライマー、０．２５μＭ　３’－ＡＤＰプライマーを用いた伸長６０秒の１ｓｔ　ＰＣＲ及び０．２５μＭ　ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡｆ＿Ｔ７Ｆ０１プライマー、０．２５μＭ　ＡｃＧＦＰ－ＲＮＡｆＲ０１プライマーを用いた伸長６０秒の２ｎｄ　ＰＣＲを行い、ＡｃＧＦＰフラグメントを増幅した。Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　（ＡＢＩ社製）と０．１６５μＭ　ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡｆ＿Ｔ７Ｆ０１プライマーを用いた伸長６０秒のシークエンシング反応を行い、クロマトチャートを得た。クロマトチャート（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）を図３に併せて示す。
標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の細胞内編集誘導能評価２
　ｇＲＮＡ発現プラスミドとして、実施例１１で得られたｐＳｕｐｅｒ＿ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ＿ｄｅｌ０３．５を用いたこと以外は上記と同様にして細胞内編集誘導能を評価した。結果を図４に示す。
　図３から、ＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘのみ、又はＧＦＰ＿Ｗ５８ＸとｈＡＤＡＲ２のみを発現させた細胞では、蛍光を発する細胞は観測されなかった。一方で、それら細胞にＡＤ－ｇＲＮＡ発現プラスミドを形質導入することで、蛍光を発する、すなわちＧＦＰを発現する多数の細胞が確認された。さらに、抽出したＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘのダイレクトシークエンスにより得られたクロマトチャートから、Ａ１７３はＡＤ－ｇＲＮＡ依存的に編集されることが確認された。なお、図３におけるＧＦＰ＿ＷＴは、野生型ＧＦＰのｍＲＮＡを発現させた系である。図４では、第二オリゴヌクレオチドの残基数を１４残基まで減らしても、従来型の標的編集ガイドＲＮＡと同程度の編集活性を示した。
（実施例１２から２２）
　第二オリゴヌクレオチド（ＡＲＲ）が表１２に示す塩基配列を有する標的編集ガイドＲＮＡを、実施例１に記載の方法に準じて作製した。得られた標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を、実施例３で得られた標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＲＲ＿ｗｔ）と共に、上述した評価１と同様の方法で評価した。結果を表１３及び図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　以上より、標的編集ガイドＲＮＡの好ましい一態様は、第一オリゴヌクレオチドが、標的対応ヌクレオチド残基（例えば、Ｃ）の５’側に標的ＲＮＡの対応する塩基配列と相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に標的ＲＮＡの対応する塩基配列と相補的な塩基配列を有する３残基のオリゴヌクレオチドとを有し、第二オリゴヌクレオチドが、５’側のステム部分として２残基の任意配列（ＮＮ）と、連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる配列（ＧＵＧ）とを含み、４残基の任意配列からなるループ部分を介して、３’側のステム部分に５’側のステム部分と相補対を形成可能な配列を含む。係る編集ガイドＲＮＡは、例えば図６で模式的に表される。
（実施例２３）
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
　Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、以下のようにして内在性ＡＤＡＲによる編集誘導活性を確認した。レポーター発現プラスミドとして、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘを構築した。ｐｓｉＣＨＥＣＫ２＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘは、市販のｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）－２（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に対して、Ｒｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒｌｕｃ）をコードする領域の１０４Ｗ（トリプトファン）を１０４Ｘ（終止コドン）に、４１Ｋ（リシン）を４１Ｒ（アルギニン）に変換させて得た。具体的には１０４番目のトリプトファンに対応する３１１Ｇを３１１Ａに変異させて編集標的を設定した。また、ＡＤＡＲによって標的編集ガイドＲＮＡに非依存的に編集される部位である４１Ｋが４１Ｒに変換されているが、この変異による発光測定への影響は無いことは確認ずみである。標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｗ１０４Ｘ）の配列を表１４に示す。
　標的編集ガイドＲＮＡ発現プラスミドとして、ｐＳｕｐｅｒ＿ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１を構築した。ｐＳｕｐｅｒ＿ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１は、３１１Ａを編集標的とし、ＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；第二オリゴヌクレオチド）として実施例３と同じ１４残基の配列を有する標的編集ガイドＲＮＡ（ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１）を発現する。また、コントロールとしてアンチセンス領域（ＡＳＲ；第一オリゴヌクレオチド；５ＡＳ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１）のみを発現するプラスミドとして、ｐＳｕｐｅｒ＿ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１を構築した。各プラスミドが発現するＲＮＡの配列を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　ヒトＡＤＡＲ２の発現制御が可能なＴｅｔ－ＡＤＡＲ２細胞を２４－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅに８．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、Ｄｏｘ　５．０μｇ／ｍＬを含む培地中で４８時間培養した。ＦｕＧＥＮＥ　ＨＰ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて１５ｎｇのｐｓｉＣＨＥＣＫ２＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘと、５００ｎｇのｐＳｕｐｅｒ＿ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１（標的編集ガイドＲＮＡ発現プラスミド）、又はｐＳｕｐｅｒ＿５ＡＳ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１（アンチセンス領域のみを発現するプラスミド）をトランスフェクトし、Ｄｏｘ　５．０μｇ／ｍＬを含む培地中で７２時間培養した。なお、Ｔｅｔ－ＡＤＡＲ２細胞については、ＲＮＡ，１８，１７３５－１７４４（２０１２）に記載されている。
　培養した細胞に対して１００μＬのＰａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液２０μＬにＬＡＲＩＩの１００μＬを添加した６０秒後に、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）２０／２０　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によりＦｌｕｃの発光強度を測定した。その後、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ　Ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ添加し、６０秒後にＲｌｕｃの発光強度を測定した。Ｒｌｕｃの発光強度をＦｌｕｃの発光強度で規格化して図７に示す。
　図７に示すように、ＡＲＲが１４残基の標的編集ガイドＲＮＡ（ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１）を発現させることで、内在性のｈＡＤＡＲ２によって標的ＲＮＡが編集された。
　アンチセンス領域をＡＤＡＲ結合領域の５’側に有する場合と３’側に有する場合の標的編集活性の相違について、以下のようにして検討した。
（実施例２４）
　実施例１から５及び参考例２で得られたアンチセンス領域（ＡＳＲ；第一オリゴヌクレオチド）をＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；第二オリゴヌクレオチド；表中の下線部）の５’側に有する標的編集ガイドＲＮＡ（５’－ＡＳ　ＡＤｇ）に加えて、アンチセンス領域（ＡＳＲ）を、実施例１から５及び参考例２におけるＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；表中の下線部）の３’側に有する標的編集ガイドＲＮＡ（３’－ＡＳ　ＡＤｇ）を、上記と同様にして準備した。準備した標的編集ガイドＲＮＡの配列を表１５に示す。併せてＡＳＲを４０残基及び３４残基のＡＲＲの５’側又は３’に有する標的編集ガイドＲＮＡを、上記と同様にして準備した。準備した標的編集ガイドＲＮＡについて、編集誘導活性を上述した評価１と同様の方法で評価した。結果を図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　図８から、ＡＲＲの残基数が４９残基（参考例２）、４０残基及び３４残基の標的編集ガイドＲＮＡでは、ＡＳＲがＡＲＲの５’側である５’－ＡＳ型（５’－ＡＳ　ＡＤｇ）と、３’側である３’－ＡＳ型（３’－ＡＳ　ＡＤｇ）のいずれにも良好な編集誘導活性が認められた。一方、ＡＲＲの残基数が２４残基以下（実施例１から５に相当）の標的編集ガイドＲＮＡでは、５’－ＡＳ型のみが良好な編集誘導活性を示し、３’－ＡＳ型は充分な編集誘導活性を示さなかった。これは、例えば、５’－ＡＳ型と３’－ＡＳ型の標的編集ガイドＲＮＡでは、ＡＤＡＲの編集活性を誘導するメカニズムが異なることを示していると考えられる。
　次に、ＡＲＲが短鎖型である標的編集ガイドＲＮＡによる編集位置の選択性について、以下のようにして評価した。
（実施例２５）
編集位置の選択性の評価
　ｓＧＦＰ＿ＲＮＡを基盤として、設定した位置に編集標的となるＡを配置した標的ＲＮＡを以下の方法に従って設計、合成した。
・前後１塩基（－１，１）の選択性を評価する際の標的ＲＮＡには、ＡＡＡ（真ん中のＡがＧＦＰ＿Ａ２００に相当）を導入した。
・前後２塩基の選択性を評価する際の標的ＲＮＡには、ＵＡＵＡＵＡＵを導入した。
・３塩基以上離れた位置の選択性を評価する際の標的ＲＮＡには、前後の塩基が変わらないようにＵＡＣという配列を固定し、離れた位置に配置することにより作製した。例えば、３と８を評価する場合の標的配列として、ＵＡＣＵＡＣＣＧＵＡＣを導入した。
　標的ＲＮＡの配列を標的部分に下線を付して表１６に示す。ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿ＡＡＡは、前後１塩基の位置選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿ＵＡＵは、前後２塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿３．８は、３塩基及び８塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿４．９は、４塩基及び９塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿５．１０は、５塩基及び１０塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿６．１１は、６塩基及び１１塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿７．１２は、７塩基及び１２塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　それぞれの標的ＲＮＡの配列に合わせて設計した標的編集ガイドＲＮＡ（ｓｈＡＤ－ｇＲＮＡ及びＡＤ－ｇＲＮＡ）を合成した。ｓｈＡＤ－ｇＲＮＡにおけるＡＲＲは、実施例３の標的編集ガイドＲＮＡ（配列番号１８）のＡＲＲと同一の１４残基の短鎖型である。また比較例であるＡＤ－ｇＲＮＡにおけるＡＲＲは、ＳＬ４９（配列番号２９）のＡＲＲと同一の４９残基である。ｓｈＡＤ－ｇＲＮＡの配列を、標的ＲＮＡを認識するＡＳＲ（第一オリゴヌクレオチド）に下線を付してを表１７に示す。得られた標的編集ガイドＲＮＡについて、編集誘導活性を上述した評価１と同様の方法で評価して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ編集解析を行った。各部位での編集割合を算出し、編集標的Ａとオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）部位の相対編集割合（Ａｏｆｆ－ｔａｒｇｅ／Ａｔａｒｇｅｔ）を求めた。結果を図９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　図９から、ＡＲＲ（第二オリゴヌクレオチド）の残基数が１４と短鎖型の標的編集ガイドＲＮＡ（ｓｈＡＤ－ｇＲＮＡ）は、ＡＲＲの残基数が４９残基の標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ－ｇＲＮＡ）と比べて、編集位置の選択性が高いことが分かる。
　日本国特許出願２０１７－２３４３４１号（出願日：２０１７年１２月６日）および日本国特許出願２０１８－１５１７５７号（出願日：２０１８年８月１０日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (11)

  1. 　標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備え、
    　前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、
    　前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、
    　前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３又は４残基のオリゴヌクレオチドとからなり、
    　前記第二オリゴヌクレオチドは、２から２４個のヌクレオチド残基からなり、
    　前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド。
  2. 　前記第二オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して非相補的な塩基配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 　前記第二オリゴヌクレオチドは、前記第一オリゴヌクレオチドに隣接して連結するグアノシン残基又はその誘導体を含む請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 　前記第二オリゴヌクレオチドが、ステムループ構造を形成し得る塩基配列を有する請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 　前記第二オリゴヌクレオチドは、５’側のステム部分に、連続する２又は３のグアニンからなる塩基配列、連続するウラシル及びグアニンからなる塩基配列、及び連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる塩基配列からなる群から選択される少なくとも１種を含み、３’側のステム部分にこれらと相補対を形成可能な塩基配列を含む請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 　前記第二オリゴヌクレオチドは、５’側のステム部分のループ部分に連結する領域に、連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる塩基配列を含み、３’側のステム部分にこれらと相補対を形成可能な塩基配列を含む請求項４又は５に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 　前記標的対応ヌクレオチド残基が、シチジン残基、ウリジン残基、アデノシン残基又はそれらの誘導体である請求項１から６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 　前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼによる酵素反応に起因する請求項１から７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 　請求項１から８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、標的ＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させることを含む標的ＲＮＡの部位特異的編集方法。
  10. 　真核細胞中で行われる請求項９に記載の編集方法。
  11. 　編集標的となるアデノシン残基を含む標的ＲＮＡを選択することと、
    　前記標的ＲＮＡが有する、前記アデノシン残基の３’側の１５から３０残基分の第一塩基配列、前記アデノシン残基の５’側の３又は４残基分の第二塩基配列、及び前記第二塩基配列の５’側に隣接する少なくとも２残基分の第三塩基配列を取得することと、
    　前記第一塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと前記アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記第二塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとが、５’側から順に連結したオリゴヌクレオチドを準備することと、
    を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。
PCT/JP2018/044751 2017-12-06 2018-12-05 オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法 WO2019111957A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/770,161 US11643658B2 (en) 2017-12-06 2018-12-05 Oligonucleotides, manufacturing method for same, and target RNA site-specific editing method
EP18886229.6A EP3722420A4 (en) 2017-12-06 2018-12-05 OLIGONUCLEOTIDES, METHODS OF MANUFACTURING THEREFORE AND TARGET RNA SITE-SPECIFIC EDITING METHOD
US18/187,880 US20230265431A1 (en) 2017-12-06 2023-03-22 Oligonucleotides, manufacturing method for same, and target rna site-specific editing method

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017234341 2017-12-06
JP2017-234341 2017-12-06
JP2018-151757 2018-08-10
JP2018151757A JP7333508B2 (ja) 2017-12-06 2018-08-10 オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/770,161 A-371-Of-International US11643658B2 (en) 2017-12-06 2018-12-05 Oligonucleotides, manufacturing method for same, and target RNA site-specific editing method
US18/187,880 Continuation US20230265431A1 (en) 2017-12-06 2023-03-22 Oligonucleotides, manufacturing method for same, and target rna site-specific editing method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019111957A1 true WO2019111957A1 (ja) 2019-06-13

Family

ID=66750461

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/044751 WO2019111957A1 (ja) 2017-12-06 2018-12-05 オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20230265431A1 (ja)
WO (1) WO2019111957A1 (ja)

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020246560A1 (ja) * 2019-06-05 2020-12-10 学校法人福岡大学 化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドｒｎａ
WO2021020550A1 (ja) 2019-08-01 2021-02-04 アステラス製薬株式会社 機能性塩基配列を付加した標的編集ガイドｒｎａ
WO2021060527A1 (ja) * 2019-09-27 2021-04-01 学校法人福岡大学 オリゴヌクレオチド及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
WO2021117729A1 (ja) 2019-12-09 2021-06-17 アステラス製薬株式会社 標的ｒｎａを編集するための機能性領域を付加したアンチセンス型ガイドｒｎａ
WO2021182474A1 (ja) * 2020-03-12 2021-09-16 株式会社Ｆｒｅｓｔ オリゴヌクレオチド及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
WO2022124345A1 (ja) * 2020-12-08 2022-06-16 学校法人福岡大学 化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドｒｎａ
WO2022138929A1 (ja) * 2020-12-25 2022-06-30 アステラス製薬株式会社 標的ｒｎａのポリアデニル化シグナル配列を編集するためのガイドｒｎａ
US11453878B2 (en) 2019-01-22 2022-09-27 Korro Bio, Inc. RNA-editing oligonucleotides and uses thereof
US11479575B2 (en) 2019-01-22 2022-10-25 Korro Bio, Inc. RNA-editing oligonucleotides and uses thereof
WO2022248879A1 (en) * 2021-05-27 2022-12-01 Oxford University Innovation Limited Composition and method for adar-mediated rna editing
WO2023152371A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Proqr Therapeutics Ii B.V. Guide oligonucleotides for nucleic acid editing in the treatment of hypercholesterolemia
WO2024013360A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified oligonucleotides for adar-mediated rna editing
WO2024013361A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides for adar-mediated rna editing and use thereof
WO2024084048A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Proqr Therapeutics Ii B.V. Heteroduplex rna editing oligonucleotide complexes
WO2024110565A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of hereditary hfe-hemochromatosis
WO2024115635A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of aldehyde dehydrogenase 2 deficiency
WO2024121373A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of cardiovascular disease
US12018257B2 (en) 2016-06-22 2024-06-25 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded RNA-editing oligonucleotides
WO2024153801A1 (en) 2023-01-20 2024-07-25 Proqr Therapeutics Ii B.V. Delivery of oligonucleotides
WO2024175550A1 (en) 2023-02-20 2024-08-29 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of atherosclerotic cardiovascular disease
WO2024200278A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified antisense oligonucleotides for use in rna editing
WO2024200472A1 (en) 2023-03-27 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of liver disease
WO2024206175A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of neurological disorders

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012161144A1 (ja) * 2011-05-20 2012-11-29 学校法人 福岡大学 Rna配列上の修飾を識別するリボザイムおよびそれを用いたrna開裂方法
DE102015012522B3 (de) * 2015-09-26 2016-06-02 Eberhard Karls Universität Tübingen Verfahren und Substanzen zur gerichteten RNA-Editierung
WO2016097212A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Proqr Therapeutics Ii B.V. Targeted rna editing
WO2017010556A1 (ja) 2015-07-14 2017-01-19 学校法人福岡大学 部位特異的ｒｎａ変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイドｒｎａならびに標的ｒｎａ－標的編集ガイドｒｎａ複合体
JP2018151775A (ja) 2017-03-10 2018-09-27 国際航業株式会社 物理量分布図の作成方法、及び物理量分布図作成装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012161144A1 (ja) * 2011-05-20 2012-11-29 学校法人 福岡大学 Rna配列上の修飾を識別するリボザイムおよびそれを用いたrna開裂方法
WO2016097212A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Proqr Therapeutics Ii B.V. Targeted rna editing
WO2017010556A1 (ja) 2015-07-14 2017-01-19 学校法人福岡大学 部位特異的ｒｎａ変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイドｒｎａならびに標的ｒｎａ－標的編集ガイドｒｎａ複合体
DE102015012522B3 (de) * 2015-09-26 2016-06-02 Eberhard Karls Universität Tübingen Verfahren und Substanzen zur gerichteten RNA-Editierung
JP2018151775A (ja) 2017-03-10 2018-09-27 国際航業株式会社 物理量分布図の作成方法、及び物理量分布図作成装置

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOPHYS. J., vol. 113, 2017, pages 257 - 267
FUKUDA, M. ET AL.: "Construction of a guide-RNA for site-directed RNA mutagenesis utilising intracellular A-to-I RNA editing", SCI. REP., vol. 7, 2 February 2017 (2017-02-02), pages 41478, XP055404025, DOI: 10.1038/srep41478 *
FUKUDA, MASATORA ET AL.: "2PW01-3: Development of transient genetic modification technology based on RNA editing induction using designer RNA", CONFERENCE OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, vol. 90, no. 1, 15 November 2017 (2017-11-15), JP, pages 1, XP009521274 *
FUKUDA, MASATORA: "Genetic modification and regulation technology based on an RNA editing mechanism", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 36, no. 19, 1 December 2018 (2018-12-01), pages 3246 - 3251, XP009521250 *
HOSHINO, RINA ET AL.: "1P-0787: Generation of translation start point and control of protein translation in A-to-I RNA editing", CONFERENCE OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, vol. 90, no. 1, 15 November 2017 (2017-11-15), JP, pages 1 - 2, XP009521276 *
HOSHINO, RINA ET AL.: "Control of protein translation by generation of translation start point in A-to-I RNA editing", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN, vol. 41, no. 1, 9 November 2018 (2018-11-09), JP, pages 1P-0182, XP009521264 *
HOSHINO, RINA: "Generation of the translation start point by A- to-I RNA editing", ABSTRACTS OF ANNUAL MEETING OF THE RNA SOCIETY, vol. 19, 19 July 2017 (2017-07-19), pages 156, XP009521246 *
KANAKO NOSE, RYOMA NOGUCHI, RINA HOSHINO, NAOKI MASUDA, HIROYUKI NAKAGAWA, MASATORA FUKUDA: "Development of RNA mutagenesis method to use editing activity of human ADARs", ABSTRACTS OF ANNUAL MEETING OF THE RNA SOCIETY, vol. 19, 19 July 2017 (2017-07-19), JP, pages 231, XP009521244 *
KANAKO NOSE, RYOMA NOGUCHI, RINA HOSHINO, NAOKI MASUDA, HIROYUKI NAKAGAWA, MASATORA FUKUDA: "functional evaluation of a guide RNA inducing the editing activity of ADAR for site-directed RNA editing", PROGRAM & ABSTRACTS. INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NUCLEIC ACIDS CHEMISTRY, vol. 44, 14 November 2017 (2017-11-14), pages 190 - 191, XP009521258 *
MASATORA FUKUDA, KANAKO NOSE: "Development of the artificial guide RNA for a site-directed RNA mutagenesis", LECTURE ABSTRACTS OF ANNUAL CONFERENCE OF NUCLEIC ACIDS THERAPEUTICS SOCIETY OF JAPAN, vol. 4, 25 June 2018 (2018-06-25), pages 38, XP009521279 *
MASATORA FUKUDA; KANAKO NOSE: "The Latest genetic modification and regulation technology based on RNA editing", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 36, no. 9, 1 June 2018 (2018-06-01), pages 1522 - 1528, XP009521262 *
NOGUCHI, RYUMA ET AL.: "Formation of G-quadruplex structure induced by A-to-I RNA editing", ABSTRACTS OF ANNUAL MEETING OF THE RNA SOCIETY, vol. 19, 19 July 2017 (2017-07-19), pages 125, XP009521245 *
NOSE, KANAKO ET AL.: "1P-1335: Construction of a guide RNA which site-specifically induces editing activity of ADAR, and editing induction mechanism", CONFERENCE OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, vol. 90, 15 November 2017 (2017-11-15), JP, pages 1 - 2, XP009521277 *
NOSE, KANAKO ET AL.: "3P-0708: Design and functional evaluation of a guide RNA which target site-specifically induces A-to-: RNA editing", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAR, vol. 41, no. 1, 9 November 2018 (2018-11-09), JP, pages 1 - 2, XP009521280 *
NOSE, KANAKO ET AL.: "Design and functional evaluation of a guide RNA which site-specifically induces RNA editing", ABSTRACTS OF ANNUAL MEETING OF THE RNA SOCIETY, vol. 20, 9 July 2018 (2018-07-09), pages 215, XP009521243 *
RNA, vol. 18, 2012, pages 1735 - 1744
STAFFORST, T. ET AL.: "An RNA-Deaminase Conjugate Selectively Repairs Point Mutations", ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 51, no. 44, 2012, pages 11166 - 11169, XP002765253 *
VALLECILLO-VIEJO, I. ET AL.: "Abundant off-target edits from site-directed RNA editing can be reduced by nuclear localization of the editing enzyme", RNA BIOL., vol. 15, no. 1, 13 November 2017 (2017-11-13), pages 104 - 114, XP055614862 *
VOGEL, P. ET AL.: "Improving site-directed RNA editing in vitro and in cell culture by chemical modification of the guideRNA", ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 53, no. 24, 2014, pages 6267 - 6271, XP002765255 *
WETTENGEL, J. ET AL.: "Harnessing human ADAR2 for RNA repair-Recoding a PINK1 mutation rescues mitophagy", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 45, no. 5, 17 March 2017 (2017-03-17), pages 2797 - 2808, XP055329586 *

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12018257B2 (en) 2016-06-22 2024-06-25 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded RNA-editing oligonucleotides
US11453878B2 (en) 2019-01-22 2022-09-27 Korro Bio, Inc. RNA-editing oligonucleotides and uses thereof
US12031131B2 (en) 2019-01-22 2024-07-09 Korro Bio, Inc. RNA-editing oligonucleotides and uses thereof
US11479575B2 (en) 2019-01-22 2022-10-25 Korro Bio, Inc. RNA-editing oligonucleotides and uses thereof
WO2020246560A1 (ja) * 2019-06-05 2020-12-10 学校法人福岡大学 化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドｒｎａ
CN113939592A (zh) * 2019-06-05 2022-01-14 学校法人福冈大学 导入了化学修饰核酸的稳定型目标编辑向导rna
WO2021020550A1 (ja) 2019-08-01 2021-02-04 アステラス製薬株式会社 機能性塩基配列を付加した標的編集ガイドｒｎａ
CN114514318A (zh) * 2019-09-27 2022-05-17 学校法人福冈大学 寡核苷酸和靶rna的位点特异性编辑方法
WO2021060527A1 (ja) * 2019-09-27 2021-04-01 学校法人福岡大学 オリゴヌクレオチド及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
WO2021117729A1 (ja) 2019-12-09 2021-06-17 アステラス製薬株式会社 標的ｒｎａを編集するための機能性領域を付加したアンチセンス型ガイドｒｎａ
WO2021182474A1 (ja) * 2020-03-12 2021-09-16 株式会社Ｆｒｅｓｔ オリゴヌクレオチド及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
WO2022124345A1 (ja) * 2020-12-08 2022-06-16 学校法人福岡大学 化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドｒｎａ
WO2022138929A1 (ja) * 2020-12-25 2022-06-30 アステラス製薬株式会社 標的ｒｎａのポリアデニル化シグナル配列を編集するためのガイドｒｎａ
WO2022248879A1 (en) * 2021-05-27 2022-12-01 Oxford University Innovation Limited Composition and method for adar-mediated rna editing
WO2023152371A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Proqr Therapeutics Ii B.V. Guide oligonucleotides for nucleic acid editing in the treatment of hypercholesterolemia
WO2024013361A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides for adar-mediated rna editing and use thereof
WO2024013360A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified oligonucleotides for adar-mediated rna editing
WO2024084048A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Proqr Therapeutics Ii B.V. Heteroduplex rna editing oligonucleotide complexes
WO2024110565A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of hereditary hfe-hemochromatosis
WO2024115635A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of aldehyde dehydrogenase 2 deficiency
WO2024121373A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of cardiovascular disease
WO2024153801A1 (en) 2023-01-20 2024-07-25 Proqr Therapeutics Ii B.V. Delivery of oligonucleotides
WO2024175550A1 (en) 2023-02-20 2024-08-29 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of atherosclerotic cardiovascular disease
WO2024200278A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified antisense oligonucleotides for use in rna editing
WO2024206175A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of neurological disorders
WO2024200472A1 (en) 2023-03-27 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of liver disease

Also Published As

Publication number Publication date
US20230265431A1 (en) 2023-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019111957A1 (ja) オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
WO2021060527A1 (ja) オリゴヌクレオチド及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
KR102418185B1 (ko) 단일 가닥 rna-편집 올리고뉴클레오타이드
US20240247258A1 (en) Oligonucleotide and target rna site-specific editing method
WO2022124345A1 (ja) 化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドｒｎａ
WO2021020550A1 (ja) 機能性塩基配列を付加した標的編集ガイドｒｎａ
JP7333508B2 (ja) オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
CA2968336C (en) Construct for site directed editing of an adenosine nucleotide in target rna
CN114787357A (zh) 用于编辑靶标rna的添加了功能性区域的反义型指导rna
JP2021534732A (ja) Ｒｎａ編集のための人工核酸
TW202136509A (zh) 用於基因編輯之經修飾引導rna
BRPI0611701A2 (pt) materiais e métodos para a geração de transcritos de ácidos nucléicos inteiramente modificados em 2
US6037463A (en) Enzymatic RNA molecules that cleave mutant N-RAS
JP2021519071A (ja) シュードウリジン化のための核酸分子
WO2018003739A1 (ja) 機能的リガンドを含む核酸複合体
US11939580B2 (en) Construct of self-circularization RNA
EP2781598A1 (en) Nucleic acid molecule for inhibiting activity of rnai molecule
CN116981773A (zh) 用于编辑靶标rna的多聚腺苷酸化信号序列的指导rna
WO2023176863A1 (ja) ＲＮＡｉ活性を有する化学修飾オリゴヌクレオチド
WO2021039598A1 (ja) Ｒｎａ作用抑制剤及びその利用
KR20240144777A (ko) 폴리 테일 및 폴리 캡 mRNA 그리고 그의 용도
WO2014084246A1 (ja) RNAi分子活性抑制用核酸の阻害剤
JP2016192918A (ja) ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの活性を抑制するための核酸分子
JP2023527673A (ja) Ｒｎａの免疫原性を低下させる方法及び免疫原性が減少したｒｎａ分子
WO2024200278A1 (en) Chemically modified antisense oligonucleotides for use in rna editing

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18886229

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018886229

Country of ref document: EP

Effective date: 20200706