WO2012161144A1 - Rna配列上の修飾を識別するリボザイムおよびそれを用いたrna開裂方法 - Google Patents

Rna配列上の修飾を識別するリボザイムおよびそれを用いたrna開裂方法 Download PDF

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将虎 福田
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes

Definitions

  • the present invention relates to a ribozyme for identifying a modification on an RNA sequence and an RNA cleavage method using the ribozyme. More specifically, the present invention relates to a hammerhead ribozyme that identifies modifications by RNA editing or the like on an RNA sequence and an RNA cleavage method using the same.
  • RNA In vivo RNA is known to be chemically modified, and noncoding RNAs such as rRNA and tRNA function by being modified.
  • mRNA is also modified, for example, A-to-I editing in which the nucleotide of mRNA is replaced from adenosine (A) to inosine (I), or C-- from cytosine (C) to uracil (U). Modifications such as RNA editing such as to-U editing are known.
  • RNA editing is a mechanism for converting post-transcriptional genetic information.
  • the base sequence of the mRNA precursor generated by transcription from the gene the base at a specific site is altered to another base by the action of an enzyme. It appears in various forms such as base insertion, deletion, and substitution (Non-patent Document 1). This phenomenon is generally a mechanism programmed in the body to change the gene product in response to changes in physiological conditions and environment.
  • Non-patent Document 2 A-to-I editing, in which base substitution from adenosine (A) base to inosine (I) base at a specific site of the mRNA precursor by the action of adenosine deaminase (ADAR) is physiologically important.
  • ADAR adenosine deaminase
  • RNA precursors for A-to-I editing in coding RNA include serotonin 2C type receptor (HTR2CR) and glutamate receptor B subunit ⁇ ⁇ (GRIA2) ((Non-patent Document 3).
  • Serotonin 2C type receptor is a 7-transmembrane G protein-coupled receptor that mediates neuronal signal transduction in the brain by serotonin, and is thought to be deeply involved in emotional control.
  • the serotonin type 2C receptor (HTR2CR), when serotonin binds to the extracellular loop of HTR2CR, transmits its stimulation to the coupled G protein, and then causes changes in neuronal properties through the intracellular signaling pathway, Ultimately controls brain functions such as memory, learning, and emotion.
  • HTR2CR serotonin 2C type receptor
  • RNA editing the amino acid sequence of the G protein binding region of the receptor protein changes, and the signal transduction ability of the receptor changes.
  • FIG. 2 combining the nucleotide sequence of HTR2CR and the encoded amino acid with a site that has undergone RNA editing (shown in white in the figure) results in amino acids from a single gene.
  • a maximum of 24 types (mainly 8 types) of receptor proteins with different sequences and transfer functions are generated (Non-patent Documents 4 and 5, FIG. 2).
  • Non-patent Document 6 RNA editing
  • Non-Patent Literature 7 cytosine (C) is base-substituted to uracil (U), and cytosine is converted to uridine by deamination. 7). Nuclear transcripts encoding intestinal apolipoprotein B (ApoB) ⁇ ⁇ ⁇ have been reported to undergo C-to-U RNA editing, converting CAA codons to UAA stop codons and producing shorter proteins than before editing ( Non-patent document 8).
  • RNA editing such as A-to-I editing and C-to-U editing is used to control genetic adaptability by generating a protein that is different from the protein generated when not editing. It is related to an important mechanism. Since RNA substitution modification in the coding region plays a decisive role in the control of biological processes, the occurrence of abnormal modification causes severe diseases (Non-Patent Document 9), especially RNA substitution. The involvement of modified schizophrenia, bipolar disorder, major depression and other mental disorders is drawing attention.
  • RNA RNA precursors in addition to the serotonin type 2C receptor (HTR2C) and glutamate receptor B subunit (GRIA2) RNA RNA precursors, in particular the central nervous system mentality such as ⁇ -aminobutyric acid (GABA) receptors and potassium channels
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • Other RNA editing targets have been identified in sequences encoding receptors, ion channels and proteins of other proteins that are deeply involved in neural function (Non-patent Document 10). Although high-throughput sequence data suggests that RNA substitution editing controls amino acid sequence to control protein function, the detailed biological function of this RNA editing is still unclear.
  • a ribozyme is known as a functional molecule that specifically recognizes and reacts with a specific site modified on an RNA sequence.
  • HHR hammerhead ribozyme
  • HHR hammerhead ribozyme
  • HHR hammerhead ribozyme H
  • HHR consists of an active region (Helix II) ⁇ ⁇ consisting of a core sequence with a conserved catalytic activity in the center, and two hybridization arms that recognize the target sequences 3 'and 5' of the active region. It consists of a recognition region ⁇ ⁇ (Helix III and Helix I, respectively) ⁇ ⁇ consisting of sequences.
  • a target-specific hammerhead ribozyme kit can be prepared by converting the above-mentioned hybridization arm sequence for a target RNA according to a simple Watson-Crick base pairing rule.
  • HHRs with different core sequences for target RNA can be designed, and by using a sequence complementary to the hybridization sequence sandwiching a specific triplet of target RNA, it can bind to target RNA and the triplet The phosphodiester bond existing on the 3 ′ side of can be cleaved (Non-patent Document 13).
  • HHR hammerhead ribozyme
  • Non-patent Document 14 Non-patent Document 14
  • HHR hammerhead ribozyme
  • RNA editing in brain controls a determinant of ion flow inglutamate-gated channels.
  • RNA 14 (10): 2074-2085; Li, JB, Levanon, EY, Yoon, JK, Aach, J., Xie, B ., Leproust, E., Zhang, K., Gao, Y., and Church, GM 2009. Genome-wide identification ofhuman RNA editing sites by parallel DNA capturing and sequencing. Science 324 (5931): 1210-1213; Pullirsch, D. and Jantsch, MF 2010. Proteome diversification byadenosine to inosine RNA editing. RNA Biol 7 (2): 205-212. Uhlenbeck, O.C.
  • HHR hammerhead ribozyme
  • the hammerhead ribozyme (HHR) ⁇ according to the present invention has a target specificity of HHR for the three bases (triplets) of the target RNA that is preferentially cleaved so that the modification site such as RNA editing can be cleaved specifically. Based on the design.
  • HHR hammerhead ribozyme kit
  • the hammerhead ribozyme kit (HHR) designed based on the above theory can be represented by the structural formula in FIG.
  • the upper molecule represented by a thick black solid line represents a hammerhead ribozyme.
  • This hammerhead ribozyme (HHR) has three regions, namely, an active region (Helix II) consisting of a core sequence having catalytic activity in the center, and a target RNA located 5 'to the active region (Helix II).
  • Helix I 5 'recognition region
  • HelixHIII 3' recognition region
  • the 5 ′ side recognition region (Helix I) and 3 ′ side recognition region (Helix III) consisting of the arm sequences are designed to hybridize with the target RNA (substrate RNA).
  • the base (D) is located between the 3 'recognition region (Helix III) and the active region (Helix II), and the active region (Helix II) and 5 'Design to interpose the base (X) at the position between the side recognition region (Helix I).
  • This base (D) forms a base pair with the target RNA base and pairs with the base H of the triplet represented by 3′-NHH′-5 ′ (the structural formula in FIG. 3) in the target RNA.
  • the base (X) is designed to form a base pair only with the modification site (editing site) of the target RNA.
  • cytosine is used as the recognition base.
  • C-to-U editing specific cleavage guanosine is converted to adenosine, so adenosine is used as the recognition base.
  • the base of the target RNA is converted to another base by other modifications other than A-to-I editing or C-to-U editing, it should correspond to the converted base. It goes without saying that the recognition base of HHR can be designed.
  • the lower molecule represented by the black solid line represents the target RNA (substrate RNA).
  • This target RNA hybridizes to the 5 'recognition region (HelixHI) and the 3' recognition region (Helix III) of HHR to form base pairs, respectively.
  • the target RNA (substrate RNA) has a modification site (indicated here as “edit”), this modification site hybridizes with the recognition base of HHR to form a base pair. The bond with the base adjacent to the 3 ′ side of the modification site is cleaved.
  • the triplet represented by 3′-NHH′-5 ′ indicates a site with particularly high cleavage activity, and is a site that is preferentially cleaved by the catalytic action of HHR ( Cleavage Site).
  • N may be any nucleotide
  • H represents adenosine (A), cytosine (C), or uracil (U) (Kore et al. 1998).
  • the present invention provides a hammerhead ribozyme (HHR) that identifies modifications of RNA on the target mRNA, for example, modifications such as RNA editing (A-to-I editing, C-to-U editing, etc.).
  • HHR hammerhead ribozyme
  • Another object of the present invention is to provide a hammerhead ribozyme-target RNA construct that is a base-paired product of a hammerhead ribozyme (HHR) and a target RNA.
  • HHR hammerhead ribozyme
  • another object of the present invention is to provide a method for cleaving a target RNA comprising cleaving a specific site modified with a target RNA by base pairing a hammerhead ribozyme (HHR) with a target RNA. Is to provide.
  • HHR hammerhead ribozyme
  • the present invention is a hammerhead ribozyme capable of recognizing the target RNA modified as described above, which has the general formula [I]:
  • X is a modified recognition base that recognizes the modification site of the target RNA, and means adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U);
  • N may be the same or different, and means any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U);
  • N ′ may be the same or different and is any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U), and the corresponding base N
  • a hammerhead ribozyme in which the base X is adenine (A) or cytosine (C) in general formula ⁇ ⁇ ⁇ [Ia].
  • HHR hammerhead ribozyme
  • N ′ is any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U)), and the corresponding base in the hammerhead ribozyme (HHR) Means a base that forms a base pair with N; H means any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or uracil (U), and forms a base pair with the corresponding base D in the HHR.
  • H ′ means any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U);
  • E is any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G), uracil (U) or inosine (I), and the corresponding base X and base in HHR [I] above Means a base that forms a pair, and that, when forming a base pair with base X, cleaves the bond with the base H ′ adjacent to the 5 ′ side; m and n have the same meaning as described above) It can be expressed as
  • the present invention relates to the general formula [III] constructed by forming a base pair between the hammerhead ribozyme ⁇ ⁇ and the target RNA:
  • a hammerhead ribozyme-target RNA construct represented by:
  • a general formula [IIIa] constructed by base pairing of a hammerhead ribozyme [Ia] and a target RNA [II]:
  • a hammerhead ribozyme-target RNA construct represented by:
  • the base E when the base E is the base I, the base X is the base C, and when the base E is the base U, the base X Provides a hammerhead ribozyme-target RNA construct that is base A.
  • the present invention provides an RNA-modified cleavage method comprising cleaving the cleavage site of the target RNA portion of the construct using the HHR. More specifically, the present invention provides an RNA cleavage method comprising cleaving a modification site existing on a target RNA using the HHR, and cleaving a binding site adjacent to the 5 ′ upstream of the RNA modification site. To do.
  • the hammerhead ribozyme (HHR) has a triplet sequence 5′-N′HH′-3 ′ (where the base N ′ is adenine (A), uracil ( U), guanine (G) or cytosine (C), and the base H and the base H ′ may be A, C or U).
  • base H nor base H ′ represents guanine (G), but when base H and base H ′ are guanine (G), it is considered that there is almost no cleavage activity, If it occurs, it may be guanine (G).
  • this triplet sequence is naturally included in the scope of the present invention.
  • Electrophoresis diagram after synthesis of each ribozyme and substrate RNA S.
  • FIG. 5 is another electrophoretic diagram showing the results of a round 1 cycle check.
  • disconnection of the ribozyme with respect to a HTR2C RNA fragment is a figure which shows the base sequence of a ribozyme and an HTR2C RNA fragment.
  • B The figure which shows the analysis result of A-to-I edit specific cutting
  • C The figure which summarized the cutting rate obtained by the experiment with respect to HR-HTR2C and CHR-HTR2C-edit with respect to HTR2C-ade and HTR2C-ino.
  • TM APOB
  • A is a figure which shows the base sequence of ribozyme and APOB mRNA fragment.
  • FIG. 20 The figure which shows the time-dependent cleavage reaction and dynamic analysis result about HR-APOB-edit with respect to a non-edited and edited APOB * RNA fragment.
  • FIG. 20 the figure which shows the time-dependent cutting
  • TM unedited APOB
  • (A) is a figure which shows the base sequence of a ribozyme and a synthetic
  • (B) is a figure which shows the analysis result of A-to-I edit specific cleavage by ribozyme using denaturing PAGE (15%).
  • (C) The figure which summarized the cutting rate obtained by the experiment (B) with respect to HR-HRFLNA and HR- FLNA -edit against FLNA -ade and FLNA -ino.
  • Diagram showing in vitro A-to-I editing-specific cleavage of ribozymes for cell-extracted FLNA mRNA (edit-specific cleavage of HR-FLNA-edit for cell-extracted FLNA mRNA by measuring the editing rate at the Q / R site Figure showing experimental method for analysis).
  • the hammerhead ribozyme according to the present invention has a general formula [I]:
  • X is a modification recognition base that recognizes the modification site of the target RNA, and means any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U);
  • N may be the same or different, and means any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U);
  • N ′ may be the same or different and is any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or uracil (U), and the corresponding base
  • the active region (Helix II) having the core sequence of the hammerhead ribozyme of the present invention is a region that acts to catalyze the cleavage activity of the modified target RNA of the modified target RNA, and has the general formula [IV] : 3'- AAG NaNbN'a AG Nc AGUC -5 '[IV] It can also be expressed as In the above general formula [IV], the underlined bases ( A , C , G and U ) are base sequences (consensus sequence) that exert a cleavage catalytic activity necessary for cleavage of the target RNA modification site. Represents.
  • the hammerhead ribozyme as one preferred embodiment of the present invention has a general formula [Ia]:
  • target RNA recognized by the hammerhead ribozyme of the present invention include, for example, serotonin 2C type receptor (HTR2C), glutamate receptor, ⁇ -aminobutyric acid (GABA) receptor, FLNA (filamin A, alpha [ actin binding protein 280]: actin-binding protein 280), apolipoprotein B (ApoB), and receptors that are deeply involved in the central nervous system such as potassium channels and RNA precursors such as ion channels .
  • HTR2C serotonin 2C type receptor
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • FLNA lactamin A, alpha [ actin binding protein 280]: actin-binding protein 280
  • ApoB apolipoprotein B
  • receptors that are deeply involved in the central nervous system such as potassium channels and RNA precursors such as ion channels .
  • each N ′ may be the same or different and is any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U)).
  • H is any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U), and forms a base pair with the corresponding base D in the above HHR [I] Means
  • H ′ means any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U);
  • E is any base selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G), uracil (U) or inosine (I), and forms a base pair with the corresponding base X in the HHR Means a base that, when forming a base pair with base X,
  • base E means a base that has undergone modification such as RNA editing or mutation.
  • base E means inosine (I) ⁇
  • C-to For -U editing it means uracil (U) ⁇ ⁇ .
  • the modified recognition base X (X) ⁇ of the hammerhead ribozyme that forms base pairs with the target RNA [II] ⁇ is cytosine (C)
  • the base E of RNA [II] is uracil (U) ⁇
  • it is preferably adenine (A).
  • the three base sequence (triplet sequence) represented by the above general formula 5′-N′HH′-3 ′ is a peripheral sequence of the cleavage site of the target RNA, and a 3′-side region of the target RNA. It is a base sequence sandwiched between 5'-side regions and shows high cleavage activity for the target RNA cleavage site. That is, the hammerhead ribozyme (HHR) of the present invention has the triplet sequence 5′-N′HH′-3 ′ (wherein the base N ′ is adenine (A), uracil (U), guanine (G) or Cytosine (C), and the base H and the base H ′ may be A, C or U).
  • HHR hammerhead ribozyme
  • base H nor base H ′ represents guanine (G).
  • base H and base H ′ are guanine (G)
  • both base H and base H ′ may be guanine (G).
  • this triplet sequence is naturally included in the scope of the present invention.
  • the target RNA [II] when the target RNA [II] is subjected to modification such as RNA editing or mutation, the base at that site is converted to a base different from the original base. As a result, the modified base forms a base pair with the modified recognition base of the ribozyme. As a result, the binding site between the modified base and the base adjacent to the 5'-side upstream is cleaved.
  • a hammerhead ribozyme-target RNA construct represented by:
  • the modified recognition base (X) of HHR forms a base pair with the modification site (E) of the target RNA, so that it is upstream of the modification site (E). Breaks the bond with the adjacent base (H ′). That is, the base (E) of the target RNA means, for example, inosine (I) in the case of A-to-I editing, and uracil (U) in the case of C-to-U editing. To do. Therefore, in the case of A-to-I editing, the modified recognition base (X) of the hammerhead ribozyme corresponding to the modified base (E) is cytosine (C), and in the case of C-to-U editing. Is adenine (A).
  • a hammerhead ribozyme-target RNA construct represented by:
  • the hammerhead ribozyme of the present invention recognizes the modification site of the target RNA ⁇ that has been modified by, for example, RNA editing, and the modification recognition base (X) of the hammerhead ribozyme and the modification of the target RNA.
  • a hammerhead ribozyme-target RNA construct is constructed by forming a base pair with the base (E), a phosphodiester with the base (H ′) adjacent to the 5′-side upstream of the modified base (E) of the target RNA It will break the bond.
  • the target mRNA that has undergone modification such as RNA editing will produce a protein having a function or action different from that of the original protein derived from the target mRNA that has not undergone such modification.
  • the hammerhead ribozyme of the present invention can suppress the function and action of the modified target mRNA that may adversely affect the biological function due to the modification of the target mRNA.
  • the hammerhead ribozyme of the present invention includes, for example, serotonin 2C type receptor (HTR2C), glutamate receptor, ⁇ -aminobutyric acid (GABA) receptor, FLNA (actin binding protein 280), apolipoprotein B (ApoB) Prevention of diseases such as schizophrenia, bipolar disorder, major depression and other psychiatric disorders related to receptors and ion channels that are deeply involved in central nervous system neuropsychiatric functions such as potassium channels And can be expected to help improve treatment.
  • HTR2C serotonin 2C type receptor
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • FLNA actin binding protein 280
  • ApoB apolipoprotein B
  • RNA editing occurs at the following sites in five sites A to E.
  • Diseases that are considered to be involved in such RNA editing include the diseases shown in Table 1 below. Therefore, the hammerhead ribozyme according to the present invention can be expected to exert effects on diseases as shown in Table 1 below in addition to the above diseases.
  • RNA editing in the protein coding region is also known, and the hammerhead ribozyme [I] according to the present invention is also as shown in Table 2 below for diseases associated with these genes. Expected to have an effect on diseases.
  • HHR-HTR2C RNA construct hammerhead ribozyme and serotonin 2C receptor (HTR2C) mRNA
  • HTR2C2RNA hammerhead ribozyme and serotonin 2C receptor
  • the present invention is not limited to the HHR-HTR2C RNA construct. Absent.
  • the structure of the HHR-HTR2C RNA construct used in the present invention can be described as follows.
  • the modified site (E) of HTR2C RNA is represented as adenosine (A), that is, an unmodified site, and therefore, the cytosine of the modification recognition base (X) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ of the hammerhead ribozyme It cannot form base pairs with C). Therefore, in the construct represented by the above structural formula, cleavage does not occur at the cleavage site of HTR2C RNA.
  • the HTR2C RNA modification site (E) is base-edited to inosine (I) by A-to-I editing, it forms a base pair with the edit recognition site (C), and the cleavage site indicated by the arrow Disconnection occurs at.
  • the hammerhead ribozyme (HHR)-RNA construct includes, for example, a construct of HHR and FLNA (actin binding protein 280), and a construct of HHR and ApoB (Apolipoprotein B: apolipoprotein B). Etc.
  • HHRz FLNA01 HHRz FLNA01
  • the hammerhead ribozyme kit (HHR) kit can be added directly, or can be complexed with a cationic lipid, encapsulated in a liposome, or otherwise delivered to target cells.
  • the hammerhead ribozyme or complex thereof of the present invention is incorporated into biopolymers with or without incorporation, ex vivo, or locally in vivo by injection, infusion pump or stent. Can be administered.
  • the HHR of the present invention can be expressed in a cell from either an inducible or endogenous promoter since it can be expressed from a DNA or RNA vector delivered to the cell.
  • recombinant vectors are preferably DNA plasmids, adenoviruses, retroviruses or adeno-associated virus vectors.
  • Other mammalian cell vectors that direct the expression of RNA can also be used for this purpose.
  • Such recombinant vectors can be delivered locally as described above, and the delivered HHR cleaves the target mRNA as soon as it is expressed.
  • the composition of the liposome is usually preferably a combination of steroids, particularly phospholipids combined with cholesterol, particularly a combination of high phase transition temperature phospholipids.
  • the physical properties of liposomes depend on pH, ionic strength and the presence of divalent cations.
  • the constructs of the invention can also be delivered as naked gene expression vectors. This means that the construct of the present invention is not associated with a delivery vehicle (eg, liposomes or colloidal particles).
  • a delivery vehicle eg, liposomes or colloidal particles.
  • One of the major benefits expected with naked vectors is that there is no immune response stimulated by the vector itself.
  • the present invention is applicable to gene therapy for treating diseases.
  • a therapeutic method can exert a therapeutic effect by introducing an appropriate ribozyme that specifically cleaves mRNA into a target cell having the above-mentioned disease.
  • Ribozymes can be delivered using recombinant expression vectors such as chimeric viruses or colloidal dispersion systems.
  • the gene therapy method according to the present invention can be carried out in vivo or ex vivo according to a conventional method.
  • virus vectors that can be used include RNA viruses such as adenovirus, herpes virus, vaccinia, and retrovirus.
  • retroviral vector examples of the retroviral vector are those derived from mouse or avian retrovirus.
  • retroviral vectors that can insert a single foreign gene include, for example, Moloney murine leukemia virus (MoMuLV), Harvey murine sarcoma virus (HaMuSV), mouse mammary tumor virus (MuMTV), and Lewis sarcoma virus (RSV) .
  • MoMuLV Moloney murine leukemia virus
  • HaMuSV Harvey murine sarcoma virus
  • MuMTV mouse mammary tumor virus
  • RSV Lewis sarcoma virus
  • HHRH HTR2C
  • HTR2C ribozyme with A-to-I editing-specific cleavage activity
  • HR-HTR2C HHRH
  • HTR2C RNA for cleaving C at the 5 'position. It was designed according to a common method to include 16 complementary bases (FIG. 18A).
  • the core sequence having catalytic activity (Helix II) used in this example is as shown below.
  • 5′-CUGANcGAGGCC GAAAGGCCGAA-3 ′ This sequence is a consensus sequence (5′-CUGANGA ---- GAA-3 ′) And 4 base pair (bp) GCGC duplex and stem loop structure including GAAA tetraloop (Scott, WG, et al. 1995. Cell 81 (7): 991-1002). Since the sequence context of the target cleavage site (GU A triplet) in this structure is selected based on the above triplet rule, HHR is expected to show cleavage activity against HTR2C RNA.
  • the modified recognition base forms a UA base pair (A is a modified site) at the C site.
  • An edit-specific ribozyme is constructed by converting the recognition base U to C so that cleavage activity is produced only when A at the C site is replaced with I by A-to-I RNA editing (FIG. 18A). ).
  • Inosine forms base pairs with cytosine, which is identical to GC base pairs.
  • the resulting ribozyme acquires the ability to identify target RNA modification sites by base pair recognition. Therefore, it is expected that the cleavage ability of this ribozyme against editing HTR2C (HR-HTR2C-edit) is higher than that of non-editing HTR2C.
  • HHSeq_F_EcoRI (26mer) 5'-C GGAATTC TAATACGACTCACTATAG-3 '
  • HHSeq_R_BamHI (25mer) 5'-GCG GGATCC GGTATGTAGCAATACG-3 '
  • the modified RNA was obtained from Hokkaido System Science. 5 'terminal biotin S (27nt) 5'-CAUUACGUAAUCCUAUUGAGCAUAGCC-3 ' S C-ino (41nt) 5'-GGAUCGGUAUGUAGCAAUACGUAIUCCUAUUGAGCAUAGCC-3 '
  • the design (control) of the ribozyme 1 (HRz1E and HRz2E) ⁇ that cleaves the E site on HTR2C mRNA is such that the sequence around the cleavage site conforms to the 5'-Nn'HH'-3 'rule (triplet rule).
  • E-site-cleaving ribozymes (HRz1E and HRz2E) were designed by shifting the cleavage site of HRz2C by 1 base to the 5 ′ side.
  • ribozyme HRz1C, HRz2C, HRz1E and HRz2E
  • substrate RNA substrate RNA
  • S1, S2, S3, S4 and S5 target sequence
  • ribozymes HRz1C and HRz2C
  • the target recognition region was converted to a sequence complementary to the sequence of HTR2C mRNA so that the C site on HTR2C mRNA was a cleavage site. Since it has already been reported that the number of stems in the active region affects the cleavage activity, a ribozyme with one stem (HRz1C: 35 nt) and a ribozyme with four stems (HRz2C: 41 nt) are designed. did. However, these two types of ribozymes have low activity because the sequence around the cleavage site is (5'-UAA-3 ') and does not apply to the 5'-N'HH'-3' rule (triplet rule). It was predicted.
  • the base group in the left frame indicates Helix I (5'-recognition region)
  • the underlined base group indicates the stem region
  • the base group Helix III (3'-recognition region) in the right frame The same applies to the following.
  • Ribozymes (HRz1E and HRz2E) can also be designed and synthesized in substantially the same manner as ribozymes (HRz1C and HRz2C).
  • the following composition was heated at 98 ° C. for 5 minutes and then cooled to 25 ° C. over 1 hour for annealing.
  • RNA ribozyme
  • RNA sample was analyzed for purity using a denaturing gel. As a result, HRz1C was 38.8 ⁇ M, HRz2C was 35.8 ⁇ M, HRz1E was 17.0 ⁇ M, and HRz2E was 8.91 ⁇ M.
  • Fig. 4 is an electrophoretic diagram after the T7 promoter reaction of each ribozyme (HRz1C, HRz2C, HRz1E, HRz2E and substrate RNA (S).
  • Fig. 5 (A) and (B) are each ribozyme and substrate RNA (S ) And S5 after PAGE purification.
  • HRz1C (35nt), HRz2C (41nt), HRz1E (35nt), HRz2E (41nt) and the target sequence (S (35nt)) constructed above were heated at 80 ° C for 3 minutes and then removed to 25 ° C over 15 minutes. After cooling and annealing, a cleavage reaction was performed by adding 20 mM MgCl 2 (4 ⁇ l) to an annealing sample (36 ⁇ l) having the following composition and incubating at 37 ° C.
  • the reaction solution was sampled (4 ⁇ l and 8 ⁇ l each) at each time (0, 1, 2, 24 hours), and the sampled reaction solution was dissolved in 90% formamide after purification by ethanol precipitation, and a denaturing gel (6M).
  • the cleavage band was analyzed by electrophoresis using Urea 15% polyacrylamide gel. Electrophoresis photographs were taken with a scanner, and the cleavage rate was calculated using image analysis software Image J.
  • FIG. 6A and FIG. 6B are electropherograms showing evaluation of activity over time (EtBr staining) of each ribozyme and target RNA sequence (S).
  • H1 represents HRz1
  • H2 represents HRz2.
  • H1 represents HRz1C
  • H2 represents HRz2C.
  • the number represents time (h).
  • FIG. 7 is a bar graph showing the analysis results of the cut band by Image J, (A) shows the ratio of the cut band of HRz1E vs HRz1C, and (B) shows the ratio of the cut band of HRz2E vs HRz2C.
  • the cleavage band of the target sequence was confirmed in all samples, but it was revealed that the control sequence cleaves the target sequence in a shorter time than HRz1 and HRz2. This is the expected result that it is difficult to construct a highly active ribozyme against the 5'-UAA-3 'sequence by molecular design alone.
  • the cleavage activity was evaluated using an RI label.
  • Samples purified by ethanol precipitation as described above were dissolved in 80% formamide and electrophoresed using a denaturing (8M urea, 15% polyacrylamide gel) gel.
  • the target band was cut out, the gel was finely crushed with the tip of a pipette tip, 300 ⁇ l of TE buffer was added, and the mixture was stirred for 1 hour using a rotator. Centrifugation was performed at 15,000 rpm for 5 minutes, RNA was extracted from the gel, and then purified by ethanol precipitation.
  • the purified sample was dissolved in 20 ⁇ l of TE to prepare substrate S radiolabeled at the 5 ′ end.
  • the cleavage activity of the ribozyme obtained above was evaluated by the following method. To 2 ⁇ M ribozyme (10 ⁇ l), add 10 ⁇ cleavage buffer (2 ⁇ l), isotope-labeled substrate S (1 ⁇ l), H 2 O (5 ⁇ l), and heat at 80 ° C. for 3 minutes using a block incubator. after performs cooling and annealing reaction at room temperature for 10 minutes, the reaction was initiated by addition of 20 mM MgCl 2. Then, the cleavage reaction was performed by incubating at 37 ° C.
  • FIG. 8 is a diagram showing the change over time of the cleavage activity (RI label) of each ribozyme.
  • FIG. 9 is a bar graph showing the results of calculating the cleavage rate for each ribozyme cleavage activity (RI label) in FIG. 8 over time.
  • RNA molecules having a target function were selected by the following procedure. (1) Selection of RNA molecules from RNA libraries under specific conditions (such as binding to target molecules or showing activity). (2) The RNA molecule selected in (1) is converted to DNA by reverse transcription. Addition and amplification of T7 promoter sequence by PCR. (3) Transcription to RNA by T7 RNA polymerase. By repeating the operations (1) to (3), an RNA molecule having a function of cleaving the C site on HTR2C mRNA was obtained.
  • the basic skeleton used was a hammerhead ribozyme (Martick, M .; Scott, W. G. Cell 2006, 126, 309-20) derived from Schistosoma mansoni.
  • the selection method was designed with reference to literature (Persson, T., et. Al. Chembiochem 2002, 3, 1066-71).
  • composition is as shown below (H1 and H2 have the same composition).
  • the libraries H1 and H2 obtained above were selected.
  • the libraries H1 and H2 and the target RNA biotinylated at the 5 ′ end were respectively annealed.
  • the magnetic bead (Dynabeads M-280 streptavidin: DYNAL) washed with a washing buffer (10 mM HEPES, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl) and the annealed sample are mixed, and incubated at room temperature for 20 minutes.
  • a streptavidin binding reaction was performed (1 Round: 300 ⁇ l; 2-8 Round: 50 ⁇ l).
  • a cleavage buffer 50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 20 mM MgCl 2 ) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to activate the ribozyme.
  • the active molecule cleaves the target RNA and dissociates from the magnetic beads.
  • the solution was purified by ethanol precipitation, dissolved in 6 ⁇ l of TE, and converted to cDNA by reverse transcription reaction.
  • a selection sample (3 ⁇ l) and 20 ⁇ selection H (RT) (9.5 ⁇ l) were heated at 80 ° C. for 15 minutes, left at 25 ° C. for 1 minute, and then cooled at 4 ° C. and annealed.
  • the annealed sample (12.5 ⁇ l) ⁇ thus obtained was mixed with 5 buffer (4 l) 10 mM dNTP (2 l) AMV RTase (1.5) ⁇ , heated at 42 ° C for 15 minutes, and then heated at 99 ° C for 5 minutes. After that, it was cooled to 4 ° C. to carry out a reverse transcription reaction.
  • PCR was carried out using the following composition as a cycle of heating at 95 ° C. for 15 seconds, heating at 55 ° C. for 30 seconds, and then heating at 68 ° C. for 30 seconds.
  • a cycle check was performed under the same conditions as the PCR. In the first to third rounds, the cycle check was sampled every 5 cycles up to 10 to 35 cycles, and in the 4th to 8th rounds, sampling was performed every 4 cycles up to 8 to 24 cycles.
  • FIG. 11A and FIG. 11B are electropherograms showing the results of the round 1 cycle check, respectively.
  • the left half shows library H1
  • the right half shows library H2.
  • the amplified sample is purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, dissolved in 10 ⁇ l of TE, and 5 ⁇ l of template DNA in 10 ⁇ l is used for the next round by in vitro transcription reaction (heating at 37 ° C. for 3 hours).
  • the RNA library to be used was synthesized.
  • RNA molecule sequence analysis was performed (Fig. 12: Library H1 on the left half and Library H1 on the right half) Library H2 is shown). The result of sequence analysis of library H1 is as shown in FIG. 13, and the result of sequence analysis of library H2 is as shown in FIG.
  • library H1 had a fragment with 10/16 shorter than the basic skeleton.
  • ribozymes were obtained that were shifted by one base from the C site so that the sequence of the cleavage site obeyed the 5'-N'HH'-3 'rule.
  • library H2 since the convergence of molecular species was not so much observed, in-vitro selection was performed continuously, and a decrease in the number of PCR cycles after the reverse transcription reaction was confirmed in 12 rounds, so that sequence analysis was performed again. The result of rearrangement analysis is shown in FIG.
  • RNA library (2H1) in which the sequence (5'-CUGA-3 '), which is essential for the cleavage activity in the active region, is fixed and the others are diversified so that only the ribozyme that cleaves the C site can be selected. As well as 2H2).
  • the product was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and dissolved in 20 ⁇ l of TE.
  • pBluescript (0.245 ⁇ g / ⁇ l) was treated with a restriction enzyme by treating with BamHI and EcoRI at 37 ° C. for 2 hours. After the treatment, purification was performed by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. After the treatment, the result of concentration quantification by Nanoview was 0.041 ⁇ g / ⁇ l.
  • PCR In PCR, after 30 cycles of heat treatment at 95 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 30 seconds, 1% agarose electrophoresis was performed to determine whether the target amplification product was obtained. confirmed. 18 samples of DNA libraries H1 and H2 were selected and subjected to sequence PCR.
  • HRzC-ino a ribozyme that identifies A-to-I editing at the C site on HTR2C mRNA was designed.
  • HRz2E is the basic skeleton, and C-site adenosine is recognized by forming a base pair with uridine present in the target recognition region of HRzC. Therefore, by utilizing the fact that inosine forms a base pair with cytosine, and replacing the uridine that base-pairs with the C site with cytosine, the ribozyme HRzC-, which shows cleavage activity only when the C site is edited A to I, designed ino.
  • the activity of ribozyme HRzC-ino obtained above was evaluated (RI labeling).
  • S C-ino in which the C sites of the substrates S and S are inosine (I) was used, and the cleavage activity against each target RNA was compared (Fig. 17).
  • the target RNA 5 'end labeling method and activity evaluation method were performed in the same manner as described above. *
  • the in vitro trans-cleaving activity and specificity of A-to-I editing-specific ribozymes against HTR2C RNA fragments were examined.
  • an in vitro assay was performed using a synthetic HTR2C RNA fragment containing a C site.
  • two forms of 32 P-labeled HTR2C mRNA fragment 37 nucleotides
  • one with base A at the C site as an unedited substrate HTR2C-ade
  • Two formats were used, one with base I at the C site (FIG. 18A).
  • Substrate RNA was transcribed in vitro and annealed in the presence of gel purified excess amounts of HR-HTR2C and HR-HTR2C-edit ribozymes.
  • the cleavage reaction was initiated by adding 20 mM MgCl 2 at 37 ° C. After 1 hour, the cleavage band was analyzed using gel electrophoresis, and the cleavage rate was calculated (FIGS. 18B and 18C). In the case of HR-HTR2C, similar cleavage rates were observed for HTR2C-ade and HTR2C-ino (0.69 and 0.59).
  • FIG. 19A shows the time course of cleavage products obtained from the reaction of HR-HTR2C-edit on HTR2C-ade (upper part of FIG. 19A) and HTR2C-ino (lower part of FIG. 19A).
  • the kinetic analysis results of HR-HTR2C-edit are high k cat value (0.67 ⁇ 0.011 min -1 ) when using HTR2C-ino, and low k cat (0.01 ⁇ 0.001 min -1 when using HTR2C-ade. ) Values (FIG. 19B, Table 3).
  • HR-HTR2C is cut k cat values for both edited and non-edited substrate (0.05 ⁇ 0.001 min -1, 0.44 ⁇ 0.022 min -1) showed catalytic activity.
  • the difference in k cat values for this ribozyme was less than that for HR-HTR2C-edit.
  • the product fraction at the end of the reaction (F ⁇ ) is similar when the combination of recognition base and modification site is UA (0.74), UI (0.63), CI (0.85), CA showed a significantly lower value (0.23).
  • C-to-U editing-specific cleavage of APOB RNA using a ribozyme was examined.
  • C-to-U editing specific ribozymes were constructed by changing the recognition base.
  • C-to-U editing-specific ribozyme is based on APOB mRNA, where C-to-U editing of base C at position 6666 converts the glutamine codon (CAA) into an in-frame stop codon. Designed as a target for mRNA.
  • HHR was constructed to cleave the 5 'C-to-U modification site on APOB mRNA using the same catalytically active core sequence.
  • C-to-U editing specific ribozyme (HR-APOB-edit) introduces base A into the recognition nucleotide to form a base pair with base U from C-to-U editing of APOB RNA.
  • HR-APOB-edit introduces base A into the recognition nucleotide to form a base pair with base U from C-to-U editing of APOB RNA.
  • the cleavage activity of HR-APOB-edit against non-editing substrate (APOB-cyt) and editing substrate (APOB-uri) was analyzed by in vitro cleavage assay (FIG. 20B). As shown in FIG.
  • the ribozyme for editing-specific cleavage of FLNA mRNA was designed using the method described above, and the cleavage activity and editing specificity of HR-FLNA-edit used synthetic FLNA RNA fragments. Analyzed by in vitro cleavage assay ( Figure 22). The cleavage rate constant and fraction of the product at the end point of HR-FLNA-edit for the edited FLNA RNA fragment was much larger than that of the unedited FLNA RNA fragment ( Figure 22, Table 3). These results were similar to those observed for HR-HTR2C-edit.
  • edited FLNA mRNA was prepared from HEK293 cells overexpressing ADAR2.
  • the inventor has already established Tet-ADAR2 cells that can be stably transfected with an ADAR2 expression vector containing a doxycycline (Dox) inducible expression system.
  • Total RNA containing a mixture of edited and unedited FLNA mRNA could be obtained from Tet-ADAR2 cells cultured with any concentration of Dox. If ribozyme specifically cleaves edited FLNA mRNA in the total RNA extracted, the ratio of edited FLNA mRNA to unedited FLNA mRNA should decrease.
  • Dox doxycycline
  • FIG. 23A An experimental scheme for quantifying the editing rate is shown in FIG. 23A.
  • 150 ng of extracted RNA was annealed with an excessive amount of HR-FLNA-edit (final concentration: 2.5 ⁇ M), and a cleavage reaction was performed in a buffer containing MgCl 2 20 mM.
  • RNA samples are subjected to RT-PCR using FLNA-specific primers, and PCR fragments are directly sequenced using the fluorescent dideoxy sequencing method. (FIG. 23A).
  • the ribozyme recognition base is designed to form a base pair only with the modified base of the target RNA.
  • RNA editing-specific cleavage Ribozymes designed for A-to-I editing-specific cleavage were more than 10 times more catalytically active against editing HTR2C and editing FLNA RNA fragments than against non-editing RNA.
  • ribozymes for C-to-U editing of APOB RNA were found to have very high catalytic activity against the edited APOB RNA fragment.
  • Converting the ribozyme recognition base as in the present invention is useful for designing editing-specific and mutation-specific cleavage, even if its cleavage activity is limited by the triplet rule.
  • the cleavage sites of all the target RNAs exemplified were selected so as to match the triplet rule that retains the ribozyme cleavage activity. Since HHR has N'HH 'cleavage specificity, the present invention cannot be applied when G is present in the nucleotide at the 5'-side 1 base or 2 bases upstream of the target sequence mutation site. For the same reason, not all combinations of mutations can be identified using the mutant recognition method by HHR applying the N'HH 'specificity.
  • the ribozyme is designed based on the strategy adopted in the present invention and considering which base is the target mutation site or exists in the context of the surrounding sequence, substitution of almost any nucleotide can be achieved. It can be specifically recognized by an artificial ribozyme. Thus, if the target mutation specificity increases, the possibility that the ribozyme can be applied to mutation or substitution editing that selectively suppresses gene expression can be increased.
  • the present invention shows that editing-specific cleavage by ribozymes can be applied not only to short RNA fragments but also to physiological mRNAs in vitro.
  • the effectiveness of editing-specific cleavage of cell-derived target mRNA was evaluated as a change in editing rate using the peak height of the modified site based on the DNA sequencing chromatogram.
  • This method analyzed edit-specific cleavage of HR-FLNA-edit and required quantification of the total amount of FLNA mRNA, but roughly estimated that 51% of FLNA mRNA was HR in the 24-hour reaction. -Disconnected by FLNA-edit.
  • the present invention utilizes the minimal hammerhead liposome (HHR) framework to design ribozymes for target RNA cleavage based on A-to-I and C-to-U RNA substitution editing.
  • HHR minimal hammerhead liposome
  • the basic framework for designing the ribozyme of the present invention is to convert the recognition base of the ribozyme to produce a ribozyme exhibiting high specific cleavage activity for both synthetic editing RNA fragments and physiological mRNAs.
  • the strategy of the present invention is not limited to RNA substitution editing, but by selecting specific combinations of recognition bases and target bases, substitution of bases, including other types of mutations, such as mutations such as SNPs, It can be widely applied to modifications such as deletion and addition. Therefore, the present invention is expected to be useful not only for diseases caused by RNA editing and the like, but also for research and development of new drugs that contribute to the prevention and treatment of diseases caused by other types of modifications such as mutations.

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Abstract

本発明に係るハンマーヘッド型リボザイムは、編集を受けた標的ＲＮＡと塩基対合することによりハンマーヘッド型リボザイム－標的ＲＮＡ構築物を生成するとともに、ハンマーヘッド型リボザイムの編集認識部位が、標的ＲＮＡの修飾部位と塩基対を形成することにより、修飾部位を開裂させる。この修飾部位の開裂により、編集標的ＲＮＡに起因する疾患の予防または治療に利用できる新規な薬剤の研究・開発に供することができることが期待される。

Description

RNA配列上の修飾を識別するリボザイムおよびそれを用いたRNA開裂方法
　本件出願は、２０１１年５月２０日に出願された米国仮出願第６１／４８８，３４５号に基づく優先権を主張している。本発明は、RNA配列上の修飾を識別するリボザイムおよびそれを用いたRNA開裂方法に関するものである。更に詳細には、本発明は、RNA配列上のRNA編集などによる修飾を識別するハンマーヘッド型リボザイムおよびそれを用いたRNA開裂方法に関するものである。
　生体内のRNAは化学修飾を受けることが知られており、rRNAやtRNAのようなnoncoding RNAは、修飾を受けることにより機能化する。一方、mRNAも修飾を受け、例えば、mRNAのヌクレオチドがアデノシン（A）からイノシン（I）に置換されるA-to-I編集や、シトシン(C)からウラシル(U)に置換されるC-to-U編集などのRNA編集などの修飾などが知られている。
　このうち、RNA編集は、転写後の遺伝情報を変換する機構であり、遺伝子からの転写により生じたmRNA前駆体の塩基配列のうち、特定部位の塩基が酵素の作用により他の塩基に改変される現象であり、塩基挿入、欠失、置換などのような様々な形で現れる（非特許文献１）。この現象は、一般に、生理学的条件や環境の変化に応じて遺伝子産物を変化させるために、生体にプログラムされた機構である。高等真核生物においては、アデノシンデアミナーゼ (ADAR) の作用によるmRNA前駆体の特定部位のアデノシン（A）塩基からイノシン（I）塩基への塩基置換が起こるA-to-I編集が生理学的に重要な意義を持つとされている（非特許文献２）。タンパク質をコードするmRNA配列においてA-to-I塩基置換が起これば、そのイノシン（I）は、翻訳中にリボソームによってグアノシンに解読されることから、コドンが変化し、それにより遺伝情報が変換され、本来とは異なる機能を持つタンパク質を生じることになる。
　コーディングRNAにおけるA-to-I編集について最も研究されているRNA前駆体としては、セロトニン2C型受容体（HTR2CR）とグルタミン酸受容体Bサブユニット (GRIA2) があげられる（非特許文献３）。
　セロトニン2C型受容体（HTR2CR）は、セロトニンによる脳内神経情報伝達を仲介する7回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体であって、情動制御に深く関与していると考えられており、二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）により、HTR2C mRNA前駆体上のAからE部位の5か所のアデノシン（A）が、イノシン（I）に置換されるRNA編集（A-to-I編集）を受けることが知られている（非特許文献４、図１）。
　健常人においても、HTR2CR mRNAのA部位からE部位のアデノシン（A）塩基が、A -to -I編集により、酵素ADAR1およびADAR2の触媒作用により、イノシン（I）塩基にそれぞれ適当な頻度で改変されている。その結果、健常人においては、正常な情動制御がなされているのに対し、うつ病患者や自殺者では、その調節が破綻しているとの報告がなされている。うつ病、統合失調症、自閉症などの機能性精神疾患にセロトニン2C型受容体（HTR2CR）におけるRNA編集の異常が関与していると考えられるが、その正常な調節を支配する機構は未だ明らかになっていない。
　セロトニン2C型受容体（HTR2CR）は、セロトニンがHTR2CRの細胞外ループに結合すると、その刺激を共役したＧタンパク質に伝達し、次いで、細胞内シグナル伝達経路を介して神経細胞の性状変化を引き起こし、最終的に記憶・学習・情動などの脳機能を制御している。セロトニン2C型受容体（HTR2CR）がRNA編集を受けると、受容体タンパク質のＧタンパク質結合領域のアミノ酸配列が変化し、受容体のシグナル伝達能力が変化することになる。HTR2CRにおいては、図２に示すように、HTR2CRの塩基配列およびコードされるアミノ酸のうち、RNA編集を受けた部位（図中では白抜きで示している）を組み合わせると、単一の遺伝子からアミノ酸配列および伝達機能が異なる最大２４種（主に８種）の受容体タンパク質が生じる（非特許文献４、５、図２）。
　また、グルタミン酸受容体Bサブユニット (GRIA2) のmRNA前駆体においては、RNA編集によって受容体の脱感作動態とイオンチャンネルのCa2++透過能が制御されている（非特許文献６）。
　RNA置換修飾の別の形式としては、シトシン（C）がウラシル（U）へ塩基置換され、脱アミノ化によりシトシンがウリジンに変換されるC-to-U編集が知られている（非特許文献７）。腸アポリポタンパクB (ApoB) をコードする核転写体は、C-to-U RNA編集を受けて、CAAコドンがUAAストップコドンに変換し、編集前よりも短いタンパク質を生成するとの報告がある（非特許文献８）。
　上述したように、A-to-I編集およびC-to-U編集などのRNA編集は、非編集の場合に生成するタンパク質とは異なるタンパク質が生成することにより、遺伝適応性を制御するための重要な機構に関係している。コーディング領域中でのRNA置換修飾は、生物学的プロセスの制御において決定的な役割を果たしているので、異常な修飾が発生すると由々しい疾病の原因になり（非特許文献９）、特にRNA置換修飾の統合失調症、双極性障害、大うつ病などの精神疾患への関わりが注目されている。
　最近、セロトニン2C型受容体（HTR2C）とグルタミン酸受容体Bサブユニット (GRIA2) のRNA前駆体の他に、特に、γ－アミノ酪酸（GABA）受容体や、カリウムチャンネルなどの中枢神経系の精神神経機能に深く関与している受容体、イオンチャンネルや別のタンパク質のタンパク質をコードする配列中に、別のRNA編集の標的が同定された（非特許文献１０）。高スループットシークエンスデータは、RNA置換編集が、アミノ酸配列を変換してタンパク質の機能を制御していることを示唆しているけれども、このRNA編集の詳細な生物学的機能は未だ明らかではない。
　このようにRNA編集の詳細な生物学的機能が未だ明らかではないとしても、部位特異的RNA置換編集を制御する技術は、RNA編集に関連する生物学的プロセスを分析・制御するための魅力的なツールであることには変わりはない。
　一方、RNA配列上の修飾を受けた特定部位を特異的に認識し、反応する機能性分子として、リボザイムが知られている。かかるリボザイムのうち、触媒作用を有する最小のRNAモチーフであるハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、特定部位のRNAホスホジエステル結合を切断でき、トランス型を切断する最小のハンマーヘッド型リボザイム (HHR) が、天然のHHRを修飾して作成され（非特許文献１１）、RNAを媒介した遺伝子制御によりin vivoでの標的遺伝子発現を抑制するために利用された（非特許文献１２）。HHRは、中央部の保存された触媒活性を有するコア配列からなる活性領域 (Helix II) と、その活性領域の3’側および5’側に存在する標的配列を認識する２個のハイブリッド形成アーム配列からなる認識領域 (それぞれHelix IIIおよびHelix I) からなっている。
　標的特異的ハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、標的RNAに対する上記ハイブリッド形成アーム配列を単純なワトソン－クリック塩基対合ルールに従って変換させることによって作製することができる。また、標的RNAに対して様々に異なるコア配列を有するHHRが設計でき、標的RNAの特定のトリプレットを挟むハイブリッド形成配列と相補関係にある配列を使用することによって、標的RNAに結合でき、該トリプレットの3’側に存在するホスホジエステル結合を切断することができる（非特許文献１３）。
　かかるハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、in vitroならびに in vivoで変異特異的にmRNAを切断することができる（非特許文献１４）。HHRのこれらの変異特異的な性質は、優先的に切断されるトリプレットに基づいて発生する。このように標的RNAを変異特異的に切断できるHHRがいくつか作成されているが、RNA置換修飾を特異的に認識できるHHRは報告されていない。
 
Maas, S. and Rich, A.2000. Changing genetic information through RNA editing. Bioessays 22(9): 790-802；Bass, B.L. 2002. RNAediting by adenosine deaminases that act on RNA. Annu RevBiochem 71: 817-846；Farajollahi, S. and Maas, S. 2010. Molecular diversity through RNAediting: a balancing act. Trends Genet 26(5): 221-230；Nishikura, K. 2010. Functionsand regulation of RNA editing by ADAR deaminases. Annu Rev Biochem 79: 321-349. Nishikura, K. 2010.Functions and regulation of RNA editing by ADAR deaminases. Annu RevBiochem 79: 321-349；Pullirsch, D. and Jantsch, M.F. 2010. Proteomediversification by adenosine to inosine RNA editing. RNA Biol 7(2): 205-212. Burns, C.M., Chu, H.,Rueter, S.M., Hutchinson, L.K., Canton, H., Sanders-Bush, E., andEmeson, R.B. 1997. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling byRNA editing. Nature 387(6630): 303-308；Sommer, B., Kohler,M., Sprengel, R., andSeeburg, P.H. 1991. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow inglutamate-gated channels. Cell 67(1): 11-19 Werry, T.D.,Loiacono, R., Sexton, P.M., and Christopoulos, A. 2008. RNA editing of theserotonin 5HT2C receptor and its effects on cell signalling, pharmacology andbrain function. Pharmacol Ther 119(1): 7-23. 寺田成之他、福岡大学理学集報　40（1）１１６－１２３ (2010) Higuchi, M., Single, F.N., Kohler, M., Sommer, B., Sprengel,R., and Seeburg, P.H. 1993.RNA editing of AMPA receptor subunit GluR-B: a base-paired intron-exon structuredetermines position and efficiency. Cell 75(7): 1361-1370. Blanc, V. and Davidson,N.O. 2003. C-to-U RNA editing: mechanisms leading to geneticdiversity. J Biol Chem 278(3): 1395-1398. Wang, A.B., Liu,D.P., and Liang, C.C. 2003. Regulation of humanapolipoprotein B geneexpression at multiple levels. Exp Cell Res 290(1): 1-12. Maas, S., Kawahara,Y., Tamburro, K.M., and Nishikura, K. 2006. A-    to-I RNA editing and human disease. RNA Biol 3(1): 1-9. Levanon, E.Y., Hallegger, M., Kinar, Y., Shemesh, R.,Djinovic-Carugo, K., Rechavi, G., Jantsch, M.F., and Eisenberg, E. 2005.Evolutionarily conserved human targets of adenosineto inosine RNA editing. Nucleic Acids Res 33(4): 1162-1168；Gommans, W.M.,Tatalias, N.E., Sie, C.P., Dupuis, D., Vendetti, N., Smith, L., Kaushal, R., and Maas, S.2008. Screening of human SNP database identifies recoding sites of A-to-I RNA editing.RNA 14(10): 2074-2085；Li, J.B., Levanon, E.Y., Yoon, J.K., Aach, J., Xie, B., Leproust,E., Zhang, K., Gao, Y., and Church, G.M. 2009. Genome-wide identification ofhuman RNA editing sites by parallel DNA capturing and sequencing. Science 324(5931):1210-1213；Pullirsch, D. and Jantsch, M.F. 2010. Proteome diversification byadenosine to inosine RNA editing. RNA Biol 7(2): 205-212. Uhlenbeck, O.C. 1987.A small catalytic oligoribonucleotide. Nature 328(6131): 596-600；Haseloff, J. andGerlach, W.L. 1988. Simple RNA enzymes with new and highly specificendoribonuclease activities. Nature 334(6183): 585-591. Goodchild, J. 2002. Hammerhead ribozymes for targetvalidation. Expert Opin TherTargets 6(2): 235-247；Citti, L. and Rainaldi, G. 2005. Synthetic hammerhead ribozymesas therapeutic tools to control disease genes. Curr Gene Ther 5(1): 11-24；Tedeschi, L., Lande,C., Cecchettini, A., and Citti, L. 2009. Hammerhead ribozymes intherapeutic target discovery and validation. Drug Discov Today 14(15-16): 776-783. Kore, A.R., Vaish,N.K., Kutzke, U., and Eckstein, F. 1998. Sequence specificity of thehammerhead ribozyme revisited; the NHH rule. Nucleic Acids Res 26(18): 4116-4120 Scherr, M., Grez, M., Ganser, A., and Engels, J.W. 1997.Specific hammerheadribozyme-mediated cleavage of mutant N-ras mRNA in vitro and ex vivo. Oligoribonucleotidesas therapeutic agents. J Biol Chem 272(22): 14304-14313；Lewin, A.S., Drenser, K.A.,Hauswirth, W.W., Nishikawa, S., Yasumura, D., Flannery, J.G., and LaVail, M.M. 1998.Ribozyme rescue of photoreceptor cells in a transgenic rat model of autosomal dominantretinitis pigmentosa. Nat Med 4(8): 967-971；Dawson, P.A. and Marini, J.C. 2000.Hammerhead ribozymes selectively suppress mutant type I collagen mRNA in osteogenesisimperfecta fibroblasts. Nucleic Acids Res 28(20): 4013-4020.
　そこで、本発明者らは、RNAの特定部位のホスホジエステル結合を切断する触媒作用を有するRNA分子であるハンマーヘッド型リボザイム（HHR）に着目して、そのRNA配列上の修飾を特異的に認識し、反応する機能性について鋭意研究した結果、ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）が、標的RNAの修飾部位を特異的に認識し、反応する機能性分子として作用することを見いだして、本発明を完成した。
　つまり、本発明に係るハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、RNA編集等の修飾部位を特異的に切断できるように、優先的に切断される標的RNAの３塩基（トリプレット）に対するHHRの標的特異性に基づいて設計した。
　本発明のハンマーヘッド型リボザイム (HHR) の作成に当たっては、トランス型に作用するHHRを変異特異的標的切断のツールとして利用した。しかし、HHRの切断活性は、優先的に切断される上記トリプレットばかりではなく、触媒活性を持つHHRのコア配列に近接する塩基対合によっても、有意に影響されることから、このHHR塩基を修飾認識塩基として利用することによって、RNA修飾に対する特異的リボザイムをHHR塩基の塩基対合に基づいて設計した。
　上記理論に基づいて設計したハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、図３中の構造式で表すことができる。なお、図３中の構造式において、黒色の太い実線で表した上段の分子は、ハンマーヘッド型リボザイムを表している。このハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、３個の領域、つまり、中央部に触媒活性を有するコア配列からなる活性領域（Helix II）と、その活性領域の5’側に位置して標的RNA（基質RNA）とハイブリダイズするアーム配列からなる5’側認識領域（Helix I）ならびに3’側に位置して標的RNA（基質RNA）とハイブリダイズするアーム配列からなる3’側認識領域（Helix III）とから構成されている。アーム配列からなる5’側認識領域（Helix I）ならびに3’側認識領域（Helix III）は、標的RNA（基質RNA）とハイブリダイズするように設計する。
　さらに、このハンマーヘッド型リボザイム (HHR) では、 3’側認識領域（Helix III）と活性領域（Helix II）とに挟まれた位置に塩基（D）を、また活性領域（Helix II）と5’側認識領域（Helix I）に挟まれた位置に塩基（X）を介在するように設計する。この塩基（D）は、標的RNA塩基と塩基対を形成して、標的RNA中の3’-NHH’-5’（ 図３中の構造式）で表されるトリプレットの塩基Hと対合することによって切断活性が出現する。一方、塩基（X）は、標的RNAの修飾部位（editing site）とだけ塩基対を形成するように設計されている。したがって、A-to-I編集特異的切断の場合には、シトシンが認識塩基として使用される。同様に、C-to-U編集特異的切断の場合には、グアノシンはアデノシンに変換されるので、認識塩基としてはアデノシンが使用される。当然のことながら、A-to-I編集やC-to-U編集以外のその他の修飾により標的RNAの塩基が別の塩基に変換された場合には、その変換された塩基に対応するようにHHRの認識塩基を設計することができることは言うまでもない。
　一方、図３中の構造式 において、黒色の実線で表した下段の分子は、標的RNA（基質RNA）を表している。この標的RNAは、HHRの5’側認識領域（Helix I）ならびに3’側認識領域（Helix III）にハイブリダイズしてそれぞれ塩基対を形成する。標的RNA（基質RNA）に修飾部位（ここでは、「edit」と表している）が存在すると、この修飾部位が、HHRの認識塩基とハイブリダイズして塩基対を形成するとともに、この修飾部位と、その修飾部位の3’側に隣接する塩基との結合が切断される。ここで、図３中の構造式 中、3’-NHH’-5’で表されるトリプレットは、切断活性が特に高い部位を示していて、HHRの触媒作用により優先的に切断される部位（Cleavage Site）である。なお、上記構造式においては、Nはいずれのヌクレオチドであってよく、またHはアデノシン（A）、シトシン（C）またはウラシル（U）を表している（Kore et al. 1998）。
　したがって、本発明は、標的 mRNA上におけるRNAの修飾、例えば、RNA編集（A-to-I編集やC-to-U編集等）などの修飾を識別するハンマーヘッド型リボザイム（HHR）を提供することを目的としている。
　また、本発明の別の目的は、ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）と標的RNA との塩基対合物であるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物を提供することである。
　さらに、本発明の別の目的は、ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）と標的RNA とを塩基対合させることにより、標的RNAの修飾を受けた特定の部位を切断することからなる標的RNAの開裂方法を提供することである。
　上記目的を達成するために、本発明は、上記のような修飾を受けた標的RNAを認識できるハンマーヘッド型リボザイムであって、一般式 [ I ] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
                             
（式中、Aはアデニン(A)を意味し;
Cはシトシン(C)を意味し;
Gはグアニン(G)を意味し;
Uはウラシル(U)を意味し;
Dは、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) を意味し; 
Xは、標的RNAの修飾部位を認識する修飾認識塩基であって、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) を意味し；
Nは、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
N’は、同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；
ａは、１～１０の整数、好ましくは２～６の整数、より好ましくは２～４の整数を意味し；
ｂは、１～６の整数、好ましくは２～４の整数を意味し；
ｃは、１～４の整数、好ましくは１～２の整数を意味し；
ｍは、２～５０の整数、好ましくは５～３０の整数、さらに好ましくは５～２０の整数を意味し；および
ｎは、２～５０の整数、好ましくは５～３０の整数、さらに好ましくは５～２０の整数を意味する）
で表されるハンマーヘッド型リボザイムを提供する。
　本発明の好ましい１つの形態としては、一般式 [Ia] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中、A、C、G、U、D、X、NおよびN’はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイムが提供される。
　本発明のさらに好ましい形態としては、一般式 [Ia] において、塩基Xがアデニン（A）またはシトシン（C）であるハンマーヘッド型リボザイムが提供される。
　一方、本発明のハンマーヘッド型リボザイム（HHR）が認識することができる標的RNAは、一般式 [II] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、N’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）において対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；　
Hは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記HHRにおいて対応する塩基Dと塩基対を形成する塩基を意味し；
H’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
Eは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）から選ばれるいずれかの塩基であるとともに、上記HHR [I] において対応する塩基Xと塩基対を形成する塩基であって、塩基Xと塩基対を形成したときに、5’側に隣接する塩基H’との結合を切断する塩基を意味し；
ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する）
で表わすことができる。
　したがって、本発明は、上記ハンマーヘッド型リボザイム と、上記標的RNA とが塩基対を形成して構築される一般式 [III] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有し、矢印は切断部位を示している。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物を提供する。
　本発明は、その好ましい１つの別の形態として、ハンマーヘッド型リボザイム [Ia] と標的RNA [II] とが塩基対合して構築される一般式 [IIIa] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物を提供する。
　本発明は、さらに好ましい形態として、一般式 [IIIa] において、前記塩基Ｅが塩基Iの場合、前記塩基Xは塩基Cであり、また前記塩基Ｅが塩基Uの場合、前記塩基Xは塩基Aであるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物を提供する。
　本発明は、さらに好ましい別の形態としては、一般式 [IIIa] において、前記塩基Eが塩基Iの場合、前記塩基Xは塩基Cであり、また前記塩基Eが塩基Uの場合、前記塩基Xは塩基Aであるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物を提供する。
　さらに、本発明は、上記HHRを用いて、上記構築物の上記標的RNA部分の切断部位を切断することからなるRNA修飾開裂方法を提供する。更に詳細には、本発明は、上記HHR を用いて、標的RNA 上に存在する修飾部位を、そのRNA修飾部位の5’側上流に隣接する結合部位を開裂することからなるRNA開裂方法を提供する。
　本発明に係るハンマーヘッド型リボザイム（HHR）は、標的RNAの切断部位の周辺配列であるトリプレット配列5’-N’HH’-3’ (式中、塩基N’がアデニン（A ）、ウラシル（U）、グアニン（G）またはシトシン（C）であり、塩基Hおよび塩基H’がA 、C またはUであるのがよい) に対して高い切断活性を示す。なお、塩基Hおよび塩基H’はいずれもグアニン（G）を表していないが、塩基Hおよび塩基H’がグアニン（G）である場合は、ほとんど切断活性がないと考えられるが、切断活性が生じる場合は、グアニン（G）であってもよい。また、上記トリプレット配列がNUCである場合も高い切断活性を有するとの報告もあるので、このトリプレット配列も当然本発明の範囲に包含されるものと言わざるを得ない。
セロトニン2C型受容体（HTR2C）上のRNA編集（A-to-I編集）を受ける部位を示す図。 セロトニン2C受容体の生理機能（Ａ）とそのRNA編集（Ｂ）を説明する図。 本発明のハンマーヘッド型リボザイム (HHR) の構造を示す概念図。 各リボザイムと基質RNA (S) の合成後の電気泳動図。 各リボザイム（HRz1C、HRz2C、HRz1EおよびHRz2E）と基質RNA (S) のPAGE精製後の電気泳動図。 基質RNA (S5) のPAGE精製後の電気泳動図。 各リボザイム（H1: HRz1およびH2: HRz2）と標的RNA配列 (S) の活性評価（EtBr染色）を示す電気泳動図。 各リボザイム（H1: HRz1CおよびH2: HRz2C）と標的RNA配列 (S) の活性評価（EtBr染色）を示す電気泳動図。 Image Jによる切断バンドの解析結果を示す図。 各リボザイムの切断活性（RIラベル）の経時変化を示す図。 図８における各リボザイムの切断活性（RIラベル）の経時毎の切断割合を算出した結果を示す棒グラフである。 ライブラリーH1およびH2の作成を確認した電気泳動図。 ラウンド１のサイクルチェックの結果を示す電気泳動図。 ラウンド１のサイクルチェックの結果を示す別の電気泳動図。 ラウンド８のサイクルチェックの結果を示す電気泳動図。 ライブラリーH1の配列解析結果を示す図。 ライブラリーH2の配列解析結果を示す図。 ライブラリーH2の再配列解析結果を示す図。 リボザイムHRzC-inoの合成後の確認電気泳動図。 リボザイムHRzC-inoの切断割合の算出結果を示す図。 HTR2C RNAフラグメントに対するリボザイムのA-to-I編集特異的切断を示す図。（Ａ）は、リボザイムと、HTR2C RNAフラグメントの塩基配列を示す図。（Ｂ）変性PAGE (15%)　を用いたリボザイムによるA-to-I編集特異的切断の分析結果を示す図。（Ｃ）HTR2C-adeおよび HTR2C-inoに対するHR-HTR2Cおよび HR-HTR2C-editに対する実験によって得られた切断率をまとめた図。 単独ターンオーバー条件下での編集ならびに非編集HTR2C RNAフラグメントに対するHR-HTR2Cおよび HR-HTR2C-editについての経時切断反応および動態分析結果を示す図。 APOB mRNAフラグメントに対するリボザイムのC-to-U編集特異的切断を示す図。（Ａ）は、リボザイムと、APOB mRNAフラグメントの塩基配列を示す図。（Ｂ）変性PAGE (15%)を用いたリボザイムによるHR-APOB-editのC-to-U編集特異的切断の分析結果を示す図。（Ｃ）非編集および編集APOB RNAフラグメントに対するHR-APOB-editについての経時切断反応および動態分析結果を示す図。 図２０において、単独ターンオーバー条件下での編集ならびに非編集APOB mRNAフラグメントに対するHR-APOBについての経時切断反応および動態分析結果を示す図。HR-APOB-ade（上段）およびHR-APOB-ino（下段）に対するHR-APOB-editの経時切断を示す変性PAGE (15%)を示す図。 FLNAmRNAに対するA-to-I編集特異的切断を示す図。（Ａ）は、リボザイムと、合成FLNA mRNAフラグメントの塩基配列を示す図。（Ｂ）は、変性PAGE (15%)　を用いたリボザイムによるA-to-I編集特異的切断の分析結果を示す図。（Ｃ）FLNA -adeおよび FLNA -inoに対するHR- FLNA および HR- FLNA -editに対する実験（Ｂ）によって得られた切断率をまとめた図。 細胞抽出FLNAmRNAに対するインビトロでのリボザイムのA-to-I編集特異的切断を示す図（Q/R部位での編集率を測定することによる細胞抽出FLNA mRNAに対するHR-FLNA-editの編集特異的切断分析のための実験手法を示した図）。 細胞抽出FLNAmRNAに対するインビトロでのリボザイムのA-to-I編集特異的切断を示す図（HR-FLNA-editの切断反応の有無による生成物のシークエンスクロマトグラフ図）。 リボザイムとの反応後のHR-FLNAフラグメントの編集率の定量結果を示す図。
　本発明に係るハンマーヘッド型リボザイムは、一般式 [ I ] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、Aはアデニン(A)を意味し;
Cはシトシン(C)を意味し;
Gはグアニン(G)を意味し;
Uはウラシル(U)を意味し;
Dは、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) を意味し; 
Xは、標的RNAの修飾部位を認識する修飾認識塩基であって、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
Nは、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
N’は、同一であっても、または異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；
ａは、１～１０の整数、好ましくは２～６の整数、より好ましくは２～４の整数を意味し；
ｂは、１～６の整数、好ましくは２～４の整数を意味し；
ｃは、１～４の整数、好ましくは１～２の整数を意味し；
ｍは、２～５０の整数、好ましくは５～３０の整数、さらに好ましくは５～２０の整数を意味し；および
ｎは、２～５０の整数、好ましくは５～３０の整数、さらに好ましくは５～２０の整数を意味する）
で表すことができる。
なお、本発明のハンマーヘッド型リボザイム のコア配列を有する活性領域 (Helix II) は、修飾を受けた標的RNAの修飾部位の切断活性を触媒する作用を有する領域であって、一般式 [IV]　:
           3’-AAGNaNbN’aAGNcAGUC-5’   [IV]
で表すこともできる。上記一般式 [IV] において、下線を施した塩基（A、C、GおよびU）は、標的RNA の修飾部位の切断に必要な切断触媒活性作用を及ぼす塩基配列（共通配列：consensus sequence）を表している。
本発明の好ましい１つの形態としてのハンマーヘッド型リボザイムは、一般式 [Ia] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式中、A、C、G、U、D、X、NおよびN’はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表わすことができる。
　一方、本発明のハンマーヘッド型リボザイムによって認識される標的RNAとしては、例えば、セロトニン2C型受容体（HTR2C）、グルタミン酸受容体、γ－アミノ酪酸（GABA）受容体、FLNA（filamin A, alpha [actin
binding protein 280]：アクチン結合タンパク質２８０)、アポリポタンパクB (ApoB) や、カリウムチャンネル等の中枢神経系の精神神経機能に深く関与している受容体やイオンチャンネル等のRNA前駆体などが挙げられる。
　これらの標的RNA は、一般式 [II] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　（式中、N’は、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）において対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；　
Hは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記HHR [I] において対応する塩基Dと塩基対を形成する塩基を意味し；
H’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
 Eは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記HHRにおいて対応する塩基Xと塩基対を形成する塩基であって、塩基Xと塩基対を形成したときに、5’側上流に隣接する塩基H’との結合を切断する塩基を意味し；
ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する）
で表わすことができる。
　標的RNAにおいて、塩基Eは、RNA編集や変異などの修飾を受けた塩基を意味し、例えば、A-to-I編集を受けた場合には、イノシン (I) を意味し、またC-to-U編集の場合には、ウラシル (U) を意味する。したがって、標的RNA [II] と塩基対を形成するハンマーヘッド型リボザイムの修飾認識塩基 (X) は、標的RNA [II] の塩基Eがイノシン (I) の場合には、シトシン(C) 、標的RNA [II] の塩基Eがウラシル (U) の場合には、アデニン(A) であるのがよい。
　さらに、上記一般式5’-N’HH’-3’で表される３塩基配列（トリプレット配列）は、標的RNAの切断部位の周辺配列であり、かつ、標的RNAの3’-側領域と5’-側領域に挟まれた塩基配列であって、標的RNAの切断部位に対して高い切断活性を示している。つまり、本発明のハンマーヘッド型リボザイム（HHR）は、このトリプレット配列5’-N’HH’-3’ (式中、塩基N’がアデニン（A ）、ウラシル（U）、グアニン（G）またはシトシン（C）であり、塩基Hおよび塩基H’がA 、C またはUであるのがよい) に対して高い切断活性を示す。なお、塩基Hおよび塩基H’はいずれもグアニン（G）を表していないが、塩基Hおよび塩基H’がグアニン（G）である場合は、切断活性がないか、またはほとんど切断活性がないと考えられる。しかし、グアニン（G）が切断活性が生じる場合があれば、塩基Hおよび塩基H’がーはいずれもグアニン（G）であってもよい。また、上記トリプレット配列がNUCである場合も高い切断活性を有するとの報告もあるので、このトリプレット配列も当然本発明の範囲に包含されるものである。
　つまり、標的RNA [II] は、RNA編集や変異などの修飾を受けると、その部位の塩基が本来の塩基とは異なる塩基に変換される。その結果、その修飾塩基は、リボザイムの修飾認識塩基とが塩基対を形成し、その結果、修飾塩基と、その5’-側上流に隣接する塩基との結合部位が切断される。
　したがって、本発明は、上記ハンマーヘッド型リボザイム と、標的RNA とを反応させて塩基対を形成して得られる一般式 [III] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有し、矢印は切断部位を示している。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物を提供する。
　このハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA 構築物において、HHRの修飾認識塩基（X）は、標的RNAの修飾部位（E）と塩基対を形成することにより、該修飾部位（E）の5’側上流に隣接する塩基（H’）との結合を切断する。つまり、標的RNAの塩基（E）は、例えば、A-to-I編集の場合には、イノシン（Ｉ）を意味し、またC-to-U編集の場合には、ウラシル（Ｕ）を意味する。したがって、A-to-I編集の場合には、修飾塩基（E）に対応するハンマーヘッド型リボザイムの修飾認識塩基（X）は、シトシン（Ｃ）になり、またC-to-U編集の場合には、アデニン（Ａ）となる。
　また、本発明は、その好ましい１つの形態として、一般式 [IIIa] ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物を提供する。
　上述したように、本発明のハンマーヘッド型リボザイムは、例えばRNA編集等の修飾を受けた標的RNA の修飾部位を認識して、ハンマーヘッド型リボザイムの修飾認識塩基（X）と、標的RNAの修飾塩基（E）とが塩基対を形成してハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA 構築物を構築すると、標的RNAの修飾塩基（E）の5’－側上流に隣接する塩基（H’）とのホスホジエステル結合を切断することになる。
　その結果、RNA編集などの修飾を受けた標的mRNAは、かかる修飾を受けなかった標的mRNAから誘導される本来のタンパク質とは異なる機能や作用を有するタンパク質を生成することになる。その結果、本発明のハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAが修飾を受けたことにより生体機能に悪影響を及ぼし兼ねなかった修飾標的mRNA の機能や作用を抑制することが可能になる。したがって、本発明のハンマーヘッド型リボザイムは、例えば、セロトニン2C型受容体（HTR2C）、グルタミン酸受容体、γ－アミノ酪酸（GABA）受容体、FLNA（アクチン結合タンパク質２８０)、アポリポタンパクB (ApoB) や、カリウムチャンネルなどの中枢神経系の精神神経機能に深く関与している受容体やイオンチャンネルなどが関連している統合失調症、双極性障害、大うつ病などの精神疾患などの疾患の予防や治療の改善に役立つものと期待できる。
　例えば、図１に示すように、生体内のセロトニン2C型受容体（HTR2C）RNAには、Ａ～Ｅ部位の５つの部位において、下記のような部位にRNA編集が発生していることが知られていて、かかるRNA編集が関与していると考える疾病としては、下表１に示すような疾病が挙げられる。したがって、本発明に係るハンマーヘッド型リボザイムは、上記疾病に加えて、下表１に示すような疾病に対しても作用効果を及ぼすことが期待できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　これらの他に、タンパク質コード領域内のRNA編集も知られていて、それらの遺伝子と関連する疾病に対しても、本発明に係るハンマーヘッド型リボザイム [I] は、下表２に示すような疾病に対しても作用効果を及ぼすことが期待できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　以下、ハンマーヘッド型リボザイムとセロトニン２Ｃ受容体（HTR2C）mRNA(HTR2C RNA) との構築物を例に挙げて具体的に説明するが、本発明は、HHR－HTR2C RNA構築物に一切限定されるものではない。本発明で使用するHHR－HTR2C RNA構築物の構造は次のように記載することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（なお、下線を付した塩基は、触媒活性に必要なコンセンサス配列を意味する。）
　なお、上記構造式 [IIIb] においては、HTR2C RNAの修飾部位（E）は、アデノシン（Ａ）、つまり未修飾部位として表しているので、ハンマーヘッド型リボザイムの修飾認識塩基 (X) のシトシン（Ｃ）とは塩基対を形成できない。したがって、上記構造式で表される構築物においては、HTR2C RNAの切断部位では切断が起こらないことになる。一方、HTR2C RNAの修飾部位（E）が、A-to-I編集によりイノシン (I) に塩基編集されると、編集認識部位（Ｃ）と塩基対を形成して、矢印で示した切断部位において切断が起こる。
　上記HTR2C RNAの他に、ハンマーヘッド型リボザイム (HHR) - RNA構築物としては、例えば、HHRとFLNA（アクチン結合タンパク質２８０) との構築物や、HHRとApoB （Apolipoprotein B：アポリポタンパク質B）との構築物などが挙げられる。
　ここで、上記HHRとFLNAとの構築物（HHRz FLNA01）の構造式は下記に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　また、上記HHRとApoBとの構築物（HHRz ApoB01）の構造式 [IIId]は、下記に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　本発明に係るハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、直接添加するか、または陽イオン脂質とコンプレックスを形成するか、リポソーム内に包み込むか、あるいはその他の態様で標的細胞に送達することができる。本発明のハンマーヘッド型リボザイムまたはそのコンプレックスは、バイオポリマー内に組み込んでまたは組み込まなくて、エクスビボ（ex vivo）で、または注射、注入ポンプもしくはステントによってインビボ（in vivo）で関連組織に局所的に投与することができる。あるいは、本発明のHHRは、細胞に送達されるDNAベクターやRNAベクターから発現することができるので、誘導性または内在性プロモーターのどちらかからも細胞内で発現できる。これら組換えベクターとしては、DNAプラスミド、アデノウイルス、レトロウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクターであるのが好ましい。RNAの発現を指令する他の哺乳動物細胞ベクターもこの目的のために使用することができる。かかる組換えベクターは、上述したようにして局所的に送達でき、送達されたHHRは発現すると直ちに標的mRNAを開裂する。
　上記リポソームの組成は、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせたリン脂質との組み合わせ物、特に、高い相遷移温度リン脂質の組合せ物であるのがよい。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度及び二価陽イオンの存在に依存している。本発明の構築物はまた、ネーキッド遺伝子発現ベクターとして送達することもできる。これは、本発明の構築物が送達媒体（例えば、リポソームまたはコロイド粒子）と結合していないことを意味する。ネーキッドベクターで予想される主要な利点の１つはベクター自体によって刺激される免疫応答が無いことである。
　本発明は、疾病を治療するための遺伝子治療に適用可能である。このような治療法は、上記疾患を有している対象の細胞にmRNAを特異的に開裂する適当なリボザイムを導入することによって治療効果を発揮することが可能である。なお、リボザイムは、キメラウイルスまたはコロイド分散系のような組換え発現ベクターを使用して送達することができる。
　本発明による遺伝子治療法は、インビボ（in vivo）またはエクスビボ（ex vivo）で常法に従って実施することができる。使用できるウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルスが挙げられる。上記レトロウイルスベクターとしては、例えば、マウスまたはトリレトロウイルス由来のものである。単一の外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例としては、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）及びルイス肉腫ウイルス（RSV）が含まれる。
　以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、下記実施例は、本発明をより具体的に説明するための目的だけで記載するものであって、本発明を制限する意図は一切ないものと理解すべきである。したがって、下記実施例から想到されるあらゆる変形は本発明の範囲に包含されるものと理解すべきである。
　本実施例においては、設計したリボザイムの編集特異的切断の有効性を評価するために、HTR2C mRNA上のA-to-I編集部位、つまりＣ部位を、標的修飾部位として選択した。また、A-to-I編集特異的切断活性を持つリボザイムを構築するために、HHR (HR-HTR2C) を、触媒活性を持つコア配列および、5’位のＣを切断するためのHTR2C RNAに相補的な１６塩基を含むように共通の方法に従って設計した（図１８Ａ）。
本実施例で使用した触媒活性を有するコア配列 (Helix II) は下記に示すとおりである。
5′-CUGANcGAGGCC GAAAGGCCGAA-3′
　この配列は、コンセンサス配列 (5′-CUGANGA----GAA-3′)
および４塩基対 (bp) GCGCデュプレックス (duplex) とGAAAテトラループ (tetraloop) を含むステム・ループ構造から構成されている (Scott,
W.G., et al. 1995. Cell 81(7): 991-1002)。この構造における標的切断部位（GUAトリプレット）の配列の前後関係は上記トリプレットルールに基づいて選択されているので、HHRは、HTR2C RNAに対して切断活性を示すことが期待される。そこで、得られたHHR構築物において、その修飾認識塩基は、C部位でU-A 塩基対（Aは修飾部位）を形成する。編集特異的リボザイムは、C部位のAがA-to-I RNA編集によってIで置換されたときだけ切断活性が出るように、認識塩基のUをCに変換することによって構築される（図１８Ａ）。イノシンは、G-C 塩基対と同一であるシトシンと塩基対を形成する。その結果、得られるリボザイムは、塩基対認識による標的RNA修飾部位を識別する能力を取得する。したがって、このリボザイムの編集HTR2C(HR-HTR2C-edit) に対する切断能力は、非編集HTR2Cよりも高いことが期待される。
下記実施例で得られるオリゴヌクレオチドの配列は下表３に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　本実施例において使用する材料、試薬等は下記に示すとおりである。
（in vitro 転写試薬）
RNase-Free water、10× AmpliScribe T7 Reaction Buffer, 25mM NTP、100 mM DTT、RiboGuard RNase Inhitor、AmpliScribe T7または Enzyme Solution : AmpliScribe
（PCR試薬）
Taq DNA Polymerase、10×Thermo Pol Reaction Buffer：NEB
2.5mM dNTP, 2mM dNTP：
（逆転写試薬）
AMV Reverse Transcriptase 10U/μl、AMV RT 5×BUFFER、10mM dNTP：Promega
（脱リン酸化試薬）
Antarctic Phasshatase 5000U/ml、10×Antarctic Phasphatase buffer：NEB
（リン酸化試薬）
T4 Polynucleotide Kinase、10×T4 Polynucleotide Kinase Buffer, ：TAKARA
NEG 502Z 〔gamma-32P〕 222TBq/mmol( 6000Ci/mmol ) 370MBq/ml：PerkinElmer
（制限酵素）
BamHＩ 10U/μl：TOYOBO   
EcoRＩ 70U/μl：Promega  10×H buffer：TAKARA
（その他）
2×Ligation mix
　オリゴDNAは、ジーンネットから常法に従って取得した。
HRz1C （53nt）
5’-GCAATACGTATTCGAAAACTCATCAGTCCTATTGCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
HRz 2C （59nt）
5’-GCAATACGTATTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGTCCTATTGCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
HRzC 1E （53nt）
5’-AGCAATACGTTTCGAAAACTCATCAGATCCTATTCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
HRzC 2E （59nt）
5’-AGCAATACGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGATCCTATTCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
S （40nt）
5’-CAATAGGATTACGTATTGCTACTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
S5 （59nt）
5’-GGCTATGCTCAATAGGATTACGTATTGCTACATACCGATCCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
T7proG cap
5’-CTAATACGACTCACTATAG-3’
(Library H(+)) （29 mer）
5’-CTAATACGACTCACTATAGGCTATGCTCA-3’            
(Library H1(-)) （59mer）
5’-GGTATGTAGCAATACGTA(N24)TCCTATTGAGCATAGCC-3’    
(Library H2(-)) （63mer）
5’-GGTATGTAGCAATACGTA(N24)TCCTAT(N4)TGAGCATAGCC-3’           
HRzC-ino （59nt）
5’-AGCAATACGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGGTCCTATTCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
プライマー
(Library H(+)) （29 mer）
5’-CTAATACGACTCACTATAGGCTATGCTCA-3’
Selection H RT　16nt
5’-GGTATGTAGCAATACG-3’
HHSeq_F_EcoRI （26mer）
5’-CGGAATTCTAATACGACTCACTATAG-3’
HHSeq_R_BamHI （25mer）
5’-GCGGGATCCGGTATGTAGCAATACG-3’
修飾RNAは、北海道システムサイエンスから取得した。
5’末端biotin S （27nt）
5’-CAUUACGUAAUCCUAUUGAGCAUAGCC-3’
S C-ino （41nt）
5’-GGAUCGGUAUGUAGCAAUACGUAIUCCUAUUGAGCAUAGCC-3’
　HTR2C mRNA上のE部位を切断するリボザイム (HRz1EおよびHRz2E) の設計（コントロール）は、切断部位周辺の配列が5’-Nn’HH’-3’ ルール（トリプレットルール）に適うように、HRz1CおよびHRz2Cの切断部位を5’側に1塩基シフトさせたE部位切断型リボザイム（HRz1EおよびHRz2E）を設計した。
　E部位切断型リボザイム（HRz1EおよびHRz2E）の具体的な配列は、下記式(1)ないし(2)に示すとおりである。
HRz1E  (35nt)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
HRz2E  (41nt)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　次に、リボザイム（HRz1C、HRz2C、HRz1EおよびHRz2E）と基質RNA（S1、S2、S3、S4および S5）（標的配列）の合成を次のように行った。
　なお、リボザイム(HRz1CおよびHRz2C) の設計は、HTR2C mRNA上C部位が切断部位となるように、標的認識領域をHTR2C mRNAの配列と相補的な配列に変換した。活性領域に存在するステムの数が切断活性に影響を与えることが既に報告されているため、ステム数が1つのリボザイム（HRz1C：35nt）および、ステム数が4つのリボザイム（HRz2C：41nt）を設計した。しかし、この２種のリボザイムは、切断部位周辺の配列が（5’-UAA-3’）となり、5’-N’HH’-3’ルール（トリプレットルール）には当てはまらない為に活性が低いと予測された。
　上記リボザイム (HRz1CおよびHRz2C) の具体的な配列は下記式(3)ないし(4)に示すとおりである。
HRz1C  (35nt）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
HRz2C （41nt）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　上記配列において、左側枠内の塩基群はHelix I（5’－認識領域）、下線を施した塩基群はステム領域、および右側枠内の塩基群Helix III（3’－認識領域）を示す。以下も同じである。
　リボザイム(HRz1EおよびHRz2E) についても、リボザイム(HRz1CおよびHRz2C)と実質的には同様に設計、合成することができる。
　まず、各リボザイムの配列の上流にT7プロモーターを付加するために、下記組成を用いて、９８ ℃で５分間加熱後、２５ ℃まで１時間かけて除冷してアニーリングを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　アニーリング後のサンプルを鋳型にし、下記組成の溶液中でin vitro 転写反応（３７℃：３時間）によりRNA（リボザイム）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　上記で得られたサンプルに2μlのDNase を加え、３７℃で１５分間インキュベートし、DNase 処理を行った。その後、フェーノール／クロロホルムを加え、15,000 rpmで５分間遠心を行い、上清をフェノール／クロロホルム抽出した。この上清の２.５倍量のエタノールと１０分の１量の3 M 酢酸ナトリウムを加え、15,000 rpmで１５分間遠心を行い、エタノール沈殿により精製を行った。
　次に、変性ゲル（6M Urea 15％ ポリアクリルアミドゲル）を用いて、RNAサンプルのPAGE精製を行った。エタノール沈殿により精製を行ったRNAサンプルを90％ホルムアミド( 60μl )で溶解し、変性ゲル(6M Urea 15％ ポリアクリルアミドゲル)を用いて電気泳動を行った。目的バンドを切り出し、ゲルをピペットチップの先端で細かく砕いた後、TEバッファーを400μl加えてローテーターを用い1時間攪拌を行った。15,000 rpmで５分間遠心を行い、ゲルからRNAを抽出した。その後、フェーノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行った。精製したRNAサンプルは変性ゲルで純度解析を行った。その結果、HRz1Cは38.8μM、HRz2Cは35.8μM、HRz1Eは17.0μM、ならびにHRz2Eは8.91μMであった。
　図４は、各リボザイム（HRz1C、HRz2C、HRz1E、HRz2Eならびに基質RNA (S) のT7プロモーター反応後の電気泳動図である。図５(A) および (B) は、各リボザイムおよび基質RNA (S)ならびにS5 のPAGE精製後のそれぞれの電気泳動図である。
　各リボザイム（HRz1C、HRz2CおよびHRz2E）は、PAGE精製にメインバンドを切り出すことに成功した。しかし、HRz1Eはバンドが2本確認できた。一方、基質Sにおいては、転写反応が効率よく起こっていないようなので、配列を長くしたS2、S3、S4、S5の合成を行った結果、S5が最も効率よく転写されることが分かった。
　引き続いて、リボザイムの活性評価をEtBr染色によって行った。上記で構築したHRz1C（35nt）、HRz2C（41nt）、HRz1E（35nt）、HRz2E（41nt）と標的配列（S（35nt））を、80℃で３分間加熱後、25 ℃まで１５分間かけて除冷してアニーリングした後、以下の組成を持つアニーリングサンプル（36μl）に20mM MgCl2（4μl）を添加して３７℃でインキュベートすることによって切断反応を行った。反応溶液を各時間（０、１、２、２４時間）おきにサンプリング（4μlおよび8μlずつ）して、サンプリングした反応溶液は、エタノール沈殿による精製後、90％ ホルムアミドに溶解し、変性ゲル (6M Urea 15％ ポリアクリルアミドゲル) を用いた電気泳動により、切断バンドの解析を行なった。泳動写真をスキャナで取り込み、画像解析ソフトImage Jを用いて切断割合を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　図６Ａおよび図６Ｂは、各リボザイムと標的RNA配列 (S)の経時活性評価（EtBr染色）を示す電気泳動図である。図６Ａ中、Ｈ１はHRz1を表し、Ｈ２はHRz2を表す。図６Ａ中、Ｈ１はHRz1Cを表し、Ｈ２は HRz2Cを表す。また、数字は時間（ｈ）を表す。
図７は、Image Jによる切断バンドの解析結果を示す棒グラフであり、（Ａ）は、HRz1E vs HRz1Cの切断バンドの割合、（Ｂ）はHRz2E vs HRz2Cの切断バンドの割合を示している。
　解析の結果、すべてのサンプルで標的配列の切断バンドを確認したが、HRz1ならびにHRz2よりもコントロールの方がより短時間で標的配列を切断することが明らかになった。これは、分子設計だけでは5’-UAA-3’配列に対しては高活性なリボザイムを構築するのは困難であるという予測通りの結果である。さらに詳しく切断割合を算出するために、RIラベルによる切断活性評価を行った。
　引き続いて、上記で得られたリボザイムの切断活性評価を行うために、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を用いて、用いて基質Sの5’末端をRI (γ-32P) で標識した。
　まず、上記で得られたサンプルに、H2O (79μl)、10×Antarctic Phasphatase buffer (10μl)、10μM S (10μl)、Antarctic Phasphatase
(1μl) を加え、37℃にて１時間インキュベートして5’末端の脱リン酸化を行った。その後、フェーノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行ったサンプルをH2O 14μlに溶解し、ブロックインキュベーターを用いて65℃で１０分間加熱することによりAntarctic Phasphataseを失活させた。
　次に、脱リン酸化後の基質S (14μl)、10×T4 Polynucleotide Kinase Buffer (2 μl)、(γ-32P)ATP (2 μl)、T4 Polynucleotide Kinase(2 μl) を加え、37℃にて３０分間インキュベートし5’末端を同位元素で標識した。その後、スピンカラムを用いてフィルターろ過を行い未反応の (γ32P)ATPを取り除く操作を行い（8,000 rpm 、１分間遠心）、エタノール沈殿により精製した。上記のようにエタノール沈殿により精製したサンプルを80%ホルムアミドで溶解し、変性(8M尿素、15％ ポリアクリルアミドゲル) ゲルを用いて電気泳動を行った。目的バンドを切り出し、ゲルをピペットチップの先端で細かく砕いた後、TEバッファーを300μl加えてローテーターを用い１時間攪拌を行った。15,000 rpmで５分間遠心を行い、ゲルからRNAを抽出した後、エタノール沈殿により精製を行った。精製後のサンプルを20μlのTEで溶解し、5’末端を放射標識した基質Sを準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　上記で得たリボザイムの切断活性を以下の方法により評価した。2μM リボザイム (10μl)に、10×cleavage buffer (2μl)、5’末端を同位元素標識した基質S (1μl)、H2O (5μl)を加え、ブロックインキュベーターを用いて80℃にて３分間加熱後、室温で１０分間放冷しアニーリング反応を行い、20mM MgCl2を加えることにより反応を開始した。その後、37℃でインキュベートして切断反応を行った。各時間（１、３、６時間）おきにサンプリングして（3.6μlずつ）、サンプリングした溶液に0.5M EDTAを0.4μl 、ホルムアミドを16μl加えて、80℃で３分間加熱後、氷上にて２分間急冷し、変性ゲル (8M尿素、15％ ポリアクリルアミドゲル) を用いた電気泳動により、切断バンドの解析を行なった。
　図８は、各リボザイムの切断活性（RIラベル）の経時変化を示す図である。図９は、図８における各リボザイムの切断活性（RIラベル）の経時毎の切断割を算出した結果を示す棒グラフである。
　本実施例では、in vitro セレクション法を用いたHTR2C mRNA上C部位を切断するリボザイムを構築した。このin vitro セレクション法は、機能性RNA (核酸) を構築する方法の一つである。
　RNAは、逆転写でDNAに変換することができ、DNAはPCRで増幅することも可能である。この性質を利用し、以下のような手順で目的機能を有するRNA分子の選出を行った。(1) RNAライブラリーからの特定条件下（標的分子に結合するや、活性を示すなど）でのRNA分子の選別。(2) (1)で選択した RNA分子を逆転写反応によるDNAへの変換。PCRによるT7プロモーター配列の付加、増幅。(3) T7 RNAポリメラーゼによるRNAへの転写。(1)～(3)の操作を繰り返し行うことで、HTR2C mRNA上C部位を切断する機能をもつRNA分子を得た。
　なお、基本骨格は、Schistosoma mansoni由来のハンマーヘッド型リボザイム（Martick, M.; Scott, W. G. Cell 2006, 126, 309-20）を用いた。セレクション方法は、文献（Persson, T., et. al. Chembiochem 2002, 3, 1066-71）を参考にして設計した。
（ライブラリーH1およびH2の作成）
　活性領域に存在する24塩基を全てランダム化したライブラリーH1と、標的認識領域に4塩基のループを導入したライブラリーH2を設計した。
ライブラリーH1の具体的な設計は以下に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
ライブラリーH2の具体的な設計は以下に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　ライブラリー H(+) と、ライブラリーH1(-) またはライブラリーH2(-) をそれぞれアニーリングした後にKlenowを用いて鋳型DNAの調節を行った。作成した二本鎖DNAを鋳型にし、in vitro 転写反応により、ライブラリーH1およびH2をそれぞれ合成した（図１０）。
　組成は以下に示すとおりである（H1およびH2のどちらも組成は同じ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
　上記で得られたライブラリーH1およびH2をセレクション処理した。
　まず、ライブラリーH1およびH2と、5’末端をbiotin化した標的RNAをそれぞれアニーリングした。続いて、洗浄用バッファー（10mM HEPES、5mM EDTA、50mM NaCl）で洗浄したマグネットビーズ（Dynabeads M-280 streptavidin: DYNAL社）とアニーリングしたサンプルを混合し、室温で２０分間インキュベートすることにより、biotinとstreptavidinの結合反応を行なった（1Round：300μl；2～8Round：50μl）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　上記で得られたサンプルに、切断用バッファー（50mM Tris/HCl (pH7.5)、50mM NaCl、 20mM MgCl2)を加え、37℃で３０分間インキュベートし、リボザイムを活性化させた。ここで、活性を有する分子は、標的RNAを切断し、マグネットビーズから解離する。マグネットビーズを除去した後、溶液をエタノール沈澱により精製し、6μlのTEに溶解後、逆転写反応によりcDNAに変換した。
　逆転写反応は、セレクションサンプル (3μl)と20μセレクションH RT (9.5μl) とを、80℃で１５分間加熱した後、25℃で１分間放置した後、4℃で冷却してアニーリングした。このようにして得られたアニールサンプル (12.5μl) を、5 xバッファー (4l) 10mM dNTP (2l) AMV RTase (1.5) と混合し、42℃で１５分間加熱した後、99℃で５分間加熱した後、４℃に冷却して逆転写反応を行った。
　その後、PCRにより鋳型となるDNAを増幅した。PCRは、下記組成を用いて、９５℃で１５秒間加熱後、５５℃で３０秒間、続いて６８℃で３０秒間加熱することを１サイクルとして行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
　その際、最適なPCR条件を決定するために、上記PCRと同一条件でサイクルチェックを行なった。サイクルチェックは、１～３ラウンドにおいては、１０～３５サイクルまでは５サイクルごとにサンプリングし、４～８ラウンドにおいては、８～２４サイクルまでは４サイクルごとにサンプリングして行った。
　図１１Ａおよび図１１Ｂは、ラウンド１のサイクルチェックの結果をそれぞれ示す電気泳動図である。図中、左半分はライブラリーH1、右半分はライブラリーH2を示す。
　増幅後のサンプルをフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製後、10μlのTEに溶解し、10μl中5μlのtemplate DNAを用いて、in vitro転写反応（３７℃で３時間加熱）により次のラウンドに用いるRNAライブラリーを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　上記の操作を８回繰り返し、サイクルチェックの結果から、分子種が収束していると予想されたため、RNA分子の配列解析を行った（図１２：左半分はライブラリーH1を、また右半分はライブラリーH2を示す）。ライブラリーH1の配列解析結果は図１３に、またライブラリーH2の配列解析結果は図１４に示すとおりである。
　配列解析の結果、ライブラリーH1は、10/16が基本骨格よりも短い断片がえられていた。また、その他の分子については、切断部位の配列が5’-N’HH’-3’の法則に従うようにC部位から１塩基シフトしたリボザイムが得られた。また、ライブラリーH2に関しては、あまり分子種の収束が見られなかったため、引き続きin vitro セレクションを行い、１２ラウンドで逆転写反応後のPCRサイクル数の減少を確認したので再び配列解析を行った。再配列解析結果を図１５に示す。
　再配列解析にて３６分子配列を確認したうち、図１５に示す３分子において収束が見られた。この3分子の活性評価（RIラベル）を行ったが、HTR2C mRNAに対しては全く切断活性を示さなかった。そこで、C部位を切断リボザイムのみを選択できるように、活性領域に存在する切断活性に必須である配列 (5’-CUGA-3’)を固定し、それ以外を多様化したRNAライブラリー（2H1ならびに2H2）を再設計した。
　なお、上記で合成したサンプルに1μlのDNaseＩを加え、３７℃で１５分間インキュベートし、DNase 処理を行った。その後、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行った。また、未反応のNTPを除くため、精製後のサンプルを40μlのTEに溶解し、ゲルろ過を行った。方法は、Micro Bio-Spin 30 Colum in RNase Freeを用い、3,200rpmで４分間遠心した。ナノビューを用いて、ゲルろ過後のサンプルの濃度を決定し、次のラウンドに移った。
（制限酵素サイトふ化）
　８ラウンドのPCRにより増幅したDNAライブラリーに制限酵素をふ化するために、HH-FwとHH-Rvの2種類のプライマーを用いてPCRを行った。その際、最適なPCR条件を決定するために、サイクルチェックを行なった。サイクルチェックは、下記組成を用いて、９５℃で１５秒間加熱した後、５５℃で３０秒間、続いて６８℃で３０秒間加熱処理し、２～１０ラウンドまでは２サイクルごとにサンプリングした。その結果、６ラウンドが最適条件であったので、以下の組成で制限酵素ふ化を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
　増幅後、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行い、20μlのTEで溶解した。
　以下の組成で３７℃で２時間制限酵素処理を行った後、フェノール/クロロホルム抽出をした後、エタノール沈殿により精製を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
　処理後、ナノビューによる濃度定量の結果は、DNAライブラリーH1は0.020μg /μl、またDNAライブラリーH2は0.020μg /μlであった。
（ベクターの制限酵素処理）
　pBluescript（0.245μg /μl）を、BamHＩとEcoRＩを含む組成を用いて、37℃で2時間処理して制限酵素処理を行った。処理後、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行った。処理後、ナノビューによる濃度定量の結果は、0.041μg /μlであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
（ライゲーション）
　pBluescriptと、DNAライブラリー（H1、H2）とを、１６℃で４時間３１分間ライゲーションを行った。なお、mol比がpBluescript：DNAライブラリー＝1：3であった。その後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行った後、H2O 3μlで溶解した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
（エレクトポレーション）
　ライゲーション後のサンプル3μlから1.5μlを氷上にて溶解したJM83に加え、エレクトロキュベットに移し、エレクトロポレーションを行った。その後、直ちにSOCに注ぎ、３７℃にて３０分間培養を行った。培養後のサンプルをLB培地（アンピシリン、X-gal含）に撒き、３７℃にて一夜培養を行った。
（コロニーPCR）
　一夜培養を行った後、青コロニーおよび白コロニーのうち、白コロニーのみを爪楊枝を用いて、DNAライブラリーH1およびH2をそれぞれ24個ずつPCRチューブにピックアップした。チューブには、以下の組成のPCRミックスをそれぞれ10μlずつ分注した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
　PCRは、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間ならびに６８℃で３０秒間の加熱処理を１サイクルとして３０サイクル行った後、1%アガロース電気泳動を行い目的の増幅物が得られているかを確認した。DNAライブラリーH1およびH2を１８サンプルずつを選別し、シークエンスPCRを行った。
　シークエンスPCR後、エタノール沈殿により精製を行い、ホルムアミド：ブルーデキストラン（5：1）の混合溶液3μlに溶解した。そのサンプルを９５℃にて３分間加熱後、氷上で急冷した。その後ABI377で塩基配列の解析を行った。
　本実施例では、HTR2C mRNA上C部位のA-to-I編集を識別するリボザイム ( HRzC-ino) の設計を行った。
　HRz2Eを基本骨格とし、C部位のアデノシンは、HRzCの標的認識領域に存在するウリジンと塩基対を形成することにより認識される。そこで、イノシンがシトシンと塩基対を形成することを利用し、C部位と塩基対合するウリジンをシトシンに置換することにより、C部位がA to I編集された時にのみ切断活性を示すリボザイムHRzC-inoを設計した。
　リボザイムHRzC-ino（41nt）の具体的な配列は下記式(5)に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　上記のようにして設計したリボザイムHRzC-inoに基づいて、HTR2C mRNA上C部位のA-to-I編集を識別するリボザイム ( HRzC-ino) の合成を行ったところ、最終濃度（2.3μM）は低かったけれどHRzC-inoが得られた（図１６）。
　上記で得られたリボザイム HRzC-inoの活性評価（RI標識）を行った。標的RNAとしては、基質SとSのC部位がイノシン (I) であるS C-inoを用い、それぞれの標的RNAに対しての切断活性を比較した（図１７）。なお、標的RNAの5’末端標識方法ならびに活性評価方法は、上記に示した方法と同様に行った。　
　上記のようにリボザイム HRzC-inoの切断活性を評価した結果、C部位が、塩基Aよりも塩基Iの配列に対してより高い切断活性（約１４倍）を示すことを確認した。以上の結果より、リボザイム HRzC-inoは、HTR2C mRNAのC部位におけるA-to-I編集を特異的に識別できることが示された。
　本実施例では、HTR2C RNAフラグメントに対するA-to-I編集特異的リボザイムのin vitroトランス切断活性および特異性を調べた。
　HR-HTR2C-editの切断活性と編集特異性を評価するために、インビトロアッセイを、Ｃ部位を含む合成HTR2C RNAフラグメントを用いて行った。このアッセイでは、２形式の32P標識 HTR2C mRNAフラグメント（３７個のヌクレオチド）、つまり、１つは、非編集基質（HTR2C-ade）としてのC部位に塩基Aを有するものと、編集基質としてのC部位に塩基Iを有するものとの２形式を使用した（図１８Ａ）。
　基質RNAは、インビトロで転写し、ゲル精製した過剰量のHR-HTR2CとHR-HTR2C-editリボザイムの存在下でアニールした。切断反応は、３７℃で20 mM MgCl2を添加して開始した。１時間後、切断バンドは、ゲル電気泳動を用いて分析し、切断率を算出した（図１８Ｂ、１８Ｃ）。HR-HTR2Cの場合、HTR2C-adeとHTR2C-ino (0.69 and 0.59) に対して同様の切断率が観察された。対照的に、HR-HTR2C-editを用いたHTR2C-inoに対する切断率は、HTR2C-ade (0.76 and 0.09) に対する切断率よりも格段に高かった。これらの結果は、HR-HTR2Cの２番目の塩基を変換してHR-HTR2C-editを形成することは、A-to-I編集特異的切断活性を授けることを示している。
　次に、リボザイムのための切断動態を分析するために、上述した実験法を用いて、単独ターンオーバー条件下でtrans切断率定数を決定した（図１９）。図１９Ａは、HTR2C-ade（図１９Ａの上図）とHTR2C-ino（図１９Ａの下図）に対するHR-HTR2C-editの反応から得られた切断産物の経時変化を示す。HR-HTR2C-editの動態分析結果は、HTR2C-inoを用いた場合は高kcat値 (0.67 ± 0.011 min-1)、HTR2C-adeを用いた場合は低kcat (0.01 ± 0.001 min-1)値を示した（図１９Ｂ、表３）。対照的に、HR-HTR2Cは、編集ならびに非編集基質の両方の切断をkcat値（0.05 ± 0.001 min-1、0.44 ± 0.022 min-1）で触媒活性を示した。このリボザイムに対するkcat値の相違は、HR-HTR2C-editに対するそれよりも小さかった。反応の最終ポイント（F∞）での産物の分画は、認識塩基と修飾部位との組み合わせが、U-A (0.74)、U-I (0.63)、C-I (0.85）である場合は類似しているが、C-A の場合は有意に低い値（0.23）を示した。
　この結果、先行研究（Werner, M., et al. 1995. Nucleic Acids Res 23(12): 2092-2096）の結果と一致しているとともに、HR-HTR2C-editの切断活性が、塩基対が認識塩基で形成されているかどうかに左右されて非常に影響されることを見いだした。HR-HTR2Cについては、U-AならびにU-I 間の切断活性の相違は、塩基対の熱安定性に従った順になるようも思われ、U-I 塩基対はU-A 塩基対よりも安定性が低かった (Serra, M.J., et al. 2004. Nucleic Acids Res 32(5): 1824-1828)。これらの結果は、リボザイムの編集特異的切断活性が、認識塩基と、標的修飾部位の塩基とを組み合わせることによって設計できることを示した。
　本実施例では、リボザイムを用いたAPOB RNAに対するC-to-U編集特異的切断を調べた。本発明で作製したリボザイムが他の形式のRNA置換編集の特異的切断に応用可能かどうかを決定するために、認識塩基を変化させてC-to-U編集特異的リボザイムを構築した。C-to-U編集特異的リボザイムは、APOB mRNAの6666位の塩基ＣのC-to-U編集が、グルタミンコドン（CAA）をフレーム内（in-frame）ストップコドンに変換することによって、APOB mRNAに対する標的として設計した。A-to-I 編集に使用した同様の方法を用いて、HHRは、同じ触媒活性コア配列を用いて、APOB mRNA上の５’位のC-to-U修飾部位を切断するように構築した。C-to-U編集特異的リボザイム（HR-APOB-edit）は、塩基Aを、APOB RNAのC-to-U編集からの塩基Uと塩基対を形成するように、認識ヌクレオチドに導入することによって生成した。非編集基質（APOB-cyt）と編集基質（APOB-uri）に対するHR-APOB-editの切断活性は、インビトロ切断アッセイ法によって分析した（図２０Ｂ）。図２０Ｂに示すように、過剰量のリボザイムの存在下での１時間での切断反応後では、APOB-uriの切断は、APOB-cytの切断よりもかなり大きかった。HR-APOB-editに対する動的分析では、APOB-cytとAPOB-uriに対するHR-APOB-editの切断率は有意に異なっていた（0.01 ± 0.006 min-1 and 0.17 ± 0.008 min-1）（図２０Ｃ）。その上、最終ポイントでの産物分画においては、APOB-cytとAPOB-uriの間には明確な違いが観察された。これらのデータは、認識塩基とターゲット修飾部位との組み合わせを選択することが、A-to-I変異特異的切断ばかりではなく、C-to-U編集特異的切断のリボザイムの構築に応用できることを示した。
　本実施例では、細胞抽出ならびに合成FLNA mRNAに対するA-to-I編集特異的切断について調べるために、細胞抽出したmRNAに対するA-to-I編集特異的切断の有効性を評価した。
保存A-to-I修飾部位（Q/R部位）を含むFLNA mRNAを、内在性FLNA mRNAが編集されて、細胞中でRNA 2上で作用するアデノシン・デアミナーゼ(ADAR2)を過剰発現する標的mRNAとして使用した
(Nishimoto, Y., et al. 2008. Neurosci Res 61(2): 201-206)。FLNA mRNA (HR-FLNA-edit) の編集特異的切断のためのリボザイムは、上述した方法を用いて設計し、HR-FLNA-editの切断活性ならびに編集特異性は、合成FLNA RNAフラグメントを使用したインビトロ切断アッセイにより分析した（図２２）。編集FLNA RNAフラグメントに対するHR-FLNA-editの最終ポイントでの産物の切断率定数ならびに分画は、非編集FLNA RNAフラグメントのそれよりもずっと大きかった（図２２、表３）。これらの結果は、HR-HTR2C-editに対して観察された結果と類似していた。
　次に、細胞抽出FLNA mRNAに対するHR-FLNA-editのための編集特異的切断の効率を評価するために、ADAR2を過剰発現するHEK293細胞から編集FLNA mRNAを調製した。本発明者は、ドキシサイクリン（Dox）誘発可能な発現システムを含むADAR2発現ベクターで安定的にトランスフェクト可能なTet-ADAR2細胞をすでに確立した。編集FLNA mRNAおよび非編集 FLNA mRNAの混合物を含む全RNAは、任意の濃度のDoxを用いて培養したTet-ADAR2細胞から得ることができた。もしリボザイムが抽出した全RNA中の編集 FLNA mRNAを特異的に切断するならば、編集FLNA mRNAと非編集 FLNA mRNAとの比率は低下するはずである。したがって、編集特異的切断の効率は、Q/R部位での編集率に差異があるリボザイムを含むサンプルと含まないサンプルとの違いを測定することによって評価した。編集率を定量化する実験スキームを図２３Ａに示す。第一に、抽出RNA150ngを過剰量のHR-FLNA-edit (最終濃度： 2.5μM)でアニールし、MgCl2　20mMを含むバッファー中で切断反応を行った。異なる時間（１、３、６、２４時間）切断反応を行った後、RNAサンプルを、FLNA特異的プライマーを用いてRT-PCRを行い、蛍光dideoxyシーケンシング法を用いてPCRフラグメントを直接シーケンシングした（図２３Ａ）。各サンプルのQ/R部位での編集率を定量化するために、TならびにCのピーク高が、リバースプライマーを用いて増幅させた配列のために生成したクロマトグラムで測定した（図２３Ｂ）。編集率はHR-FLNA-edit反応の長さに従って低下した。つまり、１、３、６、２４時間当たり、編集率はそれぞれ0.56、0.52、0.47、0.36であり、これらの値は、リボザイムを含まない反応に比べて低かった。A/G混合ピーク高は、T/C混合ピーク高よりもかなり不一致であったけれども、フォワードプライマーを使用した各反応における編集率を測定して、リボザイム存在下での反応時間における編集率の低下を評価した（図２４）。これらの結果は、HR-FLNA-editが細胞抽出FLNA mRNAを編集特異的に切断することを示していた。
　上述したように、本発明においては、編集特異的リボザイムを構築するために、リボザイムの認識塩基が、標的RNAの修飾塩基とだけ塩基対を形成するように設計したので、このように設計したリボザイムは、RNA編集特異的切断に非常に有効であることが示された。A-to-I編集特異的切断のために設計したリボザイムは、編集HTR2Cと編集FLNA RNAフラグメントに対する触媒活性が、非編集RNAに対するよりも１０倍以上高かった。同様に、APOB RNAのC-to-U編集のためのリボザイムも、編集APOB RNAフラグメントに対する触媒活性が非常に高いことが判明した。本発明におけるインビトロ切断アッセイによる結果は、本発明に係る編集特異的ハンマーヘッド型リボザイム (HHR) が、編集標的RNAに対して選択的切断活性を有することを示した。編集基質に対する本発明のハンマーヘッド型リボザイム (HHR) の動的分析データを比較すると、HR-HTR2C-editの切断率は、HR-FLNA-editならびにHR-APOB-editのそれよりも非常に高いことが分かった。一方、反応の各最終ポイントでの産物分画は同様であった。これらの切断率の違いは、ハイブリダイズ形成アームとそれらの塩基対の配列によるものと考えられる。HHRの認識塩基に相当する位置での変異分析において示されるように（例えば、Zoumadakis, M., et al. 1994. Nucleic Acids Res 22(24): 5271-5278）、本発明のHHRの標的切断活性は、その認識塩基が標的RNAの修飾塩基と塩基対を形成できるかどうかに基づいて制御される。加えて、U-AならびにU-I塩基対を有するHR-HTR2Cのデータもまた、切断活性が、認識塩基での塩基対の熱安定性によって影響されることを示している。これらの結果は、本発明が、認識塩基と標的塩基との適切な組み合わせを選択することによって、RNA置換編集ばかりではなく、点変異、一塩基多型（SNP）などを含む別の形式の塩基置換の特異的切断にも応用できることを示唆している。
　本発明のようにリボザイムの認識塩基を変換することは、その切断活性が、たとえ上記トリプレットルールによって制限されたとしても、編集特異的ならびに変異特異的切断などを設計するのに有用である。本発明においては、例示した全ての標的RNAの切断部位は、リボザイムの切断活性を保持するトリプレットルールに合致するように選択した。HHRはN’HH’切断特異性があるため、本発明は、標的配列の変異部位の5’側1塩基、もしくは２塩基上流のヌクレオチドにＧが存在する場合は適用することができない。同様の理由で、N’HH’特異性を応用したHHRによる変異体認識法を用いても、全ての組み合わせの変異を識別することはできない。しかしながら、本発明で採用した戦略に基づいて、どの塩基が、標的変異部位であるかまたはその周囲の配列の前後関係に存在するかを考慮してリボザイムを設計すれば、ほぼあらゆるヌクレオチドの置換を人工リボザイムによって特異的に認識することが可能である。このように標的変異特異性が広がれば、リボザイムを遺伝子発現を選択的抑制する変異もしくは置換編集に応用できる可能性を増大させることができる。　
　さらに、本発明は、リボザイムによる編集特異的切断が、インビトロにおいて、短いRNAフラグメントばかりでなく、生理学的mRNAに対しても応用可能であることを示している。本発明においては、細胞由来標的mRNAの編集特異的切断の有効性は、DNAシーケンシングクロマトグラムに基づく修飾部位のピーク高を利用した編集率の変化として評価した。この方法によって、HR-FLNA-editの編集特異的切断を分析したところ、FLNA mRNAの総量の定量化が必要であるけれども、大雑把に見積もったところ、FLNA mRNAの51％が24時間の反応においてHR-FLNA-editによって切断された。編集特異的切断の量は、反応時間に依存したが、切断効率は、FLNA mRNAフラグメントに対する反応に比べて低く、FLNA mRNAフラグメントに対する１時間の切断反応でほぼ飽和状態になった（図２２、２３）。
　要約すると、本発明においては、最小のハンマーヘッド型リポソーム（HHR）のフレームワークを利用して、A-to-IならびにC-to-U RNA置換編集に基づく標的RNA切断のためのリボザイム設計・作成を発展させてきた。本発明のリボザイム設計の基本フレームワークは、リボザイムの認識塩基を変換し、合成編集RNAフラグメントならびに生理学的mRNAの両方に対して高い特異的切断活性を示すリボザイムを作製することにある。さらに、本発明の戦略は、RNA置換編集ばかりではなく、認識塩基と標的塩基との特異的組み合わせを選択することによって、別の形式の変異、例えば、SNPなどの変異を含む、塩基の置換、欠失、追加等の修飾などにも幅広く応用することができる。したがって、本発明は、RNA編集などに起因する疾患ばかりではなく、その他の形式の変異などの修飾に起因する疾患の予防ならびに治療に寄与する新しい薬剤の研究・開発に役立つものと期待される。
 

Claims (10)

  1. 一般式 [ I ] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Aはアデニン(A)を意味し;
    Cはシトシン(C)を意味し;
    Gはグアニン(G)を意味し;
    Uはウラシル(U)を意味し;
    Dは、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) を意味し; 
    Xは、標的RNAの修飾部位を認識する修飾認識塩基であって、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
    Nは、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
    N’は、同一であっても、または異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；
    ａは、１～１０の整数、好ましくは２～６の整数、より好ましくは２～４の整数を意味し；
    ｂは、１～６の整数、好ましくは２～４の整数を意味し；
    ｃは、１～４の整数、好ましくは１～２の整数を意味し；
    ｍは、２～５０の整数、好ましくは５～３０の整数、さらに好ましくは５～２０の整数を意味し；および
    ｎは、２～５０の整数、好ましくは５～３０の整数、さらに好ましくは５～２０の整数を意味する）
    で表されるハンマーヘッド型リボザイム。
     
  2. 　請求項１に記載のハンマーヘッド型リボザイムであって、 一般式 [Ia] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、（式中、N’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）[I] において対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；　
    Hは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記HHR [I] において対応する塩基Dと塩基対を形成する塩基を意味し；
    H’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
     Eは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）から選ばれるいずれかの塩基であり、かつ、上記HHR [I] において対応する塩基Xと塩基対を形成する塩基であって、塩基Xと塩基対を形成したときに、5’側に隣接する塩基H’との結合を切断する塩基を意味し；
    A、C、G、U、D、X、N、N’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する）
    はいずれも前記と同じ意味を有する。）
    で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA分子構築物。
     
  3. 請求項１または２に記載のハンマーヘッド型リボザイムであって、一般式 [Ia] において、塩基Xがアデニン（A）またはシトシン（C）であるハンマーヘッド型リボザイム。
     
  4. 一般式 [III] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有し、矢印は切断部位を示している。）
    で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物。
     
  5. 請求項４に記載のハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物であって、一般式 [IIIa] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する。）
    で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物。
     
  6. 請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物であって、構造式 [IIIb] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物。
     
  7. 請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物であって、構造式 [IIIc] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物。
     
  8. 請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物であって、構造式 [IIId] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物。
     
  9. 一般式 [ I ] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、ａ、ｂおよびｃはいずれも前記と同じ意味を有する。）
    で表されるハンマーヘッド型リボザイムと、一般式 [ II ] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （式中、）
    で表される標的RNAとを反応させて、一般式 [ III ] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     で表されるハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物を得ることにより標的RNAを開裂するRNA開裂方法。
     
  10. 請求項９に記載のRNA開裂方法であって、前記ハンマーヘッド型リボザイムが、一般式 [ Ia ] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
      
    で表され、また前記ハンマーヘッド型リボザイム－標的RNA構築物が、一般式 [ IIIa ] ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     で表されるRNA開裂方法。
     
     
     
     
     
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2776450A4 (en) * 2011-11-10 2015-07-22 Shire Human Genetic Therapies ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE MODULATORS OF SEROTONIN RECEPTOR 2C AND USES THEREOF
WO2019111957A1 (ja) * 2017-12-06 2019-06-13 学校法人福岡大学 オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112017011510B1 (pt) 2014-12-17 2023-12-05 Proqr Therapeutics Ii B.V. Construto de oligonucleotídeo para a edição direcionada ao sítio de um nucleotídeo adenosina em uma sequência de rna alvo em uma célula eucariótica e uso do mesmo
US10301626B2 (en) 2015-03-02 2019-05-28 The Regents Of The University Of California Catalytic strands of minimal hammerhead ribozymes and methods of using the same
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CN115038789A (zh) 2019-12-02 2022-09-09 塑造治疗公司 治疗性编辑
CN112063694B (zh) * 2020-05-09 2022-08-09 西安交通大学 一种rna a-i编辑的酶识别检测方法

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ECKSTEIN, F. ET AL.: "In vitro selection of hammerhead ribozyme sequence variants", CHEMBIOCHEM, vol. 2, 2001, pages 629 - 635 *
IWAMOTO, K. ET AL.: "RNA editing of serotonin 2C receptor and major mental disorders", YAKUGAKU ZASSHI, vol. 128, no. 4, 2008, pages 521 - 525 *
MAAS, S. ET AL.: "A-to-I RNA editing and human disease", RNA BIOLOGY, vol. 3, no. 1, January 2006 (2006-01-01), pages 1 - 9 *
MOSHIRI, H. ET AL.: "A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 38, no. 13, 2010, pages E138, 1 - 13 *
NISHIMOTO, Y. ET AL.: "Determination of editors at the novel A-to-I editing positions", NEUROSCIENCE RESEARCH, vol. 61, 2008, pages 201 - 206 *
PAN, W.-H. ET AL.: "Rapid identification of efficient target cleavage sites using a hammerhead ribozyme library in an iterative manner", MOLECULAR THERAPY, vol. 7, no. 1, January 2003 (2003-01-01), pages 129 - 139 *
SCOTT, W. G. ET AL.: "The crystal structure of an all-RNA hammerhead ribozyme: a proposed mechanism for RNA catalytic cleavage", CELL, vol. 81, June 1995 (1995-06-01), pages 991 - 1002 *
SOWDEN, M. P. ET AL.: "Apolipoprotein B RNA sequence 3' of the mooring sequence and cellular sources of auxiliary factors determine the location and extent of promiscuous editing", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 26, no. 7, 1998, pages 1644 - 1652 *
TANG, J. ET AL.: "Examination of the catalytic fitness of the hammerhead ribozyme by in vitro selection", RNA, vol. 3, 1997, pages 914 - 925 *
THOMSON, J. B. ET AL.: "In vitro selection of hammerhead ribozymes containing a bulged nucleotide in stem II", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 24, no. 22, 1996, pages 4401 - 4406 *
VAISH, N. K. ET AL.: "In vitro selection of a purine nucleotide-specific hammerhead-like ribozyme", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 95, March 1998 (1998-03-01), pages 2158 - 2162 *
WERRY, T. D. ET AL.: "RNA editing of the serotonin 5HT2c receptor and its effects on cell signaling, pharmacology and brain function", PHARMACOLOGY & THERAPEUTICS, vol. 119, 2008, pages 7 - 23 *
YAMANAKA, S. ET AL.: "RNA Editing Tenshago no Iden Joho Shushoku", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 42, no. 6, 1997, pages 803 - 811 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2776450A4 (en) * 2011-11-10 2015-07-22 Shire Human Genetic Therapies ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE MODULATORS OF SEROTONIN RECEPTOR 2C AND USES THEREOF
WO2019111957A1 (ja) * 2017-12-06 2019-06-13 学校法人福岡大学 オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法

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