BR112017011510B1

BR112017011510B1 - Construto de oligonucleotídeo para a edição direcionada ao sítio de um nucleotídeo adenosina em uma sequência de rna alvo em uma célula eucariótica e uso do mesmo

Info

Publication number: BR112017011510B1
Application number: BR112017011510-7A
Authority: BR
Inventors: Bart Klein; Gerardus Johannes Platenburg
Original assignee: Proqr Therapeutics Ii B.V.
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2023-12-05
Also published as: IL252386B; CA2968336A1; AU2015367378A1; US10676737B2; IL252386A0; JP2017537618A; CN107109413A; WO2016097212A1; RU2017117510A; US20190040383A1; BR112017011510A2; JP6718872B2; EP3234134A1; PL3234134T3; AU2022201266A1; ES2810375T3; EP3712269A1; RU2017117510A3; NZ732182A; EP3234134B1

Abstract

EDIÇÃO DE RNA DIRECIONADO. A presente invenção refere-se à edição de RNA que é obtida usando construtos de oligonucleotídeo compreendendo (i) uma porção de direcionamento específica para uma sequência de ácido nucleico alvo a ser editada e (ii) uma porção de recrutamento capaz de ligar e recrutar uma entidade de edição de ácido nucleico naturalmente presente na célula. A entidade de edição de ácido nucleico, tal como ADAR, é redirecionada a um sítio alvo pré-selecionado por meio da porção de direcionamento, dessa forma, promovendo a edição de resíduos de nucleotídeo pré-selecionados em uma região do RNA alvo que corresponde à porção de direcionamento.

Description

[001] O presente pedido reivindica o benefício de pedidos de patente do Reino Unido 1422511.4, 1512467.0, 57 12595.8 e 1521987.6 (depositado em 17 de dezembro de 2014, 16 de julho de 2015, 17 de julho de 2015 e 14 de dezembro de 2015, respectivamente), cujos conteúdos completos de cada um são por meio deste incorporados aqui por referência para todos os propósitos.

CAMPO TÉCNICO

[002] A invenção está no campo da edição de RNA, por meio da qual a sequência de nucleotídeo de uma sequência de RNA alvo é modificada, por exemplo, para corrigir uma mutação.

FUNDAMENTO DA TÉCNICA

[003] A edição de RNA é um processo natural através do qual as células eucarióticas alteram a sequência de moléculas de RNA, frequentemente de uma maneira sítio- específica e precisa, por meio da qual o aumento do repertório de RNAs codificados pelo genoma por várias ordens de magnitude. As enzimas de edição de RNA foram descritas para espécies eucarióticas em todo o animal e reinos de plantas e estes processos desempenham um papel importante no gerenciamento da homeostase celular em metazoários das formas de vida mais simples, tais como Caenorhabditis elegans, a seres humanos. Os exemplos de edição de RNA são conversões de adenosina à inosina e citidina à uridina através das enzimas chamadas de adenosina deaminase e citidina deaminase, respectivamente. O sistema de edição de RNA estudado mais extensivamente é a enzima adenosina deaminase. A adenosina deaminase é uma proteína de múltiplos domínios, compreendendo um domínio de reconhecimento e um domínio catalítico. O domínio de reconhecimento reconhece uma sequência e/ou conformação de dsRNA específica, enquanto o domínio catalítico converte uma adenosina em inosina em uma posição próxima, mais ou menos predefinida no RNA alvo, pela desaminação da nucleobase. A inosina é leita como guanina pela maquinaria translacional da célula, significando que, se uma adenosina editada estiver em uma região de codificação de um mRNA ou pré-mRNA, ela pode recodificar a sequência de proteína. A conversão de A a I também pode ocorrer na sequência de não codificação 5’ de um mRNA alvo, criando novos sítios de início de translação a montante do sítio de início original, que dá origem a proteínas N-terminalmente estendidas. Em adição, conversões de A a I podem ocorrer em elementos de emenda em íntrons ou éxons em pré-mRNAs, dessa forma, alterando o padrão de emenda. Éxons podem ser incluídos ou pulados, como uma consequência de tal edição de RNA. As adenosinas deaminase são parte da família estensiva de enzimas denominadas adenosina deaminases agindo no RNA (ADAR), incluindo deaminases humanas hADAR1, hADAR2 e hADAR3.

[004] O uso de oligonucleotídeos para editar um RNA alvo é conhecido na técnica, por exemplo, vide Montiel- Gonzalez et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences 2013 November 5, 2013, vol. 110, no. 45, pp. 18285-18290). Os autores descreveram a edição direcionada de um RNA alvo usando uma proteína de fusão modificada geneticamente, compreendendo um domínio de adenosina deaminase da proteína hADAR1, fundida com o assim chamado domínio de ligação de caixa B de proteína N de bacteriófago lambda. O domínio de reconhecimento natural de hADAR1 foi removido para eliminar as propriedades de reconhecimento do substrato da ADAR natural e substitui-las pelo domínio de reconhecimento de caixa B proteína N lambda. A caixa B é uma curta extensão de RNA de 17 nucleotídeos que é reconhecida pelo domínio de ligação de caixa B da proteína N. Os autores criaram um oligonucleotídeo antissentido compreendendo uma parte de RNA guia que é complementar à sequência alvo para a edição fundida a uma porção da caixa B para o reconhecimento específico da sequência pela proteína de fusão deaminase do domínio N. Os autores mostraram elegantemente que o oligonucleotídeo de RNA guia direcionou fielmente a proteína de fusão adenosina deaminase para o sítio alvo, resultando em edição de A a I sítio-específica direcionada a gRNA do RNA alvo.

[005] Uma desvantagem do método proposto é a necessidade de uma proteína de fusão consistindo no domínio de ligação de caixa B de proteína N do bacteriófago lambda, geneticamente fundida ao domínio de adenosina deaminase de uma proteína ADAR natural truncada. Isto exige que as células alvo sejam transduzidas com a proteína de fusão, que é um grande obstáculo ou que as células alvo sejam transfectadas com um construto de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão adenosina deaminase modificada para a expressão nas células alvo. A última não constitui qualquer obstáculo quando a edição deve ser obtida em um organismo multicelular, tal como em terapia contra doença humana.

[006] Vogel et al. (Angewandte Chemie. Int. Ed. 2014, 53, 6267-71) revelam a edição de eCFP e fator V de Leiden codificando RNAs usando um RNA guia benzilguanina substituído e uma proteína de fusão modificada geneticamente, compreendendo o domínio de adenosina deaminase de ADAR1 ou 2 geneticamente fundida a um domínio de SNAP-tag (uma O6-alquilguanina-DNA-alquil transferase modificada). Embora a proteína de fusão deaminase artificial geneticamente modificada pudesse ser direcionada a um sítio de edição desejado nos RNAs alvo em células Hela em cultura, usando RNA guia covalentemente ligado (através de benzilguanina), este sistema sofre de desvantagens similares as das ADARs geneticamente modificadas descritas acima, pelo fato de que não é claro como aplicar o sistema sem ter que modificar geneticamente a ADAR primeiro e subsequentemente transfectar ou transduzir as células contendo o RNA alvo, para prover as células com esta proteína geneticamente modificada. Claramente, este sistema não é prontamente adaptável para o uso em seres humanos, por exemplo, em uma configuração terapêutica.

[007] Outra técnica de edição que usa oligonucleotídeos é conhecida como sistema CRISPR/Cas9, mas este complexo de edição atua sobre o DNA. O ultimo método sofre da mesma desvantagem que os sistemas de ADAR modificados descritos acima, visto que ele exige a codistribuição para a célula alvo da enzima CRISPR/Cas9 ou um construto de expressão que codifica a mesma, com o oligonucleotídeo guia.

[008] Consequentemente, ainda permanece uma necessidade de novas técnicas que podem utilizar caminhos celulares endógenos para editar ácidos nucleicos endógenos em células mamíferas, mesmo em organismos inteiros, sem os problemas associados com os métodos da técnica anterior. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção acaba com as desvantagens dos métodos de acordo com a técnica anterior ao prover uma abordagem direcionada para a edição de RNA usando construtos de oligonucleotídeo compreendendo uma porção de direcionamento específica para a sequência de ácido nucleico alvo a ser editada e uma porção de recrutamento capaz de ligar e recrutar uma entidade de edição de ácido nucleico naturalmente presente na célula. A função de uma porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo é se ligar seletivamente com afinidade suficiente a uma entidade de edição de RNA endógena para e residente na célula, redirecionando tal entidade a um sítio alvo pré- selecionado por meio da porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo da invenção, dessa forma, promovendo a edição de resíduos de nucleotídeo pré- selecionados em uma região do RNA alvo correspondendo à porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo.

[0010] A porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo compreende geralmente uma sequência de oligonucleotídeo antissentido que é complementar ao sítio alvo na sequência de RNA a ser editada. Uma modalidade preferida de tal abordagem direcionada para a edição de RNA alvo é um construto de oligonucleotídeo compreendendo duas porções, uma porção de direcionamento, compreendendo uma sequência antissentido complementar à sequência de RNA alvo, e uma porção de recrutamento compreendendo uma sequência de reconhecimento para uma enzima de edição de RNA.

[0011] Uma porção de recrutamento pode compreender um dsRNA na forma de uma estrutura em grampo, com uma haste e um laço. O grampo pode residir a montante (5’) ou a jusante (3’) da porção de direcionamento (preferivelmente a montante). Alternativamente, uma porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo pode interromper a porção de direcionamento de tal maneira que parte da porção de direcionamento se encontra a montante de uma porção de recrutamento e parte da porção de direcionamento se encontra a jusante de uma porção de recrutamento, fazendo com que uma porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo fique fora do laço após o construto de oligonucleotídeo fazer o anelamento com o RNA alvo.

[0012] De acordo com outra modalidade, uma porção de recrutamento compreende um segmento de dsRNA que imita, isto é, é idêntico ou similar em estrutura a uma sequência de RNA conhecida por ser editada por entidades de edição de RNA de ocorrência natural. Esta sequência de RNA conhecida por ser um substrato natural para a edição de RNA compreende um segmento de dsRNA, preferivelmente compreendendo um segmento de RNA único que se dobra sobre si mesmo através de pareamento de nucleobase complementar, dessa forma, formando uma estrutura em grampo ou haste-laço (“estrutura em grampo ou haste-laço”). Dois exemplos de sequências de RNA editadas conhecidas que foram caracterizados em grandes detalhes estão na subunidade B do receptor de glutamato (GluR-B) subtipo ácido 3-amino-3- hidróxi-5-metil-4-isoxazol propiônico (AMPA). Este sistema de modelo compreende dois sítios editados frequentemente em que AGA codificada por DNA é editada para IGA, resultando em uma substituição de arginina-a-glicina (sítio R/G) e uma substituição distinta de glutamina-a-arginina (sítio Q/R). O sítio GluR-B (R/G) é conhecido por compreender de uma estrutura em haste-laço consistindo em 71 nucleotídeos compreendendo 3 incompatibilidades, 2 A-C e pares de base oscilantes G-U. Interessantemente, o laço (“loop”) consiste em uma estrutura GCUAA de estrutura pentaloop bem- conservada que se conforma a uma sequência GCUMA filogeneticamente conservada, em que M é A ou C (Aruscavage P.J. & Bass B.L. RNA. 2000; 6: 257-269). Parece haver alguma preferência para a edição das duas adenosinas oscilantes, com uma eficiência crescente quando a base oposta à adenosina editada é selecionada de citidina ou uridina, a citidina sendo preferida.

[0013] Esta estrutura pode ser usada convenientemente como é ou ser adaptada quando usada em um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção, como uma porção de recrutamento, pela redução ou aumento do número de pares de nucleobase oscilantes na haste para modificar a especificidade de editar e/ou redirecionar a edição ao sítio(s) preferido na sequência de RNA alvo. Em adição ou alternativemente, o sítio de reconhecimento do GluR-B para hADAR1 pode ser modificado pelo encurtamento da haste sem abolir o reconhecimento completamente. Tal encurtamento pode ser conveniente de uma perspectiva de boa capacidade de fabricação ou custo e os similares.

[0014] Um exemplo de uma porção de recrutamento derivada do domínio GluR-B compreende a sequência: 5’- (AUANa)nUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA(NbUAU)n-3’, em que Nae Nbsão, cada um, nucleotídeos únicos os quais podem ser A, G, C ou U, contanto que Nae Nbformem um par de base incompatível mediante a formação de uma estrutura em haste- laço, e n é 1 ou 0 (isto é, SEQ ID NOs: 6 & 7). Um exemplo útil de tal porção de recrutamento inclui esta sequência onde n=1, com outras extensões nas direções 5' e 3', por exemplo, onde cada extensão tem de 1 a 10 nucleotídeos de comprimento (ou mais longo, por exemplo 1 a 20 nucleotídeos ou mais). Por exemplo, estendendo 3 outros nucleotídeos em cada direção fornecem (SEQ ID NO: 23) 5’-GGAAUANaUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANbUAUCCC-3’, como visto dentro de SEQ ID NOs: 20-22 (na qual Na=Nb=G). Esta outra extensão pode melhorar a eficiência da correção.

[0015] Outro exemplo de uma porção de recrutamento com base em substrato receptor GluR-B natural de comprimento total é 5 ' -GUGGAAUANaUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANbUAUCCCAC-3' (SEQ ID NO: 24; sequência estendida relativa ao parágrafo anterior sublinhado), como usado abaixo nos exemplos. Uma porção de recrutamento do receptor GluR-B de comprimento total em combinação com as porções de direcionamento para o transcrito A1AT com a mutação G a A na posição 9989 associada com a deficiência de A1AT é descrita no exemplo 4. Uma porção de recrutamento do receptor GluR-B de comprimento total em combinação com porções de direcionamento para o transcrito LRRK2 com a mutação G2019S, associada com o mal de Parkinson, é descrita no exemplo 5.

[0016] Uma porção de recrutamento pode ser ligada na extremidade 5’ ou 3’ a uma porção de direcionamento, opcionalmente por meio de um ligante “L” que compreende um ou mais nucleotídeos, um oligopeptídeo ou outro ligante químico, tal como polietileno glicol (PEG).

[0017] A porção de direcionamento pode compreender uma sequência que é complementar à sequência de RNA alvo representada pela fórmula geral: N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17CN18N19N20(SEQ ID NO: 8), em que N1a N20, dependendo da sequência complementar na sequência de RNA alvo, cada um, independentemente são A, G, C ou U, em que N4preferivelmente forma um par de base incompatível com seu nucleotídeo oposto na sequência de RNA alvo quando a porção de direcionamento é anelada a sua sequência de RNA alvo e N10e N16formam pares de base oscilantes com seu nucleotídeo oposto na sequência de RNA alvo quando a porção de direcionamento é anelada com a sua sequência de RNA alvo, e C é citidina oposta à adenosina na sequência de RNA alvo que é um alvo para a desaminação.

[0018] Pares de base incompatíveis são G-A, C-A, U- C, A-A, G-G, C-C, U-U pares de base. Os pares de base oscilantes são: pares de base G-U, I-U, I-A, e I-C. A porção de direcionamento pode ser mais longa do que 20 nucleotídeos, tanto quanto 200 nucleotídeos ou mais, embora se acredite que mais longa do que 50 não é necessário e mais curto do que 40 é preferido. Ainda mais preferidas são as porções de recrutamento mais curtas do que 30 nucleotídeos, preferivelmente mais curtas do que 25 nucleotídeos.

[0019] Preferivelmente, a porção de direcionamento compreende grupos 2’-O metila em cada posição que se opõe a uma adenosina quando a porção de direcionamento é anelada à sequência de RNA alvo se aquela adenosina na sequência de RNA alvo não for um alvo para a edição. Mais geralmente, para proteger a porção de direcionamento contra a degradação por nucleases é preferido que todos os nucleotídeos compreendam grupos 2'-O-metila, exceto para o nucleotídeo oposto à adenosina alvo e os ditos nucleotídeos vizinhos ao nucleotídeo oposto (uma 5' e uma 3'), que deve compreender grupos 2'-OH.

[0020] De acordo com uma modalidade preferida, uma porção de recrutamento compreende uma sequência de DNA: (CG)3N1-Nn(CG)3, em que cada um de N1a Nnpode ser o mesmo ou diferente e selecionado de guanosina, adenosina, timidina, citidina e inosina, ‘n’ está entre 2 e 20, preferivelmente entre 2 e 10, mais preferivelmente entre 2 e 5, ainda mais preferivelmente entre 3 e 5, mais preferivelmente 4 ou 5. Assim, existem três repetições CG flanqueando até 20 nucleotídeos intermediários. Esta sequência de DNA é capaz de formar uma estrutura em haste- laço. De acordo com uma modalidade preferida adicional, uma porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo é uma estrutura de DNA compreendendo a sequência: (CG)3Tn(CG)3, em que n é um número inteiro de 3 - 5, preferivelmente 4, (CGCGCGTTTTCGCGCG; SEQ ID NO: 5). Esta sequência de DNA é capaz de formar uma estrutura em haste- laço. Além disso, foi descrito na técnica que a sequência (CG)3T4(CG)3 forma uma conformação de Z-DNA sob condições fisiológicas e que esta estrutura Z-DNA é reconhecida e ligada por hADAR1 (FEBS letters 458:1 1999 Sep 10 pg 2731). Como acima para uma porção de recrutamento de dsRNA, estuma porção de recrutamento de Z-DNA pode residir a montante ou a jusante da porção de direcionamento, ou interromper a porção de direcionamento separando a porção de direcionamento em um segmento a montante e um segmento a jusante, pelo que uma porção de recrutamento de DNA fica fora do laço quando as porções de direcionamento fazem o anelamento com o RNA alvo. De acordo com esta modalidade, as bases citidina são preferivelmente 5-metilcitidina, para reduzir a potencial imunogenicidade associada com sequências CpG.

[0021] Os oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção compreendem uma porção de direcionamento (isto é, uma porção que direciona o oligonucleotídeo para a posição correta na sequência de RNA alvo) e uma porção de recrutamento (isto é, uma porção que tem como função primária recrutar a entidade de edição, por exemplo, uma ADAR, e não é necessariamente complementar, preferivelmente não complementar com o RNA alvo na região da adenosina(s) que são o alvo(s) para a edição). Esta estrutura bipartida distinguee claramente oligonucleotídeos da invenção de oligonucleotídeos conhecidos tais como aqueles descritos na técnica anterior (por exemplo, WO2014/011053, WO2005/094370 e Woolf et al, 1995. PNAS USA 92, 8298-8302) os quais são essencialmente complementares ao alvo durante seu comprimento total e não compreendem uma porção de recrutamento (certamente não uma que não seja complementar ao RNA alvo, mas em vez disso tem afinidade com a entidade de edição, como com a presente invenção). Portanto, é preferido de acordo com a invenção prover um construto de oligonucleotídeo para a edição direcionada ao sítio de um nucleotídeo em uma sequência de RNA alvo em uma célula eucariótica, o dito construto de oligonucleotídeo compreendendo: (a) uma porção de direcionamento, compreendendo uma sequência antissentido complementar à parte do RNA alvo; e (b) uma porção de recrutamento que não é complementar à sequência de RNA alvo e é capaz de ligar e recrutar uma entidade de edição de RNA naturalmente presente na dita célula e capaz de realizar a edição do dito nucleotídeo.

[0022] De acordo com uma modalidade adicional, a invenção provê um construto de oligonucleotídeo compreendendo: (c) uma porção de direcionamento, compreendendo uma sequência antissentido complementar à parte do RNA alvo; e (d) uma porção de recrutamento que é capaz de formar uma estrutura intramolecular em haste-laço, de ligação e recrutamento de uma entidade de edição de RNA naturalmente presente na dita célula e de realizar a edição do dito nucleotídeo.

[0023] De acordo ainda com outra modalidade, a porção de recrutamento pode ser um aptâmero selecionado para a ligação à entidade de edição residente na célula. Os procedimentos para selecionar os aptâmeros são bem- conhecidos na técnica. Os aptâmeros que se ligam à entidade de edição sem abolir a atividade de deaminase podem ser selecionados como porção de recrutamento e prontamente fundidos à porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção, usando qualquer tipo de ligante incluindo ligação internucleosídica regular (fosfodiéster) ou modificada (por exemplo, fosforotioato ou fosforoditioato), ligação de peptidila ou qualquer outra ligação química, tal como polietileno glicol.

[0024] De acordo ainda com outra modalidade da invenção, um anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio de ligação dos mesmos ou um anticorpo camelídeo, que se liga a uma entidade de edição residente na célula sem abolir a atividade de edição pode ser selecionado como uma porção de recrutamento e fundido à porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção.

[0025] O termo “construto de oligonucleotídeo” pode se referir a um oligonucleotídeo único, um complexo de dois ou mais oligonucleotídeos (incluindo um aptâmero) com afinidade uns com os outros (complementaridade antissentido ou de outra forma) ou um complexo de um oligonucleotídeo e uma porção de ligação proteinácea (tal como um anticorpo, fragmento de anticorpo ou domínio de ligação), que pode ser ligado diretamente ou por meio de um PEG ou outro ligante.

[0026] Assim, a presente invenção provê construtos de oligonucleotídeo e métodos para a edição sítio- específico de sequências de RNA alvo em uma célula, sem a necessidade de transduzir ou transfectar a célula com enzimas de edição geneticamente modificadas. Devido ao projeto dos construtos de oligonucleotídeo, as entidades de edição, tais como ADARs, são recrutadas e direcionadas para sítios de edição escolhidos pelo experimentador. Estes construtos de oligonucleotídeo e métodos da invenção podem ser usados convenientemente para fazer mudanças em sequências de RNA alvo, por exemplo, para reverter as mutações que estão envolvidas em ou causam doença, dessa forma, aliviando os sintomas da doença. As entidades de edição de RNA são conhecidas por editar seus substratos muito eficientemente, com frequências muito superiores às do reparo de DNA ou RNA mediado por oligonucleotídeo. Isto é de grande vantagem quando usado no tratamento da doença.

[0027] A porção de direcionamento e a porção de recrutamento em um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção podem ser diretamente adjacentes. Alternativamente, a porção de direcionamento e a porção de recrutamento podem ser ligadas covalentemente através de um ligante. O ligante pode compreender resíduos de nucleotídeo não específicos (não específicos no sentido de que eles não são necessariamente complementares à sequência de RNA alvo nem têm afinidade com uma entidade de edição residente na célula), ligantes de (oligo)peptídeo ou outros ligantes químicos. De acordo ainda com outra modalidade, a porção de direcionamento e a porção de recrutamento podem ser providas como duas sequências de oligonucleotídeo separadas - isto é, não covalentemente ligadas - compreendendo complementaridade antissentido capaz de formar um dsRNA ou uma estrutura híbrida de DNA:RNA. A formação de tal dsRNA ou construto de oligonucleotídeo híbrido pode ocorrer antes da administração à célula ou o indivíduo a ser tratado ou após a administração dos dois oligonucleotídeos separados, in vitro ou in vivo, por exemplo no indivíduo a ser tratado.

[0028] A invenção provê um método para fazer uma mudança em uma sequência de RNA alvo em uma célula eucariótica, preferivelmente uma mamífera, compreendendo as etapas de: (i) introdução na dita célula de um construto de oligonucleotídeo compreendendo uma porção de direcionamento, que compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência de RNA alvo para ligar por pareamento de nucleobase o dito RNA alvo e uma porção de recrutamento, que compreende uma sequência que é reconhecida por uma entidade de edição de RNA que está naturalmente presente na dita célula eucariótica, preferivelmente mamífera; (ii) sujeição de tempo suficiente para a entidade de edição de RNA para realizar uma reação de edição na sequência de RNA alvo; e (iii) identificação da presença da mudança na sequência de RNA. De acordo com uma modalidade preferida, a reação de edição é realizada pela dita entidade de edição em uma ou mais nucleobases dentro da região de sobreposição entre a sequência de RNA alvo e a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo. De acordo com uma modalidade preferida, a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo compreende uma incompatibilidade oposta à nucleobase(s) a ser editada. De acordo com uma modalidade preferida adicional, a reação de edição compreende uma conversão de A a I por desaminação da nucleobase adenosina na sequência de RNA alvo. Preferido de acordo com o último método é um em que o construto de oligonucleotídeo compreende uma C oposta à adenosina a ser editada. De acordo com outro método preferido, a reação de edição é uma conversão de C a U através de desaminação da nucleobase citidina; prefere-se, de acordo com o último método, que a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo compreenda uma A oposta a C na sequência de RNA alvo a ser editada.

[0029] A invenção também provê um método para a edição de uma sequência de RNA alvo CFTR mutante em uma célula humana, compreendendo as etapas de: (i) introdução na dita célula de um construto de oligonucleotídeo compreendendo uma porção de direcionamento que é complementar à sequência de RNA alvo CFTR e uma porção de recrutamento capaz de recrutar uma entidade de edição hADAR; e (ii) sujeição de tempo suficiente para a entidade de edição de hADAR para editar nucleobases em ou próximo a uma região de sobreposição entre a sequência de RNA alvo e a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo. Em uma modalidade preferida de acordo com a invenção, o RNA alvo CFTR mutante (um pré-mRNA ou mRNA) compreende uma mutação de G551D e a reação de edição faz com que uma adenosina seja convertida em uma inosina, dessa forma, revertendo a mutação de G551D na dita sequência de RNA alvo. Existem dois códons para ácido aspártico (D); GAU e GAC. Consequentemente, um paciente com fibrose cística com a mutação de G551D pode ter mutação GAU ou GAC na posição que corresponde ao códon 551 da proteína CFTR. A desaminação da A na segunda posição do códon levará à formação de uma I, que será lida pela maquinaria translacional como uma G. Consequentemente, a desaminação da A na segunda posição do códon mutado cria GIU ou GIC, respectivamente, os quais são de fato lidos como GGU e GGC. Ambos GGU e GGC codificam glicina, de modo que a edição de RNA de ambos os códons G551D mutados por uma adenosina deaminase renderá uma glicina apropriada que codifica tripleto, revertendo eficazmente a mutação para uma proteína CFTR normal.

[0030] Tornar-se-á claro a um versado na técnica que a mutação de G551D é usada como um exemplo somente e de maneira alguma para limitar o escopo da invenção. Existem literalmente mulhares de doenças genéticas causadas por substituições de par de base único que são passíveis de reversão usando construtos de oligonucleotídeo e métodos de acordo com a invenção, recrutando uma deaminase, tal como as adenosinas deaminases descritas em detalhe aqui ou uma citidina deaminase.

[0031] O recrutamento de citidina deaminase para um sítio alvo trabalha da mesma maneira que para as adenosinas deaminases hADAR1 e hADAR2. No entanto, as citidinas deaminases têm exigências de ligação diferentes e reconhecer estruturas diferentes em suas sequências de RNA alvo que determinam a edição da citidina. Uma citidina aminase particularmente bem-estudada é Apobec1 humana. O princípio geral de edição de RNA usando um construto de oligonucleotídeo para direcionar um sítio de edição e recrutar uma entidade de edição residente, naturalmente presente permanece o mesmo para as citidinas deaminases e é parte da invenção descrita e reivindicada aqui.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0032] Os construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção são únicos pelo fato de que eles combinam duas funções essenciais; eles se ligam naturalmente às presentes entidades de edição de RNA com uma determinada afinidade e eles se ligam através de pareamento de bases complementares antissentido (Watson-Crick) ao sítio na sequência de RNA alvo onde a edição deve ocorrer, dessa forma, recrutando as entidades de edição de RNA para o sítio de edição. Uma entidade “naturalmente presente” está presente em uma célula sem a necessidade de intervenção humana anterior. Consequentemente, uma enzima truncada ou recombinante (tal como descrito em Montiel-Gonzalez et al., e Vogel et al.) não está naturalmente presente em uma célula; elas podem estar presentes em uma célula, mas somente após a intervenção humana (transdução ou transfecção). A invenção pode operar, assim, usando entidades de edição de RNA do tipo selvagem que são endógenas a uma célula.

[0033] Entender-se-á que tal recrutamento não precisa ser quantitativo pelo fato de que todas as entidades de edição de RNA residentes na célula serão recrutadas para a edição da sequência de RNA alvo de escolha. Espera-se e também considera desejável se uma porcentagem de entidades de edição residentes permanecer disponível para agir sobre seus substratos naturais. Em adição, em determinadas modalidades, por exemplo, onde a porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo é uma sequência de dsRNA compreendendo adenosinas, o domínio catalítico da entidade de edição de RNA, uma vez recrutado pelo construto de oligonucleotídeo, pode agir sobre a porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo, assim como sobre o substrato de edição na porção de dsRNA criada pelo anelamento da porção de direcionamento com a sequência complementar na sequência de RNA alvo. Isto não é um problema sob todas as circunstâncias, visto que pode haver aplicações onde a edição em excesso é desejável. Nos casos onde a edição em excesso deve ser evitada, uma porção de direcionamento pode ser quimicamente modificada em sua totalidade, por exemplo, pela provisão de todos os nucleotídeos com uma porção de açúcar 2’-O-metilada, exceto no nucleotídeo(s) oposto à adenosina(s) alvo e os dois nucleotídeos (um 5' e um 3') flanqueando cada nucleotídeo oposto à adenosina alvo. Em geral, uma adenosina em um RNA alvo pode ser protegida contra a edição pela provisão de um nucleotídeo oposto com um grupo 2'-OMe ou pela provisão de uma guanina ou adenine como base oposta, visto que estas duas nucleobases são capazes de prevenir a edição da adenosina oposta.

Os construtos de oligonucleotídeo

[0034] A porção de recrutamento dos construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção é caracterizada por um dsRNA ou estrutura de dsDNA. Uma maneira de estabelecer uma estrutura de oligonucleotídeo de filamento duplo em uma molécula única é pelo estabelecimento de uma sequência palindrômica que é capaz de se dobrar sobre pelo menos parte de seu comprimento. Tais estruturas em haste- laço podem surgir de (1) sequências de RNA artificiais capazes de formar uma estrutura em haste-laço, (2) sequências de DNA artificiais capazes de formar uma estrutura em haste-laço, (3) sequências de RNA tiradas dos RNAs de substrato conhecidos para a edição de entidades residentes na célula. Por exemplo, um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode compreender uma porção de recrutamento similar em sequência ao sítio de reconhecimento natural para a atividade de edição ou ele pode imitar aquele sítio de reconhecimento em um modo similar ao aptâmero. Cada uma destas modalidades será descrita em mais detalhes abaixo. Em adição, aqueles versados na técnica serão capazes de fazer porções de projeto e recrutamento com base em cada uma das modalidades descritas em maiores detalhes. Os métodos para projetar e testar estruturas de ácido nucleico que têm afinidade para proteínas são, como tais, bem-conhecidos na técnica.

[0035] A porção de direcionamento de um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção deve ter suficiente sobreposição e complementaridade ao sítio alvo para permitir a hibridização específica da sequência do construto de oligonucleotídeo com a sequência de RNA alvo. O comprimento e a quantidade de sobreposição podem variar de alvo a alvo, mas podem ser rotineiramente determinados por uma pessoa tendo habilidade comum na técnica. Em geral, sequências mais longas proveem mais especificidade - e consequentemente menores efeitos inespecíficos, por exemplo, através de ligação não específica - e ligação mais forte ao sítio alvo. A porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção normalmente deve ser mais longa do que 10 nucleotídeos, preferivelmente mais do que 11, 12, 13, 14, 15, 16 ainda mais preferivelmente mais do que 17 nucleotídeos. A porção de direcionamento é preferivelmente mais curta do que 200 nucleotídeos, mais preferivelmente mais curta do que 100 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente mais curta do que 50 nucleotídeos, ainda mais preferível 25 ou menos nucleotídeos.

[0036] De acordo com uma modalidade, a invenção provê um construto de oligonucleotídeo para fazer uma mudança desejada em uma ou mais posições específicas em uma sequência de RNA alvo em uma célula, pelo recrutamento de uma entidade de edição de RNA naturalmente presente na dita célula, tendo a sequência 5’-X-(Y-X')n-L-Z-3’, em que X é complementar à sequência de RNA alvo a jusante da posição específica, X'é complementar à sequência de RNA alvo a montante da posição específica, Y compreende um ou mais nucleotídeos (por exemplo, até 10, preferivelmente entre 1 e 5, mais preferivelmente entre 1 e 3, tal como 1 ou 2) que não é/são complementares à sequência de RNA alvo, n é um número inteiro de 1 a 10 (preferivelmente de 1 a 5, mais preferivelmente de 1 a 3 ou 1), L é uma sequência ligante que é opcional e pode compreender qualquer número de nucleotídeos incluindo zero, e Z é uma sequência que é reconhecida por e se liga à dita entidade de edição de RNA. L também pode consistir em uma ligação química diferente, tal como uma ligação de (oligo)peptídeo ou ligação de PEG.

[0037] Quando n é maior do que ou igual a 1, a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo não é perfeitamente complementar à sequência de RNA alvo, mas em vez disso compreende uma ou mais incompatibilidades, ou bases oscilantes, que servem para intensificar a especificidade, pelo aumento da frequência de edição do nucleotídeo oposto na sequência de RNA alvo. Quando n é dois ou mais, X' ocorre mais do que uma vez e dois ou mais X' podem ser idênticos dependendo da sequência das bases complementares na sequência de RNA alvo, mas em toda probabilidade, os dois ou mais X'não são idênticos. Quando n é 0, a porção de direcionamento é perfeitamente complementar à sequência de RNA alvo em todo o comprimento da porção de direcionamento, isto é, sem quaisquer incompatibilidades com a sequência de RNA alvo. Esta modalidade é suscetível de causar a edição de RNA por adenosina deaminase de uma maneira não específica, significando todas as adenosinas na região de sobreposição entre a porção alvo do construto de oligonucleotídeo e a sequência de RNA alvo são igualmente suscetíves de serem convertidos em inosina. Qualquer edição não específica de adenosinas pode ser limitada, ao se certificar de que as adenosinas que não devem ser direcionadas ou pelo menos em uma menor frequência, a encontrar um nucleotídeo oposto com uma porção de 2’-O ribose modificada, tal como um 2'-OMe, visto que o último é conhecido por reduzir a eficiência de edição da adenosina oposta. Alternativa ou adicionalmente, uma base oposta sendo uma guanina ou adenina pode ser provida visto que estas nucleobases geralmente impedem a desaminação da base oposta.

[0038] De acordo com outra modalidade, a invenção provê um construto de oligonucleotídeo para fazer uma mudança desejada em uma posição específica em uma sequência de RNA alvo em uma célula, pelo recrutamento de uma entidade de edição de RNA naturalmente presente na dita célula, tendo a sequência 5’-Z-L-(X'-Y)n-X-3’, em que X é complementar à sequência de RNA alvo a montante da posição específica, X'é complementar à sequência de RNA alvo a jusante da posição específica, Y compreende um ou mais nucleotídeos que não é/são complementares à sequência de RNA alvo (por exemplo, até 10, preferivelmente de 1 a 5, mais preferivelmente de 1 a 3, tal como 1 ou 2), n é um número inteiro de 1 a 10 (preferivelmente de 1 a 5, mais preferivelmente de 1 a 3, ou 1), L é uma sequência ligante que é opcional e pode compreender qualquer número de nucleotídeos incluindo zero, e Z é uma sequência que é reconhecida por e se liga à dita entidade de edição de RNA. L também pode consistir em uma ligação química diferente, tal como uma ligação de (oligo)peptídeo.

[0039] Quando n é maior do que ou igual a 1, a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo não é perfeitamente complementar à sequência de RNA alvo, mas em vez disso compreende uma ou mais incompatibilidades, ou bases oscilantes, que servem para intensificar a especificidade, pelo aumento da frequência de edção do nucleotídeo oposto na sequência de RNA alvo. Quando n é dois ou mais, X' ocorre mais do que uma vez e dois ou mais X’ podem ser idênticos dependendo da sequência das bases complementares na sequência de RNA alvo, mas em toda probabilidade, os dois ou mais X'não são idênticos. Quando n é 0, a porção de direcionamento é perfeitamente complementar à sequência de RNA alvo em todo o comprimento da porção de direcionamento, isto é, sem quaisquer incompatibilidades com a sequência de RNA alvo. Esta modalidade é suscetível de causar edição de RNA por adenosina deaminase de uma maneira não específica, significando que todas as adenosinas na região de sobreposição entre a porção alvo do construto de oligonucleotídeo e a sequência de RNA alvo são igualmente suscetíveis de serem convertidas em inosina. Qualquer edição não específica de adenosinas pode ser limitada ao se certificar de que as adenosinas, que não devem ser direcionadas ou pelo menos em uma menor frequência, encontrem um nucleotídeo oposto com uma porção de 2’-O ribose modificada, tal como um 2’-OMe, visto que o último é conhecido por reduzir a eficiência de edição da adenosina oposta.

[0040] Um oligonucleotídeo da invenção pode ser uma molécula híbrida de DNA/RNA, isto é, incluindo ambos deoxirribo- e ribonucleotídeos dentro do mesmo oligonucleotídeo.

Porção de recrutamento: modalidades preferidas

[0041] A porção de recrutamento deve ser longa o suficiente para prover uma estrutura, tal como uma estrutura de RNA ou DNA em haste-laço, preferivelmente na conformação Z-RNA ou Z-DNA, que é reconhecida pela entidade de edição de acordo com a invenção. Se a entidade de edição for hADAR1, sequências de ácido nucleico são conhecidas que proveem o reconhecimento e ligação pelo domínio Z-alfa da variante de 150kDa de hADAR1.

Porções de recrutamento de estruturas em haste-laço de RNA ou DNA artificiais

[0042] Um exemplo de uma estrutura em haste-laço de RNA ou DNA artificial, sendo uma porção de recrutamento preferida de acordo com a invenção, compreende a sequência (RY ou YR)nNm(RY ou YR)n, em que R, Y e N representam ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos e em que R é A ou G, Y é T, U ou C, N é A, G, C, T ou U, n é 3 ou mais, m é 1 ou mais (preferivelmente m é 2 ou mais, mais preferivelmente m é 3 ou mais, ainda mais preferivelmente m é 4 ou mais) e em que N forma um laço e as duas sequências (RY)n ou (YR)n formam uma estrutura em haste de dsRNA (quando todos os nucleotídeos são ribonucleotídeos) ou estrutura de dsDNA (quando todos os nucleotídeos são desoxirribonucleotídeos) por meio de pareamento de nucleobase complementar Watson-Crick. A porção de recrutamento preferivelmente consiste em todos os ribonucleotídeos ou todos os desoxirribonucleotídeos, embora uma porção de recrutamento compreendendo ambos ribo- e desoxirribonucleotídeos não sejam excluidos.

[0043] Exemplos especialmente preferidos de porções de recrutamento conhecidas por se ligarem a hADAR1 são (i) as estruturas de DNA representadas por (CG)nTm(CG)n em que n é 3 e m é 4 ou mais, preferivelmente 4 ou 5, que tem uma tendência de formar as assim chamadas estruturas Z-DNA, (ii) as estruturas de RNA representadas pela fórmula (RY)nNm(RY)n, em que R é A ou G, Y é C ou U, N é qualquer A, G, C, ou U e em que N pode todo ser o mesmo ou diferente, n é 3 ou mais, m é 4 ou mais, preferivelmente 4 ou 5, que tem uma tendência de formar estruturas Z-RNA. As estruturas Z- DNA e Z-RNA diferem de suas contrapartes mais comuns (para dsDNA, a conformação B é a forma mais comum, enquanto para dsRNA, a forma A é mais comum) pelo fato de que a hélice dupla está à esquerda quando oposta às formas A e B, que estão ambas à direita e as nucleobases na estrutura principal de Z-DNA e Z-RNA estão dispostas espacialmente em uma disposição em zig-zag (consequentemente o prefixo “Z”).

Porções de recrutamento de RNAs de substrato natural

[0044] Estruturas em haste-laço e protuberâncias formadoras de sequências de dsRNA não formadoras de Z-RNA também entram em jogo como porções de recrutamento. Várias estruturas de dsRNA, com pares de base em haste-laço e incompatibilidades ou oscilantes, que não os GluR-B descritos em alguns detalhes acima, foram descritas na técnica que interagem com o domínio de ligação de entidades de edição, tais como GluR-C e GluR-D, receptores de serotonina 5-HT2c e vários pri- e pré-miRNAs e miRNAs. Os laços preferidos nas porções de recrutamento dos construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção se conformam às sequências conservadas tetra- ou pentaloop UNCG, em que N pode ser qualquer A, G, C ou U ou GCUMA, em que M é A ou C, respectivamente. Quando a porção de recrutamento compreende um segmento em haste-laço de um sítio de edição de RNA conhecido na técnica, a haste pode ser tirada “como é” ou pode ser alterada em sequência ou comprimento, encurtada ou modificada de alguma outra maneira para alterar suas características, tais como afinidade com a entidade de edição de RNA ou por razões de capacidade de fabricação ou manuseamento, custo ou qualquer outra razão, desde que a função de recrutamento não seja totalmente prejudicada. Estas estruturas podem ser feitas prontamente in vitro e testadas quanto à sua capacidade de se ligar a, recrutar e redirecionar entidades de edição. Várias entidades de edição são conhecidas na técnica que podem ser obtidas comercialmente, incluindo hADARs, e testadas em ensaios quanto à ligação a dsRNA ou estruturas de dsDNA em construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção. Tais ensaios estão prontamente disponíveis àqueles versados na técnica de interações de proteína-ácido nucleico e incluem um ensaio de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA).

[0045] Dois exemplos de sequências de RNA editadas conhecidas que foram caracterizadas em grandes detalhes estão na subunidade B do receptor de glutamato (GluR-B) subtipo ácido 3-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazol propiônico (AMPA). Este sistema de modelo compreende dois sítios frequentemente editados em que AGA codificada por DNA é editada para IGA, resultando em uma substituição de arginina-a-glicina (sítio R/G) e uma substituição distinta de glutamina-a-arginina (sítio Q/R). O sítio de GluR-B (R/G) é conhecido por compreender uma estrutura em haste- laço consistindo em 71 nucleotídeos compreendendo 3 incompatibilidades, 2 pares de base oscilantes A-C e um G•U. De modo interessante, o laço consiste em uma estrutura GCUAA de estrutura pentaloop bem-conservada que se conforma a uma sequência GCUMA filogeneticamente conservada, em que M é A ou C (Aruscavage P.J. & Bass B.L. RNA. 2000; 6: 257269). Parece haver alguma preferência para a edição das duas adenosinas oscilantes, com uma eficiência crescente quando a base oposta à adenosina editada é selecionada de citidina ou uridina, a citidina sendo preferida.

[0046] Esta estrutura pode ser usada convenientemente como é ou ser adaptada quando usada em um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção, como uma porção de recrutamento, pela redução ou aumento do número de pares de nucleobase oscilantes na haste para modificar a especificidade de edição e/ou redirecionar a edição para o sítio(s) preferido na sequência de RNA alvo. Em adição ou alternativamente, o sítio de reconhecimento do GluR-B para hADAR1 pode ser modificado pelo encurtamento da haste sem abolir o reconhecimento completamente. Tal encurtamento pode ser conveniente de uma perspectiva de boa capacidade de fabricação ou custo e os similares.

[0047] Um exemplo de uma porção de recrutamento derivada do domínio GluR-B, sendo uma modalidade preferida de acordo com a invenção, compreende a sequência: 5'-(AUANa)nUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA(NbUAU)n-3', em que Na e Nbsão, cada um, nucleotídeos únicos os quais podem ser A, G, C ou U, contanto que Nae Nbformem um par de base incompatível mediante a formação de uma estrutura em haste- laço, e n seja 1 ou 0 (isto é, SEQ ID NOs: 6 & 7).

[0048] Outra porção de recrutamento preferida compreende ou consiste na sequência 5'-GUGGNcAUANaUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANbUAUNdCCAC-3' (SEQ ID NO: 25), onde: Na, Nb, Nc, e Ndcada um pode ser um nucleotídeo A, G, C ou U, contanto que Na& Nbformem um par de base incompatível e Nc& Ndformem um par de base incompatível mediante a formação de haste-laço; e pelo que o pentanucleotídeo gcuaa forma um laço e as sequências a montante e a jusante adjacentes a gcuaa formam uma haste por pareamento de bases.

[0049] A porção de recrutamento pode ser ligada na extremidade 5' ou 3' a uma porção de direcionamento, opcionalmente por meio de um ligante “L”, que compreende um ou mais nucleotídeos, um oligopeptídeo ou outro ligante químico, tal como polietileno glicol (PEG).

Modificação química dos constructos de oligonucleotídeos

[0050] Vários produtos químicos e modificação são conhecidos no campo de oligonucleotídeos que podem ser prontamente usados de acordo com a invenção. As ligações internucleosídicas regulares entre os nucleotídeos podem ser alteradas por mono- ou ditioação das ligações de fosfodiéster para render ésteres de fosforotioato ou ésteres de fosforoditioato, respectivamente. Outras modificações das ligações internucleosídicas são possíveis, incluindo amidação e ligantes de peptídeo. O açúcar ribose pode ser modificado pela substituição da porção 2'-O com uma alquila inferior (C1-4, tal como 2’-O-Me), alquenil (C2-4), alquinil (C2-4), metoxietil (2’-MOE), ou outro substituinte. Os substituintes preferidos do grupo 2’ OH são um grupo metila, metoxietila ou 3,3’-dimetilalila. I ultimo é conhecido por sua propriedade de inibir a sensibilidade à nuclease devido a seu volume, enquanto melhora a eficiência de hibridização (Angus & Sproat FEBS 1993 Vol. 325, no. 1, 2, 123-7). Alternativamente, sequências de ácido nucleico travadas (LNAs), compreendendo uma ligação em ponte 2'-4' intramolecular (geralmente uma ponte de metileno entre o 2'oxigênio e 4' carbono) dentro do anel de ribose, podem ser aplicadas. As nucleobases purina e/ou nucleobases pirimidina podem ser modificadas para alterar suas propriedades, por exemplo, por aminação ou desaminação dos anéis heterocíclicos. Os produtos químicos e formatos exatos podem depender do construto de oligonucleotídeo a construto de oligonucleotídeo e de aplicação à aplicação e podem ser trabalhados de acordo com os desejos e preferências daqueles versados na técnica.

Comprimento

[0051] Os construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção podem compreender entre 20 e várias centenas de nucleotídeos. Por razões práticas tais como capacidade de fabricação e custo, os construtos de oligonucleotídeo devem ser preferivelmente mais curtos do que 200 nucleotídeos. Preferivelmente, os construtos de oligonucleotídeo têm entre 20 e 100 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente entre 24 e 60 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente entre 30 e 50 nucleotídeos. A porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo preferivelmente compreende mais do que 10 nucleotídeos, preferivelmente mais do que 11, 12, 13, 14, 15, 16 ainda mais preferivelmente mais do que 17 nucleotídeos. Porções de direcionamento mais longas proveem mais especificidade para o sítio alvo da sequência de RNA a ser editada, menos efeitos inespecíficos devido à ligação não intencional (inespecífica) assim como mais espaço para criar estruturas secundárias, tais como estruturas em haste-laço dentro da porção de direcionamento por si só, incompatibilidades ou bases oscilantes (devido a incompatibilidades com uma ou mais da(s) base(s) complementar(es) na sequência de RNA direcionada em ou próximo ao sítio a ser editado) e assim por diante. Porções de direcionamento preferidas são complementares à sequência de RNA alvo em todo o comprimento da porção de direcionamento exceto pela incompatibilidade oposta ao nucleotídeo a ser editado e, opcionalmente, uma ou duas bases oscilantes.

Conformação

[0052] Sabe-se na técnica que entidades de edição de RNA, tais como hADARs, editam estruturas de dsRNA com especificidade variável, dependendo de vários fatores. Um fator importante é o grau de complementaridade dos dois filamentos que constituem a sequência de dsRNA. A complementaridade perfeita dos dois filamentos, geralmentem faz com que o domínio catalítico de hADAR deamine adenosinas de uma maneira não discriminativa, reagindo mais ou menos com qualquer adenosina que ele encontre. A especificidade de hADAR1 pode ser aumentada somente para converter adenosinas particulares ao assegurar uma incompatibilidade no dsRNA, pela provisão de uma porção de direcionamento que compreende uma incompatibilidade oposta à adenosina a ser editada. A incompatibilidade é preferivelmente criada pela provisão de uma porção de direcionamento tendo uma citidina ou uridina, mais preferivelmente uma citidina, oposta à adenosina a ser editada. Mediante a desaminação da adenosina no filamento alvo, o filamento alvo obterá uma inosina que, para a maioria dos processos bioquímicos, é “lida” pela maquinaria bioquímica da célula como uma G. Consequentemente, após a conversão de A em I, a incompatibilidade foi resolvida, porque I é perfeitamente capaz de pareamento de bases com a C oposta na porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção. Após a incompatibilidade ter sido resolvida devido à edição, o substrato é liberado e o complexo da entidade de edição do construto de oligonucleotídeo é liberado da sequência de RNA alvo, que a seguir se torna disponível para processos bioquímicos a jusante, tais como emenda e translação.

[0053] O nível desejado de especificidade de edição da sequência de RNA alvo pode depender de aplicação à aplicação. Seguindo as instruções no presente pedido de patente, aqueles versados na técnica serão capazes de projetar a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo de acordo com suas necessidades e, com alguma tentativa e erro, obter o resultado desejado.

[0054] A porção de direcionamento dos construtos de oligonucleotídeo da invenção geralmente compreenderão os nucleotídeos normais A, G, U e C, mas podem incluir também inosina (I), por exemplo, em vez de um ou mais nucleotídeos G. Em uma porção de recrutamento de um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção G também pode ser substituída por uma I, embora se deva ter cuidado para que uma I na haste ou no laço não interfira na formação de conformações Z-DNA ou Z-RNA naquelas modalidades onde isto é desejável.

Especificidade de Edição

[0055] Para prevenir edição indesejada de adenosinas na sequência de RNA alvo na região de sobreposição com o construto de oligonucleotídeo, a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo pode ser quimicamente modificada. Mostrou-se na técnica que 2'-O- metilação da porção ribosila de um nucleosídeo oposto a uma adenosina na sequência de RNA alvo reduz dramaticamente a desaminação daquela adenosina por ADAR (Vogel et al. 2014 Angewandte Chemie Int. Ed. 53, 6267-71). Consequentemente, ao incluir nucleotídeos 2'-metóxi (2’-OMe) na posição desejada do construto de oligonucleotídeo, a especificidade de edição pode ser dramaticamente melhorada. Está previsto que outras substituições 2’-O da porção ribosila, tais como grupos 2’-metoxietila (2’-MOE) e 2’-O-dimetilalila também podem reduzir edição indesejada da adenosina (oposta) correspondente na sequência de RNA alvo. Outras modificações químicas estão prontamente disponíveis à pessoa versada na técnica de síntese e projeto de oligonucleotídeo. A síntese de tais construtos de oligonucleotídeo quimicamente modificados e o teste deles em métodos de acordo com a invenção não constitui um incômodo indevido e outras modificações são abrangidas pela presente invenção.

Entidades de edição

[0056] As entidades de edição serão geramente proteináceas por natureza, tais como as enzimas ADAR encontradas em metazoários, incluindo mamíferos. As entidades de edição também podem compreender complexos de ácido nucleico(s) e proteínas ou peptídeos, tais como ribonucleoproteínas. As enzimas de edição podem compreender ou consistir em ácido nucleico(s) somente, tais como robozimas. Todas tais entidades de edição são abrangidas pela presente invenção, desde que elas sejam recrutadas pelos construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção. Preferivelmente, a entidade de edição é uma enzima, mais preferivelmente uma adenosina deaminase ou uma citidina deaminase, ainda mais preferivelmente uma adenosina deaminase. Quando a entidade de edição é uma adenosina deaminase, Y é preferivelmente uma citidina ou uma uridina, mais preferivelmente uma citidina. Aquelas de amior interesse são as ADARs, hADAR1 e hADAR2 humanas, incluindo quaisquer isoformas das mesmas tais como hADAR1 p110 e p150.

[0057] As enzimas de edição de RNA conhecidas na técnica, para as quais construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção podem ser convenientemente projetados, incluem as adenosina deaminases agindo no RNA (ADARs), tais como hADAR1 e hADAR2 em seres humanos ou células humanas e citidina deaminases. ADAR3 humana (hADAR3) foi descrita na técnica anterior, mas supostamente não tem qualquer atividade de deaminase.

[0058] Sabe-se que hADAR1 existe em duas isoformas; uma versão indzível por intereferon de 150 kDa de comprimento e uma versão mais curta de 100 kDa, que é produzida através de emenda alternativo de um pré-mRNA comum. De modo interessante, apenas a isoforma mais longa é capaz de se ligar à estrutura Z-DNA que pode ser compreendida na porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção. Consequentemente, o nível da isoforma de 150 kDa presente na célula pode ser influenciado por interferon, particularmente interferon-gama (IFN-gama). hADAR1 também é induzível por TNF-alfa. Isto provê uma oportunidade para desenvolver a terapia de combinação, por meio da qual interferon-gama ou TNF-alfa e construtos de oligonucleotídeo compreendendo Z-DNA como porção de recrutamento de acordo com a invenção são administrados a um paciente como um produto de combinação ou como produtos separados, seja simultaneamente ou subsequentemente, em qualquer ordem. Determinadas condições de doença já podem coincidir com níveis aumentados de IFN-gama ou TNF-alfa em determinados tecidos de um paciente, criando oportunidades adicionais de fazer a edição mais específica para os tecidos doentes.

[0059] Ambas a porção de direcionamento e a porção de recrutamento podem compreender ou consistir em nucleotídeos tendo modificações químicas que alteram a resistência à nuclease, alteram a afinidade de ligação (expressa como temperatura de fusão) ou outras propriedades. Exemplos de modificações químicas são modificações da porção açícar, incluindo por reticulação de substituintes dentro da porção açúcar (ribose) (por exemplo, como em LNA ou ácidos nucleicos travados), por substituição do átomo 2’-O com grupos alquila (por exemplo 2’-O-metila), alquinila (2’-O-alquinila), alquenila (2’-O- alquenila), alcoxialquila (por exemplo metoxietila, 2’- MOE), tendo um comprimento como especificado acima e os similares. Em adição, o grupo fosfodiéster da estrutura principal pode ser modificado por tioação, ditioação, amidação e os similares para render ligações internucleosídicas de fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato, etc.. As ligações internucleotídicas podem ser substiruídas por completo ou em parte por ligações peptídicas para render sequências de ácido peptídeo- nucleico e os similares. Alternativamente ou em adição, as nucleobases podem ser modificadas por (des)aminação para render inosina ou 2’6’-diaminopurinas e os similares.

[0060] Uma modificação adicional pode ser metilação do C5 na porção citidina do nucleotídeo para reduzir propriedades imnogênicas potenciais conhecidas por serem associadas com sequências CpG.

[0061] A arquitetura dos construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode variar de grampos “de uma perna” (Figuras 1 e 2), a grampos “de duas pernas” (Figura 3), por meio dos quais as pernas compreendem a porção ou porções de direcionamento e o corpo ou núcleo do grampo provê a porção de recrutamento (Figuras 1 - 3). A perna ou pernas do construto de oligonucleotídeo proverão incompatibilidade ou nucleobases oscilantes que representam o sítio oposto do sítio de edição, por exemplo, uma adenosina ou citidina a ser editada, no RNA alvo. Por exemplo, no caso do construto de oligonucleotídeo recrutar a atividade de ADAR para editar uma conversão de A em I no RNA alvo, a incompatibilidade ou oscilação podem compreender um resíduo de adenosina, um de guanina, um de uridina ou um de citidina, preferivelmente um resíduo de citidina. Exceto para a incompatibilidade ou oscilação oposta ao sítio de edição, a porção de direcionamento será geralmente perfeitamente complementar ao RNA alvo, embora um número limitado de combinações imperfeitas, tais como bases oscilantes ou incompatíveis, possa ser permitido sem prejudicar de forma inaceitável a especificidade e/ou a resistência de ligação entre o construto de oligonucleotídeo e a sequência de RNA alvo. A haste do grampo pode consistir em um alongamento perfeitamente complementar de nucleotídeos, formando uma estrutira de RNA de filamento duplo sobre a totalidade de seu comprimento. Alternativamente, a haste do grampo pode compreender um ou mais nucleotídeos opostos oscilantes ou não compativeis, desde que o reconhecimento do construto de oligonucleotídeo pela atividade de edição não seja prejudicado de forma inaceitável. Deve-se entender que o funcionamento da atividade de edição na célula em seus sítios de edição naturais pode ser reduzido como uma consequência do recrutamento das entidades responsáveis pela atividade de edição pelos construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção. Será compreendido por uma pessoa versada na técnica que a extensão na qual as entidades de edição dentro da célula são redirecionadas a outros sítios alvo pode ser regulada ao variar a afinidade da porção de recrutamento dos construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção com o domínio de reconhecimento da entidade de edição. Isto pode ser feito pela redução da afinidade da porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo com a entidade de edição através de qualquer uma ou combinação de maneiras, incluindo pela mudança da sequência da haste, do tamanho ou estrutura (sequência, produto químico da estrutura principal, ribosila ou nucleobase) do laço ou uma combinação de ambos. A modificação exata pode ser determinada através de alguma tentativa e erro e/ou através de métodos computacionais com base em interações estruturais entre a porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo e o domínio de reconhecimento da entidade de edição.

[0062] Em adição ou alternativamente, o grau de recrutamento e redirecionamento da entidade de edição residente na célula pode ser regulado pela dosagem e pelo regime de dosagem do construto de oligonucleotídeo. Isto é algo a ser determinado pelo experimentador (in vitro) ou pelo clínico, geralmente, em ensaios clínicos de fase I e/ou II.

[0063] Preferivelmente, a invenção provê o uso de um construto de oligonucleotídeo que consiste em um oligonucleotídeo único (Figura 1, Figura 2A, Figura 3) compreendendo ambas a porção de direcionamento e a porção de recrutamento para a edição de sequências de ácido nucleico. No entanto, um construto de oligonucleotídeo compreendendo o uso de dois oligonucleotídeos (Figura 2B), por exemplo, um compreendendo a porção de direcionamento e um compreendendo a porção de recrutamento, está certamente dentro do âmbito da presente invenção. Consequentemente, de acordo com outra modalidade, a invenção provê dois oligonucleotídeos separados, um compreendendo a porção de direcionamento e o outro compreendendo a porção de recrutamento, pelo que os dois oligonucleotídeos são projetados de tal maneira que eles tenham afinidade uns com os outros, por exemplo, pelo pareamento de bases antissentido Watson-Crick entre as duas porções funcionais ou de uma sequência dem um direcionamento específico ou função de recrutamento, por exemplo, uma sequência ligante. Tal sistema de dois componentes pode ter vantagens em termos de flexibilidade, adaptabilidade (por exemplo, dentro do contexto da medicina personalizada), capacidade de fabricação, custo dos produtos ou de outra forma. Os dois (ou mais) oligonucleotídeos de acordo com o sistema de múltiplos componentes não têm necessariamente que separar as funções diferentes (direcionamento e recrutamento) estritamente. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem dar origem à função de direcionamento e recrutamento somente após a montagem em um complexo. No caso dos dois oligonucleotídeos anelarem, formando uma porção de dsRNA, eles podem realmente criar a função de recrutamento mediante o anelamento. O anelamento é uma maneira de formar um complexo, mas ficará claro que existem outras maneiras pelas quais dois componentes (ou mais) de oligonucleotídeo podem se reunir, dessa forma, ligando a função de direcionamento e a de recrutamento. Os construtos de oligonucleotídeo compreendendo mais do que dois oligonucleotídeos não são excluídos do escopo da presente invenção, embora quanto maior número de oligonucleotídeos por construto, mais complexo é o sistema em termos de fabricação, analítica, formulação, administração ou outros aspectos de manuseamento, incluindo logística e custos.

A célula mamífera

[0064] A invenção se refere à modificação de sequências de RNA alvo em células eucarióticas, preferivelmente de metazoário, mais preferivelmente mamíferas. Em princípio, a invenção pode ser usada com células de quaisquer espécies de mamíferos, mas ela é preferivelmente usada com uma célula humana.

[0065] A invenção pode ser usada com células de qualquer órgão, por exemplo, pele, pulmão, coração, rim, fígado, pâncreas, intestino, músculo, glândula, olho, cérebro, sangue e os similares. A invenção é particularmente adequada para a modificação de sequências em células, tecidos ou órgãos implicados em um estado de doença de um indivíduo (humano). Tais células incluem, entre outros, células epiteliais do pulmão ou do trato gastrointestinal, células dos órgãos reprodutores, células musculares, células do olho, células da pele, células dos tecidos e órgãos tais como fígado, rim, pâncreas, células imunes, células cancerígenas, células glandulares, células do cérebro e os similares.

[0066] A invenção também pode ser usada com células mamíferas que não estão naturalmente presentes em um organismo, por exemplo, com uma linhagem celular ou com uma célula estaminal embrionária (ES).

[0067] A invenção pode ser usada com vários tipos de célula estaminal, incluindo células estaminais pluripotentes, células estaminais totipotentes, células estaminais embrionárias, células estaminais pluripotentes induzidas, etc.

[0068] A célula pode ser localizada in vitro ou in vivo. Uma vantagem da invenção é que ela pode ser usada com células in situ em um organismo vivo, mas ela também pode ser usada com células em cultura. Em algumas modalidades, as células são tratadas ex vivo e são então introduzidas em um organismo vivo (por exemplo, reintroduzido em um organismo do qual elas foram originalmente derivadas).

[0069] A invenção também pode ser usada para editar sequências de RNA alvo em células dentro de um assim chamado organoide. Os organóides podem ser considerados tecidos derivados in vitro tridimensionais, mas são acionados usando condições específicas para gerar tecidos individuais, isolados (por exemplo, vide Lancaster & Knoblich, Science 2014, vol. 345 no. 6194 1247125). Em uma configuração terapêutica, eles são úteis porque eles podem ser derivados in vitro de células de um paciente e os organóides podem ser então reintroduzidos no paciente como material autólogo que é menos suscetível de ser rejeutado do que um transplante normal. Assim, de acordo com outra modalidade preferida, a invenção pode ser praticada em organóides desenvolvidos de amostras de tecido tiradas de um paciente (por exemplo, de seu trato gastrointestinal; vide Sala et al. J Surg Res. 2009; 156(2):205-12 e também Sato et al. Gastroenterology 2011;141:1762-72); mediante a edição de RNA de acordo com a invenção, os organóides ou células estaminais que residem dentro dos organóides podem ser usados para transplantar de volta para o paciente para melhorar a função do órgão.

[0070] A célula a ser tratada terá geralmente uma mutação genética. A mutação pode ser heterozigótica ou homozigótica. A invenção será usada tipicamente para modificar mutações pontuais, tais como mutações de N a A, em que N pode ser G, C, U (no nível de DNA T), preferivelmente mutações de G a A ou mutações de N a C, em que N pode ser A, G, U (no nível de DNA T), preferivelmente mutações de U a C. Os genes contendo mutações de interesse particular são discutidos abaixo. Em algumas modalidades, no entanto, a invenção é usada da maneira oposta pela introdução de uma mutação associada à doença em uma linhagem celular ou um animal, a fim de prover uma ferramenta de pesquisa útil para a doença em questão. Como um exemplo de criação de um modelo de doença, foi provida uma sequência de oligonucleotídeo que provê o recrutamento de atividade de edição em uma célula humana para criar uma mutação no gene CEP290, criando um sítio de splice críptico que forma a base para uma forma de amaurose congênita de Leber, a forma mais comum de cegueira infantil congênita.

[0071] Uma mutação a ser revertida através da edição de RNA pode ter surgido no nível do cromossoma ou alguma outra forma de DNA, tal como DNA mitocondrial ou RNA, incluindo pré-mRNA, RNA ribossômico ou RNA mitocondrial. Uma mudança a ser feita pode ser em um RNA alvo de um patógeno, incluindo fungos, leveduras, parasitas, cinetoplastídeos, bactérias, fagos, vírus etc, com os quais a célula ou indivíduo foi infectado. Subsequentemente, a edição pode ocorrer no nível de RNA em uma sequência alvo dentro de tal célula, indivíduo ou patógeno. Determinados patógenos, tais como vírus, liberam seu ácido nucleico, DNA ou RNA na célula do hospedeiro infectado (célula). Outros patógenos residem ou circulam no hospedeiro infectado. Os construtos de oligonucleotídeo da invenção podem ser usados para editar sequências de RNA alvo que residem em uma célula do hospedeiro eucatiótico infectado ou para editar uma sequência de RNA dentro da célula de um patógeno que reside ou circula no hospedeiro eucatiótico, desde que as células, onde a edição deve ocorrer, contenham uma entidade de edição compatível com o construto de oligonucleotídeo administrado a elas.

[0072] Sem desegar estar ligado por teoria, a edição de RNA através de hADAR1 e hADAR2 é considerada como ocorrendo em pré-mRNAs no núcleo, durante a transcrição ou emenda. A edição de RNA por citidina deaminases é considerada como ocorrendo no nível do mRNA. A edição de códons de RNA mitocondrial ou sequências de não codificação em mRNAs maduros não é excluída.

A sequência alvo e a mudança

[0073] A invenção é usada para fazer uma mudança em uma sequência de RNA alvo em uma célula eucariótica através do uso de um construto de oligonucleotídeo que é capaz de direcionar um sítio a ser editado e recrutar entidades de edição de RNA residentes na célula para realizar a reação(s) de edição. As reações de edição preferidas são desaminações da adenosina e desaminações da citidina, convertendo adenosinas em inosinas e citidinas em uridinas, respectivamente. As mudanças podem ser em regiões não traduzidas 5’ ou 3’ de um RNA alvo, em sítios de splice (crípticos), em éxons (mudando aminoácidos em proteína traduzidos do RNA alvo, uso do códon ou comportamento de emenda ao mudar silenciadores ou intensificadores de emenda exônico, pela introdução ou remoção de códons de iniciação ou terminação), em íntrons (mudando a emenda pela alteração de silenciadores de emenda intrônico ou intensificadores de emenda intrônico, pontos de ramificação) e em geral em qualquer região que afete a estabilidade, estrutura ou funcionamento do RNA. A sequência de RNA alvo pode compreender uma mutação que se pode desejar corrigir ou alterar, tal como a (uma transição ou uma transversão). Alternativamente, a sequência de RNA alvo é deliberadamente mutada para criar um fenótipo alterado (ou genótipo, no caso de organismos com base em RNA, tais como vírus RNA), onde não havia qualquer mutação antes. Por exemplo, linhagens celulares ou animais podem ser feitas as quais carregam mudanças (mutações) em uma sequência de RNA alvo, que pode ser usada em ensaios ou como sistemas de modelo (animal, organoide, etcetera) para estudar a doença, testar compostos experimentais contra a doença e os similares. Os construtos de oligonucleotídeo e métodos de acordo com a invenção podem ser usados em sistemas de triagem de alto rendimento (em formato organizado) para a fabricação de bancos de célula com uma grande variedade de RNAs alvo, por exemplo, que codificam uma grande variedade de isoformas de proteína, para experimentação adicional, incluindo triagem do composto, modificação da proteína e os similares.

[0074] O RNA alvo pode ser qualquer sequência de RNA celular ou viral, mas é mais usualmente um pré-mRNA ou um mRNA com uma função de codificação de proteína.

[0075] Apenas para facilidade de referência e sem a intenção de limitar a invenção, a tabela a seguir é provida para ilustrar as mudanças de códon potenciais que podem ser realizadas pela edição de adenosina deaminase direcionada por oligonucleotídeos da invenção. A tabela particularmente não deve ser interpretada como uma limitação da aplicabilidade da invenção a sequências de codificação em qualquer RNA; como já destacado, a invenção pode ser praticada em qualquer RNA alvo compreendendo uma adenosina, seja em uma região de codificação, um íntron, um éxon de não codificação (tal como uma região não traduzida 5'- ou 3'), em miRNAs, tRNAs, rRNAs e assim por diante. Para evitar qualquer equívoco em relação à amplitude da aplicabilidade, mudanças que são inconsequentes (‘silenciosas’) de uma perspectiva da codificação podem ainda alterar a expressão de gene de uma determinada proteína visto que alguns códons para o mesmo aminoácido possam ser mais preferidos a outros e podem levar, por exemplo, a diferente estabilidade de transcrição ou eficiência de translação, fazendo com que a proteína codificada se torne mais ou menos abundante do que sem a mudança.

[0076] Adenosinas alvo particularmente interessantes para a edição usando oligonucleotídeos de acordo com a invenção são aquelas que são parte de códons para resíduos de aminoácido que definem funções chave ou características, tais como sítios catalíticos, sítios de ligação para outras proteínas, ligação por substratos, domínios de localização, para modificação co- ou pós- translacional, tal como glicosilação, hidroxilação, miristoilação, clivagem da proteína por proteases (para maturar a proteína e/ou como parte da encaminhamento intracelular) e assim por diante.

[0077] Um hospedeiro de doenças genéticas é causado por mutações de G a A e estas são doenças alvo preferidas porque a desaminação da adenosina na adenosina alvo mutada reverterá a mutação para o tipo selvagem. No entanto, a reversão para o tipo selvagem pode não ser sempre necessária para obter um efeito benéfico. A modificação de uma A em G em um alvo também pode ser benefica se o nucleotídeo de tipo selvagem for outro que não uma G. Em determinadas circunstâncias, isto pode ser previsto como sendo o caso, em outras, isto pode exigir algum teste. Em determinadas circunstâncias, a modificação de uma A em um RNA alvo para G onde o tipo selevagem não é uma G pode ser silenciosa (não traduzida em um aminoácido diferente) ou de outra forma não consequente (por exemplo, um aminoácido é substituído, mas ele constitui uma substituição conservativa que não interrompe a estrutura e função da proteína) ou o aminoácido é parte de um domínio funcional que tem uma determinada robustez para a mudança. Se a transição de A a G realizada pela edição de acordo com a invenção for em um RNA de não codificação ou uma parte de não codificação de um RNA, a consequência também pode ser inconsequente ou menos grave do que a mutação original. Aqueles versados na técnica compreenderão que a aplicabilidade da invenção atual é muito ampla e não é mesmo limitada para prevenir ou tratar a doença. A invenção também pode ser usada para modificar os transcritos para estudar o efeito dos mesmos, mesmo se ou particularmente quando tal modificação induz um estado de doença, por exemplo, em uma célula ou um modelo animal não humano.

[0078] Os exemplos preferidos de doenças genéticas que podem ser prevenidas e/ou tratadas com oligonucleotídeos de acordo com a invenção são qualquer doença onde a modificação de uma ou mais adenosinas em um RNA alvo realizará uma mudança (potencialmente) benéfica.

[0079] As sequências de RNA transcritas que são sequências de RNA alvo potenciais de acordo com a invenção, contendo mutações de interesse particular incluem, entre outras, aquelas transcritas do gene CFTR (o regulador de condutância transmembrana de fibrose cística), distrofina, huntingtina, neurofibromina 1, neurofibromina 2, a cadeia de ß-globina de hemoglobina, CEP290 (proteína centrossomal de 290kDa), o gene HEXA da ß-hexosaminidase A, e qualquer um dos genes Usher (por exemplo, USH2B que codifica Usherina) responsáveis por uma forma de cegueira genética denominada síndrome Usher. Uma lista mais extensiva é apresentada adicionalmente abaixo. A sequência alvo será selecionada de acordo e o construto de oligonucleotídeo incluirá a modificação desejada a fim de corrigir a mutação.

[0080] Aqueles versados na técnica de mutações de CF reconhecem que entre 1000 e 2000 mutações são conhecidas no gene de CFTR, incluindo R117H, G542X, G551D, R553X, W1282X e N1303K.

[0081] Em geral, mutações em qualquer RNA alvo que podem ser revertidas usando construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção são mutações de G a A, no caso de recrutamento de adenosina deaminase e mutações de U a C no caso de recrutamento de citidina deaminase e construtos de oligonucleotídeo podem ser projetados de acordo. As mutações que podem ser direcionadas usando construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção também incluem C a A, U a A (T a A no nível de DNA) no caso de recrutamento de adenosina deaminases e mutações de A a C e G a C no caso de recrutamento de citidina deaminases. Embora a edição de RNA nas últimas circunstâncias possa não reverter necessariamente a mutação para o tipo selvagem, o nucleotídeo editado pode dar origem a uma melhoria sobre a mutação original. Por exemplo, uma mutação que causa um códon de terminação em estrutura (“in frame”) - dando origem a uma proteína truncada, mediante a translação - pode ser alterada em um códon que codifica um aminoácido que pode não ser o aminoácido original naquela posição, mas que dá origem a uma proteína (de comprimento completo) com pelo menos alguma funcionalidade, pelo menos mais funcionalidade do que a proteína truncada.

[0082] A sequência alvo é endógena à célula eucariótica, preferivelmente mamífera, mais preferivelmente humana. Assim, a sequência alvo não é, por exemplo, um transgene ou um gene marcador que foi introduzido artificialmente em algum ponto na história da célula, mas preferivelmente é um gene que está naturalmente presente na célula (seja na forma mutante ou não mutante).

[0083] A invenção não é limitada a corrigir mutações, visto que ela pode, em vez disso, ser útil para mudar uma sequência do tipo selvagem para uma sequência mutada pela aplicação de oligonucleotídeos de acordo com a invenção. Um exemplo onde ela pode ser vantajosa para modificar uma adenosina do tipo selvagem é realizar salto de um éxon, por exemplo, pela modificação de uma adenosina que acontece de ser um sítio de ramificação exigido para a emenda do dito éxon. Outro exemplo é onde a adenosina define ou é parte de uma sequência de reconhecimento para a ligação da proteína ou está envolvida em estrutura secundária definindo a estabilidade do mRNA. Como observado acima, portanto, a invenção pode ser usada para prover ferramentas de pesquisa para doenças, para introduzir novas mutações as quais são menos prejudiciais do que uma mutação existente, etc.

Aplicações dos construtos de oligonucleotídeo

[0084] A quantidade de construtos de oligonucleotídeo a ser administrada, o grau e o regime de dosagem podem variar de tipo da célula a tipo da célula, da doença a ser tratada, da população alvo, do modo de administração (por exemplo, sistêmica versus local), da gravidade da doença e do nível aceitável de atividade lateral, mas estes podem e devem ser avaliados por tentativa e erro durante a pesquisa in vitro, em ensaios pré-clínicos e clínicos. Os ensaios são particularmente simples quando a sequência modificada leva a uma mudança fenotípica detectada facilmente. É possível que doses maiores de oligonucleotídeo pudessem competir pela ligação a uma entidade de edição de ácido nucleico (por exemplo, ADAR) dentro de uma célula, dessa forma, esgotando a quantidade da entidade que é livre para tomar parte na edição de RNA, mas ensaios de dosagem de rotina revelerão quaisquer tais efeitos para um dado oligonucleotídeo e um dado alvo.

[0085] Uma técnica de ensaio adequada envolve a distribuição do construto de oligonucleotídeo para linhagens celulares ou um organismo de teste e a seguir a condução de amostras de biópsia em vários pontos no tempo depois disso. A sequência do RNA alvo pode ser avaliada na amostra de biópsia e a proporção de células tendo a modificação pode ser facilmente seguida. Após este ensaio ter sido realizado uma vez então o conhecimento pode ser retido e a distribuição futura pode ser realizada sem a necessidade de levar amostras de biópsia.

[0086] Um método da invenção pode incluir, assim, uma etapa de identificação da presença da mudança desejada na sequência de RNA alvo da célula, dessa forma, verificando que a sequência de RNA alvo foi modificada. Esta etapa envolverá tipicamente o sequenciamento da parte relevante do RNA alvo ou uma cópia de cDNA dos mesmos (ou uma cópia de cDNA de um produto de emenda dos mesmos, no caso do RNA alvo se um pré-mRNA), como discutido acima e a mudança de sequência pode, assim, ser facilmente verificada. Alternativamente, a mudança pode ser avaliada no nível da proteína (comprimento, glicosilação, função ou os similares) ou por algma leitura funcional, tal como uma corrente (induzível), quando a proteína codificada pela sequência de RNA alvo é um canal de íon, por exemplo. No caso de função de CFTR, um ensaio de câmara de Ussing ou um teste NPD em um mamífero, incluindo seres humanos, são bem- conhecidos por uma pessoa versada na técnica para avaliar a restauração ou ganho de função.

[0087] Após a edição de RNA ter ocorrido em uma célula, o RNA modificado pode se tornar diluído ao longo do tempo, por exemplo, devido à divisão da célula, meia-vida limitada dos RNAs editados, etc. Assim, em termos terapêuticos práticos, um método da invenção pode envolver a distribuição repetida de um construto de oligonucleotídeo até que os RNAs alvo suficientes tenham sido modificados para prover um benefício tangível ao paciente e/ou para manter os benefícios ao longo do tempo.

Distribuição do construto de oligonucleotídeo

[0088] Os construtos de oligonucleotídeo da invenção são particularmente adequados para o uso terapêutico e assim a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um construto de oligonucleotídeo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades da invenção, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser simplesmente uma solução salina. Esta pode ser utilmente isotônica ou hipotônica, particularmente para a distribuição pulmonar.

[0089] A invenção também provê um dispositivo de distribuição (por exemplo, seringa, inalador, nebulizador) que inclui uma composição farmacêutica da invenção.

[0090] A invenção também provê um construto de oligonucleotídeo da invenção para o uso em um método para fazer uma mudança em uma sequência de RNA alvo em uma célula mamífera, preferivelmente, humana como descrito aqui. Similarmente, a invenção provê o uso de um construto de oligonucleotídeo da invenção na fabricação de um medicamento para fazer uma mudança em uma sequência de RNA alvo em uma célula mamífera, preferivelmente, humana como descrito aqui.

Formulação, dosagem e modo de administração para o uso em terapia.

[0091] Os construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção são administrados adequadamente em slução aquosa, por exemplo, solução salina ou em suspensão, opcionalmente compreendendo aditivos, excipientes e oitros ingredientes compatíveis com o uso farmacêutico em concentrações que variam de 1 ng/ml a 1 g/ml, preferivelmente de 10 ng/ml a 500 mg/ml, mais preferivelmente de 100 ng/ml a 100 mg/ml. A dosagem pode variar adequadamente dentre cerca de 1 µg/kg a cerca de 100 mg/kg, preferivelmente de cerca de 10 µg/kg a cerca de 10 mg/kg, mais preferivelmente de cerca de 100 µg/kg a cerca de 1 mg/kg. A administração pode ser por inalação (por exemplo, através de nebulização), intranasalmente, oralmente, por injeção ou infusão, intravenosamente, subcutaneamente, intradermicamente, intracranialmente, intramuscularmente, intratraquealmente, intraperitonealmente, intrarretalmente, por injeção direta em um tumor e os similares. A administração pode ser na forma sólida, na forma de um pó, uma pílula ou em qualquer outra forma compatível com o uso farmacêutico em seres humanos.

[0092] A invenção é particularmente adequada para o tratamento de doenças genéticas, tais como fibrose cística, albinismo, deficiência em alfa-1-antitripsina, mal de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, Asma, ß- talassemia, síndrome de Cadasil, soença de Charcot-Marie- Tooth, Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Atrofia muscular espinhal distal (DSMA), distrofia muscular de Duchenne/Becker, epidermólise bolhosa distrófica, epidermólise bolhosa, doença de Fabry, distúrbios associados ao fator V de Leiden, adenomatose familiar, Polipose, Galactosemia, Doença de Gaucher, Glicose-6- fosfato desidrogenase, Hemofilia, Hemocromatose Hereditária, Síndrome de Hunter, Doença de Huntington, Síndrome de Hurler, Doença Inflamatória do Intestino (IBD), Síndrome de poliglutinação hereditária, amaurose congênita de Leber, síndrome de Lesch-Nyhan, Síndrome de Lynch, síndrome de Marfan, mucopolissacaridose, distrofia muscular, Distrofia miotônica tipos I e II, neurofibromatose, doença de Niemann-Pick tipo A, B e C, câncer relacionado a NY-eso1, mal de Parkinson, síndrome de Peutz-Jeghers, Fenilcetonúria, Doença de Pompe, Doença ciliar primária, distúrbios relacionados com a mutação da protrombina, tais como a mutação de protrombina G20210A, Hipertensão Pulmonar, Retinite Pigmentosa, Doença de Sandhoff, Síndrome de Imunodeficiência Combinada Grave (SCID), Anemia Falciforme, Atrofia Muscular Espinhal, Doença de Stargardt, Doença de Tay-Sachs, síndrome de Usher, Imunodeficiência ligada ao X, várias formas de câncer (por exemplo, câncer de mama e câncer ovariano ligados a BRCA1 e 2), e os similares.

[0093] Em algumas modalidades, o construto de oligonucleotídeo pode ser distribuído sistemicamente, mas é mais típico distribuir um construto de oligonucleotídeo para células nas quais o fenótipo da sequência alvo é visto. Por exemplo, mutações em CFTR causam fibrose cística que é vista principalmente em tecido epitelial pulmonar, assim com uma sequência alvo CFTR é preferido distribuir o construto de oligonucleotídeo específica e diretamente aos pulmões. Isto pode ser convenientemente obtido por inalação, por exemplo, de um pó ou aerossol, tipicamente por meio do uso de um nebulizador. Especialmente preferidos são nebulizadores que usam uma assim chamada rede vibratória, incluindo o PARI eFlow (Rápido) ou o i-neb de Respironics. Os inventores verificaram que o uso inalado de construtos de oligonucleotídeo pode levar à distribuição sistêmica do construto de oligonucleotídeo e absorção pelas células no intestino, fígado, pâncreas, rim e tecidos da glândula salivar, dentre outros. Portanto, espera-se que a distribuição inalada de construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção também possa direcionar estas células eficientemente, o que no caso do direcionamento de gene CFTR poderia levar à melhoria de sintomas gastrointestinais também associados com fibrose cística. Para outras sequências alvo, dependendo da doença e/ou do órgão alvo, a administração pode ser tópica (por exemplo, na pele), intradérmica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, oral, injeção ocular, etc.

[0094] Em algumas doenças, a camada de muco mostra uma espessura aumentada, levando a uma absorção diminuída de medicamentos por meio do pulmão. Tal doença é bronquite crônica, outro exemplo é fibrose cística. Várias formas de normalizadores de muco estão disponíveis, tais como DNAses, solução salina hipertônica ou manitol, que é comercialmente disponível sob o nome de Bronquitol. Quando os normalizadores de muco são usados em combinação com construtos de oligonucleotídeo de edição de RNA, tais como os construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção, eles podem aumentar a eficácia daqueles medicamentos. Consequentemente, a administração de um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção a um indivíduo, preferivelmente um indivíduo humano é preferivelmente combinado com normalizadores de muco, preferivelmente aqueles normalizadores de muco descritos aqui. Em adição, a administração dos construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode ser combinada com a administração de pequena molécula para o tratamento de CF, tal como compostos potenciadores, por exemplo, Kalydeco (ivacaftor; VX-770), ou compostos corretores, por exemplo, VX-809 (lumacaftor) e/ou VX-661. Outras terapias de combinação em CF podem compreender o uso de um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção em combinação com um indutor de adenosina deaminase, usando IFN-gama ou TNF- alfa.

[0095] Alternativamente ou em combinação com os normalizadores de muco, a distribuição em partículas ou nanopartículas que penetram no muco pode ser aplicada para a distribuição eficiente de moléculas de edição de RNA a células epiteliais de, por exemplo, pulmão e intestino. Consequentemente, a administração de um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção a um indivíduo, preferivelmente, um indivíduo humano, preferivelmente usa a distribuição em partículas ou nanopartículas que penetram no muco.

[0096] Infecções pulmonares crônicas e agudas estão frequentemente presentes em pacientes com doenças tais como fibrose cística. Os tratamentos com antibiótico reduzem as infecções bacterianas e os sintomas daquelas tais como espessamento do muco e/ou formação de biopelícula. O uso de antibióticos em combinação com construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção poderia aumentar a eficácia da edição de RNA devido ao acesso mais fácil das células alvo para o construto de oligonucleotídeo. Consequentemente, a administração de um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção a um indivíduo, preferivelmente um indivíduo humano, é preferivelmente combinada com o tratamento com antibiótico para reduzir as infecções bacterianas e os sintomas daquelas tais como espessamento do muco e/ou formação de biopelícula. Os antibióticos podem ser administrados sistêmica ou localmente ou ambos.

[0097] Para a aplicação em, por exemplo, pacientes com fibrose cística, os construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou construtos de oligonucleotídeo acondicionados ou complexados de acordo com a invenção podem ser combinados com qualquer normalizador de muco tal como uma DNase, manitol, solução salina hipertônica e/ou antibióticos e/ou uma pequena molécula para o tratamento de CF, tal como compostos potencializadores, por exemplo, ivacaftor ou compostos corretores, por exemplo, lumacaftor e/ou VX-661.

[0098] Para aumentar o acesso às células alvo, Lavagem Bronquio-Alveolar (BAL) poderia ser aplicada para limpar os pulmões antes da administração dos construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção.

[0099] A invenção também provê um construto de oligonucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo de qualquer um de SEQ ID NOs: 1 a 3: GFP SEQ ID NO: 1 5' -cgcgcgttttcgcgcgGCUGAAC*CACUGCAC-3 ' CEP290 SEQ ID NO: 2 5' -cgcgcgttttcgcgcgGAGAUAC*UCACAAUU-3‘ CFTR SEQ ID NO: 3 5' -cgcgcgttttcgcgcgCGUUGAC*CUCCAC,UC-3‘

[00100] Sequência correspondente SEQ ID NO: 9 G551D mRNA 3'-GCAACUA*GAGGUGAG-5' Letras pequenas = DNA com propensão para formar a estrutura Z-DNA Negrito e sublinhado = 2’-O-metila Itálico = ligações internucleosídicas de fosforotioato e 2’-O-metila C*= base oposta à adenosina alvo a ser editada

[00101] Similarmente, a invenção também provê um construto de oligonucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NOs: 16 a 22 (e opcionalmente as modificações nucleicas descritas no Exemplo 1 para tais sequências de nucleotídeo) ou qualquer uma de SEQ ID NOs: 2, 3, 28, 38, 39, 40 e 41 (e opcionalmente as modificações nucleicas descritas nos Exemplos 2-5 para tais sequências de nucleotídeo). Geral

[00102] Os termos “adenina”, “guanina”, “citosina”, “timina”, “uracila” e hipoxantina (a nucleobase em inosina) se referem às nucleobases como tais.

[00103] Os termos adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina e inosina se referem às nucleobases ligadas ao açúcar (desoxi)ribosila.

[00104] O termo “nucleosídeo” se refere à nucleobase ligada ao açúcar (desoxi)ribosila.

[00105] O termo nucleotídeo se refere à respectiva nucleobase-(deoxi)ribosil-fosfoligante, assim como quaisquer modificações químicas da porção de ribose ou do grupo fosfo. Assim, o termo incluiria um nucleotídeo incluindo uma porção ribosila travada (compreendendo uma ponte 2’-4’, compreendendo um grupo metileno ou qualquer outro grupo, bem-conhecido na técnica), um nucleotídeo incluindo um ligante compreendendo ligantes de um fosfodiéster, fosfotriéster, fosforo(di)tioato, metilfosfonatos, fosforamidato e os similares.

[00106] Algumas vezes, os termos adenosina e adenina, guanosina e guanina, citosina e citidina, uracila e uridina, timina e timidina, inosina e hipo-xantina são usados intercambiavelmente para se referir à nucleobase, nucleosídeo ou nucleotídeo correspondente.

[00107] Algumas vezes, os termos nucleobase, nucleosídeo e nucleotídeo são usados intercambiavelmente, a menos que o contexto claramente exija diferentemente.

[00108] Sempre que referência for feita a um “oligonucleotídeo”, significa ambos os oligorribonucleotídeos e desoxioligorribonucleotídeos a menos que o contexto dite o contrário. Sempre que referência for feita a um oligorribonucleotídeo, ela pode compreender as bases A, G, C, U ou I. Sempre que referência for feita a um desoxioligorribonucleotídeo, ela pode compreender as bases A, G, C, T ou I.

[00109] Sempre que referência for feita a nucleotídeos no construto de oligonucleotídeo, tal como citosina, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina e ß-D- Glucosil-5-hidroxi-metilcitosina estão incluídos; quando referência for feita à adenina, N6-Metiladenina e 7-metiladenina são incluídos; quando referência for feita à uracila, di-hidrouracila, 4-tiouracila e 5- hidroximetiluracila são incluídos; quando referência for feita à guanina, 1-metilguanina é incluída.

[00110] Sempre que referência for feita a nucleosídeos ou nucleotídeos, derivados de ribofuranose, tais como 2’-desoxi, 2’-hidróxi, e 2’-O-variantes substituídas, tais como 2’-O-metila, são incluídos, assim como outras modificações, incluindo variantes em ponte 2’4’.

[00111] Sempre que referência for feita a oligonucleotídeos, ligações entre dois mono-nucleotídeos podem ser ligações de fosfodiéster assim como modificações dos mesmos, incluindo, ligantes de fosfodiéster, fosfotriéster, fosforo(di)tioato, metilfosfonato, fosforamidato e os similares.

[00112] O termo “compreendendo” abrange “incluindo” assim como “consistindo”, por exemplo, uma composição “compreendendo” X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[00113] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x+10%.

[00114] A palavra “substancialmente” não exclui “completamente”, por exemplo, uma composição que é “substancialmente livre” de Y pode ser completamente livre de Y. Onde relevante, a palavra “substancialmente” pode ser omitida da definição da invenção.

[00115] O termo “a jusante” em relação a uma sequência de ácido nucleico significa mais adiante na sequência na direção 3'; o termo “a montante” significa o inverso. Assim em qualquer sequência que codifica um polipeptídeo, o códon de iniciação está a montante do códon de terminação no filamento de sentido, mas está a jusante do códon de terminação no filamento antissentido.

[00116] Referências à “hibridização” se referem tipicamente à hibridização específica e excluem hibridização não específica. A hibridização específica pode ocorrer sob condições experimentais escolhidas, usando técnicas bem-conhecidas na técnica, para assegurar que a maioria de interações estáveis entre sonda e alvo sejam onde a sonda e alvo têm pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade de sequência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00117] Figura 1: desenho de uma sequência de RNA alvo e um construto de oligonucleotídeo de acordo com a invenção; A: o construto de oligonucleotídeo é projetado como um construto “de uma perna” de oligonucleotídeo único, com a porção de direcionamento em sua extremidade 3’ e a porção de recrutamento em sua extremidade 5’. B: o construto de oligonucleotídeo é projetado como um construto “de uma perna” de oligonucleotídeo único, com a porção de direcionamento em sua extremidade 5’ e a porção de recrutamento em sua extremidade 3’; a entidade de edição é descrita como uma estrutura cinza, descrevendo o domínio de reconhecimento no lado esquerdo e o domínio catalítico no lado direito, indicando a reação de desaminação (instantânea) no sítio alvo.

[00118] Figura 2: desenho da estrutura de RNA alvo com construto de oligonucleotídeo: A mostra o construto de oligonucleotídeo com um Ligante entre a porção de direcionamento e a porção de recrutamento; B mostra a modalidade onde o construto de oligonucleotídeo compreende duas sequências de oligonucleotídeo - não covalentemente ligadas - interagindo através de pareamento de bases antissentido Watson-Crick por seus respectivos segmentos 3’.

[00119] Figura 3: desenho da estrutura de RNA alvo com o construto de oligonucleotídeo em seu formato “de duas pernas”, onde a porção de direcionamento é separada (ou “dividida”) pela porção de recrutamento; A mostra o sítio de edição a montante na sequência de RNA alvo, relativa à porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo; B mostra o sítio de edição a jusante no direcionamento da sequência de RNA, relativa à porção de recrutamento do construto de oligonucleotídeo.

[00120] Figura 4: Microscopia de fluorescência de cavidades mostrando fluorescência verde em células HeLa após a transfecção de lipofectamina com pGFPstop57 e os oligonucleotídeos indicados, exceto: o painel superior esquerdo são células não tratadas; os quatro painéis de fundo são controles que não receberam pelo menos um dos componentes indicados. As figuras 4a & 4b diferem apenas pelo contraste.

[00121] Figura 5: microscopia de fluorescência de cavidades mostrando fluorescência verde em células HeLa após a transfecção de lipofectamina com pGFPstop57, pADAR2, e oligonucleotídeo #11 em várias razões dos dois plasmídeos. O painel superior esquerdo são células não tratadas; o painel de fundo mostra células com um plasmídeo que codifica GFP não mutante em vez de pGFPstop57.

[00122] Figura 6: Microscopia de fluorescência de cavidades mostrando fluorescência verde em células HeLa 24 ou 48 horas após nenhum tratamento ou transfecção com 50 nM ou 200 nM oligonucleotídeo #11 (ou com 500 nM de um oligonucleotídeo de controle) com pGFPstop57.

[00123] Figura 7: os espectos de FACS de células HeLa não tratadas (pico esquerdo) ou transfectadas (pico direito). Em 7A-7F, as células foram transfectadas com pGFPstop57 e oligonucleotídeo #11. Em 7B-7F (mas não 7A), as células também foram transfectadas com pADAR2. Em 7G & 7H, GFP não mutante foi expresso.

[00124] Todas as modalidades ilustradas nos desenhos podem ser combinadas, como explicado na descrição detalhada da invenção aqui.

MODOS PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Exemplo 1: Reversão de uma mutação sem sentido em um RNA alvo da GFP pela edição de A a I direcionada ao sítio

[00125] Construto de oligonucleotídeo a ser usado: 5’-cgcgcgttttcgcgcgGCUGAAC*CACUGCAC-3‘ (SEQ ID NO: 1). As células HeLa (ATCC, CCL-2) são cultivadas em Meio Eagle Modificado de Dulbecco (Life Technologies) suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor. As células são mantidas em uma atmosfera de ar umidificado com 5% de CO2. As células são semeadas em placa de 24 cavidades um dia antes da transfecção e quando elas alcançam 70-80% de confluência. O construto repórter de GFP com uma atividade de GFP abolida devido a um códon de terminação TGA ser usado. 100-200 ng de plasmídeo DNA e 500 ng de construto de oligonucleotídeo (10-100 pmol) são misturados na quantidade apropriada de meio Opti-MEM I (Life Technologies) e reagente Lipofectamina 2000 e as células são transfectadas de acordo com o procedimento do fabricante. As células são incubadas a 37°C em uma incubadora de CO2 e o meio é substituído após 4-6 horas. Após 48 hours, as células são analisadas sob o microscópio fluorescente para avaliar a eficiência do oligo para restaurar a expresão de GFP.

[00126] Outros experimentos usaram novamente uma GFP mutante tendo um códon de terminação TAG interno devido a uma mutação pontual G^A, expressa de um plasmídeo (‘pGFPstop57’). As células foram adicionalmente transfectadas com um plasmídeo que codifica ADAR2 para assegurar que as células fossem capazes de realizar a edição de RNA. Vários oligonucleotídeos foram preparados para a restauração da expressão de GFP por meio da desaminação do resíduo A mutante, com base no princípio de uma porção de direcionamento específica para a mutação de GFP e uma porção de recrutamento com base em GluR-B.

[00127] Sete oligonucleotídeos de RNA foram testados e estas formas direcionadas curtas, médias ou longas de GluR-B (S/M/L; comprimentos diferentes da porção de recrutamento). Em adição, estes tinham as porções de direcionamento e de recrutamento Em qualquer ordem (a montante/a jusante) e em alguns casos os oligos incluíam regiões quimicamente modificadas (a porção de recrutamento foi quimicamente modificada para incluir açúcares 2'-OMe e ligações de fosforotioato; a porção de direcionamento foi modificada da mesma maneira, exceto para a posição A mutante (sublinhado duplo) e seus dois nucleotídeos de flanqueamento). Todos os oligos incluem SEQ ID NO: 7 (siblinhado) e porções de direcionamento de GFP estão em negrito:

[00128] As células HeLa são cultivadas em Meio Eagle Modificado de Dulbecco supplemented com 10% de soro bovino fetal inativado por calor. As células são mantidas em uma atmosfera de ar umidificado com 5% de CO2. 8x104 células são semeadas em uma cavidade de uma placa de 24 cavidades um dia antes da transfecção e quando elas alcançam 70-80% de confluência são transientemente transfectada com (i) oligonucleotídeo + plasmídeo GFPstop57 ou (ii) oligonucleotídeo + GFPstop57 + plasmídeos ADAR2 pelo uso de Lipocetamine 2000 de acordo com procedimento do fabricante. O meio é refrescado 24 horas após a transfecção e a expressão de GFP é avaliada sob o microscópio fluorescente 24 horas mais tarde.

[00129] A análise de FACS também é realizada. As células são tripsinizadas e coletadas em um tubo Eppendorf e a seguir ressuspensas em Tampão de coloração de citometria de fluxo. As células intactas são selecionadas com base em propriedades morfológicas usando dispersão frontal e dispersão lateral, excluindo resíduos das células intactas, valores medianos e médios de intensidade fluorescente média de GPC (MFI) são calculados. Histogramas de sobreposição são criados usando o editor de layout.

[00130] Os resultados para células transfectadas sem o plasmídeo ADAR são mostrados na Figura 4 e a fluorescência verde acima dos níveis vistos em controles (que é devido à autofluorescência de células e/ou componentes médios) é claramente visível para todos os sete oligos. Oligos #10 & #11 forneceram os melhores resultados (ambos tendo uma porção de recrutamento longa GluR-B) e o oligo com uma porção de recrutamento a montante (#11) foi levemente melhor.

[00131] O oligo #11 foi, portanto, escolhido para outros estudos em combinação com o plasmídeo que codifica ADAR2. A figura 5 novamente mostra que células tratadas com oligo #11 fluorescem acima dos níveis vistos em controle negativos. Para comparação, as células foram trasnfectadas com um plasmídeo que codifica uma GFP não mutante e a fluorescência esperada foi vista (Figura 5, painel do fundo).

[00132] Diferentes concentrações de oligo #11 foram testadas, variando de 50-1500 nM. A figura 6 mostra resultados exemplares após 24 ou 48 horas usando 50 e 200 nM, juntamente com as células não tratadas (esquerda) e células de controle que foram testadas com 500 nM de um oligo de controle tendo o mesmo comprimento e modificações químicas que oligo #11. Oligo #11 mostrou um aumento dependente do tempo em fluorescência, que não foi visto com o oligo de controle.

[00133] O efeito de oligonucleotídeo sobre a expressão de GFP também esteve visível por FACS (Figura 7). As células tratadas com oligo #11, com (7B-7F) ou sem (7A) o plasmídeo ADAR2, exibiram um aumento em fluorescência de GFP em relação a células não tratadas (pico à esquerda). GFP não mutante foi usada como um controle positivo (7G- 7H).

Exemplo 2: Introdução de um sítio de splice críptico em um RNA alvo CEP290 por edição de A a I direcionada ao sítio

[00134] Construto de oligonucleotídeo a ser usado: 5’-cgcgcgttttcgcgcgGAGAUAC*UCACAAUU-3‘ (SEQ ID NO: 2).

[00135] Todas as linhagens celulares são fibroblastos humanos, gerados de biópsias da pele. FBL1 (CL10-00008) e FBL2 (CL12-00027) são do tio selvage e representam linhagens celulares de controle, FBL3 (CL12- 00035) e FBL4 (CL12-00036) são ambas mutantes homozigotas para uma mutação em CEP290 (c.2991+1655A>G). Todas as linhagens celulares são desenvolvidas em meio DMEM (Life Technologies) suplementado com 20% de FBS, 1% de Pen/strep e 1% de piruvato de sódio.

[00136] Um dia antes da transfecção, as células são semeadas em uma densidade de 2x105/cavidade em uma placa de 6 cavidades em um volume total de 2,5 ml de meio. No dia da transfecção, o AON a ser testado é adicionado a cada cavidade em uma concentração final de 100nM usando maxPEI (Poliscience) como um agente de transfecção, com uma razão em massa de oligo:PEI de 1:4. Após 24h, as células são lavadas com PBS e o lisado de célula é coletado e congelado a -80°C.

[00137] O RNA é isolado dos lisados de célula que foram mantidos a -80°C usando o kit da Promega ReliaPrep RNA Cell Miniprep System. O RNA total é quantificado usando um espectrofotômetro Nanodrop 2000.

[00138] 400 ng de RNA são usados como modelo para a síntese de cDNA usando o kit de síntese de cDNA Verso (Thermoscientific) de acordo com as instruções do fabricante.

[00139] cDNA é diluído 2,5x para esta reação e 2 µl deste cDNA diluído são usados como modelo. A amplificação da sequência alvo usa AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase de Life Technologies. Os iniciadores usados são ex26_Fw (SEQ ID NO: 10) e ex27_Rv (SEQ ID NO: 11) com condições de PCR como a seguir: manter 5 min a 95°C, desnaturar 30 s a 95°C, anelar 30 s a 58°C e estender 35 s a 72°C, 35 ciclos, estensão final é 7 min a 72°C.

[00140] Os fragmentos de PCR são analisados no Agilent 2100 Bioanalyzer usando o kit Agilent DNA 1000 de Agilent technologies. Este kit contém um chip composto de microcanais interconectados, através dos quais os fragmentos são separados com base em seu tamanho visto que eles são acionados através dele eletroforeticamente. Para medir o nível de expressão de mRNA CEP290, transcritos do tipo selvagem e mutantes são amplificados como fragmentos de 93bp e 117bp, respectivamente. O RNA de proteína ribossômica grande P0 humano (RPLP0) é usado como normalização. Os iniciadores usados são wt_Fw (SEQ ID NO: 12), wt-Rv (SEQ ID NO: 13), mt_Fw (SEQ ID NO: 14), e mt_Rv (SEQ ID NO: 15). Para esta reação, SYBR seleciona master mix de Life Technologies com cDNA diluído 10x usado como modelo. O programa PCR fica a 50°C por 2 min, 95°C por 2 min, 50 ciclos de 95°C por 15 s, 62,5°C por 1 min.

Exemplo 3: Reversão de uma substituição de aminoácido em um RNA alvo mutante CFTR G551D pela edição de A a I direcionada ao sítio

[00141] Construto de oligonucleotídeo a ser usado: 5’-cgcgcgttttcgcgcgCGUUGAC*CUCCACUC-3‘ (SEQ ID NO: 3).

[00142] As linhagens celulares são fibroblastos humanos, gerados de biópsias de pele e pericárdio do coração, GM00142 e GM03465, respectivamente, (Coriell Institute Cell Repository). Elas são ambas heterozigotas: um alelo carrega a mutação de deleção deltaF508 (Phe508Del) e um segundo alelo carrega uma transição G-a-A no nucleotídeo 1784 (1784G>A) que converte o códon gly-551 (GGT) em um asp (GAT), resultando em uma mutação missense no éxon 11 no gene CFTR [Gly551Asp (G551D)]. Todas as linhagens celulares são desenvolvidas em meio essencial mínimo de Eagle (Life Technologies) com sais de Earle e aminoácidos não essenciais suplementados com 15% de FBS não ativado e 1% de Pen/strep.

[00143] No dia anterior à transfecção, as células são semeadas em uma densidade de 2x105/cavidade em uma placa de 6 cavidades em um volume total de 2,5 ml de meio. No dia da transfecção, o oligo a ser testado é adicionado a cada cavidade em uma concentração final de 100 nM usando maxPEI (Poliscience) como um agente de transfecção, com uma razão em massa de oligo:PEI de 1:4. Após 24h, as células são lavadas com PBS e o lisado de célula é coletado e congelado a -80°C.

[00144] O RNA é isolado dos lisados de célula que foram mantidos a -80°C usando o kit da Promega ReliaPrep RNA Cell Miniprep System. O RNA total é quantificado usando um espectrofotômetro Nanodrop 2000. 400 ng de RNA são usados como modelo para a síntese de cDNA usando o kit de síntese de cDNA Verso (Thermoscientific) de acordo com as instruções do fabricante. 1 µl de cDNA foi primeiro submetido a PCR com 0,4 µM de iniciadores para a frente e reverso, 25 µM de cada dNTP, 1x de tampão AmpliTaq Gold® 360, 3,125 de 30 mM MgCl2 e 1,0 unidade de polimerase AmpliTaq Gold® 360 (todos de Life Technologies) foram montados. Os iniciadores usados são SEQ ID NOs: 26 (adt) e 27 (rev). Os ciclos de PCR foram realizados usando as condições de ciclização a seguir. Uma etapa de desnaturação inicial a 95°C por 7 min foi seguida por 30 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s a 55°C e 45 s a 72°C. As amplificações de PCR foram terminadas por um período de alongamento final de 7 min a 72°C. 1 µl da PCR anterior foi usado em um programa nested-PCR contendo 35 0,4 µM de iniciadores para a frente e um iniciador de índice único MiSeq por amostra, 25 µM de cada dNTP, 1x de tampão AmpliTaq Gold® 360, 3,125 mM de MgCl2 e 1,0 unidade de polimerase AmpliTaq Gold® 360. Os ciclos de PCR foram realizados usando as condições de ciclização a seguir: uma etapa de desnaturação inicial a 95°C por 7 min foi seguida por 25 ciclos de 30s a 95°C, 30 s a 60°C e 45 s a 72°C. As reações foram terminadas usando um período de alongamento final de 7 minutos a 72°C. Antes do carregamento dos produtos de PCR contendo as sequências iniciadoreas da sequência MiSeq no sequenciador, a concentração dos produtos de PCR purificados foi medida usando um fluorômetro Qubit® 2.0 (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, dois tubos de ensaio para os padrões foram feitos ao fazer diluições 20 vezes dos 2 padrões de reserva em solução de trabalho. Para cada amostra, 200 µl de solução de trabalho foram preparados em 10 tubos separados, 1 µl do produto de PCR foi trazido para esta solução e misturado ao submeter a vórtice por alguns segundos. As amostras foram medidas contra os dois padrões e a concentração em ng/µl foi calculada, consequentemente. O sequenciamento dos produtos de PCR foi realizado no sistema MiSeq™ de Illumina, que usa sequenciamento por síntese para prover dados de sequência rápidos com alta qualidade. Exemplo 4: Reversão de uma mutação por substituição de aminoácido no transcrito a-1-antitripsina (A1AT) pela edição de A a I para o tratamento de deficiência de A1AT

[00145] Oligonucleotídeos (SEQ ID NO: 28): ADAR45: rGrGrArArUrArGrUrArUrArArCrArArUrArUrgrcrurararArUr GrUrUrGrUrUrArUrArGrUrArUrCrCrCmC*mA*mG*mU*mCmCmCmUmUmUmCrU rCrGmUmCmGmAmUmGmG*mU*mC*mA*mG ADAR47: mG*mG*mA*mA*mU*mA*mG*mU*mA*mU*mA*mA*mC*mA*mA*mU*mA* mU*mG*mC*mU*mA*mA*mA*mU*mG*mU*mU*mG*mU*mU*mA*mU*mA*mG*mU*mA *mU*mC*mC*mCmC*mA*mG*mU*mCmCmCmUmUmUmCrUrCrGmUmCmGmAmUmGmG* mU*mC*mA*mG r = nenhuma modificação m = 2'O-Me * = ligação de fosforotioato

Transfecção de fibroblastos do fígado

[00146] Os fibroblastos do fígado são providos de repositório de células Coriell (GM11423), isolados de um indivíduo doador homozigoto para os alelos Z (ZZ), que resulta de uma transição G>A no nucleotídeo 9989 em éxon 5 do gene SERPINA1 [9989G>A] resultando em uma substituição de lisina por ácido glutâmico no códon 342 [Glu342Lys (E342K)]. As células são mantidas em meio EMEM (Life Technologies) e suplementadas com 15% de FBS. Um dia antes das transfecções, as células são semeadas em uma placa de 6 cavidades em um volume total de 2 ml de meio. No dia da transfecção, o oligonucleotídeo é adicionado a 1x de PBS (Thermo Fisher Scientific) em 1,5 ml de tubo de microcentrífuga e misturado com MaxPei (Polysciences) e incubado junto e incubado por 20 min. Nesse ínterim, o meio de cultura de célula é removido das células e quantidade adequada de EMEM fresco com 15% de FBS é adicionada. A seguir, a mistura diluída de DNA/Oligo-MaxPei é adicionada sobre a célula com pipetagem gentil gota a gota. As células são incubadas a 37°C e o meio é refrescado após 6-24h.

Isolamento de RNA

[00147] O isolamento de RNA é realizado usando o Reliaprep RNA Cell Miniprep System (Promega) de acordo com procedimento do fabricante. Em resumo, o meio de cultura é removido e as células são lavadas com PBS frio. 250 µl de tampão de lise é adicionado sobre cada cavidade de placa de 6 cavidades. A placa é balançada suavemente e as células são lisadas completamente por pipetagem repetida sobre a superfície da cavidade. 85 µl de isopropanol são adicionados sobre o lisado como recomendado e o lisado é transferido para Minicoluna e centrifugado por 30 s a 12.000-14.000g (RT), o líquido é descartado. 500 µl de solução de lavagem de RNA são adicionados e centrifugados novamente 30 s a 12.000-14.000g. Em um tubo estéril, DNase I incubation master mix é preparada pela combinação da amostra de 24 µl de Yellow Core Buffer, 3 µl de 0,09 M MnCl2, 3 µl de DNAse I e 30 µl de mistura de DNase I recém- preparada são adicionados à membrana na coluna de cada amostra, incubados por 15 min a RT. A seguir, 200 µl de solução de lavagem de coluna são adicionados e centrifugados por 15 s a 12.000-14.000g. Após isso, 500 µl de solução de lavagem de RNA são adicionados e centrifugados por 30 s a 12.000-14.000g e o líquido é descartado. A minicoluna é colocada em um novo tubo de coleta e 300 µl de solução de lavagem de RNA são adicionados e centrifugados a 14.000 g por 2 min. Cada minicoluna é colocada em um tubo de iluição e água livre de nuclease é adicionada à membrana e centrifugada 1 min. Por último, a concentração de RNA é medida no Nanodrop.

Síntese de cDNA

[00148] A síntese de cDNA é realizada usando o kit de síntese de cDNA Verso (Thermo Fisher) com 500 ng ou 1000 ng de entrada de RNA. A mistura de RNA é preparada levando a quantidade desejada de RNA e completando-a até um volume total de 11 µl pela adição de água. A mistura é aquecida por 5 min a 70°C, a seguir resfriada. A mistura de cDNA é preparada de acordo com o esquema de pipetagem provido pelo fornecedor. 9 µl de mistura de cDNA são colocados em um tubo de reação e 11 µl de mistura de RNA são adicionados e são mantidos no ciclizador térmico por 30 min a 42°C e 2 min a 95°C.

PCR

[00149] A PCR é realizada usando o kit AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase 1000U (Applied Biosystems). Uma PCR mastermix é preparada pela adição de 1 µl de cDNA, 2,5 µl de 10x tampão, 3 µl de MgCl2, 0,5 µl de dNTPs, 1 µl de cada iniciador, 0,5 µl de Taq polymerase e pela adição de água para completar 25 µl. O programa PCR é como a seguir; 95°C por 5 min, 95°C por 30 s, 55°C por 30 s, 72°C por 1 min para 35 ciclos e 72°C por 7 min. Após PCR, as amostras foram executadas no Bioanalyzer usando o kit e programa DNA 1000 (Agilent).

Purificação da amostra de PCR

[00150] As amostras são purificadas usando um kit de limpeza de PCR Nucleospin (Macherey-Nagel) para assegurar a remoção de contaminação de produtos de PCR. 1 volume de amostra de PCR é miturado com 2 volumes NT1 e as amostras são carregadas no gel NucleoSpin® e a coluna de limpeza de PCR é colocada em um tubo de coleta e centrifugada por 30 s a 11000 x g. O líquido é descartado e a coluna é colocada novamente no tubo de coleta. 700 µl de tampão NT3 para o NucleoSpin® Gel são adicionados e centrifugados por 30 s a 11000 x g. A etapa de lavagem é repetida e os tubos são centrifugados por 1 min a 11000 x g para remover o tampão NT3.

[00151] O gel NucleoSpin® e a coluna de limpeza de PCR são coloados em um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml, 15-30 µl de tampão NE são adicionados e incubados por 1 min à temperatura ambiente, a seguir centrifugados por 1 min a 11000 x g. A concentração de DNA é medida pelo uso do método Nanodrop.

Digestão de Restrição

[00152] Após a limpeza de PCR, o amplicon SERPINA1 é submetido à digestão de restrição Hyp99I. A enzima reconhece a última G na sequência CGACG em WT e corta o amplicon em dois pedaços, mas ela não pode cortar a sequência CGACA na versão mutante devido á ausência da segunda G. Assim, se a edição for bem-sucedida, haverá algum DNA WT como um substrato para a digestão de restrição Hyp99I. 1 unidade de Hyp99I (NEB) é usada para digerir 0,1 µg de DNA. Uma entrada de DNA de 0,5 µg é usada. As amostras são diluídas em água livre de nuclease e incubadas por 1-1,5 hora a 37°C, a enzima é inativada por incubação subsequente das amostras a 65°C por 20 min. Após a incubação, as amostras são carregadas no Bioanalyzer usando o kit e programa DNA1000 (Agilent) e para visualizar os resultados.

PCR Taqman

[00153] O ensaio de genotipização de SNP é realizado usando o ensaio de genotipização de SNP personalizado SERPINA1 (ThermoFisher Scientific). Este ensaio é realizado em paralelo ao ensaio de digestão da enzima de restrição para explorar qual ensaio é mais sensível para a detecção da edição. As sondas específicas para WT e SERPINA1 mutante têm diferentes grupos fluorescentes fixados, VIC e FAM, respectivamente. Assim, se pode quantificar o aumento ou diminuição nas quantidades de transcritos de WT/mutantes. A mistura de reação é preparada pela adição de 5 µl de master mix e 0,5 µl de mistura de sonda-iniciador. As sequências de oligos usadas são: sonda de WT (SEQ ID NO: 29), sonda mutante (SEQ ID NO: 30), iniciador para a frente (SEQ ID NO: 31), e iniciador reverso (SEQ ID NO: 32). 5,5 µl de mistura de reação são adicionados às cavidades designadas de uma placa de 96 cavidades. 4,5 µl de cDNA são adicionados a cada cavidade. O programa PCR é executado como a seguir: 95°C por 10 min, 92°C por 15 s e 60°C por 90 s por 50 ciclos. Os resultados foram analisados pelo uso do CFX Manager.

Exemplo 5: Reversão de uma mutação por substituição de aminoácido G2019S no transcrito LRRK2 pela edição direcionada de A a I para o tratamento de mal de Parkinson

[00154] As mutações nos domínios catalítico Roc-COR e de cinase de gene de cinase de repetição tica em leucina 2 (gene LRRK2 ID: 120892) são uma causa comum de mal de Parkinson (PD) familiar. Foi decidido direcionar a mutação de G2019S no transcrito pré-mRNA LRRK2 (Transcript RefSeq NM_198578.3) usando AONs capazes de recrutar ADAR1 e 2 em virtude da porção GluRB de comprimento total ou encurtado como porção de recrutamento ligada a uma porção de direcionamento com complementaridade à sequência circundando a mutação G a A no éxon 41 na posição G6055 (vide a sequência abaixo com a G mutada sublinhada). Esta mutação também é identificada como variação Genbank dbSNP rs34637584, comumente referida como G2019S.

[00155] Sequência de éxon 41 LRRK2 com o resíduo de G de wt destacado na posição 6055: ATACCTCCACTCAGCCATGATTATATACCGAGACCTGAAACCCCACAATGTGCTGCTTT TCACACTGTATCCCAATGCTGCCATCATTGCAAAGATTGCTGACTACGGCATTGCTCAG TACTGCTGTAGAATGGGGATAAAAACATCAGAGGGCACACCAG (SEQ ID NO: 33)

[00156] Alelo mutante e translação: GCT GAC TAC AGC ATT GCT CAG SEQ ID NO: 34 Ala Asp Tyr Ser Ile Ala Gln SEQ ID NO: 35

[00157] Alelo normal e translação (após edição de A a I): GCT GAC TAC GGC ATT GCT CAG SEQ ID NO: 3 6 Ala Asp Tyr Gly Ile Ala Gln SEQ ID NO: 37

[00158] As seguintes sequências foram designadas para serem direcionadas à mutação de LRRK2 G2019S. Os nucleotídeos em negrito formam a porção de direcionamento; todos os nucleotídeos são 2'-OMe exceto aqueles sublinhados; * designa uma ligação PS. Os AONs variam no comprimento da porção de direcionamento seja de 25 (LRRK2- ADAR1 e LRRK2-ADAR3) ou 30 nucleotídeos (LRRK-ADAR2 e 4). Os AONs variam no comprimento da porção de recrutamento: porção de recrutamento GluRB encurtada (LRRK2-ADAR3 e 4) e porção de recrutamento GluRB de comprimento total (LRRK2- ADAR1 e 2).

[00159] A correção de LRRK2 é avaliada em fibroblastos mutantes LRRK2G6055A através de meios de sequenciamento de RNA, análise de western blot de estado de (auto)-fosforilação LRRK2 e leituras funcionais de fenótipos mitocondriais associados a LRRK2 estabelecidos (taxa de consumo de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial). Vide: Tatiana et al. (2012) Hum. Mol. Genet. 21 (19): 4201-4213; Smith et al. (2015) Molecular Neurobiology, 1-17; e Grünewald et al. (2014) Antioxidants & Redox Signaling, 20(13), 1955-1960.

[00160] A linhagem de fibroblasto homozigoto LRRK2G6055A fff-028 (Telethon Network of Genetic Biobanks), linhagens heterozigotas de G6055A ND29492, ND29542, ND29802 e linhagens de controle saudáveis GM023074, GM08402 (Coriell Institute) são transfectadas com LRRK2-ADAR AON usando Lipofectamine 2000. Após 48-96 horas de incubação, as seguintes analyses são realizadas: 1) Para detector o transcrito de LRRK2 editado de A-aI, as células são lisadas, RNA isolado por métodos padrão e submetidas à análise de sequenciamento de RNA semiquantitativa usando os seguintes iniciadores de sequenciamento de SEQ ID NOs: 42 & 43. As sequências de mRNA editadas de A-a-I aparecem após a transfecção de LRRK2-ADAR-AON. 2) A proteína LRRK2G6055A demonstrou anteriormente (Smith et al., 2015) mostrar aumentada autofosforilação em serina 955 após o tratamento com tensão com o agente de despolarização de membrana mitocondrial valinomicina (10 µM por 24 h), devido à atividade catalítica aumentada do domínio cinase, quando comparado a LRRK2wt. O tratamento com LRRK2-ADAR-AON reduz a fosforilação de serina-955 de células LRRK2G6055A tratadas com valinomicina pelo menos parcialmente, potencialmente ainda completamente para os níveis de tipo selvagem. Isto pode ser avaliado por análise western blot (Smith et al.) usando anticorpos LRRK2 fosfo- S955 (Abcam clone MJF-R11-(75-1)) e LRRK2 total (Abcam clone MJFF2 (c41-2)). 3) Os fibrosblastos LRRK2G6055A exibem alterações na respiração mitocondrial (OXPHOS), incluindo aumentado vazamento de próton (Smith et al., 2015; Grünewald et al., 2014) que pode ser revertido após transfecção de LRRK2- ADAR-AON. A taxa de consumo de oxigênio sob condições respiratórias basais e forçadas é avaliada usando um analisador de fluxo extracelular Seahorse XF24 (Seahorse Bioscience), um dispositivo que mede a concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura em intervalos de tempo de 2 s por sondas de sensor no estado sólido. Esta análise pode ser realizada com o kit XF Xell Mito Stress Test (Seahorse Bioscience), que, por tratamento sequencial com oligomicina, carbonil cianeto-4-(trifluorometóxi)fenil hidrazona (FCCP), rotenona e antimicina-A, pode determinar parâmetros metabólicos tais respiração basal, produção de ATP, vazamento de próton e respiração máxima. O ensaio é realizado de acordo com as instruções do fabricante e o vazamento de próton é definido como o consumo de oxigênio restante após o tratamento com oligomicina. 4) Os fibrosblastos LRRK2G6055A exibem potencial de membrana mitocondrial diminuído quando comparado às células de controle (Smith et al., 2015; Grünewald et al., 2014). O potencial de membrana mitocondrial é avaliado com o tetrametilrodamina metiléster (TMRM) de corante catiônico lipofílico, usado no modo de não resfriamento (0,5-30 nM, determinado empiricamente), carregado em meio de cultura livre de feno vermelho por 20 minutos. Após o carregamento com corante, a fluorescência de TMRM mitocondrial em estado constante é medida por microscopia confocal de célula viva e análise de imagem. A transfecção de LRRK2-ADAR-AON pode aumentar o potencial da membrane mitocondrial pelo menos parcialmente, potencialmente ainda completamente para controlar os níveis.

Conclusões

[00161] Os exemplos descritos acima mostram como fazer mudanças desejadas em uma sequência de RNA alvo pela edição direcionada ao sítio de nucleotídeos em uma molécula de RNA alvo usando construtos de oligonucleotídeo de acordo com a invenção. Os exemplos ensinam como remover um códon de terminação para reabrir a estrutura de leitura de um construto de expressão de GFP, criar um sítio de splice para mudar o padrão de emenda do RNA alvo que codifica CEP290 e como estabelecer uma substituição de aminoácido desejada ao fazer uma mudança em um códon na sequência de RNA alvo que codifica uma proteína CFTR mutante G551D. a edição de RNA bem-sucedida pode ser confirmada convenientemente, por exemplo, pela observação de células fluorescentes no caso da reversão da mutação sem sentido de GFP, pela observação de um deslocamento nas bandas RT-PR em um gel de tipo selvagem para mutante no caso de introdução do sítio de splice críptico no RNA de codificação CEP290 e pelo sequenciamento ou pelo uso de um ensaio funcional (por exemplo, um ensaio de câmara de Ussing), no caso da reversão da mutação de G551D no RNA de codificação CFTR e os similares. Trabalho similar em a-1-antitripsina (A1AT) e LRRK2 também pode ser realizado.

[00162] Entender-se-á que a invenção é descrita acima por meio de exemplo somente e modificações podem ser feitas enquanto permanecerem dentro do escopo e espírito da invenção.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[00163] SEQ ID NO: 1 construto de oligonucleotídeo de DNA-RNA editando uma mutação sem sentido em eGFP: cgcgcgttttcgcgcgGCUGAACCACUGCAC

[00164] SEQ ID NO: 2 construto de oligonucleotídeo de DNA-RNA criando um sítio de splice críptico em hCEP290: cgcgcgttttcgcgcgGAGAUACUCACAAUU

[00165] SEQ ID NO: 3 construto de oligonucleotídeo de DNA-RNA editando uma mutação de G551D em hCFTR: cgcgcgttttcgcgcgCGUUGACCUCCACUC

[00166] SEQ ID NO: 4 hCFTR DNA mostrando mutação de G551D hCFTR em minúsculas (n é T ou C) :

[00167] ATGCAGAGGTCGCCTCTGGAAAAGGCCAGCGTTGTCTCCAAACT TTTTTTCAGCTGGACCAGACCAATTTTGAGGAAAGGATACAGACAGCGCCTGGAATTGT CAGACATATACCAAATCCCTTCTGTTGATTCTGCTGACAATCTATCTGAAAAATTGGAA AGAGAATGGGATAGAGAGCTGGCTTCAAAGAAAAATCCTAAACTCATTAATGCCCTTCG GCGATGTTTTTTCTGGAGATTTATGTTCTATGGAATCTTTTTATATTTAGGGGAAGTCA CCAAAGCAGTACAGCCTCTCTTACTGGGAAGAATCATAGCTTCCTATGACCCGGATAAC AAGGAGGAACGCTCTATCGCGATTTATCTAGGCATAGGCTTATGCCTTCTCTTTATTGT GAGGACACTGCTCCTACACCCAGCCATTTTTGGCCTTCATCACATTGGAATGCAGATGA GAATAGCTATGTTTAGTTTGATTTATAAGAAGACTTTAAAGCTGTCAAGCCGTGTTCTA GATAAAATAAGTATTGGACAACTTGTTAGTCTCCTTTCCAACAACCTGAACAAATTTGA TGAAGGACTTGCATTGGCACATTTCGTGTGGATCGCTCCTTTGCAAGTGGCACTCCTCA TGGGGCTAATCTGGGAGTTGTTACAGGCGTCTGCCTTCTGTGGACTTGGTTTCCTGATA GTCCTTGCCCTTTTTCAGGCTGGGCTAGGGAGAATGATGATGAAGTACAGAGATCAGAG AGCTGGGAAGATCAGTGAAAGACTTGTGATTACCTCAGAAATGATTGAAAATATCCAAT CTGTTAAGGCATACTGCTGGGAAGAAGCAATGGAAAAAATGATTGAAAACTTAAGACAA ACAGAACTGAAACTGACTCGGAAGGCAGCCTATGTGAGATACTTCAATAGCTCAGCCTT CTTCTTCTCAGGGTTCTTTGTGGTGTTTTTATCTGTGCTTCCCTATGCACTAATCAAAG GAATCATCCTCCGGAAAATATTCACCACCATCTCATTCTGCATTGTTCTGCGCATGGCG GTCACTCGGCAATTTCCCTGGGCTGTACAAACATGGTATGACTCTCTTGGAGCAATAAA CAAAATACAGGATTTCTTACAAAAGCAAGAATATAAGACATTGGAATATAACTTAACGA CTACAGAAGTAGTGATGGAGAATGTAACAGCCTTCTGGGAGGAGGGATTTGGGGAATTA TTTGAGAAAGCAAAACAAAACAATAACAATAGAAAAACTTCTAATGGTGATGACAGCCT CTTCTTCAGTAATTTCTCACTTCTTGGTACTCCTGTCCTGAAAGATATTAATTTCAAGA TAGAAAGAGGACAGTTGTTGGCGGTTGCTGGATCCACTGGAGCAGGCAAGACTTCACTT CTAATGATGATTATGGGAGAACTGGAGCCTTCAGAGGGTAAAATTAAGCACAGTGGAAG AATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCA T CTT T GGTGTTTCCTATGAT GAATATAGATACAGAAGCGTCAT CAAAGCAT GCCAAC TA GAAGAGGACATCTCCAAGTTTGCAGAGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAAT CACACTGAGTGGAganCAACGAGCAAGAATTTCTTTAGCAAGAGCAGTATACAAAGATG CTGATTTGTATTTATTAGACTCTCCTTTTGGATACCTAGATGTTTTAACAGAAAAAGAA ATATTTGAAAGCTGTGTCTGTAAACTGATGGCTAACAAAACTAGGATTTTGGTCACTTC TAAAATGGAACATTTAAAGAAAGCTGACAAAATATTAATTTTGCATGAAGGTAGCAGCT ATTTTTATGGGACATTTTCAGAACTCCAAAATCTACAGCCAGACTTTAGCTCAAAACTC ATGGGATGTGATTCTTTCGACCAATTTAGTGCAGAAAGAAGAAATTCAATCCTAACTGA GACCTTACACCGTTTCTCATTAGAAGGAGATGCTCCTGTCTCCTGGACAGAAACAAAAA AACAATCTTTTAAACAGACTGGAGAGTTTGGGGAAAAAAGGAAGAATTCTATTCTCAAT CCAATCAACTCTATACGAAAATTTTCCATTGTGCAAAAGACTCCCTTACAAATGAATGG CATCGAAGAGGATTCTGATGAGCCTTTAGAGAGAAGGCTGTCCTTAGTACCAGATTCTG AGCAGGGAGAGGCGATACTGCCTCGCATCAGCGTGATCAGCACTGGCCCCACGCTTCAG GCACGAAGGAGGCAGTCTGTCCTGAACCTGATGACACACTCAGTTAACCAAGGTCAGAA CATTCACCGAAAGACAACAGCATCCACACGAAAAGTGTCACTGGCCCCTCAGGCAAACT TGACTGAACTGGATATATATTCAAGAAGGTTATCTCAAGAAACTGGCTTGGAAATAAGT GAAGAAATTAACGAAGAAGACTTAAAGGAGTGCTTTTTTGATGATATGGAGAGCATACC AGCAGTGACTACATGGAACACATACCTTCGATATATTACTGTCCACAAGAGCTTAATTT TTGTGCTAATTTGGTGCTTAGTAATTTTTCTGGCAGAGGTGGCTGCTTCTTTGGTTGTG CTGTGGCTCCTTGGAAACACTCCTCTTCAAGACAAAGGGAATAGTACTCATAGTAGAAA TAACAGCTATGCAGTGATTATCACCAGCACCAGTTCGTATTATGTGTTTTACATTTACG TGGGAGTAGCCGACACTTTGCTTGCTATGGGATTCTTCAGAGGTCTACCACTGGTGCAT ACTCTAATCACAGTGTCGAAAATTTTACACCACAAAATGTTACATTCTGTTCTTCAAGC ACCTATGTCAACCCTCAACACGTTGAAAGCAGGTGGGATTCTTAATAGATTCTCCAAAG ATATAGCAATTTTGGATGACCTTCTGCCTCTTACCATATTTGACTTCATCCAGTTGTTA TTAATTGTGATTGGAGCTATAGCAGTTGTCGCAGTTTTACAACCCTACATCTTTGTTGC AACAGTGCCAGTGATAGTGGCTTTTATTATGTTGAGAGCATATTTCCTCCAAACCTCAC AGCAACTCAAACAACTGGAATCTGAAGGCAGGAGTCCAATTTTCACTCATCTTGTTACA AGCTTAAAAGGACTATGGACACTTCGTGCCTTCGGACGGCAGCCTTACTTTGAAACTCT GTTCCACAAAGCTCTGAATTTACATACTGCCAACTGGTTCTTGTACCTGTCAACACTGC GCTGGTTCCAAATGAGAATAGAAATGATTTTTGTCATCTTCTTCATTGCTGTTACCTTC ATTTCCATTTTAACAACAGGAGAAGGAGAAGGAAGAGTTGGTATTATCCTGACTTTAGC CATGAATATCATGAGTACATTGCAGTGGGCTGTAAACTCCAGCATAGATGTGGATAGCT TGATGCGATCTGTGAGCCGAGTCTTTAAGTTCATTGACATGCCAACAGAAGGTAAACCT ACCAAGTCAACCAAACCATACAAGAATGGCCAACTCTCGAAAGTTATGATTATTGAGAA TTCACACGTGAAGAAAGATGACATCTGGCCCTCAGGGGGCCAAATGACTGTCAAAGATC TCACAGCAAAATACACAGAAGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACATTTCCTTCTCAATA AGTCCTGGCCAGAGGGTGGGCCTCTTGGGAAGAACTGGATCAGGGAAGAGTACTTTGTT ATCAGCTTTTTTGAGACTACTGAACACTGAAGGAGAAATCCAGATCGATGGTGTGTCTT GGGATTCAATAACTTTGCAACAGTGGAGGAAAGCCTTTGGAGTGATACCACAGAAAGTA TTTATTTTTTCTGGAACATTTAGAAAAAACTTGGATCCCTATGAACAGTGGAGTGATCA AGAAATATGGAAAGTTGCAGATGAGGTTGGGCTCAGATCTGTGATAGAACAGTTTCCTG GGAAGCTTGACTTTGTCCTTGTGGATGGGGGCTGTGTCCTAAGCCATGGCCACAAGCAG TTGATGTGCTTGGCTAGATCTGTTCTCAGTAAGGCGAAGATCTTGCTGCTTGATGAACC CAGTGCTCATTTGGATCCAGTAACATACCAAATAATTAGAAGAACTCTAAAACAAGCAT TTGCTGATTGCACAGTAATTCTCTGTGAACACAGGATAGAAGCAATGCTGGAATGCCAA CAATTTTTGGTCATAGAAGAGAACAAAGTGCGGCAGTACGATTCCATCCAGAAACTGCT GAACGAGAGGAGCCTCTTCCGGCAAGCCATCAGCCCCTCCGACAGGGTGAAGCTCTTTC CCCACCGGAACTCAAGCAAGTGCAAGTCTAAGCCCCAGATTGCTGCTCTGAAAGAGGAG ACAGAAGAAGAGGTGCAAGATACAAGGCTT

[00168] SEQ ID NO: 5 - porção de recrutamento exemplar CGCGCGTTTTCGCGCG

[00169] SEQ ID NO: 6 - porção de recrutamento exemplar AUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAU

[00170] SEQ ID NO: 7 - porção de recrutamento exemplar UAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA

[00171] SEQ ID NO: 8 - porção de . direcionamento genérico NNNNNNNNNNNNNNNNNCNNN

[00172] SEQ ID NO: 9 GCAACUAGAGGUGAG

[00173] SEQ ID NO: 10 TGCTAAGTACAGGGACATCTTGC

[00174] SEQ ID NO: 11 AGACTCCACTTGTTCTTTTAAGGAG

[00175] SEQ ID NO: 12 TGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTG

[00176] SEQ ID NO: 13 AGGAGATGTTTTCACACTCCAGGT

[00177] SEQ ID NO: 14 CTGGCCCCAGTTGTAATTTGTGA

[00178] SEQ ID NO: 15 CTGTTCCCAGGCTTGTTCAATAGT

[00179] SEQ ID NO: 16 GUGUUGGCCAUGGAACAUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA

[00180] SEQ ID NO: 17 UAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUGUUGGCCAUGGAACA

[00181] SEQ ID NO: 18 GUGUUGGCCAUGGAACAUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA

[00182] SEQ ID NO: 19 GUGUUGGCCAUGGAACAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAU

[00183] SEQ ID NO: 20 GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUGUUGGCCAUGGAACA

[00184] SEQ ID NO: 21 GUGUUGGCCAUGGAACAGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCC

[00185] SEQ ID NO: 22 GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUGUUGGCCAUGGAACA

[00186] SEQ ID NO: 23 GGAAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUCCC

[00187] SEQ ID NO: 24 GUGGAAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUCCCAC

[00188] SEQ ID NO: 25 GUGGNAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUNCCAC

[00189] SEQ ID NO: 26 GCCTGGCACCATTAAAGAAA

[00190] SEQ ID NO: 27 GCATCTTTGTATACTGCTCTTGCT

[00191] SEQ ID NO: 28 GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCCAGUCCCUUUCUCGUCGA UGGUCAG

[00192] SEQ ID NO: 29 CCATCGACGAGAAAG

[00193] SEQ ID NO: 30 CATCGACAAGAAAG

[00194] SEQ ID NO: 31 TCCAGGCCGTGCATAAGG

[00195] SEQ ID NO: 32 GCCCCAGCAGCTTCAG

[00196] SEQ ID NO: 33 ATACCTCCACTCAGCCATGATTATATACCGAGACCTGAAACCCCACAATGTGCTGCTTT T CACAC TGTATCCCAATGCTGCCAT CAT TGCAAAGAT TGCT GAC TACGGCAT TGCT CAG TACTGCTGTAGAATGGGGATAAAAACATCAGAGGGCACACCAG

[00197] SEQ ID NO: 34 GCTGACTACAGCATTGCTCAG

[00198] SEQ ID NO: 35 ADYSIAQ

[00199] SEQ ID NO: 36 GCTGACTACGGCATTGCTCAG

[00200] SEQ ID NO: 37 ADYGIAQ

[00201] SEQ ID NO: 38 GUGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACACUGAGCAAUGCcG UAGUCAGCAAU

[00202] SEQ ID NO: 39 GUGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACGUACUGAGCAAUGC cGUAGUCAGCAAUCUU

[00203] SEQ ID NO: 40 GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACUGAGCAAUGCcGUAGU CAGCAAU

[00204] SEQ ID NO: 41 GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUACUGAGCAAUGCcGUA GUCAGCAAUCUU

[00205] SEQ ID NO: 42 GTTTGAGATACCTCCACTCAGC

[00206] SEQ ID NO: 43 AGGTGCACGAAACCCTGGTG.

Claims

1. Construto de oligonucleotídeo para a edição direcionada ao sítio de um nucleotídeo adenosina em uma sequência de RNA alvo em uma célula eucariótica caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma porção de direcionamento, compreendendo uma sequência antissentido complementar à parte do RNA alvo; e (b) uma porção de recrutamento que seja capaz de formar uma estrutura em haste-laço intramolecular e capaz de se ligar e recrutar uma hADAR1 ou hADAR2 naturalmente presente na célula que é capaz de realizar a edição do nucleotídeo adenosina.

2. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a porção de recrutamento não é complementar à sequência alvo.

3. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a porção de direcionamento compreende uma sequência de oligorribonucleotídeo que forma uma estrutura de dsRNA mediante o pareamento de bases com a sequência de RNA alvo.

4. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que a porção de direcionamento compreende um nucleotídeo não complementar em uma posição oposta ao nucleotídeo adenosina a ser editado na sequência de RNA alvo.

5. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadopelo fato de que a célula é uma célula humana.

6. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que o nucleotídeo não complementar é uma citidina ou uma uridina, preferivelmente uma citidina.

7. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que uma sequência de ácido nucleico capaz de formar uma estrutura intramolecular em haste-laço é uma sequência de oligorribonucleotídeo (RNA).

8. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que uma porção de recrutamento compreende uma estrutura em haste-laço compreendendo uma sequência (RY ou YR)nNm(RY ou YR)n, em que R é adenosina ou guanosina, Y é uridina ou citidina, N é adenosina, guanosina, citidina, uridina, ou inosina, n é 3 ou mais, m é 4 ou mais, e em que N forma um laço e as duas sequências (RY)n ou (YR)n formam uma estrutura em haste de duplo filamento através de pareamento de bases complementar.

9. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizadopelo fato de que o laço é um tetranucleotídeo ou um pentanucleotídeo tendo a sequência: GCUMA, em que G é guanosina, C é citidina, M é adenosina ou citidina e U é uridina, preferivelmente, GCUAA.

10. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que uma porção de recrutamento compreende sequência de nucleotídeo: 5'-AUANaUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANbUAU-3' (SEQ ID NO: 6), em que Na e Nb são, cada um, nucleotídeos únicos os quais podem ser A, G, C ou U, contanto que Na e Nb formem um par de base incompatível mediante a formação de uma estrutura em haste-laço, ou 5'-UAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA-3' (SEQ ID NO: 7).

11. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 7 ou 9, caracterizadopelo fato de que uma porção de recrutamento compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 6, 7, 20, 21, 22, 23 e 24.

12. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 7 ou 9, caracterizadopelo fato de que a estrutura em haste-laço de dsRNA é derivada de ou imita a sequência de RNA que codifica o domínio B da proteína GluR humana.

13. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que uma porção de recrutamento compreende uma sequência de deoxioligonucleotídeo compreendendo a sequência (CG)3T4(CG)3 (SEQ ID NO: 5), em que C é citidina, G é guanosina e T é timidina.

14. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que um ou mais dos nucleotídeos compreende uma modificação química.

15. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a porção de direcionamento do construto de oligonucleotídeo compreende um ou mais 2’-O ribosil uridinas substituídas, preferivelmente 2’-OMe uridinas substituídas.

16. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que todas as adenosinas opostas a uridinas na sequência de RNA alvo que não são um alvo para a edição são 2’-metóxi-(2’-OMe) uridina.

17. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a porção de direcionamento e a porção de recrutamento são separadas por uma sequência ligante, compreendendo uma sequência de oligonucleotídeo, uma sequência de oligopeptídeo ou outra ligação química covalente, tal como PEG.

18. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a porção de direcionamento é essencialmente ininterrupta e forma a parte 5’ do construto de oligonucleotídeo e a porção de recrutamento forma a parte 3’ do construto de oligonucleotídeo.

19. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a porção de direcionamento é essencialmente ininterrupta e forma a parte 3’ do construto de oligonucleotídeo e a porção de recrutamento forma a parte 5’ do construto de oligonucleotídeo.

20. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a porção de direcionamento é interrompida pela porção de recrutamento, tal que a porção de direcionamento forma a parte 5’ e a parte 3’ do construto de oligonucleotídeo e a porção de recrutamento forma a parte do meio do construto de oligonucleotídeo.

21. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a porção de recrutamento faz um laço quando a porção de direcionamento faz o anelamento com a sequência de RNA alvo através de pareamento de bases complementar.

22. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizadopelo fato de que o comprimento do oligonucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: entre 20 e 100 nucleotídeos, entre 24 e 60 nucleotídeos, e entre 30 e 50 nucleotídeos.

23. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizadopelo fato de que a sequência de RNA alvo é selecionada do grupo consistindo em um RNA pré-mensageiro, um RNA mensageiro, um RNA ribossômico, um RNA de transferência e um miRNA.

24. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizadopelo fato de ser para uso na edição direcionada ao sítio de um nucleotídeo em um RNA alvo em uma célula eucariótica, preferivelmente uma célula mamífera, mais preferivelmente uma célula humana, por meio da ação de uma enzima de edição de RNA naturalmente presente na dita célula e capaz de realizar a edição do dito nucleotídeo.

25. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizadopelo fato de que o RNA alvo codifica CFTR, A1AT ou LRRK2.

26. Construto de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a porção de recrutamento compreende uma sequência derivada de qualquer uma das seguintes porções: (i) uma sequência de RNA que codifica para o domínio B da proteína GluR humana; (ii) uma sequência de RNA que codifica para o domínio de ligação da entidade de edição de RNA de GluR-C, GluR-D ou um receptor de serotonina 5-HT2c; (iii) um RNA ou estrutura de haste-laço de DNA compreendendo a sequência (RY ou YR)nNm(RY ou YR)n, em que R é adenosina ou guanosina, Y é uridina ou citidina, N é adenosina, guanosina, citidina, uridina ou inosina, n é 3 ou mais, m é 4 ou mais e em que N forma um laço e as duas sequências (RY)n ou (YR)n formam uma estrutura de haste-laço dupla por meio de emparelhamento de bases complementares; (iv) uma estrutura de haste-laço de DNA compreendendo a sequência (CG)3N1-Nn(CG)3 (SEQ ID NO: 44), em que cada um de N1 a Nn pode ser igual ou diferente e selecionado a partir do grupo que consiste em guanosina, adenosina, timidina, citidina e inosina, e 'n'está entre 2 e 20; (v) um pentanucleotídeo possuindo a sequência: GCUMA, em que G é guanosina, C é citidina, M é adenosina ou citidina e U é uridina; e (vi) um aptâmero selecionado para ligação a hADAR1 ou hADAR2.

27. Uso de um construto de oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizadopelo fato de ser para o preparo de uma composição farmacêutica para a edição direcionada ao sítio de um nucleotídeo em um RNA alvo em uma célula eucariótica, preferivelmente, uma célula mamífera, mais preferivelmente uma célula humana, por meio da ação de uma entidade de edição de RNA naturalmente presente na dita célula e capaz de realizar a edição do dito nucleotídeo.