JP2023528039A - 改変環状ポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドを含むベクター、改変ポリヌクレオチドの核酸、その医薬組成物、改変ポリヌクレオチドを作製する方法、及び上記のそれらを投与することにより疾患または状態を処置または予防する方法が本明細書に開示される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月２６日に提出された仮出願第６３／０２９，９９６号、２０２０年１１月１１日に提出された仮出願第６３／１１２，４８８号、２０２０年１２月１日に提出された仮出願第６３／１１９，９０２号、及び２０２１年４月２２日に出願された仮出願第６３／１７８，０５６号の、米国特許法１１９条に基づく優先権を主張し、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月２６日に提出された仮出願第６３／０２９，９９６号、２０２０年１１月１１日に提出された仮出願第６３／１１２，４８８号、２０２０年１２月１日に提出された仮出願第６３／１１９，９０２号、及び２０２１年４月２２日に出願された仮出願第６３／１７８，０５６号の、米国特許法１１９条に基づく優先権を主張し、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
参照による組み込み
本明細書で記載される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で記載される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
第１のスペーサードメイン、疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、及び第２のスペーサードメインを含む、前駆改変線状ポリヌクレオチドが本明細書に開示され、第１または第２のスペーサードメインが、標的ＲＮＡに実質的に相補的であり、前駆改変線状ポリヌクレオチドの転写物が、哺乳動物細胞への前駆改変線状ポリヌクレオチドの挿入時に環状化し、それにより、環状化された改変ポリヌクレオチドを形成し、標的化ドメインが標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される。いくつかの実施形態では、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第１のスペーサードメイン、標的化ドメイン、及び第２のスペーサードメインを含み得る。いくつかの実施形態では、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、第１のスペーサードメインの５’側または第２のスペーサードメインの３’側に、リボザイムドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、リボザイムドメイン及び第１のスペーサードメイン間、またはリボザイムドメイン及び第２のスペーサードメイン間に、ライゲーションドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、自己環状化後に、第１のスペーサードメイン及び第２のスペーサードメインは、環状化された改変ポリヌクレオチドの全長の約４０％～約７０％であり得るフィラー配列である。いくつかの実施形態では、自己環状化後に、第１のスペーサードメイン及び第２のスペーサードメインは、環状化された改変ポリヌクレオチドの全配列の約５０％～約６７％であり得るフィラー配列であり得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、別途、フィラー配列を欠く同等の環状化されたポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡへの標的化ドメインのハイブリダイゼーションを増加させ得る。いくつかの実施形態では、自己環状化後に、環状化された改変ポリヌクレオチドの全長は、約１５０ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、自己環状化後に、環状化された改変ポリヌクレオチドの全長は、約２００ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の相補性を有し得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に実質的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡのイントロン領域に実質的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、翻訳開始部位（ＴＩＳ）に実質的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）に実質的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡとミスマッチし得る少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、編集を欠く別の方法で同等の標的ＲＮＡの翻訳されたタンパク質と比較して、塩基の編集は、塩基の編集を伴う標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質またはそのフラグメントのレベルを増加させ得るか、タンパク質またはそのフラグメントの長さを増加させ得るか、タンパク質またはそのフラグメントの機能性を増加させ得るか、タンパク質またはそのフラグメントの安定性を増加させ得るか、またはその任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、塩基の編集により、センスコドンが終止コドンに変換され得る。いくつかの実施形態では、センスコドンは、疾患の病原経路に関与し得る。いくつかの実施形態では、センスコドンを終止コドンに変換すると、疾患の病原経路が減少し得る。いくつかの実施形態では、塩基の編集により、終止コドンがセンスコドンに変換され得る。いくつかの実施形態では、終止コドンは、疾患の病原経路に関与し得る。いくつかの実施形態では、終止コドンをセンスコドンに変換すると、疾患の病原経路が減少し得る。いくつかの実施形態では、塩基の編集により、第１のセンスコドンが第２のセンスコドンに変換される。いくつかの実施形態では、第１のセンスコドンは、疾患の病原経路に関与し得る。いくつかの実施形態では、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換すると、疾患の病原経路が低減し得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチド；または約１００ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集酵素は、ＡＤＡＲタンパク質またはＡＰＯＢＥＣタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集酵素は、ＡＤＡＲを含み得、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集酵素は、ＡＤＡＲを含み得、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ２であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集酵素は、ＡＤＡＲを含み得、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ３であり得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、アプタマーを含まない可能性がある。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、大脳基底核及び小脳の萎縮を伴う髄鞘形成不全（Ｈ－ＡＢＣ）、または嚢胞性線維症を含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＴＵＢＢ４Ａを含み得、ＴＵＢＢ４Ａは、Ｄ２４９Ｎ変異を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＬＲＲＫ２を含み得、ＬＲＲＫ２は、Ｇ２０１９Ｓ変異を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３９、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１を含み得、ＳＥＲＰＩＮＡ１は、Ｅ３４２Ｋ変異を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、配列番号６４または配列番号６５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＳＮＣＡを含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、翻訳開始部位（ＴＩＳ）を標的とするように、標的化ドメインを設計することができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＡＰＰを含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、配列番号６１、配列番号６２、または配列番号６３と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＡＢＣＡ４を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、配列番号５８、配列番号５９、または配列番号６０と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＤＭＤを含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、配列番号５６または配列番号５７と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含み得る。
また、５’から３’の順に、以下を含む前駆改変ポリヌクレオチドが本明細書に開示される：第１のリボザイムドメイン；第１ライゲーションドメイン；第１のスペーサードメイン；疾患または状態と関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、第２のライゲーションドメイン、及び第２のリボザイムドメイン。いくつかの実施形態では、第１のスペーサードメインは、標的ＲＮＡに実質的に相補的でない可能性がある。いくつかの実施形態では、前駆改変線状ポリヌクレオチドの転写物は、哺乳動物細胞への前駆改変線状ポリヌクレオチドの挿入時に環状化し、それにより、環状化された改変ポリヌクレオチドが形成され得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインが標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進され得る。
疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、及び標的ＲＮＡに実質的に相補的でないスペーサードメインを含む、改変環状ポリヌクレオチドも本明細書に開示され、１つ以上のヌクレオチドの付加により、スペーサードメインが改変環状ポリヌクレオチドを拡大し、標的化ドメインが標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される。いくつかの実施形態では、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、及び、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を決定することができる。いくつかの実施形態では、改変環状ポリヌクレオチドは、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない可能性がある。いくつかの実施形態では、改変環状ポリヌクレオチドは、さらに、ＲＮＡ編集酵素動員ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集酵素動員ドメインは、改変ポリヌクレオチドに関連する場合に、標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基に対し化学変換を実施することができるＲＮＡ編集酵素を動員し得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ナンセンス変異を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡとミスマッチし得る少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、大脳基底核及び小脳の萎縮を伴う髄鞘形成不全（Ｈ－ＡＢＣ）、または嚢胞性線維症を含み得る。
本明細書に開示の前駆改変線状ポリヌクレオチド、または本明細書に開示の改変環状ポリヌクレオチドを含むベクターもまた、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、これらのいずれかのキメラ、またはこれらのいずれかのバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補型アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、一本鎖ＡＡＶベクターであり得る。
本明細書に開示の前駆改変線状ポリヌクレオチド、本明細書に開示の改変環状ポリヌクレオチド、または本明細書に開示のベクター、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む単位用量形態の医薬組成物もまた、本明細書に開示される。
疾患または状態を処置または予防する方法をそれを必要とする対象において行う方法も本明細書に開示され、方法は、治療有効量の本明細書に開示の前駆改変線状ポリヌクレオチド、本明細書に開示の改変環状ポリヌクレオチド、本明細書に開示のベクター、または本明細書に開示の医薬組成物を投与することを含む。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより得られるであろう。
概要
ＲＮＡ編集は、遺伝情報を変更する治療の機会を提供し得る。ＲＮＡ編集分野における重要なハードルは、非効率的な編集であり得る。ＲＮＡ編集効率を改善する方法は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または改変ポリヌクレオチドの合成、安定性、標的化効率、または局在化を増加させることを含み得る。ＲＮＡ編集効率を増加するために、改変ポリヌクレオチドへの修飾を行うことができる。
ＲＮＡ編集は、遺伝情報を変更する治療の機会を提供し得る。ＲＮＡ編集分野における重要なハードルは、非効率的な編集であり得る。ＲＮＡ編集効率を改善する方法は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または改変ポリヌクレオチドの合成、安定性、標的化効率、または局在化を増加させることを含み得る。ＲＮＡ編集効率を増加するために、改変ポリヌクレオチドへの修飾を行うことができる。
いくつかの実施形態では、改変ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び改変ポリヌクレオチドを、本明細書に開示することができ、標的化ドメイン及びスペーサードメインを含み得る。そのような改変ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティに関して標的ＲＮＡの編集効率を高め得る。
いくつかの実施形態では、前駆改変ガイドポリヌクレオチドを本明細書に開示することができる。本明細書に記載の改変ガイドＲＮＡまたは改変ガイドポリヌクレオチドを得るために、前駆改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変線状ポリヌクレオチドを使用することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に開示することができ、改変ポリヌクレオチド、改変ガイドＲＮＡ、または前駆改変ガイドＲＮＡを含み得る。
いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に開示することができ、改変ポリヌクレオチド、改変ガイドＲＮＡ、または前駆改変ガイドＲＮＡを含み得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示することができ、改変ポリヌクレオチド、改変ガイドＲＮＡ、前駆改変ガイドＲＮＡ、ベクター、または核酸、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示することができ、改変ポリヌクレオチド、改変ガイドＲＮＡ、前駆改変ガイドＲＮＡ、ベクター、核酸、医薬組成物、及び容器を含み得る。
いくつかの実施形態では、疾患もしくは状態を処置することを、それを必要とする対象において行う方法、または、疾患もしくは状態を予防することを、それを必要とする対象において行う方法を本明細書に開示することができる。そのような方法は、改変ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、ベクター、核酸、または医薬組成物を、対象に投与することを含み得る。
いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチドを形成する方法を本明細書に開示することができる。そのような方法は、ライゲーションエンティティで、前駆改変線状ポリヌクレオチドの３’末端の第１のヌクレオチドを、前駆改変線状ポリヌクレオチドの５’末端の第２のヌクレオチドに直接的または間接的にライゲーションし、それにより、改変ポリヌクレオチドを形成することを含み得る。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためのものであり得、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきではない。いくつかの場合では、セクションの見出しは、記載される主題を限定するものとして構成されていない可能性がある。
明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ポリペプチド」という用語は、それらの混合物を含む複数のポリペプチドを含む。
量または濃度などの測定可能な値を指す場合の、本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、いくつかの場合では、所定の量の約２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味し得る。いくつかの場合では、量または濃度などの測定可能な値に言及する場合の、本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、所定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣例により、±１０％を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の±２０％、±１０％、±５％、または±１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物学的システムまたはプロセスに関して、当該用語は、値から１桁以内、５倍以内、または２倍以内を意味し得る。出願及び特許請求の範囲に、特定の値を記載することができる場合、別途記載のない限り、特定値の許容誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるべきである。また、値の範囲、部分範囲、またはその両方を指定することができる場合、範囲または部分範囲は、範囲または部分範囲の終点を含み得る。大きさ、位置、またはその両方を記載する場合、「実質的に」、「実質的にない」、「実質的に含まない」、及び「ほぼ」という用語は、記載の値が、値の妥当な予想された範囲内であり得ることを示すために使用することができる。例えば、数値は、記載の値（または値の範囲）の±０．１％、記載の値（または値の範囲）の±１％、記載の値（または値の範囲）の±２％、記載の値（または値の範囲）の±５％、記載の値（または値の範囲）の±１０％などであり得る値を有し得る。本明細書に列挙される任意の数値範囲は、その中に包含される全ての部分範囲を含むことを意図することができる。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味することを意図することができる。組成物及び方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる」は、意図される使用のための組み合わせに対して任意の本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものである。従って、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法からの微量混入物質、ならびに薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤など、を排除しないであろう。「からなる」は、他の成分の微量要素を超える要素及び本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップを排除することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれにより定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。
「対象」、「宿主」、「個体」、及び「患者」という用語は、動物、通常は、哺乳動物、を指すために、本明細書では交換可能に使用することができる。いくつかの場合では、対象または宿主は、原核生物を含み得る。いくつかの場合では、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドを、原核生物に投与することができる。例えば、原核生物への投与は、改変ポリヌクレオチド、またはファージによる、もしくはポリヌクレオチドのエレクトロポレーションによる、前駆改変ポリヌクレオチドの投与を含み得る。本明細書に記載の方法、細胞、または組成物により、任意の好適な哺乳動物を処置することができる。哺乳動物は、本明細書に記載されるように、ベクター、改変ガイドＲＮＡ、前駆体ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、核酸、または医薬組成物を投与することができる。哺乳動物の非限定例は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌ及びネコ）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、ならびに実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトであり得る。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発達段階（例えば、成人、十代、子供、乳児、または子宮内の哺乳動物）であり得る。哺乳動物は、雄または雌であり得る。哺乳動物は、妊娠中の雌であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、神経変性疾患などの疾患を有するか、または有する疑いがあり得る。いくつかの実施形態では、対象は、がんまたは新生物障害を有するか、または有する疑いがある可能性がある。他の実施形態では、対象は、異常なタンパク質発現に関連する疾患または障害を有するか、または有する疑いがある可能性がある。いくつかの場合では、ヒトは、生後約１日～生後約１０ヶ月、生後約９ヶ月～生後約２４ヶ月、約１歳～約８歳、約５歳～約２５歳、約２０歳～約５０歳、約１歳～約１３０歳まで、または約３０歳～約１００歳であり得る。ヒトは、約１、約２、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、または約１２０歳超であり得る。ヒトは、約１、約２、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０歳未満であり得る。
「処置すること」、「処置」などの用語は、本明細書では、所望の薬理学的効果、生理学的効果、またはそれらの任意の組み合わせを得ることを意味するように使用することができる。いくつかの場合では、処置は、疾患または障害に起因する有害事象を後退させ得る。いくつかの場合では、処置は、疾患または障害を安定させ得る。いくつかの場合では、処置は、疾患または障害の進行を遅延させ得る。いくつかの場合では、処置は、疾患または障害の退行を引き起こし得る。いくつかの場合では、処置は、疾患または障害の発生を予防し得る。いくつかの実施形態では、処置の効果を測定することができる。いくつかの場合では、組成物の投与前後で、測定値を比較することができる。例えば、対象は、癌の退行を示すために、処置後の画像と比較する処置前の医学的画像を有し得る。いくつかの場合では、対象は、治療前の血液検査と比較して、処置後に改善された血液検査結果を有し得る。いくつかの場合では、測定値を標準と比較することができる。
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、一般に、対象の任意のサンプル（例えば、血液サンプルまたは組織サンプル）を指し得る。サンプルまたはその一部は、幹細胞などの細胞を含んでもよい。いくつかの場合では、サンプルの一部は、癌細胞などの細胞について濃縮され得る。サンプルは、組織、細胞、血清、血漿、エクソソーム、体液、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。体液は、尿、血液、血清、血漿、唾液、粘液、脊髄液、涙、精液、胆汁、羊水、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。サンプルまたはその一部は、対象から得られた細胞外液を含んでもよい。サンプルまたはその一部は、無細胞核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡを含んでもよい。サンプルまたはその一部は、１つ以上の変異の存在または非存在について分析され得る。ゲノムデータは、サンプルまたはその一部から得られ得る。サンプルは、疾患または状態を有することが疑われるか、または確認されたサンプルであってよい。サンプルは、非侵襲的手法、最小侵襲的手法、または侵襲的手法を介して対象から取り出されたサンプルであってよい。サンプルまたはその一部は、組織ブラッシング、スワブ、組織生検、摘出組織、細針吸引、組織洗浄、細胞診標本、外科的切除、またはそれらの任意の組み合わせにより得られ得る。サンプルまたはその一部は、組織または組織型由来の細胞を含んでもよい。例えば、サンプルは、鼻組織、気管組織、肺組織、咽頭組織、喉頭組織、気管支組織、胸膜組織、肺胞組織、乳房組織、膀胱組織、腎臓組織、肝臓組織、結腸組織、甲状腺組織、子宮頸部組織、前立腺組織、心臓組織、筋肉組織、膵臓組織、肛門組織、胆管組織、骨組織、脳組織、脊髄組織、腎臓組織、子宮組織、卵巣組織、子宮内膜組織、膣組織、外陰部組織、子宮組織、胃組織、眼組織、副鼻腔組織、陰茎組織、唾液腺組織、腸組織、胆嚢組織、胃腸組織、膀胱組織、脳組織、脊髄組織、血液サンプル、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
「真核細胞」は、モネラを除く生命界の全てを含む。それらは、膜結合核により簡単に区別することができる。動物、植物、菌類、及び原生生物は、真核生物、またはその細胞が内部膜及び細胞骨格により複雑な構造に編成することができる生物であり得る。特徴的な膜結合構造は、核であり得る。「宿主」という用語は、例えば、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳動物細胞を含む真核宿主を含み得る。真核細胞または宿主の非限定例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類、及びヒトが挙げられる。
「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用することができ、最も広い意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合で結合され得る。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなど、で結合され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有してもよく、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然、非天然、または合成アミノ酸を指し得る。天然、非天然、または合成アミノ酸は、グリシンと、Ｄ及びＬの両方の光学異性体、アミノ酸アナログ、及びペプチド模倣体を含み得る。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、複数の天然タンパク質または組み換え産生タンパク質由来のドメインから構成されるタンパク質を指し得、これは、一般に、各ドメインが、異なる機能を果たす。この点に関しては、リンカーは、これらのドメインを一緒に結合するために、任意に、融合タンパク質ドメインのコンフォメーションを維持し、及び／またはそれぞれの機能を損なう可能性のある融合タンパク質ドメイン間の好ましくない相互作用を防止するために、使用することができるタンパク質フラグメントを指し得る。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指し得る。相同性は、比較のためにアラインすることができる各配列の位置を比較することにより決定することができる。比較された配列内の位置が、同じ塩基またはアミノ酸により占められ得る場合、分子は、その位置で相同となり得る。配列間の相同性の程度は、配列が共有する一致した、または相同である位置の数の関数であり得る。「無関係」または「非相同」配列は、本開示の配列の１つと、４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。配列相同性は、ある配列の参照配列に対する％同一性を指し得る。実際には、任意の特定の配列が、本明細書に記載の任意の配列（これは、本明細書に記載の特定の核酸配列と対応し得る）と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得るかどうかについて、従来の方法で、既知のコンピュータープログラム、例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７１１）を使用して、そのような特定のポリペプチド配列を決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば参照配列と９５％同一であるかどうかを判定する場合、参照配列の全長にわたって同一性の割合が計算され得るように、且つ、参照配列全体の最大５％の配列相同性のギャップが許容され得るように、パラメーターを設定することができる。
いくつかの場合では、Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７－２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づく、ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して、参照配列（クエリー配列、例えば、本開示の配列）及び対象配列（グローバル配列アラインメントとも呼ばれる）間の同一性を決定することができる。いくつかの実施形態では、ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される、同一性を狭く解釈することができる特定の実施形態のパラメーターは、スコアリングスキーム＝ＰＡＭ（パーセント受容変異）０、ｋタプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象配列の長さ（いずれか短い方であり得る）を含み得る。本実施形態によれば、対象配列が、内部欠失のためではなく、Ｎ末端またはＣ末端欠失のために、クエリー配列よりも短くなり得る場合、グローバルパーセント同一性を計算する時に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、対象配列のＮ末端及びＣ末端の切断の主要因でないという事実を考慮に入れるために、手動の補正を結果に行うことができる。Ｎ末端及びＣ末端で切断された対象配列については、クエリー配列と比較して、対象配列のＮ末端及びＣ末端の側方にあり得るクエリー配列の残基数を計算することにより、同一性パーセントを補正することができ、これを、クエリー配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／アラインさせることができる。残基が一致／アラインさせることができるかどうかの判定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果で判定することができる。次に、最終的なパーセント同一性スコアに到達するために、所定のパラメーターを使用して、ＦＡＳＴＤＢプログラムで計算されたパーセント同一性から、この割合を減じることができる。この最終パーセント同一性スコアを、この実施形態の目的のために使用することができる。いくつかの場合では、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的で、クエリー配列と一致／アラインさせることができない対象配列のＮ末端及びＣ末端に対する残基のみを考慮することができる。つまり、この手動補正のために、対象配列の最も離れたＮ末端及びＣ末端残基の外側のクエリー残基位置のみを考慮することができる。例えば、同一性パーセントを決定するために、９０残基の対象配列を１００残基のクエリー配列とアラインさせることができる。欠失は、対象配列のＮ末端で生じ、それ故、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／アラインメントを示さない。１０の不対残基は、配列の１０％を表す（一致しないＮ末端及びＣ末端の残基数／クエリー配列内の残基の総数）ので、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性スコアのから１０％を減ずることができる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的なパーセント同一性は、９０％であり得る。別の例では、９０残基の対象配列を、１００残基のクエリー配列と比較することができる。今回の欠失は、内部欠失であり得るので、クエリーと一致／アラインさせることができない対象配列のＮ末端またはＣ末端に残基が存在する可能性はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢで計算されたパーセント同一性を、手動で補正することはできない。繰り返しになるが、ＦＡＳＴＤＢアラインメントに表示される、クエリー配列と一致／アラインさせることができない対象配列のＮ末端及びＣ末端の外側にある残基位置のみを、手動で補正することができる。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用することができ、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらのアナログ）を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を実施してもよい。ポリヌクレオチドの非限定例は、以下のものであり得る：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（限定されないが、ヘテロクロマチンＤＮＡを含む）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離されたＤＮＡ配列、単離されたＲＮＡ配列、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、ｓｎＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来の低分子ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｒＤＮＡ由来の低分子ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列を、非ヌクレオチド構成要素で中断することができる。重合後に、例えば、標識構成要素とのコンジュゲーションで、ポリヌクレオチドを、さらに修飾することができる。この用語は、二本鎖及び一本鎖分子の両方も指し得る。例えば、ホスホチオアート主鎖を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合、または他の相互作用を介して別の分子、例えば、核酸またはポリペプチド、と反応可能な任意の基を含み得る。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、または他の相互作用を介してタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸と反応し得るアミノ酸反応性部分を含み得る。別途明記または要求のない限り、ポリヌクレオチドであり得る本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態、及び二本鎖形態を構成することが既知または予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
本開示の方法に有用なポリヌクレオチドは、天然の核酸配列及びそのバリアント、人工の核酸配列、またはそのような配列の組み合わせを含み得る。
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；及び、ポリヌクレオチドがＲＮＡであり得る場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）、の特定の配列から構成することができる。本明細書で提供される任意のＤＮＡ配列は、チミンがウラシルと置換されるＲＮＡ配列も指す。本明細書で提供される任意のＲＮＡ配列は、ウラシルがチミンに置換されるＤＮＡ配列も指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の他のヌクレオチド塩基、例えば、イノシン（Ｉ）を含んでもよく、このヌクレオシドは、ヒポキサンチンがβ－Ｎ９－グリコシド結合を介してリボフラノースに結合することができる場合に形成され、以下の化学構造になる：
イノシンは、翻訳機序により、グアニン（Ｇ）として読み取ることができる。
「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記であり得る。このアルファベット表記は、中央処理装置を備えたコンピューターのデータベースに入力することができ、機能ゲノミクス及び相同性検索などのバイオインフォマティクスでの適用に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され得るプロセス、及び／または、転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳され得るプロセスを指し得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来し得る場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。
本明細書で使用される「シーケンシング」という用語は、キャピラリーシーケンシング、バイサルファイトフリーシーケンシング、バイサルファイトシーケンシング、ＴＥＴアシストバイサルファイト（ＴＡＢ）シーケンシング、ＡＣＥシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、超並列シグネチャーシーケンシング、Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、４５４パイロシーケンシング、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ１分子シーケンシング、１分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ナノポアシーケンシング、ショットガンシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、Ｅｎｉｇｍａシーケンシング、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
「同等物」または「生物学的同等物」という用語は、特定の分子材料、生物学的材料、または細胞材料を指す場合に互換的に使用することができ、所望の構造または機能性を維持しながら最小限の相同性を有するものを意味する。
ポリヌクレオチドに適用され得る「コードする」という用語は、天然の状態で、または当業者に周知の方法で改変される時に、ポリペプチドまたはそのフラグメントのｍＲＮＡを生成するために、それを転写するか、翻訳するか、または翻訳及び転写することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言うことができるポリヌクレオチドを指し得る。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり得、コード配列を、それから推定することができる。
本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、所定の効果を達成することを目的とするように、任意の分子材料、生物学的材料、または細胞材料を修飾するために使用され得る。
「有効量」という用語は、所望の効果を達成するのに十分な量を指し得る。治療または予防での適用との関連で、有効量は、問題となっている状態のタイプ及び重症度、ならびに個々の対象の特徴、例えば、一般的な健康状態、年齢、性別、体重、及び医薬組成物に対する忍容性、に依存し得る。免疫原性組成物に関して、いくつかの実施形態では、有効量は、病原体に対する防御応答をもたらすのに十分な量であり得る。他の実施形態では、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすのに十分な量であり得る。いくつかの実施形態では、有効量は、それを必要とする対象に受動免疫を与えるのに必要な量であり得る。免疫原性組成物に関して、いくつかの実施形態では、有効量は、上記の要因に加えて、意図される用途、特定の抗原化合物の免疫原性の程度、及び対象の免疫系の健康／応答性に依存する。いくつかの場合では、当業者は、これら及び他の要因に応じて、適切な量を決定することができるであろう。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用の場合、いくつかの実施形態では、有効量は、問題の適用のサイズ及び性質に依存するであろう。また、それは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ標的の性質及び感受性、ならびに使用する方法にも依存するであろう。いくつかの場合では、当業者らは、これら及び他の考慮事項に基づいて有効量を決定することができるであろう。有効量は、実施形態に応じて、組成物の１回以上の投与を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、タンパク質の発現に関して「回復する」という用語は、事前に変異によりタンパク質発現が短縮された場合の、全長タンパク質の発現を確立する能力を指し得る。
本明細書で使用される「変異」という用語は、タンパク質をコードする核酸配列への該タンパク質のコンセンサス配列と比較した変化を指し得る。「ミスセンス」変異は、あるコドンの別のコドンへの置換をもたらし得；「ナンセンス」変異は、コドンを特定のアミノ酸をコードするコドンから終止コドンに変更し得る。ナンセンス変異は、多くの場合、タンパク質の切断された翻訳を引き起こす可能性がある。「サイレント」変異は、得られるタンパク質に影響を及ぼさない変異であり得る。本明細書で使用される場合、「点変異」という用語は、遺伝子配列中の１つのヌクレオチドのみに影響を与える変異を指し得る。「スプライス部位変異」は、プレｍＲＮＡ（イントロンを除去するためのプロセシングの前のもの）に存在するそれらの変異であり得、これは、誤翻訳と、多くの場合、スプライス部位の不正確な線引きによるタンパク質の切断をもたらす。変異は、単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）を含み得る。変異は、配列バリアント、配列バリエーション、配列変化、または対立遺伝子バリアントを含み得る。参照ＤＮＡ配列は、参照データベースから得ることができる。変異は、機能に影響を与え得る。変異は、機能に影響を与えない可能性がある。変異は、１つ以上のヌクレオチドのＤＮＡレベル、１つ以上のヌクレオチドのリボ核酸（ＲＮＡ）レベル、１つ以上のアミノ酸のタンパク質レベル、またはそれらの任意の組み合わせで生じ得る。参照配列は、ＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）データベースなどのデータベースから取得することができる。変異を構成し得る特定の変化は、１つ以上のヌクレオチドまたは１つ以上のアミノ酸における置換、欠失、挿入、反転、または変換を含み得る。変異は、点変異であり得る。変異は、融合遺伝子であり得る。融合対または融合遺伝子は、転座、中間部欠失、染色体逆位、またはそれらの任意の組み合わせなどの変異から生じ得る。変異は、三重化、四重化などのリピート配列数の変動性を構成し得る。例えば、変異は、所与の配列に関連するコピー数の増加または減少であり得る（例えば、コピー数変動、またはＣＮＶ）。変異は、異なる対立遺伝子に２つ以上の配列変化、または１つの対立遺伝子に２つ以上の配列変化を含み得る。変異には、１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチド、例えば、モザイクを含み得る。変異には、１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチド、例えば、キメラを含み得る。変異は、悪性組織に存在する可能性がある。変異の有無は、疾患または状態を発症するリスクの増加を示し得る。変異の有無は、疾患または状態の存在を示し得る。変異は、良性組織に存在する可能性がある。変異がないことは、組織またはサンプルが良性である可能性があることを示し得る。別の方法として、変異がないことは、組織またはサンプルが良性である可能性があることを示さない可能性がある。本明細書に記載の方法は、サンプル中の変異の存在を同定することを含み得る。
「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、ＤＮＡから転写され、次に、イントロンとして既知の非コード部分を除去するために処理され得る核酸分子であり得る。得られたｍＲＮＡは、核（またはＤＮＡが存在し得る別の遺伝子座）から輸送され、タンパク質に翻訳され得る。「プレｍＲＮＡ」という用語は、非コード部分を除去するために処理される前の鎖を指し得る。
「カノニカルアミノ酸」は、以下の表１に示すように、３文字の略語、１文字の略語、構造、及び対応するコドンのそれぞれで、人体に天然に見出される２０のアミノ酸を指す。
「非カノニカルアミノ酸」という用語は、通常、カノニカルアミノ酸の化学合成または修飾により生成される、この群に含まれない合成アミノ酸または他の方法で修飾されたアミノ酸を指し得る（例えば、アミノ酸アナログ）。本開示は、本明細書に開示の方法及びベクターのいくつかにおいて、タンパク質原性の非カノニカルアミノ酸を用いる。非カノニカルアミノ酸の非限定例は、ピロリジン（ＰｙｌまたはＯ）であり得、その化学構造は、以下に提供される：
イノシン（Ｉ）は、ｔＲＮＡに一般に見られ得る別の例示的な非カノニカルアミノ酸であり得、「ゆらぎ塩基対合」による適切な翻訳に不可欠であり得る。イノシンの構造は、上に提供される。
本明細書で使用される「ＡＤＡＲ」という用語は、ＲＮＡ配列においてアデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変換し得るアデノシンデアミナーゼを指し得る。ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２は、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ編集に関与し得るＡＤＡＲの２つの例示的な酵素であり得る。ＡＤＡＲ１の配列の非限定例は、以下の参照番号で見出され得る：ＨＧＮＣ：２２５；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ ０００００１６０７１０；ＯＭＩＭ：１４６９２０；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５５２６５；及びＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＧＣ０１Ｍ１５４５５４、ならびにその生物学的同等物。ＡＤＡＲ２の配列の非限定例は、以下の参照番号で見出され得る：ＨＧＮＣ：２２６；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７３８１；ＯＭＩＭ：６０１２１８；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ７８５６３；及びＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＧＣ２１Ｐ０４５０７３、ならびにその生物学的同等物。
本明細書で使用される「欠損症」という用語は、特定の作用物質のレベルが正常（生理学的に許容される）よりも低いことを指し得る。タンパク質の文脈では、欠損症は、全長タンパク質のレベルが正常よりも低いことを指し得る。
「相補的」または「相補性」という用語は、従来のワトソンクリックまたは従来とは異なる他のタイプのいずれかにより、核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指し得る。例えば、配列Ａ－Ｇ－Ｔは、配列Ｔ－Ｃ－Ａに相補的であり得る。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成し得る核酸分子中の残基の割合を示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続残基が、第２の核酸配列内の同数の連続残基と水素結合することを意味し得る。本明細書で使用される「実質的に相補的」は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であり得る相補性の程度を指し得るか、または、ストリンジェントな条件（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下でハイブリダイズする２つの核酸を指し得る。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズは、一本鎖核酸が、少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸にアニーリングして、二本鎖核酸を形成することを指し得る。いくつかの場合では、ハイブリダイゼーションは、核酸の相補的核酸への結合を含み得る。例えば、ＲＮＡの２つの配列のハイブリダイゼーションは、二本鎖デュプレックス（例えば、ｄｓＲＮＡ）を形成し得る。核酸は、非特異的配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「非特異的配列」または「非特異的」という用語は、任意の他の核酸配列に相補的であるように設計することができないか、または部分的にのみ相補的であり得る、一連の残基を含有する核酸配列を指し得る。
本明細書で使用される「オルニチントランスカルバミラーゼ」または「ＯＴＣ」という用語は、その名前に対応し、遺伝子Ｏｔｃにコードされるタンパク質を指し得、この非限定例は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ００４８０（ヒト）及びＰ１１７２５（マウス）で見出すことができる。ＯＴＣ欠損症は、血液中の高濃度のアンモニアをもたらすＸ連鎖遺伝的状態であり得る。いくつかの場合では、ＯＴＣ欠損症は、プレｍＲＮＡのミススプライシングをもたらす、エクソン４のドナースプライス部位におけるＧ－＞Ａスプライス部位変異により引き起こされ得る。この変異は、伸長することができるか、または点変異を有するタンパク質の形成をもたらす。ＯＴＣタンパク質レベルが１５～２０分の１に低減し得る。例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｄｇｅｓ，Ｐ．Ｅ．＆ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｅ．Ｔｈｅ ｓｐｆａｓｈ ｍｏｕｓｅ： ａ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ａｌｓｏ ｃａｕｓｅｓ ａｂｅｒｒａｎｔ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６，４１４２－４１４６（１９８９）（生成されたＯＴＣの代替形態を示す）。その配列を以下に提供する：
上に示されるように、変異が存在し得る場合、適切なスプライスバリアントが産生され得る、しかし、そのような産生は、ミスセンス変異をもたらし、これは、また、ＯＴＣ欠損症の原因になり得る。
単独でまたは「モチーフ」と組み合わせて使用される「ヘアピン」、「ヘアピンループ」、「ステムループ」、及び／または「ループ」という用語は、反対方向で読む場合に相補的であり得る一本鎖内の配列が、塩基対合して、立体配座がヘアピンまたはループに似ている領域が形成される場合の、一本鎖オリゴヌクレオチドで形成される構造を指すために、オリゴヌクレオチドの文脈で使用することができる。
本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの特定の領域を指し得、特定の機能に関連し得る。例えば、「ＲＮＡヘアピンモチーフと結合するドメイン」は、１つ以上のＲＮＡヘアピンに結合するタンパク質のドメインを指し得る。この結合は、任意に、特定のヘアピンに特異的であってよい。
本明細書で使用される「ＡＰＯＢＥＣ」という用語は、ｍＲＮＡ編集（ＣからＵへの変換を触媒）に関与する進化的に保存されたシチジンデアミナーゼのファミリーに含まれる任意のタンパク質及びその同等物を指し得る。いくつかの態様では、ＡＰＯＢＥＣという用語は、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、またはそれらの各同等物のうちのいずれか１つを指し得る。１つ以上のＡＰＯＢＥＣドメインを含む融合タンパク質の非限定の例示的な配列は、ＲＮＡ編集システムでの使用に適したものにするために、ＡＤＡＲドメインに融合された、または代替ドメインに融合された両方で本明細書に提供され得る。この目的のために、ＡＰＯＢＥＣは、ＡＤＡＲ（異なる変換により編集を触媒）と同等であると考えることができる。
本明細書で使用される「Ｇｌｕｒ２ ｍＲＮＡ」という用語は、アデノシンからイノシンへの（Ａ→Ｉ）編集を受けるイオンチャネル型ＡＭＰＡグルタミン酸受容体２（「Ｇｌｕｒ２」）をコードするｍＲＮＡを指し得る。このｍＲＮＡは、部位特異的にＡＤＡＲを動員し得る。
本明細書で使用される場合、「インターフェロン」という用語は、免疫応答と関連することが既知のシグナル伝達タンパク質のグループを指し得る。本出願に関連して、目的のインターフェロンは、ＡＤＡＲの発現の増強をもたらすものであり得る。インターフェロンα及びＡＤＡＲ１間の相関関係は、既知である可能性があり、従って、本開示は、内因性ＡＤＡＲ１発現を増加させる手段としてのインターフェロンαの使用を企図する。単離または組み換えインターフェロンαの商業的供給源には、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｃａｍ、及びＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが含まれるが、これらに限定されない可能性がある。あるいは、インターフェロンαは、既知のベクター及び所与のタンパク質配列、例えば、Ｑ６ＱＮＢ６（ヒトＩＦＮＡ）を使用して産生され得る。
明示的な言及なく、別途意図のない限り、本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、その同等物または生物学的同等物は、本開示の範囲内であると意図され得ると推定され得る。本明細書で使用される場合、「その生物学的同等物」という用語は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチド、または核酸に言及する場合、「その同等物」と同義であることが意図され得、依然として所望の構造または機能性を維持しながら、最小限の相同性を有するものを意図する。本明細書で特に言及されない限り、本明細書で言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、その同等物も含むことが企図され得る。例えば、同等物は、少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、あるいは、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または９８％の相同性または同一性を有し、参照タンパク質、ポリペプチド、または核酸と実質的に同等の生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その同等物は、ストリンジェントな条件下で、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり得る。
改変ガイドポリヌクレオチド
疾患または状態に関与する標的ポリヌクレオチド（例えば、プレＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の編集を介して対象の疾患または状態を処置するための改変ポリヌクレオチド（「改変ガイド」または「改変ガイドＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」とも呼ばれ得る）が本明細書に開示される。そのような改変ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに相補的な部分を介して標的ポリヌクレオチドに結合するように構成される。改変ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに結合すると、ＲＮＡ編集エンティティを介した標的ポリヌクレオチドの塩基の編集が促進され、それにより、対象の疾患または状態が処置される。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含み得る。
疾患または状態に関与する標的ポリヌクレオチド（例えば、プレＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の編集を介して対象の疾患または状態を処置するための改変ポリヌクレオチド（「改変ガイド」または「改変ガイドＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」とも呼ばれ得る）が本明細書に開示される。そのような改変ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに相補的な部分を介して標的ポリヌクレオチドに結合するように構成される。改変ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに結合すると、ＲＮＡ編集エンティティを介した標的ポリヌクレオチドの塩基の編集が促進され、それにより、対象の疾患または状態が処置される。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含み得る。
本明細書に記載の改変ガイドＲＮＡまたは改変ポリヌクレオチドは、様々なドメインを含み得る。「ドメイン」は、改変ポリヌクレオチドの領域を指し得る。いくつかの場合では、ドメインは、ドメインの機能の観点から記載することができる。例えば、「標的化ドメイン」は、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る改変ポリヌクレオチドの領域を指し得、「ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン」は、本明細書に記載のＲＮＡ編集エンティティと会合するか、またはそれを動員することが可能であり得るドメインを指し得、「スペーサードメイン」は、他のドメイン間にスペースを提供するドメインを指し得る。いくつかの場合では、ドメイン名の記載は、ドメインを特定の機能に限定しない。例えば、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る「標的化ドメイン」は、いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。
環状ガイドＲＮＡ
本明細書に記載されるように、改変ガイドは、環状またはループ構造を含み得る。改変ポリヌクレオチドは、前駆改変ポリヌクレオチドから環状化され得る。そのような前駆改変ポリヌクレオチドは、前駆改変線状ポリヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、環状改変ポリヌクレオチドの前駆体であり得る。例えば、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、細胞内で環状化し得る、プラスミドから転写された線状ｍＲＮＡであり得る。別の例では、細胞に挿入された時に環状化を可能にする、リボザイムドメイン及びライゲーションドメインなどのドメインを有する線状ポリヌクレオチドになるように、前駆改変線状ポリヌクレオチドを構築することができる。リボザイムドメインは、線状前駆体ＲＮＡを特定の部位（例えば、ライゲーションドメインに隣接する）で切断することが可能なドメインを含み得る。前駆体ドメインが、５’から３’へ：５’リボザイムドメイン、５’ライゲーションドメイン、環状化された領域、３’ライゲーションドメイン、及び３’リボザイムドメインを含む場合、それぞれ、５’及び３’ライゲーションドメインの露出末端を解放するために、前駆体ポリヌクレオチドを、５’及び３’リボザイムにより両方の部位で特異的にプロセシングすることができる。遊離露出末端は、末端を環状化して成熟した環状化された構造を形成するために、ライゲーション可能であり得る。例えば、遊離末端は、細胞内でＲＮＡライゲーションを介してライゲーションされる５’－ＯＨ及び２’，３’－環状リン酸塩を含み得る。ライゲーション及びリボザイムドメインを有する線状ポリヌクレオチドは、細胞内にトランスフェクトすることができ、そこで内因性細胞酵素を介して環状化し得る。
本明細書に記載されるように、改変ガイドは、環状またはループ構造を含み得る。改変ポリヌクレオチドは、前駆改変ポリヌクレオチドから環状化され得る。そのような前駆改変ポリヌクレオチドは、前駆改変線状ポリヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、環状改変ポリヌクレオチドの前駆体であり得る。例えば、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、細胞内で環状化し得る、プラスミドから転写された線状ｍＲＮＡであり得る。別の例では、細胞に挿入された時に環状化を可能にする、リボザイムドメイン及びライゲーションドメインなどのドメインを有する線状ポリヌクレオチドになるように、前駆改変線状ポリヌクレオチドを構築することができる。リボザイムドメインは、線状前駆体ＲＮＡを特定の部位（例えば、ライゲーションドメインに隣接する）で切断することが可能なドメインを含み得る。前駆体ドメインが、５’から３’へ：５’リボザイムドメイン、５’ライゲーションドメイン、環状化された領域、３’ライゲーションドメイン、及び３’リボザイムドメインを含む場合、それぞれ、５’及び３’ライゲーションドメインの露出末端を解放するために、前駆体ポリヌクレオチドを、５’及び３’リボザイムにより両方の部位で特異的にプロセシングすることができる。遊離露出末端は、末端を環状化して成熟した環状化された構造を形成するために、ライゲーション可能であり得る。例えば、遊離末端は、細胞内でＲＮＡライゲーションを介してライゲーションされる５’－ＯＨ及び２’，３’－環状リン酸塩を含み得る。ライゲーション及びリボザイムドメインを有する線状ポリヌクレオチドは、細胞内にトランスフェクトすることができ、そこで内因性細胞酵素を介して環状化し得る。
いくつかの場合では、前駆改変ポリヌクレオチドは、環状であり得る。いくつかの場合では、前駆改変ポリヌクレオチドは、前駆線状改変ポリヌクレオチドとして線状であり得る。いくつかの場合では、前駆改変ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含み得る。いくつかの場合では、前駆改変ポリヌクレオチドは、前駆改変ガイドＲＮＡを含み得る。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡを生成するために、前駆改変ガイドＲＮＡを使用することができる。
いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２５００、または約５０００ヌクレオチド長超であり得る。いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチド（例えば、改変ガイドポリヌクレオチド）、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２５００、または約５０００ヌクレオチド長未満であり得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチド（例えば、改変ガイドポリヌクレオチド）、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド～約１４０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド～約１６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド～約３００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド、約１４０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド～約３５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１２５０ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド～約２０００ヌクレオチド、または約２０００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まない可能性がある。いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉ用に構成された配列を含まない可能性がある。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはＤｉｃｅｒ基質をコードする配列を含まない可能性がある。
いくつかの実施形態では、改変ガイドＲＮＡなどの改変ポリヌクレオチドは、環状であり得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ループであり得る。いくつかの場合では、環形状は、ループ形状を含み得る。いくつかの場合では、ループ形状は、環形状を含み得る。ループ形成または環状化は、ポリヌクレオチドの露出末端が分解されるのを防ぎ得、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチドの半減期を著しく増加させ得る。いくつかの実施形態では、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドは、１つ以上の露出末端が加水分解されるのを防ぎ得る。いくつかの実施形態では、改変環状ガイドＲＮＡなどの改変ポリヌクレオチドは、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない可能性がある。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ヒト細胞に天然に存在するｍＲＮＡよりも加水分解を受けにくい可能性がある２次構造を含み得る。
いくつかの場合では、環状またはループ状の改変ガイドは、線状の改変ポリヌクレオチドと比較して異なる性質を含み得る。いくつかの場合では、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドは、環状またはループでないこともある同等のポリヌクレオチドと比較して、ポリヌクレオチドの半減期を有意に増加させ得る。いくつかの実施形態では、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドを形成すると、例えば、対象に、ｉｎ ｖｉｖｏで送達される場合に、環状でないか、またはループでない可能性のある同等の改変ポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と比較して、改変ポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）の半減期を大幅に増加させ得る。いくつかの場合では、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドを形成すると、環状でないか、またはループでない可能性のある同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、対象に投与される改変ポリヌクレオチドの量（例えば、治療有効量）を大幅に低減させ得る。いくつかの場合において、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドは、環状でないか、またはループでない可能性のある同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡのノックダウンを増加させている可能性がある。いくつかの実施形態では、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドを形成すると、環状またはループでないこともある同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、編集の効率を大幅に高め得、オフターゲット編集を大幅に減少させ、ＲＮＡ編集エンティティの動員の効率を高めることが可能であり、またはそれらの組み合わせが可能である。図１Ａ及び図１Ｂは、線状ガイドＲＮＡと比較して、環状ガイドＲＮＡが、複数の細胞株でＲＮＡ編集を増加させ得ることを示す。いくつかの場合では、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドは、環状でないか、またはループでない可能性のある同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、改変ポリヌクレオチドの合成を大幅に増加させ得る。いくつかの実施形態では、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドは、環状でないか、またはループでない可能性のある同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、改変ポリヌクレオチドの細胞への輸送を大幅に増加させ得る。いくつかの場合では、環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドは、環状でないか、またはループでない可能性のある同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、改変ポリヌクレオチドの細胞内保持を大幅に増加させ得る。
改変ガイドＲＮＡなどの、ループ状または環状の改変ガイドポリヌクレオチドは、非環状または非ループ状のガイドポリヌクレオチドと比較して、様々な利点を提供し得る。ループ状または環状の改変ポリヌクレオチドは、環状でないか、またはループ状ではない可能性のある同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、より高い安定性、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、内因性ＲＮＡ編集酵素）の動員の改善、半減期の延長、ＲＮＡ編集効率の改善、またはそれらの任意の組み合わせを提供し得る。ループ状または環状に改変ガイドポリヌクレオチドは、これらの品質の改善のうちの１つ以上を提供し得、ガイド安定性を改善するように設計された他のタイプの修飾、例えば、化学修飾または糖付加、を含むガイドポリヌクレオチドと比較して、遺伝子コード化能を保持し得る。ループ状または環状の改変ガイドポリヌクレオチドは、遺伝子によりコード可能であり、ベクターで送達可能であり、改善された安定性を保持し得る。
いくつかの実施形態では、環状の改変ガイドＲＮＡは、線状ガイドＲＮＡと比較して、細胞内での安定性が増加し得る。いくつかの実施形態では、環状の改変ポリヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチドと比較して、細胞内での安定性が増加し得る。環状改変ガイドＲＮＡもしくは線状ガイドＲＮＡ、または環状ガイドＲＮＡまたは線状ガイドＲＮＡをコードするベクターのいずれかでトランスフェクトされた細胞で一定期間にわたるＲＮＡ編集のパーセントを測定することにより、ＲＮＡの安定性の増加を決定することができる。例えば、アッセイは、４８時間、９６時間、及び１４４時間での編集率を測定し得る。後の時点でのパーセントＲＮＡ編集の増加により、安定性の増加を示すことができる。ガイドＲＮＡ構築物の逆転写後に細胞内の一定期間（例えば、４８時間、９６時間、及び１４４時間）にわたる環状ガイドＲＮＡ及び線状ガイドＲＮＡのコピー数を決定（デジタルドロップレットＰＣＲで決定）することにより、安定性の増加を測定することもできる。安定性の増加は、図５で実証することができる。図５は、細胞内の環状ガイドＲＮＡと比較した線状ガイドＲＮＡからのＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲにおけるヌクレオチドのパーセントＲＮＡ編集を示す。環状ガイドＲＮＡは、線状ガイドＲＮＡと比較して、４８時間及び９６時間でより高いレベルのＲＮＡ編集を有することが示された。編集の増加は、線状ガイドＲＮＡと比較して環状ガイドＲＮＡの安定性の向上に起因する可能性がある。
細胞または対象に送達される、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、少なくとも約４０分、約５０分、約６０分、約１．５時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約１．２５日、約１．５日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約１０日、約１４日、またはそれ以上の、細胞または対象における半減期を含み得る。細胞または対象に送達される改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの半減期は、約１時間～約６時間であり得る。細胞または対象に送達される改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの半減期は、約１時間～約２４時間であり得る。細胞または対象に送達される改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの半減期は、約１時間～約２日であり得る。細胞または対象に送達される改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの半減期は、約６時間～約２４時間であり得る。細胞または対象に送達される改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの半減期は、約６時間～約５日であり得る。
細胞または対象に送達される改変ガイドＲＮＡなどの改変ポリヌクレオチドは、内因性ＲＮＡ編集エンティティなどのＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。いくつかの場合では、改変ガイドポリヌクレオチドを、ＲＮＡ編集エンティティと共送達することができる。環状ガイドＲＮＡなどの環状ポリヌクレオチドは、環状でない可能性がある改変ポリヌクレオチドと比較して、より多くの量のＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。いくつかの実施形態では、編集を行うのに十分な量の内因性ＲＮＡ編集エンティティを動員するように、例えば、改変ポリヌクレオチドを、少量の内因性ＲＮＡ編集酵素を含み得る組織位置に送達するように、改変ポリヌクレオチドを構成することができる。
環状ガイド構造
いくつかの実施形態では、環状またはループ状の改変ガイドポリヌクレオチドは、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない可能性がある。いくつかの場合では、各５’ヒドロキシル及び各３’ヒドロキシルは、独立して、共有酸素リン結合で、リンに結合させることができる。いくつかの場合では、リンは、ホスホジエステル基に含有され得る。いくつかの場合では、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、またはその両方を、リン－酸素結合を介して結合させることができる。いくつかの場合では、リン含有部分を有するホスホエステルになるように、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、またはその両方を修飾することができる。
いくつかの実施形態では、環状またはループ状の改変ガイドポリヌクレオチドは、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない可能性がある。いくつかの場合では、各５’ヒドロキシル及び各３’ヒドロキシルは、独立して、共有酸素リン結合で、リンに結合させることができる。いくつかの場合では、リンは、ホスホジエステル基に含有され得る。いくつかの場合では、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、またはその両方を、リン－酸素結合を介して結合させることができる。いくつかの場合では、リン含有部分を有するホスホエステルになるように、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、またはその両方を修飾することができる。
いくつかの場合では、５’末端は、末端ヌクレオチドの糖の５’炭素上に、末端の、露出した、結合していない、または連結されていないリン酸基を有するポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、３’末端は、末端ヌクレオチドの糖の３’炭素上に、末端の、露出した、結合していない、または連結されていないヒドロキシル基を有するポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドが転写され得る場合、または転写され得る時に、５’末端は、転写されるべきポリヌクレオチドの最初のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが転写され得る場合、または転写され得る時に、３’末端は、転写されるべきポリヌクレオチドの最後のヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、ホスホジエステル結合で結合しているジヌクレオチドの５’末端は、糖の３’炭素上のヒドロキシル基に寄与するヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、ホスホジエステル結合で結合しているジヌクレオチドの３’末端は、糖の５’炭素上のリン酸のヒドロキシル基に寄与するヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の改変ポリヌクレオチドは、I（Ｉ）の構造を含むか、またはそれをコードし得る。
いくつかの場合では、式（Ｉ）の前駆改変ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（例えば、ウイルスポリヌクレオチド）にコードされ得る。いくつかの場合では、式（Ｉ）は、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る標的化ドメインを含み得、式（Ｉ）は、本明細書に記載のスペーサードメインを含み得る。いくつかの場合では、式（Ｉ）は、標的ＲＮＡの配列にハイブリダイズすることが可能であり得る標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、少なくとも部分的に相補的であることは、標的ＲＮＡの逆相補体と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、各Ｘが、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであり得；各Ｙが、独立して、ＰまたはＳであり得；各Ｚが、独立して、ＯＭ、ＳＭ、またはＮＲＭであり得；各Ａが、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、ＯＭ、ＳＭ、ＮＲＭ、またはＮＲＲ’であり得；各Ｂが、独立して、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの誘導体であり得；ｍが、独立して、０～１，０００の整数であり得る。いくつかの場合では、各Ｘは、Ｏであり得る。いくつかの場合では、各Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはその両方であり得る。いくつかの場合では、各Ｙは、Ｐであり得る。いくつかの場合では、Ｍは、少なくとも１であり得る。いくつかの場合では、各単位ｍは、独立して、（Ｄ）または（Ｌ）立体配置であり得る。いくつかの場合では、ｍは、約５～約２５０、約３０～約６００、約１００～約５００、約４００～約８００、約６００～約１２００、約８００～約２０００、約１５００～約４０００、または約３００～約１００００の独立した整数であり得る。いくつかの場合では、各Ｍは、独立して、無機もしくは有機カチオン、Ｈ、またはＤであり得、各Ｒ及びＲ’は、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、またはＣ１－Ｃ６アルキルであり得る。いくつかの場合では、各Ｚは、ＯＭであり得、各Ｒは、Ｈであり得、各Ｙは、Ｐであり得る。
いくつかの場合では、標的化ドメインが標的ＲＮＡの配列と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進され得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡのコード領域と少なくとも部分的に結合するように構成することができる。いくつかの場合では、標的化ドメインが標的ＲＮＡのコード領域と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進され得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲタンパク質（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２）、ＡＰＯＢＥＣ、その生物学的に活性なフラグメント、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、ヒトタンパク質であり得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、内因性タンパク質であり得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、外因性タンパク質であり得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡの非翻訳領域と少なくとも部分的に会合するように構成することができる。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも一部と少なくとも部分的に会合するように構成することができる。いくつかの場合では、標的化ドメインが標的ＲＮＡの非翻訳領域と会合すると、改変ポリヌクレオチドの非存在下での標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドのレベルと比較して、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が促進され得、これは、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株の第１の細胞及び第２の細胞に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株の第１の細胞に直接的または間接的に導入すること、ならびに、（ｉｉｉ）第１の細胞及び第２の細胞において標的ＲＮＡから発現されたポリペプチドの量を比較すること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される。
スペーサードメイン
本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（または細胞に挿入された場合に環状化される前駆改変線状ポリヌクレオチド）は、スペーサードメインを含み得る。本明細書に記載されるように、スペーサードメインは、他のドメイン間にスペースを提供するドメインを指し得る。成熟した環状化されたポリヌクレオチドの全体的なサイズを増加させるために、環状化されるべき領域及び隣接ライゲーション配列間に、スペーサードメインを使用することができる。環状化されるべき領域が、標的ポリヌクレオチドに会合するように構成される本明細書に記載の標的化ドメインを含む場合、スペーサーの追加は、スペーサードメインを欠く同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、標的ポリヌクレオチドに対する改変ポリヌクレオチドの改善（例えば、特異性の増加、編集効率の向上など）を提供し得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、フィラー配列を含み得る。いくつかの場合では、フィラー配列は、スペーサードメインを含み得る。フィラー配列またはフィラードメインは、標的配列に少なくとも部分的に非相補的である環状ガイドシャーシ内の配列であり得る。いくつかの場合では、フィラー配列は、環状のガイドシャーシの一部を含み得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、標的ポリヌクレオチドと連続して標的ＲＮＡとハイブリダイズしないように構成される。そのような構成では、スペーサードメインは、改変ポリヌクレオチドの標的ドメイン及び標的ポリヌクレオチド間の重複の量を単純に増加させていない。むしろ、標的化ドメイン及び標的ポリヌクレオチド間の重複領域の外側で環状化されたポリヌクレオチドを伸長させる（例えば、環状シャーシのサイズを増加させる）ために、スペーサードメインを使用することができる。重複領域の外側でこの環状ポリヌクレオチドのサイズを増加させることにより、本出願は、標的化ドメイン及び標的ポリヌクレオチド間の全体的な結合効率が改善されるという驚くべき発見を実証する。いくつかの場合では、この改善は、環状化されたポリヌクレオチドの標的化ドメインが、標的ポリヌクレオチドに結合する、より最適な形状を提供することに起因する可能性がある。
本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（または細胞に挿入された場合に環状化される前駆改変線状ポリヌクレオチド）は、スペーサードメインを含み得る。本明細書に記載されるように、スペーサードメインは、他のドメイン間にスペースを提供するドメインを指し得る。成熟した環状化されたポリヌクレオチドの全体的なサイズを増加させるために、環状化されるべき領域及び隣接ライゲーション配列間に、スペーサードメインを使用することができる。環状化されるべき領域が、標的ポリヌクレオチドに会合するように構成される本明細書に記載の標的化ドメインを含む場合、スペーサーの追加は、スペーサードメインを欠く同等の改変ポリヌクレオチドと比較して、標的ポリヌクレオチドに対する改変ポリヌクレオチドの改善（例えば、特異性の増加、編集効率の向上など）を提供し得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、フィラー配列を含み得る。いくつかの場合では、フィラー配列は、スペーサードメインを含み得る。フィラー配列またはフィラードメインは、標的配列に少なくとも部分的に非相補的である環状ガイドシャーシ内の配列であり得る。いくつかの場合では、フィラー配列は、環状のガイドシャーシの一部を含み得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、標的ポリヌクレオチドと連続して標的ＲＮＡとハイブリダイズしないように構成される。そのような構成では、スペーサードメインは、改変ポリヌクレオチドの標的ドメイン及び標的ポリヌクレオチド間の重複の量を単純に増加させていない。むしろ、標的化ドメイン及び標的ポリヌクレオチド間の重複領域の外側で環状化されたポリヌクレオチドを伸長させる（例えば、環状シャーシのサイズを増加させる）ために、スペーサードメインを使用することができる。重複領域の外側でこの環状ポリヌクレオチドのサイズを増加させることにより、本出願は、標的化ドメイン及び標的ポリヌクレオチド間の全体的な結合効率が改善されるという驚くべき発見を実証する。いくつかの場合では、この改善は、環状化されたポリヌクレオチドの標的化ドメインが、標的ポリヌクレオチドに結合する、より最適な形状を提供することに起因する可能性がある。
いくつかの場合では、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドは、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）（ＫＰＦＭで決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し得る。いくつかの場合では、標的ＲＮＡの非翻訳領域と少なくとも部分的に会合するように、標的化ドメインを構成することができ、標的化ドメインが標的ＲＮＡの非翻訳領域と会合すると、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が促進され、標的化ドメインが標的ＲＮＡの配列と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される。
いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、またはその両方は、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る標的化ドメイン、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン、及びスペーサードメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドが次々とつながった環状２次元形式のポリヌクレオチド配列として表すことができる。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドが次々とつながったループ状２次元形式のポリヌクレオチド配列として表すことができる。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドのスペーサードメインは、１つ以上のヌクレオチドの付加により、改変ポリヌクレオチドを拡大し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡのコード領域と少なくとも部分的に会合するように構成することができる。いくつかの場合では、標的化ドメインが標的ＲＮＡのコード領域と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進され得る。
いくつかの場合では、スペーサードメインは、約１ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約２ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、または約４００ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド長の配列長を有し得る。いくつかの場合、スペーサードメインは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０８６、１０８７、１０８８、１０８９、１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、１０９７、１０９８、１０９９、１１００、１１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０６、１１０７、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２５、１１２６、１１２７、１１２８、１１２９、１１３０、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１１３８、１１３９、１１４０、１１４１、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４６、１１４７、１１４８、１１４９、１１５０、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１１５７、１１５８、１１５９、１１６０、１１６１、１１６２、１１６３、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７４、１１７５、１１７６、１１７７、１１７８、１１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３、１１８４、１１８５、１１８６、１１８７、１１８８、１１８９、１１９０、１１９１、１１９２、１１９３、１１９４、１１９５、１１９６、１１９７、１１９８、１１９９、１２００、１２０１、１２０２、１２０３、１２０４、１２０５、１２０６、１２０７、１２０８、１２０９、１２１０、１２１１、１２１２、１２１
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いくつかの実施形態では、スペーサードメインのヌクレオチドの約８０％は、標的ＲＮＡと非相補的であり得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、約５ヌクレオチドの配列長を有し得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、約１０ヌクレオチドの配列長を有し得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、約１５ヌクレオチドの配列長を有し得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、約２０ヌクレオチドの配列長を有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、５’ＡＴＡＴＡ３’（配列番号６）、５’ＡＴＡＡＴ３’（配列番号７）、またはそれらの任意の組み合わせのポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、５’ＡＵＡＡＵ３’（配列番号８）、５’ＡＵＡＵＡ３’（配列番号９）、３’ＡＵＡＵＡ５’（配列番号３２）、または３’ＡＵＡＡＵ５’（配列番号３３）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、少なくとも１つの単一ヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり得る。
スペーサードメインは、標的化ドメインの近位に、ライゲーションドメインの近位に、リボザイムドメインの近位に、ＲＮＡ編集動員ドメインの近位に、または別のスペーサードメインの近位に位置する可能性があり、近位は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ヌクレオチド離れていることを意味し得る。
いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、標的化ドメインから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ヌクレオチド離れている可能性がある。
改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、単一のスペーサードメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、第２のスペーサードメインを含み得る。いくつかの場合では、第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、またはその両方は、標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、標的ＲＮＡに結合しないように構成することができる。いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、複数のスペーサードメイン、例えば、２、３、４、５、６、７、または８つのスペーサードメインを含み得る。
改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、フィラー配列を含み得る。いくつかの場合では、フィラー配列は、標的ＲＮＡに実質的に相補的でない核酸配列を含み得る。いくつかの場合では、フィラー配列は、標的ポリヌクレオチドと連続して、標的ＲＮＡとハイブリダイズしないように構成される。いくつかの場合では、環状ガイドシャーシは、本明細書に開示の改変線状ポリヌクレオチドのいずれか１つ（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み得、残りの配列は、フィラー配列を含み得る。いくつかの場合では、フィラー配列は、環状ガイドシャーシの全配列の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、または約９８％を含み得る。いくつかの場合では、ガイドＲＮＡは、環状ガイドシャーシの全配列の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、または約９８％を含み得る。いくつかの場合では、環状ガイドシャーシの配列の約３４％～約７２％、約４０％～約７５％、または約５０％～約６７％を含むフィラー配列は、最も高いレベルのＲＮＡ編集を生じ得る。いくつかの場合では、環状ガイドシャーシの配列の約２８％もしくは約６６％、約２５％～約６０％、または約３３％～約５０％を含む標的化ドメインは、最も高いレベルの編集を生じ得る。いくつかの場合では、環状ガイドシャーシは、約５０ヌクレオチド～約２０００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド～約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約４５０ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約９００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド～約１５００ヌクレオチド、約１４００ヌクレオチド～約２０００ヌクレオチド、または約２００ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドの全配列長を含み得る。いくつかの場合では、環状ガイドシャーシは、１、２、３、４、またはそれ以上のフィラー配列を含み得る。
スペーサードメインは、標的ＲＮＡへの少なくとも部分的な結合を促進する立体配座をとる改変ポリヌクレオチドを促進にするように構成することができる。いくつかの場合では、スペーサードメインは、ポリヌクレオチドの標的化ドメインが実質的に線状になり得るように、ポリヌクレオチドの標的化ドメインの形状を変化させ得る。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、改変ポリヌクレオチドの合成を促進し得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、前駆改変線状ポリヌクレオチドの溶媒露出末端の結合を促進し得る。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、スペーサードメインを欠くものよりも近い前駆改変ポリヌクレオチドの２つのライゲーション末端をもたらし得る。いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチドにおける結合は、共有結合または非共有結合であり得る。いくつかの場合では、ライゲーション反応により、結合を形成することができる。いくつかの実施形態では、相同組み換え反応により、結合を形成することができる。
スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドは、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの結合特異性と比較して、複数の他のＲＮＡの中で、標的ＲＮＡに対する結合特異性の増加を有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドまたはスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触させた後に、標的ＲＮＡ及び複数の他のＲＮＡをシーケンシングすることにより、標的ＲＮＡへの結合特異性の増加を決定することができる。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のより低いエントロピー（ΔＳ）を促進するように、スペーサードメインを構成することができる。いくつかの実施形態では、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの編集効率と比較して、標的ＲＮＡに対する改変ポリヌクレオチドの編集効率を少なくとも維持するように、スペーサードメインを構成することができる。いくつかの場合では、スペーサードメインを有する改変ポリヌクレオチドまたはスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触させた後の標的ＲＮＡのシーケンシングで、編集効率を決定することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも維持することは、増加を含み得る。いくつかの場合では、スペーサードメインを有する改変ポリヌクレオチドまたはスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触させた後の標的ＲＮＡの質量分析で、編集効率を決定することができる。
いくつかの実施形態では、スペーサードメインを有する改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ガイドＲＮＡの編集効率は、スペーサーを欠く同等のガイドＲＮＡまたは同等の改変ポリヌクレオチドの約２倍～約５倍高くなり得る。いくつかの場合では、細胞または対象に送達された、スペーサーを有する改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの編集効率は、スペーサーを欠く同等のガイドＲＮＡ、または同等の改変ポリヌクレオチドよりも約３倍～約６倍高くなり得る。いくつかの場合では、スペーサーを有する改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドによる標的ＲＮＡの編集率は、スペーサーを欠く同等のガイドＲＮＡまたは同等の改変ポリヌクレオチドよりも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％高い可能性がある。
いくつかの場合では、スペーサードメインを有する改変ガイドＲＮＡまたは改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）を、スペーサードメインを欠く対応する改変ガイドＲＮＡまたは改変ポリヌクレオチドの結合のΔＧと比較して決定するために、ケルビンプローブフォース顕微鏡法（ＫＰＦＭ）を使用することができ、標的ＲＮＡは、むき出しの金ナノ粒子上に固定化することができる。スペーサードメインを含むかまたは含まない改変ガイドＲＮＡまたは改変ポリヌクレオチドを添加し、金粒子上に固定された標的ＲＮＡに結合させることができる。次に、トポグラフィー及び表面電位画像をＫＰＦＭで測定し、スペーサードメインを含むかまたは含まない改変ガイドＲＮＡまたは改変ポリヌクレオチドと、標的ＲＮＡとの間の結合のΔＧを計算するために使用することができる。
スペーサードメインを有する、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期は、スペーサードメインを欠く実質的に同等のＲＮＡまたは同等のポリヌクレオチドと比較して、少なくとも約１倍、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、またはそれ以上長い可能性がある。スペーサードメインを有する、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、スペーサードメインを欠く実質的に同等のＲＮＡまたは同等のポリヌクレオチドと比較して、少なくとも約１倍、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、またはそれ以上長い可能性がある。スペーサードメインを有する改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドを含む組成物の、それを必要とする対象に投与される投薬量は、スペーサードメインを欠く実質的に同等のＲＮＡまたは同等のポリヌクレオチドを含む組成物の、それを必要とする対象に投与される量と比較して、少なくとも約１倍、約３分の２、約２分の１、約５分の２、約３分の１、約７分の２、約４分の１、約５分の１、約１０分の１、または２０分の１であり得る。２回以上の処置として与えられるスペーサードメインを欠く実質的に同等のＲＮＡまたは同等のポリヌクレオチドを含む組成物と比較して、それを必要とする対象に投与される、スペーサードメインを有する改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドを含む組成物は、１回の処置として与えることができる。
スペーサードメインを有する改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ガイドＲＮＡは、スペーサーを欠く同等のガイドＲＮＡ、または同等の改変ポリヌクレオチドの少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍長い半減期を含み得る。スペーサードメインを有する改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ガイドＲＮＡの半減期は、スペーサーを欠く同等のガイドＲＮＡまたは同等の改変ポリヌクレオチドよりも約２倍～約５倍長くなり得る。細胞または対象に送達される、スペーサーを有する改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの半減期は、スペーサーを欠く同等のガイドＲＮＡ、または同等の改変ポリヌクレオチドの約３倍～約６倍長くなり得る。
いくつかの場合では、式（Ｉ）は、式（ＩＩ）
または式（ＩＩＩ）
に従うことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の改変ガイドポリヌクレオチドは、式（ＩＶ）の構造を含むか、またはコードし得る。
いくつかの場合では、各Ｘは、独立して、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの誘導体であり得る塩基を含むヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、各ヌクレオチドは、ホスホエステル、ホスホチオエステル、ホスホチオアート、またはホスホルアミダイト結合により、各結合について独立して、２つの隣接ヌクレオチドに結合することができる。いくつかの場合では、ｎは、独立して、０～１，０００の整数であり得る。いくつかの場合では、ｎは、約５～約２５０、約１００～約５００、約４００～約８００、約６００～約１２００、約８００～約２０００、約１５００～約４０００、または約３００～約１００００の独立した整数であり得る。いくつかの場合では、式（ＩＶ）は、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る標的化ドメインを含み得、式（ＩＶ）は、スペーサードメインを含み得る。一部の場合では、標的化ドメインが、スペーサードメインを物理的に含まない。例えば、標的化ドメインは、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得、スペーサードメインは、標的ＲＮＡに相補的でない可能性がある。いくつかの場合では、少なくとも部分的に相補的であることは、標的ＲＮＡの逆相補体と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る標的化ドメイン（改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドにおける）を含み得る。いくつかの場合では、少なくとも部分的に相補的であることは、標的ＲＮＡの逆相補体と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡの少なくとも約８０％と塩基対合し得る。いくつかの場合では、スペーサードメインは、標的ＲＮＡの約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％未満と塩基対合し得る。
いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチドは、キラリティーを含み得る。いくつかの実施形態では、キラルであり得る任意の中心原子は、独立して、（Ｒ）または（Ｓ）立体配置であり得る。いくつかの場合では、キラルは、４つの異なるタイプの原子または原子鎖に結合させることができる分子内の原子を含み得る。いくつかの場合では、ガイドＲＮＡなどの改変ポリヌクレオチドは、単一のジアステレオマーであり得るか、または、主に１つのジアステレオマーであり得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、約５１％～約１００％、約５１％～約６０％、約６０％～約７５％、約７０％～約９０％、または約８０％～約９９％のジアステレオマー過剰率を有し得る。ジアステレオマー過剰率は、キラル物質に使用される純度の測定値であり得る。いくつかの場合では、サンプルが、一方のジアステレオマーを、もう一方のジアステレオマーよりも多くの量で含む程度を反映し得る。いくつかの場合では、単一の純粋なジアステレオマーは、１００％のジアステレオマー過剰率を有し得る。一方のジアステレオマーが７０％で、もう一方のジアステレオマーが３０％のサンプルは、４０％（７０％～３０％）のジアステレオマー過剰率であり得る。
いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な標的化ドメイン；ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン（ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＲＮＡ編集エンティティと少なくとも一時的に会合する）；及びスペーサードメインを含み得る。いくつかの場合では、標的化ドメインまたはＲＮＡ編集動員ドメインが、スペーサードメインを含まない可能性がある。いくつかの場合では、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドは、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡で測定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、一緒に共有結合した複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含み得る。いくつかの場合では、主鎖は、溶媒に曝露され得る、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、またはその両方を含まない可能性がある。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡのコード領域と少なくとも部分的に会合するように構成することができる。いくつかの場合では、標的化ドメインが標的ＲＮＡのコード領域と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進され得る。
環状ガイドＲＮＡの形成
上述のように、ＲＮＡ配列の複数の末端、例えば、５’末端及び３’末端の間に結合（例えば、共有結合）を形成することにより、環状またはループ状の改変ガイドポリヌクレオチド、例えば、改変ガイドＲＮＡを、直接的または間接的に形成することができる。ＲＮＡ配列は、改変ガイドＲＮＡ（例えば、動員ドメイン、標的化ドメイン、またはその両方）を含み得る。結合は、リガーゼなどの酵素を用いることにより、形成することができる。好適なリガーゼ（またはシンセターゼ）は、共有結合を形成するリガーゼを含み得る。共有結合は、炭素－酸素結合、炭素－硫黄結合、炭素－窒素結合、炭素－炭素結合、リン酸エステル結合、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。リコンビナーゼを用いて、結合を形成することもできる。結合を形成するために、酵素をＲＮＡ配列に動員することができる。結合要素を使用してＲＮＡ配列の複数の末端を結合することにより、環状またはループ状のＲＮＡを形成することができる。いくつかの実施形態では、ライゲーション反応により、結合を形成することができる。いくつかの場合では、相同組み換え反応により、結合を形成することができる。結合要素は、環状またはループ状のＲＮＡを形成するために、クリックケミストリーを用いることができる。結合要素は、アジドベースの結合であり得る。環状またはループ状のＲＮＡを遺伝子によりコードするか、または化学的に合成することにより、環状またはループ状のＲＮＡを形成することができる。
上述のように、ＲＮＡ配列の複数の末端、例えば、５’末端及び３’末端の間に結合（例えば、共有結合）を形成することにより、環状またはループ状の改変ガイドポリヌクレオチド、例えば、改変ガイドＲＮＡを、直接的または間接的に形成することができる。ＲＮＡ配列は、改変ガイドＲＮＡ（例えば、動員ドメイン、標的化ドメイン、またはその両方）を含み得る。結合は、リガーゼなどの酵素を用いることにより、形成することができる。好適なリガーゼ（またはシンセターゼ）は、共有結合を形成するリガーゼを含み得る。共有結合は、炭素－酸素結合、炭素－硫黄結合、炭素－窒素結合、炭素－炭素結合、リン酸エステル結合、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。リコンビナーゼを用いて、結合を形成することもできる。結合を形成するために、酵素をＲＮＡ配列に動員することができる。結合要素を使用してＲＮＡ配列の複数の末端を結合することにより、環状またはループ状のＲＮＡを形成することができる。いくつかの実施形態では、ライゲーション反応により、結合を形成することができる。いくつかの場合では、相同組み換え反応により、結合を形成することができる。結合要素は、環状またはループ状のＲＮＡを形成するために、クリックケミストリーを用いることができる。結合要素は、アジドベースの結合であり得る。環状またはループ状のＲＮＡを遺伝子によりコードするか、または化学的に合成することにより、環状またはループ状のＲＮＡを形成することができる。
自己切断エンティティ、例えば、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのいずれかの触媒活性フラグメント、またはそれらの任意の組み合わせ、を用いることにより、環状またはループ状のＲＮＡを形成することができる。例えば、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのいずれかの触媒活性フラグメント、またはそれらの任意の組み合わせを、前駆改変ＲＮＡの３’末端、５’末端、またはその両方に付加することができる。別の例では、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのいずれかの触媒活性フラグメント、またはそれらの任意の組み合わせを、前駆改変ＲＮＡの３’末端、５’末端、またはその両方に付加することができる。自己切断リボザイムは、例えば、ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉリボザイム）、ｇｌｍＳリボザイム、ＨＤＶ様リボザイム、Ｒ２エレメント、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ ｒＲＮＡ、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム、グループＩＩイントロン、ヘアピンリボザイム、ＶＳリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、またはグループＩイントロンを含み得る。いくつかの場合では、自己切断リボザイムは、それが存在する１つのＲＮＡ末端を、別のＲＮＡ末端に結合させるトランス作用リボザイムであり得る。いくつかの実施形態では、アプタマーを、改変ガイドＲＮＡの各末端に付加することができる。リガーゼは、改変ガイドＲＮＡの各末端でアプタマーと接触させて、アプタマー間に共有結合を形成し、それにより、環状の改変ガイドＲＮＡを形成することができる。いくつかの場合では、自己切断要素またはアプタマーは、細胞内での転写後に、改変ポリヌクレオチドまたはプロポリヌクレオチド（例えば、前駆改変ポリペプチド由来）の自己環状化を促進するように構成することができる。例えば、図３Ｂは、ＰＣＲアッセイによる改変ガイドＲＮＡの設計３及び設計５の環状化の確認を示す。いくつかの場合では、ガイドＲＮＡの環状化は、ＰＣＲにより示すことができる。例えば、ガイドＲＮＡの末端に結合し、ガイドが環状化される場合にのみ生成物が形成されるように、外側に向けられるプライマーを開発することができる。
いくつかの場合では、エクソンのバックスライシング及びライゲーションにより、環状化が生じ得る。例えば、５’から３’へ、順方向相補配列イントロン、エクソン（ガイド配列を含み得る）、続いて、逆方向相補配列イントロンを含むように、ＲＮＡを改変することができる。転写されると、相補配列のイントロンが、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成し得る。ガイド配列を含有する内部エクソンは、スプライシングにより除去され、内因性リガーゼでラーゲーションされて、環状ガイドを形成することができる。一例では、改変ガイドＲＮＡは、コードされたリボザイムの自己触媒反応により細胞内で環状化を開始し得る。１つまたは複数のリボザイムによる切断後、線状ポリヌクレオチドが、内因性リガーゼによるライゲーション配列の５’末端及び３’末端の細胞内ＲＮＡライゲーションを受け、ガイドＲＮＡを環状化する。
好適な自己切断分子は、リボザイムを含み得る。例えば、リボザイムドメインは、自己触媒ＲＮＡを作成し得る。リボザイムは、ＲＮａｓｅ Ｐ、ｒＲＮＡ（例えば、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ ｒＲＮＡ）、リードザイム、グループＩイントロンリボザイム、グループＩＩイントロンリボザイム、ＧＩＲ１分枝リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＤＶリボザイム、ツイスターリボザイム、ツイスターシスターリボザイム、ＶＳリボザイム、ピストルリボザイム、ハチェットリボザイム、ウイロイド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。リボザイムは、Ｐ３ツイスターＵ２Ａリボザイムを含み得る。リボザイムは、５’ＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴ３’（配列番号１４）を含み得る。リボザイムは、５’ＧＣＣＡＵＣＡＧＵＣＧＣＣＧＧＵＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＡＡＡＡＵＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＵ３’（配列番号１５）を含み得る。リボザイムは、５’ＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴ３’（配列番号１４）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。リボザイムは、５’ＧＣＣＡＵＣＡＧＵＣＧＣＣＧＧＵＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＡＡＡＡＵＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＵ３’（配列番号１５）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。リボザイムは、Ｐ１ツイスターリボザイムを含み得る。リボザイムは、５’ＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＡＣＧＣ３’（配列番号１６）を含み得る。リボザイムは、５’ＡＡＣＡＣＵＧＣＣＡＡＵＧＣＣＧＧＵＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＡＡＡＡＧＵＧＧＡＧＧＧＵＡＣＡＧＵＣＣＡＣＧＣ３’（配列番号１７）を含み得る。リボザイムは、５’ＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＡＣＧＣ３’（配列番号１６）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。リボザイムは、５’ＡＡＣＡＣＵＧＣＣＡＡＵＧＣＣＧＧＵＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＡＡＡＡＧＵＧＧＡＧＧＧＵＡＣＡＧＵＣＣＡＣＧＣ３’（配列番号１７）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。
ライゲーションドメインは、第１のヌクレオチドの第２のヌクレオチドへの共有結合または非共有結合を促進し得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションドメインは、ライゲーション反応を促進するために、ライゲーションエンティティを動員し得る。いくつかの場合では、ライゲーションドメインは、相同組み換えを促進するために組み換えエンティティを動員し得る。いくつかの場合では、第１のライゲーションドメインは、第２のライゲーションドメインへの共有結合または非共有結合を促進し得る。いくつかの実施形態では、第１のライゲーションドメインは、第２のライゲーションドメインの相補的対合を促進し得る。いくつかの場合では、ライゲーションドメインは、５’ＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧ３’（配列番号１０）を含み得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションドメインは、５’ＧＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＧＴＣ３’（配列番号１１）を含み得る。いくつかの場合では、ライゲーションドメインは、５’ＡＡＣＣＡＵＧＣＣＧＡＣＵＧＡＵＧＧＣＡＧ３’（配列番号１２）を含み得る。いくつかの場合では、ライゲーションドメインは、５’ＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＧＣＧＧＣＵＧＡＣＵＡＣＣＧＵＣ３’（配列番号１３）を含み得る。いくつかの場合では、ライゲーションドメインは、５’ＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧ３’（配列番号１０）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ライゲーションドメインは、５’ＧＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＧＴＣ３’（配列番号１１）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ライゲーションドメインは、５’ＡＡＣＣＡＵＧＣＣＧＡＣＵＧＡＵＧＧＣＡＧ３’（配列番号１２）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ライゲーションドメインは、５’ＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＧＣＧＧＣＵＧＡＣＵＡＣＣＧＵＣ３’（配列番号１３）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列相同性を含み得る。
いくつかの実施形態では、前駆改変線状ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、または環状の改変ガイドは、Ｕ７またはＵ１プロモーター配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を有する配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、前駆改変ポリヌクレオチドまたは環状の改変ガイドは、５’から３’の順に、第１のリボザイムドメイン；第１のライゲーションドメイン；第１のスペーサードメイン；標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る標的化ドメイン；第２のスペーサードメイン；第２のライゲーションドメイン、及び第２のリボザイムドメインを含み得る。いくつかの場合では、第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、またはその両方は、標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、標的ＲＮＡに結合しないように構成される。いくつかの場合では、前駆改変ポリヌクレオチドは、前駆改変線状ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合では、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第１のスペーサードメイン；標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る標的化ドメイン；及び第２のスペーサードメインを含み得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡの逆相補体と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合では、前駆改変線状ポリヌクレオチドのプロポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における転写後に自己環状化するように構成される。いくつかの場合では、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、第１のスペーサードメインの５’側または第２のスペーサードメインの３’側に、リボザイムドメインを含み得る。いくつかの場合では、前駆改変線状ポリヌクレオチドは、リボザイムドメイン及び第１のスペーサードメイン間、またはリボザイムドメイン及び第２のスペーサードメイン間に、ライゲーションドメインを含み得る。いくつかの場合では、前駆改変線状ポリヌクレオチドのスペーサードメインは、前駆改変線状ポリヌクレオチドの標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合に、標的ＲＮＡに結合しないように構成することができる。図２を参照すると、２つのリボザイムドメイン、２つのライゲーション配列ドメイン、２つのスペーサードメイン、及び標的化ドメイン（１００．５０）を含む改変ガイドＲＮＡが示される。
いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドを形成する方法は、ライゲーションエンティティで、前駆改変線状ポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドを、前駆改変線状ポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドに直接的または間接的にライゲーションし、それにより、改変ポリヌクレオチドを形成することを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、（ａ）標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり得る標的化ドメイン、及び、（ｂ）スペーサードメイン、を含み得、改変ポリヌクレオチドは、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシルを含まず、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドは、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有する。いくつかの場合では、以下の少なくとも１つが適用される：（ｉ）スペーサードメインは、標的化ドメインが少なくとも部分的に標的ＲＮＡに結合する時、標的ＲＮＡに結合しないように構成され得る；（ｉｉ）標的化ドメインが標的ＲＮＡに少なくとも部分的に結合する場合、スペーサードメインは、標的化ドメインから少なくとも１ヌクレオチド離れている可能性があり、スペーサードメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインの結合は、スペーサードメインに結合する標的ＲＮＡの部分で、標的ＲＮＡの編集を生じない；または、（ｉｉｉ）スペーサードメインが標的化ドメインの５’末端または３’末端に隣接している可能性がある場合、スペーサードメインは、標的ＲＮＡに相補的でない可能性がある。いくつかの場合では、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに相補的でない可能性がある場合、これは、スペーサードメインが、標的ＲＮＡと１００％相同でない可能性があることを意味し得る。いくつかの場合では、スペーサードメインが標的ＲＮＡに相補的でない可能性がある場合、スペーサードメインは、標的ＲＮＡと１つ以上の非相補的な塩基を含み得る。
いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、改変ガイドＲＮＡを含み得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、ｓｃＡＡＶを含み得る。表２は、本明細書に記載の遺伝子の配列及びガイドＲＮＡ構成要素の配列を提供する。
いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡ３’（配列番号１８）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るｓｃＩＴＲ配列を含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＣＡ３’（配列番号１９）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るイチゴ１配列を含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣ３’（配列番号２０）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るＵ６プロモーター配列を含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴ３’（配列番号２１）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るＰ３ツイスターＵ２Ａリボザイム配列を含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴ３’（配列番号２２）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る左リンカー及びスペーサー配列を含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡ３’（配列番号２３）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るＲａｂ７ａ ３’ＵＴＲ ０．１００．５０ガイド配列を含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＴＡＧ３’（配列番号２４）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る右リンカー及びスペーサー配列を含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＡＣＧＣ３’（配列番号２５）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るＰ１ツイスターリボザイムを含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＡＴＡＣＧＣＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＣ３’（配列番号２６）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るＣＭＶプロモーターを含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＣＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＡ３’（配列番号２７）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るｅＧＦＰを含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡ３’（配列番号２８）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の相同性を含み得るＳＶ４０ＳＴＯＰを含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＴＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＴＣＧＣＧＧ３’（配列番号２９）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るイチゴ２を含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ３’（配列番号３０）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得るＡＡＶ２ ＩＴＲを含むか、またはコードし得る。いくつかの場合では、ウイルスゲノムは、５’ＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＴＡＧＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣ
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ＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＣＣＴＴＡＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＣＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＡＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＴＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＴＣＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ３’（配列番号３１）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を有する全ゲノム配列を含むか、またはコードし得る。
改変ポリヌクレオチドドメイン
Ａ．環状シャーシ
本開示は、目的の標的ＲＮＡにおける塩基のＲＮＡ編集を促進する、環状化された改変ポリヌクレオチドの組成物を提供する。本明細書に記載されるように、環状化されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡと会合し、標的ポリヌクレオチドの編集を促進するためのドメインを含み得る。例えば、本開示の改変ポリヌクレオチドは、塩基の化学修飾、例えば、アデノシン（Ａ）のイノシン（Ｉ）への脱アミノ化、を含むＲＮＡ編集を促進する。イノシンは、グアノシン（Ｇ）として読まれる。そのようなものであるから、ＲＮＡ編集の本明細書に開示の改変ポリヌクレオチド及びその使用方法は、疾患または疾患経路に関与し得る遺伝子におけるＧからＡへの点変異の修正に使用することができる。従って、本明細書に開示の改変ポリヌクレオチドは、処置方法において治療薬として使用することができる。
Ａ．環状シャーシ
本開示は、目的の標的ＲＮＡにおける塩基のＲＮＡ編集を促進する、環状化された改変ポリヌクレオチドの組成物を提供する。本明細書に記載されるように、環状化されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡと会合し、標的ポリヌクレオチドの編集を促進するためのドメインを含み得る。例えば、本開示の改変ポリヌクレオチドは、塩基の化学修飾、例えば、アデノシン（Ａ）のイノシン（Ｉ）への脱アミノ化、を含むＲＮＡ編集を促進する。イノシンは、グアノシン（Ｇ）として読まれる。そのようなものであるから、ＲＮＡ編集の本明細書に開示の改変ポリヌクレオチド及びその使用方法は、疾患または疾患経路に関与し得る遺伝子におけるＧからＡへの点変異の修正に使用することができる。従って、本明細書に開示の改変ポリヌクレオチドは、処置方法において治療薬として使用することができる。
非機能領域（例えば、標的ポリヌクレオチドと直接会合しないか、または標的ポリヌクレオチドの編集を直接促進しない環状化されたガイドの領域）は、環状化されたシャーシを形成し得る。そのようなシャーシは、本明細書に記載のスペーサードメインを含み得る。環状化されたシャーシは、任意の改変ポリヌクレオチドを標的とする任意の設計の機能部分を組み込むためのビヒクルとして、使用することができる。例えば、環状化シャーシは、改変線状ポリヌクレオチドを含み得る。従って、異なる標的ポリヌクレオチドと会合するように構成された改変ポリヌクレオチドは、単一のシャーシを共有し得るか、または異なるシャーシを有し得る。
Ｂ．標的化ドメイン
上述のように、環状化された改変ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとの会合及び改変ポリヌクレオチドの編集の促進に関与する「機能的」部分を含み得る。いくつかの場合では、この部分は、ＲＮＡ編集エンティティとの会合のための構造的特徴を含み得る標的化ドメインまたは以下に記載の他のドメインを含み得る。
上述のように、環状化された改変ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとの会合及び改変ポリヌクレオチドの編集の促進に関与する「機能的」部分を含み得る。いくつかの場合では、この部分は、ＲＮＡ編集エンティティとの会合のための構造的特徴を含み得る標的化ドメインまたは以下に記載の他のドメインを含み得る。
改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの結合及び／または標的ポリヌクレオチドの編集の促進に関与する１つ以上のドメイン、例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のドメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン、標的化ドメイン、いずれかの２つ以上、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、標的化ドメイン及びＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、標的化ドメイン及び２つの動員ドメインを含み得る。
標的化ドメインは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインに隣接して位置する可能性があり、これは、直接隣接すること、または隣接するが数ヌクレオチド離れていることを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、２つのＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインに隣接している可能性がある。いくつかの場合では、２つ以上のＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、互いに隣接している可能性がある。
改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティが化学変換を行うための、核酸配列中の特定の配列領域または塩基を標的とするための標的化ドメインを含み得る。一部の場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡとミスマッチし得る少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合では、標的化ドメインのミスマッチヌクレオチドは、標的ＲＮＡに相補的であり得る２つのヌクレオチドに隣接している可能性がある。いくつかの場合では、標的化ドメイン中のミスマッチヌクレオチドは、標的ＲＮＡに相補的であり得る２つのヌクレオチドに（ミスマッチヌクレオチドの両側に１つずつ）隣接している可能性がある。標的化ドメインは、アンチセンスＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｎｏＲＮＡより長くなり得る配列長を含み得る。標的化ドメインは、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドが２次構造を形成するのに十分な配列長を含み得る。標的化ドメインは、約２０塩基～約１，０００塩基長の配列長を含み得る。標的化ドメインは、約５０塩基～約１，０００塩基長の配列長を含み得る。標的化ドメインは、約１００塩基～約１，０００塩基長の配列長を含み得る。標的化ドメインは、約２００塩基～約１，０００塩基長の配列長を含み得る。標的化ドメインは、約５００塩基～約１，０００塩基長の配列長を含み得る。標的化ドメインは、少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００塩基長の配列長を含み得る。
いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドは、１つの標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドは、複数の標的化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドは、２つの標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドは、同じ標的ＲＮＡを標的とする２つの標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドは、異なる標的ＲＮＡを標的とする２つの標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド配列同一性を含む２つの標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチド配列同一性を含む２つの標的化ドメインを含み得る。
Ｃ．ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン
本明細書に記載の改変ポリヌクレオチドの機能部分は、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含み得る。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＲＮＡ編集エンティティにより認識される２次構造を含むドメインであり得る。そのような構造は、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインに存在する場合、標的ポリヌクレオチドとの会合なしに存在し得る。あるいは、そのような構造は、標的ポリヌクレオチドとの会合がない場合には存在し得ず、標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション時に形成され得る。そのような場合、改変ポリヌクレオチドは、標的化ドメインとは異なるＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含まない可能性がある。むしろ、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、標的ポリヌクレオチドと会合している場合、標的化ドメイン自体であってよい。
本明細書に記載の改変ポリヌクレオチドの機能部分は、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含み得る。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＲＮＡ編集エンティティにより認識される２次構造を含むドメインであり得る。そのような構造は、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインに存在する場合、標的ポリヌクレオチドとの会合なしに存在し得る。あるいは、そのような構造は、標的ポリヌクレオチドとの会合がない場合には存在し得ず、標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション時に形成され得る。そのような場合、改変ポリヌクレオチドは、標的化ドメインとは異なるＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含まない可能性がある。むしろ、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、標的ポリヌクレオチドと会合している場合、標的化ドメイン自体であってよい。
ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ａｌｕドメイン、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメイン、ＧｌｕＲ２ドメイン、ＴＡＬＥＮ動員ドメイン、Ｚｎフィンガーポリペプチド動員ドメイン、ｍｅｇａ－ＴＡＬ動員ドメイン、またはＣａｓ１３動員ドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ａｌｕドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドと少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ａｌｕ動員ドメインと少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ａｌｕドメインの少なくとも約１５、約２０、約２５、約３０、または約３５の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、Ａｌｕドメインをコードする配列と少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、Ａｌｕドメインをコードする配列と少なくとも約８５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、Ａｌｕドメインをコードする配列と少なくとも約９０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、Ａｌｕドメインをコードする配列と少なくとも約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、Ａｌｕドメインをコードする配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの実施形態では、Ａｌｕドメインをコードする配列は、修飾部分を含み得る。いくつかの場合では、Ａｌｕドメインをコードする配列は、天然に存在するＡｌｕドメインをコードする配列の一部を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＡＰＯＢＥＣドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＡＰＯＢＥＣドメインの少なくとも約１５、約２０、約２５、約３０、または約３５の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、ＡＰＯＢＥＣドメインをコードする配列と少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、ＡＰＯＢＥＣドメインをコードする配列と少なくとも約８５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、ＡＰＯＢＥＣドメインをコードする配列と少なくとも約９０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、ＡＰＯＢＥＣドメインをコードする配列と少なくとも約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＡＰＯＢＥＣドメインをコードする配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣドメインをコードする配列は、修飾部分を含み得る。いくつかの場合では、ＡＰＯＢＥＣドメインをコードする配列は、天然に存在するＡＰＯＢＥＣドメインをコードする配列の一部を含み得る。
いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連動員ドメイン配列を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連動員配列は、Ｃａｓタンパク質配列を含み得る。いくつかの場合では、Ｃａｓ１３動員ドメインは、Ｃａｓ１３ａ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｃ動員ドメイン、またはＣａｓ１３ｄ動員ドメインを含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインと少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ｃａｓ１３ｂドメインの少なくとも約１５、約２０、約２５、約３０、または約３５の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、Ｃａｓ１３ｂドメインをコードする配列と少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、Ｃａｓ１３ｂドメインをコードする配列と少なくとも約８５％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、Ｃａｓ１３ｂドメインをコードする配列と少なくとも約９０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、Ｃａｓ１３ｂドメインをコードする配列と少なくとも約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｂドメインをコードする配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの場合では、Ｃａｓ１３ｂドメインをコードする配列は、修飾部分を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｂドメインをコードする配列は、天然に存在するＣａｓ１３ｂドメインをコードする配列の一部を含み得る。
いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２ドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２ドメインの少なくとも約１５、約２０、約２５、約３０、または約３５の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、ＧｌｕＲ２ドメインをコードする配列と少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、ＧｌｕＲ２ドメインをコードする配列と少なくとも約８５％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、ＧｌｕＲ２ドメインをコードする配列と少なくとも約９０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部は、ＧｌｕＲ２ドメインをコードする配列と少なくとも約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態では、ＧｌｕＲ２ドメインをコードする配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの場合では、ＧｌｕＲ２ドメインをコードする配列は、修飾部分を含み得る。いくつかの実施形態では、ＧｌｕＲ２ドメインをコードする配列は、天然に存在するＧｌｕＲ２ドメインをコードする配列の一部を含み得る。いくつかの場合では、動員ドメインの少なくとも一部は、ＡＤＡＲを動員するコード配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。
動員ドメインが存在しない可能性がある場合、改変ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの編集を促進し、及び／または対象標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現を調節するために、依然として、対象ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ）と会合可能であり得る。これは、構造的特徴により達成され得る。構造的特徴は、ミスマッチ、対称バルジ、非対称バルジ、対称内部ループ、非対称内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、構造化モチーフ、環状化ＲＮＡ、化学修飾、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含んでもよい。一態様では、本開示の改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質、例えば、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖を形成することができる。本明細書に記載されるのは、本開示のｄｓＲＮＡ基質に存在し得るいくつかの構造的特徴のうちの１つに対応する特徴であり得る。特徴の例としては、ミスマッチ、バルジ（対称バルジもしくは非対称バルジ）、内部ループ（対称内部ループもしくは非対称内部ループ）、またはヘアピン（非標的化ドメインを含むヘアピン）が挙げられる。本開示の改変ポリヌクレオチドは、１～５０の特徴を有してもよい。本開示の改変ポリヌクレオチドは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、または８～１０の特徴を有してもよい。
本明細書に開示されるように、構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質中に２つ以上の特徴を含む。
本開示の改変ガイドＲＮＡの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質を形成することができる。本明細書に開示されるように、ミスマッチは、ｄｓＲＮＡ内の標的ＲＮＡ内の相対するヌクレオチドと対形成することができないガイドＲＮＡ内のヌクレオチドを指す。ミスマッチは、塩基対を形成しないか、相補的でないか、またはその両方である任意の２ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチであり得る。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＡに対して本開示の改変ガイドＲＮＡにＣを含んでもよい。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＣに対して本開示の改変ガイドＲＮＡにＡを含んでもよい。一実施形態では、Ｇ／Ｇミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＧに対して本開示の改変ガイドＲＮＡにＧを含んでもよい。いくつかの実施形態では、編集部位の５’に位置するミスマッチは、編集されるべき標的Ａのベースフリッピングを促進し得る。ミスマッチは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。一実施形態では、ミスマッチは、Ｇ／Ｇミスマッチを含む。一実施形態では、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含み、Ａは、標的ＲＮＡに存在し得、Ｃは、改変ポリヌクレオチドの標的化配列に存在し得る。別の実施形態では、Ａ／Ｃミスマッチ中のＡは、対象ＲＮＡ編集エンティティにより編集された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基であり得る。
いくつかの場合では、対象標的化配列は、対象ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域と、少なくとも部分的な配列相補性を含む。いくつかの場合では、標的化配列は、標的化ドメインを含み得る。いくつかの場合では、標的化配列は、標的ＲＮＡと９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相補性を含む。いくつかの場合では、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列と１００％未満の相補性を含む。例えば、標的化配列と、標的化配列により結合され得る標的ＲＮＡの領域は、一塩基ミスマッチを有してもよい。他の場合では、対象改変ポリヌクレオチドの標的化配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、３０、４０、または最大約５０塩基のミスマッチを含む。いくつかの態様では、ヌクレオチドミスマッチは、本明細書において提供される構造的特徴と関連し得る。いくつかの態様では、標的化配列は、対象標的ＲＮＡの野生型ＲＮＡと相補性が異なる少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または最大約１５ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、標的化配列は、標的ＲＮＡに相補性を有する少なくとも５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、標的化配列は、標的ＲＮＡに相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、標的化配列は、標的ＲＮＡに相補性を有する５０～２００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、標的化配列は、標的ＲＮＡに相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、標的化配列は、標的ＲＮＡに相補性を有する５０～３００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、標的化配列は、標的ＲＮＡと相補性を有する５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、または３００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、標的化配列は、合計で５０ヌクレオチド超を含み、標的ＲＮＡと相補性を有する少なくとも５０ヌクレオチドを有する。いくつかの場合では、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡと相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドを有する。いくつかの場合では、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡと相補性を有する５０～２００ヌクレオチドを有する。いくつかの場合では、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡと相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドを有する。いくつかの場合では、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡと相補性を有する５０～３００ヌクレオチドを有する。いくつかの場合では、標的ＲＮＡと相補性を有する少なくとも５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、もしくは１つ以上のループ、またはそれらの任意の組み合わせで隔てられている。いくつかの場合では、標的ＲＮＡと相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、もしくは１つ以上のループ、またはそれらの任意の組み合わせで隔てられている。いくつかの場合では、標的ＲＮＡと相補性を有する５０～２００ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、もしくは１つ以上のループ、またはそれらの任意の組み合わせで隔てられている。いくつかの場合では、標的ＲＮＡと相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、もしくは１つ以上のループ、またはそれらの任意の組み合わせで隔てられている。いくつかの場合では、標的ＲＮＡと相補性を有する５０～３００ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、もしくは１つ以上のループ、またはそれらの任意の組み合わせで隔てられている。例えば、標的化配列は、合計５４ヌクレオチドを含み、順に、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡと相補性であり、４ヌクレオチドが、バルジを形成し、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡと相補的である。別の例として、標的化配列は、合計１１８ヌクレオチドを含み、順に、２５ヌクレオチドは、標的ＲＮＡと相補的であり、４ヌクレオチドは、バルジを形成し、２５ヌクレオチドは、標的ＲＮＡと相補的であり、１４ヌクレオチドは、ループを形成し、５０ヌクレオチドは、標的ＲＮＡと相補的である。
一態様では、構造的特徴は、改変ポリヌクレオチドにおいて独立して形成し得る。他の場合では、改変ポリヌクレオチドが標的ＲＮＡに結合する時に、構造的特徴が形成し得る。構造的特徴はまた、改変ポリヌクレオチドが、他の分子、例えば、ペプチド、ヌクレオチド、または小分子、と会合する場合、形成され得る。特定の実施形態では、改変ポリヌクレオチドの構造的特徴は、標的ＲＮＡとは無関係に形成され得、その構造は、標的ＲＮＡ領域との改変ポリペプチドのハイブリダイゼーションの結果として変化し得る。特定の実施形態では、改変ポリヌクレオチドが標的ＲＮＡと会合し得る場合、構造的特徴が存在し得る。
いくつかの場合では、構造的特徴は、ヘアピンであり得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ヘアピンドメインを欠く可能性がある。他の場合では、改変ポリヌクレオチドは、ヘアピンドメインまたは複数のヘアピンドメインを含み得る。ヘアピンは、ポリヌクレオチドの任意の場所に位置する可能性がある。本明細書に開示されるように、ヘアピンは二重鎖ＲＮＡであり得、一本鎖ＲＮＡがそれ自体に折りたたまれて二重鎖ＲＮＡを形成している。一本鎖ＲＮＡは、折りたたみ領域の上流及び下流に互いに塩基対合するヌクレオチド配列を有するので、それ自体に折りたたまれる。ヘアピンは、二重鎖構造全体の長さで１０～５００ヌクレオチドを有してもよい。ヘアピンのステムループ構造は、３～１５ヌクレオチド長であってよい。ヘアピンは、任意の本明細書に開示の改変ポリヌクレオチドに存在し得る。本明細書に開示の改変ポリヌクレオチドは、１～１０のヘアピンを有してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の改変ポリヌクレオチドは、１つのヘアピンを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の改変ポリヌクレオチドは、２つのヘアピンを有する。本明細書に開示のように、ヘアピンは、動員ヘアピンまたはヘアピンまたは非動員メントヘアピンを指し得る。ヘアピンは、本開示の改変ポリヌクレオチド内の任意の場所に位置する可能性がある。いくつかの実施形態では、本開示の改変ポリヌクレオチドの３’末端、本開示の改変ポリヌクレオチドの５’末端、もしくは本開示の改変ポリヌクレオチドの標的化配列内、またはそれらの任意の組み合わせに、１つ以上のヘアピンが存在し得る。
態様では、構造的特徴は、本明細書に開示のように、動員ヘアピンを含む。動員ヘアピンは、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。いくつかの実施形態では、動員ヘアピンは、ＧｌｕＲ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ヘアピンは、Ａｌｕドメインを含む。
さらに別の態様では、構造的特徴は、非動員ヘアピンを含む。本明細書に開示の非動員ヘアピンは、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの局在化を改善する機能性を示し得る。いくつかの実施形態では、非動員ヘアピンは、核保持を改善する。いくつかの実施形態では、非動員ヘアピンは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ由来のヘアピンを含む。
別の態様では、構造的特徴は、ゆらぎ塩基を含む。ゆらぎ塩基対は、弱く対合する２つの塩基を指す。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Ｕと対合したＧを指し得る。
本開示のヘアピンは、任意の長さであり得る。一態様では、ヘアピンは、約５～２００またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、ヘアピンは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、または４００以上のヌクレオチドを含み得る。他の場合では、ヘアピンは、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～６０、５～７０、５～８０、５～９０、５～１００、５～１１０、５～１２０、５～１３０、５～１４０、５～１５０、５～１６０、５～１７０、５～１８０、５～１９０、５～２００、５～２１０、５～２２０、５～２３０、５～２４０、５～２５０、５～２６０、５～２７０、５～２８０、５～２９０、５～３００、５～３１０、５～３２０、５～３３０、５～３４０、５～３５０、５～３６０、５～３７０、５～３８０、５～３９０、または５～４００ヌクレオチドも含み得る。ヘアピンは、ヌクレオチドループで離れている二本鎖ハイブリダイズＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡモチーフ／構造にハイブリダイズするのに十分な自己の相補性を有する一本鎖ＲＮＡから形成される構造的特徴であり得る。
いくつかの場合では、構造的特徴はバルジであり得る。バルジは、標的鎖と改変ポリヌクレオチド鎖間の単一の（意図的な）核酸ミスマッチを含み得る。他の場合では、塩基のミスマッチストレッチであるバルジ領域が、ハイブリダイズした相補的ｄｓＲＮＡ領域の両側に隣接し得る限り、ストランド間の複数の連続するミスマッチがバルジを構成する。バルジは、ポリヌクレオチドの任意の場所に位置する可能性がある。いくつかの場合では、バルジは、５’ヒドロキシルまたは３’ヒドロキシルから約３０～約７０ヌクレオチドに位置する可能性がある。
一実施形態では、標的ＲＮＡへの本開示の改変ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質を形成することができる。本明細書に開示されるように、バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の形成時に形成される構造を指し、改変ポリヌクレオチドまたは標的ＲＮＡのいずれかにおけるヌクレオチドは、対向鎖上のその位置の対応物に相補的ではない。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の２次構造または３次構造を変化させ得る。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側またはｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側に１～４ヌクレオチドを有してもよい。いくつかの実施形態では、本開示の改変ポリヌクレオチドは、２つのバルジを有する。いくつかの実施形態では、本開示の改変ポリヌクレオチドは、３つのバルジを有する。いくつかの実施形態では、本開示の改変ポリヌクレオチドは、４つのバルジを有する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ基質におけるバルジの存在は、ＡＤＡＲを、標的ＲＮＡ中の標的Ａを選択的に編集し、非標的のオフターゲット編集を低減させるように配置し得る。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ基質におけるバルジの存在は、追加のＡＤＡＲを動員し得る。本明細書に開示のｄｓＲＮＡ基質のバルジは、他のＲＮＡ編集エンティティなどの他のタンパク質を動員し得る。いくつかの実施形態では、編集部位の５’に位置するバルジは、編集されるべき標的Ａのベースフリッピングを促進し得る。バルジは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。バルジは、標的Ａの選択的な編集をもたらす方向に制約することにより、ＡＤＡＲ編集を誘導するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、標的Ａの選択的編集は、標的Ａを２つのバルジ間に配置することにより達成される（例えば、改変ポリヌクレオチドに基づいて、５’末端バルジ及び３’末端バルジ間に配置される）。いくつかの実施形態では、２つのバルジは、両方とも対称的なバルジである。いくつかの実施形態では、２つのバルジは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の２ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、２つのバルジは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の３ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、２つのバルジは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の４ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、標的Ａは、２つのバルジの間の位置にあり、バルジから（例えば、５’末端のバルジまたは３’末端のバルジから）、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、または４００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、追加の構造的特徴は、バルジの間（例えば、５’端のバルジ及び３’端のバルジ間）に位置する。いくつかの実施形態では、バルジ内のミスマッチは、標的ＲＮＡにおける編集のためのヌクレオチド塩基を含む（例えば、バルジ内のＡ／Ｃミスマッチ（改変ポリヌクレオチドにおけるバルジの一部は、標的ＲＮＡのバルジの一部のＡにミスマッチしたＣを含み、Ａが編集される））。
一態様では、標的ＲＮＡへの本開示の改変ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質を形成することができる。バルジは、対称バルジであっても、非対称バルジであってよい。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質のガイドＲＮＡ側または標的ＲＮＡ側のいずれかで、１～４つの関与するヌクレオチドで形成され得る。バルジの両側に同数のヌクレオチドが存在し得る場合、対称的バルジを形成することができる。対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側またはｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側に２～４ヌクレオチドを有してもよい。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有してもよい。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の２ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２ヌクレオチドにより形成され得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の３ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチドにより形成され得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の４ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドにより形成され得る。
本開示の改変ガイドＲＮＡの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質を形成することができる。バルジは、対称バルジであっても、非対称バルジであってよい。バルジの両側に異なる数のヌクレオチドが存在し得る場合、非対称的バルジを形成することができる。非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質のガイドＲＮＡ側または標的ＲＮＡ側のいずれかで、１～４つの関与するヌクレオチドを有してもよい。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における非対称的バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側及び標的ＲＮＡ側に異なる数のヌクレオチドを有してもよい。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の１ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の２ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の３ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の２ヌクレオチドにより形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の３ヌクレオチドにより形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の４ヌクレオチドにより形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の２ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の３ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の２ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の３ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ガイドＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成され得る。いくつかの実施形態では、非対称バルジは、標的Ａを編集する効率を高める。いくつかの実施形態では、標的Ａの編集効率を高める非対称バルジは、改変ポリヌクレオチドの配列中のアデノシンの数を低減させるように形成される非対称バルジである。標的Ａの編集効率を高める非対称バルジの非限定例は、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ならびに、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４ヌクレオチドで形成される非対称バルジである。
一態様では、標的ＲＮＡへの本開示の改変ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質を形成することができる。いくつかの場合では、構造的特徴は、ループであり得る。本明細書に開示されるように、内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の形成時に形成される構造を指し、改変ポリヌクレオチドまたは標的ＲＮＡのいずれかのヌクレオチドは、対向鎖上のその位置の対応物と相補的ではなく、内部ループの片側は、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側または改変ポリヌクレオチド側のいずれかに、５個より多いヌクレオチドを有する。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであってよい。編集部位の近くに存在する内部ループは、編集されるべき標的ＲＮＡの標的Ａのベースフリッピングに役立ち得る。本開示の改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質を形成することができる。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであってよい。いくつかの実施形態では、標的Ａの選択的編集は、標的Ａを２つのループ間に配置することにより達成される（例えば、改変ポリヌクレオチドに基づいて、５’末端ループ及び３’末端ループ間に配置される）。いくつかの実施形態では、２つのループは、両方とも、対称ループである。いくつかの実施形態では、２つのループは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、２つのループは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、２つのループは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、２つのループは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、２つのループは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、２つのループは、それぞれ、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドにより形成される。いくつかの実施形態では、標的Ａは、２つのループの間の位置にあり、ループから（例えば、５’末端のループまたは３’末端のループから）、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、または４００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、追加の構造的特徴が、ループ間（例えば、５’末端ループ及び３’末端ループ間）に配置される。いくつかの実施形態では、ループ内のミスマッチは、標的ＲＮＡにおける編集のためのヌクレオチド塩基を含む（例えば、ループ内のＡ／Ｃミスマッチ（改変ポリヌクレオチドにおけるバルジの一部は、標的ＲＮＡのループの一部のＡにミスマッチしたＣを含み、Ａが編集される））。
内部ループの両側に同数のヌクレオチドが存在し得る場合、対称的内部ループを形成することができる。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有してもよい。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドで形成され得る。
一態様では、標的ＲＮＡへの本開示の改変ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質を形成することができる。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであってよい。編集部位の近くに存在する内部ループは、編集されるべき標的ＲＮＡの標的Ａのベースフリッピングに役立ち得る。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡへの本開示の改変ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであってよい。同じ数のヌクレオチドが内部ループの両側に存在する場合、対称内部ループが形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有してもよい。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドで形成され得る。ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側または改変ポリヌクレオチド側のいずれかの内部ループの片側が、５～１５０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１２０、１３５、１４０、１４５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の数のヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、２０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、２５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、３０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、３５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、４０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、４５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、５０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、５５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、６０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、６５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、７０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、７５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、８０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、８５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、９０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、９５ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１１０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１２０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１３０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１４０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１５０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、２００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、２５０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、３００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、３５０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、４００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、４５０ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、５００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、６００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、７００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、８００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、９００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループの片側は、１０００ヌクレオチドで形成され得る。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであってよい。編集部位の近くに存在する内部ループは、編集されるべき標的ＲＮＡの標的Ａのベースフリッピングに役立ち得る。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡへの本開示の改変ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであってよい。同じ数のヌクレオチドが内部ループの両側に存在する場合、対称内部ループが形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有してもよい。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の５～１５０ヌクレオチド、及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５～１５０ヌクレオチドで形成され得、ｄｓＲＮＡ標的の改変側及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側のヌクレオチドの数は同じである。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の５～１０００ヌクレオチド、及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５～１０００ヌクレオチドで形成され得、ｄｓＲＮＡ標的の改変側及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側のヌクレオチドの数は同じである。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の２０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の３０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の４０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の６０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の７０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の８０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の９０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１１０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１１０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１２０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１２０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１３０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１３０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１４０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１４０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の２５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の３５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の４５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の６００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の７００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の８００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の９００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。
一態様では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループまたは非対称内部ループであってよい。異なる数のヌクレオチドが内部ループの両側に存在する場合、非対称内部ループが形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質における非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に異なる数のヌクレオチドを有してもよい。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５～１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５～１５０ヌクレオチドで形成され得、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側のヌクレオチド数と比べて、ｄｓＲＮＡ標的の改変側において異なる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５～１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５～１０００ヌクレオチドで形成され得、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側のヌクレオチド数と比べて、ｄｓＲＮＡ標的の改変側において異なる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の９ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０ヌクレオチドの内部ループで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ル
ープは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。いくつかの実施形態では、非対称ループは、標的Ａを編集する効率を高める。いくつかの実施形態では、標的Ａの編集効率を高める非対称ループは、改変ポリヌクレオチドの配列中のアデノシンの数を低減させるように形成される非対称バルジである。標的Ａの編集効率を高める非対称ループの非限定例は、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２０ヌクレオチドで形成される非対称ループ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の６０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８０ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２４ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７５ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４６ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ならびに、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５ヌクレオチドで形成される非対称バルジである。
ープは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１５０ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の２００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の３００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０００ヌクレオチドで形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５００ヌクレオチドで形成され得る。いくつかの実施形態では、非対称ループは、標的Ａを編集する効率を高める。いくつかの実施形態では、標的Ａの編集効率を高める非対称ループは、改変ポリヌクレオチドの配列中のアデノシンの数を低減させるように形成される非対称バルジである。標的Ａの編集効率を高める非対称ループの非限定例は、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２０ヌクレオチドで形成される非対称ループ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の６０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８０ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２４ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の１００ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５０ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７０ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７５ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の８ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４６ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の４５ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５０ヌクレオチドで形成される非対称バルジ；ならびに、ｄｓＲＮＡ基質の改変ポリヌクレオチド側の７ヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１５ヌクレオチドで形成される非対称バルジである。
バルジまたはループを含む構造的特徴は、任意のサイズのものであり得る。いくつかの場合では、バルジまたはループは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００塩基を含む。いくつかの場合では、バルジまたはループは、合計で、少なくとも約１～１０、５～１５、１０～２０、１５～２５、２０～３０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、１～１２０、１～１３０、１～１４０、１～１５０、１～２００、１～２５０、１～３００、１～３５０、１～４００、１～４５０、１～５００、１～６００、１～７００、１～８００、１～９００、１～１０００、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、２０～１００、２０～１１０、２０～１２０、２０～１３０、２０～１４０、２０～１５０、１～２００、１～２５０、１～３００、１～３５０、１～４００、１～４５０、１～５００、１～６００、１～７００、１～８００、１～９００、１～１０００、３０～４０、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、３０～１１０、３０～１２０、３０～１３０、３０～１４０、３０～１５０、３０～２００、３０～２５０、３０～３００、３０～３５０、３０～４００、３０～４５０、３０～５００、３０～６００、３０～７００、３０～８００、３０～９００、３０～１０００、４０～５０、４０～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、４０～１１０、４０～１２０、４０～１３０、４０～１４０、４０～１５０、４０～２００、４０～２５０、４０～３００、４０～３５０、４０～４００、４０～４５０、４０～５００、４０～６００、４０～７００、４０～８００、４０～９００、４０～１０００、５０～６０、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、５０～１１０、５０～１２０、５０～１３０、５０～１４０、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、５０～３００、５０～３５０、５０～４００、５０～４５０、５０～５００、５０～６００、５０～７００、５０～８００、５０～９００、５０～１０００、６０～７０、６０～８０、６０～９０、６０～１００、６０～１１０、６０～１２０、６０～１３０、６０～１４０、６０～１５０、６０～２００、６０～２５０、６０～３００、６０～３５０、６０～４００、６０～４５０、６０～５００、６０～６００、６０～７００、６０～８００、６０～９００、６０～１０００、７０～８０、７０～９０、７０～１００、７０～１１０、７０～１２０、７０～１３０、７０～１４０、７０～１５０、７０～２００、７０～２５０、７０～３００、７０～３５０、７０～４００、７０～４５０、７０～５００、７０～６００、７０～７００、７０～８００、７０～９００、７０～１０００、８０～９０、８０～１００、８０～１１０、８０～１２０、８０～１３０、８０～１４０、８０～１５０、８０～２００、８０～２５０、８０～３００、８０～３５０、８０～４００、８０～４５０、８０～５００、８０～６００、８０～７００、８０～８００、８０～９００、８０～１０００、９０～１００、９０～１１０、９０～１２０、９０～１３０、９０～１４０、９０～１５０、９０～２００、９０～２５０、９０～３００、９０～３５０、９０～４００、９０～４５０、９０～５００、９０～６００、９０～７００、９０～８００、９０～９００、９０～１０００、１００～１１０、１００～１２０、１００～１３０、１００～１４０、１００～１５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～４５０、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１１０～１２０、１１０～１３０、１１０～１４０、１１０～１５０、１１０～２００、１１０～２５０、１１０～３００、１１０～３５０、１１０～４００、１１０～４５０、１１０～５００、１１０～６００、１１０～７００、１１０～８００、１１０～９００、１１０～１０００、１２０～１３０、１２０～１４０、１２０～１５０、１２０～２００、１２０～２５０、１２０～３００、１２０～３５０、１２０～４００、１２０～４５０、１２０～５００、１２０～６００、１２０～７００、１２０～８００、１２０～９００、１２０～１０００、１３０～１４０、１３０～１５０、１３０～２００、１３０～２５０、１３０～３００、１３０～３５０、１３０～４００、１３０～４５０、１３０～５００、１３０～６００、１３０～７００、１３０～８００、１３０～９００、１３０～１０００、１４０～１５０、１４０～２００、１４０～２５０、１４０～３００、１４０～３５０、１４０～４００、１４０～４５０、１４０～５００、１４０～６００、１４０～７００、１４０～８００、１４０～９００、１４０～１０００、１５０～２００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００、１５０～６００、１５０～７００、１５０～８００、１５０～９００、１５０～１０００、２００～２５０、２００～３００、２００～３５０、２００～４００、２００～４５０、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、２００～９００、２００～１０００、２５０～３００、２５０～３５０、２５０～４００、２５０～４５０、２５０～５００、２５０～６００、２５０～７００、２５０～８００、２５０～９００、２５０～１０００、３００～３５０、３００～４００、３００～４５０、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、３００～９００、３００～１０００、３５０～４００、３５０～４５０、３５０～５００、３５０～６００、３５０～７００、３５０～８００、３５０～９００、３５０～１０００、４００～４５０、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、４００～９００、４００～１０００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、５００～９００、５００～１０００、６００～７００、６００～８００、６００～９００、６００～１０００、７００～８００、７００～９００、７００～１０００、８００～９００、８００～１０００、または９００～１０００塩基を含む。
いくつかの場合では、構造的特徴が、構造化モチーフであり得る。本明細書に開示されるように、構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質中に２つ以上の構造的特徴を含む。構造化モチーフは、正確な位置（複数可）でＡＤＡＲ編集のための理想的な基質を生成するために、例えば、上記の特許請求の範囲にあるように、構造的特徴の任意の組み合わせを含み得る。ＡＤＡＲ編集を最大化するように、これらの構造モチーフを人工的に改変することができ、及び／または、既知のＡＤＡＲ基質を再現するように、これらの構造モチーフを設計することができる。
いくつかの場合では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは環状化することができるか、または環状構造であり得る。いくつかの態様では、少なくとも部分的に環状のポリヌクレオチドは、５’ヒドロキシルまたは３’ヒドロキシルを欠いている。
いくつかの場合では、標的ＲＮＡは、核ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、またはミトコンドリアＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、遺伝子間ＤＮＡ（限定されないが、ヘテロクロマチンＤＮＡを含む）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレメッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離されたＤＮＡ配列、単離されたＲＮＡ配列、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、ｓｎＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来の低分子ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｒＤＮＡ由来の低分子ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ステムループ、十字形、トーホールド、ミスマッチバルジ、またはそれらの任意の組み合わせを含む２次構造を形成し得る。いくつかの場合では、２次構造は、ステム、ヘアピンループ、シュードノット、バルジ、内部ループ、マルチループ、Ｇ－四重鎖、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、Ａ型、Ｂ型、Ｚ型、またはそれらの任意の組み合わせを取り得る。
２次構造を含む、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、２次構造を欠く同等のガイドＲＮＡまたは同等のポリヌクレオチドと比較して、大幅に、標的ＲＮＡへの結合の親和性を高めるか、標的ＲＮＡへの結合の特異性を高めるか、標的ＲＮＡの編集効率を高めるか、オフターゲット編集を低減させるか、非ターゲットＲＮＡの編集を低減させるか、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を高めるか、またはそれらの組み合わせであり得る。バルジを含む、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、バルジを欠く同等のガイドＲＮＡまたは同等のポリヌクレオチドと比較して、大幅に、標的ＲＮＡへの結合の親和性を高めるか、標的ＲＮＡへの結合の特異性を高めるか、標的ＲＮＡの編集効率を高めるか、オフターゲット編集を低減させるか、非ターゲットＲＮＡの編集を低減させるか、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を高めるか、またはそれらの組み合わせであり得る。ステムループ、十字形、トーホールド、ミスマッチバルジ、ステム、ヘアピンループ、シュードノット、内部ループ、マルチループ、Ｇ－四重鎖、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ステムループ、十字形、トーホールド、ミスマッチバルジ、ステム、ヘアピンループ、シュードノット、内部ループ、マルチループ、Ｇ四重鎖、またはそれらの任意の組み合わせを欠く同等のガイドＲＮＡまたは同等のポリヌクレオチドと比較して、大幅に、標的ＲＮＡへの結合の親和性を高めるか、標的ＲＮＡへの結合の特異性を高めるか、標的ＲＮＡの編集効率を高めるか、オフターゲット編集を低減させるか、非標的ＲＮＡの編集を低減させるか、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を高めるか、またはそれらの組み合わせであり得る。
改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの配列を含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、Ｕ７、Ｕ１、Ｕ６、Ｈ１、７ＳＫプロモーター配列、またはそれらの任意の組み合わせと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の相同性を有する配列を含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａｌｐｈａプロモーター、ＭＣＫプロモーター、またはＳｐｃ５－１２プロモーターを含み得る。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ配列モチーフを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＲＮＡ配列モチーフと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の相同性を有する配列を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ配列モチーフは、ＳｍＯＰＴ配列、ｈｎＲＮＰＡ１配列、ＭＡＬＡＴ１配列、ＳＩＲＬＯＩＮ配列、ＧｌｕＲ２配列、Ｇ四重鎖キャッピング、Ａｌｕ配列、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ配列モチーフは、ヘアピン構造などの２次ＲＮＡ構造を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ配列モチーフは、１つ以上のＲＮＡ配列モチーフ、１つ以上のプロモーター配列、またはその両方を含み得る。例えば、改変ポリヌクレオチドは、ＳｍＯＰＴ配列と融合されたＵ７プロモーター配列を含み得る。
ドメインは、２次元の形状または２次構造を形成し得る。例えば、標的化ドメイン、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン、またはそれらの組み合わせは、線状領域、十字形、トーホールド、ステムループ、もしくはそれらの一部、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る２次構造を形成し得る。ドメイン自体は、実質的に線状の２次元構造を形成し得る。ドメインは、十字形を含み得る２次構造を形成し得る。ドメインは、ステムループを含み得る２次構造を形成し得る。ドメインは、トーホールドを含み得る２次構造を形成し得る。いくつかの場合では、ドメインは、単一ヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、ドメインは、少なくとも１つの単一ヌクレオチドであり得る。いくつかの場合では、ドメインは、ポリヌクレオチドの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ドメインは、ポリヌクレオチドの特定の配列を含み得る。いくつかの場合では、ドメインは、ポリヌクレオチドの非特異的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、配列ドメインは、別のドメインの配列と重複し得る。他の場合では、ドメインの配列が、別のドメインの配列と重複しない可能性がある。
改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、さらに、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド以内であり得る。
改変ガイドポリヌクレオチドの標的化ドメインと標的ＲＮＡのコード領域が会合すると、ＲＮＡ編集エンティティ、例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、またはそれらの任意の組み合わせによる標的ＲＮＡ中の塩基の編集が促進され得る。いくつかの場合では、塩基の編集は、塩基の化学変換であり得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに少なくとも部分的に結合し得るか、または少なくとも部分的に結合することが可能である。いくつかの場合では、標的ＲＮＡと、標的ＲＮＡを標的とするように設計された改変ガイドポリヌクレオチドを、同じ細胞に、直接的または間接的に導入する（例えば、トランスフェクトする）ことによるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで、ＲＮＡ編集を決定することができる。いくつかの場合では、ＡＡＶ２ベクターなどのベクターにより、改変ガイドを細胞に導入することができる。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクションなどのトランスフェクションにより、改変ガイドを細胞に導入することができる。標的ＲＮＡは、改変ガイドポリヌクレオチドによる編集を同定するためにシーケンシングされ得る。いくつかの場合では、細胞は、初代細胞であり得る。いくつかの場合では、初代細胞または細胞は、ニューロン、光受容細胞（例えば、Ｓ錐体細胞、Ｌ錐体細胞、Ｍ錐体細胞、桿体細胞）、網膜色素上皮細胞、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア）、筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、筋管）、肝細胞、肺上皮細胞、または線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）であり得る。いくつかの場合では、細胞は、水平細胞、神経節細胞、または双極細胞であり得る。いくつかの場合では、細胞株は、哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＣＩ－６０、ＭＣＦ－７、ＨＬ－６０、２９３Ｔ（ヒト胎児腎臓）、ＲＤ（ヒト胚横紋筋肉腫）、ＬＨＣＮ（ヒト骨格筋芽細胞）分化型、ＬＨＣＮ未分化型、Ｓａｏｓ－２、ＣＨＯ、またはＨｅＬａ細胞であり得る。いくつかの場合では、細胞は、分化型であり得る。いくつかの場合では、細胞は、未分化型であり得る。いくつかの場合では、細胞株は、Ｓｆ９などの昆虫細胞株であり得る。
改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または改変ポリヌクレオチドをコードする前駆改変線状ポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ編集エンティティを介して、標的ＲＮＡの編集を促進し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの編集を促進しない場合がある。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含み得る他の点で同等のポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡに対する編集効率が少なくとも約９０％増加している可能性がある。いくつかの実施形態では、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株にトランスフェクトすること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチド、及び５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含み得る他の点で同等のポリヌクレオチドを、初代細胞株にトランスフェクトすること、ならびに、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、により編集効率を決定することができる。いくつかの実施形態では、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株にトランスフェクトすること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチド、及び５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含み得る他の点で同等のポリヌクレオチドを、初代細胞株にトランスフェクトすること、ならびに、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡの質量分析、により編集効率を決定することができる。いくつかの実施形態では、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的または間接的に導入（例えば、トランスフェクト）すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的または間接的に導入（例えば、トランスフェクト）すること、及び、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を決定することができる。いくつかの場合では、標的ＲＮＡを初代細胞株にトランスフェクトすることは、標的ＲＮＡをコードするプラスミドを初代細胞株にトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドを初代細胞株にトランスフェクトすることは、前駆改変ポリヌクレオチド、または前駆改変線状ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）を、初代細胞株にトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの場合では、シーケンシングは、逆転写酵素により標的ＲＮＡがｃＤＮＡに変換された後の、標的ＲＮＡのＳａｎｇｅｒシーケンシングを含み得る。いくつかの場合では、初代細胞株は、ニューロン、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、グリア細胞、筋芽細胞、筋管細胞、肝細胞、肺上皮細胞、または線維芽細胞を含み得る。
ＲＮＡ編集エンティティは、内因性酵素を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、組み換え酵素を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、融合ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（ここで、「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、これを指し得る）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、活性化誘導（シチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（ここで、「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、これを指し得る）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、活性化誘導（シチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、またはそれらの任意の組み合わせと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、またはｈＡＤＡＲ３などのヒト酵素を含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、ウイルスにコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、麻疹、おたふくかぜ、またはパラインフルエンザ由来のウイルスにコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、標的ＲＮＡ中のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを付加または欠失することが可能なＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来の酵素であり得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集エンティティは、標的ＲＮＡ中のウラシルまたは複数のウラシルを付加または欠失することが可能なＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来の酵素であり得る。
改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、改変ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと会合する場合、標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基に化学変換を行うＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。いくつかの場合では、化学変換は、塩基の編集を含み得る。いくつかの実施形態では、塩基の編集などの化学変換は、化学変換を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡと比較して、化学変換を有する標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質またはそのフラグメントのレベルの増加をもたらし得る。いくつかの場合では、レベルの増加は、約５％～約１００％、約１０％～約５０％、約２５％～約７５％、または約４０％～約９０％であり得る。いくつかの実施形態では、化学変換は、化学変換を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡと比較して、化学変換を伴う標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質またはそのフラグメントのレベルの減少をもたらし得る。いくつかの場合では、レベルの減少は、約５％～約９９％、約１０％～約５０％、約２５％～約７５％、または約４０％～約９０％であり得る。いくつかの実施形態では、化学変換は、編集を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡの翻訳されたタンパク質と比較して、塩基の編集を有する標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質もしくはそのフラグメントの長さの増加、タンパク質もしくはそのフラグメントの機能性の増加、タンパク質もしくはそのフラグメントの安定性の増加、またはそれらの任意の組み合わせ、をもたらし得る。いくつかの場合では、長さの増加は、約５％～約１００％、約２％～約１０％、約１０％～約２５％、約２５％～約５０％、約４０％～約８０％、または約７５％～約１５０％であり得る。いくつかの場合では、タンパク質の長さの増加が、１００％超であり得る。いくつかの場合では、安定性の増加は、タンパク質またはそのフラグメントの半減期の増加であり得る。いくつかの場合では、増加した半減期は、編集を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡの翻訳されたタンパク質より、少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍長い可能性がある。いくつかの場合では、機能性の増加は、反応速度の増加、Ｖｍａｘの増加、またはその両方を可能にする、酵素などのタンパク質またはそのフラグメントを含み得る。いくつかの場合では、機能性の増加は、編集を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡの翻訳されたタンパク質と比較して、より低い活性化エネルギーを含む、塩基の編集を有する標的ＲＮＡによりコードされた、タンパク質（例えば、酵素）またはそのフラグメントを含み得る。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドの塩基の編集は、化学変換を含み得る。いくつかの実施形態では、化学変換は、センスコドンを終止コドンに変換し得る。いくつかの場合では、終止コドンが、疾患の病原経路に関与している可能性があり、終止コドンをセンスコドンに変換すると、疾患の病原経路が低減し得る。いくつかの場合では、化学変換は、終止コドンをセンスコドンに変換し得る。いくつかの実施形態では、化学変換は、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換し得る。例えば、ミスセンス変異において。いくつかの場合では、第１のセンスコドンは、疾患の病原経路に関与している可能性があり、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換すると、疾患の病原経路が低減し得る。いくつかの場合では、化学変換は、第１の終止コドンを第２の終止コドンに変換し得る。いくつかの場合では、化学変換は、第１のアミノ酸を規定するセンスコドンを、第２のアミノ酸を規定する第２のセンスコドンに変換し得る。いくつかの場合では、第１のアミノ酸は、プロテアーゼ切断部位であり得る。いくつかの実施形態では、化学変換は、化学変換を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡと比較して、化学変換を有する標的ＲＮＡの翻訳後のタンパク質またはそのフラグメントの局在化、折りたたみ、または合成を変更し得る。いくつかの場合では、化学変換は、化学変換を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡと比較して、化学変換を有する標的ＲＮＡの局在化、折りたたみ、または合成を変更し得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、コードまたは非コードＲＮＡを含み得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集は、図４に示されるように、標的ＲＮＡの複数の位置で起こり得る。図４は、対照と比較した環状ガイドＲＮＡからのＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲにおける異なるアデノシンヌクレオチドのパーセントＲＮＡ編集を示す。環状ガイドＲＮＡは、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ配列内の異なる位置で複数のヌクレオチドを編集することが示された。最も高いパーセントＲＮＡ編集は、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ配列内の－３位で生じた。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集により決定することにより評価することができる。いくつかの場合では、タンパク質レベルの変化により、ＲＮＡ編集を決定することができる。いくつかの場合では、ウェスタンブロットにより、タンパク質のレベルを測定することができる。いくつかの場合では、定量タンパク質ゲルを用いるデンシトメトリーにより、タンパク質のレベルを測定することができる。いくつかの場合では、標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次に、標的ＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集を決定するためにＳａｎｇｅｒシーケンシングを使用することにより、改変ポリヌクレオチドによるトランスフェクション後の異なる時点（例えば、２４時間、４８時間、９６時間）で、標的ＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集を決定することができる。いくつかの場合では、ポリメラーゼ連鎖反応により、シーケンシングの前にｃＤＮＡを増幅させることができる。ガイドＲＮＡの編集効率を評価するために、ＳａｎｇｅｒシーケンシングのＳａｎｇｅｒトレースを解析することができる。いくつかの場合では、ガイドＲＮＡの編集効率を評価するために、液滴デジタルＰＣＲを使用することができる。いくつかの場合では、ガイドＲＮＡの編集効率を評価するために、定量的リアルタイムＰＣＲを使用することができる。いくつかの場合では、標的ＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集を決定するために、次世代シーケンシング技術（例えば、合成によるシーケンシング）を使用することができる。例えば、ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドによるトランスフェクション後の標的ＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集を決定するために、ＲＮＡシーケンシングを使用することができる。いくつかの場合では、パーセントＲＮＡ編集を決定するために、個々のシーケンスリードを解析することができる。
いくつかの実施形態では、改変ガイドポリヌクレオチドの標的化ドメインと、標的ＲＮＡの非翻訳領域が会合すると、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドのレベルの低減が促進され得る。いくつかの場合では、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減は、ＲＮＡ指向性ＲＮＡエンドヌクレアーゼに依存しない可能性がある。いくつかの場合では、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減は、ダイサー依存性、ＲＩＳＣ依存性、またはアルゴノート依存性ではない可能性がある。いくつかの場合では、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減は、ダイサー、ＲＩＳＣ、アルゴノート、またはそれらの任意の組み合わせとは少なくとも部分的に依存しない可能性がある。いくつかの場合では、標的ＲＮＡを細胞株の第１の細胞及び第２の細胞に直接的または間接的に導入（例えば、トランスフェクト）し、続いて、標的ＲＮＡを標的とする改変ポリヌクレオチドを細胞株の第１の細胞に直接的または間接的に導入（例えば、トランスフェクト）すること、ならびに、第１の細胞及び第２の細胞において標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの量を比較することによるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドのレベルの低減を決定することができる。いくつかの場合では、細胞は、初代細胞であり得る。いくつかの場合では、初代細胞または細胞は、ニューロン、光受容細胞（例えば、Ｓ錐体細胞、Ｌ錐体細胞、Ｍ錐体細胞、桿体細胞）、網膜色素上皮細胞、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア）、筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、筋管）、肝細胞、肺上皮細胞、または線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）であり得る。いくつかの場合では、細胞は、水平細胞、神経節細胞、または双極細胞であり得る。いくつかの場合では、細胞株は、哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＣＩ－６０、ＭＣＦ－７、ＨＬ－６０、ＲＤ、ＬＨＣＮ分化型、ＬＨＣＮ未分化型、Ｓａｏｓ－２、ＣＨＯ、またはＨｅＬａ細胞であり得る。いくつかの場合では、細胞株は、Ｓｆ９などの昆虫細胞株であり得る。
いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡのコード領域、非コード領域、またはその両方に会合し得る。いくつかの場合では、非コード領域は、標的ＲＮＡのイントロン領域を含み得る。いくつかの場合では、標的ＲＮＡのイントロン領域の少なくとも一部と、少なくとも部分的に会合するように、標的化ドメインを構成することができる。いくつかの場合では、非コード領域は、非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、またはその両方を含み得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、ＵＴＲを標的とすることにより、塩基の編集を引き起こし得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、ＵＴＲを標的とすることにより、ｍＲＮＡの編集を実質的にほとんど引き起こさないか全く引き起こさない可能性がある。いくつかの場合では、標的化ドメインは、非コード領域を標的とすることにより、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはその両方でのノックダウンを引き起こす可能性がある。いくつかの場合では、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）の少なくとも一部と、少なくとも部分的に会合するように、標的化ドメインを構成することができる。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡの上流のオープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）と少なくとも部分的に会合するように構成されていない可能性がある。
いくつかの場合では、標的化ドメインは、アプタマーを含まない可能性がある。アプタマーは、標的ＲＮＡなどの標的へのヌクレオチド塩基の相補性よりはむしろ、形状の相補性により結合するポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、アプタマーは、動員ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、アプタマーは、動員ドメインである。
いくつかの場合では、本明細書に記載の改変ガイドは、ノックダウンを促進し得る。ノックダウンは、標的ＲＮＡの発現、タンパク質の発現、またはその両方を低減させ得る。いくつかの場合では、ノックダウンは、ｍＲＮＡの編集を伴い得る。いくつかの例では、ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＡＤＡＲ）で、ノックダウンを媒介することができる。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集酵素は、ＲＮＡ内の複数のアデノシンの加水分解的脱アミノ化により、ノックダウンを引き起こし得る。ＲＮＡ中の複数のアデノシンの加水分解的脱アミノ化は、ハイパー編集と呼ばれ得る。いくつかの場合では、ハイパー編集は、シス（例えば、Ａｌｕエレメント）またはトランス（例えば、改変ポリヌクレオチドにより標的ＲＮＡで）で生じ得る。いくつかの場合では、ｍＲＮＡの編集が実質的にほとんどないか全くない状態でノックダウンが生じ得る。いくつかの場合では、ノックダウンは、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、またはその両方などの、標的ＲＮＡの非翻訳領域を標的とすることにより生じ得る。いくつかの場合では、ノックダウンは、標的ＲＮＡのコード領域を標的とすることにより生じ得る。図６Ａは、ヌクレオチドのパーセントＲＮＡ編集を示し、線状ガイドＲＮＡ及び環状ガイドＲＮＡの３’ＵＴＲαシヌクレイン（ＳＮＣＡ）ｍＲＮＡのパーセントノックダウンを図６Ｂに示す。環状ガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲを編集するための線状ガイドと比較して、より低い編集レベルを示した。しかし、環状ガイドＲＮＡは、線状ガイドＲＮＡと比較して、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのノックダウンの増加を示した。環状ガイドのノックダウン効率の増加は、ＡＤＡＲに依存しない可能性がある。ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの編集は、ＡＤＡＲに依存する可能性がある。
化学修飾
いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、及び前駆改変ポリヌクレオチドは、修飾を含み得る。改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、及び前駆改変ポリヌクレオチドは、２つ以上の修飾を含み得る。修飾は、修飾塩基を含み得る。修飾は、糖修飾、例えば、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの１つ以上の塩基へのグルコースまたは他の糖ベースの部分の付加、を含み得る。修飾は、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの少なくとも一部を覆うタンパク質コーティングを含み得る。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド上の糖修飾を含み得る。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖修飾は、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖修飾は、２’－Ｏ－メチル化を含み得る。修飾は、修飾なしの実質的に同等の改変ガイドＲＮＡ、または改変ポリヌクレオチドと比較して、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの安定性もしくは半減期を増加させるか、編集の効率を高めるか、オフターゲット編集を大幅に低減させるか、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を高めるか、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、及び前駆改変ポリヌクレオチドは、修飾を含み得る。改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、及び前駆改変ポリヌクレオチドは、２つ以上の修飾を含み得る。修飾は、修飾塩基を含み得る。修飾は、糖修飾、例えば、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの１つ以上の塩基へのグルコースまたは他の糖ベースの部分の付加、を含み得る。修飾は、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの少なくとも一部を覆うタンパク質コーティングを含み得る。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド上の糖修飾を含み得る。いくつかの場合では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖修飾は、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖修飾は、２’－Ｏ－メチル化を含み得る。修飾は、修飾なしの実質的に同等の改変ガイドＲＮＡ、または改変ポリヌクレオチドと比較して、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの安定性もしくは半減期を増加させるか、編集の効率を高めるか、オフターゲット編集を大幅に低減させるか、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を高めるか、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの場合では、ガイドの安定性、合成、局在化、細胞内保持を高めるか、または半減期を延長する化学修飾は、遺伝子によりコード化可能でないことがある。改変ポリヌクレオチドは、環状、実質的に環状、または別の方法で連続的に結合しているもの（例えば、ループとして配置され得るもの）であり得、また、環状でも、ループ状でもない可能性のある実質的に同等の改変ポリヌクレオチドと実質的に同様の２次構造を保持し得る。環状またはループ状の改変ポリヌクレオチドは、事前に変形させることができる。
本開示の一態様は、ＲＮＡ編集用の、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドを含むベクター、組成物、及び医薬組成物を提供する。上記または本明細書に記載のいずれも、Ａ（アデノシン）からＩ（イノシン）への編集、Ｃ（シトシン）からＵ（ウラシル）への編集、ＵからＣへの編集、またはそれらの組み合わせ用に構成することができる。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡにおけるヌクレオチド及び／または複数のヌクレオチドの付加及び欠失であり得る。いくつかの場合では、ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡにおけるＵヌクレオチドの付加及び欠失であり得る。いくつかの場合では、ＡからＩへの編集は、ＣからＵへの変異として解釈されるか、または読まれ得る。いくつかの実施形態では、ＡからＩへの編集は、ＡからＧへの変異として解釈されるか、または読まれ得る。いくつかの場合では、標的ＲＮＡは、ミスセンスまたはナンセンス変異などの変異を含み得る。いくつかの場合では、標的ＲＮＡは、ミスセンス変異を含み得る。いくつかの場合では、標的ＲＮＡは、ナンセンス変異を含み得る。いくつかの場合では、標的化ドメインは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に結合し得る。いくつかの場合では、標的ＲＮＡは、疾患または状態、例えば、レット症候群、ハンチントン病、筋ジストロフィー、鎌状赤血球貧血、またはテイ・サックス病に関与し得る。本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドを含むベクター、組成物、及び医薬組成物は、天然系と比較した編集効率の向上、オフターゲット編集の低減、安定性の向上、合成の向上、細胞内保持の向上、もしくは半減期の延長、またはそれらの任意の組み合わせを提供し得る。
送達
本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化ポリヌクレオチド）または細胞内で環状化可能な本明細書に記載の改変前駆ポリヌクレオチドは、ベクターを介して細胞に送達することができる。そのようなベクターは、後述の遺伝子によりコード可能なベクター（例えば、ウイルスベクター）、及び後述のリポソームまたはナノ粒子などの他のビヒクルを含み得る。そのようなベクターは、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化されたポリヌクレオチド）または本明細書に記載の改変前駆ポリヌクレオチドの細胞への標的送達を行うように設計することができる。具体的には、そのようなベクターは、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化されたポリヌクレオチド）または本明細書に記載の改変前駆ポリヌクレオチドを、本明細書に記載の疾患または状態に罹患している対象の細胞に送達し得る。そのような疾患または状態は、改変ポリヌクレオチド（例えば、プレＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の変異が、疾患または状態の進行に関与している疾患または状態を含み得る。従って、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化されたポリヌクレオチド）または本明細書に記載の改変前駆ポリヌクレオチドの対象の細胞への送達は、疾患または状態を処置するために使用することができ、または投与が予防的に行われる場合に疾患または状態を予防するために使用することができる。
本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化ポリヌクレオチド）または細胞内で環状化可能な本明細書に記載の改変前駆ポリヌクレオチドは、ベクターを介して細胞に送達することができる。そのようなベクターは、後述の遺伝子によりコード可能なベクター（例えば、ウイルスベクター）、及び後述のリポソームまたはナノ粒子などの他のビヒクルを含み得る。そのようなベクターは、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化されたポリヌクレオチド）または本明細書に記載の改変前駆ポリヌクレオチドの細胞への標的送達を行うように設計することができる。具体的には、そのようなベクターは、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化されたポリヌクレオチド）または本明細書に記載の改変前駆ポリヌクレオチドを、本明細書に記載の疾患または状態に罹患している対象の細胞に送達し得る。そのような疾患または状態は、改変ポリヌクレオチド（例えば、プレＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の変異が、疾患または状態の進行に関与している疾患または状態を含み得る。従って、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化されたポリヌクレオチド）または本明細書に記載の改変前駆ポリヌクレオチドの対象の細胞への送達は、疾患または状態を処置するために使用することができ、または投与が予防的に行われる場合に疾患または状態を予防するために使用することができる。
本開示の一態様は、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドを含有する医薬組成物用のベクター及び投与方法を提供する。ＡＡＶベクターなどの様々な方法を使用して、本明細書に記載の環状またはループ状ガイドＲＮＡを、細胞または対象に送達することができる。
核酸、例えば、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドを送達するために、ベクターを用いることができる。いくつかの場合では、ベクターは、ポリペプチドコートを含み得、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの少なくとも一部が、ポリペプチドコートの内側に存在し得る。いくつかの場合では、ベクターは、前駆改変線状ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチド、またはその両方を含み得る。ベクターは、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを含み得る。ベクターは、ＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、塩基修飾を含み得る。ベクターは、組み換えベクターを含み得る。ベクターは、天然に存在するベクターから改変することができる。ベクターは、天然に存在しないベクターの少なくとも一部を含み得る。任意のベクターを利用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、細胞外小胞、ナノメッシュ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、これらのいずれかの一部、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子ベクターは、ポリマーベースのナノ粒子、アミノ脂質ベースのナノ粒子、金属ナノ粒子（例えば、金ベースのナノ粒子）、これらのいずれかの一部、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、ベクターは、ＡＡＶベクターを含み得る。いくつかの場合では、ベクターは、一本鎖ＡＡＶベクターであり得る。ベクターは、修飾ＶＰ１タンパク質を含むように修飾することができる（例えば、ＶＰ１タンパク質を含むように修飾されたＡＡＶベクター）。ＡＡＶは、血清型、例えば、ＡＡＶ１血清型、ＡＡＶ２血清型、ＡＡＶ３血清型、ＡＡＶ４血清型、ＡＡＶ５血清型、ＡＡＶ６血清型、ＡＡＶ７血清型、ＡＡＶ８血清型、ＡＡＶ９血清型、これらのいずれかの派生物、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、ＡＡＶベクターは、１つ以上の血清型のキメラ（例えば、ＡＡＶ２由来のＲｅｐ及びＩＴＲ、ならびにＡＡＶ５由来のキャプシドポリペプチドを有するＡＡＶ２／５ウイルス）であり得る。いくつかの場合では、ＡＡＶベクターは、血清型のバリアントであり得る。いくつかの場合では、ウイルスベクターは、自己相補型アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターであり得る。
核酸は、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、または前駆改変ガイドＲＮＡを少なくとも部分的にコードし得る。核酸は、二本鎖、一本鎖、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。いくつかの場合では、核酸は、標的化タグを含み得る。いくつかの場合では、標的化タグは、核酸を、体内の特定の臓器または領域に少なくとも部分的に誘導し得る。いくつかの場合では、標的化タグは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧｌａＮａｃ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチドが、医薬組成物に含まれ得る。いくつかの場合では、環状またはループ状の改変ガイドまたはその前駆体が、医薬組成物に含まれ得る。いくつかの実施形態では、単位用量形態の医薬組成物は、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド（例えば、改変ガイドポリヌクレオチド）、前駆改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドを含むベクター、または改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドの核酸、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。医薬組成物は、第１の活性成分を含み得る。第１の活性成分は、改変ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドを含むベクター、または改変ポリヌクレオチドまたは前駆改変ポリヌクレオチドの核酸を含み得る。医薬組成物を単位用量形態で製剤化することができる。薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。医薬組成物は、第２、第３、または第４の活性成分を含み得る。いくつかの場合では、医薬組成物は、医薬製剤を含み得る。
いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドを、ＲＮＡ編集エンティティと共送達することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集エンティティは、細胞または対象に別々に送達することができる。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドを、ＲＮＡ編集エンティティと会合または直接結合することができ、会合または直接結合している組成物を、細胞または対象に送達することができる。いくつかの場合では、組成物は、編集エンティティをコードする配列を含み得る。組成物は、複数の、例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上の編集エンティティを含み得る。組成物は、複数の編集エンティティを含み得、各編集エンティティが、独立して、標的配列を編集し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、単位用量形態または複数用量形態であり得る。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、単位用量形態であり得る。本明細書で使用される単位用量形態は、ヒトまたは非ヒト対象（例えば、動物）への投与に適する物理的に別個の単位を指し得る。いくつかの場合では、単位用量形態を、個別に包装することができる。各単位用量は、薬学的担体、希釈剤、賦形剤、またはそれらの任意の組み合わせを伴って、所望の治療効果を生じるのに十分であり得る所定量の活性成分（複数可）を含有し得る。単位用量形態の例は、アンプル、注射器、ならびに個別に包装された錠剤及びカプセル剤を含み得る。いくつかの場合では、単位用量形態は、使い捨て注射器に含まれ得る。いくつかの場合では、単位剤形を、その分数または倍数で投与することができる。複数回投与形態は、単一の容器に包装された複数の同一の単位投与形態であり得、これを、分離した単位投与形態で投与することができる。複数回投与形態の例は、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトル、またはパイントもしくはガロンのボトルを含み得る。いくつかの場合では、複数回投与形態は、同じ薬学的に活性な薬剤を含み得る。いくつかの場合では、複数回投与形態は、異なる薬学的に活性な薬剤を含み得る。
組成物は、活性剤、例えば、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、または、本開示の改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドを含有するベクターもしくは核酸、化合物あるいは組成物、及び、不活性（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識）または活性な、天然に存在するまたは天然に存在しない担体、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどの組み合わせを含み得、薬学的に許容される担体を含む。担体は、医薬賦形剤及び添加物のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖類、ジ、トリ、テトラオリゴ糖、及びオリゴ糖を含む糖類；誘導体化糖、例えば、アルジトール、アルドール酸、エステル化糖など；ならびに、多糖類または糖ポリマー）も含み、これは、単独で、または組み合わせて存在し得る（単独で、または組み合わせて、１～９９．９９％重量または体積で含む）。例示的なタンパク質賦形剤としては、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組み換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。緩衝能力においても機能し得る代表的なアミノ酸成分、抗体成分、またはその両方としては、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。炭水化物賦形剤は、本技術の範囲内であることも意図され得、この例としては、単糖類、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど；二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖類、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；ならびに、アルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、及びミオイノシトールが挙げられるが、これらに限定されない可能性がある。
本明細書に記載の組成物は、賦形剤を損なう可能性がある。賦形剤は、凍結保存剤、例えば、ＤＭＳＯ、グリセロール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、凍結保存剤、例えば、スクロース、トレハロース、デンプン、これらのいずれかの塩、これらのいずれかの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、ｐＨ剤（組成物の構成成分の酸化または分解を最小限に抑える）、安定化剤（組成物の構成成分の変性または分解を防ぐ）、緩衝剤（温度安定性を高める）、可溶化剤（タンパク質の溶解度を高める）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、界面活性剤、糖、アミノ酸、抗酸化剤、塩、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、トリグリセリド、アルコール、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、炭酸ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ポリソルベート８０、リン酸ナトリウム、スクロース、リン酸二ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート２０、ヒスチジン、クエン酸、アルブミン、水酸化ナトリウム、グリシン、クエン酸ナトリウム、トレハロース、アルギニン、酢酸ナトリウム、酢酸塩、ＨＣｌ、エデト酸二ナトリウム、レシチン、グリセリン、キサンタンゴム、大豆イソフラボン、ポリソルベート８０、エチルアルコール、水、テプレノン、またはそれら任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８６）に記載の賦形剤であり得る。
好適な賦形剤の非限定例としては、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、キレート剤、分散促進剤、崩壊剤、着香剤、甘味剤、着色剤が挙げられ得る。いくつかの場合では、賦形剤は、緩衝剤であり得る。好適な緩衝剤の非限定例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、及び重炭酸カルシウムが挙げられ得る。緩衝剤として、医薬品製剤中で、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、及び他のカルシウム塩、またはそれらの組み合わせを使用することができる。
賦形剤は、保存剤を含み得る。好適な防腐剤の非限定例としては、抗酸化剤、例えば、α－トコフェロール及びアスコルベート、ならびに、抗菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、及びフェノールが挙げられ得る。酸化防止剤には、さらに、ＥＤＴＡ、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、ｐ－アミノ安息香酸、グルタチオン、プロピルガラート、システイン、メチオニン、エタノール及びＮ－アセチルシステインを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合では、防腐剤は、バリダマイシンＡ、ＴＬ－３、オルトバナジン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、Ｎ－ａ－トシル－Ｐｈｅ－クロロメチルケトン、Ｎ－ａ－トシル－Ｌｙｓ－クロロメチルケトン、アプロチニン、フッ化フェニルメチルスルホニル、ジイソプロピルフルオロホスファート、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、グランザイム阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞分裂阻害剤、細胞周期阻害剤、脂質シグナル伝達阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗菌剤、オキシダーゼ阻害剤、またはその他の阻害剤を含み得る。
医薬製剤は、賦形剤として結合剤を含み得る。好適な結合剤の非限定例としては、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２－Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。
医薬製剤に使用することができる結合剤は、デンプン、例えば、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、小麦デンプン；糖類、例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、マルトデキストリン；天然及び合成ガム；ゼラチン；セルロース誘導体、例えば、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース等；ポリビニルピロリドン（ポビドン）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ワックス；炭酸カルシウム；リン酸カルシウム；アルコール、例えば、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、水、またはそれらの組み合わせから選択することができる。
医薬製剤は、賦形剤として潤滑剤を含み得る。好適な潤滑剤の非限定例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス、ポリオキシエチレンモノステアラート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、及び軽鉱油が挙げられ得る。医薬製剤に使用することができる潤滑剤は、ステアリン酸金属塩（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム）、脂肪酸エステル（例えば、フマル酸ステアリルナトリウム）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、脂肪族アルコール、グリセリルベヘナート、鉱油、パラフィン、水素添加植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ラウリル硫酸金属塩（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム）、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及びタルク、またはこれらの組み合わせから選択することができる。
いくつかの場合では、医薬製剤は、賦形剤として分散促進剤を含み得る。好適な分散剤の非限定例としては、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、同形ケイ酸塩、及び高ＨＬＢ乳化剤界面活性剤としての微結晶性セルロースが挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、賦形剤として崩壊剤を含み得る。いくつかの場合では、崩壊剤は、非発泡性崩壊剤であり得る。好適な非発泡性崩壊剤の非限定例としては、デンプン、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、それらのアルファ化及び加工デンプン、甘味料、クレイ、例えば、ベントナイト、微結晶性セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム、例えば、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、及びトラガントが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、崩壊剤は、発泡性崩壊剤であり得る。好適な発泡性崩壊剤の非限定例としては、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウム、及び酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムが含まれ得る。
いくつかの場合では、賦形剤は、甘味料、着香剤、またはその両方を含み得る。好適な甘味料の非限定例としては、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトース、及びそれらの混合物（担体として使用されない場合）；サッカリン及びその様々な塩、例えば、ナトリウム塩；ジペプチド甘味料、例えば、アスパルテーム；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリチン；ステビア・レバウディアナ（ステビオシド）；スクロースのクロロ誘導体、例えば、スクラロース；及び、糖アルコール、例えば、ソルビトール、マンニトール、シリトールなどが挙げられ得る。いくつかの場合では、組成物に組み込まれる着香剤は、合成香味油及び香味芳香族；天然油；植物、葉、花、及び果実からの抽出物；ならびにそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの実施形態では、着香剤は、桂皮油；冬緑油；ペパーミント油；クローバー油；干し草油；アニス油；ユーカリ；バニラ；柑橘油、例えば、レモン油、オレンジ油、グレープ及びグレープフルーツ油；ならびに、リンゴ、モモ、ナシ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップル、及びアプリコットを含むフルーツエッセンスからなる群より選択することができる。
医薬組成物は、希釈剤を含み得る。希釈剤の非限定例としては、水、グリセロール、メタノール、エタノール、及び他の同様の生体適合性希釈剤が挙げられ得る。いくつかの場合では、希釈剤は、酸性水溶液、例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸、または同様のものであり得る。他の場合では、希釈剤は、アルカリ金属炭酸塩、例えば、炭酸カルシウム；アルカリ金属リン酸塩、例えば、リン酸カルシウム；アルカリ金属硫酸塩、例えば、硫酸カルシウム；セルロース誘導体、例えば、セルロース、微結晶セルロース、セルロースアセタート；酸化マグネシウム、デキストリン、フルクトース、デキストロース、グリセリルパルミトステアラート、ラクチトール、コリン、ラクトース、マルトース、マンニトール、シメチコン、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、タルク、キシリトール、及び／またはそれらの無水物、水和物、及び／または薬学的に許容される誘導体、またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。
キット
いくつかの実施形態では、キットは、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドを含むベクター、改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドの核酸、または医薬組成物、及び容器を含み得る。いくつかの場合では、容器は、プラスチック、ガラス、金属、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合では、キットは、それを必要とする対象に投与するための説明書などの使用説明書を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドを含むベクター、改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドの核酸、または医薬組成物、及び容器を含み得る。いくつかの場合では、容器は、プラスチック、ガラス、金属、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合では、キットは、それを必要とする対象に投与するための説明書などの使用説明書を含み得る。
いくつかの場合では、本明細書に記載の組成物を含む包装製品を適切にラベル付けすることができる。いくつかの場合では、本明細書に記載の医薬組成物は、適正製造基準（ｃＧＭＰ）及び表示規制に従って製造することができる。いくつかの場合では、本明細書に開示の医薬組成物は、無菌であり得る。
処置方法
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象の疾患または状態を処置または予防する方法は、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド；改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドを含むベクター；改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの核酸；改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドを含む医薬組成物；及び、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を投与することを含み得る。いくつかの場合では、方法は、第２の治療を投与することを含み得る。いくつかの場合では、第２の治療は、抗生物質、抗ウイルス薬、癌処置（例えば、放射線、化学療法、チェックポイント阻害剤、ＣＡＲ－Ｔ細胞処置）、神経学的処置、ステロイド、抗炎症処置、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、第２の療法は、抗体を含み得る。いくつかの場合では、第２の療法は、バピネウズマブ、ソラネズマブ、ガンテネルマブ、クレネズマブ、ポネズマブ、アデュカヌマブ、ＢＡＮ２４０１、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。投与を、少なくとも約１日１回、約１日２回、約１日３回、約１日４回、約１日５回、または約１日６回実施することができる。方法を、約１日～約８日、約１週間～約５週間、約１ヶ月～約１２ヶ月、約１年～約３年、約３年～約１０年、約１０年～約５０年、約２５年～約１００年、または約５０年～約１３０年実施することができる。いくつかの場合では、方法は、対象が疾患を有すると診断することを含み得る。いくつかの場合では、対象は、処置前に診断されている可能性がある。いくつかの場合では、疾患または状態を有する対象を診断することは、身体検査、生検、放射線画像、遺伝子検査、血液検査、尿検査、抗体検査、またはそれらの任意の組み合わせを用いる診断を含み得る。いくつかの場合では、放射線画像は、放射線画像を含み得、放射線画像は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）画像、核スキャン、Ｘ線画像、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、超音波画像、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象の疾患または状態を処置または予防する方法は、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド；改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドを含むベクター；改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドの核酸；改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、または前駆改変ポリヌクレオチドを含む医薬組成物；及び、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を投与することを含み得る。いくつかの場合では、方法は、第２の治療を投与することを含み得る。いくつかの場合では、第２の治療は、抗生物質、抗ウイルス薬、癌処置（例えば、放射線、化学療法、チェックポイント阻害剤、ＣＡＲ－Ｔ細胞処置）、神経学的処置、ステロイド、抗炎症処置、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、第２の療法は、抗体を含み得る。いくつかの場合では、第２の療法は、バピネウズマブ、ソラネズマブ、ガンテネルマブ、クレネズマブ、ポネズマブ、アデュカヌマブ、ＢＡＮ２４０１、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。投与を、少なくとも約１日１回、約１日２回、約１日３回、約１日４回、約１日５回、または約１日６回実施することができる。方法を、約１日～約８日、約１週間～約５週間、約１ヶ月～約１２ヶ月、約１年～約３年、約３年～約１０年、約１０年～約５０年、約２５年～約１００年、または約５０年～約１３０年実施することができる。いくつかの場合では、方法は、対象が疾患を有すると診断することを含み得る。いくつかの場合では、対象は、処置前に診断されている可能性がある。いくつかの場合では、疾患または状態を有する対象を診断することは、身体検査、生検、放射線画像、遺伝子検査、血液検査、尿検査、抗体検査、またはそれらの任意の組み合わせを用いる診断を含み得る。いくつかの場合では、放射線画像は、放射線画像を含み得、放射線画像は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）画像、核スキャン、Ｘ線画像、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、超音波画像、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象の疾患もしくは状態を処置する方法、または、それを必要とする対象の疾患もしくは状態を予防する方法は、対象、細胞、またはその両方に、それぞれ、改変ガイドＲＮＡ、改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチド、前駆改変ポリヌクレオチド；改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチドを含むベクター；または、改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチド、前駆改変線状ポリヌクレオチドの核酸；または、改変ポリヌクレオチドもしくは前駆改変ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与または予防的に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞を含み得る。いくつかの場合では、細胞は、任意の組織または器官、例えば、皮膚細胞、肺細胞、心臓細胞、上皮細胞、生殖細胞、眼細胞、腎臓細胞、肝細胞、膵臓細胞、腸細胞、筋肉細胞、腺細胞、眼細胞、脳細胞、または血液細胞に由来し得る。いくつかの場合では、細胞は、ニューロン、光受容細胞、網膜色素上皮細胞、グリア細胞、筋芽細胞、筋管細胞、肝細胞、肺上皮細胞、または線維芽細胞を含み得る。いくつかの場合では、細胞は、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、多能性幹細胞、または全能性幹細胞であり得る。いくつかの場合では、細胞は、ヒト細胞を含み得る。いくつかの場合では、細胞は、白血球を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球を含み得る。いくつかの場合では、細胞は、Ｔ細胞を含み得る。いくつかの場合では、細胞は、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ細胞を含み得る。いくつかの場合では、細胞は、形質芽球、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ－１細胞、制御性Ｂ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
改変ガイドＲＮＡなどの改変ガイドポリヌクレオチドの投与は、処置過程を通して、１回の投与、連続的または断続的に実施することができる。投与の最も効果的な手段及び投薬量を決定する方法は、当業者らに既知であり得、治療に使用される組成物、治療の目的、治療される標的細胞、及び処置される対象により変化し得る。処置する医師により選択される用量レベル及びパターンで、単回または複数回の投与を実施することができる。薬剤の好適な投薬製剤及び投与方法は、当該技術分野で既知であり得る。投与経路も決定することができ、最も効果的な投与経路を決定する方法は、当業者らに既知であり得、処置に使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または病期、及び標的細胞または組織により変化し得る。投与経路の非限定例としては、経口投与、経鼻投与、注射、及び局所適用が挙げられる。
本明細書に開示される組成物の投与または適用は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１５０、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００日の連続または不連続日の期間、実施することができる。いくつかの場合では、組成物を、生涯投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与または適用は、約１～約３０日、約１～約６０日、約１～約９０日、約１～約３００日、約１～約３０００日、約３０日～約９０日、約６０日～約９００日、約３０日～約９００日、または約９０日～約１５００日であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与または適用は、約１週～約５週、約１ヶ月～約１２ヶ月、約１年～約３年、約２年～約８年、約３年～約１０年、約１０年～約５０年、約１５年～約４０年、約２５年～約１００年、約３０年～約７５年、約６０年～約１１０年、または約５０年～約１３０年であり得る。
本明細書に開示の組成物の投与または適用は、少なくとも約１週間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約４年、少なくとも約５年、少なくとも約６年、少なくとも約７年、少なくとも約８年、少なくとも約９年、少なくとも約１０年、少なくとも約１５年、少なくとも約２０年、または生涯の間、実施することができる。投与は、対象の生涯にわたって繰り返し、例えば、対象の生涯にわたって１日１回、週に１回、または月に１回、実施することができる。投与は、対象の生涯のかなりの部分にわたって繰り返し、例えば、少なくとも約１年、約５年、約１０年、約１５年、約２０年、約２５年、約３０年以上の間、１日１回、週に１回、または月に１回、実施することができる。
本明細書に開示の組成物の投与または適用は、２４時間で、少なくとも約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、約２１回、約２２回、約２３回、または約２４回、実施することができる。いくつかの場合では、２４時間にわたって連続的に、本明細書に開示の組成物の投与または適用を実施することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物の投与または適用を、週に少なくとも約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、または約２１回、実施することができる。いくつかの場合では、月に、少なくとも約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、約２１回、約２２回、約２３回、約２４回、約２５回、約２６回、約２７回、約２８回、約２９回、約３０回、約３１回、約３２回、約３３回、約３４回、約３５回、約３６回、約３７回、約３８回、約３９回、約４０回、約４１回、約４２回、約４３回、約４４回、約４５回、約４６回、約４７回、約４８回、約４９回、約５０回、約５１回、約５２回、約５３回、約５４回、約５５回、約５６回、約５７回、約５８回、約５９回、約６０回、約６１回、約６２回、約６３回、約６４回、約６５回、約６６回、約６７回、約６８回、約６９回、約７０回、約７１回、約７２回、約７３回、約７４回、約７５回、約７６回、約７７回、約７８回、約７９回、約８０回、約８１回、約８２回、約８３回、約８４回、約８５回、約８６回、約８７回、約８８回、約８９回、約９０回、またはそれ以上、本明細書に開示の組成物の投与または適用を実施することができる。いくつかの実施形態では、単回用量または分割用量として、組成物を投与することができる。例えば、カプセル剤または錠剤の投与は、複数のカプセル剤または錠剤の投与を含む。いくつかの場合では、第１の時点及び第２の時点で、本明細書に記載の組成物を投与することができる。いくつかの実施形態では、約１時間、約２時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約１日、約２日、約４日、約７日、約２週間、約４週間、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年以上の投与の時間差で、第１の投与をもう１つの投与前に投与することができるような、組成物を投与することができる。
投与
投与は、本明細書に記載の医薬組成物（例えば、改変ポリヌクレオチド）を所望の生物学的作用の部位に送達することができるようにするために使用することができる方法を指し得る。例えば、改変ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ構築物、ウイルスベクター、またはその両方に含まれ、静脈内投与により投与され得る。例えば、限定するものではないが、経口投与、局所投与、静脈内投与、吸入投与、またはそれらの任意の組み合わせにより、処置または治療を必要とする領域への本明細書に開示の投与を達成することができる。いくつかの実施形態では、送達は、吸入、耳、頬、結膜、歯、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、経腸、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊膜内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、仙骨内、海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠動脈内、体内海綿体、皮内、椎間板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、鼻腔内、脊髄内、滑膜内、腱内、精巣内、胸腔内、尿細管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口咽頭、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯根膜、経直腸、眼球後、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、髄腔内、脳室内、定位、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、筋肉内、血管内、または注入を含む）、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与、またはそれらの組み合わせを含み得る。送達は、身体の罹患組織または領域への直接適用を含み得る。いくつかの場合では、局所投与は、皮膚などの表面の外面に、ローション剤、液剤、エマルション、クリーム剤、バーム、オイル、ペースト、スティック、エアゾール剤、フォーム剤、ゼリー剤、フォーム剤、マスク、パッド、散剤、固形剤、チンキ剤、バター、パッチ、ジェル剤、スプレー、点滴、液体製剤、軟膏を投与することを含み得る。送達は、実質注射、髄腔内注射、脳室内注射、または大槽内注射を含み得る。本明細書で提供される組成物を、任意の方法で投与することができる。投与方法は、動脈内注射、大槽内注射、筋肉内注射、実質内注射、腹腔内注射、脊髄内注射、髄腔内注射、静脈内注射、脳室内注射、定位注射、皮下注射、硬膜外注射、またはそれらの任意の組み合わせによるものであり得る。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、筋肉内、血管内、または注入投与を含む）を含み得る。いくつかの実施形態では、送達は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、細胞外小胞、インプラント、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、送達は、デバイスからのものであり得る。いくつかの場合では、送達は、ポンプ、注入ポンプ、またはそれらの組み合わせにより投与することができる。いくつかの実施形態では、送達は、浣腸、点眼薬、点鼻薬、またはそれらの任意の組み合わせによるものであり得る。いくつかの場合では、対象は、管理なしで組成物を投与し得る。いくつかの場合では、対象は、医療専門家（例えば、医師、看護士、医師の助手、看護助手、ホスピス職員など）の管理下で組成物を投与し得る。いくつかの実施形態では、医療専門家が、組成物を投与し得る。
投与は、本明細書に記載の医薬組成物（例えば、改変ポリヌクレオチド）を所望の生物学的作用の部位に送達することができるようにするために使用することができる方法を指し得る。例えば、改変ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ構築物、ウイルスベクター、またはその両方に含まれ、静脈内投与により投与され得る。例えば、限定するものではないが、経口投与、局所投与、静脈内投与、吸入投与、またはそれらの任意の組み合わせにより、処置または治療を必要とする領域への本明細書に開示の投与を達成することができる。いくつかの実施形態では、送達は、吸入、耳、頬、結膜、歯、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、経腸、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊膜内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、仙骨内、海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠動脈内、体内海綿体、皮内、椎間板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、鼻腔内、脊髄内、滑膜内、腱内、精巣内、胸腔内、尿細管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口咽頭、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯根膜、経直腸、眼球後、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、髄腔内、脳室内、定位、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、筋肉内、血管内、または注入を含む）、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与、またはそれらの組み合わせを含み得る。送達は、身体の罹患組織または領域への直接適用を含み得る。いくつかの場合では、局所投与は、皮膚などの表面の外面に、ローション剤、液剤、エマルション、クリーム剤、バーム、オイル、ペースト、スティック、エアゾール剤、フォーム剤、ゼリー剤、フォーム剤、マスク、パッド、散剤、固形剤、チンキ剤、バター、パッチ、ジェル剤、スプレー、点滴、液体製剤、軟膏を投与することを含み得る。送達は、実質注射、髄腔内注射、脳室内注射、または大槽内注射を含み得る。本明細書で提供される組成物を、任意の方法で投与することができる。投与方法は、動脈内注射、大槽内注射、筋肉内注射、実質内注射、腹腔内注射、脊髄内注射、髄腔内注射、静脈内注射、脳室内注射、定位注射、皮下注射、硬膜外注射、またはそれらの任意の組み合わせによるものであり得る。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、筋肉内、血管内、または注入投与を含む）を含み得る。いくつかの実施形態では、送達は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、細胞外小胞、インプラント、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、送達は、デバイスからのものであり得る。いくつかの場合では、送達は、ポンプ、注入ポンプ、またはそれらの組み合わせにより投与することができる。いくつかの実施形態では、送達は、浣腸、点眼薬、点鼻薬、またはそれらの任意の組み合わせによるものであり得る。いくつかの場合では、対象は、管理なしで組成物を投与し得る。いくつかの場合では、対象は、医療専門家（例えば、医師、看護士、医師の助手、看護助手、ホスピス職員など）の管理下で組成物を投与し得る。いくつかの実施形態では、医療専門家が、組成物を投与し得る。
いくつかの場合では、投与は、経口摂取であり得る。いくつかの場合では、送達は、カプセル剤または錠剤であり得る。経口摂取送達は、茶、エリキシル、食品、ドリンク、飲料、シロップ剤、液剤、ジェル剤、カプセル剤、錠剤、油、チンキ剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、食品は、医療食品であり得る。いくつかの場合では、カプセル剤は、ヒドロキシメチルセルロースを含み得る。いくつかの実施形態では、カプセル剤は、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、カプセル剤は、コーティング、例えば、腸溶性コーティングを含み得る。いくつかの実施形態では、カプセル剤は、ベジタリアン製品またはビーガン製品、例えば、ヒプロメロースカプセル剤を含み得る。いくつかの実施形態では、送達は、吸入器、拡散器、ネブライザー、気化器、またはそれらの組み合わせによる吸入を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるものは、本明細書に開示の組成物を、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することを含む方法であり得る。いくつかの場合では、方法は、対象の疾患を処置または予防し得る。
疾患の適用及び標的
本明細書に記載されるように、対象の疾患または状態を処置するために、改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化された改変ポリヌクレオチド）または細胞内で環状化可能な前駆改変ポリヌクレオチド（例えば、前駆改変線状ポリヌクレオチド）を使用することができる。疾患または状態は、神経変性疾患、筋肉障害、代謝障害、眼障害（例えば、眼疾患）、がん、肝疾患（α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。疾患または状態は、嚢胞性線維症、白皮症、α１－アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－地中海貧血、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫症、ポリープ症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘマトクロマトーシス（Ｈｅｍａｔｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型及びＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連癌、パーキンソン病、ポイツ・ジェガーズ症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病、プロトロンビン変異関連障害、例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、タウオパチー、シヌクレイノパチー、重度複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、各種癌（例えば、ＢＲＣＡ１及び２関連乳癌及び卵巣癌）を含み得る。いくつかの場合では、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）などの疾患または状態の処置は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、タウ、α－シヌクレイン、またはそれらの任意の組み合わせの編集、ノックダウン、またはその両方を生じさせることを含み得る。いくつかの場合では、ＡＰＰ、タウ、及びα－シヌクレインは、病原性バリアントを含み得る。いくつかの場合では、ＡＰＰは、病原性バリアント、例えば、Ａ６７３Ｖ変異またはＡ６７３Ｔ変異を含み得る。いくつかの場合では、神経変性疾患（パーキンソン病）などの疾患または状態の処置は、ＬＲＲＫ２の病原性バリアントの編集、ノックダウン、またはその両方を生じさせることを含み得る。いくつかの場合では、ＬＲＲＫの病原性バリアントは、Ｇ２０１９Ｓ変異を含み得る。疾患または状態は、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、網膜色素変性症、乳癌、卵巣癌、アルツハイマー病、疼痛、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、レット症候群、タウオパチー、シヌクレイノパチー、またはその任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、Ｒｅｔｔ患者のミスセンス変異を修正し得る（例えば、Ｔｒｐをコードするように、終止コドンを変異させる）。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、パーキンソン病患者において、ミスセンス変異を修正するか、または、ノックダウンを誘導し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、アルツハイマー病患者に変異を誘導し得、これは、ＡＰＰの切断部位でのタンパク質の切断を減少させ得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、筋ジストロフィー患者にエクソンスキッピングを引き起こし得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、テイ・サックス病患者のＨｅｘＡの変異を修正し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、テイ・サックス病患者のＨｅｘＡの変異を修正し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ＡＡＴ欠損症患者の変異を修正し得る（例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１を編集する）。いくつかの場合では、組成物の投与は、（ａ）投与前の遺伝子の発現と比較して遺伝子の発現を減少させる、（ｂ）対象、例えば、それを必要とする対象の少なくとも１つの点変異を編集する、（ｃ）対象の少なくとも１つの終止コドンを編集して、終止コドンのリードスルーを生じさせる、（ｄ）対象にエクソンスキップを生じさせる、または、（ｅ）その任意の組み合わせのために十分であり得る。疾患または状態は、筋ジストロフィーを含み得る。筋ジストロフィーは、筋強直性、デュシェンヌ型、ベッカー型、四肢帯型、顔面肩甲上腕型、先天性、眼球咽頭型、遠位型、エメリー・ドレイフス型、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。疾患または状態は、疼痛、例えば、慢性疼痛を含み得る。疼痛は、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、またはそれらの組み合わせを含み得る。侵害受容性疼痛は、内臓痛、体性痛、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の疾患または状態、及び関連標的は、以下で参照される。
本明細書に記載されるように、対象の疾患または状態を処置するために、改変ポリヌクレオチド（例えば、環状化された改変ポリヌクレオチド）または細胞内で環状化可能な前駆改変ポリヌクレオチド（例えば、前駆改変線状ポリヌクレオチド）を使用することができる。疾患または状態は、神経変性疾患、筋肉障害、代謝障害、眼障害（例えば、眼疾患）、がん、肝疾患（α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。疾患または状態は、嚢胞性線維症、白皮症、α１－アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－地中海貧血、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫症、ポリープ症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘマトクロマトーシス（Ｈｅｍａｔｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型及びＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連癌、パーキンソン病、ポイツ・ジェガーズ症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病、プロトロンビン変異関連障害、例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、タウオパチー、シヌクレイノパチー、重度複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、各種癌（例えば、ＢＲＣＡ１及び２関連乳癌及び卵巣癌）を含み得る。いくつかの場合では、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）などの疾患または状態の処置は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、タウ、α－シヌクレイン、またはそれらの任意の組み合わせの編集、ノックダウン、またはその両方を生じさせることを含み得る。いくつかの場合では、ＡＰＰ、タウ、及びα－シヌクレインは、病原性バリアントを含み得る。いくつかの場合では、ＡＰＰは、病原性バリアント、例えば、Ａ６７３Ｖ変異またはＡ６７３Ｔ変異を含み得る。いくつかの場合では、神経変性疾患（パーキンソン病）などの疾患または状態の処置は、ＬＲＲＫ２の病原性バリアントの編集、ノックダウン、またはその両方を生じさせることを含み得る。いくつかの場合では、ＬＲＲＫの病原性バリアントは、Ｇ２０１９Ｓ変異を含み得る。疾患または状態は、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、網膜色素変性症、乳癌、卵巣癌、アルツハイマー病、疼痛、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、レット症候群、タウオパチー、シヌクレイノパチー、またはその任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、Ｒｅｔｔ患者のミスセンス変異を修正し得る（例えば、Ｔｒｐをコードするように、終止コドンを変異させる）。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、パーキンソン病患者において、ミスセンス変異を修正するか、または、ノックダウンを誘導し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、アルツハイマー病患者に変異を誘導し得、これは、ＡＰＰの切断部位でのタンパク質の切断を減少させ得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、筋ジストロフィー患者にエクソンスキッピングを引き起こし得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、テイ・サックス病患者のＨｅｘＡの変異を修正し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、テイ・サックス病患者のＨｅｘＡの変異を修正し得る。いくつかの場合では、改変ポリヌクレオチドは、ＡＡＴ欠損症患者の変異を修正し得る（例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１を編集する）。いくつかの場合では、組成物の投与は、（ａ）投与前の遺伝子の発現と比較して遺伝子の発現を減少させる、（ｂ）対象、例えば、それを必要とする対象の少なくとも１つの点変異を編集する、（ｃ）対象の少なくとも１つの終止コドンを編集して、終止コドンのリードスルーを生じさせる、（ｄ）対象にエクソンスキップを生じさせる、または、（ｅ）その任意の組み合わせのために十分であり得る。疾患または状態は、筋ジストロフィーを含み得る。筋ジストロフィーは、筋強直性、デュシェンヌ型、ベッカー型、四肢帯型、顔面肩甲上腕型、先天性、眼球咽頭型、遠位型、エメリー・ドレイフス型、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。疾患または状態は、疼痛、例えば、慢性疼痛を含み得る。疼痛は、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、またはそれらの組み合わせを含み得る。侵害受容性疼痛は、内臓痛、体性痛、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の疾患または状態、及び関連標的は、以下で参照される。
ＡＰＰ。いくつかの実施形態では、本開示は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＲＮＡ編集を促進可能な環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の組成物及びその使用方法を提供する。例えば、環状化された改変ポリヌクレオチドは、ＡＰＰの切断部位の編集を促進し得、従って、β／γセクレターゼは、ＡＰＰの切断の低減を示すか、または、ＡＰＰを切断できなくなり、従って、Ａβ４０／４２のレベルの低減が生じるか、またはＡβが生じないようにすることができる。いくつかの実施形態では、本開示の環状化された改変ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集のためにＡＰＰ内の以下の部位のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを標的とし得る：Ｋ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ａ６７３Ｖ、Ａ６７３Ｔ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、もしくはＫ６８７Ｇ、Ｉ７１２Ｘ、またはＴ７１４Ｘ。本開示の改変ポリヌクレオチド構築物（例えば、前駆ポリヌクレオチド）に、ＡＰＰ中の部位を標的とする該環状化された改変ポリヌクレオチドをコードすることができる。ＡＰＰ遺伝子を標的とする環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の配列は、配列番号６１、配列番号６２、または配列番号６３と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する標的化ドメインを含んでもよい。該環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、本明細書に開示のウイルスベクターを介して送達されてもよく（例えば、ＡＡＶのためにコードされ、ＡＡＶを介して送達される）、それを必要とする対象に、本明細書に開示の任意の投与経路を介して投与されてもよい。対象は、ヒトであってよく、アルツハイマー病を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。対象は、ヒトであってよく、ＡＰＰが疾患の病理に影響を与える神経疾患を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。従って、環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、神経疾患（例えば、アルツハイマー病）の処置方法に使用され得る。
ＡＢＣＡ４。いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）のＲＮＡ編集を促進可能な環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の組成物及びその使用方法を提供する。例えば、環状化された改変ポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ４遺伝子のヌクレオチド位置６３２０でＧをＡで；ＡＢＣＡ４遺伝子のヌクレオチド位置５７１４でＧをＡで；及び／またはＡＢＣＡ４遺伝子のヌクレオチド位置５７１４でＧをＡで修正することを促進し得る。本開示の改変ポリヌクレオチド構築物（例えば、前駆ポリヌクレオチド）に、ＡＢＣＡ４中の部位を標的とする該環状化された改変ポリヌクレオチドをコードすることができる。ＡＢＣＡ４遺伝子を標的とする環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の配列は、配列番号５８、配列番号５９、または配列番号６０のいずれか１つと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する標的化ドメインを含んでもよい。該環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、本明細書に開示のウイルスベクターを介して送達されてもよく（例えば、ＡＡＶのためにコードされ、ＡＡＶを介して送達される）、それを必要とする対象に、本明細書に開示の任意の投与経路を介して投与されてもよい。対象は、ヒトであってよく、シュタルガルト黄斑変性症を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。そのようなシュタルガルト黄斑変性症は、ＡＢＣＡ４の変異により少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド配列は、編集を促進し得、これにより、対象におけるＡＢＣＡ４の変異が修正され、シュタルガルト黄斑変性症の発生率が低減する。従って、環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、シュタルガルト黄斑変性症の処置方法に使用され得る。
α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）。α－シヌクレイン遺伝子は、５つのエクソンで構成され、推定分子量が約１４．５ｋＤａの１４０アミノ酸のタンパク質をコードする。コードされた産物は、未知の機能を有する本質的に無秩序なタンパク質である。通常、α－シヌクレインは、モノマーである。特定のストレス条件下または他の未知の原因で、α－シヌクレインは、自己凝集してオリゴマーになる。剖検で確認されたアルツハイマー病患者の脳の５０％以上では、レビー関連病理（ＬＲＰ）は、主に、α－シヌクレインで構成される。α－シヌクレインがアルツハイマー病の発症にどのように影響するかの分子的機序は不明であるが、実験的証拠は、α－シヌクレインがタウ－ｐと相互作用し、タウ－ｐの細胞内凝集を引き起こし得ることを示す。さらに、α－シヌクレインは、タウ過剰リン酸化を媒介し得るＧＳＫ３βの活性を調節し得る。α－シヌクレインは、自己集合して、病原性凝集体（レビー小体）になることもできる。タウ及びα－シヌクレインの両方は、細胞外空間に放出され、他の細胞に拡散し得る。血管の異常は、栄養素の供給及び代謝副産物の除去を弱め、微小梗塞を引き起こし、グリア細胞の活性化を促進する。従って、タウ形成、α－シヌクレイン形成、またはそれらの組み合わせを大幅に低減させる多重の方策は、神経変性疾患を効果的に処置する上で重要である可能性がある。
α－シヌクレインのドメイン構造は、Ｎ末端のＡ２脂質結合αヘリックスドメイン、非アミロイドβ成分（ＮＡＣ）ドメイン、及びＣ末端の酸性ドメインを含む。脂質結合ドメインは、５つのＫＸＫＥＧＶ不完全リピートで構成される。ＮＡＣドメインは、ＶＧＧＡＶＶＴＧＶコンセンサス配列及び３つのＧＸＸＸサブモチーフを有するＧＡＶモチーフで構成され、Ｘは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔのいずれかである。Ｃ末端の酸性ドメインは、ＤＰＤＮＥＡコンセンサス配列を有する銅結合モチーフを含有する。分子的には、α－シヌクレインは、神経細胞の伝達及びＤＮＡ修復に関与していることが示唆される。
いくつかの場合では、本明細書で提供される組成物を利用して、α－シヌクレインの領域を標的とすることができる。いくつかの場合では、ノックダウンのために、本明細書に開示する改変ポリヌクレオチドで、α－シヌクレインｍＲＮＡの領域を標的とすることができる。いくつかの場合では、α－シヌクレインｍＲＮＡのエクソンまたはイントロンの領域を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲなどのα－シヌクレインｍＲＮＡの非コード配列の領域を標的とすることができる。他の場合では、α－シヌクレインｍＲＮＡのコード配列の領域を標的とすることができる。好適な領域としては、Ｎ末端のＡ２脂質結合αヘリックスドメイン、非アミロイドβ成分（ＮＡＣ）ドメイン、またはＣ末端の酸性ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、α－シヌクレインｍＲＮＡ配列が標的とされる。いくつかの場合では、本明細書で提供される組成物及び方法を利用して、配列の３，１７７残基のいずれか１つが標的とされ得る。いくつかの場合では、標的残基は、残基１～１００、１０１～２００、２０１～３００、３０１～４００、４０１～５００、５０１～６００、６０１～７００、７０１～８００、８０１～９００、９０１～１０００、１００１～１１００、１１０１～１２００、１２０１～１３００、１３０１～１４００、１４０１～１５００、１５０１～１６００、１６０１～１７００、１７０１～１８００、１８０１～１９００、１９０１～２０００、２００１～２１００、２１０１～２２００、２２０１～２３００、２３０１～２４００、２４０１～２５００、２５０１～２６００、２６０１～２７００、２７０１～２８００、２８０１～２９００、２９０１～３０００、３００１～３１００、及び／または３１０１～３１７７に配置され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＮＣＡのＲＮＡ編集を促進可能な環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の組成物及びその使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、環状化された改変ポリヌクレオチドは、例えば、ＳＮＣＡ遺伝子の３’ＵＴＲでの編集を促進することにより、ＳＮＣＡの発現をノックダウンし得る。本開示の改変ポリヌクレオチド構築物に、ＳＮＣＡ中の部位を標的とする該環状化された改変ポリヌクレオチドをコードすることができる。ＳＮＣＡ遺伝子を標的とする環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の配列は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４のいずれか１つと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する標的化ドメインを含んでもよい。該環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、本明細書に開示のウイルスベクターを介して送達されてもよく（例えば、ＡＡＶのためにコードされ、ＡＡＶを介して送達される）、それを必要とする対象に、本明細書に開示の任意の投与経路を介して投与されてもよい。対象は、ヒトであってよく、アルツハイマー病またはパーキンソン病を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。対象は、ヒトであってよく、ＳＮＣＡの過剰発現が疾患の病理に影響を与える神経疾患を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。従って、環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、神経疾患（例えば、アルツハイマー病）の処置方法に使用され得る。
ＳＥＲＰＩＮＡ１。いくつかの実施形態では、本開示は、セルピンファミリーＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）のＲＮＡ編集を促進可能な環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の組成物及びその使用方法を提供する。例えば、環状化された改変ポリヌクレオチドは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のヌクレオチド位置９９８９でのＧからＡへの変異の修正を促進し得る。いくつかの実施形態では、環状化された改変ポリヌクレオチドは、例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＥ３４２を標的とし得る。本開示の改変ポリヌクレオチド構築物（例えば、改変前駆ポリヌクレオチド）に、ＳＥＲＰＩＮＡ１中の部位を標的とする該環状化された改変ポリヌクレオチドをコードすることができる。ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とするように構成された環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の配列は、配列番号６４または配列番号６５と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する標的化ドメインを含んでもよい。該環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、本明細書に開示のウイルスベクターを介して送達されてもよく（例えば、ＡＡＶのためにコードされ、ＡＡＶを介して送達される）、それを必要とする対象に、本明細書に開示の任意の投与経路を介して投与されてもよい。対象は、ヒトであってよく、α１－アンチトリプシン欠損症を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。そのようなα１－アンチトリプシン欠損症は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異により少なくとも部分的に引き起こされ得、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１の編集、それによる、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異の修正、及び対象のα１－アンチトリプシン欠損症の発病率の低減を促進し得る。従って、環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、α－１アンチトリプシン欠損症の処置方法に使用され得る。
ＬＲＲＫ２。ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）は、パーキンソン病及びクローン病などの免疫関連障害の家族性及び散発性の症例と関連している。そのエイリアスは、ＬＲＲＫ２、ＡＵＲＡ１７、ＤＡＲＤＡＲＩＮ、ＰＡＲＫ８、ＲＩＰＫ７、ＲＯＣＯ２、またはロイシンリッチリピートキナーゼ２を含む。ＬＲＲＫ２遺伝子は、５１のエクソンで構成され、推定分子量が約２８６ｋＤａの２５２７アミノ酸のタンパク質をコードする。コードされた産物は、キナーゼ及びＧＴＰａｓｅ活性を有するマルチドメインタンパク質である。限定されないが、副腎、虫垂、骨髄、脳、結腸、十二指腸、子宮内膜、食道、脂肪、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、甲状腺、及び膀胱を含む様々な組織及び器官に、ＬＲＲＫ２を見出すことができる。ＬＲＲＫ２は遍在的に発現されるが、一般には、脳、腎臓、及び肺組織で、より豊富である。細胞的には、ＬＲＲＫ２は、星状細胞、内皮細胞、ミクログリア、ニューロン、及び末梢免疫細胞で見出されている。
ＬＲＲＫ２には１００以上の変異が確認されており；それらのうちの６つ（Ｇ２０１９Ｓ、Ｒ１４４１Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｙ１６９９Ｃ、及びＩ２０２０Ｔ）は、分離比分析によりパーキンソン病を引き起こすことが示されている。Ｇ２０１９Ｓ及びＲ１４４１Ｃは、遺伝性の症例で最も一般的な疾患を引き起こす変異である。散発的な症例では、これらの変異は、年齢に依存した浸透率を示しており、年齢が５０から７０歳に上がると、疾患を発症するＧ２０１９Ｓ変異を含有する個体の割合が１７％から８５％に跳ね上がる。いくつかの場合では、変異含有個体が、疾患を発症することはない。
ＬＲＲＫ２の触媒コアは、複合タンパク質のＲａｓ（Ｒｏｃ）、ＲＯＣのＣ末端（ＣＯＲ）、及びキナーゼドメインを含有する。複数のタンパク質間相互作用ドメインが、このコアに隣接する：アルマジロリピート（ＡＲＭ）領域、アンキリンリピート（ＡＮＫ）領域、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインがＮ末端に見られ、Ｃ末端ＷＤ４０ドメインが結合している。Ｇ２０１９Ｓ変異は、キナーゼドメイン内にある。キナーゼ活性を高めることが示されており、Ｒ１４４１Ｃ／Ｇ／Ｈ及びＹ１６９９Ｃでは、これらの変異は、ＲｏｃドメインのＧＴＰａｓｅ活性を低減させ得る。ゲノム全体の関連研究は、ＬＲＲＫ２の共通したバリエーションが散発性パーキンソン病の発症リスクを増加させることが判明している。これらのバリエーションのいくつかは、タンパク質の結合または触媒活性に影響を与える非保存的変異であるが、他の変異は、その発現を調節する。特定の対立遺伝子またはハプロタイプが、ＬＲＲＫ２発現を調節し得ることを、これらの結果は示唆する。
前炎症性シグナルは、様々な免疫細胞タイプでＬＲＲＫ２発現を上方調節し、これは、ＬＲＲＫ２が免疫応答における重要な調節因子であることを示唆する。全身性及び中枢神経系（ＣＮＳ）炎症の両方がパーキンソン病の症状に関与することが、研究により判明している。さらに、パーキンソン病に関連するＬＲＲＫ２変異は、炎症性刺激に応答して発現レベルを調節する。ＬＲＲＫ２の多くの変異は、免疫関連障害、例えば、炎症性腸疾患、例えば、クローン病に関連する。例えば、Ｇ２０１９Ｓ及びＮ２０８１Ｄの両方が、ＬＲＲＫ２のキナーゼ活性を増加させ、特定の集団のクローン病患者で過剰に見られる。これらの障害における重要な役割のために、ＬＲＲＫ２は、パーキンソン病及びクローン病の重要な治療標的である。特に、Ｇ２０１９Ｓを含む点変異などの多くの変異が、これらの疾患の発症に関与しており、これにより、ＬＲＲＫ２がＲＮＡ編集などの治療方策にとって魅力的なものとなっている。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＲＲＫ２のＲＮＡ編集を促進可能な環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の組成物及びその使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、環状化された改変ポリヌクレオチドは、ＬＲＲＫ２における以下の変異を標的とし得る：Ｅ１０Ｌ、Ａ３０Ｐ、Ｓ５２Ｆ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｌ１１９Ｐ、Ａ２１１Ｖ、Ｃ２２８Ｓ、Ｅ３３４Ｋ、Ｎ３６３Ｓ、Ｖ３６６Ｍ、Ａ４１９Ｖ、Ｒ５０６Ｑ、Ｎ５４４Ｅ、Ｎ５５１Ｋ、Ａ７１６Ｖ、Ｍ７１２Ｖ、Ｉ７２３Ｖ、Ｐ７５５Ｌ、Ｒ７９３Ｍ、Ｉ８１０Ｖ、Ｋ８７１Ｅ、Ｑ９２３Ｈ、Ｑ９３０Ｒ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｑ１１１１Ｈ、Ｉ１１２２Ｖ、Ａ１１５１Ｔ、Ｌ１１６５Ｐ、Ｉ１１９２Ｖ、Ｈ１２１６Ｒ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｐ１２６２Ａ、Ｒ１３２５Ｑ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１３９８Ｈ、Ｔ１４１０Ｍ、Ｄ１４２０Ｎ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｐ１４４６Ｌ、Ｖ１４５０Ｉ、Ｋ１４６８Ｅ、Ｒ１４８３Ｑ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｐ１５４２Ｓ、Ｖ１６１３Ａ、Ｒ１６２８Ｐ、Ｍ１６４６Ｔ、Ｓ１６４７Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１７２８Ｈ、Ｒ１７２８Ｌ、Ｌ１７９５Ｆ、Ｍ１８６９Ｖ、Ｍ１８６９Ｔ、Ｌ１８７０Ｆ、Ｅ１８７４Ｘ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｙ２００６Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｇ２０１９Ｓ、Ｉ２０２０Ｔ、Ｔ２０３１Ｓ、Ｎ２０８１Ｄ、Ｔ２１４１Ｍ、Ｒ２１４３Ｈ、Ｙ２１８９Ｃ、Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ、Ｖ２３９０Ｍ、Ｅ２３９５Ｋ、Ｍ２３９７Ｔ、Ｌ２４６６Ｈ、またはＱ２４９０ＮｆｓＸ３。本開示の改変ポリヌクレオチド構築物（例えば、前駆改変ポリヌクレオチド）に、ＬＲＲＫ２中の部位を標的とする該環状化された改変ポリヌクレオチドをコードすることができる。ＬＲＲＫ２を標的とするように構成された環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の配列は、配列番号３９、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する標的化ドメインを含んでもよい。該環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、本明細書に開示のウイルスベクターを介して送達されてもよく（例えば、ＡＡＶのためにコードされ、ＡＡＶを介して送達される）、それを必要とする対象に、本明細書に開示の任意の投与経路を介して投与されてもよい。対象は、ヒトであってよく、ＬＲＲＫ２の変異と関連する疾患または状態（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）または胃腸（ＧＩ）管の疾患）を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。例えば、そのような状態の疾患は、クローン病またはパーキンソン病を含み得る。そのようなＣＮＳまたはＧＩ管疾患（例えば、クローン病またはパーキンソン病）は、ＬＲＲＫ２の変異により少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド配列は、編集を促進し得、それにより、対象におけるＬＲＲＫ２の変異が修正され、ＣＮＳまたはＧＩ管疾患の発病率が低減される。従って、環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、クローン病またはパーキンソン病などの疾患の処置方法に使用され得る。
ＤＭＤ。いくつかの実施形態では、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子のＲＮＡ編集を促進可能な環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の組成物及びその使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、環状化された改変ポリヌクレオチドは、ＤＭＤ遺伝子のエクソン、例えば、少なくとも部分的にジストロフィンタンパク質をコードするＤＭＤ遺伝子プレｍＲＮＡのエクソン５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、６、７、８、５５、２、１１、１７、１９、２１、５７、５９、６２、６３、６５、６６、６９、７４、及び／または７５、を標的とし得る。本開示の改変ポリヌクレオチド構築物（例えば、前駆改変ポリヌクレオチド）に、ＤＭＤ遺伝子中の部位を標的とする該環状化された改変ポリヌクレオチドをコードすることができる。ＤＭＤを標的とするように構成された環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の配列は、配列番号５６または配列番号５７と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する標的化ドメインを含んでもよい。該環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、本明細書に開示のウイルスベクターを介して送達されてもよく（例えば、ＡＡＶのためにコードされ、ＡＡＶを介して送達される）、それを必要とする対象に、本明細書に開示の任意の投与経路を介して投与されてもよい。対象は、ヒトであってよく、ＤＭＤなどのＤＭＤ遺伝子の変異と関連する疾患または状態を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子の変異により少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド配列は、編集を促進し、それにより、対象におけるＤＭＤ遺伝子の変異を修正し、ＤＭＤの発病率が低減され得る。従って、環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、ＤＭＤなどの疾患の処置方法に使用され得る。
ＴＵＢＢ４Ａ。いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子のＲＮＡ編集を促進可能な環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の組成物及びその使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、環状化された改変ポリヌクレオチドは、７４５Ｇ＞Ａヌクレオチド変異により引き起こされ得るＴＵＢＢ４Ａ中のＤ２４９Ｎ変異を標的とし得る。本開示の改変ポリヌクレオチド構築物（例えば、前駆改変ポリヌクレオチド）に、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子中の部位を標的とする該環状化された改変ポリヌクレオチドをコードすることができる。ＴＵＢＢ４Ａを標的とするように構成された環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）の配列は、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する標的化ドメインを含んでもよい。該環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、本明細書に開示のウイルスベクターを介して送達されてもよく（例えば、ＡＡＶのためにコードされ、ＡＡＶを介して送達される）、それを必要とする対象に、本明細書に開示の任意の投与経路を介して投与されてもよい。対象は、ヒトであってよく、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の変異と関連する疾患または状態、例えば、大脳基底核及び小脳萎縮を伴う髄鞘形成不全症（Ｈ－ＡＢＣ）を発症するリスクがあり得るか、またはそれを発症している。Ｈ－ＡＢＣは、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の変異により少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチド配列は、編集を促進し、それにより、対象におけるＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の変異が修正され、Ｈ－ＡＢＣの発病率が低減され得る。従って、環状化された改変ポリヌクレオチド（または細胞内で環状化するように構成された前駆改変ポリヌクレオチド）は、Ｈ－ＡＢＣなどの疾患の処置方法に使用され得る。
番号付きの実施形態
多数の組成物及び方法が、本明細書に開示される。これらの組成物及び方法の特定の例示的な実施形態が以下に開示がされる。以下の実施形態は、本明細書に開示の特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も考えられる。特に、これらの番号付けされた実施形態のそれぞれは、列挙された順序とは無関係に、前または後の全ての番号付けされた実施形態に依存するか、または関連すると考えられる。
多数の組成物及び方法が、本明細書に開示される。これらの組成物及び方法の特定の例示的な実施形態が以下に開示がされる。以下の実施形態は、本明細書に開示の特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も考えられる。特に、これらの番号付けされた実施形態のそれぞれは、列挙された順序とは無関係に、前または後の全ての番号付けされた実施形態に依存するか、または関連すると考えられる。
実施形態１。改変ポリヌクレオチドであって、
ａ）標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である標的化ドメイン；及び
ｂ）スペーサードメイン、
を含み、
スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、
（ｉ）改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含まないか、
（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドが、一緒に共有結合している複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含むか、
（ｉｉｉ）改変ポリヌクレオチドが、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含む同等の線状ポリヌクレオチドよりも加水分解を受けにくいか、
（ｉｖ）改変ポリヌクレオチドが、ヒト細胞内で、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含む他の点で同等の線状ポリヌクレオチドよりも長い半減期を含むか、
（ｖ）改変ポリヌクレオチドが、環状であるか、または
（ｖｉ）ｉ～ｖの任意の組み合わせである、
改変ポリヌクレオチド。
ａ）標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である標的化ドメイン；及び
ｂ）スペーサードメイン、
を含み、
スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、
（ｉ）改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含まないか、
（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドが、一緒に共有結合している複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含むか、
（ｉｉｉ）改変ポリヌクレオチドが、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含む同等の線状ポリヌクレオチドよりも加水分解を受けにくいか、
（ｉｖ）改変ポリヌクレオチドが、ヒト細胞内で、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含む他の点で同等の線状ポリヌクレオチドよりも長い半減期を含むか、
（ｖ）改変ポリヌクレオチドが、環状であるか、または
（ｖｉ）ｉ～ｖの任意の組み合わせである、
改変ポリヌクレオチド。
実施形態２。標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに結合しないように構成される、実施形態１の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３。標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインが、標的化ドメインから少なくとも１ヌクレオチド離れており、スペーサードメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインの結合が、スペーサードメインに結合する標的ＲＮＡの部分で標的ＲＮＡの編集を生じない、実施形態１または２の改変ポリヌクレオチド。
実施形態４。スペーサードメインが、標的化ドメインの５’末端または３’末端に隣接する場合、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに相補的ではない、実施形態１～３のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態５。改変ポリヌクレオチドであって、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である標的化ドメイン、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン、及びスペーサードメインを含み、スペーサーが、ポリヌクレオチドを含み、スペーサーポリヌクレオチドが、標的化ドメイン内に位置せず、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン内に位置せず、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡法（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、
（ｉ）改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含まないか、
（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドが、一緒に共有結合している複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含むか、
（ｉｉｉ）改変ポリヌクレオチドが、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含む同等の線状ポリヌクレオチドよりも加水分解を受けにくいか、
（ｉｖ）改変ポリヌクレオチドが、ヒト細胞内で、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含む他の点で同等の線状ポリヌクレオチドよりも長い半減期を含むか、
（ｖ）改変ポリヌクレオチドが、環状であるか、または
（ｖｉ）ｉ～ｖの任意の組み合わせである、
改変ポリヌクレオチド。
（ｉ）改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含まないか、
（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドが、一緒に共有結合している複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含むか、
（ｉｉｉ）改変ポリヌクレオチドが、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含む同等の線状ポリヌクレオチドよりも加水分解を受けにくいか、
（ｉｖ）改変ポリヌクレオチドが、ヒト細胞内で、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、もしくはその両方を含む他の点で同等の線状ポリヌクレオチドよりも長い半減期を含むか、
（ｖ）改変ポリヌクレオチドが、環状であるか、または
（ｖｉ）ｉ～ｖの任意の組み合わせである、
改変ポリヌクレオチド。
実施形態６。スペーサードメインが、標的ＲＮＡへの少なくとも部分的な結合を促進する立体配座をとる改変ＲＮＡを促進するように構成される、実施形態１～５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態７。改変ポリヌクレオチドまたはスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触させた後に、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの結合特異性と比較して、複数の他のＲＮＡの中で、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合特異性（標的ＲＮＡ及び複数の他のＲＮＡのシーケンシングで決定）の増加を促進するように、スペーサードメインが構成される、実施形態６の改変ポリヌクレオチド。
実施形態８。改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のエントロピー（ΔＳ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）が、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドと比較して低くなるように、スペーサードメインが構成される、実施形態１～７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態９。改変ポリヌクレオチドまたはスペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドと接触させた後に、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの編集効率と比較して、標的ＲＮＡに対する改変ポリヌクレオチドの編集効率（標的ＲＮＡのシーケンシングで決定）を少なくとも維持するように、スペーサードメインが構成される、実施形態１～８の改変ポリヌクレオチド。
実施形態１０。少なくとも維持することが、増加を含む、実施形態９の改変ポリヌクレオチド。
実施形態１１。改変ポリヌクレオチドが、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含む他の点で同等のポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡに対する編集効率が少なくとも約９０％増加しており、（ｉ）標的ＲＮＡを細胞株２９３Ｔにトランスフェクトすること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチド、及び５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含む他の点で同等の改変ポリヌクレオチドを細胞株２９３Ｔにトランスフェクトすること、ならびに、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、により編集効率を決定する、実施形態１の改変ガイド。
実施形態１２。主鎖が、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドの各ヌクレオチドが、ヌクレオチドの糖の３’及び５’炭素に共有結合している２つの異なるリン含有基内で、２つの異なるリン－酸素結合により、２つの隣接ヌクレオチドに直接結合している、実施形態１～１１のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態１３。サブセクションに含まれるヌクレオチドの少なくともいくつかの糖が、２’ヒドロキシル基を含有する、実施形態１２の改変ポリヌクレオチド。
実施形態１４。スペーサードメインが、約１ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド長の配列長を有する、実施形態１～１３のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態１５。スペーサードメインのヌクレオチドの少なくとも約８０％が、標的ＲＮＡに非相補的である、実施形態１～１４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態１６。標的化ドメインが、約２０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド長の配列長を有する、実施形態１～１５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態１７。標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の改変ポリヌクレオチド。
実施形態１８。改変ポリヌクレオチドが、５’ＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡ３’（配列番号２３）と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態１９。標的化ドメインが、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの約５ヌクレオチド以内にある、実施形態５の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、改変ポリヌクレオチド及び標的ＲＮＡと会合している場合に標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基に対して化学変換を行うＲＮＡ編集エンティティを動員する、実施形態５の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１。化学変換が、化学変換を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡと比較して、化学変換を有する標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質またはそのフラグメントのレベルの増加をもたらす、実施形態２０に記載の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２。レベルの増加が、約５％～約１００％である、実施形態２１の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３。化学変換が、化学変換を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡと比較して、化学変換を有する標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質またはそのフラグメントのレベルの減少をもたらす、実施形態２０に記載の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４。レベルの低減が、約５％～約１００％である、実施形態２３の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５。化学変換が、センスコドンを終止コドンに変換する、実施形態２０～２４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６。化学変換が、終止コドンをセンスコドンに変換する、実施形態２０～２４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７。化学変換が、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換する、実施形態２０～２４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２８。化学変換が、第１の終止コドンを第２の終止コドンに変換する、実施形態２０～２４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２９。改変ポリヌクレオチドが、ステムループ、十字形、トーホールド、ミスマッチバルジ、またはそれらの任意の組み合わせを含む２次構造を形成する、実施形態２０～２８のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態３０。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメイン、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメイン、ＧｌｕＲ２ドメイン、またはＣａｓ１３動員ドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態２０の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３１。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態３０の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３２。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態３１の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３３。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態３０の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３４。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態３３の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３５。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ｃａｓ１３動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み、Ｃａｓ１３動員ドメインが、Ｃａｓ１３ａ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｃ動員ドメイン、またはＣａｓ１３ｄ動員ドメインを含む、実施形態３０の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３６。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態３５の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３７。配列が、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態３６の改変ポリヌクレオチド。
実施形態３８。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＲＮＡ編集エンティティと少なくとも一時的に会合するように構成される、実施形態５～３７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態３９。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、またはその両方を含む、実施形態３８の改変ポリヌクレオチド。
実施形態４０。ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含むＡＤＡＲタンパク質を含む、実施形態３８の改変ポリヌクレオチド。
実施形態４１。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインがＲＮＡ編集エンティティと少なくとも一時的に会合し、標的化ドメインが標的ＲＮＡと少なくとも一時的に会合している場合、改変ポリヌクレオチドが、標的ＲＮＡの塩基の編集を促進するように構成される、実施形態３８～４０のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態４２。ＲＮＡ編集エンティティが、内因性酵素である、実施形態３８または４０の改変ポリヌクレオチド。
実施形態４３。ＲＮＡ編集エンティティが、組み換え酵素である、実施形態３８または４０の改変ポリヌクレオチド。
実施形態４４。改変ポリヌクレオチドが、さらに修飾を含む、実施形態１～４３のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態４５。修飾が、ヌクレオチド上の糖修飾を含む、実施形態４４の改変ポリヌクレオチド。
実施形態４６。改変ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態４５の改変ポリヌクレオチド。
実施形態４７。改変ポリヌクレオチドが、少なくとも部分的に遺伝子によりコード可能である、実施形態１～４６のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態４８。ＲＮＡ編集エンティティが、結合により改変ポリヌクレオチドに結合している、実施形態２～４７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態４９。結合が、直接的または間接的な共有結合である、実施形態４８の改変ポリヌクレオチド。
実施形態５０。ＲＮＡ編集エンティティが、融合ポリペプチドを含む、実施形態２～４９のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態５１。改変ポリヌクレオチドが、生理学的ｐＨの水溶液中で、ヒト細胞に天然に存在するｍＲＮＡよりも少なくとも約４倍長い半減期を保持する、実施形態１～５０のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態５２。スペーサードメインが、５’ＡＵＡＵＡ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１～５１のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態５３。スペーサードメインが、５’ＡＵＡＡＵ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１～５１のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態５４。改変ポリヌクレオチドが、さらに、Ｕ７またはＵ１プロモーター配列と少なくとも約８０％の相同性を有する配列を含む、実施形態１～５３のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態５５。標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な標的化ドメイン、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン、及びスペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドであって、改変ポリヌクレオチドが、ヌクレオチドが次々とつながった環状２次元形態のポリヌクレオチド配列として与えられ、スペーサードメインが、１つ以上のヌクレオチドの付加により改変ポリヌクレオチドを拡大し、改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない、改変ポリヌクレオチド。
実施形態５６。プロセシング前に、５’から３’の順に、第１のリボザイムドメイン、第１のライゲーションドメイン、第１のスペーサードメイン、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な標的化ドメイン、第２のスペーサードメイン、第２のライゲーションドメイン、及び第２のリボザイムドメイン、を含み、標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに結合しないように構成される、前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態５７。さらに、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む、実施形態５６の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態５８。第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、またはその両方が、５’ＡＵＡＵＡ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態５６または５７の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態５９。第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、またはその両方が、５’ＡＵＡＡＵ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態５６または５７の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６０。前駆改変ポリヌクレオチドが、さらに、Ｕ７またはＵ１プロモーター配列と少なくとも約８０％の相同性を有する配列を含む、実施形態５６～５９のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６１。第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、またはその両方が、約１ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド長の配列長を有する、実施形態５６～６０のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６２。第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、またはその両方のヌクレオチドの少なくとも約８０％が、標的ＲＮＡに非相補的である、実施形態５６～６１のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６３。標的化ドメインが、約２０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド長の配列長を有する、実施形態５６～６２のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６４。標的化ドメインまたはＲＮＡ編集動員ドメインが、第１のスペーサードメインまたは第２のスペーサードメインを含まない、実施形態５７～６３のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６５。標的化ドメインが、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの５ヌクレオチド以内にある、実施形態５７～６４のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６６。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメイン、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメイン、ＧｌｕＲ２ドメイン、またはＣａｓ１３動員ドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態５７～６５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６７。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態６６の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６８。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態６７の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態６９。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態６６の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７０。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態６８の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７１。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ｃａｓ１３動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み、Ｃａｓ１３動員ドメインが、Ｃａｓ１３ａ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｃ動員ドメイン、またはＣａｓ１３ｄ動員ドメインを含む、実施形態６６の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７２。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態７１の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７３。配列が、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態７２の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７４。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＲＮＡ編集エンティティと少なくとも一時的に会合するように構成される、実施形態５７～７３のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７５。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、またはその両方を含む、実施形態７４の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７６。ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含むＡＤＡＲタンパク質を含む、実施形態７５の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７７。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＲＮＡ編集エンティティと少なくとも一時的に会合し、標的化ドメインが、標的ＲＮＡと少なくとも一時的に会合する場合、改変ポリヌクレオチドが、標的ＲＮＡの塩基の編集を促進するように構成される、実施形態７４～７６のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７８。ＲＮＡ編集エンティティが、ヒト細胞に天然に存在する単離酵素である、実施形態５７～７７のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態７９。ＲＮＡ編集エンティティが、組み換え酵素である、実施形態５７～７７のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態８０。さらに、修飾を含む、実施形態５６～７９のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態８１。修飾が、糖修飾を含む、実施形態８０の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態８２。前駆改変ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態８０の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態８３。改変ポリヌクレオチドが、少なくとも部分的に遺伝子によりコード可能である、実施形態５６～８２のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態８４。ＲＮＡ編集エンティティが、結合により前駆改変ポリヌクレオチドに結合している、実施形態５７～８３のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態８５。結合が、直接的または間接的な共有結合である、実施形態８４の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態８６。実施形態１～５５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチドまたは実施形態５６～８５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
実施形態８７。ベクターがポリペプチドコートを含み、改変ポリヌクレオチドの少なくとも一部が、ポリペプチドコートの内側に存在する、実施形態８６のベクター。
実施形態８８。ベクターが、リポソーム、ウイルスベクター、ナノ粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態８６または８７のベクター。
実施形態８９。実施形態１～５５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチドまたは実施形態５６～８５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチドを少なくとも部分的にコードする、核酸。
実施形態９０。核酸が、二本鎖である、実施形態８９の核酸。
実施形態９１。核酸が、標的化タグを含む、実施形態８９の核酸。
実施形態９２。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧｌａＮＡｃ）を含む標的化タグを含む、実施形態９１の核酸。
実施形態９３。実施形態１～５５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド、実施形態５６～８５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド、実施形態８６～８８のいずれか１つのベクター、または実施形態８９～９２のいずれか１つの核酸、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体からなる、単回投与形態の医薬組成物。
実施形態９４。実施形態１～５５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド、実施形態５６～８５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド、実施形態８６～８８のいずれか１つのベクター、実施形態８９～９２のいずれか１つの核酸、または実施形態９３の医薬組成物、及び容器を含む、キット。
実施形態９５。実施形態１～５５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド、実施形態５６～８５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド、実施形態８６～８８のいずれか１つのベクター、実施形態８９～９２のいずれか１つの核酸、または実施形態９３の医薬組成物を投与することを含む、疾患または状態の処置をそれを必要とする対象において行う方法。
実施形態９６。方法が、第２の療法の投与を含む、実施形態９５の方法。
実施形態９７。投与が、少なくとも約１日１回、約１日２回、約１日３回、約１日４回、約１日５回、または約１日６回実施される、実施形態９５の方法。
実施形態９８。投与が、約１日～約８日、約１週間～約５週間、約１ヶ月～約１２ヶ月、約１年～約３年、約３年～約１０年、約１０年間～約５０年、約２５年～約１００年、または約５０年～約１３０年、実施される、実施形態９５の方法。
実施形態９９。投与が、細胞に対するものである、実施形態９５の方法。
実施形態１００。細胞が、Ｔ細胞である、実施形態９９の方法。
実施形態１０１。さらに、対象が疾患を有すると診断することを含む、実施形態９５の方法。
実施形態１０２。対象が、ヒトである、実施形態９５の方法。
実施形態１０３。実施形態１～５５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド、実施形態５６～８５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド、実施形態８６～８８のいずれか１つのベクター、実施形態８９～９２のいずれか１つの核酸、または実施形態９３の医薬組成物を予防的に投与することを含む、疾患または状態の予防をそれを必要とする対象において行う方法。
実施形態１０４。方法が、第２の療法の投与を含む、実施形態１０３の方法。
実施形態１０５。投与が、少なくとも約１日１回、約１日２回、約１日３回、約１日４回、約１日５回、または約１日６回実施される、実施形態１０３の方法。
実施形態１０６。投与が、約１日～約８日、約１週間～約５週間、約１ヶ月～約１２ヶ月、約１年～約３年、約３年～約１０年、約１０年間～約５０年、約２５年～約１００年、または約５０年～約１３０年、実施される、実施形態１０３の方法。
実施形態１０７。投与が、細胞に対するものである、実施形態１０３の方法。
実施形態１０８。細胞が、Ｔ細胞である、実施形態１０７の方法。
実施形態１０９。対象が、ヒトである、実施形態１０３の方法。
実施形態１１０。改変ポリヌクレオチドを形成する方法であって、方法が、
ライゲーションエンティティを用いて、前駆改変ポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドを、前駆改変ポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドに直接的または間接的にライゲーションし、それにより、改変ポリヌクレオチドを形成することを含み、改変ポリヌクレオチドが、
（ａ）標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である標的化ドメイン；及び
（ｂ）スペーサードメイン、を含み、改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシルを含まず、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、
（ｉ）標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに結合しないように構成される、
（ｉｉ）標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインが、標的化ドメインから少なくとも１ヌクレオチド離れており、スペーサードメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインの結合が、スペーサードメインに結合する標的ＲＮＡの部分で標的ＲＮＡの編集を生じない、または
（ｉｉｉ）スペーサードメインが標的化ドメインの５’末端もしくは３’末端に隣接している場合、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに相補的ではない
の少なくとも１つが適用される、方法。
ライゲーションエンティティを用いて、前駆改変ポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドを、前駆改変ポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドに直接的または間接的にライゲーションし、それにより、改変ポリヌクレオチドを形成することを含み、改変ポリヌクレオチドが、
（ａ）標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である標的化ドメイン；及び
（ｂ）スペーサードメイン、を含み、改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシルを含まず、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、
（ｉ）標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに結合しないように構成される、
（ｉｉ）標的化ドメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインが、標的化ドメインから少なくとも１ヌクレオチド離れており、スペーサードメインが標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインの結合が、スペーサードメインに結合する標的ＲＮＡの部分で標的ＲＮＡの編集を生じない、または
（ｉｉｉ）スペーサードメインが標的化ドメインの５’末端もしくは３’末端に隣接している場合、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに相補的ではない
の少なくとも１つが適用される、方法。
実施形態１１１。改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドと比較して、複数の他のＲＮＡの中で、標的ＲＮＡへの結合特異性の増加を促進するように構成され、これが、改変ポリヌクレオチドまたは対応する改変ポリヌクレオチドと接触した後に、標的ＲＮＡ及び複数の他のＲＮＡのシーケンシングで測定される、実施形態１１０の方法。
実施形態１１２。改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のエントロピー（ΔＳ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）が、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドと比較して低くなるように、スペーサードメインが構成される、実施形態１１０または１１１の方法。
実施形態１１３。スペーサードメインが、標的ＲＮＡへの少なくとも部分的な結合を促進する立体配座をとる改変ＲＮＡを促進するように構成される、実施形態１１０～１１２のいずれか１つの方法。
実施形態１１４。改変ポリヌクレオチドまたはスペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドと接触させた後に、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの編集効率と比較して、標的ＲＮＡに対する改変ポリヌクレオチドの編集効率（標的ＲＮＡのシーケンシングで決定）を少なくとも維持するように、スペーサードメインが構成される、実施形態１１３の方法。
実施形態１１５。少なくとも維持することが、増加を含む、実施形態１１４の方法。
実施形態１１６。前駆改変ポリヌクレオチドが、５’から３’の順に、第１のリボザイムドメイン、第１のライゲーションドメイン、第１のスペーサードメイン、標的化ドメイン、第２のスペーサードメイン、第２のライゲーションドメイン、及び第２のリボザイムドメイン、を含む、実施形態１１０～１１５のいずれか１つの方法。
実施形態１１７。スペーサードメインが、５’ＡＵＡＵＡ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１１０～１１６のいずれか１つの方法。
実施形態１１８。スペーサードメインが、５’ＡＵＡＡＵ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１１０～１１６のいずれか１つの方法。
実施形態１１９。スペーサードメインが、約１ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド長の配列長を有する、実施形態１１０～１１８のいずれか１つの方法。
実施形態１２０。スペーサードメインのヌクレオチドの少なくとも約８０％が、標的ＲＮＡに非相補的である、実施形態１１０～１１９のいずれか１つの方法。
実施形態１２１。標的化ドメインが、約２０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド長の配列長を有する、実施形態１１０～１２０のいずれか１つの方法。
実施形態１２２。改変ポリヌクレオチドが、さらに、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む、実施形態１１０～１２１のいずれか１つの方法。
実施形態１２３。標的化ドメインまたはＲＮＡ編集動員ドメインが、スペーサードメインを含まない、実施形態１２２の方法。
実施形態１２４。標的化ドメインが、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの５ヌクレオチド以内にある、実施形態１２２の方法。
実施形態１２５。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、改変ポリヌクレオチドと会合している場合に、標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基に対して化学変換を行うＲＮＡ編集エンティティを動員する、実施形態１２２の方法。
実施形態１２６。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、またはその両方を含む、実施形態１２５の方法。
実施形態１２７。ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含むＡＤＡＲタンパク質を含む、実施形態１２６の方法。
実施形態１２８。化学変換が、化学変換を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡと比較して、化学変換を有する標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質またはそのフラグメントのレベルの増加をもたらす、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２９。レベルの増加が、約５％～１００％である、実施形態１２８の方法。
実施形態１３０。化学変換が、化学変換を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡと比較して、化学変換を有する標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質またはそのフラグメントのレベルの減少をもたらす、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１３１。レベルの低減が、約５％～１００％である、実施形態１３０の方法。
実施形態１３２。化学変換が、センスコドンを終止コドンに変換する、実施形態１２５～１３１のいずれか１つの方法。
実施形態１３３。化学変換が、終止コドンをセンスコドンに変換する、実施形態１２５～１３１のいずれか１つの方法。
実施形態１３４。化学変換が、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換する、実施形態１２５～１３１のいずれか１つの方法。
実施形態１３５。化学変換が、第１の終止コドンを第２の終止コドンに変換する、実施形態１２５～１３１のいずれか１つの方法。
実施形態１３６。改変ポリヌクレオチドが、ステムループ、十字形、トーホールド、ミスマッチバルジ、またはそれらの任意の組み合わせを含む２次構造を形成する、実施形態１２５～１３５のいずれか１つの方法。
実施形態１３７。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメイン、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメイン、ＧｌｕＲ２ドメイン、またはＣａｓ１３動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態１２５の方法。
実施形態１３８。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態１３７の方法。
実施形態１３９。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ａｌｕドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態１３８の方法。
実施形態１４０。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態１３７の方法。
実施形態１４１。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態１４０の方法。
実施形態１４２。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ｃａｓ１３動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含み、Ｃａｓ１３動員ドメインが、Ｃａｓ１３ａ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｃ動員ドメイン、またはＣａｓ１３ｄ動員ドメインを含む、実施形態１３７の方法。
実施形態１４３。ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインの少なくとも約２０の核酸と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態１４２の方法。
実施形態１４４。配列が、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列相同性を含む、実施形態１４３の方法。
実施形態１４５。ＲＮＡ編集エンティティが、哺乳動物細胞に天然に存在する単離酵素である、実施形態１２２～１４４のいずれか１つの方法。
実施形態１４６。ＲＮＡ編集エンティティが、組み換え酵素である、実施形態１２２～１４４のいずれか１つの方法。
実施形態１４７。改変ポリヌクレオチドが、修飾を含む、実施形態１２２～１４６のいずれか１つの方法。
実施形態１４８。修飾が、改変ポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基上の糖修飾を含む、実施形態１４７の方法。
実施形態１４９。改変ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、メチル基、フルオロ基、メトキシエチル基、エチル基、リン酸基、アミド基、エステル基、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１４８の方法。
実施形態１５０。改変ポリヌクレオチドが、遺伝子によりコード化可能である、実施形態１１０～１４９のいずれか１つの方法。
実施形態１５１。ＲＮＡ編集エンティティが、結合により改変ポリヌクレオチドに結合している、実施形態１２２～１５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５２。改変ポリヌクレオチド及びＲＮＡ編集エンティティ間の結合が、直接的または間接的な共有結合である、実施形態１５１に記載の方法。
実施形態１５３。ライゲーションエンティティが、ＲＮＡリガーゼを含む、実施形態１１０～１５２のいずれか１つの方法。
実施形態１５４。改変ポリヌクレオチドが、生理的ｐＨの水溶液中で、同等のポリヌクレオチドよりも少なくとも約４倍長い半減期を保持する、実施形態１１０～１５３のいずれか１つの方法。
実施形態１５５。それを必要とする対象に投与される治療有効量の改変ポリヌクレオチドが、同等の改変ポリヌクレオチドよりも少なくとも約４分の１以下である、実施形態１１０～１５４のいずれか１つの方法。
実施形態１５８。標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な標的化ドメイン；ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン（ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＲＮＡ編集エンティティと少なくとも一時的に会合する）；及びスペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドであって、標的化ドメインまたはＲＮＡ編集動員ドメインが、スペーサードメインを含まず、改変ポリヌクレオチドが、一緒に共有結合している複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含み、主鎖が、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない、改変ポリヌクレオチド。
実施形態１５９。標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である標的化ドメイン及びスペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドであって、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、改変ポリヌクレオチドが、一緒に共有結合している複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含み、主鎖が、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない、改変ポリヌクレオチド。
実施形態１６０。５’から３’の順に、第１のスペーサードメイン、疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、及び第２のスペーサードメイン、を含む前駆改変線状ポリヌクレオチドであって、第１または第２のスペーサードメインが、標的ＲＮＡに相補的ではなく、前駆改変線状ポリヌクレオチドの転写物が、哺乳動物細胞への前駆改変線状ポリヌクレオチドの挿入時に自己環状化し、それにより、環状化された改変ポリヌクレオチドを形成し、標的化ドメインが標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６１。前駆改変線状ポリヌクレオチドが、第１のスペーサードメインの５’側または第２のスペーサードメインの３’側に、リボザイムドメインを含む、実施形態１６０の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６２。前駆改変線状ポリヌクレオチドが、リボザイムドメイン及び第１のスペーサードメイン間、またはリボザイムドメイン及び第２のスペーサードメイン間に、ライゲーションドメインを含む、実施形態１６１の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６３。自己環状化後に、第１のスペーサードメイン及び第２のスペーサードメインが、環状化された改変ポリヌクレオチドの全長の約４０％～約７０％であるフィラー配列を含む、実施形態１６０～１６２のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６４。自己環状化後に、第１のスペーサードメイン及び第２のスペーサードメインが、環状化された改変ポリヌクレオチドの全配列の約５０％～約６７％であるフィラー配列を含む、実施形態１６３の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６５。フィラー配列が、フィラー配列を欠く他の点で同等の環状化ポリヌクレオチドと比較して、標的化ドメインの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを増加させる、実施形態１６３または１６４の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６６。標的化ドメインが、標的ＲＮＡと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の相補性を含む、実施形態１６０～１６５のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６７。標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、実施形態１６０～１６６のいずれか１つに記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６８。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に実質的に相補的である、実施形態１６０～１６７のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１６９。標的化ドメインが、標的ＲＮＡのイントロン領域と、実質的に相補的である、実施形態１６０～１６８のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７０。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）に実質的に相補的である、実施形態１６０～１６９のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７１。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）の一部に少なくとも部分的に相補的ではない、実施形態１６０～１６９のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７２。標的化ドメインが、標的ＲＮＡとミスマッチである少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含む、実施形態１６０～１７１のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７３。ミスマッチヌクレオチドが、標的ＲＮＡに相補的な２つのヌクレオチドに隣接しており、これが、ミスマッチヌクレオチドの両側に１つずつある、実施形態１７２の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７４。塩基の編集が、編集を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡの翻訳タンパク質と比較して、塩基の編集を伴う標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質もしくはそのフラグメントのレベルを増加させるか、タンパク質もしくはそのフラグメントの長さを増加させるか、タンパク質もしくはそのフラグメントの機能性を増加させるか、タンパク質もしくはそのフラグメントの安定性を増加させるか、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態１６０～１７３のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７５。レベルの増加が、約５％～約１００％である、実施形態１７４の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７６。長さの増加が、タンパク質またはそのフラグメントの約５％～約１００％である、実施形態１７４の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７７。安定性の増加が、タンパク質またはそのフラグメントの半減期の増加である、実施形態１７４の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７８。塩基の編集が、センスコドンを終止コドンに変換する、実施形態１６０～１７７のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１７９。センスコドンが、疾患の病原経路に関与し、センスコドンを終止コドンに変換すると、疾患の病原経路が低減する、実施形態１７８の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８０。塩基の編集が、終止コドンをセンスコドンに変換する、実施形態１６０～１７７のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８１。終止コドンが、疾患の病原経路に関与し、終止コドンをセンスコドンに変換すると、疾患の病原経路が低減する、実施形態１８０の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８２。塩基の編集が、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換する、実施形態１６０～１７７のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８３。第１のセンスコドンが、疾患の病原経路に関与し、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換すると、疾患の病原経路が低減する、実施形態１８２の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８４。前駆改変線状ポリヌクレオチドが、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド～約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、または約２００ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドである、実施形態１６０～１８３のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８５。標的化ドメインが、約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドである、実施形態１８４の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８６。ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲタンパク質またはＡＰＯＢＥＣタンパク質を含む、実施形態１～１８５のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８７。ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１である、実施形態１８６の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８８。ＡＤＡＲ１が、ｈＡＤＡＲ１である、実施形態１８７の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１８９。ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ２である、実施形態１８６の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１９０。ＡＤＡＲ２が、ｈＡＤＡＲ２である、実施形態１８９の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１９１。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ３である、実施形態１８６の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１９２。ＡＤＡＲ３が、ｈＡＤＡＲ３である、実施形態１９１の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１９３。標的化ドメインが、アプタマーを含まない、実施形態１６０～１９２の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１９４。前駆改変線状ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まないか、またはコードしない、実施形態１６０～１９３のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１９５。前駆改変線状ポリヌクレオチドが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはダイサー基質をコードする配列を含まないか、またはコードしない、実施形態１６０～１９４のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１９６。疾患または状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、または嚢胞性線維症を含む、実施形態１６０の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態１９７。５’から３’の順に、第１のリボザイムドメイン、第１ライゲーションドメイン、第１のスペーサードメイン、疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、第２のライゲーションドメイン、及び第２のリボザイムドメイン、を含む前駆改変ポリヌクレオチドであって、第１のスペーサードメインが、標的ＲＮＡと相補的ではなく、前駆改変線状ポリヌクレオチドの転写物が、哺乳動物細胞への前駆改変線状ポリヌクレオチドの挿入時に自己環状化し、それにより、環状化された改変ポリヌクレオチドを形成し、標的化ドメインが標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態１９８。前駆改変ポリヌクレオチドが、線状である、実施形態１９７の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態１９９。第１のスペーサードメインが、約５０ヌクレオチド～約４００ヌクレオチド、または約２００ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを含むフィラー配列である、実施形態１９７または１９８の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２００。フィラー配列が、フィラー配列を欠く他の点で同等の環状化ポリヌクレオチドと比較して、標的化ドメインの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを増加させる、実施形態１９９の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０１。標的化ドメインが、標的ＲＮＡと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の相補性を含む、実施形態１９７～２００のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０２。さらに、ＲＮＡ編集酵素動員ドメインを含む、実施形態１９７～２０１のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０３。第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、またはその両方が、５’ＡＵＡＵＡ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１９７～２０２のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０４。第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、またはその両方が、５’ＡＵＡＡＵ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１９７～２０２のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０５。環状化された改変ポリヌクレオチドが、第１のスペーサードメインを欠く環状化された改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡法（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有する、実施形態１９７～２０４のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド。
実施形態２０６。前駆改変ポリヌクレオチドが、さらに、Ｕ７またはＵ１プロモーター配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１９７～２０５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０７。前駆改変ポリヌクレオチドが、さらに、ＲＮＡ配列モチーフを含む、実施形態１９７～２０６のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０８。ＲＮＡ配列モチーフが、ＳｍＯＰＴ配列、ｈｎＲＮＰＡ１配列、ＭＡＬＡＴ１配列、ＳＩＲＬＯＩＮ配列、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態２０７の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２０９。標的化ドメインが、標的ＲＮＡとミスマッチである少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含む、実施形態１９７～２０８のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１０。ミスマッチヌクレオチドが、標的ＲＮＡに相補的な２つのヌクレオチドに隣接しており、これが、ミスマッチヌクレオチドの両側に１つずつある、実施形態２０９の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１１。前駆体ポリヌクレオチドが、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド～約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約４００ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドである、実施形態１９７～２１０のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１２。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質またはＡＰＯＢＥＣタンパク質を含む、実施形態１９７の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１３。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、またはＡＤＡＲ３を含む、実施形態２１２の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１４。疾患または状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、もしくはテイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、または嚢胞性線維症を含む、実施形態１９７の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１５。標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、実施形態１９７～２１４のいずれか１つに記載の前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１６。前駆改変ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まないか、またはコードしない、実施形態１９７～２１５のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１７。前駆改変ポリヌクレオチドが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはダイサー基質をコードする配列を含まないか、またはコードしない、実施形態１９７～２１６のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１８。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも一部に実質的に相補的である、実施形態１９７～２１７のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２１９。標的化ドメインが、標的ＲＮＡのイントロン領域の少なくとも一部に実質的に相補的である、実施形態１９７～２１８のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２０。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）の少なくとも一部に実質的に相補的である、実施形態１９７～２１９のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２１。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）の少なくとも一部に実質的に相補的である、実施形態１９７～２１４のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２２。ａ）疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、及び、ｂ）スペーサードメイン、をコードするか、またはそれを含む改変ポリヌクレオチドであって、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの標的化ドメインの標的ＲＮＡへの結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡法（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、標的化ドメインの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、改変ポリヌクレオチドが、式（Ｉ）の構造を含み：
式中、各Ｘは、Ｏであり；各Ｙは、Ｐであり、各Ｚは、ＯまたはＳであり、各Ａは、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、ＯＭ、ＳＭ、ＮＲＭ、またはＮＲＲ’であり、各Ｂは、独立して、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの誘導体であり、ｍは、独立して、０～１，０００の整数であり、各Ｍは、独立して、無機もしくは有機カチオン、Ｈ、またはＤであり、各Ｒ及びＲ’は、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、またはＣ１－Ｃ６アルキルであり、標的化ドメインが標的ＲＮＡの配列と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２３。各ユニットｍが、独立して、（Ｄ）－または（Ｌ）－立体配置にある、実施形態２２２の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２４。標的化ドメインが、標的ＲＮＡと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の相補性を含む、実施形態２２２の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２５。式（Ｉ）が、式（ＩＩ）による、実施形態２２２～２２４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２６。各Ｚが、Ｏであり、各Ｒが、Ｈである、実施形態２２２～２２５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２７。各ｍが、約３０～６００の独立した整数である、実施形態２２２～２２６のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２８。ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、及び、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される、実施形態２２２～２２７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２２９。塩基の編集が、編集を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡの翻訳されたタンパク質と比較して、塩基の編集を有する標的ＲＮＡの翻訳後の、タンパク質もしくはそのフラグメントのレベルの増加、タンパク質もしくはそのフラグメントの長さの増加、タンパク質もしくはそのフラグメントの機能性の増加、タンパク質もしくはそのフラグメントの安定性の増加、またはそれらの任意の組み合わせをもたらす、実施形態２２２～２２８のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３０。レベルの増加が、約５％～約１００％である、実施形態２２９の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３１。長さの増加が、タンパク質またはそのフラグメントの約５％～約１００％である、実施形態２２９の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３２。安定性の増加が、タンパク質またはそのフラグメントの半減期の増加である、実施形態２２９の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３３。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、またはその両方を含む、実施形態２２２～２３２のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３４。ＲＮＡ編集エンティティが，ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲが，ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含む、実施形態２２２～２３３のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３５。塩基の編集が、センスコドンを終止コドンに変換する、実施形態２２２～２３４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３６。センスコドンが、疾患の病原経路に関与し、センスコドンを終止コドンに変換すると、疾患の病原経路が低減する、実施形態２３５の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３７。塩基の編集が、終止コドンをセンスコドンに変換する、実施形態２２２～２３４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３８。塩基の編集が、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換する、実施形態２２２～２３４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２３９。第１のセンスコドンが、疾患の病原経路に関与し、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換すると、疾患の病原経路が低減する、実施形態２３８の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４０。塩基の編集が、第１のアミノ酸を規定するセンスコドンを、第２のアミノ酸を規定する第２のセンスコドンに変換する、実施形態２２２～２３８のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４１。第１のアミノ酸が、プロテアーゼ切断部位である、実施形態２４０の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４２。疾患または状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、または嚢胞性線維症を含む、実施形態２２２～２４１のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４３。ａ）標的ＲＮＡの配列にハイブリダイズすることが可能な標的化ドメイン、及び、ｂ）スペーサードメイン、をコードするか、またはそれを含む改変ポリヌクレオチドであって、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡法（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、改変ポリヌクレオチドが、式（Ｉ）の構造を含み：
式中、各Ｘは、Ｏであり；各Ｙは、Ｐであり、各Ｚは、ＯまたはＳであり、各Ａは、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、ＯＭ、ＳＭ、ＮＲＭ、またはＮＲＲ’であり、各Ｂは、独立して、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの誘導体であり、ｍは、独立して、０～１，０００の整数であり、各Ｍは、独立して、無機もしくは有機カチオン、Ｈ、またはＤであり、各Ｒ及びＲ’は、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、またはＣ１－Ｃ６アルキルであり、標的化ドメインは、標的ＲＮＡの非翻訳領域と少なくとも部分的に会合するように構成され、標的化ドメインが標的ＲＮＡの非翻訳領域と会合すると、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が促進される、改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４４。ａ）標的ＲＮＡの配列にハイブリダイズすることが可能な標的化ドメイン、及び、ｂ）スペーサードメイン、をコードするか、またはそれを含む改変ポリヌクレオチドであって、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応する改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡法（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、改変ポリヌクレオチドが、式（Ｉ）の構造を含み：
式中、各Ｘは、Ｏであり；各Ｙは、Ｐであり、各Ｚは、ＯまたはＳであり、各Ａは、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、ＯＭ、ＳＭ、ＮＲＭ、またはＮＲＲ’であり、各Ｂは、独立して、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの誘導体であり、ｍは、独立して、０～１，０００の整数であり、各Ｍは、独立して、無機もしくは有機カチオン、Ｈ、またはＤであり、各Ｒ及びＲ’は、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、またはＣ１－Ｃ６アルキルであり、標的化ドメインが、標的ＲＮＡの非翻訳領域と少なくとも部分的に会合するように構成され、標的化ドメインが標的ＲＮＡの非翻訳領域と会合すると、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が促進され、標的化ドメインが標的ＲＮＡの配列と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４５。標的化ドメインが標的ＲＮＡの非翻訳領域と会合すると、改変ポリヌクレオチドの不存在下の標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドのレベルと比較して、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が促進され、これが、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株の第１の細胞及び第２の細胞に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株の第１の細胞に直接的または間接的に導入すること、ならびに、（ｉｉｉ）第１の細胞及び第２の細胞において標的ＲＮＡから発現されたポリペプチドの量を比較すること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される、実施形態２４３または２４４の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４６。標的化ドメインが、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である、実施形態２４３～２４５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４７。標的化ドメインが、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的であり、標的ＲＮＡに対する逆相補体と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２４６の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４８。各単位ｍが、独立して、（Ｄ）－または（Ｌ）－立体配置にある、実施形態２４３～２４７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２４９。式（Ｉ）が、式（ＩＩ）による、実施形態２４３～２４８のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５０。レベルの低減が、約５％～約１００％である、実施形態２４３～２４９のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５１。初代細胞株が、ニューロン細胞、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、グリア細胞、筋芽細胞、筋管細胞、肝細胞、肺上皮細胞、または線維芽細胞を含む、実施形態２４３～２５０のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５２。標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、実施形態２４３～２５１のいずれか１つに記載の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５３。改変ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まないか、またはコードしない、実施形態２４３～２５２のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５４。改変ポリヌクレオチドが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはダイサー基質をコードする配列を含まないか、またはコードしない、実施形態２４３～２５３のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５５。標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が、ＲＮＡ指向性ＲＮＡエンドヌクレアーゼと少なくとも部分的に無関係である、実施形態２４３～２５４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５６。標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が、ＲＩＳＣまたはＤｉｃｅｒと少なくとも部分的に無関係である、実施形態２４３～２５５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５７。標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が、アルゴノートと少なくとも部分的に無関係である、実施形態２４３～２５６のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５８。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的である、実施形態２４３～２５７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２５９。標的化ドメインが、標的ＲＮＡのイントロン領域の少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的である、実施形態２４３～２５８のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６０。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）の少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的である、実施形態２４３～２５９のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６１。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）の少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的でない、実施形態２４３～２５９のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６２。標的ＲＮＡが、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、または嚢胞性線維症と関連する、実施形態２４３～２６１のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６３。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、またはその両方を含む、実施形態２４４～２６２のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６４。ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質を含む、実施形態２４４～２６２のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６５。ａ）標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である標的化ドメイン；及び、ｂ）スペーサードメインをコードするか、またはそれを含む改変ポリヌクレオチドであって、標的化ドメインが、スペーサードメインを物理的に含まず；改変ポリヌクレオチドが、式（ＩＶ）の構造を含み：
改変ポリヌクレオチドにおいて、各Ｘは、独立して、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの誘導体である塩基を含むヌクレオチドであり、ｎは、独立して、０～１，０００の整数であり、各ヌクレオチドが、各結合について独立して、ホスホエステル、ホスホチオエステル、ホスホチオアート、またはホスホルアミダイト結合で、２つの隣接するヌクレオチドに結合され、（ｉ）標的化ドメインが、標的ＲＮＡのコード領域と少なくとも部分的に会合するように構成され、標的化ドメインが標的ＲＮＡのコード領域と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進されるか、（ｉｉ）標的化ドメインが、標的ＲＮＡの非翻訳領域と少なくとも部分的に会合するように構成され、標的化ドメインが標的ＲＮＡの非翻訳領域と会合すると、標的ＲＮＡにより産生されるポリペプチドのレベルの低減が促進されるか、または、（ｉｉｉ）それらの任意の組み合わせである、改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６６。ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、ならびに、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される、実施形態２６５の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６７。標的化ドメインが標的ＲＮＡの非翻訳領域と会合すると、改変ポリヌクレオチドの不存在下の標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドのレベルと比較して、標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が促進され、これが、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株の第１の細胞及び第２の細胞に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株の第１の細胞に直接的または間接的に導入すること、ならびに、（ｉｉｉ）第１の細胞及び第２の細胞において標的ＲＮＡから発現されたポリペプチドの量を比較すること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される、実施形態２６５または２６６の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６８。改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない、実施形態２６５～２６７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２６９。各５’ヒドロキシル及び各３’ヒドロキシルが、独立して、共有酸素リン結合によりリンに結合している、実施形態２６５～２６８のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７０。リンが、ホスホジエステル基に含まれる、実施形態２６９の改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７１。改変ポリヌクレオチドが、さらに、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む、実施形態２６５～２７０のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７２。改変ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まないか、またはコードしない、実施形態２６５～２７１のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７３。改変ポリヌクレオチドが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはダイサー基質をコードする配列を含まないか、またはコードしない、実施形態２６５～２７２のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７４。標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が、ＲＮＡ指向性ＲＮＡエンドヌクレアーゼと少なくとも部分的に無関係である、実施形態２６５～２７３のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７５。標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が、ＤｉｃｅｒまたはＲＩＳＣと少なくとも部分的に無関係である、実施形態２６５～２７４のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７６。標的ＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現レベルの低減が、アルゴノートと少なくとも部分的に無関係である、実施形態２６５～２７５のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７７。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的である、実施形態２６５～２７６のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７８。標的化ドメインが、標的ＲＮＡのイントロン領域の少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的である、実施形態２６５～２７７のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２７９。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）の少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的である、実施形態２６５～２７８のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２８０。標的化ドメインが、標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）の少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的でない、実施形態２６５～２７８のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２８１。標的ＲＮＡが、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、または嚢胞性線維症と関連する、実施形態２６５～２８０のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド。
実施形態２８２。疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、及び標的ＲＮＡに相補的でないスペーサードメインをコードするか、または含む改変環状ポリヌクレオチドであって、スペーサードメインが、改変環状ポリヌクレオチドを１つ以上のヌクレオチドの付加により拡大し、
標的化ドメインが標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２８３。ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、ならびに、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される、実施形態２８２の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２８４。改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない、実施形態２８２または２８３の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２８５。各５’ヒドロキシル及び各３’ヒドロキシルが、独立して、共有酸素リン結合で、リンに結合している、実施形態２８４の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２８６。リンが、ホスホジエステル基に含まれる、実施形態２８５の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２８７。さらに、ＲＮＡ編集酵素動員ドメインを含み、ＲＮＡ編集酵素動員ドメインが、改変ポリヌクレオチドと会合した場合に、標的ＲＮＡ内のヌクレオチドの塩基に対して化学変換を行うＲＮＡ編集酵素を動員する、実施形態２８２～２８６のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２８８。改変ポリヌクレオチドが、約４０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドである、実施形態２８２～２８７のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２８９。改変ポリヌクレオチドが、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドである、実施形態２８８の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９０。改変ポリヌクレオチドが、約１４０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドである、実施形態２８８の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９１。改変ポリヌクレオチドが、約８０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドである、実施形態２８８の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９２。標的化ドメインが、約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドである、実施形態２８２～２９１のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９３。標的ＲＮＡが、ナンセンス変異を含む、実施形態２８２～２９２のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９４。標的化ドメインが、標的ＲＮＡとミスマッチである少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含む、実施形態２８２～２９３のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９５。ミスマッチヌクレオチドが、標的ＲＮＡに相補的な２つのヌクレオチドに隣接しており、これが、ミスマッチヌクレオチドの両側に１つずつある、実施形態２９４の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９６。改変ポリヌクレオチドが、さらに、Ｕ７またはＵ１プロモーター配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態２８２～２９５のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９７。改変ポリヌクレオチドが、さらに、ＲＮＡ配列モチーフを含む、実施形態２８２～２９６のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９８。ＳｍＯＰＴ配列、ｈｎＲＮＰＡ１配列、ＭＡＬＡＴ１配列、ＳＩＲＬＯＩＮ配列、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態２９７の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態２９９。疾患または状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、または嚢胞性線維症を含む、実施形態２８２の改変環状ポリヌクレオチド。
実施形態３００。実施形態１６０～１９６のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド、実施形態１９７～２２１のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド、または実施形態２２２～２９９のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
実施形態３０１。ベクターがポリペプチドコートを含み、改変ポリヌクレオチドの少なくとも一部が、ポリペプチドコートの内側に存在する、実施形態３００のベクター。
実施形態３０２。ベクターが、リポソーム、ウイルスベクター、ナノ粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態３００または３０１のベクター。
実施形態３０３。ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、実施形態３０２のベクター。
実施形態３０４。ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、これらのいずれかのキメラ、またはこれらのいずれかのバリアントである、実施形態３０３のベクター。
実施形態３０５。ウイルスベクターが、自己相補型アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、実施形態３０３または３０４のベクター。
実施形態３０６。ウイルスベクターが、一本鎖ＡＡＶベクターである、実施形態３０３または３０４のベクター。
実施形態３０７。実施形態１６０～１９６のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド、実施形態１９７～２２１のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド、または実施形態２２２～２９９のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチドを少なくとも部分的にコードする、核酸。
実施形態３０８。核酸が、二本鎖である、実施形態３０７の核酸。
実施形態３０９。核酸が、標的化タグを含む、実施形態３０７の核酸。
実施形態３１０。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧｌａＮＡｃ）を含む標的化タグを含む、実施形態３０７の核酸。
実施形態３１１。実施形態１６０～１９６のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド、実施形態２２２～２９９のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド、または実施形態３００～３０６のいずれか１つのベクター、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む、単位用量形態の医薬組成物。
実施形態３１２。実施形態１６０～１９６のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド、実施形態１９７～２２１のいずれか１つの前駆改変ポリヌクレオチド、実施形態２２２～２９９のいずれか１つの改変ポリヌクレオチド、実施形態３００～３０６のいずれか１つのベクター、実施形態３０７～３１０のいずれか１つの核酸、または実施形態３１１の医薬組成物、及び容器を含む、キット。
実施形態３１３。治療有効量の実施形態１６０～１９６のいずれか１つの前駆改変線状ポリヌクレオチド、実施形態２２２～２９９のいずれか１つの改変環状ポリヌクレオチド、実施形態３００～３０６のいずれか１つのベクター、または実施形態３１１の医薬組成物を投与することを含む、疾患または状態の処置または予防をそれを必要とする対象において行う方法。
実施形態３１４。方法が、第２の療法の投与を含む、実施形態３１３の方法。
実施形態３１５。投与が、細胞に対するものである、実施形態３１３の方法。
実施形態３１６。細胞が、Ｔ細胞である、実施形態３１５の方法。
実施形態３１７。さらに、対象が疾患を有すると診断することを含む、実施形態３１３の方法。
実施形態３１８。対象が、ヒトである、実施形態３１３の方法。
実施形態３１９。改変環状ポリヌクレオチドを形成する方法であって、方法が、ライゲーションエンティティを用いて、前駆改変ポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドを、前駆改変ポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドに直接的または間接的にライゲーションして、それにより、改変環状ポリヌクレオチドを形成することを含み、改変環状ポリヌクレオチドが、ａ）疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、及び、ｂ）スペーサードメインを含み、スペーサードメインを含む改変環状ポリヌクレオチドの標的化ドメインが、スペーサードメインを欠く対応する環状ポリヌクレオチドの標的化ドメインの結合のギブス自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡法（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、標的化ドメインの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、以下の少なくとも１つが適用される：（ｉ）スペーサードメインが、標的ＲＮＡに相補的ではない、（ｉｉ）標的化ドメインが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、スペーサードメインが、標的化ドメインから少なくとも１ヌクレオチド離れており、スペーサードメインが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、スペーサードメインのハイブリダイゼーションが、スペーサードメインに結合する標的ＲＮＡの部分で標的ＲＮＡの編集を生じない、または、（ｉｉｉ）スペーサードメインが、標的化ドメインの５’末端もしくは３’末端に隣接する場合、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに相補的ではなく、標的化ドメインが、標的ＲＮＡのコード領域にハイブリダイズし、標的化ドメインが標的ＲＮＡのコード領域にハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、方法。
実施形態３２０。ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変環状ポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、ならびに、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される、実施形態３１９の方法。
実施形態３２１。改変環状ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと比較して、複数の他のＲＮＡの中で、標的ＲＮＡに対する結合特異性の増加を促進し、これが、改変ポリヌクレオチドまたは対応するポリヌクレオチドと接触させた後に、標的ＲＮＡ及び複数の他のＲＮＡのシーケンシングで決定される、実施形態３１９または３２０の方法。
実施形態３２２。スペーサードメインが、スペーサードメインを欠く対応する環状ポリヌクレオチドと比較して低い、改変環状ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のエントロピー（ΔＳ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）を促進する、実施形態３１９～３２１のいずれか１つの方法。
実施形態３２３。スペーサードメインが、スペーサードメインを欠く他の点で同等の環状化されたポリヌクレオチドと比較して、標的化ドメインの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを増加させる、実施形態３１９～３２２のいずれか１つの方法。
実施形態３２４。スペーサードメインが、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの編集効率と比較して、標的ＲＮＡに対する改変環状ポリヌクレオチドの編集効率を増加させ、これが、改変ポリヌクレオチドまたはスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触させた後に、標的ＲＮＡのシーケンシングで決定される、実施形態３２３の方法。
実施形態３２５。改変ポリヌクレオチドが、さらに、ＲＮＡ編集酵素動員ドメインを含む、実施形態３１９～３２４のいずれか１つの方法。
実施形態３２６。ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、またはその両方を含む、実施形態３２５の方法。
実施形態３２７。ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、またはＡＤＡＲ３を含むＡＤＡＲタンパク質を含む、実施形態３２６の方法。
実施形態３２８。改変ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない、実施形態３１９～３２７のいずれか１つの方法。
実施形態３２９。各５’ヒドロキシル及び各３’ヒドロキシルが、独立して、共有酸素リン結合で、リンに結合している、実施形態３２８の方法。
実施形態３３０。リンが、ホスホジエステル基に含まれる、実施形態３２９の方法。
実施形態３３１。標的化ドメインが、標的ＲＮＡとミスマッチである少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含む、実施形態３１９～３３０のいずれか１つの方法。
実施形態３３２。ミスマッチヌクレオチドが、標的ＲＮＡに相補的な２つのヌクレオチドに隣接しており、これが、ミスマッチヌクレオチドの両側に１つずつある、実施形態３３１の方法。
実施形態３３３。標的化ドメインが、約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドである、実施形態３１９～３３２のいずれか１つの方法。
実施形態３３４。改変ポリヌクレオチドが、約４０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドである、実施形態３１９～３３２のいずれか１つの方法。
実施形態３３５。改変ポリヌクレオチドが、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドである、実施形態３３４の方法。
実施形態３３６。改変ポリヌクレオチドが、約１４０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドである、実施形態３３４の方法。
実施形態３３７。改変ポリヌクレオチドが、約８０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドである、実施形態３３４の方法。
実施形態３３８。疾患または状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、または嚢胞性線維症を含む、実施形態３１９の方法。
実施形態３３９。標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な標的化ドメイン；ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン（ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインが、ＲＮＡ編集エンティティと少なくとも一時的に会合する）；及びスペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドであって、標的化ドメインまたはＲＮＡ編集動員ドメインが、スペーサードメインを含まず、改変ポリヌクレオチドが、一緒に共有結合している複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含み、主鎖が、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まず、標的化ドメインが、標的ＲＮＡのコード領域と少なくとも部分的に会合するように構成され、標的化ドメインが標的ＲＮＡのコード領域と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、改変ポリヌクレオチド。
実施形態３４０。標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である標的化ドメイン及びスペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドであって、スペーサードメインを含む改変ポリヌクレオチドが、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）（ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）で決定）と比較して低い、改変ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合のΔＧを有し、改変ポリヌクレオチドが、一緒に共有結合している複数の糖及びリン酸部分を含む主鎖を含み、主鎖が、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まず、標的化ドメインが、標的ＲＮＡのコード領域と少なくとも部分的に会合するように構成され、標的化ドメインが標的ＲＮＡのコード領域と会合すると、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、改変ポリヌクレオチド。
実施形態３４１。ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、（ｉｉ）改変ポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、ならびに、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡをシーケンシングすること、を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される、実施形態３４０の改変ポリヌクレオチド。
実施例１
環状ガイドＲＮＡは、複数の細胞株でＲＮＡ編集を２倍～４倍増加させ得る
本実施例では、環状及び線状のガイドＲＮＡをコードするプラスミドを、異なる細胞株にトランスフェクトして、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ領域のパーセントＲＮＡ編集を決定した。線状及び環状ガイドＲＮＡを導入した後、標的ＲＮＡのＳａｎｇｅｒシーケンシングで、ＲＮＡ編集を決定した。シーケンシングの前に、標的ＲＮＡを、逆転写酵素でｃＤＮＡに変換した。Ｓａｎｇｅｒトレースを解析して、編集効率を評価した。図１Ａ及び図１Ｂは、異なる細胞株バックグラウンドにおける設計１（線状ガイド）、設計２（線状ガイド）、及び設計３（環状ガイド）のＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ編集効率を示す。細胞株のバックグラウンドは、２９３Ｔ（ヒト胎児腎臓）、ＲＤ未分化型（ヒト胚横紋筋肉腫）、ＬＨＣＮ（ヒト骨格筋芽細胞）未分化型、及びＬＨＣＮ分化型を含んでいた。対照は、「トランスフェクションなし」として示される。図１Ａは、トランスフェクションの４８時間後のＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲのパーセントＲＮＡ編集を示し、図１Ｂは、トランスフェクションの９６時間後のＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲのパーセントＲＮＡ編集を示す。図１Ａ～Ｂでは、環状ガイド設計３は、試験された全ての細胞株における線状設計１と比較して、約２Ｘ～４Ｘのパーセント編集の増加を示した。
環状ガイドＲＮＡは、複数の細胞株でＲＮＡ編集を２倍～４倍増加させ得る
本実施例では、環状及び線状のガイドＲＮＡをコードするプラスミドを、異なる細胞株にトランスフェクトして、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ領域のパーセントＲＮＡ編集を決定した。線状及び環状ガイドＲＮＡを導入した後、標的ＲＮＡのＳａｎｇｅｒシーケンシングで、ＲＮＡ編集を決定した。シーケンシングの前に、標的ＲＮＡを、逆転写酵素でｃＤＮＡに変換した。Ｓａｎｇｅｒトレースを解析して、編集効率を評価した。図１Ａ及び図１Ｂは、異なる細胞株バックグラウンドにおける設計１（線状ガイド）、設計２（線状ガイド）、及び設計３（環状ガイド）のＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ編集効率を示す。細胞株のバックグラウンドは、２９３Ｔ（ヒト胎児腎臓）、ＲＤ未分化型（ヒト胚横紋筋肉腫）、ＬＨＣＮ（ヒト骨格筋芽細胞）未分化型、及びＬＨＣＮ分化型を含んでいた。対照は、「トランスフェクションなし」として示される。図１Ａは、トランスフェクションの４８時間後のＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲのパーセントＲＮＡ編集を示し、図１Ｂは、トランスフェクションの９６時間後のＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲのパーセントＲＮＡ編集を示す。図１Ａ～Ｂでは、環状ガイド設計３は、試験された全ての細胞株における線状設計１と比較して、約２Ｘ～４Ｘのパーセント編集の増加を示した。
実施例２
改変ガイドＲＮＡは、スペーサードメイン、ライゲーション配列ドメイン、リボザイム配列ドメイン、及び標的化ドメインを含み得る
図２を参照すると、２つのリボザイムドメイン、２つのライゲーション配列ドメイン、２つのスペーサードメイン、及び標的化ドメイン（１００．５０）を含む改変ガイドＲＮＡが示される。この例では、改変ガイドＲＮＡは、コードされたリボザイムの自己触媒反応により細胞内で環状化する。ガイドＲＮＡを環状化するために、改変ガイドＲＮＡが、内因性リガーゼによりライゲーション配列の５’及び３’末端の細胞内ＲＮＡライゲーションを受ける。環状ガイドＲＮＡは、本明細書に記載の機能を実施し得る（例えば、標的ＲＮＡにおいて編集を実施する）。
改変ガイドＲＮＡは、スペーサードメイン、ライゲーション配列ドメイン、リボザイム配列ドメイン、及び標的化ドメインを含み得る
図２を参照すると、２つのリボザイムドメイン、２つのライゲーション配列ドメイン、２つのスペーサードメイン、及び標的化ドメイン（１００．５０）を含む改変ガイドＲＮＡが示される。この例では、改変ガイドＲＮＡは、コードされたリボザイムの自己触媒反応により細胞内で環状化する。ガイドＲＮＡを環状化するために、改変ガイドＲＮＡが、内因性リガーゼによりライゲーション配列の５’及び３’末端の細胞内ＲＮＡライゲーションを受ける。環状ガイドＲＮＡは、本明細書に記載の機能を実施し得る（例えば、標的ＲＮＡにおいて編集を実施する）。
実施例３
細胞内で環状化することにより、環状改変ガイドＲＮＡを形成することができる
この例では、環状及び線状ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを、細胞にトランスフェクトして、細胞内で環状化が起こるかどうかを判定した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ガイドＲＮＡの１００．５０領域にアニールしたプライマーを用いて、ＰＣＲを実施した。プライマーを、３’末端及び５’末端まで増幅するように設計し、それにより、環状化が生じた場合に産物を生じた。図３Ｂは、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲによる改変ガイドＲＮＡの設計３及び設計５の環状化の確認を示した。線状ガイドＲＮＡ設計１及び設計４は、ガイドＲＮＡの環状化を検出するように設計されたプライマーを使用して増幅されなかったので、環状ガイドＲＮＡを生じなかった。線状ガイドＲＮＡは、細胞内での環状化を可能にするライゲーション配列を欠いていた。ＲＮＡ編集またはＲＮＡノックダウンの生成用に、環状改変ガイドＲＮＡを設計することができる。
細胞内で環状化することにより、環状改変ガイドＲＮＡを形成することができる
この例では、環状及び線状ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを、細胞にトランスフェクトして、細胞内で環状化が起こるかどうかを判定した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ガイドＲＮＡの１００．５０領域にアニールしたプライマーを用いて、ＰＣＲを実施した。プライマーを、３’末端及び５’末端まで増幅するように設計し、それにより、環状化が生じた場合に産物を生じた。図３Ｂは、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲによる改変ガイドＲＮＡの設計３及び設計５の環状化の確認を示した。線状ガイドＲＮＡ設計１及び設計４は、ガイドＲＮＡの環状化を検出するように設計されたプライマーを使用して増幅されなかったので、環状ガイドＲＮＡを生じなかった。線状ガイドＲＮＡは、細胞内での環状化を可能にするライゲーション配列を欠いていた。ＲＮＡ編集またはＲＮＡノックダウンの生成用に、環状改変ガイドＲＮＡを設計することができる。
実施例４
ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡの複数の位置で生じ得る
環状ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトして、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ領域の様々な位置での環状ガイドＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集を決定した。トランスフェクションは、２０，０００個のＷＴ ＨＥＫ２９３細胞当たり１μｇのプラスミドを用いた。標的ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写後の標的ＲＮＡのＳａｎｇｅｒシーケンシングで、パーセントＲＮＡ編集を決定した。Ｓａｎｇｅｒトレースを解析して、編集効率を評価した。図４は、設計３（環状ガイド）由来のＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ及び対照ＧＦＰプラスミドにおける様々なアデノシンヌクレオチドのパーセントＲＮＡ編集を示した。編集されたヌクレオチド位置は、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ配列に示される。設計３ガイドＲＮＡは、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ配列の－３、－２、－１、及び＋１位のヌクレオチドを編集することが示された。最も高いパーセントＲＮＡ編集は、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ配列内の－３位で生じた。
ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡの複数の位置で生じ得る
環状ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトして、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ領域の様々な位置での環状ガイドＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集を決定した。トランスフェクションは、２０，０００個のＷＴ ＨＥＫ２９３細胞当たり１μｇのプラスミドを用いた。標的ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写後の標的ＲＮＡのＳａｎｇｅｒシーケンシングで、パーセントＲＮＡ編集を決定した。Ｓａｎｇｅｒトレースを解析して、編集効率を評価した。図４は、設計３（環状ガイド）由来のＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ及び対照ＧＦＰプラスミドにおける様々なアデノシンヌクレオチドのパーセントＲＮＡ編集を示した。編集されたヌクレオチド位置は、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ配列に示される。設計３ガイドＲＮＡは、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ配列の－３、－２、－１、及び＋１位のヌクレオチドを編集することが示された。最も高いパーセントＲＮＡ編集は、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ配列内の－３位で生じた。
実施例５
環状ガイドＲＮＡは、線状ガイドＲＮＡと比較して、細胞内で経時的にＲＮＡ編集を増加させている
Ｒａｂ７ａ ＵＴＲを標的とする環状及び線状のガイドＲＮＡをコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。１マイクログラムのプラスミドを、約２０，０００個のＷＴ ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、経時的なパーセントＲＮＡ編集（４８時間及び９６時間）を決定した。標的ＲＮＡが逆転写酵素によりｃＤＮＡに変換された後のＳａｎｇｅｒシーケンシングで、標的ＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集を決定した。Ｓａｎｇｅｒトレースを解析して、編集効率を評価した。図５は、環状ガイドＲＮＡの設計５及び設計３と比較した、線状ガイドＲＮＡの設計１及び設計４からのＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲにおけるヌクレオチドのパーセントＲＮＡ編集を示す。対照ＧＦＰプラスミドが、実験に含まれた。設計５及び設計３ガイドＲＮＡでは、線状ガイドＲＮＡと比較して、４８時間及び９６時間でより高いレベルのＲＮＡ編集が示された。編集の増加は、線状ガイドＲＮＡと比較して環状ガイドＲＮＡの安定性の向上に起因する可能性がある。
環状ガイドＲＮＡは、線状ガイドＲＮＡと比較して、細胞内で経時的にＲＮＡ編集を増加させている
Ｒａｂ７ａ ＵＴＲを標的とする環状及び線状のガイドＲＮＡをコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。１マイクログラムのプラスミドを、約２０，０００個のＷＴ ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、経時的なパーセントＲＮＡ編集（４８時間及び９６時間）を決定した。標的ＲＮＡが逆転写酵素によりｃＤＮＡに変換された後のＳａｎｇｅｒシーケンシングで、標的ＲＮＡのパーセントＲＮＡ編集を決定した。Ｓａｎｇｅｒトレースを解析して、編集効率を評価した。図５は、環状ガイドＲＮＡの設計５及び設計３と比較した、線状ガイドＲＮＡの設計１及び設計４からのＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲにおけるヌクレオチドのパーセントＲＮＡ編集を示す。対照ＧＦＰプラスミドが、実験に含まれた。設計５及び設計３ガイドＲＮＡでは、線状ガイドＲＮＡと比較して、４８時間及び９６時間でより高いレベルのＲＮＡ編集が示された。編集の増加は、線状ガイドＲＮＡと比較して環状ガイドＲＮＡの安定性の向上に起因する可能性がある。
実施例６
環状ガイドＲＮＡ及び線状ガイドＲＮＡは、３’ＵＴＲを標的にすることにより、α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ＲＮＡを編集及びノックダウンし得る
線状及び環状ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを、細胞にトランスフェクトした。３’ＵＴＲ ＳＮＣＡ ｍＲＮＡを標的とするように、ガイドＲＮＡを設計した。標的ｍＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換し、４０時間及び７２時間後にＳａｎｇｅｒシーケンシングでシーケンシングして、編集されたＳＮＣＡ ＲＮＡのパーセントを決定し、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのノックダウンを定量的逆転写酵素ＰＣＲで４０時間及び７２時間で決定した。Ｓａｎｇｅｒトレースを解析して、編集効率を評価した。図６Ａは、パーセントＲＮＡ編集を示し、図６Ｂは、線状ガイドＲＮＡ（ガイド１～７）及び環状ガイドＲＮＡ（ガイド８、ガイド９、及びＲａｂ７）からの４０及び７２時間後の３’ＵＴＲ ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのパーセントノックダウンを示す。Ｒａｂ７環状ＲＮＡは、ＳＮＣＡのコード領域を標的としており、対照として含まれ、コード領域を標的とする場合、ＲＮＡ編集が環状ガイドにより高い割合で生じたことを示す。グラフの下部は、外因的に追加されたＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２の有無を示す。環状ガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲの編集に関して、線状ガイド１～４と比較して、低い編集レベルを示した。しかし、環状ガイドＲＮＡは、線状ガイドＲＮＡと比較してＳＮＣＡ ｍＲＮＡのノックダウンの増加を示した。環状ガイドのノックダウン効率の増加は、ＡＤＡＲと無関係である可能性がある。
環状ガイドＲＮＡ及び線状ガイドＲＮＡは、３’ＵＴＲを標的にすることにより、α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ＲＮＡを編集及びノックダウンし得る
線状及び環状ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを、細胞にトランスフェクトした。３’ＵＴＲ ＳＮＣＡ ｍＲＮＡを標的とするように、ガイドＲＮＡを設計した。標的ｍＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換し、４０時間及び７２時間後にＳａｎｇｅｒシーケンシングでシーケンシングして、編集されたＳＮＣＡ ＲＮＡのパーセントを決定し、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのノックダウンを定量的逆転写酵素ＰＣＲで４０時間及び７２時間で決定した。Ｓａｎｇｅｒトレースを解析して、編集効率を評価した。図６Ａは、パーセントＲＮＡ編集を示し、図６Ｂは、線状ガイドＲＮＡ（ガイド１～７）及び環状ガイドＲＮＡ（ガイド８、ガイド９、及びＲａｂ７）からの４０及び７２時間後の３’ＵＴＲ ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのパーセントノックダウンを示す。Ｒａｂ７環状ＲＮＡは、ＳＮＣＡのコード領域を標的としており、対照として含まれ、コード領域を標的とする場合、ＲＮＡ編集が環状ガイドにより高い割合で生じたことを示す。グラフの下部は、外因的に追加されたＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２の有無を示す。環状ガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲの編集に関して、線状ガイド１～４と比較して、低い編集レベルを示した。しかし、環状ガイドＲＮＡは、線状ガイドＲＮＡと比較してＳＮＣＡ ｍＲＮＡのノックダウンの増加を示した。環状ガイドのノックダウン効率の増加は、ＡＤＡＲと無関係である可能性がある。
実施例７
ｓｃＡＡＶ２を使用した環状及び線状ガイドでは、高レベルの形質導入が観察された。ｅＧＦＰレポーター及びｈＵ６駆動の環状ガイドまたはＲａｂ７ａの３’ＵＴＲを標的とする線状ガイドで、ベクター（ｓｃＡＡＶ ＧＯＩプラスミド）を構築した。ＧＯＩプラスミド、ｐＲＣ２（Ｒｅｐ２／Ｃａｐ２）、及びアデノウイルスヘルパープラスミドのトリプルトランスフェクションを用いて、ｓｃＡＡＶ２ウイルスを生成した。ウイルスを精製し、定量した。図７は、１×１０＾５ｖｇｓ／細胞（細胞当たりのウイルスゲノム）で感染させ、感染の２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に採取された細胞を示す。実験に使用された細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＷＴ（ＡＤＡＲ１））細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＤＡＲ１ノックアウト＋ＡＤＡＲ２）細胞であった（グラフの上部に示す）。ＧＦＰ陽性細胞は、線状及び環状のガイドＲＮＡをコードするベクターの成功した形質導入を示す。形質導入後、フローサイトメトリーでＧＦＰ陽性を測定し、全ての時点で全ての細胞株で、９７％を超えるＧＦＰ陽性細胞が検出された。
ｓｃＡＡＶ２を使用した環状及び線状ガイドでは、高レベルの形質導入が観察された。ｅＧＦＰレポーター及びｈＵ６駆動の環状ガイドまたはＲａｂ７ａの３’ＵＴＲを標的とする線状ガイドで、ベクター（ｓｃＡＡＶ ＧＯＩプラスミド）を構築した。ＧＯＩプラスミド、ｐＲＣ２（Ｒｅｐ２／Ｃａｐ２）、及びアデノウイルスヘルパープラスミドのトリプルトランスフェクションを用いて、ｓｃＡＡＶ２ウイルスを生成した。ウイルスを精製し、定量した。図７は、１×１０＾５ｖｇｓ／細胞（細胞当たりのウイルスゲノム）で感染させ、感染の２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に採取された細胞を示す。実験に使用された細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＷＴ（ＡＤＡＲ１））細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＤＡＲ１ノックアウト＋ＡＤＡＲ２）細胞であった（グラフの上部に示す）。ＧＦＰ陽性細胞は、線状及び環状のガイドＲＮＡをコードするベクターの成功した形質導入を示す。形質導入後、フローサイトメトリーでＧＦＰ陽性を測定し、全ての時点で全ての細胞株で、９７％を超えるＧＦＰ陽性細胞が検出された。
実施例８
環状ガイドＲＮＡは、長期間、細胞内の標的を編集し得る
編集は、環状ガイドで７２時間観察された。図８は、線状及び環状の改変ガイドＲＮＡをコードするベクターで形質導入された細胞におけるＲａｂ７ａ ３’ＵＴＲのパーセントＲＮＡ編集を示す。ｅＧＦＰレポーター及びｈＵ６駆動の環状ガイドまたはＲａｂ７ａの３’ＵＴＲを標的とする線状ガイドで、ベクター（ｓｃＡＡＶ ＧＯＩプラスミド）を構築した。ＧＯＩプラスミド、ｐＲＣ２（Ｒｅｐ２／Ｃａｐ２）、及びアデノウイルスヘルパープラスミドのトリプルトランスフェクションを用いて、ｓｃＡＡＶ２ウイルスを生成した。ウイルスを精製し、定量した。細胞を、１Ｘ１０＾５ｖｇｓ／細胞で感染させ、感染の２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に採取した。実験に使用された細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＷＴ（ＡＤＡＲ１））細胞及びＨＥＫ２９３（ＡＤＡＲ１ノックアウト＋ＡＤＡＲ２）細胞であった（グラフの上部に示す）。ＨＥＫ２９３（ＡＤＡＲ１ノックアウト＋ＡＤＡＲ２）細胞は、ＡＤＡＲ２を発現するがＡＤＡＲ１を発現しないように改変されている。線状及び環状ガイドＲＮＡをコードするベクターで形質導入された細胞について、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ ｍＲＮＡのパーセント編集を２４時間、４８時間、及び７２時間で測定した。編集を決定するために、ＲＮＡを細胞から採取し、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ ｃＤＮＡを逆転写で生成した。これは、以下のステップを含んでいた：ＲＮＡをオリゴｄＴプライマーと共に９５℃で３分間インキュベートし、合成を４８℃で１時間行い、次に、８０℃で５分間変性させた。ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、Ｒａｂ７の３’ＵＴＲのＰＣＲアンプリコンをＳａｎｇｅｒシーケンシングし、トレース解析で解析して、編集を測定した。環状ガイドでは、ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｒａｂ７ａ転写物の６５～６９％がＡ－Ｇ編集され、線状ガイドでは、ほとんど編集が観察されなかった。さらに、ＡＤＡＲ２のみを発現する細胞は、ＷＴ ＡＤＡＲ１発現細胞よりも環状での編集が低かった。
環状ガイドＲＮＡは、長期間、細胞内の標的を編集し得る
編集は、環状ガイドで７２時間観察された。図８は、線状及び環状の改変ガイドＲＮＡをコードするベクターで形質導入された細胞におけるＲａｂ７ａ ３’ＵＴＲのパーセントＲＮＡ編集を示す。ｅＧＦＰレポーター及びｈＵ６駆動の環状ガイドまたはＲａｂ７ａの３’ＵＴＲを標的とする線状ガイドで、ベクター（ｓｃＡＡＶ ＧＯＩプラスミド）を構築した。ＧＯＩプラスミド、ｐＲＣ２（Ｒｅｐ２／Ｃａｐ２）、及びアデノウイルスヘルパープラスミドのトリプルトランスフェクションを用いて、ｓｃＡＡＶ２ウイルスを生成した。ウイルスを精製し、定量した。細胞を、１Ｘ１０＾５ｖｇｓ／細胞で感染させ、感染の２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に採取した。実験に使用された細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＷＴ（ＡＤＡＲ１））細胞及びＨＥＫ２９３（ＡＤＡＲ１ノックアウト＋ＡＤＡＲ２）細胞であった（グラフの上部に示す）。ＨＥＫ２９３（ＡＤＡＲ１ノックアウト＋ＡＤＡＲ２）細胞は、ＡＤＡＲ２を発現するがＡＤＡＲ１を発現しないように改変されている。線状及び環状ガイドＲＮＡをコードするベクターで形質導入された細胞について、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ ｍＲＮＡのパーセント編集を２４時間、４８時間、及び７２時間で測定した。編集を決定するために、ＲＮＡを細胞から採取し、Ｒａｂ７ａ ３’ＵＴＲ ｃＤＮＡを逆転写で生成した。これは、以下のステップを含んでいた：ＲＮＡをオリゴｄＴプライマーと共に９５℃で３分間インキュベートし、合成を４８℃で１時間行い、次に、８０℃で５分間変性させた。ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、Ｒａｂ７の３’ＵＴＲのＰＣＲアンプリコンをＳａｎｇｅｒシーケンシングし、トレース解析で解析して、編集を測定した。環状ガイドでは、ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｒａｂ７ａ転写物の６５～６９％がＡ－Ｇ編集され、線状ガイドでは、ほとんど編集が観察されなかった。さらに、ＡＤＡＲ２のみを発現する細胞は、ＷＴ ＡＤＡＲ１発現細胞よりも環状での編集が低かった。
実施例９
環状ガイドＲＮＡの環状化は、長期間生じる
環状ＲＮＡガイドの環状化は、７２時間観察された。図９は、線状ガイドＲＮＡ、環状ガイドＲＮＡ、及び対照（非感染）細胞株の環状化の有無を示すＰＣＲ産物を有するアガロースゲルを示す。ｅＧＦＰレポーター及びｈＵ６駆動の環状ガイドまたはＲａｂ７ａの３’ＵＴＲを標的とする線状ガイドで、ベクター（ｓｃＡＡＶ ＧＯＩプラスミド）を構築した。ＧＯＩプラスミド、ｐＲＣ２（Ｒｅｐ２／Ｃａｐ２）、及びアデノウイルスヘルパープラスミドのトリプルトランスフェクションを用いて、ｓｃＡＡＶ２ウイルスを生成した。ウイルスを精製し、定量した。細胞を、１Ｘ１０＾５ｖｇｓ／細胞で感染させ、感染の２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に採取した。実験に使用された細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔであった。ＧＯＩプラスミドを含有するｓｃＡＡＶ２ウイルスで形質導入した後、ＲＮＡを、ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から採取し、ｃＤＮＡに逆転写した。ガイドＲＮＡの末端に結合し、ガイドが環状化された場合に産物が形成されるように、外側に向けられるプライマーを使用して実施されたＰＣＲにより、環状ガイド形成を評価した。ゲルに示されるように、全ての時点で、環状ガイド感染細胞において、環状ガイドＲＮＡを検出した。
環状ガイドＲＮＡの環状化は、長期間生じる
環状ＲＮＡガイドの環状化は、７２時間観察された。図９は、線状ガイドＲＮＡ、環状ガイドＲＮＡ、及び対照（非感染）細胞株の環状化の有無を示すＰＣＲ産物を有するアガロースゲルを示す。ｅＧＦＰレポーター及びｈＵ６駆動の環状ガイドまたはＲａｂ７ａの３’ＵＴＲを標的とする線状ガイドで、ベクター（ｓｃＡＡＶ ＧＯＩプラスミド）を構築した。ＧＯＩプラスミド、ｐＲＣ２（Ｒｅｐ２／Ｃａｐ２）、及びアデノウイルスヘルパープラスミドのトリプルトランスフェクションを用いて、ｓｃＡＡＶ２ウイルスを生成した。ウイルスを精製し、定量した。細胞を、１Ｘ１０＾５ｖｇｓ／細胞で感染させ、感染の２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に採取した。実験に使用された細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔであった。ＧＯＩプラスミドを含有するｓｃＡＡＶ２ウイルスで形質導入した後、ＲＮＡを、ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から採取し、ｃＤＮＡに逆転写した。ガイドＲＮＡの末端に結合し、ガイドが環状化された場合に産物が形成されるように、外側に向けられるプライマーを使用して実施されたＰＣＲにより、環状ガイド形成を評価した。ゲルに示されるように、全ての時点で、環状ガイド感染細胞において、環状ガイドＲＮＡを検出した。
実施例１０
環状ガイドを、バックススプライシングで作成することができる
図１０は、環状ガイドＲＮＡを作製する方法の図解を示す。ＲＮＡは、５’から３’へ、順方向相補配列イントロン、エクソン（ガイド配列を含む）、続いて、逆方向相補配列イントロンを含むように改変される。転写されると、相補配列イントロンが、ハイブリダイズして、ｄｓＲＮＡを形成する。環状ガイドを形成するために、ガイド配列を含有するエクソンが、スプライシングにより除去され、内因性リガーゼでラーゲーションされる。いくつかの場合では、ガイドは、バックスプライシング反応で環状化される。
環状ガイドを、バックススプライシングで作成することができる
図１０は、環状ガイドＲＮＡを作製する方法の図解を示す。ＲＮＡは、５’から３’へ、順方向相補配列イントロン、エクソン（ガイド配列を含む）、続いて、逆方向相補配列イントロンを含むように改変される。転写されると、相補配列イントロンが、ハイブリダイズして、ｄｓＲＮＡを形成する。環状ガイドを形成するために、ガイド配列を含有するエクソンが、スプライシングにより除去され、内因性リガーゼでラーゲーションされる。いくつかの場合では、ガイドは、バックスプライシング反応で環状化される。
実施例１１
環状ガイドＲＮＡの医薬組成物及び対象の処置
対象が、疾患を有すると診断される。対象は、医薬組成物の投与計画を規定される。医薬組成物は、環状の改変ガイドＲＮＡを含む。環状改変ガイドＲＮＡは、標的化ドメイン、スペーサードメイン、及びヌクレオチドの編集を行うＲＮＡ編集エンティティを動員することが可能なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。医薬組成物は、注射により組み換えＲＮＡ編集酵素と共に対象に同時投与される。医薬組成物は、環状改変ガイドＲＮＡ及び組み換えＲＮＡ編集酵素を含むナノ粒子を含む。投与計画は、疾患を処置するのに有効な量を含む。
環状ガイドＲＮＡの医薬組成物及び対象の処置
対象が、疾患を有すると診断される。対象は、医薬組成物の投与計画を規定される。医薬組成物は、環状の改変ガイドＲＮＡを含む。環状改変ガイドＲＮＡは、標的化ドメイン、スペーサードメイン、及びヌクレオチドの編集を行うＲＮＡ編集エンティティを動員することが可能なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。医薬組成物は、注射により組み換えＲＮＡ編集酵素と共に対象に同時投与される。医薬組成物は、環状改変ガイドＲＮＡ及び組み換えＲＮＡ編集酵素を含むナノ粒子を含む。投与計画は、疾患を処置するのに有効な量を含む。
実施例１２
アプタマーを含む環状ガイドＲＮＡ
改変ガイドＲＮＡを得ることにより、環状の改変ガイドＲＮＡが形成される。改変ガイドＲＮＡは、標的化ドメイン、スペーサードメイン、及びヌクレオチドの編集を行うＲＮＡ編集エンティティを動員することが可能なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。アプタマーは、改変ガイドＲＮＡの両端に追加される。アプタマー間に共有結合を形成し、それにより、環状の改変ガイドＲＮＡを形成するために、リガーゼを、改変ガイドＲＮＡの各末端でアプタマーと接触させる。環状の改変ガイドＲＮＡは、環状ではない同等の改変ガイドＲＮＡの２次構造と比較して、２次構造を実質的に保持するであろう。
アプタマーを含む環状ガイドＲＮＡ
改変ガイドＲＮＡを得ることにより、環状の改変ガイドＲＮＡが形成される。改変ガイドＲＮＡは、標的化ドメイン、スペーサードメイン、及びヌクレオチドの編集を行うＲＮＡ編集エンティティを動員することが可能なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。アプタマーは、改変ガイドＲＮＡの両端に追加される。アプタマー間に共有結合を形成し、それにより、環状の改変ガイドＲＮＡを形成するために、リガーゼを、改変ガイドＲＮＡの各末端でアプタマーと接触させる。環状の改変ガイドＲＮＡは、環状ではない同等の改変ガイドＲＮＡの２次構造と比較して、２次構造を実質的に保持するであろう。
実施例１３
対象が、疾患を有すると診断される。対象は、医薬組成物の投与計画を規定される。医薬組成物は、環状の改変ガイドＲＮＡを含む。環状改変ガイドＲＮＡは、標的化ドメイン、スペーサードメイン、及びヌクレオチドの編集を行うＲＮＡ編集エンティティを動員することが可能なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。医薬組成物は、注射で対象に投与される。環状の改変ガイドＲＮＡの投与計画は、環状ではない同等の改変ガイドＲＮＡを注射により投与される対象よりも２分の１以下の頻度になる。投与計画は、疾患を処置するのに有効な量を含む。
対象が、疾患を有すると診断される。対象は、医薬組成物の投与計画を規定される。医薬組成物は、環状の改変ガイドＲＮＡを含む。環状改変ガイドＲＮＡは、標的化ドメイン、スペーサードメイン、及びヌクレオチドの編集を行うＲＮＡ編集エンティティを動員することが可能なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。医薬組成物は、注射で対象に投与される。環状の改変ガイドＲＮＡの投与計画は、環状ではない同等の改変ガイドＲＮＡを注射により投与される対象よりも２分の１以下の頻度になる。投与計画は、疾患を処置するのに有効な量を含む。
実施例１４
対象の処置のためのＡＡＶ送達環状ガイドＲＮＡ
対象が、疾患を有すると診断される。対象は、医薬組成物の投与計画を規定される。医薬組成物は、環状の改変ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを含むウイルスベクターを含む。環状の改変ガイドＲＮＡは、リボザイムドメイン、ライゲーション配列ドメイン、スペーサードメイン、標的化ドメイン、及びヌクレオチドの編集を行うＲＮＡ編集エンティティを動員することが可能なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。医薬組成物は、注射で対象に投与される。環状の改変ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを含むウイルスベクターの投与計画は、環状ではない同等の改変ガイドＲＮＡを注射により投与される対象よりも２分の１の頻度になる。投与計画は、疾患を処置するのに有効な量を含む。
対象の処置のためのＡＡＶ送達環状ガイドＲＮＡ
対象が、疾患を有すると診断される。対象は、医薬組成物の投与計画を規定される。医薬組成物は、環状の改変ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを含むウイルスベクターを含む。環状の改変ガイドＲＮＡは、リボザイムドメイン、ライゲーション配列ドメイン、スペーサードメイン、標的化ドメイン、及びヌクレオチドの編集を行うＲＮＡ編集エンティティを動員することが可能なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。医薬組成物は、注射で対象に投与される。環状の改変ガイドＲＮＡをコードするプラスミドを含むウイルスベクターの投与計画は、環状ではない同等の改変ガイドＲＮＡを注射により投与される対象よりも２分の１の頻度になる。投与計画は、疾患を処置するのに有効な量を含む。
実施例１５
環状ガイドＲＮＡを用いるＲＡＢ７Ａ編集
本実施例は、ｉＰＳＣ由来の神経細胞における、本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＲＡＢ７Ａ編集について記載し、環状ガイドＲＮＡを、ＡＡＶにより送達した。ＡＡＶ２／２発現ＧＦＰ（対照）またはＲａｂ７ガイド（Ｒａｂ７Ｕ６線状、Ｒａｂ７ Ｕ７ ｓｍＯＰＴ及びＲａｂ７ Ｕ６環状）を用いる感染前に、少なくとも６日間、二重ＳＭＡＤ阻害を使用して、ｉＰＳＣを神経系統に誘導した。これらの構築物のそれぞれにおけるガイドＲＮＡの配列は、ＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡ（配列番号２３）である。細胞を、おおむね、２４ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０＾５細胞でプレーティングし、特定のｖｇ／細胞で感染させた。感染の４８時間、７２時間、または７日後に、ｍＲＮＡを単離し、ｄｄＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングでＲａｂ７編集を評価した。図１２及び１５では、ＩｍａｇｅＪを使用して、画像を定量することにより、形質導入効率を評価した。まとめると、ＧＦＰ＋シグナルを捕捉した各ウェルの画像と、同じ実視野の明視野画像を撮影した。ＧＦＰ＋シグナルを閾値処理し、陽性シグナルの面積を測定した。同様に、細胞を含有した明視野画像の面積を閾値処理し、陽性シグナルの面積を測定した。ＧＦＰ＋面積を、細胞面積で除し、パーセント形質導入を得た。
環状ガイドＲＮＡを用いるＲＡＢ７Ａ編集
本実施例は、ｉＰＳＣ由来の神経細胞における、本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＲＡＢ７Ａ編集について記載し、環状ガイドＲＮＡを、ＡＡＶにより送達した。ＡＡＶ２／２発現ＧＦＰ（対照）またはＲａｂ７ガイド（Ｒａｂ７Ｕ６線状、Ｒａｂ７ Ｕ７ ｓｍＯＰＴ及びＲａｂ７ Ｕ６環状）を用いる感染前に、少なくとも６日間、二重ＳＭＡＤ阻害を使用して、ｉＰＳＣを神経系統に誘導した。これらの構築物のそれぞれにおけるガイドＲＮＡの配列は、ＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡ（配列番号２３）である。細胞を、おおむね、２４ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０＾５細胞でプレーティングし、特定のｖｇ／細胞で感染させた。感染の４８時間、７２時間、または７日後に、ｍＲＮＡを単離し、ｄｄＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングでＲａｂ７編集を評価した。図１２及び１５では、ＩｍａｇｅＪを使用して、画像を定量することにより、形質導入効率を評価した。まとめると、ＧＦＰ＋シグナルを捕捉した各ウェルの画像と、同じ実視野の明視野画像を撮影した。ＧＦＰ＋シグナルを閾値処理し、陽性シグナルの面積を測定した。同様に、細胞を含有した明視野画像の面積を閾値処理し、陽性シグナルの面積を測定した。ＧＦＰ＋面積を、細胞面積で除し、パーセント形質導入を得た。
ｉＰＳＣを、様々なｖｇ／細胞で４８または７２時間形質導入し、分化の８または９日目に収集した。Ｒａｂ７編集を、ｄｄＰＣＲで測定した。環状ガイドＲＮＡのＰＣＲ産物のゲルは、形質導入後最大少なくとも７日間まで、ｉＰＳＣ由来ニューロンで環状ガイドＲＮＡ ＰＣＲ産物が検出可能であることを示した。
図１１Ａに示されるように、ｖｇ／細胞が増加するにつれて、Ｒａｂ７編集において用量依存的な増加があった。データは、生物学的複製、平均＋／－ＳＥＭを表す。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングでも、Ｒａｂ７編集を測定した。図１１Ｂに示されるように、ｖｇ／細胞が増加するにつれて、Ｒａｂ７編集において用量依存的な増加がある。編集を定量するためのｄｄＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングのアプローチは、非常に類似した結果を生じる。データは、生物学的複製、平均＋／－ＳＥＭを表す。ｉＰＳＣを、様々なｖｇ／細胞で７２時間または７日間形質導入し、分化から１７日以上で採取した。Ｒａｂ７編集を、ｄｄＰＣＲで測定した。図１１Ｃで示されるように、編集は、７２時間でより未成熟な培養物よりも完全に成熟したニューロンにおいて、はるかに低かったが、編集は、感染の７日後で、より未成熟な培養物と同じレベルに達した。このデータは、ニューロンが成熟するほど、環状ガイドＲＮＡを作成するのに長い時間がかかることを意味する可能性がある。データは、生物学的複製、平均＋／－ＳＥＭを表す。
図１２Ａは、分化の９日後、感染の７２時間後に、採取された細胞におけるＲａｂ７編集効率に対してプロットされた％形質導入を示す。ドットのグレースケールは、細胞が処置されたウイルスの力価を表す。ウイルス力価は、形質導入効率に直接関係している。図１２Ｂは、種々の分化日数後及び感染時点で採取された細胞におけるＲａｂ７編集効率に対してプロットされた％形質導入を示す。ドット及び形状は、分化の日数を表し、ドットのサイズは、細胞が処置されたウイルスの力価を表す。編集及び形質導入は、より未熟な培養物よりも完全に成熟したニューロンにおいて、時間がかかる可能性がある。
ｉＰＳＣを、様々なｖｇ／細胞で４８または７２時間形質導入し、分化の８または９日目に収集した。Ｒａｂ７編集を、ｄｄＰＣＲで測定した。図１３Ａに示されるように、ｖｇ／細胞が増加するにつれて、Ｒａｂ７編集において用量依存的な増加がある。データは、生物学的複製、平均＋／－ＳＥＭを表す。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングでも、Ｒａｂ７編集を測定した。図１３Ｂに示されるように、ｖｇ／細胞が増加するにつれて、Ｒａｂ７編集において用量依存的な増加がある。編集を定量するためのｄｄＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングのアプローチは、非常に類似した結果を生じる。データは、生物学的複製、平均＋／－ＳＥＭを表す。図１３Ｃでは、７２時間または７日間、ｉＰＳＣを、種々のｖｇ／細胞で形質導入し、分化から１７日以上で採取した。Ｒａｂ７編集を、ｄｄＰＣＲで測定した。データは、生物学的複製、平均＋／－ＳＥＭを表す。
図１４Ａは、分化の９日後、感染の７２時間後に採取された細胞におけるＲａｂ７編集効率に対してプロットされた％形質導入を示す。ドットのグレースケールは、細胞が処置されたウイルスの力価を表す。ウイルス力価は、形質導入効率に直接関係している。図１４Ｂは、種々の分化日数後に採取された細胞におけるＲａｂ７編集効率に対してプロットされた％形質導入を示す。ドット及び形状は、分化の日数を表し、ドットのサイズは、細胞が処置されたウイルスの力価を表す。
図１５は、オフターゲット編集プロファイルを示す。Ｒａｂ７ Ｕ６環状ガイドは、Ｕ７ ｓｍＯＰＴ線状ガイドよりも多くのオフターゲット編集を生成する。
実施例１６
ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎ編集
本実施例は、線状及び環状のガイドＲＮＡを使用したＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎ編集について説明する。Ｐｉｇｇｙｂａｃ主鎖ベクターを使用して、ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎミニ遺伝子構築物を設計した。図１６は、ｐｉｇｇｙＢａｃ ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎミニ遺伝子の図を示し、実験計画を要約する。ＷＴまたはａｄａｒ１ノックアウト（ａｄａｒ１ ＫＯ）のいずれかであるＫ５６２細胞を、Ｐｉｇｇｙｂａｃ主鎖ベクターで形質転換した。ピューロマイシン薬物選択により、クローンの集団を選択した。ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎミニ遺伝子に対する線状及び環状ガイドＲＮＡを設計し、以下の表３に記載される。
ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎ編集
本実施例は、線状及び環状のガイドＲＮＡを使用したＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎ編集について説明する。Ｐｉｇｇｙｂａｃ主鎖ベクターを使用して、ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎミニ遺伝子構築物を設計した。図１６は、ｐｉｇｇｙＢａｃ ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎミニ遺伝子の図を示し、実験計画を要約する。ＷＴまたはａｄａｒ１ノックアウト（ａｄａｒ１ ＫＯ）のいずれかであるＫ５６２細胞を、Ｐｉｇｇｙｂａｃ主鎖ベクターで形質転換した。ピューロマイシン薬物選択により、クローンの集団を選択した。ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎミニ遺伝子に対する線状及び環状ガイドＲＮＡを設計し、以下の表３に記載される。
約５００Ｋの細胞（ＷＴ及びａｄａｒ１ ＫＯ）を、１ｕｇのガイドＲＮＡでヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの１８時間後、全ＲＮＡを、ヌクレオフェクトされた細胞から精製し、ｃＤＮＡを作成し、ＰＣＲ反応を実施して、ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎ領域を増幅した。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを使用して、ＷＴ、ａｄａｒ１ ＫＯ、及びモックトランスフェクションにおけるＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎ標的アデノシンでの編集効率を定量した。環状ＲＮＡの存在を検証するために、ＰＣＲ反応を実施した。
図１７の左に示されるように、ＴＵＢＢ４Ａ Ｄ２４９Ｎミニ遺伝子におけるパーセント編集は、環状ガイドのみを発現するＫ５６２ ＷＴ細胞において顕著である。図１７の右は、環状ガイドＲＮＡに特異的なプライマーを用いるＰＣＲ産物を示す。サンプル５及び９のみが、正しいサイズのＰＣＲフラグメントを示している。
実施例１６
異なる長さのスペーサーを有する環状ガイドＲＮＡを用いたＲａｂ７Ａ編集
本実施例は、様々な長さのスペーサーを有する本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＲａｂ７Ａ編集について記載する。ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞（３０，０００細胞）を、ガイドＲＮＡまたは対照をコードする１００ｎｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーに変換した。ＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングを実施した。ＥｄｉｔＲソフトウェアを使用して、パーセント編集を決定した。試験されたガイドＲＮＡ及びスペーサーの配列は、以下の表４に示される。図１８に見られるように、より長いスペーサーを有する環状ガイドは、より高いレベルのＲＮＡ編集を促進した。
異なる長さのスペーサーを有する環状ガイドＲＮＡを用いたＲａｂ７Ａ編集
本実施例は、様々な長さのスペーサーを有する本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＲａｂ７Ａ編集について記載する。ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞（３０，０００細胞）を、ガイドＲＮＡまたは対照をコードする１００ｎｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーに変換した。ＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングを実施した。ＥｄｉｔＲソフトウェアを使用して、パーセント編集を決定した。試験されたガイドＲＮＡ及びスペーサーの配列は、以下の表４に示される。図１８に見られるように、より長いスペーサーを有する環状ガイドは、より高いレベルのＲＮＡ編集を促進した。
実施例１６
環状ガイドＲＮＡを用いるＬＲＲＫ２編集
本実施例は、本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＬＲＲＫ２編集について記載する。ガイドをコードする５００ｎｇのプラスミドで、２０，０００細胞をトランスフェクトした。試験された細胞は、Ｇ２０１９Ｓ変異を含有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされた、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞（図１９の対応するデータ、上部）、ならびに、ＡＤＡＲ２及びＧ２０１９Ｓ変異を含有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされた、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞を含む。
環状ガイドＲＮＡを用いるＬＲＲＫ２編集
本実施例は、本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＬＲＲＫ２編集について記載する。ガイドをコードする５００ｎｇのプラスミドで、２０，０００細胞をトランスフェクトした。試験された細胞は、Ｇ２０１９Ｓ変異を含有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされた、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞（図１９の対応するデータ、上部）、ならびに、ＡＤＡＲ２及びＧ２０１９Ｓ変異を含有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされた、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞を含む。
トランスフェクションの４８時間後に、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーに変換した。ＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシング解析を実施した。ＥｄｉｔＲプログラムを使用して、パーセント編集を決定した。ガイドＲＮＡは、ガイドの５’末端からＡ／Ｃミスマッチの改変８０塩基を有する１００塩基長である。ガイドＲＮＡは、５’－ＣＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＴＡＴＣＣＣＣＡＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡ－３’（配列番号３９）の配列を有する。図１９は、Ｇ２０１９Ｓ変異のオンターゲット及びオフターゲットＡＤＡＲ１編集ならびにＡＤＡＲ１＋ＡＤＡＲ２編集のグラフを示す。
実施例１７
環状ガイドＲＮＡを用いるＳＮＣＡ編集
本実施例は、Ｕ６プロモーターの制御下で環状ガイドＲＮＡをコードする本開示の構築物について記載し、ガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子の開始部位または翻訳開始部位（ＴＩＳ）（翻訳開始部位（ＴＳＳ）とも呼ばれる）を標的とするように設計される。エクソン２のヌクレオチド位置２６のＳＮＣＡ ＴＩＳアデノシンを標的とするように、ガイド構築物を設計した（エクソン１及びエクソン２を含む、ほとんどのＳＮＣＡバリアントのヌクレオチド位置２６４に対応する）。ＨＥＫ２９３細胞を、目的のガイドＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後（特に明記しない限り）に、ＲＮＡ編集を評価した。ＨＥＫ２９３細胞で自然に発現されるＡＤＡＲ１のみ、ならびにＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２について、ＲＮＡ編集を評価した。後者の実験では、ＡＤＡＲ２をコードするｐｉｇｇｙｂａｃベクターで、ＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトした。ＲＮＡ編集のレベルを、シーケンシングで定量し、ソフトウェアプログラムを使用して解析した。
環状ガイドＲＮＡを用いるＳＮＣＡ編集
本実施例は、Ｕ６プロモーターの制御下で環状ガイドＲＮＡをコードする本開示の構築物について記載し、ガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子の開始部位または翻訳開始部位（ＴＩＳ）（翻訳開始部位（ＴＳＳ）とも呼ばれる）を標的とするように設計される。エクソン２のヌクレオチド位置２６のＳＮＣＡ ＴＩＳアデノシンを標的とするように、ガイド構築物を設計した（エクソン１及びエクソン２を含む、ほとんどのＳＮＣＡバリアントのヌクレオチド位置２６４に対応する）。ＨＥＫ２９３細胞を、目的のガイドＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後（特に明記しない限り）に、ＲＮＡ編集を評価した。ＨＥＫ２９３細胞で自然に発現されるＡＤＡＲ１のみ、ならびにＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２について、ＲＮＡ編集を評価した。後者の実験では、ＡＤＡＲ２をコードするｐｉｇｇｙｂａｃベクターで、ＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトした。ＲＮＡ編集のレベルを、シーケンシングで定量し、ソフトウェアプログラムを使用して解析した。
図２０～図２４は、編集されるべき標的Ａ（ｘ軸上の「０」）でのＲＮＡ編集及びオフターゲット位置（「０」ではない位置で黒いバーとして表示）でのＲＮＡ編集のプロットを示す。生物学的複製は、各列に示される。
図２０～図２４に示されるガイドの配列は、以下の表５に記載される。以下の表５は、観察されたパーセントオンターゲットＲＮＡ編集についても記載する。
実施例１８
３’ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを含有する環状ガイドＲＮＡ
３’ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを有する１００ｎｔのアンチセンス（標的化）ガイドＲＮＡを、Ｐ３及びＰ１ ＲｔｃＢ環状リボザイム部位間に挿入し、ｍＵ７またはｈＵ６プロモーターを使用して、発現させた。２９３Ｔ細胞を、ガイドＲＮＡ構築物を発現する１μｇのプラスミド（内因性ＡＤＡＲレベル）でトランスフェクトし、４１時間後にＲＮＡを測定した。図２５Ａは、環状ＲＮＡ形態を示し、ガイド特異的プライマーを用いたＳａｎｇｅｒシーケンシングは、リボザイム部位が、環状ＲＮＡ内のアンチセンスガイド及び３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンと一緒に正確にライゲーションされていることを示す。
３’ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを含有する環状ガイドＲＮＡ
３’ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを有する１００ｎｔのアンチセンス（標的化）ガイドＲＮＡを、Ｐ３及びＰ１ ＲｔｃＢ環状リボザイム部位間に挿入し、ｍＵ７またはｈＵ６プロモーターを使用して、発現させた。２９３Ｔ細胞を、ガイドＲＮＡ構築物を発現する１μｇのプラスミド（内因性ＡＤＡＲレベル）でトランスフェクトし、４１時間後にＲＮＡを測定した。図２５Ａは、環状ＲＮＡ形態を示し、ガイド特異的プライマーを用いたＳａｎｇｅｒシーケンシングは、リボザイム部位が、環状ＲＮＡ内のアンチセンスガイド及び３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンと一緒に正確にライゲーションされていることを示す。
図２５Ｂは、Ｐ３及びＰ１ ＲｔｃＢ環状リボザイム部位間でクローン化されたＳｍ結合ドメイン、Ｕ７ステムループヘアピン、及びＲＮＡリンカー配列のいくつかの配列バリエーションを列挙する（上部パネル）。Ｓｍ結合ドメインの前に、ヒトＲＡＢ７Ａエクソン４、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ＳＮＣＡエクソン４、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ、ＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、またはＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とする１００ｎｔのアンチセンスガイドＲＮＡが環状ＲＮＡ内に含まれた。ｍＵ７またはｈＵ６プロモーターのいずれかを使用して、ガイドＲＮＡを発現させ、それぞれは、対応するターミネーター配列を有する。線状ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡに加えて、Ｓｍ結合ドメイン及びＵ７ステムループヘアピンを含有する環状化されたガイドＲＮＡは、標的転写産物も編集し得る（Ｓａｎｇｅｒシーケンシングで測定）（中央のパネル）。陰性対照として、異なる遺伝子を標的とする線状ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡを使用した。さらに、ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡの線状または環状形態のいずれも、ＨＰＲＴ１ハウスキーピング遺伝子と比較して、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲまたはＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ標的転写産物の遺伝子発現レベルを変化させなかった（ｄｄＰＣＲで測定）（左下のパネル）。線状ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡは、ＲＡＢ７Ａエクソン４の偶発的なスキッピングを最小限に抑えたのみであり、環状ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡは、検出可能なエクソンスキッピングを示さなかった（ＰＣＲ及びゲル電気泳動で測定）（右下のパネル）。
実施例１９
環状ガイドのＡＡＶ送達
ＡＡＶ２を介して筋肉及び２９３Ｔ細胞に、Ｒａｂ７ａ標的化環状ガイド（０．１００．５０）を送達した。図２６は、ＬＨＣＮ未分化型細胞及びＬＨＣＮ分化型細胞（５日分化）における、Ｒａｂ７ａ標的化環状ガイドを担持するＡＡＶ２ベクター（ＡＡＶ２－５６１）で形質導入された細胞、及びＡＡＶ２ベクターなしでＲａｂ７ａ標的化環状と接触させた細胞（ＮＯ ＡＡＶ）のパーセントＲＮＡ編集（Ｓａｎｇｅｒシーケンシングで決定）のグラフを示す。ＡＡＶ２ベクター内のガイドは、ＡＡＶ２ベクター内にないガイドと比較して編集を増加させている。図２７は、異なる感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ２ベクターにより送達されたＲａｂ７標的化環状ガイド、及びＡＡＶ２ベクター不在で送達されたＲａｂ７標的化環状ガイドによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＲＤ未分化型細胞、及びＬＨＣＮ未分化型細胞における、パーセントＲＮＡ編集（Ｓａｎｇｅｒシーケンシングで決定）のグラフを示す。トランスフェクションの４８時間後のパーセントＲＮＡ編集が示される。より高いＭＯＩでの形質導入は、ＲＮＡ編集の増加につながる。
環状ガイドのＡＡＶ送達
ＡＡＶ２を介して筋肉及び２９３Ｔ細胞に、Ｒａｂ７ａ標的化環状ガイド（０．１００．５０）を送達した。図２６は、ＬＨＣＮ未分化型細胞及びＬＨＣＮ分化型細胞（５日分化）における、Ｒａｂ７ａ標的化環状ガイドを担持するＡＡＶ２ベクター（ＡＡＶ２－５６１）で形質導入された細胞、及びＡＡＶ２ベクターなしでＲａｂ７ａ標的化環状と接触させた細胞（ＮＯ ＡＡＶ）のパーセントＲＮＡ編集（Ｓａｎｇｅｒシーケンシングで決定）のグラフを示す。ＡＡＶ２ベクター内のガイドは、ＡＡＶ２ベクター内にないガイドと比較して編集を増加させている。図２７は、異なる感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ２ベクターにより送達されたＲａｂ７標的化環状ガイド、及びＡＡＶ２ベクター不在で送達されたＲａｂ７標的化環状ガイドによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＲＤ未分化型細胞、及びＬＨＣＮ未分化型細胞における、パーセントＲＮＡ編集（Ｓａｎｇｅｒシーケンシングで決定）のグラフを示す。トランスフェクションの４８時間後のパーセントＲＮＡ編集が示される。より高いＭＯＩでの形質導入は、ＲＮＡ編集の増加につながる。
実施例２０
環状ガイドのＡＡＶ送達
本実施例は、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ変異を発現するように改変されたＨｅｐＧ２細胞のＲＡＢ７Ａを標的とする環状ガイドＲＮＡのＡＡＶ送達について説明する。ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ変異を有する親ＨｅｐＧ２細胞及び３つのＨｅｐＧ２クローン（クローン１、クローン２、及びクローン３）を含む、５０，０００個の細胞に、１００，０００のＭＯＩで、ＡＡＶ２を介して、ＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡ（配列番号２３）の配列を有するＲＡＢ７Ａ標的化環状ガイドＲＮＡを送達した。感染の４８時間後に、ｄｄＰＣＲドロップオフアッセイにより、ＲＡＢ７Ａ編集を定量した。図２８に示されるように、ガイドＲＮＡは、親細胞株及び３つのクローン全てで、ＲＡＢ７Ａの編集の成功を示した。
環状ガイドのＡＡＶ送達
本実施例は、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ変異を発現するように改変されたＨｅｐＧ２細胞のＲＡＢ７Ａを標的とする環状ガイドＲＮＡのＡＡＶ送達について説明する。ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ変異を有する親ＨｅｐＧ２細胞及び３つのＨｅｐＧ２クローン（クローン１、クローン２、及びクローン３）を含む、５０，０００個の細胞に、１００，０００のＭＯＩで、ＡＡＶ２を介して、ＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡ（配列番号２３）の配列を有するＲＡＢ７Ａ標的化環状ガイドＲＮＡを送達した。感染の４８時間後に、ｄｄＰＣＲドロップオフアッセイにより、ＲＡＢ７Ａ編集を定量した。図２８に示されるように、ガイドＲＮＡは、親細胞株及び３つのクローン全てで、ＲＡＢ７Ａの編集の成功を示した。
実施例２１
フィラー配列を有する環状シャーシ
本実施例は、様々な長さのフィラー配列を有する本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＲＡＢ７Ａ編集について記載する。ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞（２０，０００細胞）を、ガイドＲＮＡまたは対照をコードする５００ｎｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーに変換した。ＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングを実施した。ＥｄｉｔＲソフトウェアを使用して、パーセント編集を決定した。ＨＥＫ２９３細胞で自然に発現されるＡＤＡＲ１のみ、ならびにＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２について、ＲＮＡ編集を評価した。後者の実験では、ＡＤＡＲ２を過剰発現させるために、ＡＤＡＲ２をコードするｐｉｇｇｙｂａｃベクターで、ＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトした。
フィラー配列を有する環状シャーシ
本実施例は、様々な長さのフィラー配列を有する本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＲＡＢ７Ａ編集について記載する。ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞（２０，０００細胞）を、ガイドＲＮＡまたは対照をコードする５００ｎｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーに変換した。ＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングを実施した。ＥｄｉｔＲソフトウェアを使用して、パーセント編集を決定した。ＨＥＫ２９３細胞で自然に発現されるＡＤＡＲ１のみ、ならびにＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２について、ＲＮＡ編集を評価した。後者の実験では、ＡＤＡＲ２を過剰発現させるために、ＡＤＡＲ２をコードするｐｉｇｇｙｂａｃベクターで、ＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトした。
図２９は、左に、異なるサイズで、標的に相補的な環状シャーシ全体の異なる割合を有する様々な環状ガイドＲＮＡについてのＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲのパーセント編集の棒グラフを示す（例えば、フィラー配列の量を変化させることにより、標的化ドメインである環状シャーシの部分を調節した）。驚くべきことに、ガイドＲＮＡ対環状シャーシ全体の比を変化させることにより、ＲＮＡ編集のレベルを調節することができた。つまり、ガイドＲＮＡ対環状シャーシ全体の比が低くても高くても、最も高い編集は示さなかった。ガイドＲＮＡが、環状シャーシ全体の約２８％～約６６％である環状シャーシは、最も高いレベルのＲＮＡ編集をもたらした。これらの結果は、ＡＤＡＲ１単独及びＡＤＡＲ１＋ＡＤＡＲ２過剰発現について一貫していた。図の右側のゲルは、試験された環状ガイドＲＮＡの環状化の確認を示す。
ガイドの配列が以下の表６に示される。ガイドＲＮＡは、太字であり、フィラー配列は、下線が引かれている。
実施例２２
フィラー配列を有する環状シャーシ
本実施例は、フィラー配列を有する本開示の環状ガイドＲＮＡによるＬＲＲＫ２編集について記載する。この実施例は、本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＬＲＲＫ２編集について記載する。実験設定及びガイドの詳細は、上記の実施例１６に記載される。まとめると、２０，０００個の細胞を、ガイドをコードする５００ｎｇのプラスミドでトランスフェクトした。試験された細胞は、Ｇ２０１９Ｓ変異を含有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされた、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞、ならびに、ＡＤＡＲ２及びＧ２０１９Ｓ変異を含有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされた、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞を含む。配列が以下の表７に示される。ガイドＲＮＡは、太字であり、フィラー配列は、下線が引かれている。
フィラー配列を有する環状シャーシ
本実施例は、フィラー配列を有する本開示の環状ガイドＲＮＡによるＬＲＲＫ２編集について記載する。この実施例は、本開示の環状ガイドＲＮＡを用いるＬＲＲＫ２編集について記載する。実験設定及びガイドの詳細は、上記の実施例１６に記載される。まとめると、２０，０００個の細胞を、ガイドをコードする５００ｎｇのプラスミドでトランスフェクトした。試験された細胞は、Ｇ２０１９Ｓ変異を含有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされた、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞、ならびに、ＡＤＡＲ２及びＧ２０１９Ｓ変異を含有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされた、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞を含む。配列が以下の表７に示される。ガイドＲＮＡは、太字であり、フィラー配列は、下線が引かれている。
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、説明されているが、当業者には、そのような実施形態が単なる例として提供されていることが明らかであろう。ここで、当業者には、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置き換えが想起されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明を実施する際に採用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの同等物がそれにより網羅されることが意図される。
Claims (60)
- 前駆改変線状ポリヌクレオチドであって、
第１のスペーサードメイン、
疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、及び
第２のスペーサードメイン
を含み、
前記第１または第２のスペーサードメインが、前記標的ＲＮＡに実質的に相補的ではなく、
前記前駆改変線状ポリヌクレオチドの転写物が、哺乳動物細胞への前記前駆改変線状ポリヌクレオチドの挿入時に環状化し、それにより、環状化された改変ポリヌクレオチドを形成し、
前記標的化ドメインが前記標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、
前記前駆改変線状ポリヌクレオチド。 - 前記前駆改変線状ポリヌクレオチドが、５’から３’の順に、前記第１のスペーサードメイン、前記標的化ドメイン、及び前記第２のスペーサードメインを含む、請求項１に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記前駆改変線状ポリヌクレオチドが、前記第１のスペーサードメインの５’側または前記第２のスペーサードメインの３’側に、リボザイムドメインを含む、請求項１または２に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記前駆改変線状ポリヌクレオチドが、前記リボザイムドメイン及び前記第１のスペーサードメイン間、または前記リボザイムドメイン及び前記第２のスペーサードメイン間に、ライゲーションドメインを含む、請求項３に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 自己環状化後に、前記第１のスペーサードメイン及び前記第２のスペーサードメインが、前記環状化された改変ポリヌクレオチドの全長の約４０％～約７０％であるフィラー配列である、請求項１～４のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 自己環状化後に、前記第１のスペーサードメイン及び前記第２のスペーサードメインが、前記環状化された改変ポリヌクレオチドの前記全配列の約５０％～約６７％であるフィラー配列である、請求項５に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記フィラー配列が、前記フィラー配列を欠く他の点で同等の環状化ポリヌクレオチドと比較して、前記標的化ドメインの前記標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを増加させる、請求項５または６に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 自己環状化後に、前記環状化された改変ポリヌクレオチドの前記全長が、約１５０ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドを含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 自己環状化後に、前記環状化された改変ポリヌクレオチドの前記全長が、約２００ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、前記標的ＲＮＡと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の相補性を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、前記標的ＲＮＡの３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に実質的に相補的である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、前記標的ＲＮＡのイントロン領域に実質的に相補的である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、翻訳開始部位（ＴＩＳ）に実質的に相補的である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、前記標的ＲＮＡの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）に実質的に相補的である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、前記標的ＲＮＡとミスマッチである少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記塩基の前記編集が、前記編集を欠く他の点で同等の標的ＲＮＡの翻訳タンパク質と比較して、前記塩基の前記編集を伴う前記標的ＲＮＡの翻訳後に、タンパク質もしくはそのフラグメントのレベルを増加させるか、タンパク質もしくはそのフラグメントの長さを増加させるか、タンパク質もしくはそのフラグメントの機能性を増加させるか、タンパク質もしくはそのフラグメントの安定性を増加させるか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記塩基の編集が、センスコドンを終止コドンに変換する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記センスコドンが、疾患の病原経路に関与し、前記センスコドンを前記終止コドンに変換すると、前記疾患の病原経路が低減する、請求項１８に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記塩基の編集が、終止コドンをセンスコドンに変換する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記終止コドンが疾患の病原経路に関与し、前記終止コドンを前記センスコドンに変換すると、前記疾患の病原経路が低減する、請求項２０に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記塩基の編集が、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記第１のセンスコドンが疾患の病原経路に関与し、前記第１のセンスコドンを前記第２のセンスコドンに変換すると、前記疾患の病原経路が低減する、請求項２２に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲタンパク質またはＡＰＯＢＥＣタンパク質を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲを含み、前記ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１である、請求項２５に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲを含み、前記ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ２である、請求項２５に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲを含み、前記ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ３である、請求項２５に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記疾患または状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、大脳基底核及び小脳の萎縮を伴う髄鞘形成不全（Ｈ－ＡＢＣ）、または嚢胞性線維症を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、ＴＵＢＢ４Ａを含み、ＴＵＢＢ４Ａが、Ｄ２４９Ｎ変異を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含む、請求項３０に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、ＬＲＲＫ２を含み、ＬＲＲＫ２が、Ｇ２０１９Ｓ変異を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、配列番号３９、配列番号５３、または配列番号５４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含む、請求項３２に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１を含み、ＳＥＲＰＩＮＡ１が、Ｅ３４２Ｋ変異を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、配列番号６４、または配列番号６５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含む、請求項３４に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、ＳＮＣＡを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含む、請求項３６に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、前記翻訳開始部位（ＴＩＳ）を標的とするように設計される、請求項３７に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、ＡＰＰを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、配列番号６１、配列番号６２、または配列番号６３と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含む、請求項３９に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、ＡＢＣＡ４を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、配列番号５８、配列番号５９、または配列番号６０と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含む、請求項４１に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、ＤＭＤを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、配列番号５６、または配列番号５７と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または１００％の配列相同性を含む、請求項４３に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド。
- 前駆改変ポリヌクレオチドであって、５’から３’の順に、第１のリボザイムドメイン、第１ライゲーションドメイン、第１のスペーサードメイン、疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、第２のライゲーションドメイン、及び第２のリボザイムドメイン、を含み、前記第１のスペーサードメインが、前記標的ＲＮＡと実質的に相補的ではなく、前記前駆改変線状ポリヌクレオチドの転写物が、哺乳動物細胞への前記前駆改変線状ポリヌクレオチドの挿入時に環状化し、それにより、環状化された改変ポリヌクレオチドを形成し、前記標的化ドメインが前記標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、前記前駆改変ポリヌクレオチド。
- 改変環状ポリヌクレオチドであって、疾患または状態に関与する標的ＲＮＡに実質的に相補的な標的化ドメイン、及び前記標的ＲＮＡに実質的に相補的でないスペーサードメインを含み、前記スペーサードメインが、１つ以上のヌクレオチドの付加により前記改変環状ポリヌクレオチドを拡大し、前記標的化ドメインが前記標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、ＲＮＡ編集酵素による前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集が促進される、前記改変環状ポリヌクレオチド。
- 前記ＲＮＡ編集エンティティによる前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの前記塩基の前記編集が、
（ｉ）前記標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、
（ｉｉ）前記改変ポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的または間接的に導入すること、ならびに
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡをシーケンシングすること、
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定される、請求項４６に記載の改変環状ポリヌクレオチド。 - 前記改変環状ポリヌクレオチドが、溶媒に曝露され得る、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、またはその両方を含まない、請求項４６または４７に記載の改変環状ポリヌクレオチド。
- さらに、ＲＮＡ編集酵素動員ドメインを含み、前記ＲＮＡ編集酵素動員ドメインが、前記改変ポリヌクレオチドと会合した場合に前記標的ＲＮＡ内のヌクレオチドの塩基に対して化学変換を行うＲＮＡ編集酵素を動員する、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の改変環状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、約２０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドである、請求項４６～４９のいずれか１項に記載の改変環状ポリヌクレオチド。
- 前記標的ＲＮＡが、ナンセンス変異を含む、請求項４６～５０のいずれか１項に記載の改変環状ポリヌクレオチド。
- 前記標的化ドメインが、前記標的ＲＮＡとミスマッチである少なくとも１つの単一ヌクレオチドを含む、請求項４６～５１のいずれか１項に記載の改変環状ポリヌクレオチド。
- 前記疾患または状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、α１－アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、認知症、タウオパチー、シヌクレイノパチー、シュタルガルト病、大脳基底核及び小脳の萎縮を伴う髄鞘形成不全（Ｈ－ＡＢＣ）、または嚢胞性線維症を含む、請求項４６に記載の改変環状ポリヌクレオチド。
- 請求項１～４５のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド、または請求項４６～５３のいずれか１項に記載の改変環状ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、請求項５４に記載のベクター。
- 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、これらのいずれかのキメラ、またはこれらのいずれかのバリアントである、請求項５５に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、自己相補型アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項５５または５６に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、一本鎖ＡＡＶベクターである、請求項５５または５６に記載のベクター。
- 請求項１～４５のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド、請求項４５～５３のいずれか１項に記載の改変環状ポリヌクレオチド、または請求項５４～５８のいずれか１項に記載のベクター、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む、単位用量形態の医薬組成物。
- 疾患または状態の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の請求項１～４５のいずれか１項に記載の前駆改変線状ポリヌクレオチド、請求項４６～５３のいずれか１項に記載の改変環状ポリヌクレオチド、請求項５４～５８のいずれか１項に記載のベクター、または請求項５９に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
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