CN116648508A - Rna编辑组合物和使用方法 - Google Patents

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CN116648508A CN202180090120.3A CN202180090120A CN116648508A CN 116648508 A CN116648508 A CN 116648508A CN 202180090120 A CN202180090120 A CN 202180090120A CN 116648508 A CN116648508 A CN 116648508A
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扬尼斯·萨瓦
理查德·沙利文
布赖恩·布斯
阿德里安·布里格斯
德博吉特·波斯
苏珊·伯恩
斯蒂芬·伯利
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Abstract

本文提供了工程化潜在向导RNA，其与靶RNA结合以形成向导‑靶RNA支架，并且是RNA编辑实体的底物，所述RNA编辑实体对所述靶RNA的核苷酸的碱基进行化学修饰。本文还提供了包括本文所公开的所述工程化潜在向导RNA的组合物、载体和细胞以及其使用方法。

Description

RNA编辑组合物和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119要求于2020年11月11日提交的临时申请序列号63/112,452、于2020年12月1日提交的临时申请序列号63/119,754、于2021年2月24日提交的临时申请序列号63/153,070、于2021年4月22日提交的临时申请序列号63/178,159、于2021年5月26日提交的临时申请序列号63/193,373的权益，所述临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明内容
本文公开了工程化向导RNA。在一些实施例中，工程化向导RNA在与涉及疾病或病状的靶RNA杂交时可以形成向导-靶RNA支架，所述向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合。在一些实施例中，结构特征可以基本上在与靶RNA杂交时形成。在一些实施例中，工程化向导RNA被配置成与涉及疾病或病状的靶RNA杂交。在一些实施例中，向导-靶RNA支架进一步包括错配。在一些实施例中，所述错配是腺苷/胞嘧啶(A/C)错配，其中所述腺苷(A)存在于所述靶RNA中，并且所述胞嘧啶(C)存在于所述工程化向导RNA中。在一些实施例中，向导-靶RNA支架包括摆动碱基对。在一些实施例中，向导-靶RNA支架可以是RNA编辑实体的底物，所述RNA编辑实体对靶RNA中的核苷酸碱基进行化学修饰。在一些实施例中，RNA编辑实体将靶RNA中的腺苷化学修饰成肌苷。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括结构化基序，所述结构化基序包括两个或更多个选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或10个选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征是凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，凸起包括工程化向导RNA的1至4个核苷酸和靶RNA的0至4个核苷酸。在一些实施例中，凸起包括工程化向导RNA的0至4个核苷酸和靶RNA的1至4个核苷酸。在一些实施例中，所述不对称凸起是X1/X2不对称凸起，其中X1是所述不对称凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述不对称凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，其中所述X1/X2不对称凸起是0/1不对称凸起、1/0不对称凸起、0/2不对称凸起、2/0不对称凸起、0/3不对称凸起、3/0不对称凸起、0/4不对称凸起、4/0不对称凸起、1/2不对称凸起、2/1不对称凸起、1/3不对称凸起、3/1不对称凸起、1/4不对称凸起、4/1不对称凸起、2/3不对称凸起、3/2不对称凸起、2/4不对称凸起、4/2不对称凸起、3/4不对称凸起或4/3不对称凸起。在一些实施例中，所述对称凸起是X1/X2对称凸起，其中X1是所述对称凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述对称凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2对称凸起2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环包括不对称内环。在一些实施例中，所述内环包括对称内环。在一些实施例中，所述不对称内环是X1/X2不对称内环，其中X1是所述不对称内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述不对称内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2不对称内环是5/6不对称内环、6/5不对称内环、5/7不对称内环、7/5不对称内环、5/8不对称内环、8/5不对称内环、5/9不对称内环、9/5不对称内环、5/10不对称内环、10/5不对称内环、6/7不对称内环、7/6不对称内环、6/8不对称内环、8/6不对称内环、6/9不对称内环、9/6不对称内环、6/10不对称内环、10/6不对称内环、7/8不对称内环、8/7不对称内环、7/9不对称内环、9/7不对称内环、7/10不对称内环、10/7不对称内环、8/9不对称内环、9/8不对称内环、8/10不对称内环、10/8不对称内环或9/10不对称内环或10/9不对称内环。在一些实施例中，所述对称内环是X1/X2对称内环，其中X1是所述对称内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述对称内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2对称内环是5/5对称内环、6/6对称内环、7/7对称内环、8/8对称内环、9/9对称内环、10/10对称内环、12/12对称内环、15/15对称内环或20/20对称内环。在一些实施例中，内环由工程化向导RNA或靶RNA上的至少5个核苷酸形成。在一些实施例中，内环由工程化向导RNA或靶RNA的5至1000个核苷酸形成。在一些实施例中，内环由工程化向导RNA或靶RNA的5至50个核苷酸形成。在一些实施例中，内环由工程化向导RNA或靶RNA的5至20个核苷酸形成。在一些实施例中，结构特征包括发夹。在一些实施例中，发夹包括非募集发夹。在一些实施例中，发夹的环部分包括约3至约15个核苷酸长度。在一些实施例中，工程化向导RNA进一步包括至少两个另外的结构特征，所述至少两个另外的结构特征包括至少两个错配。在一些实施例中，所述至少两个错配中的至少一个错配是G/G错配。在一些实施例中，工程化向导RNA进一步包括另外的结构特征，所述另外的结构特征包括摆动碱基对。在一些实施例中，摆动碱基对包括与尿嘧啶配对的鸟嘌呤。在一些实施例中，所述靶RNA包括与所述靶RNA中的所述腺苷相邻的5'鸟苷，所述腺苷被所述RNA编辑实体化学修饰成肌苷。在一些实施例中，工程化向导RNA包括与A/C错配的胞嘧啶相邻的5'鸟苷。在一些实施例中，所述RNA编辑实体是：(a)作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；(b)(a)的催化活性片段；(c)包括(a)或(b)的融合多肽；或者(d)这些的任何组合。在一些实施例中，RNA编辑实体对细胞是内源性的。在一些实施例中，RNA编辑实体包括ADAR。在一些实施例中，ADAR包括人ADAR(hADAR)。在一些实施例中，ADAR包括ADAR1、ADAR2、ADAR3或其任何组合。在一些实施例中，ADAR1包括ADAR1p110、ADAR1p150或其组合。在一些实施例中，工程化向导RNA包括经修饰的RNA碱基、未经修饰的RNA碱基或其组合。在一些实施例中，靶RNA是mRNA分子。在一些实施例中，靶RNA是前mRNA分子。在一些实施例中，靶RNA是APP、ABCA4、SERPINA1、HEXA、LRRK2、CFTR、SNCA、MAPT或LIPA、这些中的任何一种的片段或其任何组合。在一些实施例中，所述靶RNA编码淀粉样蛋白前体多肽、ATP结合盒、亚家族A、成员4(ABCA4)多肽、α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽、己糖胺酶A酶、富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)多肽、CFTR多肽、α突触核蛋白多肽、Tau多肽或溶酶体酸性脂肪酶多肽。在一些实施例中，所述靶RNA编码ABCA4多肽。在一些实施例中，所述靶RNA包括相对于具有登录号NC_000001.11:c94121149-93992837的野生型ABCA4基因序列，在位置5882、6320或5714处的G至A取代。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表7、表9、表10、表11、表18或表19。在一些实施例中，向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个凸起是2/1不对称凸起、1/0不对称凸起、2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起；(ii)X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述内环是5/5对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是G/G错配、A/C错配或G/A错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括2/1不对称凸起、1/0不对称凸起、G/G错配、A/C错配和3/3对称凸起。在一些实施例中，工程化向导RNA的长度为80至175个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:339-SEQ ID NO:341或SEQ ID NO:292-SEQ ID NO:296具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽。在一些实施例中，所述LRRK2多肽包括选自由以下组成的组的突变：E10L、A30P、S52F、E46K、A53T、L119P、A211V、C228S、E334K、N363S、V366M、A419V、R506Q、N544E、N551K、A716V、M712V、I723V、P755L、R793M、I810V、K871E、Q923H、Q930R、R1067Q、S1096C、Q1111H、I1122V、A1151T、L1165P、I1192V、H1216R、S1228T、P1262A、R1325Q、I1371V、R1398H、T1410M、D1420N、R1441G、R1441H、A1442P、P1446L、V1450I、K1468E、R1483Q、R1514Q、P1542S、V1613A、R1628P、M1646T、S1647T、Y1699C、R1728H、R1728L、L1795F、M1869V、M1869T、L1870F、E1874X、R1941H、Y2006H、I2012T、G2019S、I2020T、T2031S、N2081D、T2141M、R2143H、Y2189C、T2356I、G2385R、V2390M、E2395K、M2397T、L2466H或Q2490NfsX3。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表12、表15、表25、表26、表27、表17或表20。在一些实施例中，向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的一个或多个结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个凸起是0/1不对称凸起、2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起；(ii)一个或多个X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个内环是5/0不对称内环、5/4不对称内环、5/5对称内环、6/6对称内环、7/7对称内环或10/10对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、A/G错配、C/U错配、G/A错配或C/C错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括6/6对称内环、A/C错配、A/G错配和C/U错配。在一些实施例中，工程化向导RNA的长度为80至175个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:344或SEQ ID NO:345具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码SNCA多肽。在一些实施例中，所述工程化向导RNA与选自由以下组成的组的所述靶RNA的序列杂交：5'非翻译区(UTR)、3'UTR和SNCA基因的翻译起始位点。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表21、表23或表28。在一些实施例中，向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的一个或多个结构特征：(i)X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述凸起是4/4对称凸起；(ii)一个或多个X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个内环是5/5对称环、8/8对称环或49/4不对称环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、G/G错配、G/A错配、U/C错配或A/A错配；(iv)其任何组合。在一些实施例中，工程化向导RNA的长度为80至175个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码SERPINA1。在一些实施例中，所述靶RNA包括相对于具有登录号NC_000014.9:c94390654-94376747的野生型SERPINA1基因序列，在位置9989处的G至A取代。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表5、表29、表30、表31、表32、表33、表34、表35或表36。在一些实施例中，向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的一个或多个结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述凸起是0/2不对称凸起、0/3不对称凸起、1/0不对称凸起、2/0不对称凸起、2/2对称凸起、3/0不对称凸起、2/2对称凸起或3/3对称凸起；(ii)X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述内环是5/5对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、A/A错配和G/A错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。在一些实施例中，工程化向导RNA的长度为80至175个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:6-10、102-103或297-327中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，由所述RNA编辑实体修饰的所述靶RNA的所述核苷酸的所述碱基包括在所述靶RNA的点突变中。在一些实施例中，点突变包括错义突变。在一些实施例中，点突变是无义突变。在一些实施例中，无义突变是提前UAA终止密码子。在一些实施例中，所述结构特征相对于缺乏所述结构特征的在其它方面相当的向导RNA，增加了编辑所述靶RNA中靶腺苷的选择性。在一些实施例中，相对于缺乏所述结构特征的在其它方面相当的向导RNA，所述结构特征减少了所述RNA编辑实体对所述靶RNA中的靶腺苷的5'或3'的200、100、50、25、10、5、2或1、1个核苷酸内的局部脱靶腺苷的RNA编辑量。
本文还公开了工程化RNA，其包括(a)如本文所描述的工程化向导RNA和(b)U7snRNA发夹序列、SmOPT序列或其组合。在一些实施例中，U7发夹具有TAGGCTTTCTGGCTTTTTACCGGAAAGCCCCT(SEQ ID NO:389)或CAGGTTTTCTGACTTCGGTCGGAAAACCCCT(SEQ ID NO:394)的序列。在一些实施例中，SmOPT序列具有AATTTTTGGAG(SEQ ID NO:390)的序列。
本文还公开了编码如本文所描述的工程化向导RNA或如本文所描述的工程化RNA的多核苷酸。
本文还公开了递送载体，其包括如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA或如本文所描述的多核苷酸(编码工程化向导RNA或工程化RNA)。在一些实施例中，递送载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。在一些实施例中，AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。在一些实施例中，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。在一些实施例中，所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施例中，所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些实施例中，所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。
本文还公开了药物组合物，所述药物组合物包括：(a)如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸或如本文所描述的递送载体；以及(b)药学上可接受的：赋形剂、载体或稀释剂。在一些实施例中，药物组合物呈单位剂量形式。在一些实施例中，药物组合物进一步包括另外的治疗剂。在一些实施例中，所述另外的治疗剂包括氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式或其任何组合。
本文还公开了编辑细胞中的靶RNA的方法。在一些实施例中，所述方法包括：向所述细胞施用有效量的如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸、如本文所描述的递送载体或如本文所描述的药物组合物。
本文还公开了治疗受试者的疾病的方法。在一些实施例中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸、如本文所描述的递送载体或如本文所描述的药物组合物。在一些实施例中，所述工程化向导RNA作为单位剂量施用。在一些实施例中，所述单位剂量是足以治疗所述受试者的量。在一些实施例中，所述施用是鞘内的，眼内的、玻璃体内的、视网膜的、静脉内的、肌内的、心室内的、大脑内的、小脑内的、脑室内的、脑实质内的、皮下的或其组合。在一些实施例中，所述疾病包括神经疾病。在一些实施例中，所述神经疾病包括帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)、Tau蛋白病或痴呆。在一些实施例中，所述神经疾病相对于未患有所述神经疾病或病状的健康受试者，与SNCA多肽水平升高相关。在一些实施例中，所述工程化向导RNA与编码所述SNCA多肽的靶RNA的序列杂交，所述序列选自由以下组成的组：5'非翻译区(UTR)、3'UTR和SNCA的翻译起始位点；其中杂交产生作为RNA编辑实体的底物的向导-靶RNA支架，所述RNA编辑实体对所述靶RNA的所述序列中的核苷酸的碱基进行化学修饰，由此降低所述SNCA多肽的水平。在一些实施例中，所述工程化向导RNA与编码所述SNCA的翻译起始位点的靶RNA的序列杂交。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括具有至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。在一些实施例中，所述神经疾病与由所述靶RNA编码的LRRK2多肽的突变相关，其中所述突变选自由以下组成的组：E10L、A30P、S52F、E46K、A53T、L119P、A211V、C228S、E334K、N363S、V366M、A419V、R506Q、N544E、N551K、A716V、M712V、I723V、P755L、R793M、I810V、K871E、Q923H、Q930R、R1067Q、S1096C、Q1111H、I1122V、A1151T、L1165P、I1192V、H1216R、S1228T、P1262A、R1325Q、I1371V、R1398H、T1410M、D1420N、R1441G、R1441H、A1442P、P1446L、V1450I、K1468E、R1483Q、R1514Q、P1542S、V1613A、R1628P、M1646T、S1647T、Y1699C、R1728H、R1728L、L1795F、M1869V、M1869T、L1870F、E1874X、R1941H、Y2006H、I2012T、G2019S、I2020T、T2031S、N2081D、T2141M、R2143H、Y2189C、T2356I、G2385R、V2390M、E2395K、M2397T、L2466H或Q2490NfsX3。在一些实施例中，所述神经疾病与由所述靶RNA编码的LRRK2多肽的突变相关，其中所述突变是G2019S突变。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括具有至少约60％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。在一些实施例中，所述疾病包括肝病。在一些实施例中，所述肝病包括肝硬化。在一些实施例中，所述肝病是α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症。在一些实施例中，所述AAT缺乏症与具有登录号NC_000014.9:c94390654-94376747的野生型SERPINA1基因序列的位置9989处的G至A取代相关。在一些实施例中，工程化潜在，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:6-10、102-103或297-327中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括具有至少约60％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。在一些实施例中，所述疾病是黄斑变性。在一些实施例中，所述黄斑变性是斯特格氏病(Stargardt Disease)。在一些实施例中，所述斯特格氏病与具有登录号NC_000001.11:c94121149-93992837的野生型ABCA4基因序列的位置5882、6320或5714处的G至A取代相关。在一些实施例中，所述斯特格氏病与位置5882处的G至A取代相关。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述工程化向导RNA包括具有至少约70％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约80％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。在一些实施例中，所述受试者被诊断患有所述疾病或所述病状。
本文还公开了如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸、如本文所描述的递送载体或如本文所描述的药物组合物，其用作药物。
本文还公开了如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸、如本文所描述的递送载体或如本文所描述的药物组合物，其用于治疗神经疾病。在一些实施例中，所述神经疾病是帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、Tau蛋白病或痴呆。
本文还公开了如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸、如本文所描述的递送载体或如本文所描述的药物组合物，其用于治疗肝病。在一些实施例中，所述肝病包括肝硬化。在一些实施例中，所述肝病是α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症。
本文还公开了如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸、如本文所描述的递送载体或如本文所描述的药物组合物，其用于治疗黄斑变性。在一些实施例中，所述黄斑变性是斯特格氏病。
本文还公开了如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸、如本文所描述的递送载体或如本文所描述的药物组合物用于制造药物的用途。
本文还公开了如本文所描述的工程化向导RNA、如本文所描述的工程化RNA、如本文所描述的多核苷酸、如本文所描述的递送载体或如本文所描述的药物组合物用于制造用于治疗神经疾病、肝病或黄斑变性的药物的用途。
通过引用并入
本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示为通过引用并入。
附图说明
在所附权利要求书中对本公开的新颖特征进行了具体阐述。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细说明和附图，将获得对本公开的实施例的特征和优点的更好理解，在所述附图中：
图1示出了根据本文所描述的方法的工作流程的实例。
图2A和2B是展示了使用本文所公开的工程化向导靶向前mRNA分子(图2A)和成熟mRNA分子(图2B)的图像。
图3展示了来自振荡器基因(Shaker gene)的果蝇(drosophila)ADAR底物的实例，所述底物能够促进5'G背景中靶A(由箭头指示)的RNA编辑。
图4提供了形成图3的果蝇ADAR底物的RNA分子的核苷酸序列和详细说明由核苷酸相互作用形成的结构特征的注释。
图5A-5B示出了由本文所公开的工程化向导形成的本文所描述的双链底物和由ABCA4基因编码的靶RNA分子。图5A示出了展示与靶RNA分子的完全互补性的工程化向导。图5B示出了展示与靶RNA分子的部分互补性，并且形成双链底物的工程化向导，所述双链底物展示对图3和4所示出的天然存在的果蝇底物的完全模拟。
图6A-6B示出了本文所公开的工程化向导的核苷酸序列和详细说明由核苷酸相互作用形成的结构特征的注释。图6A示出了展示与靶RNA分子的部分互补性，并且形成双链底物的示例性工程化向导，所述双链底物展示对图4所示出的天然存在的果蝇底物的完全模拟。图6B示出了比较图6A和4中描绘的结构特征的位置以及图6A的向导和与靶RNA分子具有完全互补性的向导之间的核苷酸序列变化的表格。
图7示出了展示与靶RNA分子的部分互补性，并且形成双链底物的示例性工程化向导，所述双链底物展示对图6B所示出的天然存在的果蝇底物的完全模拟。
图8示出了由本文所公开的工程化向导和本文所公开的靶RNA分子形成的双链底物，所述双链底物展示对图4中描绘的天然存在的底物的不同水平的模拟。
图9A-9F示出了由本文所公开的工程向导和本文所公开的靶分子形成的双链底物。工程化向导的长度可以是100个核苷酸，在从5'端起的核苷酸80(加或减2个核苷酸)处，包括旨在与待由ADAR编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶，在本文中称为“100.80”向导。例如，“100.80”是指旨在与待编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶可以位于从5'端起的核苷酸82处的向导。双链底物展示对天然存在的果蝇ADAR底物的不同程度的模拟。
图10A-10H示出了由本文所公开的工程向导和本文所公开的靶分子形成的双链底物。工程化向导的长度可以是150个核苷酸，在从5'端起的核苷酸125(加或减2个核苷酸)处，包括旨在与待由ADAR编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶，在本文中称为“150.125”向导。例如，“150.125”是指旨在与待编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶可以位于从5'端起的核苷酸123处的向导。双链底物展示对天然存在的果蝇ADAR底物的不同程度的模拟。
图11A-11J示出了由本文所公开的工程向导和本文所公开的靶分子形成的双链底物。工程化向导的长度可以是150个核苷酸，在从5'端起的核苷酸75(加或减2个核苷酸)处，包括旨在与待由ADAR编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶，在本文中称为“150.75”向导。例如，“150.75”是指旨在与待编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶可以位于从5'端起的核苷酸77处的向导。双链底物展示对天然存在的果蝇ADAR底物的不同程度的模拟。
图12A和12B展示了由本文所公开的工程向导和本文所公开的靶序列形成的双链底物。图12A示出了展示与靶RNA分子的完全互补性的工程化向导。图12B示出了展示与靶RNA分子的部分互补性，并且形成双链底物的工程化向导，所述双链底物展示对天然存在的果蝇底物的完全模拟。
图13示出了受本文所公开的各种工程向导影响的靶RNA序列的编辑百分比。
图14示出了变化倍数荧光素酶测定的结果，进行所述变化倍数荧光素酶测定以分析最适合适应工程化向导中的果蝇ADAR底物中发现的向导模式的向导长度和错配位置，所述工程化向导靶向由ABCA4编码的RNA中的突变。
图15示出了本文所公开的100.80、150、125和150.75工程化向导的长度与错配位置的图。
图16示出了用于评估本文所公开的工程向导校正ABCA4微型化基因(微小基因)中表达的c.5882G>A突变的能力的实验工作流程。
图17示出了通过执行图20中描绘的实验工作流程生成的HEK293细胞中的ADAR1、ADAR2和GAPDH的蛋白质印迹。实验中使用的细胞在泳道3中，并且表达ADAR1和ADAR2。
图18仅示出了TAG阳性对照的编辑百分比，如通过图20所展示实验中的桑格测序(Sanger Sequencing)所确定的。
图19示出了通过三个向导实现的ABCA4微小基因中c.5882突变的编辑百分比，所述向导包括对果蝇ADAR底物的不同程度的结构模拟，如图18所展示的实验中所确定的。
图20示出了三个工程化向导实现的RNA编辑％的比较，将不包括对果蝇底物的结构模拟的向导版本与对果蝇底物展示完整结构模拟的版本进行比较。
图21示出了用包括对果蝇ADAR底物的不同程度的模拟的150.125向导转染后靶RNA的桑格测序(Sanger sequencing)读段的实例。
图22示出了通过Q5 PCR扩增的各种抗LRRK2向导RNA的体外转录(IVT)模板的凝胶电泳图像。使用表14中所列的引物进行扩增。Wt 0.100.50是LRRK2_0.0.100.50(无GluR2结构域；向导的长度为100个核苷酸；靶LRRK2 RNA中待编辑的A定位于向导的核苷酸50处)，intGluR2是LRRK2_IntGluR2，翻转_intGluR2是LRRK2_FlipIntGluR2，天然向导是LRRK2_Natguide，EIE是LRRK2_EIE，Wt 1.100.50是LRRK2_1.1.100.50，并且Wt 2.100.50是LRRK2_2.2.100.50。最左手侧的泳道是分子标志物。
图23示出了各种经纯化的IVT产生的抗LRRK2向导RNA的凝胶电泳图像。在每条泳道中加载25nmol的RNA。Wt 0.100.50是LRRK2_0.0.100.50，intGluR2是LRRK2_IntGluR2，翻转_intGluR2是LRRK2_FlipIntGluR2，天然向导是LRRK2_Natguide，EIE是LRRK2_EIE，Wt1.100.50是LRRK2_1.1.100.50，并且Wt2.100.50是LRRK2_2.2.100.50。最左手侧的泳道是分子标志物。一些向导RNA序列在表12中示出。
图24示出了用不同的抗LRRK2向导RNA和对照处理的LRRK2 G2019S杂合子细胞中第6,055个核苷酸的桑格测序迹线。用向导RNA收缩细胞持续3小时(左小图)或7小时(右小图)。这些细胞是G2019S突变杂合的EBV转化的B细胞。用不同的向导RNA处理细胞。RNA编辑效率是通过LRRK2 mRNA的示踪信号与G(经编辑的)和A(未经编辑的)的差异来计算的。通过桑格测序测量示踪信号。到3小时(左小图)时，LRRK2_FlipIntGluR2(标记为IntFlip)的RNA编辑效率达到约14％，与对照(Ctrl)中的0％相反。到第7小时(右小图)时，其它向导RNA，如LRRK2_0.100.50(标记为0.100.50)和LRRK2_1.100.50(标记为1.100.50)，也分别示出了约12％和13.5％的编辑。
图25A示出了由工程化导向形成的双链底物的非限制性实例。
图25B示出了双链底物模拟物的非限制性实例。
图26示出了双链底物模拟物的非限制性实例。
图27示出了双链底物模拟物的非限制性实例。
图28示出了双链底物模拟物的非限制性实例。
图29A示出了使用完美双链体(与靶基序完全互补)向导RNA设计或A-C错配向导设计和ADAR2的LRRK2靶RNA的各种位置的靶核苷酸编辑频率。Y轴示出了靶RNA的不同位置的编辑频率百分比。X轴示出了靶RNA的各种位置。箭头指示靶核苷酸A。顶部小图示出了具有靶RNA的完美双链体(与靶基序完全互补)向导RNA的靶核苷酸编辑频率。底部小图示出了靶RNA中靶标A处的A-C错配向导RNA的靶核苷酸编辑频率。对于任一向导RNA，中靶靶核苷酸编辑小于约20％。
图29B示出了使用2540向导RNA序列对靶RNA LRRK2和ADAR2进行的高通量向导筛选测定中靶核苷酸编辑的动力学速率的汇总。X轴示出了靶RNA上碱基相对于编辑位点的位置。位置0是靶核苷酸。靶核苷酸右边的数字表示靶核苷酸下游的核苷酸。靶核苷酸左边的数字表示靶核苷酸上游的核苷酸。Y轴列出了测试的向导RNA。颜色条表示编辑的频率；较浅的颜色表示较多的编辑，而较暗的颜色表示较少的编辑。每个位置汇总了测量编辑频率的所有时间点的编辑频率。标记了中靶和脱靶的靶标A。
图29C示出了使用图38B中鉴定的排名最前的工程化设计和ADAR2的LRRK2靶RNA的不同位置的靶核苷酸编辑频率。Y轴示出了靶RNA的不同位置的编辑频率百分比。X轴示出了靶RNA的各种位置。箭头指示靶核苷酸A。中靶靶核苷酸编辑超过80％。
图30A示出了使用V1向导RNA设计和ADAR1的ABCA4靶RNA的各种位置的靶核苷酸编辑频率。Y轴示出了靶RNA的不同位置的编辑频率百分比。X轴示出了靶RNA的各种位置。箭头指示靶核苷酸A。顶部小图示出了V1向导RNA与具有靶RNA的完美双链体(与靶基序完全互补)的靶核苷酸编辑频率。底部小图示出了靶标A处具有A-C错配的V1向导RNA的靶核苷酸编辑频率。两个向导RNA均未在靶核苷酸A处提供任何碱基编辑。
图30B示出了使用2500向导RNA序列对靶RNA ABCA4和ADAR1进行的高通量向导筛选测定中靶核苷酸编辑的频率的汇总。X轴示出了靶RNA上碱基相对于编辑位点的位置。位置0是靶核苷酸。靶核苷酸右边的数字表示靶核苷酸下游的核苷酸。靶核苷酸左边的数字表示靶核苷酸上游的核苷酸。Y轴列出了测试的向导RNA。颜色条表示编辑的频率；较浅的颜色表示较多的编辑，而较暗的颜色表示较少的编辑。每个位置汇总了测量编辑频率的所有时间点的编辑频率。标记了中靶和脱靶的靶标A。
图30C示出了使用图30B中鉴定的排名最前的工程化设计和ADAR1的ABCA4靶RNA的各种位置的靶核苷酸编辑频率。Y轴示出了靶RNA的不同位置的编辑频率百分比。X轴示出了靶RNA的各种位置。箭头指示靶核苷酸A。中靶靶核苷酸编辑超过约80％。
图31示出了对靶RNA LRRK2、ABCA4和SERPINA1和ADAR2进行的高通量向导筛选测定的结果。X轴示出了靶RNA上碱基相对于编辑位点的位置。位置0是靶核苷酸。靶核苷酸右边的数字表示靶核苷酸下游的核苷酸。靶核苷酸左边的数字表示靶核苷酸上游的核苷酸。测量编辑频率的时间点(0、20秒、1分钟、3分钟、10分钟、30分钟和100分钟)标记在图的顶部上。Y轴列出了测试的向导RNA。颜色条表示编辑的动力学；较浅的颜色表示较快的动力学，而较暗的颜色表示较慢的动力学。筛选的向导RNA的数量标记在图的右边。
图32示出了对靶RNA LRRK2、ABCA4和SERPINA1进行的高通量向导筛选测定中ADAR1与ADAR2介导的编辑的比较结果。X轴示出了靶RNA上碱基相对于编辑位点的位置。位置0是靶核苷酸。靶核苷酸右边的数字表示靶核苷酸下游的核苷酸。靶核苷酸左边的数字表示靶核苷酸上游的核苷酸。测量编辑频率的时间点(0、1分钟、10分钟和100分钟)标记在图的顶部上。对于时间点1分钟、10分钟和100分钟，还示出了ADAR1与ADAR2介导的编辑的编辑动力学。Y轴列出了测试的向导RNA。颜色条表示编辑的动力学；较浅的颜色表示较快的动力学，而较暗的颜色表示较慢的动力学。
图33示出了从高通量向导筛选测定中选择最佳候选向导RNA的分析汇总。
图34A示出了用于确定对靶RNA LRRK2进行的高通量向导筛选测定中靶核苷酸编辑速率的分析。X轴示出了靶RNA上碱基相对于编辑位点的位置。位置0是靶核苷酸。靶核苷酸右边的数字表示靶核苷酸下游的核苷酸。靶核苷酸左边的数字表示靶核苷酸上游的核苷酸。Y轴列出了测试的向导RNA。颜色条表示编辑的动力学；较浅的颜色表示较快的动力学，而较暗的颜色表示较慢的动力学。每个位置汇总了测量编辑动力学的所有时间点的编辑动力学。示出的大框是取自以下不同时间点的实例：10-0.5分钟、100分钟、100.5分钟、101分钟、101.5分钟和102分钟。
图34B示出了LRRK2靶RNA上不同向导RNA的编辑动力学。靶基因的编辑百分比显示在Y轴上，并且时间示出在X轴上。示出了向导RNA的三个实例：具有完美双链体(与靶基序完全互补)的向导RNA、具有单个A-C错配的向导RNA，以及排名最前的工程化向导RNA。与其它向导RNA设计相比，排名最前的向导RNA在较短时间内的编辑百分比更高。
图35示出了ADAR1和ADAR2编辑曲线与工程化向导RNA。靶RNA ABCA4的编辑百分比显示在Y轴上，并且靶区域示出在X轴上。gRNA示出了用ADAR2但没有用ADAR1的+1脱靶编辑。
图36示出了LRRK2靶RNA上不同向导RNA的编辑动力学。靶基因的编辑百分比显示在Y轴上，并且时间示出在X轴上。示出了向导RNA的三个实例：排名最前的工程化向导RNA、具有单个A-C错配的向导RNA，以及具有完美双链体(与靶基序完全互补)的向导RNA。与其它向导RNA设计相比，排名最前的向导RNA的Kobs增加了30倍。
图37示出了维恩图(Venn diagram)，其汇总了当使用ADAR2时在LRRK2的靶核苷酸处提供中靶核苷酸编辑的向导RNA的数量(a，在100分钟时间点处>80％的中靶编辑；b，在100分钟时间点处<40％的脱靶编辑；c，测序读段长度：>50)；当使用ADAR1时提供中靶的向导RNA的数量(a，在100分钟时间点处>55％的中靶编辑；b，在100分钟时间点处<20％的脱靶编辑；c，测序读段长度：>50)；或者使用ADAR2编辑酶动力学的前20个向导RNA(a，在100分钟时间点处>80％的中靶编辑；b，酶动力学曲线拟合r2>0.8)。当使用ADAR2时，47种向导RNA提供了中靶核苷酸编辑。当使用ADAR1时，71种向导RNA提供了中靶核苷酸编辑。当使用ADAR1和ADAR2时，14种向导RNA提供了中靶核苷酸编辑。当使用ADAR1或ADAR2时提供中靶核苷酸编辑；或者当使用ADAR2时作为用于编辑酶动力学的前20个向导RNA的向导RNA的数量是32。
图38A示出了在100分钟时间点处对靶RNA ABCA4和ADAR2进行的高通量向导筛选测定中靶核苷酸编辑的动力学速率的汇总。X轴示出了靶RNA上碱基相对于编辑位点的位置。位置0是靶核苷酸。靶核苷酸右边的数字表示靶核苷酸下游的核苷酸。靶核苷酸左边的数字表示靶核苷酸上游的核苷酸。Y轴列出了测试的向导RNA。颜色表示编辑的动力学；较浅的颜色表示较快的动力学，而较暗的颜色表示较慢的动力学。
图38B示出了两个优化的排名最前的工程化设计向导RNA在ABCA4靶RNA上的编辑动力学。在100分钟点，两个向导RNA(顶部两个图)示出了靶核苷酸A的约80％的中靶编辑频率。为了进行比较，底部图示出了在靶核苷酸A处具有A-C错配的V1设计向导RNA。当使用ADAR1或ADAR2时，靶RNA的各种位置的靶核苷酸编辑频率示出在图的右边。靶标A在其5'侧具有G，结果表明可以制备内源性ADAR以用正确的向导RNA序列编辑5'G位点。
图39示出了维恩图，其汇总了当使用ADAR2时在ABCA4的靶核苷酸处提供中靶核苷酸编辑的向导RNA的数量(a，在100分钟时间点处>80％的中靶编辑；b，在100分钟时间点处<40％的脱靶编辑；c，测序读段长度：>50)；当使用ADAR1时提供中靶编辑的向导RNA的数量(a，在100分钟时间点处>55％的中靶编辑；b，在100分钟时间点处<20％的脱靶编辑；c，测序读段长度：>50)；或者当使用ADAR2时编辑酶动力学的前20个向导RNA(a，在100分钟时间点处>80％的中靶编辑；b，酶动力学曲线拟合r2>0.8)。当使用ADAR2时，33种向导RNA提供了中靶编辑。当使用ADAR1时，153种向导RNA提供了中靶编辑。当使用ADAR1和ADAR2时，24种向导RNA提供了中靶编辑。当使用ADAR1和ADAR2时提供中靶编辑；或者当使用ADAR2时作为用于编辑酶动力学的前20个向导RNA的向导RNA的数量是32。当使用ADAR1和ADAR2时提供中靶编辑；并且使用ADAR2作为用于编辑酶动力学的前20个向导RNA的向导RNA的数量是12。
图40示出了维恩图，其汇总了当使用ADAR2时在靶RNA SERPINA1的靶核苷酸处提供中靶核苷酸编辑的向导RNA的数量(a，在100分钟时间点处>70％的中靶编辑；b，在100分钟时间点处<70％的脱靶编辑；c，测序读段长度：>50)；当使用ADAR1时在SERPINA1的靶核苷酸处提供中靶的向导RNA的数量(a，在100分钟时间点处>40％的中靶编辑；b，在100分钟时间点处<40％的脱靶编辑；c，测序读段长度：>50)；或者当使用ADAR2时编辑酶动力学的前20个向导RNA(a，在100分钟时间点处>80％的中靶编辑；b，酶动力学曲线拟合r2>0.8)。当使用ADAR2时，3种向导RNA被提供了中靶编辑。当使用ADAR1时，10种向导RNA被提供了中靶。当使用ADAR1和ADAR2时，0种向导RNA提供了中靶编辑。
图41A示出了使用69000向导RNA序列对靶RNA SERPINA1和ADAR2进行的高通量向导筛选测定中靶核苷酸编辑的动力学速率的汇总。X轴示出了靶RNA上碱基相对于编辑位点的位置。位置0是靶核苷酸。靶核苷酸右边的数字表示靶核苷酸下游的核苷酸。靶核苷酸左边的数字表示靶核苷酸上游的核苷酸。Y轴列出了测试的向导RNA。颜色表示编辑的动力学；较浅的颜色表示较快的动力学，而较暗的颜色表示较慢的动力学。
图41B示出了使用具有A-C错配或优化的排名最前的工程化设计的向导RNA和ADAR2编辑靶RNA SERPINA1的优化的向导RNA的频率。Y轴示出了靶RNA的不同位置的编辑频率百分比。X轴示出了靶RNA的各种位置。顶部图示出了在30分钟的时间点，具有A-C错配的向导RNA提供了高中靶和高脱靶编辑。底部图示出了具有优化的排名最前的工程化设计(来自具有约69,000个无偏向导RNA设计的文库2)的向导RNA提供了高中靶和低脱靶编辑。
图42示出了携带具有G2019S突变的LRRK2微小基因和mCherry(顶部处)或携带具有G2019S突变的LRRK2微小基因、mCherry、CMV和ADAR2(底部处)的piggyBac载体的构建体。
图43A示出了施用两种向导RNA和对照(GFP质粒)后ADAR1对LRRK2 G2019S突变的体外中靶编辑和脱靶编辑。图43B示出了施用两种向导RNA和对照(GFP质粒)后ADAR1和ADAR2对LRRK2 G2019S突变的体外中靶编辑和脱靶编辑。
图44A示出了编码靶向ABCA4、SmOPT序列和U7发夹中的突变的向导RNA的构建体的RNA编辑百分比，其中表达由U1启动子驱动。图44B示出了图44A所示出的各种构建体的桑格测序轨迹。
图45A示出了针对编码靶向ABCA4中的突变的向导RNA的多剂量构建体，ADAR1和ADAR2在细胞中的RNA编辑百分比。图45B示出了针对编码靶向ABCA4中的突变的向导RNA的多剂量构建体，ADAR1在细胞中的RNA编辑百分比。
图46A示出了在HEK293细胞中，由编码U1启动子驱动的向导RNA的工程化多核苷酸促进的ABCA4 G5882A错义突变的RNA编辑。待编辑的靶标A定位于向导RNA(0.100.50)的中心处或定位于与向导RNA(0.100.80)的5'相距81个核苷酸。图46B示出了各种向导的结构。
图47A和图47B示出了热图，所述热图展示了由编码U1启动子驱动的向导RNA的工程化多核苷酸促进的ABCA4 G5882A错义突变的RNA编辑百分比。在天然表达ADAR1的HEK293细胞中测试了RNA编辑，并且用ABCA4微小基因转染并转染以过表达ADAR2。热图示出了待编辑的靶标A和紧邻待编辑的靶标A的3'的脱靶A。
图48示出了位置图，所述位置图示出了由编码U1启动子驱动的具有SmOPT序列和U7发夹的向导RNA的工程化多核苷酸促进的ABCA4 G5882A错义突变的中靶和脱靶编辑。图下方是示出了向导RNA的结构以及观察到的中靶和脱靶编辑模式的示意图。对称4/4内环被放置在脱靶编辑活动附近，作为减少脱靶编辑的策略。
图49示出了与由图48中的向导RNA生成的各种向导RNA结合的靶RNA的结构，所述向导RNA用对称5/5内环或对称4/4/内环修饰，放置在脱靶编辑活动附近。每个向导RNA的δG值示出在右边。所有向导均由编码SmOPT和U7发夹的构建体编码。向导由U1启动子控制。
图50示出了ABCA4 G5882A错义突变的HEK293细胞中由图49的工程化向导RNA促进的ADAR1编辑。所有向导均由编码SmOPT和U7发夹的构建体编码。向导由U1启动子控制。
图51示出了ABCA4 G5882A错义突变的HEK293细胞中由图49的工程化向导RNA促进的ADAR1和ADAR2编辑。所有向导均由编码SmOPT和U7发夹的构建体编码。向导由U1启动子控制。
图52示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb70的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图53示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb71的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图54示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb72的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图55示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb73的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图56示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb74的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图57示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb93的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图58示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb94的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图59示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb95的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图60示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb96的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图61示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb98的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图62示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb99的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图63示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb100的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图64示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导Exb101的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图65示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导1-151的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图66示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导2的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图67示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导3的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图68示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导4的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图69示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导5的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图70示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导6的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图71示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导7的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图72示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导8的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图73示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导9的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图74示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导10的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图75示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导11的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图76示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导12的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图77示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导14的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图78示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导15(gRNA 8)的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图79示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导16的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图80示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导18(exb100镜)的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图81示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导19的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图82示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导20的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图83示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导21(exb101镜)的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图84示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导22的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图85示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导23的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图86示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导24的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图87示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导25的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图88示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导26的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图89示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导27的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图90示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导28的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图91示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导29的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图92示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导30的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图93示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导31的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图94示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的向导32的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图95示出了向导Exb95和Exb94的RNA编辑效率之间的比较。
图96示出了重复实验，所述重复实验评估了由与ABCA4杂交时形成结构特征的向导RNA实现的RNA编辑百分比。
图97示出了使用向导RNA编辑SERPINA1微小基因1和2，所述向导RNA使用具有3'SmOPT hU7发夹的U6或U7启动子表达。
图98示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的列为SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103的向导RNA的SERPINA1的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。
图99示出了靶SNCA的Exb75环状向导的脱靶编辑曲线图和向导的描述。
图100示出了靶SNCA的Exb76环状向导的脱靶编辑曲线图和向导的描述。
图101示出了靶SNCA的Exb77环状向导的脱靶编辑曲线图和向导的描述。
图102示出了靶SNCA的Exb78环状向导的脱靶编辑曲线图和向导的描述。
图103示出了靶SNCA的Exb79环状向导的脱靶编辑曲线图和向导的描述。
图104示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性对照向导02_TTHY2_v0093RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图105示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性对照向导02_TTHY2_v0093的测序所确定的。
图106示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性对照向导02_TTHY2_v0093的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图107示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性对照向导03_Glu2bRG_v0090RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图108示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性对照向导03_Glu2bRG_v0090的测序所确定的。
图109示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性对照向导03_Glu2bRG_v0090的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图110示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0446RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图111示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0446的测序所确定的。
图112示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0446的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图113示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0262RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图114示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0262的测序所确定的。
图116示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0262的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图116示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0022RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图117示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0022的测序所确定的。
图118示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0022的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图119示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导4_Glu2bRG_v0094RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图120示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导4_Glu2bRG_v0094的测序所确定的。
图121示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导4_Glu2bRG_v0094的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图122示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导4_Glu2bRG_v0126RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图123示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导4_Glu2bRG_v0126的测序所确定的。
图124示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导4_Glu2bRG_v0126的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图125示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0278RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图126示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0278的测序所确定的。
图127示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0278的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图128示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0270RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图129示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0270的测序所确定的。
图130示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0270的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图131示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0398RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图132示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0398的测序所确定的。
图133示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0398的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图134示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0314RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图135示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0314的测序所确定的。
图136示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0314的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图137示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0142RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图138示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0142的测序所确定的。
图139示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0142的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图140示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0510RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图141示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0510的测序所确定的。
图142示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0510的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图143示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0310RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图144示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0310的测序所确定的。
图145示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0310的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图146示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0262RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图147示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0262的测序所确定的。
图148示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0262的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图149示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0134RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图150示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0134的测序所确定的。
图151示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0134的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图152示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0070RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图153示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0070的测序所确定的。
图154示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0070的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图155示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0038RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图156示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0038的测序所确定的。
图157示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0038的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图158示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0298RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图159示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0298的测序所确定的。
图160示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0298的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图161示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0294RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图162示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0294的测序所确定的。
图163示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0294的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图164示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0038RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图165示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0038的测序所确定的。
图166示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0038的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图167示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导04_Glu2bRG_v0118RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图168示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导04_Glu2bRG_v0118的测序所确定的。
图169示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导04_Glu2bRG_v0118的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图170示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0326RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图171示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0326的测序所确定的。
图172示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0326的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图173示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0054RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图174示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0054的测序所确定的。
图175示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0054的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图176示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0390RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图177示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0390的测序所确定的。
图178示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0390的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图179示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导03_Glu2bRG_v0014RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图180示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导03_Glu2bRG_v0014的测序所确定的。
图181示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导03_Glu2bRG_v0014的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图182示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0430RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图183示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0430的测序所确定的。
图184示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0430的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图185示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0318RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图186示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0318的测序所确定的。
图187示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0318的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图188示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0006RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图189示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0006的测序所确定的。
图190示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0006的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图191示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0022RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图192示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0022的测序所确定的。
图193示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0022的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图194示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0414RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图195示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0414的测序所确定的。
图196示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0414的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图197示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0302RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图198示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0302的测序所确定的。
图199示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0302的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图200示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导10_Glu2bQR_v0494RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图201示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导10_Glu2bQR_v0494的测序所确定的。
图202示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导10_Glu2bQR_v0494的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图203示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0134RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图204示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0134的测序所确定的。
图205示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0134的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图206示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0006RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图207示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0006的测序所确定的。
图208示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0006的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图209示出了在100分钟处的用于靶向LRRK2的示例性向导11_Glu2bQR_v0294RNA设计以及待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图210示出了随时间而变化的编辑百分比，如通过对示例性向导11_Glu2bQR_v0294的测序所确定的。
图211示出了在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处针对示例性向导11_Glu2bQR_v0294的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图212示出了靶向LRRK2 mRNA的示例性工程化向导RNA序列的热图和结构。热图提供了在10分钟时间点处的编辑曲线的可视化。左图中是用于中靶编辑的5个工程化向导RNA(不具有-2过滤器),并且右图描绘了具有最小-2编辑的用于中靶编辑的5个工程化向导RNA。对应的预测二级结构位于热图下面。
图213示出了包括哑铃设计和靶LRRK2 mRNA的示例性工程化向导RNA。
图214示出了针对图213的871 113.57(顶部)和860 113.57(底部)向导的LRRK2的中靶和脱靶ADAR1(左侧)以及ADAR1+ADAR2(右侧)编辑的图。
图215示出了针对图213的1976 113.57(顶部)和919 113.57(底部)向导的LRRK2的中靶和脱靶ADAR1(左侧)以及ADAR1+ADAR2(右侧)编辑的图。
图216示出了针对图213的2108 113.57(顶部)和1700 113.57(底部)向导的LRRK2的中靶和脱靶ADAR1(左侧)以及ADAR1+ADAR2(右侧)编辑的图。
图217示出了针对图213的844 113.57向导的LRRK2的中靶和脱靶ADAR1(左侧)以及ADAR1+ADAR2(右侧)编辑的图。
图218示出了与靶标结合的以下ABCA4向导的序列和结构：向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0114；向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0156；向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0025；向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0220；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0115；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0081；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0019；以及向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0153。
图219示出了与靶标结合的以下ABCA4向导的序列和结构：向导05_振荡器5G_256_gID_01585_v0027；向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0446；向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0025；向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0414；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0018；向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0154；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0052；以及向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0050。
图220示出了与靶标结合的以下ABCA4向导的序列和结构：向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0190；向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0445；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0116；向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0028；向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0062；向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0189；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0082；以及向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0142。
图221示出了与靶标结合的以下ABCA4向导的序列和结构：向导05_振荡器5G_256_gID_01585_v0155；向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0155；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0113；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0030；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0084；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0049；向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0020；以及向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0051。
图222示出了在100分钟处用ADAR1(顶部)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0073的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图223示出了在100分钟处用ADAR1(顶部)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0268的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图224示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0114的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图225示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0156的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图226示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0025的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图227示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0220的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图228示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0115的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图229示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0081的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图230示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0019的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图231示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0153的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图232示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导05_振荡器5G_256_gID_01585_v0027的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图233示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0446的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图234示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0026的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图235示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0414的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图236示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0018的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图237示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0154的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图238示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0052的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图239示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0050的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图240示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0190的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图241示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0445的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图242示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0116的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图243示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0028的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图244示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0062的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图245示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0189的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图246示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0082的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图247示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导08_AJUBA_512_gID_02773_v0142的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图248示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导05_振荡器5G_256_gID_01585_v0155的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图249示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导06_振荡器5G_256_gID_01981_v0155的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图250示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0113的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图251示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0030的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图252示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0084的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图253示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0049的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图254示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0020的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图255示出了在100分钟处用ADAR1(顶部左侧)、100分钟处用ADAR2(仅次于顶部左侧)；以及在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟用ADAR2(递降)针对示例性向导01_CAPS1_128_gID_00001_v0051的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑；随时间而变化用ADAR1(顶部右侧)的编辑；以及随时间而变化用ADAR2(仅次于顶部右侧)的编辑。
图256示出了与靶SERPINA1 mRNA序列形成单个错配的第一工程化向导RNA(顶部)和靶向SERPINA1 mRNA的第二示例性工程化向导RNA(底部)的描述，其中第二工程化向导RNA与靶SERPINA1 mRNA序列形成两个错配。
图257(左侧)示出了含有U7启动子、U7发夹和SmOPT序列的构建体表现出最高水平的中靶RNA编辑。图257(右侧)示出了在与SERPINA1 mRNA杂交时形成A/C和A/A错配的第二工程化向导RNA表现出较少的局部脱靶编辑。
图258(左侧)描绘了在24小时和48小时处用随向导长度而变化的各种向导编辑SERPINA1 mRNA。图258(右侧)示出了在24小时和48小时处用95个核苷酸和100个核苷酸SERPINA1向导进行的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图259(左侧)描绘了用三个示例性向导编辑SERPINA1 mRNA。图259(右侧)示出了用三个示例性SERPINA1向导进行的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图260(左侧)描绘了用随向导长度而变化的各种指导编辑SERPINA1 mRNA，所述向导长度跨越95、99、103、107、111、115、119和123个核苷酸。图260(顶部右侧)描绘了在引入和不引入凸起的情况下，用向导长度为107、111和119个核苷酸的各种向导编辑SERPINA1mRNA。图260(顶部右侧)示出了针对SERPINA1向导进行的待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑。
图261(右侧)示出了SERPINA1靶序列和寡聚体系链工程化向导RNA的示意图。图261(左侧)描绘了用具有寡聚体系链的工程化向导RNA编辑SERPINA1 mRNA。
图262示出了在本公开的潜在向导RNA与靶RNA杂交时形成的向导-靶RNA支架中存在的各种示例性结构特征的图例。示出的示例结构特征包含8/7不对称环(靶RNA侧上8个核苷酸和向导RNA侧上7个核苷酸)、2/2对称凸起(靶RNA侧上2个核苷酸和向导RNA侧上2个核苷酸)、1/1错配(靶RNA侧上1个核苷酸和向导RNA侧上1个核苷酸)、5/5对称内环(靶RNA侧上5个核苷酸和向导RNA侧上5个核苷酸)、24bp区域(靶RNA侧上24个核苷酸和向导RNA侧上24个核苷酸)和2/3不对称凸起(靶RNA侧上2个核苷酸和向导RNA侧上3个核苷酸)。
图263示出了在靶向LRRK2的本公开的各种工程化向导RNA的向导-靶RNA支架中形成的结构特征的示意图。
图264示出了在靶向LRRK2的本公开的各种工程化向导RNA的向导-靶RNA支架中形成的结构特征的示意图。
图265示出了在靶向LRRK2的本公开的各种工程化向导RNA的向导-靶RNA支架中形成的结构特征的示意图。
具体实施方式
RNA编辑概述
RNA编辑是指一个过程，通过所述过程，RNA可以在特定核苷上合成后被酶修饰。RNA编辑可以包括核苷酸的插入、缺失或取代中的任一种。RNA编辑的实例包含假尿苷化(尿苷残基的异构化)和脱氨基化(通过募集本文所描述的APOBEC酶从胞苷中去除胺基以产生尿苷或C至U编辑；或通过募集如ADAR等腺苷脱氨酶从腺苷中去除胺基以产生肌苷或A至I编辑)。RNA的编辑可以是调节多肽表达的一种方式例如，通过调节进入RNA干扰(RNAi)途径的多肽编码双链RNA(本文中的“dsRNA”)底物。然后，这种调节可以在染色质水平上起作用，以调节多肽的表达。RNA的编辑也可以是用于调节基因翻译的一种方式。RNA编辑可以是一种机制，其中通过调节三联体密码子以引入沉默突变和/或非同义突变来调节转录物再编码。
在某些实施例中，本文提供了组合物和所述组合物的使用方法，所述组合物包括工程化向导RNA和编码所述工程化向导RNA的工程化多核苷酸，所述工程化向导RNA通过RNA编辑实体或其生物活性片段促进RNA编辑。一方面，RNA编辑实体可以包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)和其生物活性片段。在一些情况下，ADAR是催化RNA中的腺苷向肌苷化学转化的酶。因为肌苷的性质类似鸟苷的性质(例如，肌苷将与胞嘧啶形成两个氢键)，肌苷可以被翻译细胞机制识别为鸟苷。因此，“腺苷到肌苷(A到I)RNA编辑”有效地更改了RNA靶标的一级序列。通常，ADAR共享共同的结构域架构，包括可变数量的氨基末端dsRNA结合结构域(dsRBD)和一个单一羧基末端催化脱氨酶结构域。人ADAR具有两个或三个dsRBD。证据表明，当ADAR与双链RNA结合时，所述ADAR可以与其它ADAR形成同二聚体以及异二聚体，然而目前还不能确定编辑是否需要二聚体。
已经鉴定了三种人类ADAR基因(ADAR 1–3)，其中ADAR1(官方符号ADAR)和ADAR2(ADARB1)蛋白质具有充分表征的腺苷脱氨基化活性。ADAR具有典型的模块化结构域组织，所述典型的模块化结构域组织在其N末端区中包含至少两个拷贝的dsRNA结合结构域(dsRBD；具有三个dsRBD的ADAR1；各自具有两个dsRBD的ADAR2和ADAR3)，随后是C末端脱氨酶结构域。
特定的RNA编辑可以导致转录物再编码。因为肌苷共享鸟苷的碱基配对性质，翻译机制将经编辑的腺苷翻译为鸟苷，改变三联体密码子，这可以导致蛋白质产物中的氨基酸取代。基因密码中超过一半的三联体密码子可以通过RNA编辑重新分配。由于基因密码的简并性，RNA编辑可以导致沉默和非同义氨基酸取代。
在一些情况下，靶向RNA可以影响剪接。靶向编辑的腺苷酸可能不成比例地定位于前mRNA的剪接点附近。因此，在dsRNA ADAR底物的形成期间，内含子顺式作用序列可以形成涵盖剪接位点的RNA双链体，并可能使它们不被剪接机制识别。此外，通过修饰选择的腺苷酸，ADAR可以产生或消除剪接位点，广泛影响转录物的后期剪接。类似于翻译机制，剪接体将肌苷翻译为鸟苷，并且因此，可以分别通过AU(IU＝GU)和AA(AI＝AG)的脱氨作用产生典型的GU 5'剪接位点和AG 3'受体位点。对应地，RNA编辑可以破坏典型的AG 3'剪接位点(IG＝GG)。
在一些情况下，靶向RNA可以影响微RNA(miRNA)产生和功能。例如，前miRNA前体的RNA编辑可以影响miRNA的丰度，miRNA种子中的RNA编辑可以将其重新定向到另一个靶标以进行翻译抑制，或者RNA中miRNA结合位点的RNA编辑可以干扰miRNA互补性，并且因此干扰通过RNAi的抑制。
一方面，RNA编辑实体可以被本公开的向导RNA募集。在一些实例中，向导RNA可以募集RNA编辑实体，当与如本文所描述的向导RNA和靶RNA缔和时，所述RNA编辑实体有助于：编辑靶RNA的核苷酸的碱基；调节由受试者靶RNA(如LRRK2、SNCA、PINK1、Tau和本文所描述的其它)编码的多肽的表达；或其组合。向导RNA可以任选地含有能够募集RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，向导RNA可以缺少RNA编辑实体募集结构域，并且仍能够结合RNA编辑实体，或被其结合。
RNA编辑系统
本文公开了工程化向导RNA和编码所述工程化向导RNA的工程化多核苷酸，用于通过RNA编辑实体或其生物活性片段对靶RNA进行位点特异性、选择性编辑。本公开的工程化向导RNA可以包括潜在结构，使得当工程化向导RNA与靶RNA杂交形成向导-靶RNA支架时，潜在结构的至少一部分表现为如本文所描述的结构特征的至少一部分。
如本文所描述的工程化向导RNA包括与本文所描述的靶RNA互补的靶向结构域。因此，向导RNA可以被工程化成位点特异性/选择性靶向特定靶RNA并与其杂交，从而促进通过RNA编辑实体或其生物活性片段对特定靶RNA的编辑。靶向结构域可以包含被定位成以下的核苷酸，当向导RNA与靶RNA杂交时，所述核苷酸与待被RNA编辑实体或其生物活性片段编辑的碱基相对并且不与待编辑的碱基进行碱基配对，或者不与其进行完全碱基对。这种错配可以有助于将RNA编辑实体的编辑定位到靶RNA的期望碱基。然而，在一些情况下，除了期望的编辑之外，还可能存在一些(并且在一些情况下显著的)脱靶编辑。
靶RNA和向导RNA的靶向结构域的杂交在向导-靶RNA支架中产生特定的二级和三级结构，所述结构在杂交时表现，其在本文中称为“潜在结构”。潜在结构在表现时成为本文所描述的结构特征，包含错配、凸起、内环和发夹。在不希望受理论束缚的情况下，在向导RNA与靶RNA杂交时产生的本文所描述结构特征的存在将向导RNA配置成通过RNA编辑实体或其生物活性片段促进靶RNA的特定或选择性靶向编辑。进一步地，与仅包括错配的构建体或与靶RNA具有完美互补性的构建体相比，与上文所描述的错配组合的结构特征通常有助于靶腺苷的编辑量增加，减少脱靶编辑或两者。因此，合理设计本公开的工程化向导RNA中的潜在结构以在向导-靶RNA支架中产生特定结构特征可以是促进具有高特异性、选择性和稳健活性的靶RNA的编辑的有力工具。
在一些实施例中，本公开的工程化向导RNA可以在包括其它RNA元件如snRNA序列、snRNA发夹或两者的工程化RNA构建体中提供。例如，工程化RNA可以包括本文所公开的任何工程化向导RNA和SmOPT序列、U7发夹或两者。SmOPT序列、U7发夹或两者都可以定位于工程化向导RNA的5'或3'。
工程化向导RNA
本文提供了具有一种或多种潜在结构(“潜在结构向导RNA”)的工程化向导RNA以及包括所述工程化向导RNA的组合物，所述潜在结构在工程化向导RNA与靶RNA(例如，涉及疾病或病状的RNA)杂交时表现为一个或多个结构特征。如本文所公开的，与包括缺少结构特征的构建体相比，组合本文所描述的结构特征通常有助于靶RNA的靶腺苷的编辑量增加、减少脱靶编辑或两者。如本文所使用的，关于向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸的术语“工程化”是指非天然存在的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。此类工程化向导或编码工程化向导的工程化多核苷酸在施用于受试者时可以称为异源性向导RNA或异源性多核苷酸。在一些实例中，工程化向导RNA可以由工程化多核苷酸编码。在一些情况下，工程化向导可以是RNA工程化向导。在一些情况下，工程化向导可以包括RNA，并且可以进一步包括至少脱氧核苷酸。在一些实例中，工程化向导RNA包括DNA碱基。在一些实例中，工程化向导RNA只包括RNA碱基。在一些实例中，工程化向导RNA包括经修饰的DNA碱基或未经修饰的DNA碱基。在一些实例中，工程化向导RNA包括经修饰的RNA碱基或未经修饰的RNA碱基。在一些实例中，工程化向导RNA包括DNA碱基和RNA碱基两者。在一些实例中，本公开的工程化向导可以用于RNA编辑，例如以预防或治疗疾病或病状。在一些情况下，工程化向导RNA可以与受试者RNA编辑实体联合使用，以编辑靶RNA或调节由靶RNA编码的多肽的表达。在一些实例中，本文所公开的组合物可以包含能够促进受试者RNA编辑实体如ADAR多肽或其生物活性片段进行编辑的工程化向导RNA。
在一些实例中，本文提供了工程化潜在向导RNA，其在与涉及疾病或病状的靶RNA杂交时，形成向导-靶RNA支架，所述向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合，其中所述结构特征基本上在与所述靶RNA杂交时形成。
在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA包括：(a)至少一个RNA编辑酶募集结构域；(b)至少一个结构特征；或(c)其任何组合；其中工程化向导RNA被配置成促进靶RNA分子的核苷酸的核苷酸碱基的编辑以调节从所述靶RNA分子表达的蛋白质(例如，ABCA4、APP、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、CFTR、APP、GBA、PINK1或LIPA)的表达水平。
在一些实例中，靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰(例如，腺苷到肌苷的编辑)可以通过测序(例如，桑格测序或下一代测序)来确认。在一些实例中，确认已经发生化学修饰包括分离一个或多个靶RNA分子，已经向其施用了工程化向导，然后在测序之前通过逆转录酶将靶RNA转化为cDNA。在一些实例中，所采用的测序可以是桑格测序、下一代测序或其组合。
A.靶向结构域
本文所公开的工程化向导RNA可以以任何适于RNA编辑的方式进行工程化。在一些实例中，工程化向导RNA通常包括至少一个允许其与靶RNA分子的区域杂交的靶向序列。靶向序列也可以被称为“靶向结构域”或“靶向区域”。
在一些情况下，工程化向导RNA的靶向序列允许工程化向导RNA通过碱基配对，如沃森克里克碱基配对(Watson Crick base pairing)，靶向RNA序列。在一些实例中，靶向序列可以定位于工程化向导RNA的N末端或C末端。在一些情况下，靶向序列可以定位于两个末端处。靶向序列可以具有任何长度。在一些情况下，靶向序列的长度可以为至少约：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150或至多约200个核苷酸。在一些情况下，靶向序列的长度可以不大于约：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150或200个核苷酸。在一些实例中，工程化向导RNA包括长度可以为约75-100、80-110、90-120或95-115个核苷酸的靶向序列。在一些实例中，工程化向导包括长度可以为约100个核苷酸的靶向序列。
在一些实例中，靶RNA序列可以是mRNA分子或前mRNA分子。图2A和2B展示了使用本文所公开的工程化向导RNA靶向前mRNA分子(图2A)和mRNA分子(图2B)。如图2A所展示的，工程化向导RNA与前mRNA分子的内含子和外显子至少部分互补。在一些实例中，工程化向导RNA仅可以与前mRNA分子的外显子区域互补。
在一些实例中，靶RNA序列可以是mRNA分子。在一些实例中，mRNA分子包括提前终止密码子。在一些实例中，mRNA分子包括1个、2个、3个、4个或5个提前终止密码子。在一些实例中，终止密码子可以是琥珀终止密码子(UAG)、赭石终止密码子(UAA)或蛋白石终止密码子(UGA)或其组合。在一些实例中，提前终止密码子可以是点突变的结果。在一些实例中，提前终止密码子引起由mRNA分子表达的表达产物的翻译终止。在一些实例中，提前终止密码子可以通过mRNA分子上的点突变与两个另外的核苷酸组合产生。在一些实例中，在点突变的5'和3'端上，所述两个另外的核苷酸可以是(i)U和(ii)A或G。
在一些实例中，靶RNA序列可以是提前mRNA分子。在一些实例中，提前mRNA分子包括剪接位点突变。在一些实例中，剪接位点突变促进了前mRNA分子的意外剪接。在一些实例中，剪接位点突变引起由前mRNA分子编码的蛋白质的错误翻译和/或截短。
在一些实例中，靶RNA分子可以是由ABCA4、APP、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、CFTR、APP、GBA、PINK1或LIPA基因编码的前mRNA或mRNA分子、这些中的任何一种的片段或其任何组合。在一些实例中，靶RNA分子可以由选自以下的基因编码：ABCA4、AAT、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、APP、Tau、GBA、PINK1、RAB7A、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7BG1226R、HFE C282Y、LIPA c.894G>A、PCSK9起始位点或SCNN1A起始位点、这些中的任一种的片段或其任何组合。在一些实例中，靶RNA分子编码ABCA4、APP、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、CFTR、APP、GBA、PINK1、Tau或LIPA蛋白、这些中的任何一种的片段或其组合。在一些实例中，靶RNA分子编码ABCA4、AAT、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、APP、Tau、GBA、PINK1、RAB7A、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894G>A、这些中的任一种的片段或其任何组合。在一些实例中，编码RNA分子的DNA包括相对于在其它方面相同的参考DNA分子的突变。在一些实例中，RNA分子包括相对于在其它方面相同的参考RNA分子的突变。在一些实例中，由靶RNA分子编码的蛋白质包括相对于在其它方面相同的参考蛋白质的突变。
在一些实例中，靶RNA分子可以至少部分地由SERPINA1基因编码。在一些实例中，SERPINA1基因包括突变。在一些实例中，突变可以是在野生型SERPINA1基因(如登录号NC_000014.9:c94390654-94376747)内的核苷酸位置9989处用A取代G。在一些实例中，突变引起或促进抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症，如受试者的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)，可以向所述受试者施用工程化向导RNA以治疗AATD。
在一些实例中，靶RNA分子可以至少部分地由ABCA4基因编码。在一些实例中，ABCA4基因包括突变。在一些实例中，突变包括在野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)中的核苷酸位置5882处用A取代G。在一些实例中，突变可以包括在野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)中的核苷酸位置5714处G以及A。在一些实例中，突变包括在野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)中的核苷酸位置6320处用A取代G。在一些实例中，突变引起或促进受试者的黄斑变性，向所述受试者施用工程化向导RNA。在一些实例中，黄斑变性可以是斯特格黄斑变性(Stargardt macular degeneration)。在一些实例中，靶RNA分子包括具有5'G的腺苷。在一些实例中，具有5'G的腺苷可以是RNA编辑实体进行化学修饰的碱基。在一些实例中，RNA编辑实体可以是ADAR，并且ADAR在被双链底物募集后用5'G对腺苷进行化学修饰。
在一些实例中，靶RNA分子至少部分地编码淀粉样蛋白前体蛋白(APP)。在一些实例中，靶RNA分子至少部分地编码APP切割位点。在一些实例中，靶RNA分子至少部分地编码APP蛋白的β分泌酶(BACE)或γ分泌酶切割位点。在一些实例中，靶RNA分子至少部分地编码APP蛋白的β分泌酶(BACE)切割位点。在一些实例中，靶RNA分子至少部分地编码APP起始位点。在一些实例中，APP蛋白在切割位点处的切割引起或有助于脑或血管中的β淀粉样蛋白(Aβ或Abeta)肽沉积。在一些实例中，Abeta沉积引起或促进神经退行性疾病。在一些实例中，所述疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、皮质基底节变性、路易体痴呆(dementiawith Lewy bodies)、阿尔茨海默氏病的路易体变型、帕金森氏病痴呆、皮克氏病(Pick'sdisease)、进行性核上性麻痹、痴呆、具有与17号染色体上tau突变相关的帕金森氏综合征的额颞痴呆或其任何组合。
在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列互补性。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA序列小于100％互补性。例如，靶向序列和被靶向序列结合的靶RNA的区域可以具有单个碱基错配。在其它情况下，工程化向导RNA的靶向序列包括至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至多约200个未配对碱基，其中未配对碱基是本文所公开的结构特征的一部分。在其它情况下，工程化向导RNA的靶向序列包括不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至多约200个未配对碱基，其中未配对碱基是本文所公开的结构特征的一部分。在一些实例中，未配对碱基与本文所提供的结构特征相关。在一些实例中，靶向序列包括至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或至多约15个核苷酸，所述核苷酸相对于与受试者靶RNA具有完美互补性的RNA序列不同。在一些实例中，靶向序列包括与受试者靶RNA的野生型RNA在互补性上不同的不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA具有互补性的至少50个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA具有互补性的50至150个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA具有互补性的50至200个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA具有互补性的50至250个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA具有互补性的50至300个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA具有互补性的50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299或300个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括超过50个核苷酸，并且具有与靶RNA具有互补性的至少50个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括50至400个核苷酸，并且具有与靶RNA具有互补性的50至150个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括50至400个核苷酸，并且具有与靶RNA具有互补性的50至200个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括50至400个核苷酸，并且具有与靶RNA具有互补性的50至250个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括50至400个核苷酸，并且具有与靶RNA具有互补性的50至300个核苷酸。在一些情况下，与靶RNA具有互补性的至少50个核苷酸被本文所描述的结构特征(例如，一个或多个错配、一个或多个凸起、或一个或多个环、一个或多个发夹或其任何组合)分隔开。在一些情况下，与靶RNA具有互补性的50至150个核苷酸被本文所描述的结构特征(例如，一个或多个错配、一个或多个凸起、或一个或多个环、一个或多个发夹或其任何组合)分隔开。在一些情况下，与靶RNA具有互补性的50至200个核苷酸被本文所描述的结构特征(例如，一个或多个错配、一个或多个凸起、或一个或多个环、一个或多个发夹或其任何组合)分隔开。在一些情况下，与靶RNA具有互补性的50至250个核苷酸被本文所描述的结构特征(例如，一个或多个错配、一个或多个凸起、或一个或多个环、一个或多个发夹或其任何组合)分隔开。在一些情况下，与靶RNA具有互补性的50至300个核苷酸被本文所描述的结构特征(例如，一个或多个错配、一个或多个凸起、或一个或多个环、一个或多个发夹或其任何组合)分隔开。例如，靶向序列可以包括总共54个核苷酸，其中依次地，25个核苷酸与靶RNA互补，4个核苷酸形成凸起，并且25个核苷酸与靶RNA互补。作为另一个实例，靶向序列包括总共118个核苷酸，其中依次地，25个核苷酸与靶RNA互补，4个核苷酸形成凸起，25个核苷酸与靶RNA互补，14个核苷酸形成内环，并且50个核苷酸与靶RNA互补。
在一些情况下，工程化向导RNA可以包括多个靶向序列。在一些情况下，工程化向导RNA中的一个或多个靶序列结构域可以与靶RNA的一个或多个区域结合。例如，第一靶向序列可以被配置成与靶RNA的第一区域(例如前mRNA的第一外显子)至少部分互补，而第二靶向序列可以被配置成与靶RNA的第二区域(例如前mRNA的第二外显子)至少部分互补。在一些情况下，多个靶序列可以可操作地连接，以提供靶RNA的多个区域的连续杂交。在一些情况下，多个靶序列可以提供靶RNA的多个区域的非连续杂交。“非连续”重叠或杂交是指靶RNA的第一区域与第一靶向序列的杂交，以及靶RNA的第二区域与第二靶向序列的杂交，其中靶RNA的第一区域和第二区域是不连续的(例如，其中靶RNA的第一区域和第二区域之间存在间插序列)。例如，靶向序列可以被配置成与第一外显子的一部分结合并且可以包括被配置成与第二外显子的一部分结合的内部不对称环(例如，寡聚体系链)，而外显子1的一部分与外显子2的一部分之间的间插序列不与靶向序列或寡聚体系链杂交。使用如本文所描述的被配置用于非连续杂交的工程化向导RNA可以提供许多益处。例如，这种向导可能在转录期间(或其后不久)靶向前mRNA，其然后可以促进使用脱氨酶(例如ADAR)共转录的化学修饰，从而增加化学修饰的总体效率。进一步地，使用聚体系链提供非连续杂交，同时跳过间插序列可以产生更短、更特异的向导RNA，同时减少脱靶编辑。
在一些情况下，被配置用于与靶RNA非连续杂交的工程化向导RNA(例如，包括具有寡聚体系链的靶向序列的工程化向导RNA)可以被配置成与不同区域或被间插序列分隔开的靶RNA结合。在一些情况下，间插序列可以是至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900或10000个核苷酸。在一些情况下，靶向序列和寡聚体系链可以靶向同一内含子或外显子的不同非连续区域。在一些情况下，靶向序列和寡聚体系链可以靶向相邻外显子或内含子的不同非连续区域。在一些情况下，靶向序列和寡聚体系链可以靶向远侧外显子或内含子的不同非连续区域。
B.具有募集结构域的工程化向导RNA
在一些实例中，工程化向导RNA可以包括在不与靶RNA结合的情况下形成和存在的RNA编辑实体募集结构域。RNA编辑实体可以被工程化向导RNA上的RNA编辑实体募集结构域募集。在一些实例中，包括RNA编辑实体募集结构域的工程化向导RNA可以被配置成促进编辑受试者靶RNA的区域的多核苷酸的核苷酸的碱基，调节由受试者靶RNA编码的多肽的表达或两者。在一些情况下，经工程化向导RNA可以被配置成促进受试者RNA编辑实体编辑RNA的区域的核苷酸或多核苷酸的碱基。为了促进编辑，本公开的工程化向导RNA可以募集RNA编辑实体。
可以利用各种RNA编辑实体募集结构域。在一些实例中，募集结构域包括：谷氨酸离子型受体AMPA型亚单位2(GluR2)、APOBEC、MS2噬菌体外壳蛋白募集结构域、Alu、TALEN募集结构域、Zn指多肽募集结构域、mega-TAL募集结构域或Cas13募集结构域、其组合或其经修饰的形式。在一些实例中，超过一个募集结构域可以包含在本公开的工程化向导中。在存在募集序列的实例中，在靶向序列例如反义序列与靶RNA杂交之后，可以利用募集序列来定位RNA编辑实体，以有效地与受试者靶RNA反应。在一些情况下，募集序列可以允许RNA编辑实体与工程化向导RNA的瞬时结合。在一些实例中，募集序列允许RNA编辑实体与工程化向导永久结合。募集序列可以具有任何长度。在一些情况下，募集序列的长度可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、至多约80个核苷酸。在一些情况下，募集序列的长度可以不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75或80个核苷酸。在一些情况下，募集序列的长度可以是约45个核苷酸。在一些情况下，募集序列的至少一部分包括至少1至约75个核苷酸。在一些情况下，募集序列的至少一部分包括约45个核苷酸至约60个核苷酸。在一些方面，RNA编辑实体募集结构域可以形成募集发夹，如本文所公开的。募集发夹可以募集RNA编辑实体，如ADAR。在一些实施例中，募集发夹包括GluR2结构域。在一些实施例中，募集发夹包括Alu结构域。
在一实施例中，RNA编辑实体募集结构域包括GluR2序列或其功能片段。在一些情况下，GluR2序列可以被RNA编辑实体，如ADAR或其生物活性片段识别。在一些实施例中，GluR2序列可以是非天然存在的序列。在一些情况下，GluR2序列可以被修饰，例如用于增强的募集。在一些实施例中，GluR2序列可以包括天然存在的GluR2序列和合成序列的一部分。
在一些实例中，募集结构域包括GluR2序列，或与以下具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性和/或长度的序列：GUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCAC(SEQ ID NO:3)。在一些情况下，募集结构域可以包括与SEQ IDNO:3的至少约10、15、20、25或30个核苷酸至少约80％序列同源性。在一些实例中，募集结构域可以包括与SEQ ID NO:3至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性和/或长度。
还考虑了另外的RNA编辑实体募集结构域。在一实施例中，募集结构域包括载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化多肽样(APOBEC)结构域。在一些情况下，APOBEC结构域可以包括非天然存在的序列或天然存在的序列。在一些实施例中，APOBEC结构域编码序列可以包括经修饰的部分。在一些情况下，APOBEC结构域编码序列可以包括天然存在的APOBEC结构域编码序列的一部分。在一些实例中，募集结构域可以来自MS2噬菌体外壳蛋白募集结构域。在另一个实施例中，募集结构域可以来自Alu结构域。在一些实例中，募集结构域可以包括与以下的至少约：70％、80％、85％、90％或95％序列同源性和/或长度：APOBEC、MS2噬菌体外壳蛋白募集结构域或Alu结构域的至少约15个、20个、25个、30个或35个核苷酸。
在本公开的工程化向导RNA中可以发现任何数量的募集序列。在一些实例中，至少约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或至多约10个募集序列可以包含在工程化向导中。募集序列可以定位于向导RNA的任何位置处。在一些情况下，募集序列可以位于多核苷酸的N末端、中间或C末端。募集序列可以位于靶向序列的上游或下游。在一些情况下，募集序列侧接向导RNA的靶向序列。募集序列可以包括所有核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，尽管在一些情况下可以不排除包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的募集序列。
在一些实例中，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)在本公开的工程化向导RNA与靶RNA杂交时形成。在一些实例中，形成双链底物的靶RNA包括由SERPINA1基因编码的mRNA分子的一部分。在一些实例中，形成双链底物的工程化向导的靶向区域至少部分地与由SERPINA1基因编码的mRNA分子的一部分互补。在一些实例中，双链底物包括单个错配。在一些实例中，错配包括任何两个不碱基配对的核苷酸。在一些实例中，工程化向导RNA包括RNA编辑实体募集结构域，其包括发夹。在一些实例中，发夹包括ADAR募集结构域。在一些实例中，双链底物可以由以下形成：包括由SERPINA1基因编码的mRNA和与由SERPINA1基因编码的mRNA的一部分互补的工程化向导RNA的靶RNA，其中双链底物包括单个错配和包括发夹的RNA编辑实体募集结构域。
在某些实例中，靶向SERPINA1 mRNA并具有RNA编辑实体募集结构域的工程化向导RNA包括以下序列的多核苷酸：
粗体和带下划线文本中的C表示与待编辑的靶标A产生错配的碱基；GluR2发夹募集结构域用粗体、斜体和下划线表示)。在一些实例中，工程化向导RNA包括与上述SEQ ID NO:4具有至少99％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性或至少70％同一性的多核苷酸。在一些实例中，工程化向导包括与上述SEQ ID NO:4具有至少99％长度、至少95％长度、至少90％长度、至少85％长度、至少80％长度或至少70％长度的多核苷酸。
在一些实例中，形成双链底物(向导-靶RNA复合物)的靶RNA包括由SERPINA1基因编码的前mRNA分子的一部分。在一些实例中，形成双链底物的工程化向导RNA的靶向区域至少部分地与由SERPINA1基因编码的前mRNA分子的一部分互补。在一些实例中，双链底物包括单个错配。在一些实例中，错配包括任何两个不碱基配对的核苷酸。在一些实例中，工程化底物包括RNA编辑实体募集结构域，其包括发夹。在一些实例中，发夹充当ADAR募集结构域。在一些实例中，双链底物可以由以下形成：包括由SERPINA1基因编码的前mRNA和与由SERPINA1基因编码的前mRNA的一部分互补的工程化向导的靶RNA，其中双链底物包括单个错配和发夹。
在某些实例中，靶向SERPINA1前mRNA并具有RNA编辑实体募集结构域的工程化向导RNA包括以下序列的多核苷酸：
粗体和带下划线文本中的C表示与待编辑的靶标A产生错配的碱基；GluR2发夹募集结构域用粗体、斜体和下划线文本表示)。在一些实例中，工程化向导包括与上述SEQ ID NO:5具有至少99％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性或至少70％同一性的多核苷酸。在一些实例中，工程化向导RNA包括与上述SEQ ID NO:5具有至少99％长度、至少95％长度、至少90％长度、至少85％长度、至少80％长度或至少70％长度的多核苷酸。
在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA包括与下文表1中列出的序列具有至少99％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性或至少70％同一性的多核苷酸。在一些实例中，工程化向导RNA包括与下文表1中列出的序列具有至少99％长度、至少95％长度、至少90％长度、至少85％长度、至少80％长度或至少70％长度的多核苷酸。在一些实例中，本文所公开的工程化向导包括下文表1中列出的序列中的任何序列的多核苷酸。
表1–具有募集结构域的工程化向导RNA
C.具有潜在结构的工程化向导
在一些实施例中，本公开提供了具有潜在结构的工程化向导RNA，也称为“潜在向导RNA”。潜在结构是指仅在向导RNA与靶RNA杂交时在向导-靶RNA支架内形成的结构特征。例如，向导RNA的序列提供一个或多个潜在结构特征，但这些潜在结构特征仅在潜在向导RNA与靶RNA杂交时形成。因此，所述一个或多个潜在结构特征表现为潜在向导RNA与靶RNA杂交时的结构特征。在潜在向导RNA与靶RNA杂交时，结构特征形成，并且向导RNA中提供的潜在结构因此被揭露。工程化潜在向导RNA可以包括序列的一部分，所述序列在与靶RNA杂交时形成结构特征，而不是待编辑的靶腺苷处的单个A/C错配特征的至少一部分。在一些实施例中，与靶RNA杂交时形成的潜在结构特征包含向导RNA的至少两个连续核苷酸。在一些情况下，除了待编辑的靶腺苷处的A/C错配之外，潜在结构特征可以包含本文所公开的任何结构特征，其中这些另外的结构特征相对于缺乏另外的结构特征的在其它方面相当的向导RNA，提供了RNA编辑实体对靶腺苷的编辑量的增加，RNA编辑实体对局部脱靶腺苷的编辑量减少或两者。因此，本公开的工程化潜在向导RNA包括潜在结构特征，其在与向导-靶RNA支架内的靶RNA杂交时表现出多于一种结构特征。向导-靶RNA支架内存在多个结构特征提供了二级和三级三维结构，所述结构作为ADAR的优异底物，并且通过在其它方面混杂的酶驱动靶腺苷出乎意料的高编辑效率和靶腺苷的高选择性编辑(减少的局部脱靶腺苷的编辑)。在与向导-靶RNA支架内的靶RNA杂交时基本上形成结构特征的本文所描述的工程化潜在向导RNA的潜在结构也可以在通过ADAR编辑时，驱动改进的翻译和增加的蛋白质产生。在一些实施例中，本文所公开的具有潜在结构的工程化向导RNA可以施用于细胞并引起优异中靶编辑、减少的局部脱靶编辑、增加的翻译、增加的蛋白质产生或其任何组合，所有都与缺乏潜在结构的向导RNA相比。在一些实施例中，本文所公开的工程化潜在向导RNA具有潜在结构，并且还缺乏在不存在与靶RNA结合的情况下形成和存在的RNA编辑实体募集结构域。双链RNA(dsRNA)底物在本文中也可以称为向导-靶RNA支架。如本文所公开的，向导-靶RNA支架可以是在向导RNA与靶RNA杂交时形成的所得双链RNA双链体，其中在与靶RNA杂交之前的向导RNA包括序列的一部分，其在与靶RNA杂交时形成结构特征的至少一部分，而不是待编辑的靶腺苷处的单个A/C错配特征。因此，向导-靶RNA支架具有在双链RNA双链体内形成的结构特征。例如，向导-靶RNA支架可以具有选自凸起、错配、内环、发夹或摆动碱基对的两个或更多个特征。在一些实施例中，具有潜在结构的工程化向导RNA缺乏在不存在与靶RNA结合的情况下形成和存在的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，具有潜在结构的工程化向导RNA进一步包括在不存在与靶RNA结合的情况下形成和存在的募集结构域。
图262示出了在本公开的潜在向导RNA与靶RNA杂交时形成的向导-靶RNA支架中存在的本公开的各种示例性结构特征的图例。图262所示出的示例结构特征包含8/7不对称环(靶RNA侧上8个核苷酸和向导RNA侧上7个核苷酸)、2/2对称凸起(靶RNA侧上2个核苷酸和向导RNA侧上2个核苷酸)、1/1错配(靶RNA侧上1个核苷酸和向导RNA侧上1个核苷酸)、5/5对称内环(靶RNA侧上5个核苷酸和向导RNA侧上5个核苷酸)、24bp区域(靶RNA侧上24个核苷酸和向导RNA侧上24个核苷酸)和2/3不对称凸起(靶RNA侧上2个核苷酸和向导RNA侧上3个核苷酸)。除非另有说明，否则给定结构特征中参与的核苷酸数量表示为靶RNA侧上的核苷酸多于向导RNA侧上的核苷酸。此图例中还示出了每个图的位置注释的说明。例如，待编辑的靶核苷酸指定为0位置。在待编辑的靶核苷酸的下游(3')，每个核苷酸以+1的增量进行计数。在待编辑的靶核苷酸的上游(5')，每个核苷酸以-1的增量进行计数。因此，此图例中的示例2/2对称凸起位于向导-靶RNA支架中的+12至+13位置处。类似地，此图例中的2/3不对称凸起位于向导-靶RNA支架中的-36至-37位置处。如本文所使用的，位置注释是相对于待编辑的靶核苷酸和在向导-靶RNA支架的靶RNA侧上提供的。如本文所使用的，如果注释了单个位置，则结构特征从所述位置延伸远离位置0(待编辑的靶核苷酸)。例如，如果潜在向导RNA在本文中被注释为在位置-36处形成2/3不对称凸起，则2/3不对称凸起相对于待编辑的靶核苷酸(位置0)从-36位置到-37位置在向导-靶RNA支架的靶RNA侧上形成。作为另一个实例，如果潜在向导RNA在本文中被注释为在位置+12处形成2/2对称凸起，则2/2对称凸起相对于待编辑的靶核苷酸(位置0)从+12位置到+13位置在向导-靶RNA支架的靶RNA侧上形成。
在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA，当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，不会募集RNA编辑实体。在一些实例中，(i)工程化向导RNA，当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，不包括任何凸起、内环或发夹；(ii)工程化向导RNA，当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，不包括募集解离常数低于约100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1,000nM的人ADAR1的任何凸起、内环或发夹，如通过体外测定确定的；(iii)工程化向导RNA在与靶RNA分子至少部分地结合并由此形成向导-靶RNA支架时，被配置成采用募集RNA编辑实体的结构特征(与靶RNA一起)；或(iv)其任何组合。在一些实例中，工程化向导RNA，当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，如果它与RNA编辑实体结合，则以约大于或等于约100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1,000nM的解离常数进行结合。在一些实例中，工程化向导RNA，当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，如果它与RNA编辑实体结合，则以约大于或等于约500nM的解离常数进行结合。在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA，当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，缺乏本文所描述的结构特征。在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA，当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，不包括任何凸起、内环或发夹。在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA，当存在于水溶液中且未与靶RNA分子结合时，可以不是线性的并且不包括任何结构特征。
在一些实例中，工程化向导RNA可以被配置成促进受试者RNA编辑实体对靶RNA的区域的核苷酸或多核苷酸的碱基的编辑。为了促进编辑，本公开的工程化向导RNA可以募集RNA编辑实体。
在不存在与靶RNA结合的情况下形成和存在的RNA编辑实体募集结构域不包含在工程化向导RNA中的情况下，工程化向导RNA可以仍然能够与受试者RNA编辑实体(例如，ADAR)结合，以促进靶RNA的编辑和/或调节由受试者靶RNA编码的多肽的表达。这可以通过存在结构特征来实现，所述结构特征表现在向导RNA和靶RNA杂交时形成的潜在结构。结构特征可以包括以下中的任何一者：错配、对称凸起、不对称凸起、对称内环、不对称内环、发夹、摆动碱基对、结构化基序、环化RNA、化学修饰或其任何组合。一方面，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)可以在本公开的工程化向导RNA与靶RNA杂交时形成。本文描述了一种特征，其对应于可能存在于本公开的dsRNA底物中的几个结构特征中的一个。特征的实例包含错配、凸起(对称凸起或不对称凸起)、内环(对称内环或不对称内环)或发夹(包括非靶向结构域的发夹)。本公开的工程化向导RNA可以具有1至50个特征。例如，本公开的工程化向导RNA可以具有1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至35、35至40、40至45、45至50、5至20、5至25、5至30、5至35、5至40、5至45、5至50、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至11、1至12、1至13、1至14、1至15、1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、1至21、1至22、1至23、1至24、1至25、1至26、1至27、1至28、1至29、1至30、1至31、1至32、1至33、1至34、1至35、1至36、1至37、1至38、1至39、1至40、1至41、1至42、1至43、1至44、1至45、1至46、1至47、1至48、1至49、4至5、2至10、20至40、10至40、20至50、30至50、4至7或8至10个特征。在一些情况下，工程化向导RNA可以具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个特征。
如本文所公开的，“结构化基序”包括在dsRNA底物(向导-靶RNA支架)中的两个或更多个特征。
双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)在本公开的工程化向导RNA与靶RNA杂交时形成。如本文所公开的，“错配”是指向导RNA中的可以与dsRNA内的靶RNA中的相反核苷酸不配对或完全不配对的多核苷酸。错配可以包括任何两个不碱基配对、不互补或两者的核苷酸。在一些实施例中，错配可以是A/C错配。A/C错配可以包括与靶RNA中的A相反的本公开的工程化向导RNA中的C。A/C错配可以包括与靶RNA中的C相反的本公开的工程化向导RNA中的A。在一实施例中，G/G错配可以包括与靶RNA中的G相反的本公开的工程化向导RNA中的G。在一些实施例中，位于编辑位点5'的错配可以促进待编辑的靶标A的碱基翻转。错配也可能有助于赋予序列特异性。在一实施例中，错配包括G/G错配。在一实施例中，错配包括A/C错配，其中A可以在靶RNA中，并且C可以在工程化向导RNA的靶向序列中。在另一个实施例中，A/C错配中的A可以是由受试者RNA编辑实体编辑的靶RNA中的核苷酸的碱基。
一方面，结构特征可以包含如上文所描述的潜在结构，以及非潜在结构。如本文所描述的，“非潜在结构”是指可以独立于与靶RNA的结合而在工程化RNA中形成的结构。例如，募集发夹(例如，GluR2募集结构域)可能不是潜在结构，而是可能独立地形成于工程化RNA中。在一些情况下，当工程化RNA与靶RNA结合时，结构特征可以形成，因此是潜在结构。当工程化RNA与其它分子如肽、核苷酸或小分子缔合时，也可以形成结构特征。在某些实施例中，当工程化向导RNA与靶RNA缔合时，存在结构特征。
在一些实例中，当工程化向导RNA与靶RNA缔合时，存在结构特征。工程化向导RNA的结构特征可以形成基本上线性的二维结构。工程化向导RNA的结构特征可以包括线性区域、茎环、十字形、趾托、错配凸起或其任何组合。在一些情况下，结构特征可以包括茎、发夹环、假结、凸起、内环、多环、G-四链体或其任何组合。在一些实例中，工程化向导RNA可以采用A-形式、B-形式、Z-形式或其任何组合。
在一些情况下，结构特征可以是发夹。在一些情况下，工程化向导RNA可能缺少发夹结构域(例如，工程化向导RNA在没有与靶RNA杂交的情况下不会形成分子内发夹)。在其它情况下，工程化向导RNA可以含有发夹结构域或超过一个发夹结构域。发夹可以定位于向导RNA中的任何位置。如本文所公开的，“发夹”是RNA双链体，其中单个RNA链自身折叠以形成RNA双链体。单个RNA链由于在折叠区的上游和下游具有彼此碱基对的核苷酸序列而自身折叠。发夹可以在整个双链体结构的长度上具有10至500个核苷酸。发夹的茎环结构可以是3至15个核苷酸长。发夹可以存在于本文所公开的任何工程化向导RNA中。本文所公开的工程化向导RNA可以具有1至10个发夹。在一些实施例中，本文公开的工程化向导RNA具有1个发夹。在一些实施例中，本文所公开的工程化向导RNA具有2个发夹。如本文所公开的，发夹可以是募集发夹或非募集发夹。发夹可以位于本公开的工程化向导RNA内的任何地方。在一些实施例中，一个或多个发夹可以存在于本公开的工程化向导RNA的3'端处、本公开的工程化向导RNA的5'端处或本公开的工程化向导RNA的靶向序列内或其任何组合中。
在又另一方面，结构特征包括非募集发夹。如本文所公开的，非募集发夹可以表现出改善工程化向导RNA定位到靶RNA的功能。在一些实施例中，非募集发夹表现出改善工程化向导RNA定位到靶RNA的区以进行杂交的功能。在一些实施例中，非募集发夹改善了核保留。在一些实施例中，结构特征不是由潜在结构形成的，而是预先形成的结构(例如，GluR2募集发夹或来自U7 snRNA的发夹)。在一些实施例中，预先形成的非募集发夹(不是潜在结构)是来自U7 snRNA的发夹。
另一方面，结构特征包括摆动碱基。“摆动碱基对”是指两个弱配对的碱基。例如，本公开的摆动碱基对可以是指与U配对的G。
本公开的发夹可以是任何长度。一方面，发夹可以是约5-200个或更多个核苷酸。在一些情况下，发夹可以包括约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个或400个或更多个核苷酸。在其它情况下，发夹还可以包括5至10、5至20、5至30、5至40、5至50、5至60、5至70、5至80、5至90、5至100、5至110、5至120、5至130、5至140、5至150、5至160、5至170、5至180、5至190、5至200、5至210、5至220、5至230、5至240、5至250、5至260、5至270、5至280、5至290、5至300、5至310、5至320、5至330、5至340、5至350、5至360、5至370、5至380、5至390或5至400个核苷酸。
在一些情况下，结构特征可以是凸起。凸起可以包括靶链与工程化向导RNA链之间的1至4个(有意的)核酸错配。在一些情况下，链之间1至4个的连续错配构成了凸起，只要凸起区(核苷酸的错配段)在具有杂交的互补dsRNA区的两侧上侧接。凸起可以定位于向导RNA的任何位置处，除了5'端或3'端的最后一个核苷酸。在一些情况下，凸起定位于距5'羟基或3'羟基约30至约70个核苷酸处。
在一实施例中，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)在本公开的工程化向导RNA与靶RNA杂交时形成。如本文所公开的，凸起是指基本上仅在向导-靶RNA支架形成时形成的结构，其中工程化向导RNA或靶RNA中的连续核苷酸与其在相对链上的位置对应物不互补。凸起可以改变向导-靶RNA支架的二级结构或三级结构。凸起可以独立地在向导-靶RNA支架的向导RNA侧上具有0至4个连续核苷酸，并且在向导-靶RNA支架的靶RNA侧上具有1至4个连续核苷酸，或者凸起可以独立地在向导-靶RNA支架的靶RNA侧上具有0至4个核苷酸，并且在向导-靶RNA支架的向导RNA侧上具有1至4个连续核苷酸。然而，如本文所使用的，凸起不是指工程化向导RNA的单个参与核苷酸和靶RNA的单个参与核苷酸不碱基配对的结构——不碱基配对的工程化向导RNA的单个参与核苷酸和靶RNA的单个参与核苷酸在本文中称为错配。进一步地，在向导RNA侧或靶RNA侧的参与核苷酸数量超过4时，所得结构不再被视为凸起，而是被视为内环。在一些实施例中，本公开的向导-靶RNA支架具有2个凸起。在一些实施例中，本公开的向导-靶RNA支架具有3个凸起。在一些实施例中，本公开的向导-靶RNA支架具有4个凸起。因此，凸起可以是由工程化潜在向导RNA提供的潜在结构形成的结构特征。
在一些实施例中，向导-靶RNA支架中凸起的存在可以定位或有助于定位ADAR以选择性地编辑靶RNA中的靶标A并减少靶RNA中的非靶标A的脱靶编辑。在一些实施例中，向导-靶RNA支架中凸起的存在可以募集或有助于募集另外量的ADAR。本文所公开的向导-靶RNA支架中的凸起可以募集其它蛋白质，如其它RNA编辑实体。在一些实施例中，位于编辑位点的5'的凸起可以促进待编辑的靶标A的碱基翻转。相对于靶RNA中存在的其它A，凸起还可以有助于赋予待编辑的靶RNA的A的序列特异性。例如，凸起可以通过将其限制在产生靶标A的选择性编辑的定向中来帮助指导ADAR编辑。在一些实施例中，通过将靶标A定位在两个凸起之间(例如，基于工程化向导RNA，定位在5'端凸起与3'端凸起之间)来实现靶标A的选择性编辑。在一些实施例中，两个凸起都是对称凸起。在一些实施例中，所述两个凸起各自由向导-RNA支架的工程化向导RNA侧上的2个核苷酸和向导-RNA支架的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。在一些实施例中，所述两个凸起各自由向导-RNA支架的工程化向导RNA侧上的3个核苷酸和向导-RNA支架的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。在一些实施例中，所述两个凸起各自由向导-RNA支架的工程化向导RNA侧上的4个核苷酸和向导-RNA支架的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。在一些实施例中，靶标A是介于两个凸起之间的位置，并且距凸起(例如，距5'端凸起或3'端凸起)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399或400个核苷酸。在一些实施例中，另外的结构特征位于凸起之间(例如，5'端凸起与3'端凸起之间)。在一些实施例中，凸起中的错配包括用于在靶RNA中编辑的核苷酸碱基(例如，凸起中的A/C错配，其中工程化向导RNA中凸起的部分包括与靶RNA中凸起部分中的A错配的C，并且A被编辑)。
一方面，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)在本公开的工程化向导RNA与靶RNA杂交时形成。凸起可以是对称凸起或不对称凸起。出于说明目的，图262中描绘了向导-靶RNA支架中的对称凸起和不对称凸起的实例。在图262中，示出了+12至+13位置处的2/2对称凸起(靶RNA侧上2个核苷酸以及向导RNA侧上2个核苷酸)的实例。在图262中，还示出了位置-36至-37处的2/3不对称凸起(靶RNA侧上2个核苷酸以及向导RNA侧上3个核苷酸)的实例。当在凸起的每一侧上存在相同数量的核苷酸时，形成对称凸起。例如，本公开的向导-靶RNA支架中的对称凸起可以在向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧和靶RNA侧上具有相同数量的核苷酸。本公开的对称凸起可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的2个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的对称凸起可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的3个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的对称凸起可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的4个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。因此，对称凸起可以是由工程化潜在向导RNA提供的潜在结构形成的结构特征。
在一些情况下，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)可以在本公开的工程化向导RNA与靶RNA杂交时形成。凸起可以是对称凸起或不对称凸起。当在凸起的每一侧上存在不同数量的核苷酸时，形成不对称凸起。例如，本公开的向导-靶RNA支架中的不对称凸起在向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧和靶RNA侧上可以具有不同数量的核苷酸。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的0个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的0个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的0个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的0个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的0个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的0个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的0个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的0个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的2个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的2个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的2个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的2个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的3个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的3个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的4个核苷酸形成。因此，不对称凸起可以是由工程化潜在向导RNA提供的潜在结构形成的结构特征。
一方面，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)可以在本公开的工程化向导RNA与靶RNA杂交时形成。如本文所公开的，内环是指基本上仅在形成向导-靶RNA支架时形成的结构，其中工程化向导RNA或靶RNA中的核苷酸与其在相反链上的位置对应物不互补，并且其中内环的一侧(向导-靶RNA支架的靶RNA侧或工程化向导RNA侧上)具有5个或更多个核苷酸。在向导RNA侧和靶RNA侧的参与核苷酸数量均低于5时，所得结构不再被视为内环，而是被视为凸起或错配，这取决于结构特征的大小。内环可以是对称内环或不对称内环。出于说明目的，图262中描绘了向导-靶RNA支架中的对称凸起和不对称凸起的实例。在图262中，示出了+31至+38位置处的8/7不对称内环(靶RNA侧上8个核苷酸以及向导RNA侧上7个核苷酸)的实例。在图262中，还示出了位置-7至-11处的5/5对称内环(靶RNA侧上5个核苷酸以及向导RNA侧上5个核苷酸)的实例。在编辑位点附近存在的内环可能有助于待编辑的靶RNA中靶标A的碱基翻转。
内环可以是对称内环或不对称内环。在一些实施例中，通过将靶标A定位在两个环之间(例如，基于工程化向导RNA，定位在5'端环与3'端环之间)来实现对靶标A的选择性编辑。在一些实施例中，两个环都是对称环。在一些实施例中，所述两个内环各自由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸形成。在一些实施例中，所述两个内环各自由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。在一些实施例中，所述两个内环各自由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的7个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。在一些实施例中，所述两个内环各自由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的8个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的8个核苷酸形成。在一些实施例中，所述两个内环各自由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的9个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的9个核苷酸形成。在一些实施例中，所述两个内环各自由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的10个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的10个核苷酸形成。在一些实施例中，靶标A是介于两个环之间的位置，并且距环(例如，距5'端环或3'端环)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399或400个核苷酸。在一些实施例中，另外的结构特征位于环之间(例如，5'端环与3'端环之间)。
当在内环的每一侧上存在相同数量的核苷酸时，形成对称内环。例如，本公开的向导-靶RNA支架中的对称内环可以在向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧和靶RNA侧上具有相同数量的核苷酸。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的7个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的8个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的8个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的9个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的10个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的10个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的15个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的15个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的20个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的20个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的30个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的30个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的40个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的40个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的60个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的60个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的70个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的70个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的80个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的80个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的90个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的90个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的110个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的110个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的120个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的120个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的130个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的130个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的140个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的140个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的250个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的250个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的350个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的350个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的450个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的450个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的600个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的600个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的700个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的700个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的800个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的800个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的900个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的900个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由向导-靶RNA支架靶标的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸形成。因此，对称内环可以是由工程化潜在向导RNA提供的潜在结构形成的结构特征。
当在内环的每一侧上存在不同数量的核苷酸时，形成不对称内环。例如，本公开的向导-靶RNA支架中的不对称内环在向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧和靶RNA侧上可以具有不同数量的核苷酸。
本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5至150个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5至150个核苷酸形成，其中向导-靶RNA支架靶标的工程侧上的核苷酸数量与向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的核苷酸数量不同。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5至1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5至1000个核苷酸形成，其中向导-靶RNA支架靶标的工程侧上的核苷酸数量与向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的核苷酸数量不同。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的8个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的8个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的9个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的7个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的8个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的8个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的9个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的6个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的7个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的8个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的7个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的8个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的7个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的9个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的7个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的7个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的7个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的8个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的9个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的8个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的8个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的8个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的9个核苷酸和向导-靶RNA支架的靶RNA侧的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的9个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的5个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的200个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的50个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的200个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的100个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的200个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的150个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的200个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的200个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的200个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的200个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的300个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的400个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的500个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由向导-靶RNA支架的靶RNA侧上的1000个核苷酸和向导-靶RNA支架的工程化向导RNA侧上的500个核苷酸形成。因此，不对称内环可以是由工程化潜在向导RNA提供的潜在结构形成的结构特征。
包括内环的结构特征可以具有大于5个核苷酸的任何大小。在一些情况下，内环包括至少：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在一些情况下，内环包括总共至少约5-10、5-15、10-20、15-25、20-30、5-30、5-40、5-50、5-60、5-70、5-80、5-90、5-100、5-110、5-120、5-130、5-140、5-150、5-200、5-250、5-300、5-350、5-400、5-450、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-110、20-120、20-130、20-140、20-150、30-40、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、30-110、30-120、30-130、30-140、30-150、30-200、30-250、30-300、30-350、30-400、30-450、30-500、30-600、30-700、30-800、30-900、30-1000、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、40-110、40-120、40-130、40-140、40-150、40-200、40-250、40-300、40-350、40-400、40-450、40-500、40-600、40-700、40-800、40-900、40-1000、50-60、50-70、50-80、50-90、50-100、50-110、50-120、50-130、50-140、50-150、50-200、50-250、50-300、50-350、50-400、50-450、50-500、50-600、50-700、50-800、50-900、50-1000、60-70、60-80、60-90、60-100、60-110、60-120、60-130、60-140、60-150、60-200、60-250、60-300、60-350、60-400、60-450、60-500、60-600、60-700、60-800、60-900、60-1000、70-80、70-90、70-100、70-110、70-120、70-130、70-140、70-150、70-200、70-250、70-300、70-350、70-400、70-450、70-500、70-600、70-700、70-800、70-900、70-1000、80-90、80-100、80-110、80-120、80-130、80-140、80-150、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、80-600、80-700、80-800、80-900、80-1000、90-100、90-110、90-120、90-130、90-140、90-150、90-200、90-250、90-300、90-350、90-400、90-450、90-500、90-600、90-700、90-800、90-900、90-1000、100-110、100-120、100-130、100-140、100-150、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-450、100-500、100-600、100-700、100-800、100-900、100-1000、110-120、110-130、110-140、110-150、110-200、110-250、110-300、110-350、110-400、110-450、110-500、110-600、110-700、110-800、110-900、110-1000、120-130、120-140、120-150、120-200、120-250、120-300、120-350、120-400、120-450、120-500、120-600、120-700、120-800、120-900、120-1000、130-140、130-150、130-200、130-250、130-300、130-350、130-400、130-450、130-500、130-600、130-700、130-800、130-900、130-1000、140-150、140-200、140-250、140-300、140-350、140-400、140-450、140-500、140-600、140-700、140-800、140-900、140-1000、150-200、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500、150-600、150-700、150-800、150-900、150-1000、200-250、200-300、200-350、200-400、200-450、200-500、200-600、200-700、200-800、200-900、200-1000、250-300、250-350、250-400、250-450、250-500、250-600、250-700、250-800、250-900、250-1000、300-350、300-400、300-450、300-500、300-600、300-700、300-800、300-900、300-1000、350-400、350-450、350-500、350-600、350-700、350-800、350-900、350-1000、400-450、400-500、400-600、400-700、400-800、400-900、400-1000、500-600、500-700、500-800、500-900、500-1000、600-700、600-800、600-900、600-1000、700-800、700-900、700-1000、800-900、800-1000或900-1000个核苷酸。
在一些实施例中，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)包括碱基配对区域。如本文所公开的，碱基配对(bp)区域是指向导-靶RNA支架的一段，其中向导RNA中的碱基与靶RNA中的相对碱基配对。碱基配对区域可以从向导-靶RNA支架的一端延伸到向导-靶RNA支架的另一端。碱基配对区域可以在两个结构特征之间延伸。碱基配对区域可以从向导-靶RNA支架的一端延伸到结构特征。碱基配对区域可以从结构特征延伸到向导-靶RNA支架的另一端。在一些实施例中，碱基配对区域具有1bp至100bp、1bp至90bp、1bp至80bp、1bp至70bp、1bp至60bp、1bp至50bp、1bp至45bp、1bp至40bp、1bp至35bp、1bp至30bp、1bp至25bp、1bp至20bp、1bp至15bp、1bp至10bp、1bp至5bp、5bp至10bp、5bp至20bp、10bp至20bp、10bp至50bp、5bp至50bp、至少1bp、至少2bp、至少3bp、至少4bp、至少5bp、至少6bp、至少7bp、至少8bp、至少9bp、至少10bp、至少12bp、至少14bp、至少16bp、至少18bp、至少20bp、至少25bp、至少30bp、至少35bp、至少40bp、至少45bp、至少50bp、至少60bp、至少70bp、至少80bp、至少90bp、至少100bp。
在一些实例中，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)在本公开的工程化向导与靶RNA杂交时形成。在一些实例中，双链底物包括模拟天然存在的ADAR底物的结构特征的结构特征。在一些实例中，天然存在的ADAR底物可以是果蝇ADAR底物。在一些实例中，天然存在的果蝇ADAR底物可以如图3和4所描绘的，并且包括两个凸起。形成果蝇底物结构特征的特定核苷酸相互作用在图4中列出的序列上进行了注释并且包含(1)A与C错配；(2)5'G的G错配；(3)两个摆动碱基对；(4)-7位置处的错配和+11位置处的不对称凸起(2/1-靶/向导)；以及(5)+6位置处的不对称凸起(1/0-靶/向导)。在一些实例中，双链底物的结构特征模拟果蝇底物的结构特征，因为双链底物包括也存在于果蝇底物中的结构特征中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6或7)。在一些实例中，双链底物中的所述一个或多个结构特征与天然存在的果蝇底物的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6或7)结构特征共享至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同源性和/或长度。在一些实例中，双链底物中的所述一个或多个结构特征与果蝇底物的一个或多个结构特征不共享序列同源性或共享小于50％序列同源性。在一些实例中，双链底物中的所述一个或多个特征可以定位(相对于彼此)与天然ADAR底物的结构特征相同或类似。
模拟和相关特征的一些实例包含在图25A至图28中。
在一些情况下，结构特征可以是结构化基序。如本文所公开的，结构化基序包括在dsRNA底物中的两个或更多个结构特征。结构化基序可以包括如上述权利要求中的结构特征的任何组合，以产生用于在精确位置处进行ADAR编辑的理想底物。这些结构基化序可以被人工工程化以使ADAR编辑最大化，和/或这些结构化基序可以被建模以概括已知的ADAR底物。
在一些情况下，工程化向导RNA可以是环化的。在一些情况下，本文所提供的工程化向导RNA可以是环化的或呈环状构型的。在一些方面，至少部分环状向导RNA缺少5'羟基或3'羟基。
在一些实例中，工程化向导RNA可以包括主链，所述主链包括多个共价连接在一起的糖和磷酸部分。在一些实例中，工程化向导RNA的主链可以包括在DNA中脱氧核糖或RNA中核糖的5'碳上的磷酸基团中的第一羟基与DNA中脱氧核糖或RNA中核糖的3'碳上的第二羟基之间的磷酸二酯键连接。
在一些实施例中，工程化向导RNA的骨架可以缺少能够暴露于溶剂的5'还原羟基、3'还原羟基或两者。在一些实施例中，工程化向导的主链可以缺少能够暴露于核酸酶的5'还原羟基、3'还原羟基或两者。在一些实施例中，工程化向导的主链可以缺少能够暴露于水解酶的5'还原羟基、3'还原羟基或两者。在一些情况下，工程化向导的主链可以被表示为环状2维格式的多核苷酸序列，其中一个核苷酸在另一个核苷酸之后。在一些情况下，工程化向导的主链可以被表示为环2维格式的多核苷酸序列，其中一个核苷酸在另一个核苷酸之后。在一些情况下，5'羟基、3'羟基或两者可以通过磷-氧键连接。在一些情况下，5'羟基、3'羟基或两者可以被修饰成具有含磷部分的磷酸酯。
在一些实施例中，本公开提供了分裂向导RNA系统，其中包括募集结构域(例如，GluR2)的本公开的工程化向导RNA可以作为分裂向导RNA系统递送。
在一些实施例中，分裂向导RNA系统可以包括两个区段——ADAR募集结构域(例如，GluR2或Alu)和至少一个靶向结构域。靶向结构域可以位于募集结构域的5'和/或3'端处。至少一个靶向结构域具有与靶RNA区段的序列仅部分互补的序列。这两个区段与靶RNA的结合形成了三分子复合物，所述三分子复合物募集ADAR酶以对向导-靶RNA支架中的一个或多个错配的腺苷残基进行脱氨基化。
在一些实施例中，分裂向导RNA系统可以包括两个区段——包括募集结构域(例如，GluR2或Alu)的第一部分和任选地靶向结构域的一部分的第一区段以及包括募集结构域的第二部分和任选地靶向结构域的一部分的第二区段。例如，募集结构域(例如，GluR2发夹)可以放置在靶向结构域内部。内部募集结构域可以分为两个不对称5'和3'区段，其中5'GluR2区段定位于第一向导RNA内，并且3'GluR2区段定位于第二向导RNA内。在工程化向导RNA的两个区段与靶RNA杂交时，GluR2发夹被重构。因此，这两个区段与靶RNA的结合形成了三分子复合物，所述三分子复合物含有能够募集ADAR进行靶特异性RNA编辑的重构GluR2发夹。
在一些实施例中，本文所描述的工程化向导RNA可以包括修饰。化学修饰可以是取代、插入、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化或其任何组合。在一些情况下，修饰可以是化学修饰。合适的化学修饰包括以下中的任一者：5'腺苷酸、5'鸟苷-三磷酸帽、5'N7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5'三磷酸帽、3'磷酸、3'硫代磷酸、5'磷酸、5'硫代磷酸、顺式-Syn胸苷二聚体、三聚体、C12间隔子、C3间隔子、C6间隔子、dSpacer、PC间隔子、rSpacer、间隔子18、间隔子9,3'-3'修饰、5'-5'修饰、无碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3'DABCYL、黑洞猝灭剂1、黑洞猝灭剂2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDyeQC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2'脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2'脱氧核糖核苷类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2'-O-甲基核糖核苷类似物、经糖修饰的类似物、摆动/通用碱基、荧光染料标记、2'氟RNA、2'O-甲基RNA、甲基膦酸酯、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、2-O-甲基3硫代磷酸酯或其任何组合。在一些实施例中，本文所描述的工程化向导RNA不包括修饰。
通过高通量向导筛选测定进行的向导RNA选择
在一些实施例中，可以通过高通量向导筛选测定来选择工程化向导RNA。用ABCA4、LRRK2和Serpina1靶RNA完成了用于选择工程化向导RNA的高通量向导筛选测定，并且结果示出在表2中。表2示出了与靶RNA相关的疾病、靶RNA的组织表达模式、编辑中使用的体内ADAR类型、靶RNA中的靶基序、靶RNA的靶基序中的靶核苷酸、密码子随着靶核苷酸的成功编辑的变化、由编辑的靶RNA编码的蛋白质的相关氨基酸变化，并且针对每个靶RNA示出了在高通量测定中筛选的向导RNA设计总数。
表2–靶标的汇总
*表示预测ADAR类型
RNA编辑实体
在一些实例中，向导RNA和靶RNA杂交时产生的向导-靶RNA支架募集RNA编辑实体。在一些实例中，RNA编辑实体包括ADAR。在一些实例中，ADAR包括以下中的任何一个：ADAR1、ADAR1p110、ADAR1p150、ADAR2、ADAR3、APOBEC蛋白质或其任何组合。在一些实例中，ADARRNA编辑实体可以是ADAR1。在一些实例中，另外或可替代地，ADAR RNA编辑实体可以是ADAR2。在一些实例中，另外或可替代地，ADAR RNA编辑实体可以是ADAR3。一方面，RNA编辑实体可以是非ADAR。在一些实例中，RNA编辑实体可以是APOBEC蛋白质。在一些实例中，RNA编辑实体可以是APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4或其任何组合。在一些实例中，ADAR或APOBEC可以是哺乳动物。在一些实例中，ADAR或APOBEC蛋白质可以是人。在一些实例中，ADAR或APOBEC蛋白质可以是重组的(例如外源性递送的重组ADAR或APOBEC蛋白质)、经修饰的(例如外源性递送的经修饰的ADAR或APOBEC蛋白质)、内源性的或其任何组合。在一些实例中，RNA编辑实体可以是融合蛋白。在一些实例中，RNA编辑实体可以是RNA编辑实体的功能部分，如本文所提供的RNA编辑蛋白中的任何一种。在一些情况下，RNA编辑实体可以包括与APOBEC1、APOBEC2、ADAR1、ADAR1p110、ADAR1p150、ADAR2、ADAR3或其任何组合至少约70％序列同源性和/或长度。
还考虑了其它RNA编辑实体。在一些实例中，RNA编辑实体包括成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。在一些情况下，RNA编辑实体可以是病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自麻疹、腮腺炎或副流感病毒的病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自布氏锥虫(Trypanosomabrucei)的能够在靶RNA中添加或缺失一个或多个核苷酸的酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自布氏锥虫的能够在靶RNA中添加或缺失尿嘧啶或超过一个尿嘧啶的酶。在一些情况下，RNA编辑实体包括重组酶。在一些情况下，RNA编辑实体包括融合多肽。在一些情况下，RNA编辑实体不包括融合多肽。
治疗应用
本文公开了将本文所公开的任何工程化向导(例如，工程化向导、编码或包括含工程化向导的载体和其任何药物调配物)递送到细胞的方法。在一些实例中，将工程化向导递送到细胞的方法包括直接或间接地将工程化向导递送到细胞，所述工程化向导与靶RNA分子的至少一部分至少部分地杂交并至少部分地与其形成双链底物，其中双链底物包括至少一个结构特征，并且其中双链底物募集RNA编辑实体并促进RNA编辑实体对靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰。在一些实例中，可以通过测序确认靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰。在一些实例中，确认已经发生化学修饰包括分离一个或多个靶RNA分子，已经向其施用了工程化向导，然后在测序之前通过逆转录酶将靶RNA转化为cDNA。在一些实例中，所采用的测序可以是桑格测序、下一代测序或其组合。在一些实例中，在本文所公开的方法中的任何一种中，工程化向可以由本文所公开的多核苷酸或载体编码，或者可以包括在本文所公开的组合物、药物组合物、分离的细胞或多个细胞中。
本文还公开了治疗有需要的受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的任何工程化向导(例如，工程化指导、编码或包括工程化向导的载体)。在一些实例中，治疗或预防有需要的受试者的疾病或病状的方法包括向患有疾病或病状的受试者施用工程化向导，由此治疗或预防受试者的疾病或病状，其中工程化向导：(a)至少部分地与靶RNA分子的至少一部分缔和：(b)与靶RNA分子结合，形成包括至少一个结构特征的双链底物，并且其中双链底物募集RNA编辑实体；并且(c)促进RNA编辑实体对靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰。在一些实例中，碱基的化学修饰可以通过测序确认。在一些实例中，确认已经发生化学修饰包括分离一个或多个靶RNA分子，已经向其施用了工程化向导，然后在测序之前通过逆转录酶将靶RNA转化为cDNA。在一些实例中，所采用的测序可以是桑格测序、下一代测序或其组合。在一些实例中，在本文所公开的方法中的任何一种中，工程化向可以由本文所公开的多核苷酸或载体编码，或者可以包括在本文所公开的组合物、药物组合物、分离的细胞或多个细胞中。
本文所提供的组合物和方法可以用于调节靶标的表达。调节可以指在不同阶段之一处改变基因或其部分的表达，以减轻与基因或基因中的突变相关的疾病或病状。调节可以在转录水平或转录后水平处介导。调节转录可以纠正由基因中的突变产生的剪接变体的异常表达。在一些情况下，本文所提供的组合物和方法可以用于调节靶标的基因翻译。调节可以指通过降低转录物的丰度来降低或敲低基因或其部分的表达。转录物的丰度的降低可以通过降低转录物的加工、剪接、更新或稳定性；或者通过翻译机制如核糖体降低转录物的可及性来介导。在一些情况下，本文所描述的工程化向导可以促进敲低。敲低可以减少靶RNA的表达。在一些情况下，敲低可以伴随着mRNA的编辑。在一些情况下，敲低可以在基本上没有mRNA的编辑的情况下发生。在一些情况下，通过靶向靶RNA的非翻译区，如3'UTR、5'UTR或两者，可以发生敲低。在一些情况下，敲低可以通过靶向靶RNA的编码区而发生。在一些情况下，敲低可以由RNA编辑酶(例如，ADAR)介导。在一些情况下，RNA编辑酶可以通过RNA中多个腺苷的水解脱氨作用导致敲低。RNA中多个腺苷的水解脱氨作用可以被称为超编辑。在一些情况下，超编辑可以在顺式(例如，在Alu元件中)或反式(例如通过工程化向导在靶RNA中)中发生。)。在一些情况下，RNA编辑酶可以通过编辑靶RNA以包括提前终止密码子或阻止靶RNA翻译的起始(由于靶RNA中的编辑)而导致敲低。
在一些实例中，所述疾病或病状可以与编码ABCA4、APP、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、CFTR或LIPA、这些中的任何一种的片段或其任何组合的DNA分子或RNA分子中的突变相关。在一些实例中，由编码ABCA4、APP、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、CFTR或LIPA的突变DNA分子或RNA分子编码的蛋白质至少部分地有助于疾病的发病或进展。在一些实例中，疾病或病状可以与编码ABCA4、AAT、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、APP、Tau、GBA、PINK1、RAB7A、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894G>A、PCSK9起始位点或SCNN1A起始位点的DNA分子或RNA分子、这些中的任何一个的片段或其任何组合中的突变相关。在一些实例中，由编码ABCA4、AAT、SERPINA1、SERPINA1E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、APP、Tau、GBA、PINK1、RAB7A、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPAc.894G>A、PCSK9起始位点或SCNN1A起始位点的突变的DNA分子或RNA分子、这些中的任何一个的片段或其任何组合编码的蛋白质至少部分地导致疾病的发病或进展。在一些实例中，DNA或RNA分子中的突变可以与其它方面相同的参考DNA或RNA分子有关。在一些实例中，DNA或RNA分子中的突变可以与其它方面相同的参考DNA或RNA分子有关。
SERPINA1.在一些实施例中，本公开提供了能够促进对serpin家族A成员1(SERPINA1)的RNA编辑的向导RNA的组合物和其使用方法。在一些实例中，所述疾病或病状可以是AAT缺乏症或相关的肺或肝脏病理(例如，慢性阻塞性肺病、肝硬化、肝细胞癌)，其至少部分是由SERPINA1基因突变引起的。在一些实例中，突变可以是在野生型SERPINA1基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)内的核苷酸位置9989处用A取代G。在一些实例中，本文所公开的工程化向导的施用恢复了患有AAT缺陷症的受试者中的正常AAT蛋白的表达(例如，与无活性或有缺陷的AAT蛋白相比)。在一些实例中，双链RNA(dsRNA)底物(向导-靶RNA支架)在本公开的工程化向导与靶RNA杂交时形成。在一些实例中，形成双链底物的靶RNA包括由SERPINA1基因编码的mRNA或前mRNA分子的一部分。在一些实例中，形成双链底物的工程化向导的靶向区域至少部分地与由SERPINA1基因编码的mRNA或前mRNA分子的一部分互补。在一些实例中，双链底物包括单个错配。在一些实例中，工程化底物另外包括一个或两个凸起。在一些实例中，双链底物可以由以下形成：包括由SERPINA1基因编码的mRNA或前mRNA和与由SERPINA1基因编码的mRNA的一部分互补的工程化向导的靶RNA，其中工程化底物包括单个错配。在一些实例中，双链底物可以由以下形成：包括由SERPINA1基因编码的mRNA或前mRNA和与由SERPINA1基因编码的mRNA或前mRNA的一部分互补的工程化向导的靶RNA，其中工程化底物包括单个错配，并且其中工程化底物包括两个另外的凸起。
向导RNA可以促进将SERPINA1基因的核苷酸位置9989处的G突变校正为A。在一些实施例中，本公开的向导RNA可以靶向例如SERPINA1的E342K。靶向SERPINA1中的位点的所述向导RNA可以由本公开的工程化多核苷酸构建体编码。靶向SERPINA1的工程化向导RNA可以包括表3中列举的以下序列中的任何一种的多核苷酸：
表3–工程化向导RNA或编码针对SERPINA1的工程化向导RNA的多核苷酸序列
粗体和斜体文本中的C表示与待编辑的靶标A产生错配的碱基，在双链底物中形成另外凸起的核苷酸序列带下划线，并且小写文本表示与内含子靶前mRNA杂交的向导的区域。进一步地，靶向SERPINA1的向导RNA可以包括SEQ ID NO:102-SEQ ID NO:103或SEQ IDNO:297-SEQ ID NO:327中的任何一个。在一些实例中，工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括与上述SEQ ID NO:6-10、102-103或297-327中的任何一个具有至少99％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性或至少70％同一性的多核苷酸。在一些实例中，工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括与上述SEQ ID NO:6-10、102-103或297-327中的任何一个具有至少99％长度、至少95％长度、至少90％长度、至少85％长度、至少80％长度或至少70％长度的多核苷酸。在一些实例中，靶向SERPINA1的潜在向导RNA与靶SERPINA1 mRNA的杂交产生了向导-靶RNA支架，其包括选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述凸起是0/2不对称凸起、0/3不对称凸起、1/0不对称凸起、2/0不对称凸起、2/2对称凸起、3/0不对称凸起、2/2对称凸起或3/3对称凸起；(ii)X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述内环是5/5对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、A/A错配和G/A错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。所述工程化向导RNA可以通过本文所公开的病毒载体递送(例如，编码并通过AAV递送)，并且可以通过本文所公开的任何施用途径施用于有需要的受试者。受试者可以是人类并且可能处于发展或已经发展α-1抗胰蛋白酶缺乏症的风险中。此类α-1抗胰蛋白酶缺乏症可能至少部分地是由SERPINA1的突变引起的，对于所述突变，本文所描述的工程化向导RNA可以促进编辑，从而纠正SERPINA1中的突变并降低受试者中α-1抗胰蛋白酶缺乏症的发生率。因此，本公开的向导RNA可以用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的方法中。
ABCA4.在一些实施例中，本公开提供了能够促进对ATP结合盒式亚家族A成员4(ABCA4)的RNA编辑的向导RNA的组合物和其使用方法。在一些实例中，所述疾病或病状可能与ABCA4基因中的突变相关。在一些实例中，所述疾病或病状可以是斯特格黄斑变性。在一些实例中，斯特格黄斑变性可能至少部分地由ABCA4基因中的突变引起。在一些实例中，突变包括在野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)中的核苷酸位置5882处用A取代G。在一些实例中，突变可以包括在野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)中的核苷酸位置5714处G以及A。在一些实例中，突变包括在野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)中的核苷酸位置6320处用A取代G。在一些实例中，双链底物模拟天然存在的ADAR底物的一个或多个结构特征，并且包括由ABCA4基因编码的靶mRNA分子和可以与靶mRNA分子的一部分至少部分互补的工程化向导。图5A展示了由本文所描述的工程化向导的一部分形成的双链底物，其包括与由ABCA4基因编码的靶RNA分子的完全互补性的。图5B展示了仅包括与由ABCA4编码的靶RNA分子的部分互补性，但适于形成包括天然存在的ADAR底物的完整结构模拟(包括图4中列出和描述的所有结构特征)的双链底物的工程化向导。例如，图5B中所描绘的双链底物包括(1)A与C错配；(2)5'G的G错配；(3)两个摆动碱基对；(4)-6位置处的错配和+14至+15位置处的不对称凸起(2/1-靶/向导)；以及(5)+5位置处的不对称凸起(1/0-靶/向导)，所有都相对于彼此定位，类似于包括天然存在的底物的结构特征。图6A和6B示出了与天然存在的底物(6B)相比的完全模拟底物(6A)和详细说明结构特征中的每个结构特征的注释。图6C示出了详细说明完全模拟向导和天然存在的底物上的结构特征中的每个结构特征的位置的图表。图6C还详细说明了相对于与靶序列具有完全互补性的向导对完全模拟向导所做的序列更改。图7示出了双链底物，其展示了完全模拟，具有在相对于靶标A的+7位置处定位的不对称凸起(定位于靶标A的+7核苷酸5'处)。图8描绘了具有不同水平的天然存在的底物模拟的双链底物。例如，如图8所描绘的，双链底物可以包括仅A与C错配；仅5'G的A与C错配和G错配；仅A与C错配、5'G的G错配和两个摆动碱基对；或仅A与C错配、5'G的G错配、两个摆动碱基对和仅未配对的凸起。
图9-11描绘了由本文所描述的工程化向导形成的双链底物的结构特征以及包括对天然存在的果蝇ADAR底物的不同水平的结构模拟的靶ABCA4 RNA分子。图9A-9F描绘了由100个核苷酸长度的工程化向导形成的底物，在从5'端起的核苷酸80(加或减2个核苷酸)处，所述工程化向导包括旨在与待由ADAR编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶，在本文中称为“100.80”向导。例如，“100.80”是指旨在与待编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶可以位于从5'端起的核苷酸82处的向导。图10A-10H描绘了由150个核苷酸长度的向导形成的底物，在从5'端起的核苷酸125(加或减2个核苷酸)处，所述向导包括旨在与待由ADAR编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶，在本文中称为“150.125”向导。例如，“150.125”是指旨在与待编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶可以位于从5'端起的核苷酸123处的向导。图11A-11J描绘了由150个核苷酸长度的工程化向导形成的底物，在从5'端起的核苷酸75(加或减2个核苷酸)处，所述工程化向导包括旨在与待由ADAR编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶，在本文中称为“150.75”向导。例如，“150.75”是指旨在与待编辑的腺嘌呤配对的胞嘧啶可以位于从5'端起的核苷酸77处的向导。图9-11的向导包括一系列模拟果蝇底物的结构基序的结构基序。在一些实例中，本文所公开的工程化向导可以是图9-11中描绘的向导中的任何向导。图9-11中展示的靶向ABCA4的向导呈现在本公开的实例4的表9中。
在一些实例中，靶向ABCA4 mRNA的工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括SEQ ID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个的多核苷酸。在一些实例中，靶向ABCA4 mRNA的工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括与SEQID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个具有至少99％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性或至少70％同一性的多核苷酸。在一些实例中，工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括与SEQ ID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个具有至少99％长度、至少95％长度、至少90％长度、至少85％长度、至少80％长度或至少70％长度的多核苷酸。在一些实例中，靶向ABCA4的潜在向导RNA与靶ABCA4 mRNA的杂交产生了向导-靶RNA支架，其包括选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个凸起是2/1不对称凸起、1/0不对称凸起、2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起；(ii)X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述内环是5/5对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是G/G错配、A/C错配或G/A错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。在一些实施例中，所述向导-靶RNA支架包括2/1不对称凸起、1/0不对称凸起、G/G错配、A/C错配和3/3对称凸起。在一些情况下，靶向ABCA4的工程化潜在向导RNA是SEQ ID NO:291的工程化潜在向导RNA。在一些情况下，靶向ABCA4的工程化潜在向导RNA是SEQ ID NO:291的工程化潜在向导RNA。在一些情况下，靶向ABCA4的工程化潜在向导RNA包括G/G错配、U/U错配和G/G错配。所述工程化向导RNA可以通过本文所公开的病毒载体递送(例如，编码并通过AAV递送)，并且可以通过本文所公开的任何施用途径施用于有需要的受试者。受试者可以是人，并且可能处于发展或已经发展斯特格黄斑变性(斯特格氏病)的风险中。此类斯特格黄斑变性可能至少部分地是由ABCA4的突变引起的，对于所述突变，本文所描述的工程化向导RNA可以促进编辑，从而纠正ABCA4中的突变并降低受试者中斯特格黄斑变性的发生率。因此，本公开的向导RNA可以用于治疗斯特格黄斑变性的方法中。
APP.在一些实施例中，本公开提供了能够促进对淀粉样前体蛋白(APP)的RNA编辑的向导RNA的组合物和其使用方法。在一些实例中，所述疾病或病状可能与淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的表达或切割产物相关。在一些实例中，与脑或血管中的淀粉样蛋白(Aβ或Abeta)肽沉积相关的疾病或病状。在一些实例中，Abeta沉积可以由APP被β分泌酶(BACE)或γ分泌酶裂解产生。在一些实例中，所述疾病可以是神经退行性疾病。在一些实例中，所述疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、皮质基底节变性、路易体痴呆、阿尔茨海默氏病的路易体变型、帕金森氏病痴呆、皮克氏病、进行性核上性麻痹、痴呆、具有与17号染色体上tau突变相关的帕金森氏综合征的额颞痴呆或其任何组合。在一些实例中，工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)可以施用于APP的敲低表达或编辑切割位点以防止由APP形成Abeta片段。
本公开的向导RNA可以促进对APP中的切割位点的编辑，使得β/γ分泌酶展现出对APP的切割减少或可以不再切割APP，并且因此可以产生降低水平的Abeta 40/42或不产生Abeta。在一些实施例中，本公开的向导RNA可以靶向APP中的用于RNA编辑的以下位点中的任何一个位点或任何组合：K670E、K670R、K670G、M671V、A673V、A673T、D672G、E682G、H684R、K687R、K687E或K687G、I712X或T714X。靶向APP中的位点的所述向导RNA可以由本公开的工程化多核苷酸构建体编码。所述工程化向导RNA可以通过本文所公开的病毒载体递送(例如，编码并通过AAV递送)，并且可以通过本文所公开的任何施用途径施用于有需要的受试者。受试者可以是人，并且可能处于发展或已经发展阿尔茨海默氏病的风险中。受试者可以是人，并且可能处于发展或已经发展其中APP影响疾病病理学的神经疾病的风险中。因此，具有潜在结构的本公开的向导RNA可以用于治疗神经疾病(例如阿尔茨海默氏病)的方法中。
α-突触核蛋白(SNCA).α-突触核蛋白基因由5个外显子制成，并且编码140个氨基酸的蛋白质，其中预测的分子量为约14.5kDa。经编码的产物是一种具有未知功能的固有无序蛋白质。通常，α-突触核蛋白是单体。在某些应激条件下或其它未知原因下，α-突触核蛋白自聚集成寡聚体。路易相关病理学(Lewy-related pathology，LRP)主要包含尸检证实的阿尔茨海默氏病患者大脑中超过50％的α-突触核蛋白。虽然α-突触核蛋白如何影响阿尔茨海默氏病的发展的分子机制尚不清楚，但实验证据表明，α-突触核蛋白与Tau-p相互作用，并且可能导致Tau-p的细胞内聚集。此外，α-突触核蛋白可以调节GSK3β的活性，所述GSK3β可以介导Tau过度磷酸化。α-突触核蛋白也可以自组装成致病聚集体(路易体)。Tau和α-突触核蛋白都可以释放到细胞外空间中并扩散到其它细胞。血管异常损害营养物质的供应和代谢副产物的去除，引起微梗塞，并促进神经胶质细胞的活化。因此，用于显著减少Tau形成、α-突触核蛋白形成或其组合的多重策略在有效治疗神经退行性疾病中可能是重要的。
α-突触核蛋白的结构域结构包括N端A2脂质结合α-螺旋结构域、非淀粉样β组分(NAC)结构域和C端酸性结构域。脂质结合结构域由五个KXKEGV不完全重复序列组成。NAC结构域由具有VGGAVVTGV共有序列的GAV基序和三个GXXX亚基序组成，其中X是Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser或Met中的任何一个。C端酸性结构域含有具有DPDNEA共有序列的铜结合基序。在分子水平上，α-突触核蛋白被认为在神经元传递和DNA修复中起作用。
在一些情况下，可以利用本文所提供的向导RNA靶向α-突触核蛋白的区域。在一些情况下，α-突触核蛋白mRNA的区域可以用本文所公开的用于敲低的工程化向导RNA靶向。在一些情况下，可以靶向α-突触核蛋白mRNA的外显子或内含子的区域。在一些实施例中，可以靶向α-突触核蛋白mRNA的非编码序列的区域，如5'UTR和3'UTR。在其它情况下，可以靶向α-突触核蛋白mRNA的编码序列的区域。合适的区域包含但不限于N端A2脂质结合α-螺旋结构域、非淀粉样β组分(NAC)结构域或C端酸性结构域。
在一些方面，α-突触核蛋白mRNA序列被靶向。在一些情况下，可以利用本文所提供的向导RNA靶向序列的3,177个残基中的任何一个。在一些情况下，靶标残基可以定位于残基1-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900、1901-2000、2001-2100、2101-2200、2201-2300、2301-2400、2401-2500、2501-2600、2601-2700、2701-2800、2801-2900、2901-3000、3001-3100和/或3101-3177中。
在一些实施例中，本公开提供了能够促进对SNCA的RNA编辑的向导RNA的组合物和其使用方法。在一些实施例中，本公开的向导RNA可以敲低SNCA的表达，例如，通过促进SNCA基因的3'UTR处的编辑。靶向SNCA中的位点的所述向导RNA可以由本公开的工程化多核苷酸构建体编码。
在一些实例中，靶向SNCA mRNA的工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个的多核苷酸。在一些实例中，靶向SNCA mRNA的工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括与SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个具有至少99％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性或至少70％同一性的多核苷酸。在一些实例中，工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括与SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个具有至少99％长度、至少95％长度、至少90％长度、至少85％长度、至少80％长度或至少70％长度的多核苷酸。在一些实例中，靶向SNCA的潜在向导RNA与靶SNCAmRNA的杂交产生了向导-靶RNA支架，其包括选自由以下组成的组的结构特征：(i)X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述凸起是4/4对称凸起；(ii)一个或多个X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个内环是5/5对称环、8/8对称环或49/4不对称环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、G/G错配、G/A错配、U/C错配或A/A错配；(iv)其任何组合。所述工程化向导RNA可以通过本文所公开的病毒载体递送(例如，编码并通过AAV递送)，并且可以通过本文所公开的任何施用途径施用于有需要的受试者。受试者可以是人，并且可能处于发展或已经发展阿尔茨海默氏病或帕金森氏病的风险中。受试者可以是人，并且可能处于发展或已经发展其中SNCA的过表达影响疾病病理学的神经疾病的风险中。因此，本公开的向导RNA可以用于治疗神经疾病(例如阿尔茨海默氏病)的方法中。
LRRK2.富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)与帕金森氏病的家族性和散发性病例以及如克罗恩氏病(Crohn's disease)的免疫相关病症相关。它的别名包含LRRK2、AURA17、DARDARIN、PARK8、RIPK7、ROCO2或富含亮氨酸的重复激酶2。LRRK2基因由51个外显子制成，并且编码2527个氨基酸的蛋白质，其中预测的分子量为约286kDa。经编码的产物是具有激酶和GTP酶活性的多结构域蛋白。LRRK2可以在各种组织和器官中发现，包含但不限于肾上腺、阑尾、骨髓、脑、结肠、十二指肠、子宫内膜、食道、脂肪、胆囊、心脏、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、甲状腺和膀胱。LRRK2可以无处不在地表达，但通常在脑、肾和肺组织中更丰富。在细胞内，LRRK2已经在星形胶质细胞、内皮细胞、小胶质细胞、神经元和外周免疫细胞中发现。
在LRRK2中已经鉴定了超过100个突变；其中六个突变——G2019S、R1441C/G/H、Y1699C和I2020T——已经通过分离分析被显示导致帕金森氏病。G2019S和R1441C是遗传性病例中最常见的致病突变。在偶发性病例中，这些突变显示出年龄依赖性外显率：当年龄从50岁增加至70岁时，携带G2019S突变的个体患上所述疾病的百分比从17％上升至85％。在一些情况下，携带突变的个体永远不会发展疾病。
在其催化核心，LRRK2含有复合蛋白的Ras(Roc)、ROC的C端(COR)和激酶结构域。多个蛋白质-蛋白质相互作用结构域位于此核心两侧：在N端中发现犰狳重复序列(ARM)区域、锚蛋白重复序列(ANK)区域和富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域，通过C端WD40结构域连接。G2019S突变定位于激酶结构域内。它已经显示增加激酶活性；对于R1441C/G/H和Y1699C，这些突变可以降低Roc结构域的GTP酶活性。全基因组关联研究已经发现，LRRK2中的常见变异增加了发展散发性帕金森氏病的风险。虽然这些变异中的一些是影响蛋白质的结合或催化活性的非保守突变，但其它变异调节其表达。这些结果表明，特定的等位基因或单倍型可以调节LRRK2的表达。
促炎信号上调各种免疫细胞类型中LRRK2的表达，表明LRRK2是免疫应答中的关键调节因子。研究已经发现，全身和中枢神经系统(CNS)炎症都涉及帕金森氏病的症状。此外，与帕金森氏病相关的LRRK2突变调节其对炎症刺激的应答的表达水平。LRRK2中的许多突变与免疫相关病症(如炎性肠病，如克罗恩氏病)相关。例如，G2019S和N2081D两者都增加LRRK2的激酶活性，并且在特定群体的克罗恩氏病患者中过表达。由于其在这些病症中的关键作用，LRRK2是帕金森氏病和克罗恩氏病的重要治疗靶点。具体地，许多突变(如包含G2019S的点突变)在这些疾病的发展中起作用，使LRRK2对如RNA编辑的治疗策略具有吸引力。
在一些实施例中，本公开提供了能够促进对LRRK2的RNA编辑的向导RNA的组合物和其使用方法。在一些实施例中，本公开的向导RNA可以靶向LRRK2中的以下突变：E10L、A30P、S52F、E46K、A53T、L119P、A211V、C228S、E334K、N363S、V366M、A419V、R506Q、N544E、N551K、A716V、M712V、I723V、P755L、R793M、I810V、K871E、Q923H、Q930R、R1067Q、S1096C、Q1111H、I1122V、A1151T、L1165P、I1192V、H1216R、S1228T、P1262A、R1325Q、I1371V、R1398H、T1410M、D1420N、R1441G、R1441H、A1442P、P1446L、V1450I、K1468E、R1483Q、R1514Q、P1542S、V1613A、R1628P、M1646T、S1647T、Y1699C、R1728H、R1728L、L1795F、M1869V、M1869T、L1870F、E1874X、R1941H、Y2006H、I2012T、G2019S、I2020T、T2031S、N2081D、T2141M、R2143H、Y2189C、T2356I、G2385R、V2390M、E2395K、M2397T、L2466H或Q2490NfsX3。靶向LRRK2中的位点的所述向导RNA可以由本公开的工程化多核苷酸构建体编码。
在一些实例中，靶向LRRK2 mRNA的工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括SEQ ID NO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个的多核苷酸。在一些实例中，靶向LRRK2 mRNA的工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括与SEQ IDNO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个具有至少99％同一性、至少95％同一性、至少90％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性或至少70％同一性的多核苷酸。在一些实例中，工程化向导(包含具有潜在结构的潜在向导RNA)包括与SEQ ID NO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个具有至少99％长度、至少95％长度、至少90％长度、至少85％长度、至少80％长度或至少70％长度的多核苷酸。在一些实例中，靶向LRRK2的潜在向导RNA与靶LRRK2 mRNA的杂交产生了向导-靶RNA支架，其包括选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个凸起是0/1不对称凸起、2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起；(ii)一个或多个X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个内环是5/0不对称内环、5/4不对称内环、5/5对称内环、6/6对称内环、7/7对称内环或10/10对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、A/G错配、C/U错配、G/A错配或C/C错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。所述工程化向导RNA可以通过本文所公开的病毒载体递送(例如，编码并通过AAV递送)，并且可以通过本文所公开的任何施用途径施用于有需要的受试者。受试者可以是人并且可能处于发展或已经发展与LRRK2中的突变相关的疾病或病状(例如，中枢神经系统(CNS)或胃肠(GI)道的疾病)的风险中。例如，此类疾病或病状可以包含克罗恩氏病或帕金森氏病。此类CNS或GI道疾病(例如，克罗恩氏病或帕金森氏病)可以至少部分地由LRRK2的突变引起，对于所述突变，本文所描述的工程化向导RNA可以促进编辑，从而校正LRRK2中的突变并降低受试者的CNS或GI道疾病的发病率。因此，本公开的向导RNA可以用于治疗如克罗恩氏病或帕金森氏病等疾病的方法中。
含有潜在结构的本公开的工程化向导RNA相对于缺乏潜在结构的其它方面相当的向导RNA，可以通过RNA编辑实体具有增加的中靶编辑。在一些实施例中，本公开的工程化向导RNA相对于缺乏潜在结构的其它方面相当的向导RNA，在通过RNA编辑实体进行的中靶编辑方面具有至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍或100倍改进。在一些情况下，含有潜在结构的本公开的工程化向导RNA对ADAR1具有至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于99％的中靶编辑。在一些情况下，含有潜在结构的本公开的工程化向导RNA对ADAR2具有至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于99％的中靶编辑。在一些情况下，含有潜在结构的本公开的工程化向导RNA对ADAR1的中靶特异性为至少约1.00、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或大于2.00。在一些情况下，含有潜在结构的本公开的工程化向导RNA对ADAR2的中靶特异性为至少约1.00、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或大于2.00。
适应症
可以将工程化向导RNA或编码所述工程化向导RNA的工程化多核苷酸施用于受试者以治疗本文所描述的疾病或病状。在一些情况下，疾病或病状包括神经退行性疾病、肌肉障碍、代谢障碍、眼部障碍(例如，眼病)、癌症、肝脏疾病(例如，α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症)或其任何组合。在一些实例中，所述疾病包括囊性纤维化、白化病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合征、夏柯-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆症、远端脊髓性肌萎缩症(DSMA)、杜兴/贝克尔肌营养不良症(Duchenne/Becker muscular dystrophy)、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病(Fabry disease)、因子V莱顿相关疾病(Factor V Leiden associated disorder)、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高雪氏病(Gaucher's Disease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性红细胞增多症、亨特综合征(Hunter Syndrome)、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease)、赫勒综合征(HurlerSyndrome)、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集综合征、莱伯氏先天性黑蒙症(Lebercongenital amaurosis)、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)、林奇综合征(Lynchsyndrome)、马凡氏综合征(Marfan syndrome)、黏多糖贮积症、肌营养不良症、肌强直性营养不良症I型和II型、神经纤维瘤病、尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)A型、B型和C型、NY-eso1相关癌症、帕金森氏病、黑斑息肉综合征(Peutz-Jeghers Syndrome)、苯丙酮尿症、庞贝氏病(Pompe'sdisease)、原发性睫状病、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高压、色素性视网膜炎、山德霍夫病(Sandhoff Disease)、严重联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌萎缩、斯特格氏病、泰-萨二氏病(Tay-Sachs Disease)、尤塞氏综合症(Usher syndrome)、沃尔曼病(Wolman disease)、X-连锁免疫缺陷症、各种形式的癌症(例如，BRCA1和2连锁的乳腺癌和卵巢癌)。在一些情况下，疾病或病状如神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病)的治疗可以包括产生淀粉样前体蛋白(APP)、tau、α-突触核蛋白或其任何组合的编辑、敲低或两者。在一些情况下，APP、tau和α-突触核蛋白可以包括致病性变体。在一些情况下，APP可以包括致病性变体，如A673V突变或A673T突变。在一些情况下，疾病或病状如神经退行性疾病(帕金森氏病)的治疗可以包括产生LRRK2的致病性变体的编辑、敲低或两者。在一些情况下，LRRK的致病性变体可以包括G2019S突变。所述疾病或病状可以包括肌营养不良症、鸟氨酸氨基转移酶缺乏症、色素性视网膜炎、乳腺癌、卵巢癌、阿尔茨海默氏病、疼痛、斯特格黄斑营养不良(Stargardt macular dystrophy)、夏柯-马利-杜斯氏病、雷特氏综合征(Rett syndrome)或其任何组合。
在一些实例中，疾病或病状可能至少部分地由包括提前终止密码子的mRNA编码的蛋白质引起或促成。在一些情况下，提前终止密码子导致截短形式的多肽或蛋白质。在一些情况下，所述疾病、病症或病状可能由截短形式的多肽的水平升高或基本上全长多肽的水平降低引起。在一些实例中，提前终止密码子可以通过点突变创建。在一些实例中，提前终止密码子可以通过mRNA分子上的点突变与两个另外的核苷酸组合产生。在一些实例中，mRNA分子包括一个、两个、三个或提前终止密码子。在一些实例中，疾病或病状可能至少部分地由前mRNA分子上的剪接位点突变引起或促成。在一些实例中，剪接位点突变促进了前mRNA分子的意外剪接。在一些实例中，剪接位点突变导致由前mRNA剪接位点的不正确描绘引起的蛋白质的错误翻译和/或截短。
在一些实例中，在本文所公开的方法中，受试者可以被诊断患有疾病或病状。在一些实例中，受试者可以通过体外测定被诊断患有疾病或病状。
在一些实例中，本文所公开的工程化向导的组合物的施用：(a)相对于施用前基因的表达，降低基因的表达；(b)编辑受试者(如有需要的受试者)中的至少一个点突变；(c)编辑受试者中的至少一个终止密码子以产生终止密码子的通读；(d)在受试者中产生外显子跳跃，或(e)其任何组合。
施用和另外的疗法
本文所描述的方法可以包括向受试者施用一种或多种工程化向导RNA、编码所述工程化向导RNA的工程化多核苷酸以及含有如本文所描述的工程化向导RNA的组合物、药物组合物、载体、细胞和分离的细胞。确定最有效的施用方式和剂量的方法可能因用于疗法的组合物、疗法目的、被治疗的靶细胞和被治疗的受试者而异。
在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA、工程化多核苷酸、组合物、药物组合物、载体或细胞的施用可以进行持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天的连续或非连续天数的治疗持续时间。在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA、工程化多核苷酸、组合物、药物组合物、载体或细胞的施用可以进行持续不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天的连续或非连续天数的治疗持续时间。
在一些情况下，治疗持续时间可以是约1天至约30天、约2天至约30天、约3天至约30天、约4天至约30天、约5天至约30天、约6天至约30天、约7天至约30天、约8天至约30天、约9天至约30天、约10天至约30天、约11天至约30天、约12天至约30天、约13天至约30天、约14天至约30天、约15天至约30天、约16天至约30天、约17天至约30天、约18天至约30天、约19天至约30天、约20天至约30天、约21天至约30天、约22天至约30天、约23天至约30天、约24天至约30天、约25天至约30天、约26天至约30天、约27天至约30天、约28天至约30天或约29天至约30天。
在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA、工程化多核苷酸、组合物、药物组合物、载体或细胞的施用可以进行持续至少约1周、至少约1个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约15年、至少约20年或更长时间的治疗持续时间。在一些实例中，施用可以在受试者一生中重复进行，如在受试者的一生中每月施用一次或每年施用一次。在一些实例中，施用可以在受试者生命的大部分时间内重复进行，如每月施用一次或每年施用一次，持续至少约1年、5年、10年、15年、20年、25年、30年或更长时间。
在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA、工程化多核苷酸、组合物、药物组合物、载体或细胞的施用可以每天进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次。在一些实例中，本文所公开的组合物的施用或施涂可以每周进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21次。在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA的施用可以每月进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90次。
在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA、工程化多核苷酸、组合物、药物组合物、载体或细胞可以作为单剂量或作为分剂量施用/施涂。在一些实例中，本文所公开的工程化向导RNA可以在第一时间点和第二时间点施用。在一些实例中，可以施用本文所公开的工程化向导RNA，使得第一次施用可以在另一次施用之前被施用，其中施用时间的差异为1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、4天、7天、2周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长时间。
施用方法可以通过吸入、耳、颊、结膜、牙、子宫颈内、鼻窦内、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜内、动脉内、关节内、胆管内、支气管内、囊内、心内、软骨内、尾内、海绵体内、腔内、侧脑室内、脑池内、角膜内、冠内、冠状动脉内、体内海绵体内、真皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食管内、胃内、牙龈内、海马内、回肠内、病灶内、管腔内、淋巴内、髓内、脑膜内、肌内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、椎管内、滑膜内、腱内、睾丸内、胸腔内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉团注、静脉滴注、膀胱内、玻璃体内、离子电渗疗法、冲洗、喉、鼻、鼻饲、眼、口、口咽、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周、牙周、直肠、眼球后、蛛网膜下、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、经皮、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓膜、输尿管、尿道、阴道、眼眶下、实质内、鞘内、心室内、立体定向或其任何组合。递送可以包含肠胃外施用(包含静脉内、皮下、鞘内、腹膜内、肌内、血管内或输注)、口服施用、吸入施用、十二指肠内施用、直肠施用。递送可以包含对表面(如皮肤)的外表面的局部施用(如洗剂、乳膏、软膏)。在一些情况下，施用是通过实质注射、鞘内注射、心室内注射、脑池内注射、静脉内注射或鼻内施用或其任何组合。在一些情况下，受试者可以在没有监督的情况下施用组合物。在一些情况下，受试者可以在医疗专业人员(例如，医师、护士、医师助理、护理员、临终关怀工作者等)的监督下施用组合物。医学专业人员可以施用该组合物。在一些情况下，美容专业人员可以施用组合物。
在一些实例中，本文所公开的药物组合物可以以在足以每天、一天一次或多次递送约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重的剂量水平下施用以获得期望的治疗、诊断或预防效果。
在一些实例中，本文所描述的方法可以包括施用协同疗法。在一些实例中，协同疗法可以包括癌症治疗(例如放射疗法、化学疗法、CAR-T疗法、免疫疗法、激素疗法、冷冻消融)。在一些实例中，协同疗法可以包括外科手术。在一些实例中，协同疗法可以包括激光疗法。
在一些实例中，药物组合物包括第一活性成分(例如，本文所公开的工程化向导RNA、本文所公开的组合物、本文所公开的分离的细胞或本文所公开的分离的多个细胞)。在一些实例中，药物组合物包括可以包括第二、第三或第四活性成分。在一些实例中，药物组合物包括另外的治疗剂。在一些实例中，第二、第三或第四活性成分可以是另外的治疗剂。在一些实例中，所述另外的治疗剂治疗黄斑变性。在一些实例中，所述另外的治疗剂可以用于治疗神经疾病或病症(例如，帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或痴呆)。在一些实例中，所述另外的治疗剂可以用于治疗肝病或病症(例如，肝硬化或α-1抗胰蛋白酶缺乏症)。在一些情况下，淀粉样蛋白-β聚集(Abeta斑块)有助于阿尔茨海默氏病的病理学。Abeta可以源自作为可变长度片段的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的顺序蛋白水解。在一些实例中，另外的治疗剂可以用于防止β-淀粉样蛋白聚集成斑块或去除已经形成的β-淀粉样蛋白斑块。
在一些实例中，另外的治疗剂可以是5-HT 6拮抗剂、5-HT2A反向激动剂、AB42降低剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、α分泌酶增强剂、α-1肾上腺素能受体拮抗剂、氨还原剂、血管紧张素II受体阻断剂、α-2肾上腺素能激动剂、抗淀粉样蛋白抗体、抗凝剂、抗淀粉样蛋白免疫疗法、消炎药、神经胶质细胞调节剂、抗氧化剂、抗tau抗体、抗tau免疫疗法、抗VEGF剂、抗病毒药物、BACE抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、精氨酸酶抑制剂、β阻断剂、β-HSD1抑制剂、钙通道阻滞剂、大麻素、CB1或CB2内源性大麻素受体激动剂、胆固醇降低剂、D2受体激动剂、多巴胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂、FLNA抑制剂、γ分泌酶抑制剂、GABA受体调节剂、胰高血糖素样肽1受体激动剂、谷氨酸盐调节剂、谷氨酸盐受体拮抗剂、甘氨酸转运体1抑制剂、促性腺激素释放激素受体激动剂、GSK-3B抑制剂、肝细胞生长因子、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、IgG1-Fc-GAIM融合蛋白、离子通道调节剂、铁螯合剂、白三烯受体拮抗剂、MAPT RNA抑制剂、肥大细胞稳定剂、褪黑素受体激动剂、微管蛋白调节剂、线粒体ATP合成酶抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、毒蕈碱激动剂、烟碱乙酰胆碱受体激动剂、NMDA拮抗剂、NMDA受体调节剂、非激素雌激素受体B激动剂、非核苷逆转录酶抑制剂、非类固醇抗炎剂、ω-3脂肪酸、P38 MAPK抑制剂、P75神经营养蛋白受体配体、PDE 5抑制剂、PDE-3抑制剂、PDE4D抑制剂、GABA-A受体的正变构调节剂、PPAR-γ激动剂、蛋白激酶C调节剂、RIPK1抑制剂、分泌酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂、选择性血清素再摄取抑制剂、选择性酪氨酸激酶抑制剂、SGLT2抑制剂、SIGLEC-3抑制剂、σ-1受体激动剂、σ-2受体拮抗剂、干细胞疗法、SV2A调节剂、合成激素、合成粒细胞集落刺激剂、合成硫胺、tau蛋白聚集抑制剂、端粒酶逆转录酶疫苗、凝血酶抑制剂、转运蛋白ABCC1激活剂、TREM2抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、维生素或其任何组合。
在一些实例中，所述另外的治疗剂可以是氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式或其任何组合。
在一些实例中，所述另外的治疗剂可以是AADvac1、AAVrh.10hAPOE2、ABBV-8E12、ABvac40、AD-35、阿杜卡尼单抗(aducanumab)、阿柏西普(aflibercept)、AGB101、AL002、AL003、四氢孕酮(allopregnanolone)、氨氯地平(amlopidine)、AMX0035、ANAVEX 2-73、APH-1105、AR1001、AstroStem、阿托伐他汀(atorvastatin)、AVP-786、AXS-05、BAC、苯磷硫胺(benfotiamine)、BHV4157、BI425809、BIIB092、BIIP06、生物活性膳食多酚制剂、BPN14770、依匹哌唑(brexpiprazole)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、苔藓抑素(byrostatin)、CAD106、坎地沙坦(candesartan)、CERE-110、西洛他唑(cilostazol)、CKD-355、CNP520、COR388、克瑞组单抗(crenezumab)、色甘酸(cromolyn)、CT1812、姜黄素(curcumin)、达比加群酯(dabigatran)、DAOI、达格列净(dapagliflozin)、去铁酮(deferiprone)、DHA、DHP1401、DNL747、屈大麻酚(dronabinol)、依法韦仑(efavirenz)、接骨木汁、依仑倍司他(elenbecestat)、依他普仑(escitalopram)、福莫特罗(formoterol)、更汀芦单抗(gantenerumab)、银杏、葡萄籽提取物、GRF6019、胍法辛(guanfacine)、GV1001、hUCB-MSCs、布洛芬(ibuprofen)、二十碳五烯酸乙酯、ID1201、门冬胰岛素(insulinaspart)、赖谷胰岛素(insulin glulisine)、IONIS MAPTRx、J147、JNJ-63733657、乳果糖、乳糖醇、莱博雷生(lemborexant)、醋酸亮丙瑞林贮库(leuprolide acetate depot)、左乙拉西坦(levetiracetam)、利拉鲁肽(liraglutide)、锂、LM11A-31-BHS、氯沙坦(losartan)、L-丝胺酸、L-鸟氨酸苯乙酸盐、Lu AF20513、LY3002813、LY3303560、LY3372993、马赛替尼(masitinib)、亚甲蓝(methylene blue)、哌甲酯(methylphenidate)、甲硝唑(metronidazole)、米氮平(mirtazapine)、ML-4334、MLC901、孟鲁司特(montelukast)、MP-101、那密浓(nabilone)、NDX-1017、奈法拉莫德(neflamapimod)、新霉素(neomycin)、烟酰胺(nicotinamide)、尼古丁(nicotine)、尼罗替尼(nilotinib)、硝唑尼特(nitazoxanide)、NPT08、奥克塔加(octagam)10％、琥珀八氢吖啶(octohydroaminoacridine succinate)、ω-3PUFA、培哚普利(perindopril)、匹莫范色林(pimavanserin)、吡罗美拉汀(piromelatine)、波西芬(posiphen)、哌唑嗪(prazosin)、PTI-125、兰尼单抗(ranibizumab)、雷沙吉兰(rasagiline)、利福昔明(rifaximin)、利鲁唑(riluzole)、RO7105705、RPh201、沙格司亭(sagramostim)、双水杨酯、S-雌马酚(S-equol)、苯甲酸钠、苯基乙酸钠、索拉珠单抗(solanezumab)、SUVN-502、替米沙坦(telmisartan)、TEP、THN201、TPI-287、traneurocin、TRx0237、UB-311、伐昔洛韦(valacyclovir)、文拉法辛(venlafaxine)hMSC(人间充质干细胞)、伏立诺他(vorinostat)、xanamem、唑吡坦(zolpidem)或其任何组合。
组合物
载体
在一些实例中，递送媒剂包括递送载体。在一些实例中，递送载体包括如双链或单链DNA等DNA。在一些实例中，载体包括RNA。在一些实例中，递送媒剂包括一种或多种递送载体。在一些实例中，所述一种或多种递送载体包括本文所公开的工程化向导。在一些实例中，所述一种或多种递送载体包括编码本文所公开的工程化向导的多核苷酸。在一些实例中，一种递送载体包括编码本文所公开的工程化向导RNA的多核苷酸。在一些实例中，一种递送载体包括编码本文所公开的工程化向导RNA的一部分的多核苷酸，并且第二递送载体编码本文所公开的工程化向导RNA的一部分。
在一些实例中，递送载体可以是真核载体、原核载体(例如细菌载体)、病毒载体或其任何组合。在一些实例中，递送载体可以是病毒载体。在一些实例中，病毒载体可以是逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体、慢病毒载体(例如，人或猪)、疱疹病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体(Epstein-Barr virus vector)、SV40病毒载体、痘病毒载体或其组合。在一些实例中，病毒载体可以是重组载体、杂交载体、嵌合载体、自互补载体、单链载体或其任何组合。
在一些实例中，病毒载体可以作为腺相关病毒(AAV)。在一些实例中，病毒载体可以具有特定的血清型。在一些实例中，病毒载体可以是AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、AAV10血清型、AAV11血清型、AAV 12血清型、AAV13血清型、AAV 14血清型、AAV 15血清型、AAV 16血清型、AAV.rh8血清型、AAV.rh10血清型、AAV.rh20血清型、AAV.rh39血清型、AAV.Rh74血清型、AAV.RHM4-1血清型、AAV.hu37血清型、AAV.Anc80血清型、AAV.Anc80L65血清型、AAV.7m8血清型、AAV.PHP.B血清型、AAV2.5血清型、AAV2tYF血清型、AAV3B血清型、AAV.LK03血清型、AAV.HSC1血清型、AAV.HSC2血清型、AAV.HSC3血清型、AAV.HSC4血清型、AAV.HSC5血清型、AAV.HSC6血清型、AAV.HSC7血清型、AAV.HSC8血清型、AAV.HSC9血清型、AAV.HSC10血清型、AAV.HSC11血清型、AAV.HSC12血清型、AAV.HSC13血清型、AAV.HSC14血清型、AAV.HSC15血清型、AAV.HSC16血清型或AAVhu68血清型、这些中的任一种的衍生物或其任何组合。
在一些实例中，AAV载体可以是重组载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。
在一些实例中，AAV载体可以是重组AAV(rAAV)载体。产生重组AAV载体的方法通常涉及在一些情况下将以下引入生产细胞系：(1)AAV复制和AAV衣壳合成所必需的DNA；(b)包括AAV载体缺失的病毒功能的一种或多种辅助构建体；(c)辅助病毒；以及(d)含有AAV载体基因组的质粒构建体，例如，ITR、启动子和转基因(例如，本文所公开的工程化向导)序列等。在一些实例中，本文所描述的病毒载体可以通过合成或其它合适的方式通过参考如可以在文献中获得的公开的序列进行工程化。例如，AAV的各种血清型的基因组和蛋白质序列以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列可见于文献或公共数据库如GenBank或蛋白质数据库(PDB)。
在一些实例中，产生本文递送载体的方法包括将本文所公开的工程化向导包装在AAV载体中。在一些实例中，产生本文所描述的递送载体的方法包括(a)将以下引入细胞：(i)编码本文所公开的任何工程化向导RNA的多核苷酸；和(ii)包括复制(Rep)基因和编码野生型AAV衣壳蛋白或其经修饰形式的衣壳(Cap)基因的病毒基因组；(b)在细胞中表达野生型AAV衣壳蛋白或其经修饰形式；(c)组装AAV颗粒；以及(d)将编码工程化向导RNA的多核苷酸包装在AAV颗粒中，从而生成AAV递送载体。在一些实例中，本文所公开的任何工程化向导RNA、启动子、填充序列和其任何组合都可以包装在AAV载体中。在一些实例中，AAV载体可以包装1、2、3、4或5个拷贝的工程化向导RNA。在一些实例中，重组载体包括一个或多个反向末端重复序列，并且所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些实例中，突变的末端重复序列缺少末端解链位点。
在一些实例中，可以通过转壳产生杂交AAV载体，例如将反向末端重复序列(ITR)从第一血清型包装到第二血清型的衣壳中，其中第一血清型和第二血清型可能不相同。在一些实例中，来自第一AAV血清型(例如，AAV2)的Rep基因和ITR可以用于来自第二AAV血清型(例如，AAV9)的衣壳中，其中第一和第二AAV血清型可能不相同。作为非限制性实例，包括AAV2 ITR和AAV9衣壳蛋白的杂交AAV血清型可以表示为AAV2/9。在一些实例中，杂交AAV递送载体包括AAV2/1、AAV2/2、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/8或AAV2/9载体。
在一些实例中，AAV载体可以是嵌合AAV载体。在一些实例中，嵌合AAV载体包括外源性氨基酸或氨基酸取代或来自两种或更多种血清型的衣壳蛋白。在一些实例中，可以对嵌合AAV载体进行基因工程化以提高转导效率、选择性或其组合。
在一些实例中，AAV载体包括自互补AAV基因组。自互补AAV基因组可以含有两条DNA链，其可以一起退火以形成双链DNA。
在一些实例中，递送载体可以是逆转录病毒载体。在一些实例中，逆转录病毒载体可以是莫洛尼鼠白血病病毒载体(Moloney Murine Leukemia Virus vector)、脾脏坏死病毒载体或源自劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(Harvey SarcomaVirus)、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒或乳腺肿瘤病毒的载体或其组合。在一些实例中，逆转录病毒载体可以被转染，使得大多数编码病毒结构基因的序列(例如，gag、pol和env)可以缺失并被所关注的基因替代。
在一些实例中，递送媒剂可以是非病毒载体。在一些实例中，递送媒剂可以是质粒。在一些实施例中，质粒包括DNA。在一些实施例中，质粒包括RNA。在一些实例中，质粒包括环状双链DNA。在一些实例中，质粒可以是线性的。在一些实例中，质粒包括一种或多种所关注的基因和一种或多种调节元件。在一些实例中，质粒包括含有复制起点和抗生素抗性基因或用于在细菌中扩增质粒的其它可选标志物的细菌主链。在一些实例中，质粒可以是微环质粒。在一些实例中，质粒含有一个或多个基因，所述基因提供了可选标志物以诱导靶细胞保留所述质粒。在一些实例中，质粒可以调配为由携带针头的注射器通过注射递送。在一些实例中，质粒可以调配用于通过电穿孔递送。在一些实例中，质粒可以通过本领域已知的合成或其它合适的方法进行工程化。例如，在一些情况下，可以通过对来自供体质粒或生物体的期望遗传序列进行限制性消化来组装遗传元件，以产生DNA末端，然后可以容易地将所述DNA末端连接到另一个遗传序列。
在一些实例中，一种或多种分离的细胞包括本文所公开的工程化引导或递送载体中的任何一种。在一些实例中，一种或多种分离的细胞包括一种或多种人细胞。在一些实例中，一种或多种分离的细胞包括一种或多种T细胞。在一些实例中，一种或多种分离的细胞包括一种或多种HEK293细胞。
药物组合物
在某些实施例中，本文公开了药物组合物，其包括本文所公开的工程化向导RNA、本文所公开的组合物、本文所公开的分离的细胞或本文所公开的分离的多个细胞和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实例中，药物组合物包括本文所公开的工程化向导RNA和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实例中，药物组合物包括编码本文公开的工程化向导RNA的工程化多核苷酸和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实例中，药物组合物包括本文所公开的递送载体和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实例中，药物组合物包括分离的细胞(例如，包括本文公开的递送载体)或多个本文所公开的细胞和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
在一些实例中，药物组合物包括第一活性成分(例如，本文所公开的工程化向导、本文所公开的组合物、本文所公开的分离的细胞或本文所公开的分离的多个细胞)。在一些实例中，药物组合物包括可以包括第二、第三或第四活性成分。在一些实例中，药物组合物包括另外的治疗剂。在一些实例中，第二、第三或第四活性成分可以是另外的治疗剂。在一些实例中，所述另外的治疗剂治疗黄斑变性。在一些实例中，另外的治疗剂包括。在一些实例中，所述另外的治疗剂可以用于治疗神经疾病或病症(例如，帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或痴呆)。在一些实例中，所述另外的治疗剂可以用于治疗肝病或病症(例如，肝硬化或α-1抗胰蛋白酶缺乏症)。在一些情况下，淀粉样蛋白-β聚集(Abeta斑块)有助于阿尔茨海默氏病的病理学。Abeta可以源自作为可变长度片段的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的顺序蛋白水解。在一些实例中，另外的治疗剂可以用于防止β-淀粉样蛋白聚集成斑块或去除已经形成的β-淀粉样蛋白斑块。
在一些实例中，另外的治疗剂可以是5-HT 6拮抗剂、5-HT2A反向激动剂、AB42降低剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、α分泌酶增强剂、α-1肾上腺素能受体拮抗剂、氨还原剂、血管紧张素II受体阻断剂、α-2肾上腺素能激动剂、抗淀粉样蛋白抗体、抗凝剂、抗淀粉样蛋白免疫疗法、消炎药、神经胶质细胞调节剂、抗氧化剂、抗tau抗体、抗tau免疫疗法、抗VEGF剂、抗病毒药物、BACE抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、精氨酸酶抑制剂、β阻断剂、β-HSD1抑制剂、钙通道阻滞剂、大麻素、CB1或CB2内源性大麻素受体激动剂、胆固醇降低剂、D2受体激动剂、多巴胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂、FLNA抑制剂、γ分泌酶抑制剂、GABA受体调节剂、胰高血糖素样肽1受体激动剂、谷氨酸盐调节剂、谷氨酸盐受体拮抗剂、甘氨酸转运体1抑制剂、促性腺激素释放激素受体激动剂、GSK-3B抑制剂、肝细胞生长因子、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、IgG1-Fc-GAIM融合蛋白、离子通道调节剂、铁螯合剂、白三烯受体拮抗剂、MAPT RNA抑制剂、肥大细胞稳定剂、褪黑素受体激动剂、微管蛋白调节剂、线粒体ATP合成酶抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、毒蕈碱激动剂、烟碱乙酰胆碱受体激动剂、NMDA拮抗剂、NMDA受体调节剂、非激素雌激素受体B激动剂、非核苷逆转录酶抑制剂、非类固醇抗炎剂、ω-3脂肪酸、P38 MAPK抑制剂、P75神经营养蛋白受体配体、PDE 5抑制剂、PDE-3抑制剂、PDE4D抑制剂、GABA-A受体的正变构调节剂、PPAR-γ激动剂、蛋白激酶C调节剂、RIPK1抑制剂、分泌酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂、选择性血清素再摄取抑制剂、选择性酪氨酸激酶抑制剂、SGLT2抑制剂、SIGLEC-3抑制剂、σ-1受体激动剂、σ-2受体拮抗剂、干细胞疗法、SV2A调节剂、合成激素、合成粒细胞集落刺激剂、合成硫胺、tau蛋白聚集抑制剂、端粒酶逆转录酶疫苗、凝血酶抑制剂、转运蛋白ABCC1激活剂、TREM2抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、维生素或其任何组合。
在一些实例中，所述另外的治疗剂可以是氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式或其任何组合。
在一些实例中，所述另外的治疗剂可以是AADvac1、AAVrh.10hAPOE2、ABBV-8E12、ABvac40、AD-35、阿杜卡尼单抗、阿柏西普、AGB101、AL002、AL003、四氢孕酮、氨氯地平、AMX0035、ANAVEX 2-73、APH-1105、AR1001、AstroStem、阿托伐他汀、AVP-786、AXS-05、BAC、苯磷硫胺、BHV4157、BI425809、BIIB092、BIIP06、生物活性膳食多酚制剂、BPN14770、依匹哌唑、布洛赛珠单抗、苔藓抑素、CAD106、坎地沙坦、CERE-110、西洛他唑、CKD-355、CNP520、COR388、克瑞组单抗、色甘酸、CT1812、姜黄素、达比加群酯、DAOI、达格列净、去铁酮、DHA、DHP1401、DNL747、屈大麻酚、依法韦仑、接骨木汁、依仑倍司他、依他普仑、福莫特罗、更汀芦单抗、银杏、葡萄籽提取物、GRF6019、胍法辛、GV1001、hUCB-MSCs、布洛芬、二十碳五烯酸乙酯、ID1201、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、IONIS MAPTRx、J147、JNJ-63733657、乳果糖、乳糖醇、莱博雷生、醋酸亮丙瑞林贮库、左乙拉西坦、利拉鲁肽、锂、LM11A-31-BHS、氯沙坦、L-丝胺酸、L-鸟氨酸苯乙酸盐、Lu AF20513、LY3002813、LY3303560、LY3372993、马赛替尼、亚甲蓝、哌甲酯、甲硝唑、米氮平、ML-4334、MLC901、孟鲁司特、MP-101、那密浓、NDX-1017、奈法拉莫德、新霉素、烟酰胺、尼古丁、尼罗替尼、硝唑尼特、NPT08、奥克塔加10％、琥珀八氢吖啶、ω-3PUFA、培哚普利、匹莫范色林、吡罗美拉汀、波西芬、哌唑嗪、PTI-125、兰尼单抗、雷沙吉兰、利福昔明、利鲁唑、RO7105705、RPh201、沙格司亭、双水杨酯、S-雌马酚、苯甲酸钠、苯基乙酸钠、索拉珠单抗、SUVN-502、替米沙坦、TEP、THN201、TPI-287、traneurocin、TRx0237、UB-311、伐昔洛韦、文拉法辛hMSC(人间充质干细胞)、伏立诺他、xanamem、唑吡坦或其任何组合。
在一些实例中，药物组合物可以调配成单位剂量形式或多剂量形式。在一些实例中，单位剂量形式可以是物理上离散的单位，适用于对人或非人受试者(例如，动物)施用。在一些实例中，单位剂量形式可以单独包装。在一些实例中，每个单位剂量含有预定数量的活性成分，所述活性成分可以足以与药物载体、稀释剂、赋形剂或其任何组合一起产生所期望的治疗效果。在一些实例中，单位剂量形式包括安瓿、注射器或单独包装的片剂和胶囊或其任何组合。在一些情况下，单位剂量形式可以被包括在一次性注射器中。在一些情况下，单位剂型可以以其分数或倍数施用。在一些实例中，多剂量形式包括包装在单个容器中的多个相同的单位剂量形式，其可以以分离的单位剂量形式施用。在一些实例中，多剂量形式包括小瓶、片剂或胶囊瓶，或品脱或加仑瓶。在一些情况下，多剂量形式包括相同的药物活性剂。在一些情况下，多剂量形式包括不同的药物活性剂。
在一些实例中，药物组合物包括药学上可接受的赋形剂。在一些实例中，赋形剂包括缓冲剂、低温防腐剂、防腐剂、稳定剂、粘结剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂或着色剂或其任何组合。
在一些实例中，赋形剂包括缓冲剂。在一些实例中，缓冲剂包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙、碳酸氢钙或其任何组合。在一些实例中，缓冲剂包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙或氢氧化钙和其它钙盐或其任何组合。
在一些实例中，赋形剂包括低温防腐剂。在一些实例中，冷冻保存剂包括DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其任何组合。在一些实例中，冷冻保存剂包括蔗糖、海藻糖、淀粉、这些中的任一个的盐、这些中的任一个的衍生物或其任何组合。在一些实例中，赋形剂包括pH剂(以使组合物的组分的氧化或降解最小化)、稳定剂(以防止组合物的组分的改性或降解)、缓冲剂(以增强温度稳定性)、增溶剂(以增加蛋白质溶解度)或其任何组合。在一些实例中，赋形剂包括表面活性剂、糖、氨基酸、抗氧化剂、盐、非离子型表面活性剂、增溶剂、甘油三酯、醇或其任何组合。在一些实例中，赋形剂包括碳酸钠、乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白(HSA)、山梨醇、蔗糖、海藻糖、聚山梨醇酯80、磷酸钠、蔗糖、磷酸二钠、甘露醇、聚山梨醇酯20、组氨酸、柠檬酸盐、白蛋白、氢氧化钠、甘氨酸、柠檬酸钠、海藻糖、精氨酸、乙酸钠、乙酸盐、HCl、乙二胺四乙酸二钠、卵磷脂、甘油、黄原胶橡胶、大豆异黄酮、聚山梨醇酯80、乙醇、水、替普瑞酮(teprenone)或其任何组合。在一些实例中，赋形剂可以是《药用赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》,美国制药协会(American Pharmaceutical Association)(1986)中所描述的赋形剂。
在一些实例中，赋形剂包括防腐剂。在一些实例中，防腐剂包括抗氧化剂如α-生育酚和抗坏血酸盐、抗微生物剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚或其任何组合。在一些实例中，抗氧化剂包括EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、蛋氨酸、乙醇或N-乙酰半胱氨酸或其任何组合。在一些实例中，防腐剂包括井冈霉素A(validamycin A)、TL-3、正钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、二异丙基氟磷酸酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、颗粒酶抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗菌剂、氧化酶抑制剂或其它抑制剂或其任何组合。
在一些实例中，赋形剂包括粘合剂。在一些实例中，粘合剂包括淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、低聚糖或其任何组合。
在一些实例中，粘合剂可以是淀粉例如，马铃薯淀粉、玉米淀粉或小麦淀粉；糖类如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖或麦芽糊精；天然和/或合成树胶；明胶；纤维素衍生物如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素或乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇如山梨糖醇、木糖醇、甘露醇或水或其任何组合。
在一些实例中，赋形剂包括润滑剂。在一些实例中，润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、氢化蓖麻油、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁和轻矿物油或其任何组合。在一些实例中，润滑剂包括金属硬脂酸盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山嵛酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属月桂基硫酸盐(如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠或滑石或其组合。
在一些实例中，赋形剂包括分散增强剂。在一些实例中，分散增强剂包括作为高HLB乳化剂表面活性剂的淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、经纯化的木质纤维素、羟基乙酸淀粉钠、异无定形硅酸盐或微晶纤维素或其任何组合。
在一些实例中，赋形剂包括崩解剂。在一些实例中，崩解剂包括非泡腾崩解剂。在一些实例中，非泡腾崩解剂包括淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉；甜味剂；粘土，如膨润土；微晶纤维素；海藻酸盐；羟基乙酸淀粉钠；或胶，如琼脂、瓜尔胶、槐豆胶、卡那亚胶、果胶和黄蓍胶或其任何组合。在一些实例中，崩解剂包括泡腾崩解剂。在一些实例中，合适的泡腾崩解剂包括碳酸氢盐与柠檬酸的组合以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
在一些实例中，赋形剂包括甜味剂、调味剂或两者。在一些实例中，甜味剂包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查耳酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(SteviaRebaudiana)(甜菊苷(Stevioside))；蔗糖的氯代衍生物，如三氯蔗糖；以及糖醇，例如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇等或其任何组合。在一些情况下，并入组合物中的调味剂包括合成调味油和调味芳香剂；天然油；植物、叶子、花朵和果实的提取物；或其任何组合。在一些实施例中，调味剂包括肉桂油；冬青油；薄荷油；丁香油；干草油；茴香油；桉叶；香草；柑橘油，如柠檬油、橙油、葡萄油和葡萄柚油；和水果香精，包含苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏或其任何组合。
在一些实例中，赋形剂包括pH剂(例如，以使组合物的组分的氧化或降解最小化)、稳定剂(例如，以防止组合物的组分的改性或降解)、缓冲剂(例如，以增强温度稳定性)、增溶剂(例如，以增加蛋白质溶解度)或其任何组合。在一些实例中，赋形剂包括表面活性剂、糖、氨基酸、抗氧化剂、盐、非离子型表面活性剂、增溶剂、甘油三酯、醇或其任何组合。在一些实例中，赋形剂包括碳酸钠、乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白(HSA)、山梨醇、蔗糖、海藻糖、聚山梨醇酯80、磷酸钠、蔗糖、磷酸二钠、甘露醇、聚山梨醇酯20、组氨酸、柠檬酸盐、白蛋白、氢氧化钠、甘氨酸、柠檬酸钠、海藻糖、精氨酸、乙酸钠、乙酸盐、HCl、乙二胺四乙酸二钠、卵磷脂、甘油、黄原胶橡胶、大豆异黄酮、聚山梨醇酯80、乙醇、水、替普瑞酮或其任何组合。在一些实例中，赋形剂包括低温防腐剂。在一些实例中，赋形剂包括DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其任何组合。在一些实例中，赋形剂包括蔗糖、海藻糖、淀粉、这些中的任一个的盐、这些中的任一个的衍生物或其任何组合。
在一些实例中，药物组合物包括稀释剂。在一些实例中，稀释剂包括水、甘油、甲醇、乙醇或其它类似的生物相容性稀释剂或其任何组合。在一些实例中，稀释剂包括酸的水溶液，如乙酸、柠檬酸、马来酸、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸或其任何组合。在一些实例中，稀释剂包括碱金属碳酸盐如碳酸钙；碱金属磷酸盐如磷酸钙；碱金属硫酸盐如硫酸钙；纤维素衍生物如纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素；氧化镁、糊精、果糖、右旋糖、棕榈酸甘油酯、乳糖醇、胆碱、乳糖、麦芽糖、甘露醇、二甲基硅油、山梨糖醇、淀粉、预胶化淀粉、滑石、木糖醇和/或无水化合物、水合物和/或其药学上可接受的衍生物或其组合。
在一些实例中，药物组合物包括载体。在一些实例中，载体包括液体或固体填料、溶剂或封装材料。在一些实例中，载体包括添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包含单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生糖，如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合。
在一些实例中，药物组合物可以通过将gRNA和/或ADAR(或编码gRNA和/或ADAR的载体)与靶细胞接触的任何方式施用于受试者。在一些实例中，具体途径将取决于如靶细胞等某些变量，并且可以由熟练的从业者确定。在一些实例中，药物组合物可以通过静脉内施用、腹膜内施用、肌内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用(例如，进入颈动脉)、皮下施用、透皮递送、气管内施用、皮下施用、关节内施用、心室内施用、吸入(例如，气雾剂)、脑内、鼻腔、口服、肺部施用、导管浸渍或直接注射到组织中或其任何组合来施用。在一些实例中，靶细胞可以在肿瘤内或肿瘤附近，并且施用可以通过直接注射到肿瘤或肿瘤周围的组织中进行。在一些实例中，肿瘤可以是乳腺肿瘤并且施用包括浸渍导管和直接注射到肿瘤中。在一些实例中，可以使用本领域已知的方法进行气雾剂(吸入)递送，如例如Stribling等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》189:11277-11281,1992中描述的方法。在一些实例中，口服递送可以通过将工程化向导(或编码工程化向导的载体)与能够耐受动物肠道消化酶降解的载体复合来进行。此类载体的实例包含塑料胶囊或片剂，如本领域已知的那些。
在一些实例中，直接注射技术可以用于向可以通过外科手术接近的和在身体表面上或附近的细胞或组织施用gRNA和/或ADAR(或编码gRNA和/或ADAR的载体)。在一些实例中，在靶细胞区域内局部施用组合物包括距离靶细胞或组织数厘米处，优选地数毫米注射组合物。
本文所描述的治疗方法的适当剂量和治疗方案根据所治疗的特定疾病、所递送的gRNA和/或ADAR(或编码gRNA和/或ADAR的载体)以及受试者的具体情况而有所不同。在一些实例中，施用可以在一段时间内直到实现预期效果(例如，实现症状减轻)。在一些实例中，施用可以是每周1、2、3、4、5、6或7次。在一些实例中，本文所公开的组合物的施用或施涂可以进行持续至少约1周、至少约1个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约15年、至少约20年或更长时间的治疗持续时间。在一些实例中，施用可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周的时间段内。在一些实例中，施用可以在2、3、4、5、6或更多个月的时间段内。在一些实例中，施用可以在受试者一生中重复进行，如在受试者的一生中每月施用一次或每年施用一次。在一些实例中，施用可以在受试者生命的大部分时间内重复进行，如每月施用一次或每年施用一次，持续至少约1年、5年、10年、15年、20年、25年、30年或更长时间。在一些实例中，缓解一段时间后可以恢复治疗。
试剂盒
本文公开了包括本文所公开的向导RNA、编码所述向导RNA的多核苷酸、组合物、药物组合物和分离的细胞的试剂盒。在一些实例中，试剂盒包括本文所公开的一种或多种向导RNA、编码所述向导RNA的多核苷酸、组合物、药物组合物或分离的细胞以及容器。在一些实例中，试剂盒包括本文公开的药物组合物，其包括本文所公开的工程化向导RNA或编码本文所公开的工程化向导RNA的多核苷酸和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实例中，试剂盒包括一种或多种本文所公开的递送载体，其包括编码工程化向导RNA的多核苷酸。在一些实例中，试剂盒包括一种或多种本文所描述的分离的细胞。在一些情况下，容器可以是塑料、玻璃、金属或其任何组合。在一些实例中，容器可以被分隔开以容纳一个或多个容器(如小瓶、管等)的载体、包装或容器，所述容器中的每个容器包括用于本文所描述的方法中的单独元件之一。在某个实例中，容器可以是瓶、小瓶、注射器或试管。
在一些实例中，除了本文所公开的组合物、药物组合物或分离的细胞之外，本文所公开的试剂盒进一步包括本文所公开的另外的治疗剂。在一些实例中，所述另外的治疗剂包括血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗或维生素或其经修饰的形式或其任何组合。
在一些实例中，试剂盒包括使用说明书，如向有需要的受试者施用的说明书。
在一些情况下，试剂盒包括用于本文所描述的组合物或药物组合物的包装。在一些实例中，包装可以正确地标记。在一些情况下，可以根据良好制造规范(cGMP)和标签规定制造本文所描述的药物组合物。
本文还公开了制备本文所公开的试剂盒的方法。在一些实例中，制备本文的试剂盒的方法包括使本文所公开的工程化向导、组合物、药物组合物、分离的细胞或分离的多个细胞中的任何一种与容器接触。在一些实例中，制备本文所公开的试剂盒的方法包括将本文所公开的工程化向导RNA、组合物、药物组合物或分离的细胞或多个细胞放置在本文所公开的容器中。在一些实例中，此类方法进一步包括将使用说明书放置在容器中。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其它技术和科学术语可以具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员可以通常所理解含义的相同的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了便于参考而可能在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包括的这些定义不应被解释为表示可以与本领域通常理解的存在实质性差异。
贯穿本申请，各个实施例可以以范围格式呈现。应当理解，采用范围格式的描述可以仅仅是为了方便和简洁起见，并且不应当解释为是对本公开的范围的非灵活限制。因此，对范围的描述应被视为已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，例如1至6的范围描述应被视为已经具体地公开了例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及所述范围内的个别数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度为多少，这都适用。
如在说明书和权利要求书中所使用的，单数形式的“一种/一个(a/an)”以及“所述(the)”包含复数对象，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“样品”包含多种样品，包含其混合物。
如本文所使用的，术语“约”数字可以是指所述数字加上或减去所述数字的10％。
如本文所公开的，“凸起”是指基本上仅在向导-靶RNA支架形成时形成的结构，其中工程化向导RNA或靶RNA中的连续核苷酸与其在相对链上的位置对应物不互补。凸起可以独立地在向导-靶RNA支架的向导RNA侧上具有0至4个连续核苷酸，并且在向导-靶RNA支架的靶RNA侧上具有1至4个连续核苷酸，或者凸起可以独立地在向导-靶RNA支架的靶RNA侧上具有0至4个核苷酸，并且在向导-靶RNA支架的向导RNA侧上具有1至4个连续核苷酸。然而，如本文所使用的，凸起不是指工程化向导RNA的单个参与核苷酸和靶RNA的单个参与核苷酸不碱基配对的结构——不碱基配对的工程化向导RNA的单个参与核苷酸和靶RNA的单个参与核苷酸在本文中称为“错配”。进一步地，在向导RNA侧或靶RNA侧的参与核苷酸数量超过4时，所得结构不再被视为凸起，而是被视为“内环”。“对称凸起”是指在凸起的每一侧上存在相同数量的核苷酸的情况下的凸起。“不对称凸起”是指在凸起的每一侧上存在不同数量的核苷酸的情况下的凸起。
“典型氨基酸”是指自然界中存在的那20种氨基酸，包含例如表4中所示出的氨基酸。
表4–天然存在的氨基酸用三个字母缩写、一个字母缩写、结构和对应的密码子表示
术语“互补的”或“互补性”是指核酸通过例如氢键合(例如，传统的沃森-克里克(Watson-Crick))、共价键合或其它类似方法与对应的核酸序列形成一个或多个键的能力。在沃森-克里克碱基配对中，双氢键在核碱基T与A之间形成，而三氢键在核碱基C与G之间形成。例如，序列A-G-T可以与序列T-C-A互补。互补性百分比表示核酸分子中能够与第二个核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中分别有5个、6个、7个、8个、9个、10个是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”可以是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。如本文所使用的，“基本上互补”可以是指在10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸的区域内，互补性程度可以至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或可以是指在严格条件(即，严格杂交条件)下杂交的两个核酸。核酸可以包含非特异性序列。如本文所使用的，术语“非特异性序列”或“非特异性的”可以指含有未被设计成与任何其它核酸序列互补或可以与任何其它核酸序列仅部分互补的一系列残基的核酸序列。
术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”可以在本文中可互换使用以指代各形式的测量。所述术语包含确定元素是否存可以在(例如，检测)。这些术语可以包含定量、定性或定量和定性确定。评估可以是相对的或绝对的。“检测存在”除了根据上下文确定某物是否可能存在或不存在之外，可以包含确定存在的某物的量。
如本文所使用的，术语“编码”是指多核苷酸提供足以产生对应基因表达产物的信息或指令序列的能力。在非限制性实例中，mRNA可以在翻译期间编码多肽，而DNA可以在转录期间编码mRNA分子。
“工程化潜在向导RNA”是指包括序列的一部分的工程化向导RNA，所述序列在与靶RNA杂交时或仅与其杂交时，基本上形成结构特征，而不是待编辑的靶腺苷处的单个A/C错配特征的至少一部分。
如本文所使用的，术语工程化向导RNA“促进RNA编辑”是指工程化向导RNA在与RNA编辑实体和靶RNA缔和时提供RNA编辑实体对靶RNA的靶向编辑的能力。在一些情况下，工程化向导RNA可以直接募集或定位/定向RNA编辑实体到适当的位置以编辑靶RNA。在其它情况下，工程化向导RNA在与靶RNA杂交时形成具有本文所描述的一个或多个结构特征的向导-靶RNA支架，其中具有结构特征的向导-靶RNA支架募集或定位/定向RNA编辑实体到适当的位置以编辑靶RNA。
如本文所公开的，“向导-靶RNA支架”是在具有潜在结构的向导RNA与靶RNA杂交时形成的所得双链RNA。向导-靶RNA支架具有一个或多个杂交时在双链RNA双链体内形成的结构特征。例如，向导-靶RNA支架可以具有选自凸起、错配、内环、发夹或摆动碱基对的一个或多个结构特征。
如本文所公开的，“发夹”包含RNA双链体，其中单个RNA链的一部分自身折叠以形成RNA双链体。单个RNA链的部分由于具有彼此碱基配对的核苷酸序列而自身折叠，其中核苷酸序列被不与自身碱基配对的间插序列分开，从而形成碱基配对部分和非碱基配对的间插环部分。
术语“同源性”或“同一性”或“相似性”可以指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较可以出于比较目的比对的每个序列中的位置来确定同源性。当比较序列中的位置可以被相同碱基或氨基酸占据时，则分子在所述位置处可以是同源的。序列之间的同源性程度可以是序列共享的匹配或同源位置的数量的函数。“不相关”或“非同源”序列与本公开的序列之一共享小于40％同一性，或者可替代地小于25％同一性。序列同源性可以指序列与参考序列的同一性％。作为实际问题，任何特定序列是否可以与本文所述的任何序列(其可以对应于本文所述的特定核酸序列)至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同，此类特定多肽序列可以常规地使用已知的计算机程序如Bestfit程序来确定(威斯康星州麦迪逊科学大道575号大学研究园的遗传学计算机集团的威斯康星序列分析软件包Unix第8版(Wisconsin Sequence AnalysisPackage,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.)，邮编53711)。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与参考序列具有例如95％同一性时，可以设置参数，使得可以在参考序列的全长上计算同一性百分比，并且可以允许总参考序列中至多5％的序列同源性缺口。
在一些情况下，参考序列(查询序列，例如本公开的序列)与主题序列之间的同一性，也被称为全局序列比对，可以基于Brutlag等人的算法使用FASTDB计算机程序来确定(《生物科学中的计算机应用(Comp.App.Biosci.)》6:237-245(1990))。在一些实施例中，FASTDB氨基酸比对中使用的同一性可以狭义解释的特定实施例的参数可以包含：评分方案＝PAM(接受突变百分比)0，k-元组＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化组长度＝0，截止值分数＝1，窗口大小＝序列长度，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或受试者序列的长度，以较短者为准。根据此实施例，如果受试者序列由于N端或C端缺失而比查询序列短，而不是由于内部缺失，则可以对结果进行人工校正，以考虑到FASTDB程序在计算全局同一性百分比时没有考虑受试者序列的N端和C端截短的事实。对于在N端和C端处截短的受试者序列，相对于查询序列，可以通过计算受试者序列的N端和C端旁侧的查询序列的残基的数量来校正百分比同一性，其可以不与对应的受试者残基匹配/比对，作为查询序列的总碱基的百分比。可以通过FASTDB序列比对的结果来确定残基是否可以匹配/比对。然后可以从由FASTDB程序使用指定参数计算的同一性百分比中减去此百分比，以得到最终的同一性百分比分数。此最终同一性百分比分数可以用于此实施例的目的。在一些情况下，只有不能与查询序列匹配/比对的受试者序列的N端和C端的残基可以被考虑用于手动调整百分比同一性分数的目的。也就是说，只有在受试者序列的最远N端和C端残基之外的查询残基位置可以被考虑用于这种人工校正。例如，90个残基的受试者序列可以与100个残基的查询序列进行比对，以确定同一性百分比。缺失发生在受试者序列的N端，并且因此，FASTDB比对没有显示出N端出的前10个残基的匹配/比对。10个不配对的残基代表10％的序列(N端和C端处不匹配的残基数量/查询序列中的残基的总数),因此可以通过FASTDB程序计算的同一性百分比分数中减去10％。如果剩余的90个残基完全匹配，最终同一性百分比可以是90％。在另一个实例中，90个残基的受试者序列可以与100个残基的查询序列进行比较。这次缺失可以是内部缺失，因此在受试者序列的N端或C端处不能存在与查询不匹配/比对的残基。在这种情况下，通过FASTDB计算的同一性百分比不能手动校正。同样，如在FASTDB比对中所显示的，只有在受试者序列的N端和C端之外的不能与查询序列匹配/比对的残基位置可以被人工校正。
在一些情况下，参考序列(查询序列，例如本公开的序列)与主题序列之间的同一性，也被称为全局序列比对，可以基于Brutlag等人的算法使用FASTDB计算机程序来确定(《生物科学中的计算机应用》6:237-245(1990))。在一些实施例中，FASTDB氨基酸比对中使用的同一性可以狭义解释的特定实施例的参数可以包含：评分方案＝PAM(接受突变百分比)0，k-元组＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化组长度＝0，截止值分数＝1，窗口大小＝序列长度，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或受试者序列的长度，以较短者为准。根据此实施例，如果受试者序列由于N端或C端缺失而比查询序列短，而不是由于内部缺失，则可以对结果进行人工校正，以考虑到FASTDB程序在计算全局同一性百分比时没有考虑受试者序列的N端和C端截短的事实。对于在N端和C端处截短的受试者序列，相对于查询序列，可以通过计算受试者序列的N端和C端旁侧的查询序列的残基的数量来校正百分比同一性，其可以不与对应的受试者残基匹配/比对，作为查询序列的总碱基的百分比。可以通过FASTDB序列比对的结果来确定残基是否可以匹配/比对。然后可以从由FASTDB程序使用指定参数计算的同一性百分比中减去此百分比，以得到最终的同一性百分比分数。此最终同一性百分比分数可以用于此实施例的目的。在一些情况下，只有不能与查询序列匹配/比对的受试者序列的N端和C端的残基可以被考虑用于手动调整百分比同一性分数的目的。也就是说，只有在受试者序列的最远N端和C端残基之外的查询残基位置可以被考虑用于这种人工校正。例如，90个残基的受试者序列可以与100个残基的查询序列进行比对，以确定同一性百分比。缺失发生在受试者序列的N端，并且因此，FASTDB比对没有显示出N端出的前10个残基的匹配/比对。10个不配对的残基代表10％的序列(N端和C端处不匹配的残基数量/查询序列中的残基的总数),因此可以通过FASTDB程序计算的同一性百分比分数中减去10％。如果剩余的90个残基完全匹配，最终同一性百分比可以是90％。在另一个实例中，90个残基的受试者序列可以与100个残基的查询序列进行比较。这次缺失可以是内部缺失，因此在受试者序列的N端或C端处不能存在与查询不匹配/比对的残基。在这种情况下，通过FASTDB计算的同一性百分比不能手动校正。同样，如在FASTDB比对中所显示的，只有在受试者序列的N端和C端之外的不能与查询序列匹配/比对的残基位置可以被人工校正。
如本文所公开的，“内环”是指基本上仅在形成向导-靶RNA支架时形成的结构，其中工程化向导RNA或靶RNA中的核苷酸与其在相反链上的位置对应物不互补，并且其中内环的一侧(向导-靶RNA支架的靶RNA侧或工程化向导RNA侧上)具有5个或更多个核苷酸。在向导RNA侧和靶RNA侧的参与核苷酸数量均低于5时，所得结构不再被视为内环，而是被视为“凸起”或“错配”，这取决于结构特征的大小。当在内环的每一侧上存在相同数量的核苷酸时，形成“对称内环”。当在内环的每一侧上存在不同数量的核苷酸时，形成“不对称内环”。
“潜在结构”是指基本上仅在向导RNA与靶RNA杂交时形成的结构特征。例如，向导RNA的序列提供一个或多个结构特征，但这些结构特征基本上仅在与靶RNA杂交时形成，因此所述一个或多个潜在结构特征在与靶RNA杂交时表现为结构特征。在向导RNA与靶RNA杂交时，结构特征形成，并且向导RNA中提供的潜在结构因此被揭露。
“信使RNA”或“mRNA”是包括编码多肽或蛋白质的序列的RNA分子。通常，RNA可以从DNA转录。在一些情况下，序列中含有非蛋白质编码区的前体mRNA可以从DNA转录，然后进行处理以去除所有或部分非编码区(内含子)，从而产生成熟mRNA。如本文所使用的，术语“前mRNA”可以是指在经历去除非蛋白质编码区的处理之前从DNA转录的RNA分子。
如本文所公开的，“错配”是指向导RNA中的单个核苷酸与向导-靶RNA支架内的靶RNA中的相对单个核苷酸不配对。错配可以包括任何两个不碱基配对的单个核苷酸。在向导RNA侧和靶RNA侧的参与核苷酸数量超过1时，所得结构不再被视为错配，而是被视为“凸起”或“内环”，这取决于结构特征的大小。
如本文所使用的，术语“突变”可以是指可以相对于参考序列的核酸序列或多肽序列的改变。突变可以发生在DNA分子、RNA分子(例如，tRNA、mRNA)或多肽或蛋白质或其任何组合中。参考序列可以从数据库如NCBI参考序列数据库(RefSeq)获得。可以构成突变的特定变化可以包含一个或多个核苷酸或一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、倒位或转化。在没有突变的情况下编码多肽序列的核酸序列中的突变的非限制性实例包含：可能导致一个密码子取代另一个密码子的“错义”突变、可以将编码特定氨基酸的密码子更改为终止密码子的“无义”突变(这可能导致蛋白质翻译截短)或可以是那些对所得蛋白质没有影响的突变的“沉默”突变。突变可以是“点突变”，其可以是指仅影响DNA或RNA序列中的一个核苷酸的突变。突变可以是“剪接位点突变”，所述突变可以存在于前mRNA(在去除内含子的处理之前)，导致错误翻译，并且经常由于剪接位点的不正确描绘而截短蛋白质。突变可以是融合基因。融合对或融合基因可以由突变，如易位、间隙缺失、染色体倒位或其任何组合产生。突变可以构成重复序列的数量的可变性，如一式三份、一式四份或其它。例如，突变可以是与给定序列相关的拷贝数的增加或减少(例如，拷贝数变异，或CNV)。突变可以包含不同等位基因的两个或多个序列变化，或者一个等位基因的两个或更多个序列变化。突变可以在一个等位基因如镶嵌物的一个位置处包含两个不同的核苷酸。突变可以在一个等位基因如嵌合体的一个位置处包含两个不同的核苷酸。恶性组织中可能存在突变。突变可以包括单核苷酸变异(SNV)。突变可以包括序列变体、序列变异、序列改变或等位基因变体。
突变的存在或不存在可以表明患上疾病或病状的风险增加。突变的存在或不存在可以指示疾病或病状的存在。良性组织中可能存在突变。不存在突变可能表明组织或样品可能是良性的。作为替代方案，不存在突变可能不表明组织或样品可能是良性的。如本文所描述的方法可以包括鉴定样品中突变的存在。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以可互换地使用并且可以是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知的功能。以下可以是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核糖核酸酶、cDNA、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)和核苷酸类似物。如果存在，则可以在组装多核苷酸之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合后如通过与标记组分结合来进一步修饰。所述术语还可以指双链分子和单链分子两者。除非另外指定或需要，否则是可以是多核苷酸的本公开的任何实施例既涵盖双链形式，也涵盖已知或预测构成双链形式的两种互补的单链形式中的每种单链形式。
多核苷酸可以由核苷酸的特定序列构成。核苷酸包括核苷和磷酸基团。核苷酸包括糖(例如，核糖或2'脱氧核糖)和如含氮碱基等核碱基。核碱基的非限制性实例包含腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和肌苷(I)。在一些实施例中，当次黄嘌呤可以经由P-N9-糖苷键附接到呋喃核糖时可以形成I，从而产生化学结构：
一些多核苷酸实施例是指DNA序列。在一些实施例中，DNA序列可以与类似的RNA序列互换。一些实施例是指RNA序列。在一些实施例中，RNA序列可以与类似的DNA序列互换。在一些实施例中，U和T可以在本文所提供的序列中互换。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以可互换地使用，并以其最广泛的意义可以指代两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。这些亚基可以通过肽键连接。在另一个实施例中，所述亚基可以通过其它键例如酯、醚等连接。蛋白质或肽可以含有至少两个氨基酸，并且可以对可以包括蛋白质的序列或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所使用的，术语“氨基酸”可以是指天然氨基酸、非天然氨基酸或合成氨基酸中的任一种，包含甘氨酸和D和L光学异构体两者、氨基酸类似物和肽模拟物。如本文所使用的，术语“融合蛋白”可以是指包括来自多于一种天然存在或重组产生的蛋白质的结构域的蛋白质，其中通常每个结构域具有不同的功能。在这方面，术语“接头”可以是指可以用于将这些结构域连接在一起的蛋白质片段——任选地用于保持融合蛋白结构域的构象，预防融合蛋白结构域之间可能损害其相应功能的不利相互作用或两者。
术语“终止密码子”可以是指信使RNA内发出翻译终止信号的三核苷酸连续序列。非限制性实例包含RNA、UAG(琥珀)、UAA(赭石)、UGA(棕土，也称为蛋白石)和DNA TAG、TAA或TGA。除非另有说明，否则所述术语还可以包含DNA或RNA内引入提前终止密码子的无义突变，导致任何所得蛋白质异常缩短。
术语“结构化基序”是指向导-靶RNA支架中两个或更多个结构特征的组合。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文可以互换使用。“受试者”是指含有表达的遗传物质的生物实体。生物实体可以是植物、动物或微生物，包含例如细菌、病毒、真菌和原生动物。受试者可以是在体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞和其子代。所述受试者可以是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人。受试者可以被诊断或怀疑处于疾病的高风险中。在一些情况下，受试者不一定被诊断或怀疑处于疾病的高风险中。
术语“体内”是指在受试者体内发生的事件。
术语“离体”是指在受试者体外发生的事件。可以不对受试者进行离体测定。相反，可以在与受试者分离的样品上进行离体测定。对样品进行的离体测定的实例可以是“体外”测定。
术语“体外”是指在用于容纳实验室试剂的容器中发生的事件，使得材料可以与材料可以所获自的生物源分离。体外测定可以涵盖基于细胞的测定，其中可以采用活细胞或死细胞。体外测定可以涵盖无细胞测定，在所述测定中可以不采用完整的细胞。
术语“摆动碱基对”是指两个弱配对的碱基。例如，摆动碱基对可以是指与U配对的G。
如本文所描述的，术语“基本上形成”，当指代特定的二级或三级结构时，是指在生理条件下(例如生理pH、生理温度、生理盐浓度等)形成至少80％的结构。
如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可以用于指代用于在接受者中获得有益或期望的结果的药物或其它干预方案。有益或期望的结果包含但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处可以是指根除或改善正在治疗的潜在病症的一种或多种症状。此外，治疗益处可以通过根除或改善与基础病症相关的一种或多种生理症状来实现，使得可以在受试者中观察到改善，尽管受试者仍可能患有基础病症。预防性作用包含延迟、预防或消除疾病或病状的出现，延迟或消除疾病或病状的一种或多种症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病状的进展或其任何组合。对于预防益处，处于患特定疾病风险中的受试者或报告疾病的生理症状中的一种或多种生理症状的受试者可以接受治疗，即使可能尚未做出此疾病的诊断。
本文所使用的小节标题仅是为了组织目的并且不应该被解释为对所描述的主题进行限制。
带编号的实施例
本文公开了多种组合物和方法。下文公开了这些组合物和方法的具体示例性实施例。以下实施例叙述了本文所公开的特征的组合的非限制性排列。特征的组合的其它排列也是可以预期的。具体地，这些带编号的实施例中的每一个都被认为是从属于或涉及每一个前面或随后的带编号的实施例，而与它们列出的顺序无关。
1.一种治疗有需要的个体中与编码SERPINA1蛋白的靶分子中的点突变相关的疾病或病症的方法，所述方法包括a)向所述个体施用对所述个体是外源性的工程化向导，所述工程化向导包括至少一个针对RNA编辑酶的募集结构域，其中所述募集结构域募集RNA编辑实体并促进所述RNA编辑实体对编码所述SERPINA1蛋白的所述靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰。2.一种将工程化向导递送到细胞的方法，所述方法包括a)向所述个体施用对所述个体是外源性的工程化向导，所述工程化向导包括至少一个针对RNA编辑酶的募集结构域，其中所述募集结构域募集RNA编辑实体并促进所述RNA编辑实体对编码SERPINA1蛋白的靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰。3.根据列举的实施例1或2所述的方法，其中所述RNA编辑实体对所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基的所述化学修饰可以通过体外ELISA测定来确认。4.根据列举的实施例1至3中任一项所述的方法，其中所述募集结构域包括结构特征。5.根据列举的实施例4所述的方法，其中所述结构特征包括凸起、内环、发夹或其任何组合。6.根据列举的实施例4或5所述的方法，其中所述结构特征可以是发夹。7.根据列举的实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述工程化向导包括DNA。8.根据列举的实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述工程化向导包括RNA。9.根据列举的实施例1至8中任一项中任一项所述的方法，其中所述工程化向导包括与SEQ ID NO:2-5中提供的核酸序列至少约85％序列同一性。10.根据列举的实施例1至9中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体包括：作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)或载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样(APOBEC)酶；(a)的催化活性片段；包括(a)或(b)的融合多肽；或这些的任何组合。11.根据列举的实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体对细胞可以是内源性的。12.根据列举的实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体包括ADAR。13.根据列举的实施例12所述的方法，其中所述ADAR包括人ADAR(hADAR)。14.根据列举的实施例12或13所述的方法，其中所述ADAR包括ADAR1或ADAR2。15.根据列举的实施例1至14中任一项所述的方法，其中所述工程化向导可以由包括在第一递送载体中或第一递送载体上的多核苷酸编码，或者其中包括在第二递送载体中的多核苷酸至少部分地编码所述工程化向导。16.根据列举的实施例1至15中任一项所述的方法，其中所述第一递送载体或所述第二递送载体包括腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。17.根据列举的实施例16所述的方法，其中所述AAV载体可以来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV 11。18.根据列举的实施例16至17中任一项所述的方法，其中所述AAV载体可以是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。19.根据列举的实施例16至18中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。20.根据列举的实施例16至19中任一项所述的方法，其中所述AAV载体可以是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。21.根据列举的实施例1至20中任一项所述的方法，其中所述工程化向导、所述第一递送载体或所述第二递送载体可以包括在单位剂型的药物组合物中，所述药物组合物包括至少一种药学上可接受的：赋形剂、载体或稀释剂。22.根据列举的实施例21所述的方法，其中所述药物组合物可以以治疗有效剂量施用以治疗受试者。23.根据列举的实施例21或22所述的方法，其中所述药物组合物可以通过以下方式施用于所述受试者：鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、大脑内、小脑内、脑室内、脑实质内、皮下或其组合。24.根据列举的实施例1至23中任一项所述的方法，其中受试者可以被诊断患有α-1抗胰蛋白酶缺乏症。25.根据列举的实施例24所述的方法，其中所述受试者可以通过体外测定被诊断患有所述疾病或所述病状。26.根据列举的实施例1至25中任一项所述的方法，其进一步包括施用另外的治疗剂以治疗所述疾病或所述病症。27.根据列举的实施例26所述的方法，其中所述另外的治疗剂包括氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物或其组合，其用于治疗肝病或病症。28.根据列举的实施例26所述的方法，其中所述另外的治疗剂包括血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式，其用于治疗黄斑变性。29.一种工程化向导，其包括：(a)至少一个RNA编辑酶募集结构域；(b)至少一个核酸结构特征；并且其中所述工程化向导可以被配置成促进靶RNA分子的核苷酸的核苷酸碱基的编辑以调节从所述靶RNA分子表达的SERPINA1蛋白质的表达水平。30.根据列举的实施例29所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子可以是mRNA分子。31.根据列举的实施例29所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子可以是前mRNA分子。32.根据列举的实施例29至31中任一项所述的工程化向导，其中所述结构特征包括凸起、内环、发夹或其任何组合。33.根据列举的实施例29至32中任一项所述的工程化向导，其中所述结构特征可以是发夹。34.根据列举的实施例29至33中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括DNA。35.根据列举的实施例29至34中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括RNA。36.根据列举的实施例29至35中任一项中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括与SEQ ID NO:2-5中提供的核酸序列至少约85％序列同一性。37.根据列举的实施例29至36中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体包括：作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)或载脂蛋白BmRNA编辑催化多肽样(APOBEC)酶；(a)的催化活性片段；包括(a)或(b)的融合多肽；或这些的任何组合。38.一种组合物，其包括根据列举的实施例1至37中任一项所述的工程化向导。39.一种多核苷酸，其至少部分地编码根据列举的实施例1至37中任一项所述的工程化向导。40.一种递送载体和任选地第二递送载体，其包括根据列举的实施例1至37中任一项所述的工程化向导或根据列举的实施例39所述的多核苷酸。41.根据列举的实施例40所述的递送载体，其中所述递送载体或所述第二递送载体包括病毒载体。42.根据列举的实施例40所述的递送载体，其中所述递送载体或所述第二递送载体包括腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。43.根据列举的实施例42所述的递送载体，其中所述AAV载体可以来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV 11。44.根据列举的实施例42或43所述的递送载体，其中所述AAV载体可以是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体或其任何组合。45.根据列举的实施例42至44中任一项所述的递送载体，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。46.根据列举的实施例42至45中任一项所述的递送载体，其中所述AAV载体可以是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。47.一种分离的细胞，其包括根据列举的实施例1至46中任一项所述的工程化向导。48.一种分离的细胞，其包括根据列举的实施例40至46中任一项所述的递送载体。49.根据列举的实施例47或48所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞可以是免疫细胞。50.根据列举的实施例48或49所述的分离的细胞，其中所述免疫细胞可以是T细胞。51.一种分离的多个细胞，其包括根据列举的实施例1至50中任一项所述的工程化向导或根据列举的实施例40至46中任一项所述的载体。根据列举的实施例51所述的分离的多个细胞，其中所述免疫细胞可以是T细胞。
另外的实施例：
1.一种工程化向导，其被配置成与靶RNA分子杂交时，与所述靶RNA分子的至少一部分形成双链底物，(i)其中所述双链底物包括至少一个结构特征，所述至少一个结构特征包括凸起、内环、发夹或其任何组合；(ii)其中所述双链底物募集RNA编辑实体；并且其中所述RNA编辑实体促进所述RNA编辑实体对所述靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰。2.根据实施例1所述的工程化向导，其中所述RNA编辑实体对所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基的所述化学修饰可通过桑格测序、下一代测序或其组合来确认。3.根据实施例1或2所述的工程化向导，其中所述工程化向导是单链的。4.根据实施例1至3中任一项所述的工程化向导，其中所述双链底物包括结构化基序，所述结构化基序包括结构特征中的两个或更多个结构特征。5.根据实施例1至4中任一项所述的工程化向导，其中所述结构特征包括凸起、内环、发夹、错配、摆动碱基对或其任何组合。6.根据实施例1至6中任一项所述的工程化向导，其中所述结构特征包括凸起。7.根据实施例5至6中任一项所述的工程化向导，其中所述凸起包括不对称凸起。8.根据实施例5至7中任一项所述的工程化向导，其中所述凸起包括对称凸起。9.根据实施例5至8中任一项所述的工程化向导，其中所述凸起包括所述工程化向导的约1至约4个核苷酸和所述靶RNA分子的约0至约4个核苷酸。10.根据实施例5至9中任一项所述的工程化向导，其中所述凸起包括所述工程化向导的约0至约4个核苷酸和所述靶RNA分子的约1至约4个核苷酸。11.根据实施例5至10中任一项所述的工程化向导，其中所述凸起包括所述工程化向导的3个核苷酸和所述靶RNA分子的3个核苷酸。12.根据实施例1至11中任一项所述的工程化向导，其中所述结构特征包括内环。13.根据实施例5至13中任一项所述的工程化向导，其中所述内环包括不对称内环。14.根据实施例5至13中任一项所述的工程化向导，其中所述内环包括对称内环。15.根据实施例5至14中任一项所述的工程化向导，其中所述内环由所述工程化向导或所述靶RNA分子的约5至约10个核苷酸形成。16.根据实施例5至15中任一项所述的工程化向导，其中所述结构特征包括发夹。17.根据实施例5至16中任一项所述的工程化向导，其中所述发夹包括双链RNA非靶向结构域。18.根据实施例5至17中任一项所述的工程化向导，其中所述发夹的茎环包括约3至约15个核苷酸的长度。19.根据实施例1至18中任一项所述的工程化向导，其中所述结构特征包括错配。20.根据实施例5至19中任一项所述的工程化向导，其中所述错配包括所述工程化向导中的与所述靶RNA分子中的碱基相对且不配对的碱基。21.根据实施例5至20中任一项所述的工程化向导，其中所述错配包括G/G错配。22.根据实施例5至21中任一项所述的工程化向导，其中所述错配包括A/C错配，并且其中A位于所述靶RNA分子中，并且C位于所述工程化向导中。23.根据实施例21所述的工程化向导，其中所述A/C错配中的A是由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基。24.根据实施例1至23中任一项所述的工程化向导，其中所述结构特征包括摆动碱基对。25.根据实施例5至24中任一项所述的工程化向导，其中所述摆动碱基对包括与尿嘧啶配对的鸟嘌呤。26.根据实施例5至25中任一项所述的工程化向导，其中所述结构基序包括两个凸起和A/C错配。27.根据实施例1至26中任一项所述的工程化向导，其中当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，如果它与RNA编辑实体结合，则以约大于或等于500nM的解离常数进行结合。28.根据实施例1至27中任一项所述的工程化向导，其中所述双链底物包括错配。29.根据实施例28所述的工程化向导，其中所述错配包括所述工程化向导中的与所述靶RNA分子中的碱基相对且不配对的碱基。30.根据实施例28所述的工程化向导，其中所述错配包括A/C错配，并且其中A位于所述靶RNA分子中，并且C位于所述工程化向导中。31.根据实施例30所述的工程化向导，其中所述A/C错配中的A是由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基。32.根据实施例31所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括与由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基相反的C。33.根据实施例1至32中任一项所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子包括与由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA中的所述核苷酸的所述碱基相邻的5'G。34.根据实施例1至33中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括与和由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的A相反且不配对的C相邻的5'G。35.根据实施例1至34中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导当与所述靶RNA分子结合时，模拟ADAR酶的天然存在的底物。36.根据实施例1至35中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导当与所述靶RNA分子结合时，模拟果蝇ADAR酶的天然存在的底物。37.根据实施例1至36中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括与SEQ ID NO:1-34或55-61中提供的核酸序列至少约85％序列同一性。38.根据实施例1至37中任一项所述的工程化向导，其中所述RNA编辑实体是：(a)ADAR或APOBEC；(b)(a)的催化活性片段；(c)包括(a)或(b)的融合多肽；或者(d)这些的任何组合。39.根据实施例1至38中任一项所述的工程化向导，其中所述RNA编辑实体对细胞是内源性的。40.根据实施例1至39中任一项所述的工程化向导，其中所述RNA编辑实体包括ADAR。41.根据实施例40所述的工程化向导，其中所述ADAR包括人ADAR(hADAR)。42.根据实施例40所述的工程化向导，其中所述ADAR包括ADAR1或ADAR2 43。根据实施例1至42中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括经修饰的DNA碱基、未经修饰的DNA碱基或其组合。44.根据实施例1至42中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括经修饰的RNA碱基、未经修饰的RNA碱基或其组合。45.根据任一项实施例1至44中所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子是mRNA分子。46.根据实施例1至44中任一项所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子是前mRNA分子。47.根据实施例1至44中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导被分离或纯化或两者。48.根据实施例1至44中任一项所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子编码APP、ABCA4、SERPINA1、HEXA、LRRK2、CFTR、SNCA、Tau或LIPA、这些中的任何一种的片段或其任何组合。49.根据实施例1至48中任一项所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子的所述核苷酸是相对于其它方面相同的参考靶RNA分子的所述靶RNA分子的点突变。50.根据实施例49所述的工程化向导，其中所述点突变包括错义突变。51.根据实施例50所述的工程化向导，其中所述错义突变引起所突变的核苷酸处的A。52.根据实施例49至51中任一项所述的工程化向导，其中所述点突变促进了所述靶RNA分子的意外剪接。53.根据实施例49所述的工程化向导，其中所述点突变包括定位成分别与所述点突变的5'和3'端上的C和G相邻的剪接位点突变。54.根据实施例1至53中任一项所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子由所述SERPINA1基因或其一部分编码。55.根据实施例53所述的工程化向导，其中所述SERPINA1基因包括相对于野生型SERPINA1基因(如登录号NC_000014.9:c94390654-94376747)的核苷酸位置9989处用A取代G。56.根据实施例1至53中任一项所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子由ABCA4基因或其一部分编码。57.根据实施例56所述的工程化向导，其中所述ABCA4基因包括相对于野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)的核苷酸位置5882处用A取代G。58.根据实施例56所述的工程化向导，其中所述ABCA4基因包括相对于野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)的核苷酸位置5714处用A取代G。59.根据实施例56所述的工程化向导，其中所述ABCA4基因包括相对于野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)的核苷酸位置6320处用A取代G。60.根据实施例1至53中任一项所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子由所述LRRK2基因或其一部分编码。61.根据实施例1至60中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括与由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基相反的C。62.根据实施例1至59中任一项所述的工程化向导，其中所述靶RNA分子包括与由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA中的所述核苷酸的所述碱基相邻的5'G。63.根据实施例1至62中任一项所述的工程化向导，其中所述工程化向导包括与和由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的A相反且不配对的C相邻的5'G。64.一种将工程化向导递送到细胞的方法，所述方法包括：直接或间接地将所述工程化向导递送到所述细胞，所述工程化向导与靶RNA分子的至少一部分至少部分地杂交并与其形成双链底物，(i)其中所述双链底物包括至少一个结构特征，所述至少一个结构特征包括凸起、内环、发夹或其任何组合；(ii)其中所述双链底物募集RNA编辑实体；并且65.其中所述RNA编辑实体促进所述RNA编辑实体对所述靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰。(ii)一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括：向患有疾病或病状的受试者施用工程化向导，由此治疗或预防所述受试者的所述疾病或所述病状，其中所述工程化向导：(a)至少部分地与靶RNA分子的至少一部分缔和：(b)与靶RNA分子结合，形成包括至少一个结构特征的双链底物，并且其中双链底物募集RNA编辑实体；并且(c)促进RNA编辑实体对靶RNA分子中的核苷酸的碱基的化学修饰。66.根据实施例64或65所述的方法，其中所述RNA编辑实体对所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基的所述化学修饰可通过桑格测序、下一代测序或其组合来确认。67.根据实施例64至66中任一项所述的方法，其中所述工程化向导是单链的。68.根据实施例64至67中任一项所述的方法，其中所述双链底物包括结构化基序，所述结构化基序包括结构特征中的两个或更多个结构特征。69.根据实施例64至68中任一项所述的方法，其中所述结构特征包括凸起、内环、发夹、错配、摆动碱基对或其任何组合。70.根据实施例64至69中任一项所述的方法，其中所述结构特征包括凸起。71.根据实施例69至70中任一项所述的方法，其中所述凸起包括不对称凸起。72.根据实施例69至71中任一项所述的方法，其中所述凸起包括对称凸起。73.根据实施例69至72中任一项所述的方法，其中所述凸起包括所述工程化向导的约2至约4个核苷酸和所述靶RNA分子的约2至约4个核苷酸。74.根据实施例69至73中任一项所述的方法，其中所述凸起包括所述工程化向导的3个核苷酸和所述靶RNA分子的3个核苷酸。75.根据实施例64至74中任一项所述的方法，其中所述结构特征包括内环。76.根据实施例69至75中任一项所述的方法，其中所述内环包括不对称内环。77.根据实施例69至76中任一项所述的方法，其中所述内环包括对称内环。78.根据实施例69至77中任一项所述的方法，其中所述内环由所述工程化向导或所述靶RNA分子的约5至约10个核苷酸形成。79.根据实施例64至78中任一项所述的方法，其中所述结构特征包括发夹。80.根据实施例69至79中任一项所述的方法，其中所述发夹包括双链RNA非靶向结构域。81.根据实施例69至80中任一项所述的方法，其中所述发夹的茎环包括约3至约15个核苷酸的长度。82.根据实施例69至81中任一项所述的方法，其中所述结构特征包括错配。83.根据实施例69至83中任一项所述的方法，其中所述错配包括所述工程化向导中的与所述靶RNA分子中的碱基相对且不配对的碱基。84.根据实施例69至83中任一项所述的方法，其中所述错配包括G/G错配。85.根据实施例69至84中任一项所述的方法，其中所述错配包括A/C错配，并且其中A位于所述靶RNA分子中，并且C位于所述工程化向导中。86.根据实施例85所述的方法，其中所述A/C错配中的A是由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基。87.根据实施例64至86中任一项所述的方法，其中所述结构特征包括摆动碱基对。88.根据实施例69至87中任一项所述的方法，其中所述摆动碱基对包括与尿嘧啶配对的鸟嘌呤。89.根据实施例69至87中任一项所述的方法，其中所述结构基序包括两个凸起和A/C错配。90.根据实施例69至87中任一项所述的方法，其中当存在于水溶液中并且未与靶RNA分子结合时，如果它与RNA编辑实体结合，则以约大于约500nM的解离常数进行结合。91.根据实施例64至91中任一项所述的方法，其中所述工程化向导包括经修饰的DNA碱基、未经修饰的DNA碱基或其组合。92.根据实施例64至92中任一项所述的方法，其中所述工程化向导包括经修饰的RNA碱基、未经修饰的RNA碱基或其组合。93.根据实施例64至93中任一项所述的方法，其中所述工程化向导包括与SEQ ID NO:1-34或55-61中提供的核酸序列至少约85％序列同一性。94.根据实施例64至94中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体包括：(a)作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)或载脂蛋白BmRNA编辑催化多肽样(APOBEC)酶；(b)(a)的催化活性片段；(c)包括(a)或(b)的融合多肽；或(d)这些的任何组合。95.根据实施例64至95中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体对细胞是内源性的。96.根据实施例64至97中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体包括ADAR。97.根据实施例96所述的方法，其中所述ADAR包括人ADAR(hADAR)。98.根据实施例96至97中任一项所述的方法，其中所述ADAR包括ADAR1或ADAR2。99.根据实施例64至99中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子编码APP、ABCA4、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、CFTR或LIPA、这些中的任何一种的片段或其任何组合。100.根据实施例64至99中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子编码蛋白质的切割位点的至少一部分。101.根据实施例100所述的方法，其中通过在所述切割位点处切割所述蛋白质产生的所述蛋白质的切割产物导致疾病的发病或进展。102.根据实施例63至101中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子编码淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的β-分泌酶切割位点。103.根据实施例52至102中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子的所述核苷酸是相对于其它方面相同的参考靶RNA分子的所述靶RNA分子的点突变。104.根据实施例103所述的方法，其中所述点突变与两个另外的核苷酸组合形成提前终止密码子，这导致从所述靶RNA分子表达的表达产物的翻译终止。105.根据实施例104所述的方法，其中在所述点突变的5'和3'端上，所述两个另外的核苷酸是(i)U和(ii)A或G。106.根据实施例103所述的方法，其中所述点突变是错义突变。107.根据实施例106所述的方法，其中所述错义突变引起所突变的核苷酸处的A。108.根据实施例103所述的方法，其中所述点突变促进了所述靶RNA分子的意外剪接。109.根据实施例103或106所述的方法，其中所述点突变是定位成分别与所述点突变的5'和3'端上的C和G相邻的剪接位点突变。110.根据实施例63至109中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子由所述SERPINA1基因或其一部分编码。111.根据实施例110所述的方法，其中所述SERPINA1基因包括相对于野生型SERPINA1基因(如登录号NC_000014.9:c94390654-94376747)的核苷酸位置9989处用A取代G。112.根据实施例63至109中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子由ABCA4基因或其一部分编码。113.根据实施例111所述的方法，其中所述ABCA4基因包括相对于野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)的核苷酸位置5882处用A取代G。114.根据实施例111所述的方法，其中所述ABCA4基因包括相对于野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)的核苷酸位置5714处用A取代G。115.根据实施例111所述的方法，其中ABCA4基因包括相对于野生型ABCA4基因(如登录号NC_000001.11:c94121149-93992837)的核苷酸位置6320处用A取代G。116.根据实施例63至109中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子由所述LRRK2基因或其一部分编码。117.根据实施例63至109中任一项所述的方法，其中所述工程化向导包括与由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的所述核苷酸的所述碱基相反的C。118.根据实施例62至116中任一项所述的方法，其中所述靶RNA分子包括与由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA中的所述核苷酸的所述碱基相邻的5'G。119.根据实施例62至117中任一项所述的方法，其中所述工程化向导包括与和由所述RNA编辑实体化学修饰的所述靶RNA分子中的A相反且不配对的C相邻的5'G。120.根据实施例63至119中任一项所述的方法，其中所述工程化向导由包括在第一递送载体中或第一递送载体上的多核苷酸编码，或者其中包括在第二递送载体中的多核苷酸至少部分地编码所述工程化向导。121.根据实施例119所述的方法，其中所述第一递送载体或所述第二递送载体包括腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。122.根据实施例120所述的方法，其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。123.根据实施例120至121中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。124.根据实施例120至122中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。125.根据实施例120至123中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。126.根据实施例123至124中任一项所述的方法，其中所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。127.根据实施例125所述的方法，其中所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。128.根据实施例62至126中任一项所述的方法，其中所述工程化向导、所述第一递送载体或所述第二递送载体包括在单位剂型的药物组合物中，所述药物组合物包括至少一种药学上可接受的：赋形剂、载体或稀释剂。129.根据实施例128所述的方法，其中所述药物组合物以治疗有效剂量施用以治疗受试者。130.根据实施例127或128所述的方法，其中所述药物组合物通过以下方式施用于所述受试者：鞘内、眼内、玻璃体内、视网膜、静脉内、肌内、心室内、脑内、小脑内、脑室内、脑实质内、皮下或其组合。131.根据实施例65至130中任一项所述的方法，其中所述疾病是黄斑变性。132.根据实施例65至131中任一项所述的方法，其中所述疾病是斯特格氏病。133.根据实施例65至132中任一项所述的方法，其中所述疾病是α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)。134.根据实施例65至133中任一项所述的方法，其中所述疾病或所述病状包括神经疾病或病症。135.根据实施例134所述的方法，其中所述神经疾病或病症包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、Tau蛋白病或痴呆。136.根据实施例65至135中任一项所述的方法，其中所述疾病或所述病状包括肝病或病症。137.根据实施例136所述的方法，其中所述肝病或病症包括肝硬化。138.根据实施例136所述的方法，其中所述肝病或病症是α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AAT缺乏症)。139.根据实施例65至138中任一项所述的方法，其中所述受试者被诊断患有所述疾病或所述病状。140.根据实施例139所述的方法，其中所述受试者通过体外测定被诊断患有所述疾病或所述病状。141.根据实施例65至140中任一项所述的方法，其进一步包括施用另外的治疗剂以治疗所述疾病或所述病症。142.根据实施例141所述的方法，其中所述另外的治疗剂包括氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物或其组合，其用于治疗肝病或病症。143.根据实施例141所述的方法，其中所述另外的治疗剂包括血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式，其用于治疗黄斑变性。144.一种组合物，其包括根据实施例1至143中任一项所述的工程化向导。145.一种多核苷酸，其至少部分地编码根据实施例1至144中任一项所述的工程化向导。146.一种递送载体和任选地第二递送载体，其包括根据实施例1至143中任一项所述的工程化向导或根据实施例145所述的多核苷酸。147.根据实施例146所述的递送载体，其中所述递送载体或所述第二递送载体包括病毒载体。148.根据实施例146所述的递送载体，其中所述递送载体或所述第二递送载体包括腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。149.根据实施例147所述的递送载体，其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。150.根据实施例147或148所述的递送载体，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体或其任何组合。151.根据实施例147至150中任一项所述的递送载体，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。152.根据实施例147至150中任一项所述的递送载体，其中所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。153.一种分离的细胞，其包括根据实施例1至143中任一项所述的工程化向导。154.一种分离的细胞，其包括根据实施例146至152中任一项所述的递送载体。155.根据实施例153或154所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是免疫细胞。156.根据实施例155所述的分离的细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。157.一种分离的多个细胞，其包括根据实施例1至143中任一项所述的工程化向导或根据实施例146至152中任一项所述的载体。158.根据实施例157所述的分离的多个细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。159.一种药物组合物，其包括：(a)根据实施例1至145中任一项所述的工程化向导、根据实施例146所述的组合物、根据实施例155至158中任一项所述的分离的细胞或根据实施例159或160所述的分离的多个细胞；以及(b)药学上可接受的：赋形剂、载体或稀释剂。160.根据实施例159所述的药物组合物，其呈单位剂量形式。161.根据实施例159或160所述的药物组合物，其进一步包括另外的治疗剂。162.根据实施例159所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂包括氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式或其任何组合。163.一种试剂盒，其包括：(a)根据实施例1至143中任一项所述的工程化向导、根据实施例144所述的组合物、根据实施例159至162中任一项所述的药物组合物、根据实施例153至156中任一项所述的分离的细胞或根据实施例157或158所述的分离的多个细胞；以及(b)容器。164.根据实施例163所述的试剂盒，其进一步包括另外的治疗剂。165.根据实施例164所述的试剂盒，其中所述另外的治疗剂包括氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式或其任何组合。166.一种制备根据实施例165所述的试剂盒的方法，所述方法包括：使根据实施例1至143中任一项所述的工程化向导、根据实施例144所述的组合物、根据实施例159至162中任一项所述的药物组合物、根据实施例153至156中任一项所述的分离的细胞或根据实施例157或158所述的分离的多个细胞与所述容器接触。167.一种制备表达载体的方法，所述方法包括：将至少部分地编码根据实施例1至143中任一项所述的工程化向导的转基因引入表达载体中。168.一种制备递送载体的方法，所述方法包括：用根据实施例1至143中任一项所述的工程化向导加载递送载体。169.一种产生AAV递送载体的方法，所述方法包括：(a)将以下引入细胞中：(i)编码根据实施例1至145中任一项所述的工程化向导的多核苷酸；和(ii)包括复制(Rep)基因和编码野生型AAV衣壳蛋白或其经修饰形式的衣壳(Cap)基因的病毒基因组；(b)在细胞中表达野生型AAV衣壳蛋白或其经修饰形式；(c)组装AAV颗粒；以及(d)将编码工程化向导RNA的多核苷酸包装在AAV颗粒中，从而生成AAV递送载体。170.根据实施例169所述的方法，其中编码所述工程化向导的所述多核苷酸被5'和3'反向末端重复(ITR)序列封闭。171.根据实施例170所述的方法，其中所述病毒基因组进一步包括5'ITR和3'ITR。172.根据实施例170所述的方法，其中编码所述工程化向导的所述多核苷酸包括在质粒中。173.根据实施例169至172中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将包括从腺病毒分离的辅助基因的辅助质粒引入所述细胞中。174.根据实施例169至173中任一项所述的方法，其中所述质粒蛋白、所述Rep基因或所述ITR序列或其组合来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。175.根据实施例175所述的方法，其中所述AAV递送载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。176.根据实施例176至177中任一项所述的方法，其中所述AAV递送载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。
实施例B1.一种工程化潜在向导RNA，其在与涉及疾病或病状的靶RNA杂交时，形成向导-靶RNA支架，所述向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合，其中所述结构特征基本上在与所述靶RNA杂交时形成。
实施例B2.根据实施例B1所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架进一步包括错配。
实施例B3.根据实施例B2所述的工程化潜在向导RNA，其中所述错配是腺苷/胞嘧啶(A/C)错配，其中所述腺苷(A)存在于所述靶RNA中，并且所述胞嘧啶(C)存在于所述工程化潜在向导RNA中。
实施例B4.根据实施例B1至实施例B3中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括摆动碱基对。
实施例B5.根据实施例B1至实施例B3中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架是RNA编辑实体的底物，所述RNA编辑实体对所述靶RNA中的核苷酸的碱基进行化学修饰。
实施例B6.根据实施例B3至实施例B5中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述RNA编辑实体将所述靶RNA中的所述腺苷化学修饰成肌苷。
实施例B7.根据实施例B1至实施例B6中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括结构化基序，所述结构化基序包括两个或更多个选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合。
实施例B8.根据实施例B1至实施例B6中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或10个选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合。
实施例B9.根据实施例B1至实施例B8中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述结构特征是凸起。
实施例B10.根据实施例B9所述的工程化潜在向导RNA，其中所述凸起是不对称凸起。
实施例B11.根据实施例B9所述的工程化潜在向导RNA，其中所述凸起是对称凸起。
实施例B12.根据实施例B9至实施例B11中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述凸起包括所述工程化潜在向导RNA的1至4个核苷酸和所述靶RNA的0至4个核苷酸。
实施例B13.根据实施例B9至实施例B11中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述凸起包括所述工程化潜在向导RNA的0至4个核苷酸和所述靶RNA的1至4个核苷酸。
实施例B14.根据实施例B10所述的工程化潜在向导RNA，其中所述不对称凸起是X1/X2不对称凸起，其中X1是所述不对称凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述不对称凸起中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，其中所述X1/X2不对称凸起是0/1不对称凸起、1/0不对称凸起、0/2不对称凸起、2/0不对称凸起、0/3不对称凸起、3/0不对称凸起、0/4不对称凸起、4/0不对称凸起、1/2不对称凸起、2/1不对称凸起、1/3不对称凸起、3/1不对称凸起、1/4不对称凸起、4/1不对称凸起、2/3不对称凸起、3/2不对称凸起、2/4不对称凸起、4/2不对称凸起、3/4不对称凸起或4/3不对称凸起。
实施例B15.根据实施例B11所述的工程化潜在向导RNA，其中所述对称凸起是X1/X2对称凸起，其中X1是所述对称凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述对称凸起中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2对称凸起2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起。
实施例B16.根据实施例B1至实施例B8中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述结构特征包括内环。
实施例B17.根据实施例B16所述的工程化潜在向导RNA，其中所述内环包括不对称内环。
实施例B18.根据实施例B16所述的工程化潜在向导RNA，其中所述内环包括对称内环。
实施例B19.根据实施例B17所述的工程化潜在向导RNA，其中所述不对称内环是X1/X2不对称内环，其中X1是所述不对称内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述不对称内环中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2不对称内环是5/6不对称内环、6/5不对称内环、5/7不对称内环、7/5不对称内环、5/8不对称内环、8/5不对称内环、5/9不对称内环、9/5不对称内环、5/10不对称内环、10/5不对称内环、6/7不对称内环、7/6不对称内环、6/8不对称内环、8/6不对称内环、6/9不对称内环、9/6不对称内环、6/10不对称内环、10/6不对称内环、7/8不对称内环、8/7不对称内环、7/9不对称内环、9/7不对称内环、7/10不对称内环、10/7不对称内环、8/9不对称内环、9/8不对称内环、8/10不对称内环、10/8不对称内环或9/10不对称内环或10/9不对称内环。
实施例B20.根据实施例B18所述的工程化潜在向导RNA，其中所述对称内环是X1/X2对称内环，其中X1是所述对称内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述对称内环中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2对称内环是5/5对称内环、6/6对称内环、7/7对称内环、8/8对称内环、9/9对称内环、10/10对称内环、12/12对称内环、15/15对称内环或20/20对称内环。
实施例B21.根据实施例B16至实施例B20中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述内环由所述工程化潜在向导RNA或所述靶RNA上的至少5个核苷酸形成。
实施例B22.根据实施例B16至实施例B21中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述内环由所述工程化潜在向导RNA或所述靶RNA的5至1000个核苷酸形成。
实施例B23.根据实施例B16至实施例B22中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述内环由所述工程化潜在向导RNA或所述靶RNA的5至50个核苷酸形成。
实施例B24.根据实施例B16至实施例B23中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述内环由所述工程化潜在向导RNA或所述靶RNA的5至20个核苷酸形成。
实施例B25.根据实施例B1至实施例B8中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述结构特征包括发夹。
实施例B26.根据实施例B25所述的工程化潜在向导RNA，其中所述发夹包括非募集发夹。
实施例B27.根据实施例B25或实施例B26所述的工程化潜在向导RNA，其中所述发夹的环部分包括约3至约15个核苷酸的长度。
实施例B28.根据实施例B1至实施例B27中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA进一步包括至少两个另外的结构特征，所述结构特征包括至少两个错配。
实施例B29.根据实施例B28所述的工程化潜在向导RNA，其中所述至少两个错配中的至少一个错配是G/G错配。
实施例B30.根据实施例B1至实施例B29中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA进一步包括另外的结构特征，所述结构特征包括摆动碱基对。
实施例B31.根据实施例B30所述的工程化潜在向导RNA，其中所述摆动碱基对包括与尿嘧啶配对的鸟嘌呤。
实施例B32.根据实施例B6至实施例B31中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA包括与所述靶RNA中的所述腺苷相邻的5'鸟苷，所述腺苷被所述RNA编辑实体化学修饰成肌苷。
实施例B33.根据实施例B32所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA包括与所述A/C错配的所述胞嘧啶相邻的5'鸟苷。
实施例B34.根据实施例B1至实施例B33中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架模拟ADAR酶的天然存在的底物。
实施例B35.根据实施例B1至实施例B34中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架模拟果蝇ADAR酶的天然存在的底物。
实施例B36.根据实施例B5至实施例B35中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述RNA编辑实体是：
(a)作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；
(b)(a)的催化活性片段；
(c)包括(a)或(b)的融合多肽；或
(d)这些的任何组合。
实施例B37.根据实施例B5至实施例B36中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述RNA编辑实体对细胞是内源性的。
实施例B38.根据实施例B5至实施例B37中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述RNA编辑实体包括ADAR。
实施例B39.根据实施例B38所述的工程化潜在向导RNA，其中所述ADAR包括人ADAR(hADAR)。
实施例B40.根据实施例B38所述的工程化潜在向导RNA，其中所述ADAR包括ADAR1、ADAR2、ADAR3或其任何组合。
实施例B41.根据实施例B38所述的工程化潜在向导RNA，其中所述ADAR1包括ADAR1p110、ADAR1p150或其任何组合。
实施例B42.根据实施例B1至实施例B41中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA包括经修饰的RNA碱基、未经修饰的RNA碱基或其组合。
实施例B43.根据任一项实施例B1至实施例B42所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA是mRNA分子。
实施例B44.根据实施例B1至实施例B42中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA是前mRNA分子。
实施例B45.根据实施例B1至实施例B44中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA是APP、ABCA4、SERPINA1、HEXA、LRRK2、CFTR、SNCA、MAPT或LIPA、这些中的任何一种的片段或其任何组合。
实施例B46.根据1至实施例B44中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA编码淀粉样蛋白前体多肽、ATP结合盒、亚家族A、成员4(ABCA4)多肽、α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽、己糖胺酶A酶、富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)多肽、CFTR多肽、α突触核蛋白多肽、Tau多肽或溶酶体酸性脂肪酶多肽。
实施例B47.根据实施例B45或实施例B46所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA编码ABCA4多肽。
实施例B48.根据实施例B47所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA包括相对于具有登录号NC_000001.11:c94121149-93992837的野生型ABCA4基因序列，在位置5882、6320或5714处的G至A取代。
实施例B49.根据实施例B47或实施例B48所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表7、表9、表10、表11、表18或表19。
实施例B50.根据实施例B47至实施例B49中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个凸起是2/1不对称凸起、1/0不对称凸起、2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起；(ii)X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述内环是5/5对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是G/G错配、A/C错配或G/A错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。
实施例B51.根据实施例B50所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括2/1不对称凸起、1/0不对称凸起、G/G错配、A/C错配和3/3对称凸起。
实施例B52.根据实施例B47至实施例B51中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA的长度为80至175个核苷酸。
实施例B53.根据实施例B47至实施例B52中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:339-SEQ ID NO:341或SEQ ID NO:292-SEQ ID NO:296具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
实施例B54.根据实施例B47至实施例B52所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
实施例B55.根据实施例B45或实施例B46所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA编码LRRK2多肽。
实施例B56.根据实施例B55所述的工程化潜在向导RNA，其中所述LRRK2多肽包括选自由以下组成的组的突变：E10L、A30P、S52F、E46K、A53T、L119P、A211V、C228S、E334K、N363S、V366M、A419V、R506Q、N544E、N551K、A716V、M712V、I723V、P755L、R793M、I810V、K871E、Q923H、Q930R、R1067Q、S1096C、Q1111H、I1122V、A1151T、L1165P、I1192V、H1216R、S1228T、P1262A、R1325Q、I1371V、R1398H、T1410M、D1420N、R1441G、R1441H、A1442P、P1446L、V1450I、K1468E、R1483Q、R1514Q、P1542S、V1613A、R1628P、M1646T、S1647T、Y1699C、R1728H、R1728L、L1795F、M1869V、M1869T、L1870F、E1874X、R1941H、Y2006H、I2012T、G2019S、I2020T、T2031S、N2081D、T2141M、R2143H、Y2189C、T2356I、G2385R、V2390M、E2395K、M2397T、L2466H或Q2490NfsX3。
实施例B57.根据实施例B55或实施例B56所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表12、表15、表25、表26、表27、表17或表20。
实施例B58.根据实施例B55至实施例B57中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个凸起是0/1不对称凸起、2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起；(ii)一个或多个X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个内环是5/0不对称内环、5/4不对称内环、5/5对称内环、6/6对称内环、7/7对称内环或10/10对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、A/G错配、C/U错配、G/A错配或C/C错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。
实施例B59.根据实施例B58所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括6/6对称内环、A/C错配、A/G错配和C/U错配。
实施例B60.根据实施例B55至实施例B59中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA的长度为80至175个核苷酸。
实施例B61.根据实施例B55至实施例B60中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:344或SEQ ID NO:345具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
实施例B62.根据实施例B55至实施例B60所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％、至少100％序列同一性。
实施例B63.根据实施例B45或实施例B46所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA编码SNCA多肽。
实施例B64.根据实施例B63所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA与选自由以下组成的组的所述靶RNA的序列杂交：5'非翻译区(UTR)、3'UTR和SNCA基因的翻译起始位点。
实施例B65.根据实施例B63或实施例B64所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表21、表23或表28。
实施例B66.根据实施例B63至实施例B65中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自由以下组成的组的结构特征：(i)X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述凸起是4/4对称凸起；(ii)一个或多个X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个内环是5/5对称环、8/8对称环或49/4不对称环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、G/G错配、G/A错配、U/C错配或A/A错配；(iv)其任何组合。
实施例B67.根据实施例B66所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA的长度为80至175个核苷酸。
实施例B68.根据实施例B63至实施例B66中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
实施例B69.根据实施例B45或实施例B46所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA编码SERPINA1。
实施例B70.根据实施例B69所述的工程化潜在向导RNA，其中所述靶RNA包括相对于具有登录号NC_000014.9:c94390654-94376747的野生型SERPINA1基因序列，在位置9989处的G至A取代。
实施例B71.根据实施例B69或实施例B70所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表5、表29、表30、表31、表32、表33、表34、表35或表36。
实施例B72.根据实施例B69至实施例B71中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述凸起是0/2不对称凸起、0/3不对称凸起、1/0不对称凸起、2/0不对称凸起、2/2对称凸起、3/0不对称凸起、2/2对称凸起或3/3对称凸起；(ii)X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化潜在向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述内环是5/5对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、A/A错配和G/A错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。
实施例B73.根据实施例B72所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA的长度为80至175个核苷酸。
实施例B74.根据实施例B69至实施例B73中任一项所述的工程化潜在向导RNA，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:6-10、102-103或297-327中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
实施例B75.根据1至实施例B74所述的工程化潜在向导RNA，其中由所述RNA编辑实体修饰的所述靶RNA的所述核苷酸的所述碱基包括在所述靶RNA的点突变中。
实施例B76.根据实施例B75所述的工程化潜在向导RNA，其中所述点突变包括错义突变。
实施例B77.根据实施例B75所述的工程化潜在向导RNA，其中所述点突变是无义突变。
实施例B78.根据实施例B77所述的工程化潜在向导RNA，其中所述无义突变是提前UAA终止密码子。
实施例B79.根据1至实施例B78所述的工程化潜在向导RNA，其中所述结构特征相对于缺乏所述结构特征的在其它方面相当的向导RNA，增加了编辑所述靶RNA中靶腺苷的选择性。
实施例B80.根据1至实施例B79所述的工程化潜在向导RNA，其中相对于缺乏所述结构特征的在其它方面相当的向导RNA，所述结构特征减少了所述RNA编辑实体对所述靶RNA中的靶腺苷的5'或3'的200、100、50、25、10、5、2或1、1个核苷酸内的局部脱靶腺苷的RNA编辑量。
实施例B81.一种工程化RNA，其包括：
(a)根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA；
(b)U7 snRNA发夹序列、SmOPT序列或其组合。
实施例B82.根据实施例B81所述的工程化潜在向导RNA，其中所述U7发夹具有TAGGCTTTCTGGCTTTTTACCGGAAAGCCCCT(SEQ ID NO:389)或
CAGGTTTTCTGACTTCGGTCGGAAAACCCCT(SEQ ID NO:394)的序列。
实施例B83.根据实施例B81所述的工程化潜在向导RNA，其中所述SmOPT序列具有AATTTTTGGAG(SEQ ID NO:390)的序列。
实施例B84.一种多核苷酸，其编码根据实施例B1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA或根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA。
实施例B85.一种递送载体，其包括根据实施例B1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA或根据实施例B84所述的多核苷酸。
实施例B86.根据实施例B85所述的递送载体，其中所述递送载体是病毒载体。
实施例B87.根据实施例B86所述的递送载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。
实施例B88.根据实施例B87所述的递送载体，其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。
实施例B89.根据实施例B87或实施例B88所述的递送载体，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。
实施例B90.根据实施例B87至实施例B89中任一项所述的递送载体，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。
实施例B91.根据实施例B87至实施例B90中任一项所述的递送载体，其中所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。
实施例B92.根据实施例B90所述的递送载体，其中所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。
实施例B93.根据实施例B92所述的递送载体，其中所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。
实施例B94.一种药物组合物，其包括：
(a)根据实施例B1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸或根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体；以及
(b)药学上可接受的：赋形剂、载体或稀释剂。
实施例B95.根据实施例B94所述的药物组合物，其呈单位剂量形式。
实施例B96.根据实施例B94或实施例B95所述的药物组合物，其进一步包括另外的治疗剂。
实施例B97.根据实施例B96所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂包括氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式或其任何组合。
实施例B98.一种编辑细胞中的靶RNA的方法，所述方法包括：向所述细胞施用有效量的根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸、根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体或根据实施例B94至实施例B97中任一项所述的药物组合物。
实施例B99.一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸、根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体或根据实施例B94至实施例B97中任一项所述的药物组合物。
实施例B100.根据实施例B98所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA作为单位剂量施用。
实施例B101.根据实施例B100所述的方法，其中所述单位剂量是足以治疗所述受试者的量。
实施例B102.根据实施例B98至实施例B101中任一项所述的方法，其中所述施用是鞘内的，眼内的、玻璃体内的、视网膜的、静脉内的、肌内的、心室内的、大脑内的、小脑内的、脑室内的、脑实质内的、皮下的或其组合。
实施例B103.根据实施例B98至实施例B102中任一项所述的方法，其中所述疾病包括神经疾病。
实施例B104.根据实施例B103所述的方法，其中所述神经疾病包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、Tau蛋白病或痴呆。
实施例B105.根据实施例B103或实施例B104所述的方法，其中所述神经疾病相对于未患有所述神经疾病或病状的健康受试者，与SNCA多肽水平升高相关。
实施例B106.根据实施例B105所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA与编码所述SNCA多肽的靶RNA的序列杂交，所述序列选自由以下组成的组：5'非翻译区(UTR)、3'UTR和SNCA的翻译起始位点；其中杂交产生作为RNA编辑实体的底物的向导-靶RNA支架，所述RNA编辑实体对所述靶RNA的所述序列中的核苷酸的碱基进行化学修饰，由此降低所述SNCA多肽的水平。
实施例B107.根据实施例B106所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA与编码所述SNCA的翻译起始位点的靶RNA的序列杂交。
实施例B108.根据实施例B105至实施例B107中任一项所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
实施例B109.根据实施例B105至实施例B108中任一项所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA包括具有至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。
实施例B110.根据实施例B103或实施例B104所述的方法，其中所述神经疾病与由所述靶RNA编码的LRRK2多肽的突变相关，其中所述突变选自由以下组成的组：E10L、A30P、S52F、E46K、A53T、L119P、A211V、C228S、E334K、N363S、V366M、A419V、R506Q、N544E、N551K、A716V、M712V、I723V、P755L、R793M、I810V、K871E、Q923H、Q930R、R1067Q、S1096C、Q1111H、I1122V、A1151T、L1165P、I1192V、H1216R、S1228T、P1262A、R1325Q、I1371V、R1398H、T1410M、D1420N、R1441G、R1441H、A1442P、P1446L、V1450I、K1468E、R1483Q、R1514Q、P1542S、V1613A、R1628P、M1646T、S1647T、Y1699C、R1728H、R1728L、L1795F、M1869V、M1869T、L1870F、E1874X、R1941H、Y2006H、I2012T、G2019S、I2020T、T2031S、N2081D、T2141M、R2143H、Y2189C、T2356I、G2385R、V2390M、E2395K、M2397T、L2466H或Q2490NfsX3。
实施例B111.根据实施例B103或实施例B104所述的方法，其中所述神经疾病与由所述靶RNA编码的LRRK2多肽的突变相关，其中所述突变是G2019S突变。
实施例B112.根据实施例B110至114中任一项所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％、至少100％序列同一性。
实施例B113.根据实施例B110至实施例B112中任一项所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA包括具有至少约60％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。
实施例B114.根据实施例B98至实施例B102中任一项所述的方法，其中所述疾病包括肝病。
实施例B115.根据实施例B114所述的方法，其中所述肝病包括肝硬化。
实施例B116.根据实施例B114所述的方法，其中所述肝病是α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症。
实施例B117.根据实施例B116所述的方法，其中所述AAT缺乏症与具有登录号NC_000014.9:c94390654-94376747的野生型SERPINA1基因序列的位置9989处的G至A取代相关。
实施例B118.根据实施例B116或实施例B117所述的方法，其中所述工程化潜在，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:6-10、102-103或297-327中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
实施例B119.根据实施例B116至实施例B118中任一项所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA包括具有至少约60％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。
实施例B120.根据实施例B98至实施例B102中任一项所述的方法，其中所述疾病是黄斑变性。
实施例B121.根据实施例B120所述的方法，其中所述黄斑变性是斯特格氏病。
实施例B122.根据实施例B121所述的方法，其中所述斯特格氏病与具有登录号NC_000001.11:c94121149-93992837的野生型ABCA4基因序列的位置5882、6320或5714处的G至A取代相关。
实施例B123.根据实施例B122所述的方法，其中所述斯特格氏病与位置5882处的G至A取代相关。
实施例B124.根据实施例B121或实施例B122所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
实施例B125.根据实施例B122至实施例B124中任一项所述的方法，其中所述工程化潜在向导RNA包括具有至少约70％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约80％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。
实施例B126.根据实施例B98至实施例B125中任一项所述的方法，其中所述受试者被诊断患有所述疾病或所述病状。
实施例B127.根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸、根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体或根据实施例B94至实施例B97中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
实施例B128.根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸、根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体或根据实施例B94至实施例B97中任一项所述的药物组合物，其用于治疗神经疾病。
实施例B129.根据实施例B129所述的供使用的所述工程化潜在向导RNA、所述多核苷酸、所述递送载体或所述药物组合物，其中所述神经疾病是帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、Tau蛋白病或痴呆。
实施例B130.根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸、根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体或根据实施例B94至实施例B97中任一项所述的药物组合物，其用于治疗肝病。
实施例B131.根据实施例B130所述的供使用的所述工程化潜在向导RNA、所述多核苷酸、所述递送载体或所述药物组合物，其中所述肝病包括肝硬化。
实施例B132.根据实施例B130所述的供使用的所述工程化潜在向导RNA、所述多核苷酸、所述递送载体或所述药物组合物，其中所述肝病是α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症。
实施例B133.根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸、根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体或根据实施例B94至实施例B97中任一项所述的药物组合物，其用于治疗黄斑变性。
实施例B134.根据实施例B133所述的供使用的所述工程化潜在向导RNA、所述多核苷酸、所述递送载体或所述药物组合物，其中所述黄斑变性是斯特格氏病。
实施例B135.一种根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸、根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体或根据实施例B94至实施例B97中任一项所述的药物组合物用于制造药物的用途。
实施例B136.一种根据1至实施例B80中任一项所述的工程化潜在向导RNA、根据实施例B81至实施例B83中任一项所述的工程化RNA、根据实施例B84所述的多核苷酸、根据实施例B85至实施例B93中任一项所述的递送载体或根据实施例B94至实施例B97中任一项所述的药物组合物用于制造用于治疗神经疾病、肝病或黄斑变性的药物的用途。
实施例B137.一种工程化潜在向导RNA，其中与靶RNA杂交时，形成向导-靶RNA支架，所述向导-靶RNA支架包括A/C错配和选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹、第二错配和其任何组合，其中所述结构特征相对于缺乏所述结构特征的在其它方面相当的向导RNA，增加了所述RNA编辑实体对所述靶RNA的RNA编辑量。根据实施例B1所述的工程化潜在向导RNA，其中所述结构特征基本上在与所述靶RNA杂交时形成。
实例
仅出于说明性目的包含以下实例，并且所述实例并不旨在限制本公开的范围。
实例1
示例工作流程
图1展示了根据本文所描述的方法的工作流程的实例。首先分离并永生化来自具有致病突变的患者的mRNA、前mRNA或细胞(步骤a)。其次，使用DNA或RNA测序(例如，桑格测序)验证一个或多个突变的mRNA表达(步骤b)。第三，重组产生具有能够与前mRNA或包括突变的mRNA的区域杂交的靶向区域的工程化向导(步骤c)。第四，向患者细胞施用工程化向导(例如，经由病毒载体)。治疗后，为了验证编辑是否已发生，分离患者RNA并将其转化为cDNA(步骤e)，然后通过桑格测序进行测序(步骤f)。在一些情况下，mRNA或前mRNA没有突变，但包含待编辑的靶腺苷以减少疾病发病机制。例如，靶mRNA可以是APP，并且腺苷可以被向导RNA靶向以由ADAR编辑，从而减少分泌酶的切割。
实例2
SERPINA1 E342K可以在来自纯合患者的成纤维细胞中被编辑
此实例描述了对来自携带纯合突变的患者的成纤维细胞中的SERPINA1 E342K突变进行编辑。重组产生靶向mRNA和前mRNA两者的向导RNA(gRNA)。测试的gRNA在待编辑的SERPINA1中与靶标A相反的位置处包括C，因此在gRNA与靶序列杂交并形成双链底物时产生错配。测试的gRNA全都为线性gRNA。下表5中提供了测试的gRNA的汇总。表5中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。对于1.100.50gRNA，内部GluR2是gRNA本身中预先形成的发夹(或募集结构域)。对于表5中所示出的工程化向导RNA序列，小写字母表示靶向内含子序列的向导RNA的区域，并且大写字母表示靶向外显子序列的向导RNA的区域。
表5–针对SERPINA1前mRNA的工程化gRNA
来自携带E342K突变的患者的永生化细胞(成纤维细胞)在培养物中生长。使用RT-PCR或可以识别突变的同种型的合适抗体验证患者中来自突变的SERPINA1基因的α-1抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的突变同种型的mRNA表达。针对Rab7a的工程化gRNA(“对照gRNA”；阴性对照)和针对SERPINA1的工程化gRNA在成纤维细胞中被核转染。每次转染使用2×10^5个细胞，并且用60pmol的工程化gRNA转染细胞。对从分离的RNA合成的cDNA进行PCR扩增，然后进行桑格测序。使用定量软件对编辑百分比进行定量。图13示出了由gRNA中的每个gRNA实现的编辑百分比。在此实验中，具有单个A/C错配并且缺少募集结构域的gRNA提供了最高水平的中靶编辑。
实例3
向导RNA长度和ABCA4靶向工程化向导RNA中的A/C错配位置的影响
此实例描述了改变向导RNA长度和本公开的ABCA4靶向工程化向导RNA中的A/C错配位置对ADAR介导的RNA编辑的影响。在破碎的荧光素酶筛选中进行变化倍数荧光素酶测定，以评估改变向导长度和错配位置对ABCA4的RNA编辑的影响。将携带所关注的ABCA4突变的人造ABCA4微小基因引入细胞。为了生成人造ABCA4微小基因，对原始转录物的五个核苷酸进行了修饰。这些改变汇总在下文表6中。GAA到TAG的突变引入了提前终止密码子，并且靶RNA中TAG序列内的A被靶向用于使用本文所公开的工程化向导RNA进行RNA编辑。
表6–人造ABCA4突变
突变 外显子 与靶标A的距离 基本原理
GAA->TAG 42 +1，-1 创建终止密码子
A->G 41 80 向导中无TTTT
A->G 43 -52 向导中无TTTT
A->G 44 -154 向导中无TTTT
重组产生具有各种长度和具有各种错配位置的向导。测试的gRNA全都为线性gRNA。下表7中提供了测试的gRNA的汇总。表7中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。
表7–针对ABCA4的工程化gRNA
如图14所示出的，150.75向导显示荧光素酶的最高变化倍数。当它从5'至3'表示时，第10、50和90行是指A/C错配的百分位数，并且x轴表示每个向导RNA的长度。表7中列举的名称详述了各种向导中的长度和错配位置。例如，向导“150.75”是指长度为150个核苷酸的向导，其中在工程化向导RNA与靶RNA杂交时形成的双链底物中形成A/C错配的C定位于从5'到3'方向计数的工程化向导RNA链的核苷酸75(加或减2个核苷酸)处。相同的命名法用于表7中的其余工程化向导RNA。
选择工程化向导150.125、150.75和100.80以进入下文详述的实验。
实例4
用工程化向导RNA校正ABCA4中的突变
此实例描述了本公开的设计用于靶向ABCA4 RNA中的突变以进行校正的工程化向导RNA。斯特格氏病可能是由ABCA4基因中的功能丧失基因突变引起的。斯特格氏病患者中存在的最常见突变详见下表8，其中以粗体文本列出了适合通过ADAR校正的突变。斯特格氏病中最常见的错义突变包含G>A突变(例如，c.5882G>A突变)，所述突变可以通过ADAR校正。然而，ADAR可能通常不愿意对具有上游5'G的腺苷进行脱氨基化，就像靶向c.5882G>A突变的情况一样。
进行本文所描述的实验以评估工程化向导RNA的能力，如本文所公开的，所述工程化向导RNA在与靶ABCA4序列杂交时，在所得双链RNA底物中形成结构特征，以校正ABCA4微型化基因(微小基因)中表达的c.5882G>A突变。在不受任何理论束缚的情况下，与在与靶ABCA4 RNA杂交时不形成所述结构特征的工程化向导RNA促进的腺苷的ADAR脱氨基化相比，结构特征产生的空间位阻可能改善了具有5'G的腺苷的ADAR脱氨基化。
表8–斯特格氏病相关突变
产生了表达微小基因的野生型HEK293细胞，所述微小基因在框架中含有ABCA4的外显子40-48以及下游P2A-mCherry。如图16所展示的，微小基因的外显子42表达c.5882G>A突变。另外的突变——c.6089和c.6320——也包含在微小基因以及TAG阳性对照中。细胞中ADAR1、ADAR2和GAPDH的蛋白质印迹示出于图17中。在图17中，泳道1来自WT HEK293，泳道2来自仅表达ADAR2的工程化HEK293细胞系，并且泳道3来自ABCA4微小基因细胞系。ABCA4微小基因通过piggybac载体转染到WT HEK293细胞系(ADAR1表达)中，并且微小基因也表达ADAR2。因此，如泳道3所证明的，细胞表达ADAR1和ADAR2。
具有不同长度和不同A/C错配定位的工程化向导RNA——150.125、150.75.和100.80——是重组产生的。这些向导RNA中的每一个被进一步工程化，以在与靶ABCA4RNA杂交时形成结构特征。在工程化向导RNA和靶ABCA4 RNA杂交时形成的所得双链底物产生了工程化向导-靶RNA支架，其——在不同程度上模拟果蝇底物——示出于图3和4。测试的gRNA全都为线性gRNA。
下表9中提供了测试的gRNA的汇总。表9中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。在表9中，ABCA4的RNA编辑％是在工程化向导RNA转染后48小时在表达ADAR1和ADAR2的HEK293细胞中测定的。
表9–针对ABCA4的工程化gRNA
用含有工程化向导RNA的质粒转染HEK293细胞。以生物学一式三份转染150.125和150.75工程化向导RNA。以生物学一式两份转染100.80工程化向导RNA。转染48小时内分离并收集靶RNA，转化为cDNA，然后经由桑格测序进行测序。
图21包含用150.125向导转染后靶RNA的桑格测序读段的实例，包含SEQ ID NO:21(左)和SEQ ID NO:18(右)。可以进一步收集NGS数据以通知脱靶编辑。
图18示出了作为阳性对照的ABCA4中TAG中腺苷的编辑百分比，如通过桑格测序所确定的。如图18所展示的，向导RNA能够编辑ABCA4中的腺苷，因此编辑c.5882突变的挑战尤其是局部序列上下文——即，靶腺苷紧邻上游的5'G。每个工程化向导RNA示出在图19的x轴上。工程化向导中的若干个的结构特征的描述提供在图9-图11中。所述结构特征还描述于图6A、图7和图8中。图19示出了由通过测试的工程化向导RNA实现的ABCA4微小基因中c.5882突变的编辑百分比。图20示出了由三种工程化向导RNA实现的RNA编辑％的比较，比较了工程化向导RNA的各版本，其中在与靶ABCA4 RNA杂交时，双链RNA底物除了靶标A处的A/C错配之外没有结构特征可以被编辑为工程化向导RNA的各版本，其中与靶ABCA4 RNA杂交时，双链RNA底物除了A/C错配之外还具有各种结构特征(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:21)。如图20所示的，当与没有结构特征(除了待编辑的靶腺苷处的A/C错配之外)的工程化向导RNA相比时，与ABCA4 RNA杂交时工程化成形成结构特征(例如，不对称凸起、待编辑的靶腺苷的5'G处的G/G错配、摆动碱基对等)的向导RNA促进了更高水平的ADAR介导的RNA编辑。
启动子、RNA元件和剂量依赖性
一组初始实验证明了在并入SmOPT序列(AATTTTTGGAG；SEQ ID NO:390)和U7发夹序列(CAGGTTTTCTGACTTCGGTCGGAAAACCCCT；SEQ ID NO:389)的工程化向导RNA中观察到的ABCA4的RNA编辑的改进，如下表10的SEQ ID NO:339-341所描绘的。用携带具有5882G->A突变和ADAR2的ABCA4微小基因的piggyBac载体来转染天然表达ADAR1的HEK293细胞。测试的工程化向导RNA包含两个U6驱动的工程化向导RNA(“U6完全模拟0.100.50”和“U6完全模拟0.100.80”)和U1驱动的工程化向导RNA，其含有SmOPT序列和U7发夹序列(“U1完全模拟0.100.80”)。阴性对照包含针对不同基因(Rab7A)的环状向导RNA、单独的GFP质粒和无转染。如图44A和图44B所示出的，包含SmOPT序列和U7发夹增加了RNA编辑。
下表10中描述了每种工程化向导RNA的汇总。表10中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。
表10–抗ABCA4工程化向导RNA
随后的实验评价了靶向ABCA4 5882G->A突变的工程化向导RNA的剂量依赖性，其中编码工程化向导RNA的多核苷酸还编码了SmOPT序列和U7发夹序列。图45A示出了ADAR1和ADAR2在细胞中对编码靶向ABCA4、SmOPT序列和U7发夹序列中的突变的工程化向导RNA的多剂量构建体的RNA编辑百分比，其中表达由U1启动子驱动。如上文所描述的，HEK293细胞自然地表达ADAR1。对于图45A，用携带具有5882G->A突变和ADAR2的ABCA4微小基因的piggyBac载体来转染HEK293细胞。图45B示出了ADAR1在细胞中对编码靶向ABCA4、SmOPT序列和U7发夹中的突变的向导RNA的多剂量构建体的RNA编辑百分比，其中表达由U1启动子驱动。用仅携带具有5882G->A突变的ABCA4微小基因的piggyBac载体来转染HEK293细胞。在图45A和图45B两者中，编码向导RNA、SmOPT序列和U7发夹的质粒以250ng、500ng、750ng或1000ng给药。GFP质粒和无转染被用作阴性对照。结果显示ABCA4 5882G->A突变的RNA编辑百分比的剂量依赖性。
用内环进一步修饰
图48-图51示出了用在脱靶编辑活动区域附近放置的另外的对称4/4内环进一步工程化以减少脱靶编辑的工程化向导RNA的结构。下表11中描述了每种工程化向导RNA的汇总。带下划线的序列是SmOPT序列，并且紧跟在带下划线的序列之后的序列是U7发夹。斜体序列是工程化向导RNA序列。
表11–针对ABCA4的向导RNA序列
实例5
体外转录的(IVT)LRRK2-靶向工程化向导RNA
此实例描述了体外转录的(IVT)LRRK2-靶向工程化向导RNA。gBlocksTM基因片段购自IDT公司(IDT)，并且用于生成IVT工程化向导RNA(表12)。表12中序列的格式表示每个DNA构建体的各种元件，包含非转录的T7启动子元件(小写)、引物结合序列(带下划线)；GluR2募集结构域(斜体)。^表示核苷酸错配；*表示将形成凸起的核苷酸；#表示将形成内环的核苷酸；下划线表示将形成发夹的一部分的核苷酸。表12中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。
表12–针对体外转录的LRKK2工程化向导RNA的构建体
使用表13中描述的试剂、数量和浓度进行IVT。按照Q5 PCR方案(60C退火)，随后通过凝胶电泳进行确认，为所有工程化向导RNA制作IVT模板(图22)。
表13–示例性IVT方案
试剂 数量 浓度
无核酸酶水 5μl
10X反应缓冲液 2μl
ATP(100mM) 2μl 最终10mM
GTP(100mM) 2μl 最终10mM
UTP(100mM) 2μl 最终10mM
CTP(100mM) 2μl 最终10mM
模板DNA 3μl 1μg
T7 RNA聚合酶混合物 2μl
总反应体积 20μl
简言之，表13中所示出的IVT方案用于产生IVT向导RNA。将试剂混合并在37℃下温育过夜(过夜IVT通常会产生很大的产率)。对于DNA酶处理，将70μl无核酸酶水、10μl的10XDNA酶I缓冲液和2μl的DNA酶I(无RNA酶)混合并在37℃下温育持续30分钟。将纯化的IVT产生的多核苷酸RNA调整至1μg/ul(约25nmol)。
表14–IVT引物
SEQ ID NO 引物 序列
SEQ ID NO:43 LRRK2_RP_GEN TTTTCACACTGTATCCCAATG
SEQ ID NO:44 LRRK2_RP_EIE TTAGTCACAGGTGTATCCC
SEQ ID NO:43 LRRK2_RP_INTG2 TTTTCACACTGTATCCCAATG
工程化向导RNA在表15中示出。这些工程化向导RNA可以恢复LRRK2 mRNA序列的位置6190处的单个碱基对突变。表15中序列的格式表示每个构建体的各种元件：募集序列(GluR2)为斜体。^表示核苷酸错配；*表示将形成凸起的核苷酸；#表示将形成内环的核苷酸；下划线表示将形成发夹的一部分的核苷酸。表15中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。
表15–抗LRRK2工程化向导RNA和靶mRNA序列
实例6
将IVT向导RNA导入到含有G2019S LRRK2突变的细胞中获得编码来自供体的LRRK2(杂合子)中G2019S突变的一个突变等位基因的EBV转化的B细胞(LRRK2 G2019S患者来源的淋巴母细胞系；LCL)，并且在这些实验中用于评估ADAR介导的从A到G的RNA编辑以及恢复为野生型LRRK2等位基因。
7种IVT生成的工程化向导RNA(来自实例5)针对LRRK2进行测试，并且1种IVT工程化向导RNA针对RAB7A(作为对照)进行测试。所有工程化向导RNA均使用龙沙公司(Lonza)X核转染用程序EH100在LCL细胞中进行核转染。反应条件包含大约40nmol或60nmol的每种IVT工程化向导RNA和每个反应约2×10^5个LCL细胞。将反应分成2个孔，每个孔含有1×10^5个细胞，并且在3小时或7小时中的任一者处收集细胞用于RNA分离。收集时，将细胞以1,500x g旋转持续1分钟，然后去除培养基，并且向每个孔中添加180μl的RLT裂解缓冲液+β-巯基乙醇(BMe)。使用Qiagen(凯杰公司)RNeasy方案和试剂盒分离RNA，随后使用新英格兰生物实验室(New England Biolabs)(NEB)ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒。
位于靶标区域之外的LRRK2 mRNA特异性引物用于扩增靶向IVT工程化向导RNA的区域(表16)。引物与工程化向导RNA中的任何一种没有序列重叠。LRRK2引物1和2用于扩增mRNA，并且引物4用于靶标区域的测序。分析桑格迹线以评估每种IVT向导的编辑效率。
表16–LRRK2 mRNA特异性引物
SEQ ID NO 引物名称 序列
SEQ ID NO:55 LRRK2_1 CGTAGCTGATGGTTTGAGATACCT
SEQ ID NO:56 LRRK2_2 ACCAAATGAATAAACATCAGCCTGTTG
SEQ ID NO:57 LRRK2_4 TTTCCTCTGGCAACTTCAGGTG
实例7
用于校正G2019S突变和治疗帕金森氏病的LRRK2靶向向导RNA
此实例描述了使用本公开的向导RNA治疗具有LRRK2中的G2019S突变的患者的帕金森氏病。向诊断具有G2019S突变的帕金森氏病患者施用本文所描述的向导RNA中的任何一种(例如，表15中列出的那些)。向导RNA例如通过PCR和IVT(如实例6和实例7中所描述的)制备或在AAV中包裹的DNA构建体中遗传编码。通过本文所公开的任何施用途径如静脉内注射、脑室内、脑实质内、脑池内或鞘内注射，向受试者施用向导RNA。所述受试者是人或非人动物。
对于遗传编码的向导RNA，向导RNA(例如，如表12中列出的那些)的编码序列克隆到病毒载体，如腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或逆转录病毒载体中，其中其T7启动子序列被U7、U1、U6、H1或7SK启动子序列替代。可替代地，向导RNA(例如，如表12中列出的那些)的编码序列通过PCR或gBlocksTM基因片段制备，其中其T7启动子序列被U7、U1、U6、H1或7SK启动子序列替代，并且编码序列调配成药物调配物、纳米颗粒或树状物(例如，经由封装或直接附接)。
RNA编辑的监测如下：一周后收集约1×10^5个细胞进行RNA分离。收集时，将细胞以1,500x g旋转持续1分钟。去除培养基。向每个孔中添加180ul的RLT缓冲液+BMe。从细胞中分离出RNA，并且合成cDNA并测序(例如，经由桑格测序或NGS)。对中靶编辑百分比、脱靶编辑百分比或两者的组合进行定量。特别地，计算了每个向导RNA促进ADAR介导的A到GLRRK2的RNA编辑以校正G2019S突变的能力(例如，通过在第6055个核苷酸处用G(编辑)和A(未编辑)对LRRK2 mRNA的微量信号差异进行定量)。
实例8
使用工程化向导RNA的LRRK2和SNCA的多重靶向
由于LRRK2(G2019S)或SNCA的多态性可能与特发性帕金森氏病的风险增加相关，同时操纵两种基因的表达可能是有用的治疗。如本公开所展示的，RNA编辑是模块化的；RNA编辑酶和RNA靶向工程化向导是两个不同的实体。因此，工程化向导RNA可以被多重化以实现对多于一种不同靶标的同时校正。例如，为了治疗具有LRRK2(G2019S)和SNCA贡献多态性的特发性帕金森氏病患者，设计了两种工程化向导RNA。第一工程化向导RNA选自本文所公开的LRRK2靶向工程化向导RNA中的任何一种(例如，表15中公开的那些)并且靶向LRRK2G2019S突变以在第6055个核苷酸处进行ADAR介导的A到G的编辑(例如，参见实例7)。第二工程化向导RNA选自本文所公开的SNCA靶向工程化向导RNA中的任何一种并且靶向SNCA的ATG起始密码子以进行ADAR介导的A到G的编辑。编辑起始位点时，α-突触核蛋白的表达减少。这些工程化向导RNA中的每个的表达都可以在上游U7、U1、U6、H1、7SK启动子下独立或一起驱动，并且克隆到单个病毒载体或两个单独的病毒载体中，如腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或逆转录病毒载体。通过本文所公开的任何施用途径如静脉内注射、脑室内、脑实质内、脑池内或鞘内注射，向受试者施用向导RNA。所述受试者是人或非人动物。
特别地，计算了每个向导RNA促进ADAR介导的A到G LRRK2的RNA编辑以校正N2081D突变的能力(例如，通过在第6055个核苷酸处用G(编辑)和A(未编辑)对LRRK2 mRNA的微量信号差异进行定量)。
SNCA的表达水平监测如下：使用蛋白质印迹、ELISA或中尺度发现(MSD)分析评估α-突触核蛋白的敲低。
实例9
具有高特异性和效率的LRRK2设计
针对LRRK2*G2019S突变对2,540个gRNA序列进行高通量筛选(HTS)确定了具有卓越中靶活性和特异性的设计。数据和结果示出于图29A至图29C中。排名最前的设计在疾病模型细胞系中针对LRRK2 G2019S mRNA进行了测试.
此实例描述了本公开的靶向LRRK2 mRNA的工程化向导RNA。被靶向的LRRK2mRNA的区域是LRRK2 mRNA的位置6055处的A，其编码致病性G2019S突变蛋白。
将包括表25的工程化多核苷酸序列(和对照工程化多核苷酸序列)以及向导RNA靶向的区域的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑向导RNA靶向的区域的条件下接触。随后使用下一代测序(NGS)评估向导RNA靶向的区域以进行编辑。
图104-图110示出了用于靶向LRRK2的对照向导RNA设计，如通过测序确定的每种工程化多核苷酸随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。LRRK1_向导02_TTHY2_128_gID_03565__v0093是与靶RNA形成完美双链体的向导RNA并且具有5'–TACAGCAGTACTGAGCAATGCTGTAGTCAGCAATCTTTGCAATGA–3'的序列(SEQ ID NO:109)。LRRK1_向导03_Glu2bRG_128_gID_03961__v0090是与靶RNA形成一个A/C错配的向导RNA并且具有5'–
TACAGCAGTACTGAGCAATGCCGTAGTCAGCAATCTTTGCAATGA–3'的序列(SEQ ID NO:110)。
图110-图211是自退火RNA结构的结构，其包括表17的工程化向导RNA和靶LRRK2RNA。在图110-图211中，左侧的图示出了ADAR1介导的RNA编辑动力学，并且右侧的图示出了ADAR2介导的RNA编辑动力学。因此，这些图示出了在本公开的工程化向导RNA与靶LRRK2RNA杂交时形成的结构特征。靶标A朝向向导-靶RNA支架的中心定位。这些图还示出了在100分钟处的ADAR1和ADAR2中靶和脱靶编辑、在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的ADAR1和ADAR2动力学、ADAR2中靶和脱靶编辑的时间进程。这些图示出了如通过测序确定的每种工程化多核苷酸随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。
对应于图110-图211的示例性向导RNA序列示出于表17中。图263-图265示出了向导-靶RNA支架的图表，突出显示了针对表17的工程化向导RNA提供的各种结构特征。中靶编辑百分比由以下式计算：靶标处含有“G”的读段数/读段总数。特异性由下式计算：(中靶编辑百分比+100)/(选定脱靶位点处的脱靶编辑百分比总和+100)。
表17–用于顺式编辑实验的示例性工程化向导RNA靶向LRRK2 mRNA，45聚体
实例10
ABCA4-靶向工程化向导RNA
此实例描述了本公开的工程化向导RNA，其靶向ABCA4 G1961E突变，ABCA4错义突变，涉及斯特格氏病。G1961E突变包含待编辑的A上游的5'G。这种编辑上下文特别难以靶向，因为它可能难以进行内源性ADAR编辑。
高通量筛选
生成了2,500个向导设计的高通量筛选(HTS)，并且筛选了靶向ABCA4 G1961E突变的筛选，如图30A-图30C所示出的。在图30A-图30C中，实验包含将工程化向导RNA与ADAR1温育100分钟，随后进行编辑效率的NGS读出。图30A示出了中靶A的百分比编辑(由箭头指示)和待编辑的靶标A的任何脱靶编辑5'和3'。使用与靶ABCA4RNA形成完美双链体的工程化向导RNA(顶部图)和与待编辑的靶标A处的靶ABCA4RNA形成单个A/C错配的工程化向导RNA(底部图)，中靶编辑可忽略不计。图30B示出了中靶A(x轴上的位置0)的ADAR1介导的RNA编辑和待编辑的靶标A的脱靶编辑5'和3'的热图。y轴表示针对ABCA4的独特工程化向导RNA。图30C示出了中靶A的百分比编辑(由箭头指示)和针对对于ABCA4的排名最前的工程化向导RNA(SEQ ID NO:291)待编辑的靶标A的任何脱靶编辑5'和3'，在与靶ABCA4 RNA杂交时，形成结构特征，包含在-1位置(相对于靶腺苷)处的1/1G/G错配、在3位置(相对于靶腺苷)处1/1U/U错配和在19位置(相对于靶腺苷)处的1/1G/G错配。如图30C所展示的，在与靶ABCA4 RNA杂交时，具有X、Y、Z结构特征的工程化向导RNA表现出高中靶A编辑和可忽略不计的脱靶编辑。
将包括表18的工程化多核苷酸序列以及向导RNA靶向的区域的序列的自退火RNA结构与ADAR1和/或ADAR2在允许编辑向导RNA靶向的区域的条件下接触(“顺式编辑”)。随后使用下一代测序(NGS)评估向导RNA靶向的区域以进行编辑。
图218-图221示出了包括表18的工程化多核苷酸序列以及向导RNA靶向的ABCA4区域的序列的自退火RNA结构，突出了表18中汇总的结构特征。靶标A朝向向导-靶RNA支架的中心定位。图224-图255示出了在100分钟时间点处的ADAR1和ADAR2中靶和脱靶编辑、在1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的ADAR1和ADAR2动力学以及ADAR2中靶和脱靶编辑的时间进程。对照包含靶序列与向导RNA之间的完美双链双链RNA底物(图222)和在与靶序列杂交时形成单个A/C错配的工程化向导RNA(图223)。中靶编辑百分比由以下式计算：靶标处含有“G”的读段数/读段总数。特异性由下式计算：(中靶编辑百分比+100)/(选定脱靶位点处的脱靶编辑百分比总和+100)。
表18–用于顺式编辑实验的ABCA4工程化向导RNA，45聚体
从上文所描述的高通量筛选中发现的选定工程化向导RNA进一步适于(例如，在杂交时形成结构特征的向导RNA的主要区段被修剪和/或延长为约100聚体向导RNA)用于反式编辑ABCA4。在细胞中测试的延长的100聚体向导RNA被工程化使得向导靶RNA支架中的结构特征将不对称地定位(朝向靶的5'端和向导RNA的3'端)。在这些细胞实验中，靶腺苷被定位成跨向导RNA的第80个核苷酸周围。
用携带ABCA4微小基因和ADAR2的piggyBac载体转染天然表达ADAR1的HEK293细胞。将工程化向导RNA施用于细胞，并且在转染后48小时对RNA编辑进行定量。如图46A所示出的，A/C(靶/向导)错配被设计成发生在从工程化向导RNA的5'端的位置80处的向导促进了ABCA4 5882G->A突变的更高百分比的RNA编辑。
图47A和图47B示出了热图，所述热图展示了由编码U1启动子驱动的具有SmOPT序列和U7发夹序列的向导RNA的工程化多核苷酸促进的ABCA4 G5882A错义突变的RNA编辑百分比，其中RNA编辑由ADAR1和ADAR2促进。对于这些图47A和图47B，用携带ABCA4微小基因和ADAR2的piggyBac载体转染天然表达ADAR1的HEK293细胞。将工程化向导RNA施用于细胞，并且在转染后48小时对RNA编辑进行定量。热图示出了待编辑的靶标A和紧邻待编辑的靶标A的3'的脱靶A。工程化向导RNA与靶ABCA4 RNA杂交时形成的结构特征示出在图47A和图47B的热图的左侧处。下表19中描述了每种工程化向导RNA的汇总。
下表19提供了编码靶向ABCA4的工程化向导RNA的多核苷酸序列。表19中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。斜体序列是100聚体工程化向导RNA的序列。
表19–用于反式编辑实验的针对ABCA4的向导RNA序列
实例11
通过LRRK2-靶向工程化向导RNA在细胞中进行RNA编辑
此实例描述了在细胞中由本公开的工程化向导RNA促进的ADAR介导的LRRK2的RNA编辑。从实例9所描述的高通量筛选中发现的选定工程化向导RNA进一步适于(例如，在杂交时形成结构特征的向导RNA的主要区段被修剪和/或延长为约100聚体向导RNA)用于细胞中的反式编辑LRRK2。测试了靶向LRRK2 G2019S突变的两种向导RNA设计，均具有SmOPT序列和U7发夹(SEQ ID NO:344和SEQ ID NO:345)。第一工程化向导RNA(“V0118 0.100.50”)含有100个核苷酸，其中LRRK2中的靶标A跨工程化向导RNA中位置50处的核苷酸编辑。第二工程化向导RNA(“V0118 0.100.80”)含有100个核苷酸，其中LRRK2中的靶标A跨向导中位置80处的核苷酸编辑。在细胞中测试的延长的100聚体向导RNA被工程化使得向导靶RNA支架中的结构特征将对称地定位(朝向向导-靶RNA支架的中间；v0118 0.100.50)或不对称地定位(朝向靶的5'端和向导RNA的3'端；v0118 0.100.80)。除了靶腺苷处的A/C错配外，两种工程化向导RNA进一步形成了6/6对称内环和2个其它错配(A/G错配和C/U错配)。下表20中描述了每种工程化向导RNA的汇总。表20中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。
表20–抗LRRK2工程化向导RNA
在用携带LRRK2微小基因的piggyBac载体转染的WT HEK293细胞中，测试了工程化向导RNA促进G2019S LRRK2突变的ADAR介导的RNA编辑的能力。WT HEK293细胞自然地表达ADAR1。在其中测试经由ADAR1和ADAR2介导的RNA编辑的实验中，ADAR2经由携带LRRK2微小基因的相同piggyBac载体在细胞中过表达。piggyBac构建体的示意图在图42中示出。实验仅在ADAR1(图43A)或ADAR1和ADAR2(图43B)存在的情况下进行。GFP质粒用作对照。图43A和图43B示出了含有SmOPT序列和U7发夹序列的工程化向导RNA仅在ADAR1存在的情况下促进了8％的中靶编辑效率，并且在ADAR1和ADAR2存在的情况下促进了28％的中靶编辑效率。图43A和图43B示出了含有SmOPT序列和U7发夹序列的向导RNA仅在ADAR1存在的情况下促进了19％的中靶编辑效率，并且在ADAR1和ADAR2存在的情况下促进了58％的中靶编辑效率。另外的实验证明，第一工程化向导RNA(“V0118 0.100.50”)的吉布斯自由能(Gibbs freeenergy)(δG)为-161.98kcal/mol，并且第二工程化向导RNA(“V01180.100.80”)的δG为-169.44kcal/mol。两个工程化向导RNA的结构在图43A-图43B的图的下方示出。如在结构图中所看到的，第二工程化向导RNA(“V0118 0.100.50”)与靶RNA形成了双链体RNA的更长的连续延伸。这些数字表明，与A/C错配的居中(例如，0.100.50设计)相反，A/C错配(例如，0.100.80设计)的不对称定位在gRNA设计中通常更优选。
实例12
针对SNCA的工程化向导RNA
此实例描述了本公开的构建体，所述构建体编码被设计成靶向SNCA基因中的起始位点或翻译初始位点(TIS)(也称为翻译起始位点(TSS))的工程化向导RNA。工程化向导构建体被设计成靶向外显子2的核苷酸位置26处的SNCA TIS腺苷(对应于大多数SNCA变体的核苷酸位置264，包含外显子1和外显子2)。
用编码所关注的向导RNA的质粒转染HEK293细胞，并且在转染后48小时评估RNA编辑。仅评估了ADAR1(其由HEK293细胞天然表达)以及ADAR1和ADAR2的RNA编辑。在后一个实验中，HEK293细胞与编码ADAR2的piggybac载体共转染。RNA编辑的水平通过桑格测序进行量化，并使用测序分析脚本(EditADAR)进行分析。
图52-图94示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。在每一列中均示出了生物复制品。在几个向导RNA构建体中观察到SNCA的高水平的RNA编辑。示出于图69、图74和图85的向导构建体(对应于SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:92)分别表现出高水平的RNA编辑和高比率的中靶编辑与脱靶编辑。示出于图67-图75的向导是包括寡聚体系链的本公开的向导，所述寡聚体系链是与靶向序列相邻的向导的区段，所述靶向序列与靶链具有非连续互补性。
示出于图52-图94的向导序列在下表21中描述。下表21还描述了在给定向导与靶RNA杂交时形成的特征，以及非潜在hU7发夹、观察到的中靶RNA编辑百分比、中靶编辑占作为中靶RNA编辑的总RNA编辑的百分比和中靶编辑占编码区起始位点和起始位点下游的靶标处RNA编辑的百分比。
表21–针对SNCA的工程化向导RNA序列
实例13
针对SERPINA1的向导RNA
此实例描述了本公开的构建体，所述构建体编码被设计成靶向SERPINA1错义突变(SERPINA1，位置9989处的G至A突变，产生SERPINA1 E342K突变)的向导RNA，涉及α-1抗胰蛋白酶缺乏症。
简言之，SERPINA1微小基因经由piggyBac载体转染到表达内源性ADAR1的K562细胞中，并且经由嘌呤霉素选择来选择细胞。整合到K562细胞中的SERPINA1微小基因包含具有全长3'UTR的SERPINA1微小基因1或具有截短的3'UTR的SERPINA1微小基因2。两个微小基因都携带感兴趣的G至A 9989突变。K562细胞(2×10^5个细胞)用编码可操作地连接到U7发夹和SmOPT序列的向导RNA的质粒进行电穿孔。表达由小鼠U7启动子驱动。电穿孔后24小时，分离RNA，经由RT-PCR合成cDNA，并且经由桑格测序对RT-PCR产物进行测序，以量化RNA编辑百分比。对照向导RNA缺少U7发夹和SmOPT序列，并且表达在U6启动子下驱动。向导RNA序列汇总在下表中。图97和图98示出了使用向导RNA序列编辑SERPINA1。使用的向导RNA序列包含表22中的SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103。
表22–向导RNA序列
实例14
用环状工程化向导RNA进行SNCA编辑
此实例描述了本公开的构建体，在U6启动子的控制下，所述构建体编码具有表现结构特征的潜在结构的环状工程化向导RNA，其中工程化向导RNA被设计成靶向SNCA基因中的起始位点或翻译初始位点(TIS)(也称为翻译起始位点(TSS))。工程化向导RNA构建体被设计成靶向外显子2的核苷酸位置26处的SNCA TIS腺苷(对应于大多数SNCA变体的核苷酸位置264，包含外显子1和外显子2)。
用编码所关注的向导RNA的质粒转染HEK293细胞，并且在转染后评估RNA编辑。仅评估了ADAR1(其由HEK293细胞天然表达)以及ADAR1和ADAR2的RNA编辑。在后一个实验中，HEK293细胞与编码ADAR2的piggybac载体共转染。通过测序对RNA编辑水平进行定量和分析。
图99-图103示出了待编辑的靶标A处(x轴上的“0”)的RNA编辑和脱靶位置处(在非“0”的位置处表示为黑条)的RNA编辑的图。在每一列中均示出了生物复制品。
示出于图99-图103的向导序列在下表23中描述。下表23还描述了在给定向导与靶RNA杂交时形成的特征、观察到的中靶RNA编辑百分比、中靶编辑占作为中靶RNA编辑的总RNA编辑的百分比和中靶编辑占编码区起始位点和起始位点下游的靶标处RNA编辑的百分比。
表23–向导RNA序列
实例15
包括靶向LRRK2 mRNA的向导RNA
此实例描述了用本公开的向导RNA进行LRRK2编辑。将包括表25的向导RNA序列以及工程化向导RNA靶向的区域的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑向导RNA靶向的区域的条件下接触。随后使用下一代测序(NGS)评估向导RNA靶向的区域以进行编辑。
图212示出了靶向LRRK2 mRNA的示例性工程化向导RNA序列的热图和结构。热图提供了在10分钟时间点处的编辑曲线的可视化。左图中是用于中靶编辑的5个工程化向导RNA(不具有-2过滤器),并且右图描绘了具有最小-2编辑的用于中靶编辑的5个工程化向导RNA。对应的预测二级和三级结构位于热图下面。
对应于图212的示例性完全向导序列示出于表24中。
表24：靶向LRRK2 mRNA的示例性工程化多核苷酸序列
下表25描绘了针对每种向导的所得编辑。每个中靶编辑百分比由以下式计算：靶标处含有“G”的读段数/读段总数。特异性由下式计算：(中靶编辑百分比+100)/(选定脱靶位点处的脱靶编辑百分比总和+100)。
表25用于顺式编辑实验的靶向LRRK2 mRNA，45聚体的工程化多核苷酸序列
实例16
具有哑铃设计并靶向LRRK2 mRNA的工程化向导RNA
此实例描述了包括哑铃设计并靶向LRRK2 mRNA的工程化向导RNA。工程化向导RNA中的哑铃设计包括两个对称内环，其中待编辑的靶标A位于两个对称环之间以用于靶标A的选择性编辑。两个对称内环各自由dsRNA底物的向导RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。在此实例中，靶标A是LRRK2 mRNA的位置6055处的A，其编码致病性G2019S突变蛋白。具有哑铃设计并靶向LRRK2mRNA的示例性工程化向导RNA示出于表26和图213中。
表26–示例性哑铃工程化向导RNA序列
图214-图217示出了示例性哑铃型向导RNA序列的编码G2019S突变的密码子的核苷酸的中靶和脱靶ADAR1编辑和ADAR1+ADAR2编辑的图(参见表26)。对于图214-图217，750ng质粒在20,000个细胞中转染。用携带LRRK2微小基因的piggyBac载体转染或用携带LRRK2微小基因和ADAR2的piggyBac载体转染天然表达ADAR1的HEK293细胞。将工程化向导RNA施用于细胞，并且在转染后48小时对RNA编辑进行定量。
实例17
靶向LRRK2 mRNA的工程化向导RNA
此实例描述了靶向LRRK2 mRNA的向导RNA。将包括表27的向导RNA序列以及向导RNA靶向的区域的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑向导RNA靶向的区域的条件下接触，持续30分钟。随后使用下一代测序(NGS)评估向导RNA靶向的区域以进行编辑。表27的向导RNA示出了编码LRRK2 G2019S的mRNA的位置6055处的A核苷酸的特异性编辑。中靶编辑百分比由以下式计算：靶标处含有“G”的读段数/读段总数。特异性由下式计算：(中靶编辑百分比+100)/(选定脱靶位点处的脱靶编辑百分比总和+100)。
表27–靶向LRRK2 mRNA的示例性向导RNA
实例18
靶向SNCA mRNA的工程化向导RNA
此实例描述了靶向SNCA mRNA的工程化向导RNA。将包括表28的工程化向导RNA序列以及向导RNA靶向的区域的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑向导RNA靶向的区域的条件下接触。随后使用下一代测序(NGS)评估向导RNA靶向的区域以进行编辑。表28的向导RNA示出了SNCA mRNA的翻译初始位点处(TIS；ATG中的A以基因组坐标开始编码：hg38 chr4：89835667链-1)的A核苷酸的特异性编辑。中靶编辑百分比由以下式计算：靶标处含有“G”的读段数/读段总数。特异性由下式计算：(中靶编辑百分比+100)/(选定脱靶位点处的脱靶编辑百分比总和+100)。
表28–靶向SNCA mRNA的示例性向导RNA
实例19
体外编辑iPSC源性LRRK2-G2019S多巴胺能神经元中的LRRK2 mRNA
此实例描述了可以表达LRRK2-G2019S突变蛋白的诱导多能干细胞(iPSC)源性神经元的体外编辑。对iPSC神经元的培养、诱导、成熟、转染或转导进行了优化，以筛选通过向导RNA促进的编辑。通过TaqMan qPCR、流式细胞术和免疫荧光对每种多巴胺能神经元表型进行表征和验证。然后用靶向编码LRRK2-G2019S突变的密码子的核苷酸的向导RNA转染或转导iPSC、神经干细胞(NSC)、神经祖细胞(NPC)或源性神经元细胞，并使用编码LRRK2-G2019S基因座的序列的桑格测序、ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。使用LRRK2蛋白的LC-MS/MS以及LRRK2底物(例如磷酸-Rab(-8，-10，-35)，LRRK2自身磷酸化)的蛋白质印迹和中尺度发现(MSD)分析评估翻译成LRRK2蛋白的LRRK2 mRNA的体外生化编辑。
实例20
hLRRK2-G2019S小鼠的原代皮层神经元中的LRRK2 mRNA的离体编辑
此实例描述了在分离自hLRRK2-G2019S小鼠的原代皮层神经元中对编码LRRK2-G2019S突变的密码子的核苷酸的离体编辑。在转染或转导向导RNA之前，对来自hLRRK2-G2019S小鼠的原代神经元的原代显微解剖和培养进行了优化。然后用靶向编码LRRK2-G2019S突变的mRNA的向导RNA转染分离的皮层神经元，并使用编码基因座的LRRK2-G2019S的桑格测序、ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。进一步地，使用LRRK2蛋白的LC-MS/MS以及LRRK2底物(例如磷酸-Rab(-8，-10，-35)，LRRK2自身磷酸化)的蛋白质印迹和MSD分析评估翻译成LRRK2蛋白的LRRK2 mRNA的离体生化编辑。
实例21
hLRRK2-G2019S小鼠中LRRK2 mRNA的体内编辑
此实例描述了在hLRRK2-G2019S小鼠中对编码LRRK2-G2019S的mRNA的体内编辑。将靶向编码LRRK2-G2019S突变的mRNA的向导RNA通过侧脑室、脑实质内、脑池内或鞘内注射向hLRRK2-G2019S小鼠的大脑施用。然后从hLRRK2-G2019S小鼠中分离脑组织，并进行处理以分离LRRK2核酸和蛋白。使用编码LRRK2-G2019S的基因座的ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。进一步地，使用LRRK2蛋白的LC-MS/MS以及LRRK2底物(例如磷酸-Rab(-8，-10，-35)，LRRK2自身磷酸化)的蛋白质印迹和MSD分析评估翻译成LRRK2蛋白的LRRK2mRNA的体内生化编辑。
实例22
LUHMES和iPSC源性多巴胺能神经元中SNCA mRNA的体外编辑
此实例描述了LUHMES和iPSC源性多巴胺能神经元中的体外SNCA编辑。对LUHMES和iPSC源性神经元的培养、诱导、分化、转染和转导进行了优化，以筛选通过向导RNA促进的编辑。通过TaqMan qPCR、流式细胞术和免疫荧光对每种多巴胺能神经元表型进行表征和验证。然后用靶向SNCA的向导RNA转染或转导神经元，并使用SNCA基因座的qPCR、ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。使用蛋白质印迹、ELISA和SNCA蛋白水平的MSD分析评估SNCA蛋白的体外生化敲低。
实例23
hSNCA小鼠的原代皮层神经元中的SNCA mRNA的离体编辑
此实例描述了分离自hSNCA小鼠的原代皮层神经元中的SNCA mRNA编辑和SNCA蛋白的离体敲低。在转染或转导向导RNA之前，对来自SNCA小鼠的原代神经元的原代显微解剖和培养进行了优化。然后用靶向SNCA的向导RNA转染或转导分离的皮层神经元，并使用SNCA基因座的qPCR<ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。进一步地，使用蛋白质印迹、ELISA和SNCA蛋白水平的MSD分析评估SNCA蛋白的离体生化敲低。
实例24
hSNCA小鼠中SNCA mRNA的体内编辑
此实例描述了hSNCA小鼠中的体内SNCA编辑。将靶向SNCA的向导RNA通过侧脑室、脑实质内、脑池内或鞘内注射向hSNCA小鼠的大脑施用。然后从hSNCA小鼠中分离脑组织，并进行处理以分离SNCA核酸和蛋白。使用SNCA基因座的qPCR，ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。进一步地，使用蛋白质印迹、ELISA和SNCA蛋白水平的MSD分析，从分离的SNCA蛋白中评估SNCA蛋白的体内生化敲低。
实例25
靶向SERPINA1 mRNA的工程化向导RNA
此实例描述了靶向SERPINA1 mRNA的工程化向导RNA。针对SERPINA1 E342K突变对gRNA序列进行高通量筛选(HTS)确定了具有卓越中靶活性和特异性的设计。
将包括表29的工程化向导RNA序列以及向导RNA靶向的区域的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑向导RNA靶向的区域的条件下接触，持续30分钟。随后使用下一代测序(NGS)评估向导RNA靶向的区域以进行编辑。表29的向导RNA示出了A核苷酸的特异性编辑。中靶编辑百分比由以下式计算：靶标处含有“G”的读段数/读段总数。特异性由下式计算：(中靶编辑百分比+100)/(选定脱靶位点处的脱靶编辑百分比总和+100)。
表29–靶向SERPINA1 mRNA的示例性向导RNA
实例26
靶向SERPINA1 mRNA的工程化向导RNA
此实例描述了靶向SERPINA1 mRNA的工程化向导RNA。从针对SERPINA1的工程化向导RNA的高通量筛选(类似于实例25中描述的筛选)中鉴定出SERPINA1向导RNA。将包括工程化向导RNA序列以及向导RNA靶向的区域的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑向导RNA靶向的区域的条件下接触，持续30分钟。随后使用下一代测序(NGS)评估向导RNA靶向的区域以进行编辑。
图256示出了与靶SERPINA1 mRNA序列形成单个错配的第一工程化向导RNA(顶部处)和靶向SERPINA1 mRNA的第二示例性工程化向导RNA(底部处)的描述，其中第二工程化向导RNA与靶SERPINA1 mRNA序列形成两个错配。下表30中描述了每种工程化向导RNA的汇总。表30中题为“结构特征”的栏描述了gRNA与靶RNA杂交时形成的双链RNA底物的结构特征。
表30–靶向SERPINA1的示例性工程化向导RNA序列
表30中的工程化向导RNA序列适于细胞体外测试。表30中的工程化向导RNA序列适于100聚体序列，如表31所公开的。K562细胞用Piggybac载体稳定转染，所述载体含有两个含有E342K突变的SERPINA1微小基因构建体之一。工程化向导RNA序列被质粒转染(2μg)到2×10^5个K562细胞中。质粒针对工程化向导RNA序列加上下游小鼠U7发夹(CAGGTTTTCTGACTTCGGTCGGAAAACCCCT；SEQ ID NO:389)和SmOPT序列(AATTTTTGGAG；SEQ IDNO:390)编码并且表达在U6启动子(无U7发夹或SmOPT序列)或U7启动子下驱动。转染后24小时，分离RNA，将其转化为cDNA并且进行桑格测序。图257(左侧处)展示了含有U7启动子、U7发夹和SmOPT序列的构建体表现出最高水平的中靶RNA编辑。图257(右侧处)展示了在与SERPINA1mRNA杂交时形成A/C和A/A错配的第二工程化向导RNA表现出较少的局部脱靶编辑。
表31–靶向SERPINA1的示例性工程化向导RNA序列
表31中的SEQ ID NO:349的工程化向导RNA序列转入到进一步的实验中，其中保留了A/C错配和A/A错配的结构特征，但总体工程化向导RNA长度缩短到95、85、80、75、70、65和60个核苷酸长。表32中描述了此实验中使用的工程化向导RNA序列的序列。细胞实验如上文所描述的进行，但在转染后24小时和48小时评估RNA编辑。如图258(左侧处)所展示的，长度为95个核苷酸的工程化向导序列表现出最高百分比的SERPINA1 mRNA编辑。所有工程化向导RNA序列都在含有U7发夹和SmOPT序列的构建体中进行测试，其中表达经由U1启动子驱动。
表32–靶向SERPINA1的示例性工程化向导RNA序列
长度为95个核苷酸的工程化向导RNA被转入到细胞中的进一步实验中。细胞实验如上文所描述的进行，但在转染后24小时评估RNA编辑。为了检查减少局部脱靶编辑的能力，对向导RNA进行进一步工程化，以在局部脱靶编辑位点处(相对于靶腺苷的-20和-21位置)形成对称、不对称凸起或不对称内环。表33中描述了此实验中使用的工程化向导RNA序列的序列。如图259(左侧处)所示出的，SEQ ID NO:361(ASOTB)和SEQ ID NO:362(95_50_SEH_U1)表现出最高水平的中靶SERPINA1 RNA编辑。如图259(右侧处)所示出的，由靶RNA和工程化向导RNA形成的双链RNA底物中存在对称凸起、不对称凸起或不对称环减少了局部脱靶编辑。因此，SEQ ID NO:361(ASOTB5)的工程化向导RNA显示了最高水平的中靶编辑，同时最小化局部脱靶编辑。RAB7A向导RNA的Rab7A编辑作为阳性对照进行了测试。所有工程化向导RNA序列都在含有U7发夹和SmOPT序列的构建体中进行测试，其中表达经由U1启动子驱动。
表33–靶向SERPINA1的示例性工程化向导RNA序列
形成上文和表33中描述的不对称内环的工程化向导RNA被转入到细胞中的进一步实验中，其中向导长度再次被调节。细胞实验如上文所描述的进行，但在转染后24小时评估RNA编辑。表34中描述了此实验中使用的工程化向导RNA序列的序列。如图260(左侧处)所示出的，中靶编辑随着长度的增加(例如，长度为107、111和119个核苷酸的工程化向导RNA)而增加。所有工程化向导RNA序列都在含有U7发夹和SmOPT序列的构建体中进行测试，其中表达经由U1启动子驱动。
表34–靶向SERPINA1的示例性工程化向导RNA序列
107、111和119个核苷酸长的工程化向导RNA(参见上文和表34)被转入到细胞中的进一步实验中，其中在相对于待编辑的靶腺苷的+35位置处放置另外的凸起。细胞实验如上文所描述的进行，但在转染后24小时评估RNA编辑。表35中描述了此实验中使用的工程化向导RNA序列的序列。如图260(右侧处)所示出的，存在优选的gRNA长度，其驱动向导-靶RNA支架的理想δG/结合亲和力，从而增强编辑。过高的δG对于高效编辑不是理想的。针对SEQ IDNO:374，桑格测序数据示出于图260中。RAB7A向导RNA的Rab7A编辑作为阳性对照进行了测试。所有工程化向导RNA序列都在含有U7发夹和SmOPT序列的构建体中进行测试，其中表达经由U1启动子驱动。
表35–靶向SERPINA1的示例性工程化向导RNA序列
针对E342K的SERPINA1 RNA编辑测试了编码工程化向导RNA和寡聚体系链的多核苷酸。细胞实验如上文所描述的进行，但在转染后24小时评估RNA编辑。表36中描述了此实验中使用的工程化向导RNA序列的序列。图261(右侧处)示出了SERPINA1靶序列和寡聚体系链工程化向导RNA的示意图。如图261(左侧处)所示出的，编码工程化向导RNA和寡聚体系链的多核苷酸引发了SERPINA1 mRNA的RNA编辑。RAB7A向导RNA的Rab7A编辑作为阳性对照进行了测试。所有工程化向导RNA序列都在含有U7发夹和SmOPT序列的构建体中进行测试，其中表达经由U1启动子驱动。
表36–靶向SERPINA1的示例性工程化向导RNA序列
尽管本文中已经示出并描述了本公开的优选实施例，但是此类实施例仅通过举例的方式提供。在不背离本公开的情况下可以发生众多变体、变化以及取代。应当理解，可以采用本文所描述的实施例的各种替代方案。

Claims (134)

1.一种工程化向导RNA，其在与涉及疾病或病状的靶RNA杂交时，形成向导-靶RNA支架，所述向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合，其中所述结构特征基本上在与所述靶RNA杂交时形成。
2.根据权利要求1所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架进一步包括错配。
3.根据权利要求2所述的工程化向导RNA，其中所述错配是腺苷/胞嘧啶(A/C)错配，其中所述腺苷(A)存在于所述靶RNA中，并且所述胞嘧啶(C)存在于所述工程化向导RNA中。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括摆动碱基对。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架是RNA编辑实体的底物，所述RNA编辑实体对所述靶RNA中的核苷酸的碱基进行化学修饰。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述RNA编辑实体将所述靶RNA中的所述腺苷化学修饰成肌苷。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括结构化基序，所述结构化基序包括两个或更多个选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或10个选自由以下组成的组的结构特征：凸起、内环、发夹和其任何组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述结构特征是凸起。
10.根据权利要求9所述的工程化向导RNA，其中所述凸起是不对称凸起。
11.根据权利要求9所述的工程化向导RNA，其中所述凸起是对称凸起。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述凸起包括所述工程化向导RNA的1至4个核苷酸和所述靶RNA的0至4个核苷酸。
13.根据权利要求9至11中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述凸起包括所述工程化向导RNA的0至4个核苷酸和所述靶RNA的1至4个核苷酸。
14.根据权利要求10所述的工程化向导RNA，其中所述不对称凸起是X1/X2不对称凸起，其中X1是所述不对称凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述不对称凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，其中所述X1/X2不对称凸起是0/1不对称凸起、1/0不对称凸起、0/2不对称凸起、2/0不对称凸起、0/3不对称凸起、3/0不对称凸起、0/4不对称凸起、4/0不对称凸起、1/2不对称凸起、2/1不对称凸起、1/3不对称凸起、3/1不对称凸起、1/4不对称凸起、4/1不对称凸起、2/3不对称凸起、3/2不对称凸起、2/4不对称凸起、4/2不对称凸起、3/4不对称凸起或4/3不对称凸起。
15.根据权利要求11所述的工程化向导RNA，其中所述对称凸起是X1/X2对称凸起，其中X1是所述对称凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述对称凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2对称凸起2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述结构特征包括内环。
17.根据权利要求16所述的工程化向导RNA，其中所述内环包括不对称内环。
18.根据权利要求16所述的工程化向导RNA，其中所述内环包括对称内环。
19.根据权利要求17所述的工程化向导RNA，其中所述不对称内环是X1/X2不对称内环，其中X1是所述不对称内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述不对称内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2不对称内环是5/6不对称内环、6/5不对称内环、5/7不对称内环、7/5不对称内环、5/8不对称内环、8/5不对称内环、5/9不对称内环、9/5不对称内环、5/10不对称内环、10/5不对称内环、6/7不对称内环、7/6不对称内环、6/8不对称内环、8/6不对称内环、6/9不对称内环、9/6不对称内环、6/10不对称内环、10/6不对称内环、7/8不对称内环、8/7不对称内环、7/9不对称内环、9/7不对称内环、7/10不对称内环、10/7不对称内环、8/9不对称内环、9/8不对称内环、8/10不对称内环、10/8不对称内环或9/10不对称内环或10/9不对称内环。
20.根据权利要求18所述的工程化向导RNA，其中所述对称内环是X1/X2对称内环，其中X1是所述对称内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述对称内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述X1/X2对称内环是5/5对称内环、6/6对称内环、7/7对称内环、8/8对称内环、9/9对称内环、10/10对称内环、12/12对称内环、15/15对称内环或20/20对称内环。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述内环由所述工程化向导RNA或所述靶RNA上的至少5个核苷酸形成。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述内环由所述工程化向导RNA或所述靶RNA的5至1000个核苷酸形成。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述内环由所述工程化向导RNA或所述靶RNA的5至50个核苷酸形成。
24.根据权利要求16至23中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述内环由所述工程化向导RNA或所述靶RNA的5至20个核苷酸形成。
25.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述结构特征包括发夹。
26.根据权利要求25所述的工程化向导RNA，其中所述发夹包括非募集发夹。
27.根据权利要求25或26所述的工程化向导RNA，其中所述发夹的环部分包括约3至约15个核苷酸的长度。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA进一步包括至少两个另外的结构特征，所述结构特征包括至少两个错配。
29.根据权利要求28所述的工程化向导RNA，其中所述至少两个错配中的至少一个错配是G/G错配。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA进一步包括另外的结构特征，所述结构特征包括摆动碱基对。
31.根据权利要求30所述的工程化向导RNA，其中所述摆动碱基对包括与尿嘧啶配对的鸟嘌呤。
32.根据权利要求6至31所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA包括与所述靶RNA中的所述腺苷相邻的5'鸟苷，所述腺苷被所述RNA编辑实体化学修饰成肌苷。
33.根据权利要求32所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA包括与所述A/C错配的所述胞嘧啶相邻的5'鸟苷。
34.根据权利要求5至33中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述RNA编辑实体是：
(a)作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；
(b)(a)的催化活性片段；
(c)包括(a)或(b)的融合多肽；或
(d)这些的任何组合。
35.根据权利要求5至34中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述RNA编辑实体对细胞是内源性的。
36.根据权利要求5至35中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述RNA编辑实体包括ADAR。
37.根据权利要求36所述的工程化向导RNA，其中所述ADAR包括人ADAR(hADAR)。
38.根据权利要求36所述的工程化向导RNA，其中所述ADAR包括ADAR1、ADAR2、ADAR3或其任何组合。
39.根据权利要求36所述的工程化向导RNA，其中所述ADAR1包括ADAR1p110、ADAR1p150或其任何组合。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA包括经修饰的RNA碱基、未经修饰的RNA碱基或其组合。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA是mRNA分子。
42.根据权利要求1至40中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA是前mRNA分子。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA是APP、ABCA4、SERPINA1、HEXA、LRRK2、CFTR、SNCA、MAPT或LIPA、这些中的任何一种的片段或其任何组合。
44.根据权利要求1至42中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA编码淀粉样蛋白前体多肽、ATP结合盒、亚家族A、成员4(ABCA4)多肽、α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽、己糖胺酶A酶、富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)多肽、CFTR多肽、α突触核蛋白多肽、Tau多肽或溶酶体酸性脂肪酶多肽。
45.根据权利要求43或44所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA编码ABCA4多肽。
46.根据权利要求45所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA包括相对于具有登录号NC_000001.11:c94121149-93992837的野生型ABCA4基因序列，在位置5882、6320或5714处的G至A取代。
47.根据权利要求45或46所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表7、表9、表10、表11、表18或表19。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个凸起是2/1不对称凸起、1/0不对称凸起、2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起；(ii)X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述内环是5/5对称环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是G/G错配、A/C错配或G/A错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。
49.根据权利要求48所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括2/1不对称凸起、1/0不对称凸起、G/G错配、A/C错配和3/3对称凸起。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA的长度为80至175个核苷酸。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:339-SEQ ID NO:341或SEQ ID NO:292-SEQ IDNO:296具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
52.根据权利要求45至50所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
53.根据权利要求43或44所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA编码LRRK2多肽。
54.根据权利要求53所述的工程化向导RNA，其中所述LRRK2多肽包括选自由以下组成的组的突变：E10L、A30P、S52F、E46K、A53T、L119P、A211V、C228S、E334K、N363S、V366M、A419V、R506Q、N544E、N551K、A716V、M712V、I723V、P755L、R793M、I810V、K871E、Q923H、Q930R、R1067Q、S1096C、Q1111H、I1122V、A1151T、L1165P、I1192V、H1216R、S1228T、P1262A、R1325Q、I1371V、R1398H、T1410M、D1420N、R1441G、R1441H、A1442P、P1446L、V1450I、K1468E、R1483Q、R1514Q、P1542S、V1613A、R1628P、M1646T、S1647T、Y1699C、R1728H、R1728L、L1795F、M1869V、M1869T、L1870F、E1874X、R1941H、Y2006H、I2012T、G2019S、I2020T、T2031S、N2081D、T2141M、R2143H、Y2189C、T2356I、G2385R、V2390M、E2395K、M2397T、L2466H或Q2490NfsX3。
55.根据权利要求53或54所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表12、表15、表25、表26、表27、表17或表20。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个凸起是0/1不对称凸起、2/2对称凸起、3/3对称凸起或4/4对称凸起；(ii)一个或多个X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个内环是5/0不对称内环、5/4不对称内环、5/5对称内环、6/6对称内环、7/7对称内环或10/10对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、A/G错配、C/U错配、G/A错配或C/C错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。
57.根据权利要求56所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括6/6对称内环、A/C错配、A/G错配和C/U错配。
58.根据权利要求53至57中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA的长度为80至175个核苷酸。
59.根据权利要求53至58中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:344或SEQ ID NO:345具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
60.根据权利要求53至58所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
61.根据权利要求43或44所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA编码SNCA多肽。
62.根据权利要求61所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA与选自由以下组成的组的所述靶RNA的序列杂交：5'非翻译区(UTR)、3'UTR和SNCA基因的翻译起始位点。
63.根据权利要求61或62所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表21、表23或表28。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自由以下组成的组的结构特征：(i)X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述凸起是4/4对称凸起；(ii)一个或多个X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述一个或多个内环是5/5对称环、8/8对称环或49/4不对称环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、G/G错配、G/A错配、U/C错配或A/A错配；(iv)其任何组合。
65.根据权利要求64所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA的长度为80至175个核苷酸。
66.根据权利要求61至64中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
67.根据权利要求43或44所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA编码SERPINA1。
68.根据权利要求67所述的工程化向导RNA，其中所述靶RNA包括相对于具有登录号NC_000014.9:c94390654-94376747的野生型SERPINA1基因序列，在位置9989处的G至A取代。
69.根据权利要求67或68所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自以下的结构特征：表5、表29、表30、表31、表32、表33、表34、表35或表36。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述向导-靶RNA支架包括一个或多个选自由以下组成的组的结构特征：(i)一个或多个X1/X2凸起，其中X1是所述凸起中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述凸起中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述凸起是0/2不对称凸起、0/3不对称凸起、1/0不对称凸起、2/0不对称凸起、2/2对称凸起、3/0不对称凸起、2/2对称凸起或3/3对称凸起；(ii)X1/X2内环，其中X1是所述内环中的所述靶RNA的核苷酸的数量并且X2是所述内环中的所述工程化向导RNA的核苷酸的数量，并且其中所述内环是5/5对称内环；(iii)一个或多个错配，其中所述一个或多个错配是A/C错配、A/A错配和G/A错配；(iv)G/U摆动碱基对或U/G摆动碱基对；以及(v)其任何组合。
71.根据权利要求70所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA的长度为80至175个核苷酸。
72.根据权利要求67至71中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:6-10、102-103或297-327中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
73.根据权利要求1至72所述的工程化向导RNA，其中由所述RNA编辑实体修饰的所述靶RNA的所述核苷酸的所述碱基包括在所述靶RNA的点突变中。
74.根据权利要求73所述的工程化向导RNA，其中所述点突变包括错义突变。
75.根据权利要求73所述的工程化向导RNA，其中所述点突变包括无义突变。
76.根据权利要求75所述的工程化向导RNA，其中所述无义突变是提前UAA终止密码子。
77.根据权利要求1至76中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述结构特征相对于缺乏所述结构特征的在其它方面相当的向导RNA，增加了编辑所述靶RNA中靶腺苷的选择性。
78.根据权利要求1至77中任一项所述的工程化向导RNA，其中相对于缺乏所述结构特征的在其它方面相当的向导RNA，所述结构特征减少了所述RNA编辑实体对所述靶RNA中的靶腺苷的5'或3'的200、100、50、25、10、5、2或1、1个核苷酸内的局部脱靶腺苷的RNA编辑量。
79.一种工程化RNA，其包括：
(a)根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、
(b)U7 snRNA发夹序列、SmOPT序列或其组合。
80.根据权利要求79所述的工程化RNA，其中所述U7发夹具有TAGGCTTTCTGGCTTTTTACCGGAAAGCCCCT(SEQ ID NO:389)或CAGGTTTTCTGACTTCGGTCGGAAAACCCCT(SEQ ID NO:394)的序列。
81.根据权利要求79所述的工程化RNA，其中所述SmOPT序列具有AATTTTTGGAG(SEQ IDNO:390)的序列。
82.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA或根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA。
83.一种递送载体，其包括根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA或根据权利要求82所述的多核苷酸。
84.根据权利要求83所述的递送载体，其中所述递送载体是病毒载体。
85.根据权利要求84所述的递送载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。
86.根据权利要求85所述的递送载体，其中所述AAV载体来自腺相关病毒，所述腺相关病毒具有选自以下的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。
87.根据权利要求85或86所述的递送载体，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。
88.根据权利要求85至87中任一项所述的递送载体，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。
89.根据权利要求85至88中任一项所述的递送载体，其中所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。
90.根据权利要求88所述的递送载体，其中所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。
91.根据权利要求90所述的递送载体，其中所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。
92.一种药物组合物，其包括：
(a)根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸或根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体；以及
(b)药学上可接受的：赋形剂、载体或稀释剂。
93.根据权利要求92所述的药物组合物，其呈单位剂量形式。
94.根据权利要求92或93所述的药物组合物，其进一步包括另外的治疗剂。
95.根据权利要求94所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂包括氨还原剂、β阻滞剂、合成激素、抗生素或抗病毒药物、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、干细胞治疗、维生素或其经修饰的形式或其任何组合。
96.一种编辑细胞中的靶RNA的方法，所述方法包括：向所述细胞施用有效量的根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸、根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体或根据权利要求92至95中任一项所述的药物组合物。
97.一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸、根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体或根据权利要求92至95中任一项所述的药物组合物。
98.根据权利要求96所述的方法，其中所述工程化向导RNA作为单位剂量施用。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述单位剂量是足以治疗所述受试者的量。
100.根据权利要求96至99中任一项所述的方法，其中所述施用是鞘内的，眼内的、玻璃体内的、视网膜的、静脉内的、肌内的、心室内的、大脑内的、小脑内的、脑室内的、脑实质内的、皮下的或其组合。
101.根据权利要求96至100中任一项所述的方法，其中所述疾病包括神经疾病。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述神经疾病包括帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、Tau蛋白病或痴呆。
103.根据权利要求101或102所述的方法，其中所述神经疾病相对于未患有所述神经疾病或病状的健康受试者，与SNCA多肽水平升高相关。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述工程化向导RNA与编码所述SNCA多肽的靶RNA的序列杂交，所述序列选自由以下组成的组：5'非翻译区(UTR)、3'UTR和SNCA的翻译起始位点；其中杂交产生作为RNA编辑实体的底物的向导-靶RNA支架，所述RNA编辑实体对所述靶RNA的所述序列中的核苷酸的碱基进行化学修饰，由此降低所述SNCA多肽的水平。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述工程化向导RNA与编码所述SNCA的翻译起始位点的靶RNA的序列杂交。
106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:59-101、104-108和208-217中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
107.根据权利要求103至106中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括具有至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。
108.根据权利要求101或102所述的方法，其中所述神经疾病与由所述靶RNA编码的LRRK2多肽的突变相关，其中所述突变选自由以下组成的组：E10L、A30P、S52F、E46K、A53T、L119P、A211V、C228S、E334K、N363S、V366M、A419V、R506Q、N544E、N551K、A716V、M712V、I723V、P755L、R793M、I810V、K871E、Q923H、Q930R、R1067Q、S1096C、Q1111H、I1122V、A1151T、L1165P、I1192V、H1216R、S1228T、P1262A、R1325Q、I1371V、R1398H、T1410M、D1420N、R1441G、R1441H、A1442P、P1446L、V1450I、K1468E、R1483Q、R1514Q、P1542S、V1613A、R1628P、M1646T、S1647T、Y1699C、R1728H、R1728L、L1795F、M1869V、M1869T、L1870F、E1874X、R1941H、Y2006H、I2012T、G2019S、I2020T、T2031S、N2081D、T2141M、R2143H、Y2189C、T2356I、G2385R、V2390M、E2395K、M2397T、L2466H或Q2490NfsX3。
109.根据权利要求101或102所述的方法，其中所述神经疾病与由所述靶RNA编码的LRRK2多肽的突变相关，其中所述突变是G2019S突变。
110.根据权利要求108至114中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:35-42、46-52、111-207或344-345中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
111.根据权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括具有至少约60％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。
112.根据权利要求96至100中任一项所述的方法，其中所述疾病包括肝病。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述肝病包括肝硬化。
114.根据权利要求112所述的方法，其中所述肝病是α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述AAT缺乏症与具有登录号NC_000014.9:c94390654-94376747的野生型SERPINA1基因序列的位置9989处的G至A取代相关。
116.根据权利要求114或115所述的方法，其中工程化潜在，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:6-10、102-103或297-327中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
117.根据权利要求114至116中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括具有至少约60％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约90％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。
118.根据权利要求96至100中任一项所述的方法，其中所述疾病是黄斑变性。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述黄斑变性是斯特格氏病(StargardtDisease)。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述斯特格氏病与具有登录号NC_000001.11:c94121149-93992837的野生型ABCA4基因序列的位置5882、6320或5714处的G至A取代相关。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述斯特格氏病与位置5882处的G至A取代相关。
122.根据权利要求119或120所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:11-34、58、218-289、291-296或328-343中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性。
123.根据权利要求120至122中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括具有至少约70％的针对ADAR1的中靶编辑百分比或至少约80％的针对ADAR2的中靶编辑百分比。
124.根据权利要求96至123中任一项所述的方法，其中所述受试者被诊断患有所述疾病或所述病状。
125.根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸、根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体或根据权利要求92至95中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
126.根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸、根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体或根据权利要求92至95中任一项所述的药物组合物，其用于治疗神经疾病。
127.根据权利要求127所述的供使用的工程化向导RNA、多核苷酸、递送载体或药物组合物，其中所述神经疾病是帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、Tau蛋白病或痴呆。
128.根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸、根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体或根据权利要求92至95中任一项所述的药物组合物，其用于治疗肝病。
129.根据权利要求128所述的供使用的工程化向导RNA、多核苷酸、递送载体或药物组合物，其中所述肝病包括肝硬化。
130.根据权利要求128所述的供使用的工程化向导RNA、多核苷酸、递送载体或药物组合物，其中所述肝病是α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症。
131.根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸、根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体或根据权利要求92至95中任一项所述的药物组合物，其用于治疗黄斑变性。
132.根据权利要求131所述的供使用的工程化向导RNA、多核苷酸、递送载体或药物组合物，其中所述黄斑变性是斯特格氏病。
133.一种根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸、根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体或根据权利要求92至95中任一项所述的药物组合物用于制造药物的用途。
134.一种根据权利要求1至78中任一项所述的工程化向导RNA、根据权利要求79至81中任一项所述的工程化RNA、根据权利要求82所述的多核苷酸、根据权利要求83至91中任一项所述的递送载体或根据权利要求92至95中任一项所述的药物组合物用于制造用于治疗神经疾病、肝病或黄斑变性的药物的用途。
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