CN116547384A - 用于修饰靶rna的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了可以用于改善、治疗或至少部分地消除可由基因组突变引起的疾病和病状的组合物和方法。主题组合物和方法可以用于编辑RNA以改善、治疗或至少部分地消除受试者的所述疾病和病状。

Description

用于修饰靶RNA的组合物和方法

本申请根据35 U.S.C.§119要求于2020年5月26日提交的临时申请序列号63/030,166、于2020年11月11日提交的临时申请序列号63/112,329、于2020年12月1日提交的临时申请序列号63/119,921、于2021年2月24日提交的临时申请序列号63/153,175以及于2021年4月22日提交的临时申请序列号63/178,059的优先权，所述临时申请的公开内容通过引入并入本文。

发明内容

本文公开了工程化多核苷酸，其包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括非编码序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。在一些实施例中，所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。在一些实施例中，所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。在一些实施例中，所述靶RNA是mRNA。在一些实施例中，所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征包括凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，所述凸起的长度为1-4个核苷酸。在一些实施例中，所述结构特征包括发夹。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环的长度为5-50个核苷酸。在一些实施例中，所述内环的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括至少两个内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述内环是不对称内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括结构化基序。在一些实施例中，所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA，ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。在一些实施例中，所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施例中，所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。在一些实施例中，编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Ras-of-complex，Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。在一些实施例中，与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，所述突变包括多态性。在一些实施例中，所述突变是G至A突变。在一些实施例中，所述靶RNA包括与SEQ IDNO:5-SEQ ID NO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15的G2019S相对应的突变。在一些实施例中，所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。在一些实施例中，所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括所述RNA。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括翻译起始位点。

本文还公开了包括本文所描述的工程化多核苷酸的载体。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。在一些实施例中，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。在一些实施例中，所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施例中，所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些实施例中，所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括非编码序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。在一些实施例中，所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。在一些实施例中，所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。在一些实施例中，所述靶RNA是mRNA。在一些实施例中，所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征包括凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，所述凸起的长度为1-4个核苷酸。在一些实施例中，所述结构特征包括发夹。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环的长度为5-50个核苷酸。在一些实施例中，所述内环的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括至少两个内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述内环是不对称内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括结构化基序。在一些实施例中，所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。在一些实施例中，所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施例中，所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。在一些实施例中，编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。在一些实施例中，与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，所述突变包括多态性。在一些实施例中，所述突变是G至A突变。在一些实施例中，所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15的G2019S相对应的突变。在一些实施例中，所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ IDNO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。在一些实施例中，所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括所述RNA。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括翻译起始位点。

本文还公开了一种呈单位剂型的药物组合物，所述药物组合物包括：(a)如本文所描述的工程化多核苷酸；如本文所描述的载体或其任何组合；以及(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在一些实施例中，载体包括如本文描述的工程化多核苷酸。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。在一些实施例中，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。在一些实施例中，所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施例中，所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些实施例中，所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括非编码序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。在一些实施例中，所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。在一些实施例中，所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。在一些实施例中，所述靶RNA是mRNA。在一些实施例中，所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征包括凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，所述凸起的长度为1-4个核苷酸。在一些实施例中，所述结构特征包括发夹。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环的长度为5-50个核苷酸。在一些实施例中，所述内环的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括至少两个内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述内环是不对称内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括结构化基序。在一些实施例中，所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。在一些实施例中，所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施例中，所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。在一些实施例中，编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。在一些实施例中，与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，所述突变包括多态性。在一些实施例中，所述突变是G至A突变。在一些实施例中，所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQID NO:15的G2019S相对应的突变。在一些实施例中，所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。在一些实施例中，所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括所述RNA。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括翻译起始位点。

本文还公开了制备药物组合物的方法，所述方法包括将如本文所描述的工程化多核苷酸与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括非编码序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。在一些实施例中，所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。在一些实施例中，所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。在一些实施例中，所述靶RNA是mRNA。在一些实施例中，所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征包括凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，所述凸起的长度为1-4个核苷酸。在一些实施例中，所述结构特征包括发夹。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环的长度为5-50个核苷酸。在一些实施例中，所述内环的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括至少两个内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述内环是不对称内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括结构化基序。在一些实施例中，所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。在一些实施例中，所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施例中，所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。在一些实施例中，编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。在一些实施例中，与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，所述突变包括多态性。在一些实施例中，所述突变是G至A突变。在一些实施例中，所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5-SEQ IDNO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15的G2019S相对应的突变。在一些实施例中，所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。在一些实施例中，所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括所述RNA。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括翻译起始位点。

本文还公开了分离的细胞，其包括如本文所描述的工程化多核苷酸、如本文所描述的载体或两者。在一些实施例中，载体包括如本文描述的工程化多核苷酸。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。在一些实施例中，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。在一些实施例中，所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施例中，所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些实施例中，所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括非编码序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。在一些实施例中，所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。在一些实施例中，所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。在一些实施例中，所述靶RNA是mRNA。在一些实施例中，所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征包括凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，所述凸起的长度为1-4个核苷酸。在一些实施例中，所述结构特征包括发夹。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环的长度为5-50个核苷酸。在一些实施例中，所述内环的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括至少两个内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述内环是不对称内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括结构化基序。在一些实施例中，所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。在一些实施例中，所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施例中，所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。在一些实施例中，编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。在一些实施例中，与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，所述突变包括多态性。在一些实施例中，所述突变是G至A突变。在一些实施例中，所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQID NO:15的G2019S相对应的突变。在一些实施例中，所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。在一些实施例中，所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括所述RNA。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括翻译起始位点。

本文还公开了试剂盒，其在容器中包括如本文所描述的工程化多核苷酸、如本文所描述的载体或两者。在一些实施例中，载体包括如本文描述的工程化多核苷酸。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。在一些实施例中，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。在一些实施例中，所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施例中，所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些实施例中，所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括非编码序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。在一些实施例中，所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。在一些实施例中，所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。在一些实施例中，所述靶RNA是mRNA。在一些实施例中，所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征包括凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，所述凸起的长度为1-4个核苷酸。在一些实施例中，所述结构特征包括发夹。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环的长度为5-50个核苷酸。在一些实施例中，所述内环的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括至少两个内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述内环是不对称内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括结构化基序。在一些实施例中，所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。在一些实施例中，所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施例中，所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。在一些实施例中，编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。在一些实施例中，与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，所述突变包括多态性。在一些实施例中，所述突变是G至A突变。在一些实施例中，所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15的G2019S相对应的突变。在一些实施例中，所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。在一些实施例中，所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括所述RNA。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括翻译起始位点。

本文还公开了制备试剂盒的方法，所述方法包括将如本文所描述的工程化多核苷酸、如本文所描述的载体或两者加入容器中。在一些实施例中，载体包括如本文描述的工程化多核苷酸。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。在一些实施例中，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。在一些实施例中，所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施例中，所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些实施例中，所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括非编码序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。在一些实施例中，所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。在一些实施例中，所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。在一些实施例中，所述靶RNA是mRNA。在一些实施例中，所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征包括凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，所述凸起的长度为1-4个核苷酸。在一些实施例中，所述结构特征包括发夹。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环的长度为5-50个核苷酸。在一些实施例中，所述内环的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括至少两个内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述内环是不对称内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括结构化基序。在一些实施例中，所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。在一些实施例中，所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施例中，所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。在一些实施例中，编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。在一些实施例中，与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，所述突变包括多态性。在一些实施例中，所述突变是G至A突变。在一些实施例中，所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15的G2019S相对应的突变。在一些实施例中，所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。在一些实施例中，所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括所述RNA。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括翻译起始位点。

本文还公开了治疗或预防有需要的受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：(a)如本文所描述的载体；(b)如本文所描述的药物组合物；或(c)(a)和(b)。在一些实施例中，药物组合物呈单位剂型并且包括：(a)如本文所描述的工程化多核苷酸；如本文所描述的载体或其任何组合；以及(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在一些实施例中，载体包括如本文描述的工程化多核苷酸。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。在一些实施例中，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。在一些实施例中，所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些实施例中，所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些实施例中，所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括非编码序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。在一些实施例中，所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。在一些实施例中，不互补的所述核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。在一些实施例中，所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。在一些实施例中，所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。在一些实施例中，所述靶RNA是mRNA。在一些实施例中，所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。在一些实施例中，所述结构特征包括凸起。在一些实施例中，所述凸起是不对称凸起。在一些实施例中，所述凸起是对称凸起。在一些实施例中，所述凸起的长度为1-4个核苷酸。在一些实施例中，所述结构特征包括发夹。在一些实施例中，所述结构特征包括内环。在一些实施例中，所述内环的长度为5-50个核苷酸。在一些实施例中，所述内环的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括至少两个内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环。在一些实施例中，所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。在一些实施例中，所述内环是不对称内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括结构化基序。在一些实施例中，所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。在一些实施例中，所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。在一些实施例中，所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。在一些实施例中，所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施例中，所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。在一些实施例中，对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。在一些实施例中，编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。在一些实施例中，所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。在一些实施例中，与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。在一些实施例中，所述突变包括多态性。在一些实施例中，所述突变是G至A突变。在一些实施例中，所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5-SEQ IDNO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15的G2019S相对应的突变。在一些实施例中，所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。在一些实施例中，所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。在一些实施例中，所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括所述RNA。在一些实施例中，所述靶RNA的所述区包括翻译起始位点。在一些实施例中，所述施用包括施用治疗有效量的所述载体。在一些实施例中，所述施用至少部分地治疗或预防所述有需要的受试者的所述疾病或所述病状的至少一种症状。在一些实施例中，所述载体进一步包括或编码第二工程化多核苷酸。在一些实施例中，方法进一步包括施用包括或编码第二工程化多核苷酸的第二载体。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸包括与第二靶RNA的区至少部分地杂交的第二靶向序列。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸的所述第二靶向序列与所述第二靶RNA的所述区至少部分地互补。在一些实施例中，所述第二靶RNA编码包括以下的多肽：α-突触核蛋白(SNCA)、葡糖神经酰胺酶β(GBA)、PTEN诱导的激酶1(PINK1)、Tau、这些中任一种的生物活性片段或其任何组合。在一些实施例中，所述第二靶RNA编码所述SNCA多肽或其生物活性片段。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸被配置成促进所述RNA编辑实体对所述第二靶RNA的区的多核苷酸的核苷酸的碱基的编辑。在一些实施例中，所述编辑使由所述第二靶RNA编码的多肽的表达降低。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:33中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸编码SCNA多肽，所述SCNA多肽包括与SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:36中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸编码SNCA多肽，所述SNCA多肽包括与表6的突变相对应的突变，或表6的突变的任何组合。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸促进编码SNCA多肽的所述第二靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:48中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸促进编码Tau多肽的所述第二靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:49的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸促进编码PINK1多肽的所述第二靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:54中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸促进编码GBA多肽的所述第二靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。在一些实施例中，所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:183-SEQ ID NO:192中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述疾病或病状是中枢神经系统(CNS)、胃肠(GI)道或两者的疾病或病状。在一些实施例中，所述疾病是所述两者的疾病，并且其中所述疾病是帕金森氏病(Parkinson’s Disease)在一些实施例中，所述疾病是所述GI道的疾病，并且其中所述疾病是克罗恩氏病(Crohn’s disease)。在一些实施例中，方法进一步包括施用二级疗法。在一些实施例中，所述二级疗法与所述载体同时或顺序施用。在一些实施例中，所述二级疗法包括以下中的至少一种：益生菌、卡比多巴(carbidopa)、左旋多巴(levodopa)、MAO B抑制剂、儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂、抗胆碱能药、金刚烷胺(amantadine)、深部脑刺激、这些中的任一种的盐或其任何组合。在一些实施例中，所述载体、所述二级疗法或两者的所述施用独立地进行至少约：每日1次、每日2次、每日3次、每日4次、每周一次、每周两次、每周3次、两周一次、两月一次、每月一次或每年一次。在一些实施例中，方法进一步包括监测所述受试者的所述疾病或病状。在一些实施例中，所述载体包括在呈单位剂型的药物组合物中。在一些实施例中，所述受试者在所述施用之前被诊断患有所述疾病或所述病状。在一些实施例中，所述诊断是通过体外测定进行的。在一些实施例中，如通过测序所测量的，对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的所述编辑包括至少约3％、5％、10％、15％或20％的编辑。在一些实施例中，所述第二靶RNA编码所述SNCA多肽，并且其中ADAR多肽对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的所述编辑产生经修饰的多肽，所述经修饰的多肽与由所述靶RNA编码的未经修饰的多肽相比包括残基的变化，所述残基的变化包括：(a)在与SEQID NO:15的所述LRRK2多肽的位置2019相对应的位置处的腺嘌呤到肌苷的变化；(b)在与SEQ ID NO:34的所述SNCA多肽的位置30或53相对应的位置处的腺嘌呤到肌苷的变化；或(c)(a)和(b)。

通过引用的方式并入

本说明书中提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。

附图说明

本公开的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细说明，将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本公开的原理，并且在其附图中：

图1示出了通过Q5 PCR扩增的各种抗LRRK2向导RNA的体外转录(IVT)模板的凝胶电泳图像。使用表12中所列的引物进行扩增。Wt 0.100.50是LRRK2_0.100.50(无GluR2结构域；向导的长度为100个核苷酸；靶LRRK2 RNA中待编辑的A位于向导的核苷酸50处)，intGluR2是LRRK2_IntGluR2、翻转_intGluR2是LRRK2_FlipIntGluR2、天然向导是LRRK2_Natguide、EIE是LRRK2_EIE、Wt 1.100.50是LRRK2_1.100.50以及Wt 2.100.50是LRRK2_2.100.50。最左手侧的泳道是分子标志物。

图2示出了各种经纯化的IVT产生的抗LRRK2向导RNA的凝胶电泳图像。在每条泳道中加载25nmol的RNA。Wt 0.100.50是LRRK2_0.100.50、intGluR2是LRRK2_IntGluR2、翻转_intGluR2是LRRK2_FlipIntGluR2、天然向导是LRRK2_Natguide、EIE是LRRK2_EIE、Wt1.100.50是LRRK2_1.100.50以及Wt 2.100.50是LRRK2_2.100.50。最左手侧的泳道是分子标志物。向导RNA序列在表13中示出。

图3A-图3H示出了由不同工程化多核苷酸与其靶链结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。图3A示出了由LRRK2_0.100.50与其靶链RNA结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。目标用于编辑的靶链上的A通过箭头标记。LRRK2_0.100.50的5'端和3'端分别示出在左手侧和右手侧。图3B示出了由LRRK2_1.100.50与其靶链RNA结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。目标用于编辑的靶链上的A通过箭头标记。LRRK2_1.100.50的5'端和3'端分别示出在左手侧和右手侧。LRRK2_1.100.50的3'端还含有GluR2发夹。图3C示出了由LRRK2_1.100.50与其靶链RNA结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。目标用于编辑的靶链上的A通过箭头标记。LRRK2_2.100.50的5'端和3'端分别示出在左手侧和右手侧。LRRK2_1.100.50的5'端和3'端还含有GluR2发夹。图3D示出了由LRRK2_IntGluR2与其靶链RNA结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。目标用于编辑的靶链上的A通过箭头标记。LRRK2_IntGluR2的5'端和3'端分别示出在左手侧和右手侧。LRRK2_IntGluR2的GluR2发夹被放大。图3E示出了由LRRK2_FlipIntGluR2与其靶链RNA结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。目标用于编辑的靶链上的A通过箭头标记。LRRK2_FlipIntGluR2的5'端和3'端分别示出在左手侧和右手侧。LRRK2_FlipIntGluR2还包含有发夹“翻转的”GluR2发夹。与LRRK2_IntGluR2相比，其序列定向是相反的。图3F示出了由LRRK2_NatGuide与其靶链RNA结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。目标用于编辑的靶链上的A通过箭头标记。LRRK2_NatGuide的5'端和3'端分别示出在左手侧和右手侧。双链体分子含有一系列凸起。图3G示出了由LRRK2_EIE与其靶链RNA结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。目标用于编辑的靶链上的A通过箭头标记。LRRK2_EIE的5'端和3'端分别示出在左手侧和右手侧。双链体分子含有一系列凸起。图3H示出了由LRRK2_EIEv2与其靶链RNA结合形成的RNA-RNA双链体分子的二级结构。目标用于编辑的靶链上的A通过箭头标记。LRRK2_EIEv2的5'端和3'端分别示出在左手侧和右手侧。双链体分子含有一系列凸起。

图4显示出了用不同的抗LRRK2向导RNA(例如，靶向LRRK2 mRNA的区的工程化多核苷酸)和对照处理的LRRK2 G2019S杂合子细胞中第6,055个核苷酸的桑格测序(Sangersequencing)迹线。用向导RNA收缩细胞持续3小时(左图)或7小时(右图)。这些细胞是G2019S突变杂合的EBV转化的B细胞。用不同的向导RNA处理细胞。RNA编辑效率是通过LRRK2mRNA的示踪信号与G(经编辑的)和A(未经编辑的)的差异来计算的。通过桑格测序测量示踪信号。到3小时(左图)时，LRRK2_FlipIntGluR2(标记为IntFlip)的RNA编辑效率达到约14％，与对照(Ctrl)中的0％相反。到第7小时(右图)时，其它向导RNA，如LRRK2_0.100.50(标记为0.100.50)和LRRK2_1.100.50(标记为1.100.50)，也分别示出了约12％和13.5％的编辑。

图5A-图5D示出了具有3'SmOPT和U7发夹的工程化向导RNA的U7驱动表达，其用最小的非预期外显子跳跃增强了另外的基因靶标处的特异性向导RNA编辑。图5A示出了人SNCA的外显子结构。外显子示出为片段；编码区在上面用黑线表示。向导RNA靶向位点的位置如箭头所示；PCR引物在顶部示出。图5B示出了每个靶位点的ADAR编辑(通过桑格测序测量)。图5C示出了使用上述引物对RAB7a(左)和SNCA(右)的经编辑的转录物进行PCR扩增并在琼脂糖凝胶上进行分析的cDNA。PCR扩增子示出了正确剪接的外显子的预测的大小。图5D示出了桑格测序色谱图，所述桑格测序色谱图示出了在指定SNCA转录物(框)的靶腺苷处的特异性编辑。

图6A-图6C示出了SNCA的3'UTR的编辑。图6A示出了3'UTR的经编辑的位点的示例桑格测序色谱图，以及可能发生的脱靶编辑。图6B示出了在不同转染条件(核转染，龙沙公司(Lonza))下，在不同细胞类型(K562-VPR-SNCA)中，在有或没有ADAR2过表达的情况下，具有人SNCA3'UTR靶位点的3'SmOPT U7发夹构建体的小鼠或人U7启动子。图6C示出了使用与如图6B相同的构建体在3'UTR中的5'G处发生的脱靶编辑的百分比。

图7A示出了STB026 mU7 GG U7脱氧核糖核苷酸_mU6_CMV GFP sv40的代表性矢量图。图7B示出了STX0364 pAAV_hU6_scarless-Bsal_mU6-Bbsl_CMV_GFP.noBbsl的代表性矢量图。图7C示出了STX441 pAAV_hU6_环状间隔子2A_mU6_CMV_GFP的代表性矢量图。

图8示出了靶RNA LRRK2上不同向导RNA的编辑动力学。靶基因的编辑百分比显示在Y轴线上，并且时间示出在X轴线上。示出了向导RNA的三个实例：具有完美双链体的向导RNA、具有单个A-C错配的向导RNA，以及排名靠前的工程化向导RNA。与其它向导RNA设计相比，排名靠前的向导RNA在较短时间内的编辑百分比更高。

图9示出了靶RNA LRRK2上不同向导RNA的编辑动力学。靶基因的编辑百分比显示在Y轴线上，并且时间示出在X轴线上。示出了向导RNA的三个实例：排名靠前的工程化向导RNA、具有单个A-C错配的向导RNA，以及具有完美双链体的向导RNA。与其它向导RNA设计相比，排名靠前的向导RNA的K_obs增加了30倍。

图10A示出了使用完美双链体向导RNA设计或A-C错配向导设计和ADAR2的靶RNALRRK2的各种位置的靶碱基编辑频率。Y轴线示出了靶RNA的不同位置的编辑频率百分比。X轴线示出了靶RNA的各种位置。箭头指示靶碱基A。图的顶部示出了具有靶RNA的完美双链体向导RNA的靶碱基编辑频率。图的底部示出了靶RNA中靶标A处的A-C错配向导RNA的靶碱基编辑频率。对于任一向导RNA，中靶靶碱基编辑小于约20％。图10B示出了使用排名靠前的工程化设计和ADAR2的靶RNA LRRK2的各种位置的靶碱基编辑频率。Y轴线示出了靶RNA的不同位置的编辑频率百分比。X轴线示出了靶RNA的各种位置。箭头指示靶碱基A。中靶靶碱基编辑超过80％。

图11示出了携带具有G2019S突变的LRRK2小基因和mCherry(上图)或携带具有G2019S突变的LRRK2小基因、mCherry、CMV和ADAR2(下图)的piggyBac载体的构建体。

图12A示出了施用两种向导RNA和对照(GFP质粒)后ADAR1对LRRK2 G2019S突变的体外中靶编辑和脱靶编辑。图12B示出了施用两种向导RNA和对照(GFP质粒)后ADAR1和ADAR2对LRRK2 G2019S突变的体外中靶编辑和脱靶编辑。

图13示出了LRRK2的中靶和脱靶ADAR1和ADAR1+ADAAR2编辑的图，并描绘了实验中使用的环状LRRK2向导(0.100.80)。

图14示出了用于靶向LRRK2的示例性对照向导RNA向导02设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图15示出了用于靶向LRRK2的示例性对照向导RNA向导02设计的编辑动力学。

图16示出了示例性对照向导RNA向导02设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图17示出了用于靶向LRRK2的示例性对照向导RNA向导03设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图18示出了用于靶向LRRK2的示例性对照向导RNA向导03设计的编辑动力学。

图19示出了示例性对照向导RNA向导03设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图20示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图21示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图22示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图23示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图24示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图25示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图26示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图27示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图28示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图29示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导04设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图30示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导04设计的编辑动力学。

图31示出了示例性向导RNA向导04设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图32示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导04设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图33示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导04设计的编辑动力学。

图34示出了示例性向导RNA向导04设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图35示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图36示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图37示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图38示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图39示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图40示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图41示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图42示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图43示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图44示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图45示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图46示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图47示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图48示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图49示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图50示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图51示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图52示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图53示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图54示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图55示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图56示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图57示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图58示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图59示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图60示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图61示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图62示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图63示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图64示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图65示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图66示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图67示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图68示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图69示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图70示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图71示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图72示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图73示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图74示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图75示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图76示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图77示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导04设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图78示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导04设计的编辑动力学。

图79示出了示例性向导RNA向导04设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图80示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图81示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图82示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图83示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图84示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图85示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图86示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图87示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图88示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图89示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导03设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图90示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导03设计的编辑动力学。

图91示出了示例性向导RNA向导03设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图92示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图93示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图94示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图95示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图96示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图97示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图98示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图99示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图100示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图101示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图102示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图103示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图104示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图105示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图106示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图107示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图108示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图109示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图110示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图111示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导10设计的编辑动力学。

图112示出了示例性向导RNA向导10设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图113示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图114示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图115示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图116示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图117示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图118示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图119示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计，如通过测序确定的每种向导RNA随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

图120示出了用于靶向LRRK2的示例性向导RNA向导11设计的编辑动力学。

图121示出了示例性向导RNA向导11设计随时间变化的编辑百分比，如通过在时间点1分钟、10分钟、30分钟和100分钟处的测序以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”的位置表示为黑条)所确定的。

图122示出了靶向LRRK2 mRNA的示例性工程化多核苷酸序列的热图和结构。热图提供了在10分钟时间点处的编辑曲线的可视化。用于中靶编辑的5个工程化多核苷酸(不具有-2过滤器)位于左图中，并且右图描绘了具有最小-2编辑的用于中靶编辑的5个工程化多核苷酸。对应的预测二级结构位于热图下面。

图123示出了包括哑铃设计和靶LRRK2 mRNA的示例性工程化多核苷酸。

图124示出了图123的工程化多核苷酸的LRRK2的中靶和脱靶ADAR1(左侧)和ADAR1+ADAAR2(右侧)编辑的图。

图125示出了图123的工程化多核苷酸的LRRK2的中靶和脱靶ADAR1(左侧)和ADAR1+ADAAR2(右侧)编辑的图。

图126示出了图123的工程化多核苷酸的LRRK2的中靶和脱靶ADAR1(左侧)和ADAR1+ADAAR2(右侧)编辑的图。

图127示出了图123的工程化多核苷酸的LRRK2的中靶和脱靶ADAR1(左侧)和ADAR1+ADAAR2(右侧)编辑的图。

具体实施方式

除非另有指示，否则本文所公开的一些实施例的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常所理解的相同含义。

术语“一个/一种(a/an)”是指所述冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法宾语。作为实例，“元件”意指一个元件或多于一个元件。

如本文所用的术语“约”或“大约”当指可测量的值如量或浓度等时，意指涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指正或负10％。可替代地，“约”可以意指给定值的正或负20％、正或负10％、正或负5％或正或负1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的数量级内，在5倍内或在2倍内。当可以在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外指出，否则应假设术语“约”意指所述特定值在可接受的误差范围内。同样地，在可以提供值的范围、子范围或两者的情况下，范围或子范围可以包含范围或子范围的端点。术语“基本上”、“基本上没有”、“基本上不”、“基本上不含”和“大约”可以在描述量、位置或两者时使用，以指示所描述的值可以在值的合理的预期范围内。例如，数值可以具有可以是所述值(或值的范围)的+/-0.1％、所述值(或值的范围)的+/-1％、所述值(或值的范围)的+/-2％、所述值(或值的范围)的+/-5％、所述值(或值的范围)的+/-10％等的值。本文所叙述的任何数值范围都可以旨在包含纳入其中的所有子范围。

本文中如在如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包含A和B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样地，如在如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

如本文所用的，术语“包括”旨在意指组合物和方法包含所叙述的元件，但不排除其它元件。当用于定义组合物和方法时，“基本上由…组成”应当意指排除对用于预期用途的组合具有任何重要意义的其它元件。因此，基本上由如本文所定义的元件组成的组合物不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体，如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等中排除痕量污染物。“由…组成”应当意指排除多于痕量元件的其它成分和用于施用本公开的组合物的大量方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例均在本公开的范围内。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望结果的药剂的量。治疗有效量可以根据以下中的一个或多个因素而变化：经治疗的受试者和疾病病状、受试者的体重和年龄、疾病病状的严重程度、施用方式等，本领域普通技术人员可以容易地测定所述因素。有效量的活性剂可以以单剂量或多剂量施用。本文可以将组分描述为具有至少有效量，或至少有效的量，如与特定目标或目的，如本文所描述的任何目标或目的相关联的有效量。术语“有效量”也适用于将提供用于通过适当成像方法检测的图像的剂量。具体剂量可以根据以下中的一种或多种而变化：所选择的具体药剂、所遵循的给药方案、其是否与其它化合物组合施用、施用定时、待成像的组织以及其所携带的物理递送系统。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性或支化的，其可以包括经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分缀合。如本文所使用的，术语“氨基酸”试着天然和/或非天然或合成的氨基酸中的任一种，包含甘氨酸和D或L光学异构体两者以及氨基酸类似物和肽模拟物。

术语“受试者”、“宿主”、“个体”和“患者”如在本文中可互换地使用以指代动物，通常是哺乳动物。任何合适的哺乳动物均可以通过本文所描述的方法、细胞或组合物进行治疗。哺乳动物可以施用如本文所描述的载体、工程化向导RNA、前体向导RNA、核酸、多核苷酸、工程化多核苷酸或药物组合物。哺乳动物的非限制性实例包含人、非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、猕猴等)、家畜(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在一些实施例中，哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。哺乳动物可以是怀孕的雌性。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者患有或怀疑患有疾病，如神经退行性疾病。在一些实施例中，受试者患有或可能被怀疑患有癌症或肿瘤病症。在其它实施例中，受试者患有或可能被怀疑患有与异常蛋白质表达相关的疾病或病症。在一些情况下，人可以超过约：1天至约10个月大、约9个月至约24个月大、约1岁至约8岁大、约5岁至约25岁大、约20岁至约50岁大、约1岁大至约130岁大或约30岁至约100岁大。人的年龄可以大于约：1岁、2岁、5岁、10岁、20岁、30岁、40岁、50岁、60岁、70岁、80岁、90岁、100岁、110岁或120岁。人的年龄可以小于约：1岁、2岁、5岁、10岁、20岁、30岁、40岁、50岁、60岁、70岁、80岁、90岁、100岁、110岁、120岁或130岁。

如本文所使用的术语“样品”通常是指受试者的任何样品(如血液样品或组织样品)。样品或其部分可以包括细胞，如干细胞。样品的一部分可以富集干细胞。干细胞可以从样品中分离出来。样品可以包括组织、细胞、血清、血浆、外泌体、体液或其任何组合。体液可以包括尿液、血液、血清、血浆、唾液、粘液、脊髓液、泪液、精液、胆汁、羊水、脑脊液或其任何组合。样品或其部分可以包括从受试者获得的细胞外液。样品或其部分可以包括无细胞核酸、DNA或RNA。可以分析样品或其部分的存在或不存在或一种或多种突变。基因组数据可从样品或其部分获得。样品可以是疑似或确诊患有疾病或病状的样品。样品可以是通过非侵入性技术、微创性侵入性技术或侵入性技术从受试者体内取出的样品。样品或其部分可以通过组织涂刷、擦拭、组织活检、离体组织、细针抽吸、组织洗涤、细胞学样本、手术切除或其任何组合获得。样品或其部分可以包括来自组织类型的组织或细胞。例如，样品可以包括鼻组织、气管组织、肺组织、咽组织、喉组织、支气管组织、胸膜组织、肺泡组织、乳腺组织、膀胱组织、肾组织、肝组织、结肠组织、甲状腺组织、宫颈组织、前列腺组织、心脏组织、肌肉组织、胰腺组织、肛门组织、胆管组织、骨组织、脑组织、脊髓组织、肾组织、子宫组织、卵巢组织、子宫内膜组织、阴道组织、外阴组织、子宫组织、胃组织、眼组织、窦组织、阴茎组织、唾液腺组织、肠组织、胆囊组织、胃肠组织、膀胱组织、脑组织、脊髓组织、血液样品或其任何组合。

“真核细胞”包括除原核生物之外的所有生命王国。其可以通过膜结合核容易地区分。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或生物体，其细胞通过内膜和细胞骨架被组织成复杂的结构。最具特性的膜结合结构是细胞核。除非具体说明，否则术语“宿主”包含真核宿主，包含例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性实例包含猿、牛、猪、鼠类、大鼠、鸟类、爬虫类动物和人。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换地使用，并以其最广泛的意义指代两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一个实施例中，亚基可以通过其它键，例如酯、醚等连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包括蛋白质的序列或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所使用的，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸中的任一种，包含甘氨酸和D和L光学异构体两者、氨基酸类似物和肽模拟物。如本文所使用的，术语“融合蛋白”是指包括来自多于一种天然存在或重组产生的蛋白质的结构域的蛋白质，其中通常每个结构域具有不同的功能。在这方面，术语“接头”是指用于将这些结构域连接在一起的蛋白质片段——任选地用于保持融合蛋白结构域的构象和/或预防融合蛋白结构域之间可能损害其相应功能的不利相互作用。

“同源性”或“同一性”或“相似性”可以指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，出于比较的目的，可以对每个序列进行比对。当比较的序列中的位置可以被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子可以在所述位置是同源的。序列之间的同源性程度可以是序列所共享的匹配或同源位置的数量的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本公开的序列中的一者共享小于40％的同一性，或者可替代地小于25％的同一性。序列同源性可以指序列与参考序列的同一性％。作为实际问题，任何特定序列是否可以与本文所描述的任何序列(其可以与本文所描述的特定核酸序列对应)至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同，此类特定多肽序列可以常规地使用已知的计算机程序如Bestfit程序(威斯康星州序列分析软件包(Wisconsin Sequence Analysis Package),Unix版本8,遗传学计算机组,大学研究园(University Research Park),575科学驱动,威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.)53711)来确定。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与参考序列例如95％相同时，可以设置参数，使得可以在参考序列的全长上计算同一性百分比，并且可以允许总参考序列中高达5％的序列同源性缺口。

在一些情况下，参考序列(查询序列，即，本公开的序列)与主题序列之间的同一性也被称为全局序列比对，可以使用基于Brutlag等人,(《生物科学中的计算机应用(Comp.App.Biosci.)》6:237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序来确定。在一些实施例中，在FASTDB氨基酸比对中使用的可狭义解释同一性的特定实施例的参数可以包含：评分方案＝PAM(接受的突变百分比)0，k-tuple＝2，错配罚分＝1，加入罚分(JoiningPenalty)＝20，随机化分组长度＝0，截止评分＝1，窗口大小＝序列长度，间隙罚分＝5，间隙大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或主题序列的长度，以较短者为准。根据此实施例，如果由于N末端缺失或C末端缺失而不是由于内部缺失，主题序列可以比查询序列短，则可以对结果进行手动纠正，以考虑以下事实：在计算全局百分比同一性时，FASTDB程序不考虑主题序列的N末端截短和C末端截短。对于在N末端和C末端被截短的主题序列，相对于查询序列，百分比同一性可以通过计算查询序列中可能位于主题序列的N末端和C末端侧面的残基的数量(所述残基不能与对应的主题残基匹配/比对)占查询序列的总碱基的百分比来纠正。可以通过FASTDB序列比对的结果来确定残基是否可以匹配/比对的确定。然后可以从由FASTDB程序使用指定参数计算的同一性百分比中减去此百分比，以得到最终的同一性百分比分数。此最终的百分比同一性分数可以用于此实施例的目的。在一些情况下，只有不能与查询序列匹配/比对的主题序列的N末端和C末端的残基可以被考虑用于手动调整百分比同一性分数的目的。也就是说，只有在主题序列最远的N末端残基和C末端残基之外的查询残基位置可以被考虑用于此手动纠正。例如，90个残基的主题序列可以与100个残基的查询序列进行比对，以确定同一性百分比。缺失发生在主题序列的N末端，并且因此FASTDB比对未示出在N末端处的前10个残基的匹配/比对。10个不成对的残基代表10％的序列(在N末端和C末端处不匹配的残基的数量/查询序列中的残基的总数)，因此可以从由FASTDB程序计算的百分比同一性分数中减去10％。如果剩余的90个残基完全匹配，则最终的同一性百分比可以是90％。在另一个实例中，90个残基的主题序列可以与100个残基的查询序列进行比较。这次缺失可以是内部缺失，因此在主题序列的N末端或C末端处可以没有不能与查询匹配/比对的残基。在此情况下，由FASTDB计算的同一性百分比不能手动纠正。再次，只有如在FASTDB比对中所显示的在主题序列的N末端和C末端端部之外的残基位置(其不能与查询序列匹配/比对)可以被手动纠正。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换地使用并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、基因间DNA(包含但不限于异染色质DNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、序列的分离的DNA、序列的分离的RNA、sgRNA、向导RNA、核酸探针、引物、snRNA、长的非编码RNA、snoRNA、siRNA、miRNA、源自tRNA的小RNA(tsRNA)、反义RNA、shRNA或小的源自rDNA的RNA(srRNA)。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装多核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后被进一步修饰，如通过与标记组分缀合。所述术语也指双链分子和单链分子两者。核酸，包含例如具有硫代磷酸酯主链的核酸，可以包含一个或多个反应性部分。如本文所使用的，术语反应性部分包含能够通过共价、非共价或其它相互作用与另一分子，例如，核酸或多肽进行反应的任何基团。作为实例，核酸可以包含通过共价、非共价或其它相互作用与蛋白质或多肽上的氨基酸反应的氨基酸反应性部分。除非另有说明或要求，否则本公开的任何实施例，即多核苷酸，涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一者。

可用于本公开的方法的多核苷酸可以包括天然核酸序列及其变体、人工核酸序列或此类序列的组合。在一些实施例中，本公开的多核苷酸是指DNA序列。在一些实施例中，DNA序列可以与类似的RNA序列互换。在一些实施例中，本公开的多核苷酸是指RNA序列。在一些实施例中，RNA序列可以与类似的DNA序列互换。在一些实施例中，多核苷酸的Us和Ts可以在本文所提供的序列中互换。

当多核苷酸是RNA时，多核苷酸由四个核苷酸碱基的特异性序列构成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胸腺嘧啶的尿嘧啶(U)。在一些实施例中，多核苷酸可以包括一个或多个其它核苷酸碱基，如肌苷(I)，当次黄嘌呤通过β-N9糖苷键与呋喃核糖连接时形成的核苷，从而产生化学结构：

肌苷被翻译机器解读为鸟嘌呤(G)。

术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。此字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机的数据库中，并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。

如本文所使用的，“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包含在真核细胞中剪接mRNA。

当提及特定的分子、生物或细胞材料时，术语“等效物”或“生物等效物”可互换地使用，并且旨在具有最小同源性，同时仍保持期望的结构或功能的那些。

当其应用于多核苷酸时，术语“编码”是指如果处于其天然状态下或当通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA，则所述多核苷酸被称为“编码”多肽的多核苷酸。反义链是此类核酸的补体，并且编码序列可以从中推导出来。

如本文所使用的，术语“功能性”可以用于修饰任何分子、生物或细胞材料，以表明其实现特定效果、具体效果。

如本文所使用的，术语“突变”是指编码蛋白质的核酸序列相对于所述蛋白质的共有序列的改变。“错义”突变导致用一个密码子替换另一个密码子；“无义”突变将编码特定氨基酸的密码子变更为终止密码子。无义突变经常导致蛋白质的截短的翻译。“沉默”突变是那些对所得蛋白质没有影响的突变。如本文所用的，术语“点突变”是指仅影响基因序列中的一个核苷酸的突变。“剪接位点突变”是那些存在于前mRNA(在处理以去除内含子之前)的突变，这些突变导致错误翻译，并且经常由于剪接位点的不正确描绘而截短蛋白质。突变可以包括单核苷酸变异(SNV)。突变可以包括序列变体、序列变异、序列改变或等位基因变体。参考DNA序列可以从参考数据库中获得。突变可以影响功能。突变可能不影响功能。突变可以在一个或多个核苷酸的DNA水平、一个或多个核苷酸的核糖核酸(RNA)水平、一个或多个氨基酸的蛋白质水平、或其任何组合发生。参考序列可以从数据库如NCBI参考序列数据库(RefSeq)数据库获得。可以构成突变的具体变化可以包含一个或多个核苷酸或一个或多个氨基酸中的取代、缺失、插入、倒位或转化。突变可以是点突变。突变可以是融合基因。融合对或融合基因可以由突变(如易位、中间缺失、染色体倒位或其任何组合)产生。突变可以构成重复序列的数量的可变性，如三重化、四重化或其它。例如，突变可以是与给定序列相关的拷贝数的增加或减少(例如，拷贝数变异或CNV)。突变可以包含不同等位基因中的两个或更多个序列变更，或一个等位基因中的两个或更多个序列变更。突变可以在一个等位基因中的一个位置处包含两个不同的核苷酸，如镶嵌体(mosaic)。突变可以在一个等位基因中的一个位置处包含两个不同的核苷酸，如嵌合体。突变可以存在于恶性组织中。突变的存在或不存在可以指示发展疾病或病状的增加的风险。突变的存在或不存在可以指示疾病或病状的存在。突变可以存在于良性组织中。突变的不存在可能表明组织或样品是良性的。作为替代方案，突变的不存在可能不表明组织或样品是良性的。如本文所描述的方法可以包括鉴定样品中突变的存在。

“信使RNA”或“mRNA”是由DNA转录而来的核酸分子，并且然后经处理以去除被称为内含子的非编码区段。所得mRNA从细胞核(或存在DNA的另一个基因座)输出并翻译成蛋白质。术语“前mRNA”是指在处理以去除非编码区段之前的链。

“非编码”区段或序列是指RNA多核苷酸中不被翻译成基因的部分。此类非编码序列包含5'非翻译序列和3'非翻译序列，如Shine-Dalgarno序列、Kozak共有序列、3'poly-A尾等。

“标准氨基酸”是指下表中所示出的天然存在于人体中的20种氨基酸及其三个字母缩写、一个字母缩写、结构和对应的密码子：

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术语“非标准氨基酸”是指不属于这一组的那些合成的或以其它方式修饰的氨基酸，通常通过标准氨基酸(例如，氨基酸类似物)的化学合成或修饰产生。本公开在本文所公开的一些方法和载体中采用了蛋白原性非标准氨基酸。非标准氨基酸的非限制性实例是吡咯赖氨酸(Pyl或O)，其化学结构如下提供：

肌苷(I)是另一个示例性非标准氨基酸，其通常在tRNA中发现，并且对于根据“摆动碱基配对”的正确翻译是必需的。肌苷的结构在上文有所提供。

如本文所使用的，术语“ADAR”是指作用于RNA的腺苷脱氨酶，其可以将RNA序列中的腺苷(A)转化为肌苷(I)。ADAR1和ADAR2是参与体内RNA编辑的ADAR的两个示例性物种。ADAR1的非限制性示例性序列可以在以下参考号下找到：HGNC：225；Entrez基因：103；Ensembl：ENSG 00000160710；OMIM：146920；UniProtKB：P55265；以及GeneCard：GC01M154554以及其生物等效物。ADAR2的非限制性示例性序列可以在以下参考号下找到：HGNC：226；Entrez基因：104；Ensembl：ENSG00000197381；OMIM：601218；UniProtKB：P78563；以及GeneCard：GC21P045073以及其生物等效物。本文还提供了ADAR的生物活性片段，并且在提及ADAR时可将其包含在内。

如本文所使用的，术语“缺陷”是指低于正常(生理上可接受的)水平的特定药剂。就蛋白质而言，缺陷是指低于正常水平的全长蛋白质。

术语“互补的”或“互补性”是指核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)或其它非传统类型与另一核酸序列形成一个或多个氢键的能力。例如，序列A-G-T可以与序列T-C-A互补。互补性百分比指示核酸分子中能够与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中有5个、6个、7个、8个、9个、10个分别是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。“基本上互补”、“部分互补”、“至少部分地互补”或如本文所使用的，是指在10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸的区上的互补程度可以为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或者是指在严格条件(例如，严格杂交条件)下杂交的两种核酸。核酸可以包含非特异性序列。如本文所使用的，术语“非特异性序列”或“非特异性的”是指含有未被设计成与任何其它核酸序列互补或可以与任何其它核酸序列仅部分互补的一系列残基的核酸序列。

如本文所使用的，术语“结构域”是指蛋白质或多肽的特定区，并且可以与特定功能缔合。例如，“与RNA发夹基序缔合的结构域”是指结合一个或多个RNA发夹的蛋白质的结构域。此结合可以任选地特异性于特定发夹。

除非另有说明，否则无需明确叙述即可推断出，当本公开涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等效物或生物等效物预期在本公开的范围内。如本文所使用的，术语“其生物等效物”意指当提及参考蛋白、抗体、多肽或核酸时与“其等效物”同义，意指具有最小同源性，同时仍保持所期望的结构或功能的参考蛋白、抗体、多肽或核酸。除非本文中具体叙述，否则预期本文中所提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包含其等效物。例如，等效物可以具有至少约70％的同源性或同一性、至少80％的同源性或同一性、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％百分比的同源性或同一性，并表现出与参考蛋白、多肽或核酸基本上等效的生物活性。可替代地，当提及多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参考多核苷酸或其补体杂交的多核苷酸。

本文所使用的小节标题是为了组织目的并且不应该被解释为对所描述的主题进行限制。

概述

RNA编辑已经成为DNA编辑的一种有吸引力的替代方案。与DNA编辑不同，RNA编辑可能不太可能引起潜在危险的免疫反应，如利用基于CRISPR的方法报告的免疫反应。事实上，与来自细菌的DNA编辑酶Cas9不同，RNA编辑实体及其生物活性片段，如作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)是不会触发适应性免疫系统的人蛋白。另外地，RNA编辑可能是基因疗法的一种更安全的方法，因为编辑RNA不含有如DNA编辑中所看到的永久性基因组改变的风险。同样地，虽然可能发生脱位点RNA编辑，但脱位点编辑的mRNA会被稀释掉和/或被降解，这与永久性的脱位点DNA编辑不同，例如，与DNA的渗透性相比，前mRNA和mRNA的性质是短暂的，而在RNA对DNA的情况下，脱位点编辑的影响可能要小得多。

本文提供了用于靶向RNA，特别是用于预防、改善和/或治疗疾病的组合物和方法。尽管可以利用本文所提供的组合物和方法靶向许多疾病，但在一些实施例中，靶向与富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)突变相关的疾病。LRRK2突变与由中枢神经系统(CNS)和胃肠道(GI)引起的疾病有关。一方面，与利用DNA编辑的可用技术相比，本公开的组合物和方法提供了具有改进的靶向和降低的免疫原性的用于治疗CNS和/或GI疾病的合适手段。在一些实施例中，靶向与α突触核蛋白(SNCA)相关的疾病。在一些实施例中，靶向与葡糖神经酰胺酶β(GBA)相关的疾病。在一些实施例中，靶向与PTEN诱导的激酶1(PINK1)相关的疾病。在一些实施例中，靶向与由MAPT编码的Tau相关的疾病。

核糖核酸的靶向

靶向RNA可以是一个过程，通过所述过程，RNA可以在合成后在特异性核苷上被酶修饰。RNA的靶向可以包括核苷酸的插入、缺失或取代中的任一种。RNA靶向的实例包含假尿苷化(尿苷残基的异构化)和脱氨作用(从胞苷中去除胺基以产生尿苷(C至U编辑))；或从腺苷中去除胺基以产生肌苷(A至I编辑))。

RNA的靶向可以调节多肽的表达。例如，通过调节进入RNA干扰(RNAi)途径的编码多肽的dsRNA底物。此调节可以通过在染色质水平上作用的小干扰RNA(siRNA)来调节多肽的表达。此调节可以通过在RNA水平上作用的微RNA(miRNA)来调节多肽的表达。

RNA的靶向也可以是调节从基因转录RNA的翻译的一种方式。RNA编辑可以是调节转录物再编码的机制，例如，通过调节将沉默突变和/或非同义突变引入到转录物的三联体密码子中。

RNA编辑实体和其生物活性片段

本文提供了包括RNA编辑实体或其生物活性片段的组合物和所述组合物的使用方法。RNA编辑实体或其生物活性片段可以是包括催化RNA中腺苷向肌苷的化学转化的催化结构域的任何酶或其生物活性片段。

一方面，RNA编辑实体可以包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)、作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)，或其中的任一种的生物活性片段。ADAR和ADAT可以是催化RNA中腺苷向肌苷的化学转化的酶。因为肌苷的性质类似于鸟苷的性质(例如，肌苷将会与胞嘧啶形成两个氢键)，所以肌苷可以被翻译细胞机制识别为鸟苷。因此，“腺苷至肌苷(A至I)RNA编辑”有效地改变了RNA靶标的一级序列。一般而言，ADAR和ADAT酶共享类似的单羧基末端催化脱氨酶结构域。

ADAR可以包括可变数量的氨基末端dsRNA结合结构域(dsRBD)和单羧基末端催化脱氨酶结构域。人ADAR具有两个或三个dsRBD。证据表明，当ADAR与双链RNA结合时，所述ADAR可以与其它ADAR形成同二聚体以及异二聚体，然而目前还不能确定编辑是否需要二聚体。已鉴定出三种人ADAR基因(ADAR 1-3)，其中ADAR1(ADAR)和ADAR2(ADARB1)蛋白具有表征良好的腺苷脱氨活性。ADAR具有典型的模块化结构域组织，所述典型的模块化结构域组织在其N末端区中包含至少两个拷贝的dsRNA结合结构域(dsRBD；具有三个dsRBD的ADAR1；各自具有两个dsRBD的ADAR2和ADAR3)，随后是C末端脱氨酶结构域。一方面，RNA编辑实体包括ADAR。在一些实施例中，ADAR可以包括以下中的任一个：ADAR1、ADAR1p110、ADAR1p150、ADAR2、ADAR3、APOBEC蛋白或其任何组合。在一些实施例中，ADAR RNA编辑实体是ADAR1。另外地，或者可替代地，ADAR RNA编辑实体是ADAR2。另外地，或者可替代地，ADAR RNA编辑实体是ADAR3。一方面，RNA编辑实体可以是非ADAR。在一些情况下，RNA编辑实体可以包括与APOBEC1、APOBEC2、ADAR1、ADAR1p110、ADAR1p150、ADAR2、ADAR3或其任何组合的至少约80％序列同源性。

ADAT催化tRNA上的脱氨作用。ADAT在大肠杆菌(E.coli)中也被命名为tadA。已鉴定出三种人ADAT基因(ADAT 1-3)。

特异性RNA编辑可以导致转录物再编码。由于肌苷共享鸟苷的碱基配对特性，因此翻译机制将编辑的腺苷解释为鸟苷，从而改变三联体密码子，这可能导致蛋白质产物中的氨基酸取代。遗传密码中多于一半的三联体密码子可以通过RNA编辑重新分配。由于遗传密码的简并性，RNA编辑可以导致沉默和非同义氨基酸取代。

在一些情况下，靶向RNA可能影响剪接。靶向编辑的腺苷可能不成比例地位于前mRNA的剪接点附近。因此，在dsRNA ADAR底物的形成期间，内含子顺式作用序列可以形成涵盖剪接位点的RNA双链体，并且潜在地将其从剪接机制中遮蔽。此外，通过修饰选择的腺苷，ADAR可以产生或消除剪接位点，从而广泛地影响转录物的后期剪接。类似于翻译机制，剪接体将肌苷翻译为鸟苷，并且因此，可以分别通过AU(IU＝GU)和AA(AI＝AG)的脱氨作用产生标准的GU 5'剪接位点和AG 3'受体位点。对应地，RNA编辑可以破坏标准的AG 3'剪接位点(IG＝GG)。

在一些情况下，靶向RNA可以影响微RNA(miRNA)产生和功能。例如，前miRNA前体的RNA编辑可以影响miRNA的丰度，miRNA种子中的RNA编辑可以将其重新定向到另一个靶标以进行翻译抑制，或者RNA中miRNA结合位点的RNA编辑可以干扰miRNA互补性，并且因此干扰通过RNAi的抑制。

还考虑了可替代的RNA编辑实体，如来自成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统的RNA编辑实体，如Cas13(例如，Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d)。

在一些情况下，RNA编辑实体可以是病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自麻疹、腮腺炎或副流感病毒的病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自能够在靶RNA中添加或删除一个或多个核苷酸的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以是来自能够在靶RNA中添加或删除尿嘧啶或多于一个尿嘧啶的布氏锥虫的酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以包括重组酶。在一些情况下，RNA编辑实体可以包括融合多肽。

一方面，RNA编辑实体可以通过本文所公开的工程化多核苷酸募集至靶RNA处。在一些实施例中，工程化多核苷酸可以将RNA编辑实体募集到靶RNA，当RNA编辑实体与工程化多核苷酸和靶RNA缔合时，促进：靶RNA的区的多核苷酸的碱基的编辑、靶RNA编码的多肽的表达的调节，如LRRK2、SNCA、PINK1、Tau或其组合。工程化多核苷酸可以包括能够募集RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。在一些实施例中，工程化多核苷酸可以缺少RNA编辑实体募集结构域，并且仍能够结合RNA编辑实体，或被其结合。

工程化多核苷酸

本文提供了多核苷酸和包括所述多核苷酸的组合物。一方面，多核苷酸可以是工程化多核苷酸。在一实施例中，工程化多核苷酸可以是工程化多核糖核苷酸。在一些实施例中，本公开的工程化多核苷酸可以用于RNA编辑，例如用于预防或治疗疾病或病状。在一些情况下，工程化多核苷酸可以与主题RNA编辑实体联合使用，以编辑靶RNA或调节由靶RNA编码的多肽的表达。在一实施例中，本文所公开的组合物可以包含能够促进主题RNA编辑实体如ADAR或ADAT多肽或其生物活性片段进行编辑的工程化多核苷酸。

工程化多核苷酸可以以任何适合于RNA靶向的方式进行工程化。一方面，工程化多核苷酸通常包括至少一个允许其与靶RNA的区杂交的靶向序列。在一些实施例中，靶向序列与靶RNA的区部分地杂交。在一些情况下，靶向序列也可以被称为靶向结构域或靶向区。

一方面，工程化多核苷酸的靶向序列允许工程化多核苷酸通过碱基配对(例如沃森-克里克碱基配对)靶向RNA序列。在一实施例中，靶向序列可以位于工程化多核苷酸的N末端或C末端。在一些情况下，靶向序列位于两个末端。靶向序列可以是任何长度。在一些情况下，靶向序列的长度为至少约：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个或至多约200个核苷酸。在一实施例中，工程化多核苷酸包括长度为约为75-100个、80-110个、90-120个或95-115个核苷酸的靶向序列。在一实施例中，工程化多核苷酸包括长度为约100个核苷酸的靶向序列。在一实施例中，工程化多核苷酸包括长度为50-200个、50-300个或80-120个核苷酸的靶向序列。

在一些情况下，主题靶向序列包括与靶RNA的区互补的至少部分序列。在一些实施例中，靶RNA包括mRNA序列。在一些实施例中，mRNA序列包括编码序列和非编码序列。在一些实施例中，非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)、3'非翻译区(5'UTR)、内含子或其任何组合。在一些实施例中，mRNA序列编码主题多肽，例如LRRK2、SNCA、GBA、PINK1或Tau。在一些实施例中，靶RNA的区包括来自mRNA序列的5至400个核苷酸，其中mRNA序列编码主题多肽，例如LRRK2、SNCA、GBA、PINK1或Tau。在一些实施例中，靶RNA的区包括来自mRNA序列的非编码序列和编码序列的5至400个核苷酸，其中所述编码序列编码主题多肽，例如LRRK2、SNCA、GBA、PINK1或Tau。在一些实施例中，靶RNA的区包括来自3'非翻译区(3'UTR)的5至400个核苷酸和编码主题多肽的序列，例如LRRK2、SNCA、GBA、PINK1或Tau。在一些实施例中，靶RNA的区包括来自5'非翻译区(5'UTR)的5至300个核苷酸和编码主题多肽的序列，例如LRRK2、SNCA、GBA、PINK1或Tau。在一些实施例中，靶RNA的区包括来自3'非翻译区(3'UTR)的5至400个核苷酸和编码主题多肽的序列，例如LRRK2、SNCA、GBA、PINK1或Tau。在一些情况下，主题靶向序列包括与靶RNA的区互补的至少部分序列，所述靶RNA的区至少部分地编码主题多肽，例如LRRK2、SNCA、GBA、PINK1或Tau。

在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA的区的95％、96％、97％、98％、99％或100％序列互补性。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA序列的区的小于100％互补性。例如，靶向序列和可以被靶向序列结合的靶RNA的区可以具有单个碱基错配。在其它情况下，主题工程化多核苷酸的靶向序列包括至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、20个、30个、40个或至多约50个碱基错配。在一些方面，核苷酸错配可以与本文所提供的结构特征缔合。在一些方面，靶向序列包括至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或至多约15个核苷酸，其互补性与靶RNA的主题区的野生型RNA不同。在一些方面，靶向序列包括至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或至多约15个核苷酸，其互补性与靶RNA的主题区不同。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA的区具有互补性的至少50个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA的区具有互补性的50至150个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA的区具有互补性的50至200个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA的区具有互补性的50至250个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA的区具有互补性的50至300个核苷酸。在一些情况下，靶向序列包括与靶RNA的区具有互补性的50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个或300个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括多于50个核苷酸，并且具有与靶RNA的区具有互补性的至少50个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括50至400个核苷酸，并且具有与靶RNA的区具有互补性的50至150个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括50至400个核苷酸，并且具有与靶RNA的区具有互补性的50至200个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括50至400个核苷酸，并且具有与靶RNA的区具有互补性的50至250个核苷酸。在一些情况下，靶向序列总共包括50至400个核苷酸，并且具有与靶RNA的区具有互补性的50至300个核苷酸。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的至少50个核苷酸被一个或多个结构特征分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的至少50个核苷酸被一个或多个错配、一个或更多个凸起、或一个或多个环或其任何组合分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的50至150个核苷酸被一个或多个结构特征分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的50至150个核苷酸被一个或多个错配、一个或更多个凸起、或一个或多个环或其任何组合分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的50至200个核苷酸被一个或多个结构特征分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的50至200个核苷酸被一个或多个错配、一个或更多个凸起、或一个或多个环或其任何组合分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的50至250个核苷酸被一个或多个结构特征分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的50至250个核苷酸被一个或多个错配、一个或更多个凸起、或一个或多个环或其任何组合分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的50至300个核苷酸被一个或多个结构特征分离。在一些情况下，与靶RNA的区具有互补性的50至300个核苷酸被一个或多个错配、一个或更多个凸起、或一个或多个环或其任何组合分离。例如，靶向序列包括总共54个核苷酸，其中，顺序地，25个核苷酸与靶RNA的区互补，4个核苷酸形成凸起，并且25个核苷酸与靶RNA的区互补。作为另一个实例，靶向序列包括总共118个核苷酸，其中，顺序地，25个核苷酸与靶RNA的区互补，4个核苷酸形成凸起，25个核苷酸与靶RNA的区互补，14个核苷酸形成环，并且50个核苷酸与靶RNA的区互补。

在一些情况下，主题工程化多核苷酸被配置成促进主题靶RNA的区的多核苷酸的碱基的编辑，以调节主题靶RNA编码的多肽的表达，或两者。为了促进编辑，本公开的工程化多核苷酸可以募集RNA编辑实体。在某些实施例中，工程化多核苷酸包括RNA编辑实体募集结构域。在某些实施例中，工程化多核苷酸缺少RNA编辑实体募集结构域。无论哪种方式，主题工程化多核苷酸能够结合RNA编辑实体，或被其结合，并促进主题靶RNA的编辑。

一方面，主题工程化多核苷酸包括RNA编辑实体募集结构域。RNA编辑实体可以被工程化多核苷酸上的RNA编辑实体募集结构域募集。在一些情况下，工程化多核苷酸可以被配置成促进主题RNA编辑实体对RNA的区的核苷酸或多核苷酸的碱基的编辑。

可以使用各种RNA编辑实体募集结构域。在一实施例中，募集结构域包括：谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)、APOBEC、MS2噬菌体外壳蛋白募集结构域、Alu、TALEN募集结构域、Zn指多肽募集结构域、巨TAL募集结构域或Cas13募集结构域、其组合或其经修饰的版本。在某些实施例中，本公开的工程化多核苷酸中可以包含多于一个募集结构域。在存在募集序列的情况下，募集序列可以用于定位RNA编辑实体，以在靶向序列(例如反义序列)与靶RNA的区杂交后与主题靶RNA有效地反应。在一些情况下，募集序列可以允许RNA编辑实体与工程化多核苷酸的瞬时结合。在一些实例中，募集序列允许RNA编辑实体与工程化多核苷酸的永久结合。募集序列可以是任何长度。在一些情况下，募集序列的长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个、400个、401个、402个、403个、404个、405个、406个、407个、408个、409个、410个、411个、412个、413个、414个、415个、416个、417个、418个、419个、420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、453个、454个、455个、456个、457个、458个、459个、460个、461个、462个、463个、464个、465个、466个、467个、468个、469个、470个、471个、472个、473个、474个、475个、476个、477个、478个、479个、480个、481个、482个、483个、484个、485个、486个、487个、488个、489个、490个、491个、492个、493个、494个、495个、496个、497个、498个、499个或500个核苷酸。在一些情况下，募集序列的长度为约45个核苷酸。在一些情况下，募集序列的至少一部分包括至少1至约75个核苷酸。在一些情况下，募集序列的至少一部分包括约45个核苷酸至约60个核苷酸。在一些情况下，募集序列的至少一部分包括至少1至约500个核苷酸。

在一实施例中，RNA编辑实体募集结构域包括GluR2序列或其功能片段。在一些情况下，GluR2序列可以被RNA编辑实体，如ADAR或其生物活性片段识别。在一些实施例中，GluR2序列可以是非天然存在的序列。在一些情况下，GluR2序列可以被修饰，例如用于增强的募集。在一些实施例中，GluR2序列可以包括天然存在的GluR2序列和合成序列的一部分。

在一实施例中，募集结构域包括GluR2序列，或与以下具有至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列：GUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCAC(SEQ ID NO:1)。在一些情况下，募集结构域可以包括与SEQ ID NO:1的至少约10个、15个、20个、25个或30个核苷酸的至少约80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，募集结构域可以包括与SEQ ID NO:1的至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性。

还考虑了另外的RNA编辑实体募集结构域。在一实施例中，募集结构域包括载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化多肽样(APOBEC)结构域。在一些情况下，APOBEC结构域可以包括非天然存在的序列或天然存在的序列。在一些实施例中，APOBEC结构域编码序列可以包括经修饰的部分。在一些情况下，APOBEC结构域编码序列可以包括天然存在的APOBEC结构域编码序列的一部分。在另一个实施例中，募集结构域可以来自MS2噬菌体外壳蛋白募集结构域。在另一个实施例中，募集结构域可以来自Alu结构域。在一些情况下，募集结构域可以包括与APOBEC、MS2噬菌体外壳蛋白募集结构域或Alu结构域的至少约：15个、20个、25个、30个或35个核苷酸的至少约：80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同源性。

在一些实施例中，募集结构域包括CRISPR相关的募集结构域序列。例如，CRISPR相关的募集序列可以包括Cas蛋白序列。在一些情况下，Cas13募集结构域可以包括Cas13a募集结构域、Cas13b募集结构域、Cas13c募集结构域或Cas13d募集结构域。在一些情况下，RNA编辑实体募集结构域可以包括与Cas13b募集结构域的至少约20个核酸的至少约80％序列同源性。在一些实施例中，RNA编辑实体募集结构域可以包括与Cas13b募集结构域的至少约80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同源性。在一些情况下，RNA编辑实体募集结构域可以包括与Cas13b募集结构域的至少约：15个、20个、25个、30个或35个核酸的至少约：80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，RNA编辑实体募集结构域的至少一部分可以包括与Cas13b结构域编码序列的至少约80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同源性。在一些情况下，RNA编辑实体募集结构域的至少一部分可以包括与Cas13b结构域编码序列的至少约85％序列同源性。在一些实施例中，RNA编辑实体募集结构域的至少一部分可以包括与Cas13b结构域编码序列的至少约90％序列同源性。在一些情况下，RNA编辑实体募集结构域的至少一部分可以包括与Cas13b结构域编码序列的至少约95％序列同源性。在一些情况下，RNA编辑实体募集结构域的至少一部分可以包括与Cas13b结构域编码序列的至少约99％序列同源性。在一些情况下，RNA编辑实体募集结构域的至少一部分可以包括与Cas13b结构域编码序列的至少约100％序列同源性。在一些实施例中，Cas13b结构域编码序列可以是非天然存在的序列。在一些情况下，Cas13b结构域编码序列可以包括经修饰的部分。在一些实施例中，Cas13b结构域编码序列可以包括天然存在的Cas13b结构域编码序列的一部分。

在本公开的工程化多核苷酸中可以发现任何数量的募集序列。在一些情况下，多核苷酸中包含至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或至多约10个募集序列。募集序列可以位于主题多核苷酸的任何位置。在一些情况下，募集序列位于多核苷酸的N末端、中间或C末端。募集序列可以位于靶向序列的上游或下游。在一些情况下，募集序列侧接主题多核苷酸的靶向序列。募集序列可以包括所有的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，尽管不排除包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的募集序列。

在一些情况下，工程化多核苷酸可以包括募集结构域和一个或多个结构特征或结构化基序。结构特征可以包括以下中的任一种：错配、对称凸起、不对称凸起、对称内环、不对称内环、发夹、摆动碱基对、化学修饰或其任何组合。一方面，双链RNA(dsRNA)底物，例如杂交的多核苷酸链，可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA的区杂交时形成。本文描述了一种特征，所述特征与可能存在于本公开的dsRNA底物中的若干个结构特征中的一个对应。特征的实例包含错配、凸起(对称凸起或不对称凸起)、内环(对称内环或不对称内环)或发夹(非靶向结构域)。本公开的工程化多核苷酸可以具有1至50个特征和募集结构域。本公开的工程化多核苷酸可以具有1至5个、5至10个、10至15个、15至20个、20至25个、25至30个、30至35个、35至40个、40至45个、45至50个、5至20个、1至3个、4至5个、2至10个、20至40个、10至40个、20至50个、30至50个、4至7个或8至10个特征和募集结构域。

在募集结构域可能不存在的情况下，工程化多核苷酸仍然能够与主题RNA编辑实体(例如，ADAR)缔合，以促进靶RNA的编辑和/或调节由主题靶RNA编码的多肽的表达。这可以通过一个或多个结构特征或结构化基序来实现。结构特征可以包括以下中的任一种：错配、对称凸起、不对称凸起、对称内环、不对称内环、发夹、摆动碱基对、化学修饰或其任何组合。一方面，双链RNA(dsRNA)底物，例如杂交的多核苷酸链，可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA的区杂交时形成。本文描述了一种特征，所述特征与可能存在于本公开的dsRNA底物中的若干个结构特征中的一个对应。特征的实例包含错配、凸起(对称凸起或不对称凸起)、内环(对称内环或不对称内环)或发夹(包括非靶向结构域的发夹)。本公开的工程化多核苷酸可以具有1至50个特征。本公开的工程化多核苷酸可以具有1至5个、5至10个、10至15个、15至20个、20至25个、25至30个、30至35个、35至40个、40至45个、45至50个、5至20个、1至3个、4至5个、2至10个、20至40个、10至40个、20至50个、30至50个、4至7个或8至10个特征。

如本文所公开的，结构化基序包括在dsRNA底物中的两个或更多个特征。

双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA(例如，靶RNA的区)杂交时形成。如本文所公开的，错配是指多核苷酸中的核苷酸可以与dsRNA内靶RNA中的相对核苷酸不成对。错配可以包括任何两个不碱基配对、不互补或两者的核苷酸。在一些实施例中，错配可以是A/C错配。A/C错配可以包括与靶RNA中(例如，在靶RNA的区中)的A相对的本公开的工程化多核苷酸中的C。在一实施例中，错配包括A/C错配，其中A可以在靶RNA中，并且C可以在工程化多核苷酸的靶向序列中。在另一个实施例中，A/C错配中的A可以是由主题RNA编辑实体编辑的靶RNA中的核苷酸的碱基。在另一个实施例中，A/C错配中的A可以是由主题RNA编辑实体编辑的靶RNA的区中的核苷酸的碱基。A/C错配可以包括与靶RNA中(例如，在靶RNA的区中)的C相对的本公开的工程化多核苷酸中的A。在一实施例中，错配包括G/G错配。在一实施例中，G/G错配可以包括与靶RNA中的G相对的本公开的工程化多核苷酸中的G。在一些实施例中，位于编辑位点5'的错配可以促进待编辑的靶标A的碱基翻转。错配也可能有助于赋予序列特异性。

一方面，结构特征可以独立地在与靶RNA的区杂交的工程化多核苷酸中形成。在其它情况下，当工程化多核苷酸与靶RNA的区结合时，可以形成结构特征。当工程化多核苷酸与其它分子如肽、核苷酸或小分子缔合时，也可以形成结构特征。在某些实施例中，工程化多核苷酸的结构特征可以独立地在与靶RNA的区杂交时形成，并且其结构可以由于工程化多核苷酸与靶RNA区杂交而变化。在某些实施例中，当工程化多核苷酸可以与靶RNA缔合时，存在结构特征。

在一些情况下，结构特征可以是发夹。在一些情况下，工程化多核苷酸可能缺少发夹结构域。在其它情况下，工程化多核苷酸可以包括发夹结构域或多于一个发夹结构域。发夹可以位于工程化多核苷酸中的任何位置。如本文所公开的，发夹可以是RNA双链体，其中单RNA链自身折叠以形成RNA双链体。单条RNA链由于在相对于彼此的折叠区碱基对的上游和下游具有核苷酸序列而自身折叠。发夹可以在整个双链体结构的长度上具有10至500个核苷酸。发夹的茎环结构可以是3至15个核苷酸长。发夹可以存在于本文所公开的任何工程化多核苷酸中。本文所公开的工程化多核苷酸可以包括1至10个发夹。在一些实施例中，本文所公开的工程化多核苷酸包括1个发夹。在一些实施例中，本文所公开的工程化多核苷酸包括2个发夹。如本文所公开的，发夹可以指代募集发夹或发夹或非募集发夹。发夹可以位于本公开的工程化多核苷酸内的任何地方。在一些实施例中，一个或多个发夹可以存在于本公开的工程化多核苷酸的3'端处、本公开的工程化多核苷酸的5'端处或本公开的工程化多核苷酸的靶向序列内或其任何组合中。

募集发夹可以募集RNA编辑实体，如ADAR。在一些实施例中，募集发夹包括GluR2结构域。在一些实施例中，募集发夹包括Alu结构域。

在又另一方面，结构特征包括非募集发夹。如本文所公开的，非募集发夹可以表现出改善工程化多核苷酸定位到靶RNA的功能。在一些实施例中，非募集发夹表现出改善工程化多核苷酸定位到靶RNA的区以进行杂交的功能。在一些实施例中，非募集发夹改善了核保留。在一些实施例中，非募集发夹包括来自U7 snRNA的发夹。

另一方面，结构特征包括摆动碱基。摆动碱基对是指两个弱配对的碱基。例如，本公开的摆动碱基对可以是指与U配对的G。

本公开的发夹可以是任何长度。一方面，发夹可以是约5-200个或更多个核苷酸。在一些情况下，发夹可以包括约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个或400个或更多个核苷酸。在其它情况下，发夹还可以包括5至10个、5至20个、5至30个、5至40个、5至50个、5至60个、5至70个、5至80个、5至90个、5至100个、5至110个、5至120个、5至130个、5至140个、5至150个、5至160个、5至170个、5至180个、5至190个、5至200个、5至210个、5至220个、5至230个、5至240个、5至250个、5至260个、5至270个、5至280个、5至290个、5至300个、5至310个、5至320个、5至330个、5至340个、5至350个、5至360个、5至370个、5至380个、5至390个或5至400个核苷酸。发夹可以是由自身具有足够的互补性的单链RNA形成的结构特征，以与双链RNA基序/结构杂交，所述基序/结构由被核苷酸环分离的双链杂交的RNA组成。

在一些情况下，结构特征可以是凸起。凸起可以包括靶链与工程化多核苷酸链之间的单个(有意的)核酸错配。在其它情况下，链之间多于一个的连续错配构成了凸起，只要凸起区(碱基的错配的延伸)可以在具有杂交的互补dsRNA区的两侧上侧接。凸起可以位于多核苷酸的任何位置。在一些情况下，凸起可以位于距5'羟基或3'羟基约30至约70个核苷酸处。

在一实施例中，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。如本文所公开的，凸起是指在形成dsRNA底物时形成的结构，其中工程化多核苷酸或靶RNA中的核苷酸与其在相反链上的位置对应物不互补。凸起可以改变dsRNA底物的二级结构或三级结构。凸起可以在dsRNA底物的工程化多核苷酸侧或dsRNA底物的靶RNA侧上具有1至4个核苷酸。在一些实施例中，本公开的工程化多核苷酸具有2个凸起。在一些实施例中，本公开的工程化多核苷酸具有3个凸起。在一些实施例中，本公开的工程化多核苷酸具有4个凸起。在一些实施例中，dsRNA底物中凸起的存在可以定位ADAR以选择性地编辑靶RNA中的靶标A并减少非靶标的脱靶编辑。在一些实施例中，dsRNA底物中凸起的存在可以募集另外的ADAR。本文所公开的dsRNA底物中的凸起可以募集其它蛋白质，如其它RNA编辑实体。在一些实施例中，位于编辑位点的5'的凸起可以促进待编辑的靶标A的碱基翻转。凸起也可能有助于赋予序列特异性。凸起可以通过将其限制在产生靶标A的选择性编辑的定向中来帮助指导ADAR编辑。在一些实施例中，通过将靶标A定位在两个凸起之间(例如，基于工程化多核苷酸，定位在5'端凸起与3'端凸起之间)来实现靶标A的选择性编辑。在一些实施例中，两个凸起均是对称凸起。在一些实施例中，两个凸起各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。在一些实施例中，两个凸起各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的3个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。在一些实施例中，两个凸起各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的4个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。在一些实施例中，靶标A位于两个凸起之间，并且距凸起(例如，距5'端凸起或3'端凸起)至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个或400个核苷酸。在一些实施例中，另外的结构特征位于凸起之间(例如，5'端凸起与3'端凸起之间)。在一些实施例中，凸起中的错配包括用于在靶RNA中编辑的核苷酸碱基(例如，凸起中的A/C错配，其中工程化多核苷酸中凸起的部分包括与靶RNA中凸起部分中的A错配的C，并且A被编辑)。

一方面，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。凸起可以是对称凸起或不对称凸起。凸起可以由dsRNA底物的多核苷酸侧或靶RNA侧上的1至4个参与核苷酸形成。当在凸起的每一侧上可以存在相同数量的核苷酸时，可以形成对称凸起。对称凸起可以在dsRNA底物的工程化多核苷酸侧或dsRNA底物的靶RNA侧上具有2至4个核苷酸。例如，本公开的dsRNA底物中的对称凸起可以在dsRNA底物的工程化多核苷酸侧和靶RNA侧上具有相同数量的核苷酸。本公开的对称凸起可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的对称凸起可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的3个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的对称凸起可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的4个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。

双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。凸起可以是对称凸起或不对称凸起。当在凸起的每一侧上存在不同数量的核苷酸时，可以形成不对称凸起。不对称凸起可以在dsRNA底物的多核苷酸侧或靶RNA侧上具有1至4个参与核苷酸。例如，本公开的dsRNA底物中的不对称凸起可以在dsRNA底物的工程化多核苷酸侧和靶RNA侧上具有不同数量的核苷酸。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的2个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的2个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的3个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的3个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成。本公开的不对称凸起可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的4个核苷酸形成。在一些实施例中，不对称凸起增加了编辑靶标A的效率。在一些实施例中，增加编辑靶标A的效率的不对称凸起是为了减少工程化多核苷酸的序列中腺苷的数量而形成的不对称凸起。增加编辑靶标A的效率的不对称凸起的非限制性实例是由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的1个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的0个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的2个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的3个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的2个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成的不对称凸起；以及由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的3个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的4个核苷酸形成的不对称凸起。

一方面，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。在一些情况下，结构特征可以是环。在一些实施例中，所述环是内环。如本文所公开的，内环是指在形成dsRNA底物时形成的结构，其中工程化多核苷酸或靶RNA中的核苷酸可以与其在相反链上的位置对应物不互补，并且其中内环的一侧(在dsRNA底物的靶RNA侧或工程化多核苷酸侧上)具有大于5个核苷酸。内环可以是对称内环或不对称内环。在编辑位点附近存在的内环可能有助于待编辑的靶RNA中靶标A的碱基翻转。双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。内环可以是对称内环或不对称内环。在一些实施例中，通过将靶标A定位在两个环之间(例如，基于工程化多核苷酸，定位在5'端环与3'端环之间)来实现对靶标A的选择性编辑。在一些实施例中，两个环均是对称环。在一些实施例中，两个环各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸形成。在一些实施例中，两个环各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。在一些实施例中，两个环各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。在一些实施例中，两个环各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸形成。在一些实施例中，两个环各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸形成。在一些实施例中，两个环各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸形成。在一些实施例中，靶标A位于两个环之间，并且距环(例如，距5'端环或3'端环)至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个或400个核苷酸。在一些实施例中，另外的结构特征位于环之间(例如，5'端环与3'端环之间)。在一些实施例中，环中的错配包括用于在靶RNA中编辑的核苷酸碱基(例如，环中的A/C错配，其中工程化多核苷酸中凸起的部分包括与靶RNA中环部分中的A错配的C，并且A被编辑)。

当在内环的每一侧上可以存在相同数量的核苷酸时，可以形成对称内环。例如，本公开的dsRNA底物中的对称内环可以在dsRNA底物的工程化多核苷酸侧和靶RNA侧上具有相同数量的核苷酸。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸形成。

一方面，双链RNA(dsRNA)底物可以在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。如本文所公开的，内环是指在形成dsRNA底物时形成的结构，其中工程化多核苷酸或靶RNA中的核苷酸与其在相反链上的位置对应物不互补，并且其中内环的一侧(在dsRNA底物的靶RNA侧或工程化多核苷酸侧上)具有大于5个核苷酸。内环可以是对称内环或不对称内环。在编辑位点附近存在的内环可能有助于待编辑的靶RNA中靶标A的碱基翻转。双链RNA(dsRNA)底物在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。内环可以是对称内环或不对称内环。当在内环的每一侧上存在相同数量的核苷酸时，形成对称内环。例如，本公开的dsRNA底物中的对称内环可以在dsRNA底物的工程化多核苷酸侧和靶RNA侧上具有相同数量的核苷酸。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸形成。内环的一侧(在dsRNA底物的靶RNA侧或工程化多核苷酸侧上)可以由5至150个核苷酸形成。内环的一侧可以由5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、120个、135个、140个、145个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个核苷酸或其间的任何数量的核苷酸形成。内环的一侧可以由5个核苷酸形成。内环的一侧可以由10个核苷酸形成。内环的一侧可以由15个核苷酸形成。内环的一侧可以由20个核苷酸形成。内环的一侧可以由25个核苷酸形成。内环的一侧可以由30个核苷酸形成。内环的一侧可以由35个核苷酸形成。内环的一侧可以由40个核苷酸形成。内环的一侧可以由45个核苷酸形成。内环的一侧可以由50个核苷酸形成。内环的一侧可以由55个核苷酸形成。内环的一侧可以由60个核苷酸形成。内环的一侧可以由65个核苷酸形成。内环的一侧可以由70个核苷酸形成。内环的一侧可以由75个核苷酸形成。内环的一侧可以由80个核苷酸形成。内环的一侧可以由85个核苷酸形成。内环的一侧可以由90个核苷酸形成。内环的一侧可以由95个核苷酸形成。内环的一侧可以由100个核苷酸形成。内环的一侧可以由110个核苷酸形成。内环的一侧可以由120个核苷酸形成。内环的一侧可以由130个核苷酸形成。内环的一侧可以由140个核苷酸形成。内环的一侧可以由150个核苷酸形成。内环的一侧可以由200个核苷酸形成。内环的一侧可以由250个核苷酸形成。内环的一侧可以由300个核苷酸形成。内环的一侧可以由350个核苷酸形成。内环的一侧可以由400个核苷酸形成。内环的一侧可以由450个核苷酸形成。内环的一侧可以由500个核苷酸形成。内环的一侧可以由600个核苷酸形成。内环的一侧可以由700个核苷酸形成。内环的一侧可以由800个核苷酸形成。内环的一侧可以由900个核苷酸形成。内环的一侧可以由1000个核苷酸形成。内环可以是对称内环或不对称内环。在编辑位点附近存在的内环可能有助于待编辑的靶RNA中靶标A的碱基翻转。双链RNA(dsRNA)底物在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。内环可以是对称内环或不对称内环。当在内环的每一侧上存在相同数量的核苷酸时，形成对称内环。例如，本公开的dsRNA底物中的对称内环可以在dsRNA底物的工程化多核苷酸侧和靶RNA侧上具有相同数量的核苷酸。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的5至150个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5至150个核苷酸形成，其中在dsRNA靶标的工程化侧和dsRNA底物的靶RNA侧上的核苷酸的数量相同。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的5至1000个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5至1000个核苷酸形成，其中在dsRNA靶标的工程化侧和dsRNA底物的靶RNA侧上的核苷酸的数量相同。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的15个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的15个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的20个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的20个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的30个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的30个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的40个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的40个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的60个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的60个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的70个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的70个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的80个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的80个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的90个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的90个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的110个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的110个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的120个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的120个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的130个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的130个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的140个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的140个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的200个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的250个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的250个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的350个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的350个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的450个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的450个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的600个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的600个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的700个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的700个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的800个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的800个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的900个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的900个核苷酸形成。本公开的对称内环可以由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸形成。

一方面，双链RNA(dsRNA)底物在本公开的工程化多核苷酸与靶RNA杂交时形成。内环可以是对称内环或不对称内环。当在内环的每一侧上存在不同数量的核苷酸时，形成不对称内环。例如，本公开的dsRNA底物中的不对称内环可以在dsRNA底物的工程化多核苷酸侧和靶RNA侧上具有不同数量的核苷酸。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5至150个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5至150个核苷酸形成，其中在dsRNA靶标的工程化侧上的核苷酸的数量与dsRNA底物的靶RNA侧上的核苷酸的数量不同。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5至1000个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的5至1000个核苷酸形成，其中在dsRNA靶标的工程化侧上的核苷酸的数量与dsRNA底物的靶RNA侧上的核苷酸的数量不同。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的10个核苷酸内环形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的9个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的200个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的200个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的50个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的200个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的150个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的200个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的200个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的200个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的200个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的200个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的300个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的300个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的400个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的400个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的500个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的1000个核苷酸形成。本公开的不对称内环可以由dsRNA底物的靶RNA侧上的1000个核苷酸和dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的500个核苷酸形成。在一些实施例中，不对称环增加了编辑靶标A的效率。在一些实施例中，增加编辑靶标A的效率的不对称环是为了减少工程化多核苷酸的序列中腺苷的数量而形成的不对称凸起。增加编辑靶标A的效率的不对称环的非限制性实例是由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的5个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的20个核苷酸形成的不对称环；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的10个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的60个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的80个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的18个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的24个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的100个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的150个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的70个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的75个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的8个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的15个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的45个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的46个核苷酸形成的不对称凸起；由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的45个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的50个核苷酸形成的不对称凸起；以及由dsRNA底物的工程化多核苷酸侧上的7个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的15个核苷酸形成的不对称凸起。

包括凸起或环的结构特征可以是任何大小。在一些情况下，凸起或环包括至少：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个碱基。在一些情况下，凸起或环包括总共至少约1-10个、5-15个、10-20个、15-25个、20-30个、1-30个、1-40个、1-50个、1-60个、1-70个、1-80个、1-90个、1-100个、1-110个、1-120个、1-130个、1-140个、1-150个、1-200个、1-250个、1-300个、1-350个、1-400个、1-450个、1-500个、1-600个、1-700个、1-800个、1-900个、1-1000个、20-50个、20-60个、20-70个、20-80个、20-90个、20-100个、20-110个、20-120个、20-130个、20-140个、20-150个、1-200个、1-250个、1-300个、1-350个、1-400个、1-450个、1-500个、1-600个、1-700个、1-800个、1-900个、1-1000个、30-40个、30-50个、30-60个、30-70个、30-80个、30-90个、30-100个、30-110个、30-120个、30-130个、30-140个、30-150个、30-200个、30-250个、30-300个、30-350个、30-400个、30-450个、30-500个、30-600个、30-700个、30-800个、30-900个、30-1000个、40-50个、40-60个、40-70个、40-80个、40-90个、40-100个、40-110个、40-120个、40-130个、40-140个、40-150个、40-200个、40-250个、40-300个、40-350个、40-400个、40-450个、40-500个、40-600个、40-700个、40-800个、40-900个、40-1000个、50-60个、50-70个、50-80个、50-90个、50-100个、50-110个、50-120个、50-130个、50-140个、50-150个、50-200个、50-250个、50-300个、50-350个、50-400个、50-450个、50-500个、50-600个、50-700个、50-800个、50-900个、50-1000个、60-70个、60-80个、60-90个、60-100个、60-110个、60-120个、60-130个、60-140个、60-150个、60-200个、60-250个、60-300个、60-350个、60-400个、60-450个、60-500个、60-600个、60-700个、60-800个、60-900个、60-1000个、70-80个、70-90个、70-100个、70-110个、70-120个、70-130个、70-140个、70-150个、70-200个、70-250个、70-300个、70-350个、70-400个、70-450个、70-500个、70-600个、70-700个、70-800个、70-900个、70-1000个、80-90个、80-100个、80-110个、80-120个、80-130个、80-140个、80-150个、80-200个、80-250个、80-300个、80-350个、80-400个、80-450个、80-500个、80-600个、80-700个、80-800个、80-900个、80-1000个、90-100个、90-110个、90-120个、90-130个、90-140个、90-150个、90-200个、90-250个、90-300个、90-350个、90-400个、90-450个、90-500个、90-600个、90-700个、90-800个、90-900个、90-1000个、100-110个、100-120个、100-130个、100-140个、100-150个、100-200个、100-250个、100-300个、100-350个、100-400个、100-450个、100-500个、100-600个、100-700个、100-800个、100-900个、100-1000个、110-120个、110-130个、110-140个、110-150个、110-200个、110-250个、110-300个、110-350个、110-400个、110-450个、110-500个、110-600个、110-700个、110-800个、110-900个、110-1000个、120-130个、120-140个、120-150个、120-200个、120-250个、120-300个、120-350个、120-400个、120-450个、120-500个、120-600个、120-700个、120-800个、120-900个、120-1000个、130-140个、130-150个、130-200个、130-250个、130-300个、130-350个、130-400个、130-450个、130-500个、130-600个、130-700个、130-800个、130-900个、130-1000个、140-150个、140-200个、140-250个、140-300个、140-350个、140-400个、140-450个、140-500个、140-600个、140-700个、140-800个、140-900个、140-1000个、150-200个、150-250个、150-300个、150-350个、150-400个、150-450个、150-500个、150-600个、150-700个、150-800个、150-900个、150-1000个、200-250个、200-300个、200-350个、200-400个、200-450个、200-500个、200-600个、200-700个、200-800个、200-900个、200-1000个、250-300个、250-350个、250-400个、250-450个、250-500个、250-600个、250-700个、250-800个、250-900个、250-1000个、300-350个、300-400个、300-450个、300-500个、300-600个、300-700个、300-800个、300-900个、300-1000个、350-400个、350-450个、350-500个、350-600个、350-700个、350-800个、350-900个、350-1000个、400-450个、400-500个、400-600个、400-700个、400-800个、400-900个、400-1000个、500-600个、500-700个、500-800个、500-900个、500-1000个、600-700个、600-800个、600-900个、600-1000个、700-800个、700-900个、700-1000个、800-900个、800-1000个或900-1000个碱基。

在一些情况下，结构特征可以是结构化基序。如本文所公开的，结构化基序包括在dsRNA底物中的两个或更多个结构特征。结构化基序可以包括如上述权利要求中的结构特征的任何组合，以产生用于在精确位置处进行ADAR编辑的理想底物。这些结构基化序可以被人工工程化以使ADAR编辑最大化，和/或这些结构化基序可以被建模以概括已知的ADAR底物。

在一些情况下，工程化多核苷酸包括多核苷酸的至少部分环化。在一些情况下，本文所提供的工程化多核苷酸可以是环化的或呈环状构型的。在一些方面，至少部分地环状的多核苷酸缺少5'羟基或3'羟基。

在一些实施例中，工程化多核苷酸可以包括主链，所述主链包括多个共价连接在一起的糖和磷酸部分。在一些情况下，工程化多核苷酸的主链可以包括在DNA中脱氧核糖或RNA中核糖的5'碳上的磷酸基团中的第一羟基与DNA中脱氧核糖或RNA中核糖的3'碳上的第二羟基之间的磷酸二酯键连接。

在一些实施例中，工程化多核苷酸的主链可以缺少能够暴露于溶剂的5'还原羟基、3'还原羟基或两者。在一些实施例中，工程化多核苷酸的主链可以缺少能够暴露于核酸酶的5'还原羟基、3'还原羟基或两者。在一些实施例中，工程化多核苷酸的主链可以缺少能够暴露于水解酶的5'还原羟基、3'还原羟基或两者。在一些情况下，工程化多核苷酸的主链可以被表示为环状2维格式的多核苷酸序列，其中一个核苷酸在另一个核苷酸之后。在一些情况下，工程化多核苷酸的主链可以被表示为环2维格式的多核苷酸序列，其中一个核苷酸在另一个核苷酸之后。在一些情况下，5'羟基、3'羟基或两者通过磷-氧键连接。在一些情况下，5'羟基、3'羟基或两者被修饰成具有含磷部分的磷酸酯。

主题多核苷酸可以包括修饰。化学修饰可以是取代、插入、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化或其任何组合。在一些情况下，修饰是化学修饰。合适的化学修饰包括以下中的任一者：5'腺苷酸、5'鸟苷-三磷酸帽、5'N7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5'三磷酸帽、3'磷酸、3'硫代磷酸、5'磷酸、5'硫代磷酸、顺式-Syn胸苷二聚体、三聚体、C12间隔子、C3间隔子、C6间隔子、dSpacer、PC间隔子、rSpacer、间隔子18、间隔子9,3'-3'修饰、5'-5'修饰、无碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3'DABCYL、黑洞猝灭剂1、黑洞猝灭剂2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2'脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2'脱氧核糖核苷类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2'-O-甲基核糖核苷类似物、经糖修饰的类似物、摆动/通用碱基、荧光染料标记、2'氟RNA、2'O-甲基RNA、甲基膦酸酯、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、2-O-甲基3硫代磷酸酯或其任何组合。

可以在多核苷酸的任何位置进行修饰。在一些情况下，修饰位于5'端或3'端。在一些情况下，多核苷酸在选自以下的碱基处包括修饰：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150。可以对多核苷酸进行多于一种的修饰。在一些情况下，修饰可以是永久的。在其它情况下，修饰可以是暂时的。在一些情况下，对多核酸进行多种修饰。多核酸修饰可以改变核苷酸的生理化学性质，如其构象、极性、疏水性、化学反应性、碱基配对相互作用或其任何组合。

修饰也可以是硫代磷酸酯取代物。在一些情况下，天然磷酸二酯键可以容易被细胞核酸酶快速降解；并且使用硫代磷酸酯(PS)键取代物的核苷酸间连接的修饰对于通过细胞降解的水解可以更稳定。修饰可以增加多核酸的稳定性。修饰也可以增强生物活性。在一些情况下，硫代磷酸酯增强的RNA多核酸可以抑制RNase A、RNase T1、小牛血清核酸酶或其任何组合。这些性质可以允许PS-RNA多核酸用于体内或体外暴露于核酸酶的可能性高的应用中。例如，硫代磷酸酯(PS)键可以被引入到多核酸的5'端或3'端处的最后3-5个核苷酸之间，这可以抑制核酸外切酶降解。在一些情况下，可以在整个多核酸中添加硫代磷酸酯键，以减少核酸内切酶的攻击。

多核苷酸可以具有任何频率的碱基。例如，多核苷酸可以具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的腺嘌呤百分比。多核苷酸可以具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的胞嘧啶百分比。多核苷酸可以具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的胸腺嘧啶百分比。多核苷酸可具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的鸟嘌呤百分比。多核苷酸可以具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的尿嘧啶百分比。

在一些情况下，多核苷酸可以在修饰后进行质量控制。在一些情况下，质量控制可以包含PAGE、HPLC、MS或其任何组合。在一些情况下，可以确定多核苷酸的质量。质量可以通过LC-MS测定来确定。质量可以是30,000amu、50,000amu、70,000amu、90,000amu、100,000amu、120,000amu、150,000amu、175,000amu、200,000amu、250,000amu、300,000amu、350,000amu、400,000amu至约500,000amu。质量可以是多核苷酸的钠盐的质量。

在一些情况下，可以确定多核苷酸的内毒素水平。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于3EU/mL。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于10EU/mL。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于8EU/mL。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于5EU/mL。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于4EU/mL。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于3EU/mL。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于2EU/mL。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于1EU/mL。内毒素的临床上/治疗上可接受的水平可以低于0.5EU/mL。

在一些情况下，多核苷酸可以进行无菌测试。无菌测试的临床上/治疗上可接受的水平可以是0或在培养物上无生长表示。无菌测试的临床上/治疗上可接受的水平可以是小于0.5％的生长。无菌测试的临床上/治疗上可接受的水平可以是小于1％的生长。

在一些情况下，包括募集序列的多核苷酸中的任一种也可以包括本文所描述的结构特征。

还提供了线性工程化多核苷酸。线性多核苷酸可能基本上缺少本文所提供的结构特征。例如，线性多核苷酸可能缺少结构特征，或者可以具有少于约2个结构特征或部分结构。部分结构可以包括实现如本文所描述的结构特征所需的一部分碱基。

在其它情况下，线性工程化多核苷酸可以包括以下中的任一者：5'羟基、3'羟基或两者这些中的任一个都能够暴露于溶剂并保持线性化。

本文所提供的组合物和方法可以用于调节靶标的表达。调节可以指在不同阶段之一改变基因或其部分的表达，以减轻与基因或基因中的突变相关的疾病或病状。调节可以在转录水平或转录后水平处被介导。调节转录可以纠正由基因中的突变产生的剪接变体的异常表达。在一些情况下，本文所提供的组合物和方法可以用于调节靶标的翻译。调节可以指通过降低转录物的丰度来降低或敲低基因或其部分的表达。降低转录物的丰度可以通过降低转录物的处理、剪接、转换或稳定性；或者通过降低转录物对翻译机器如核糖体的可及性来介导。在一些情况下，本文所描述的工程化多核苷酸可以促进敲低。敲低可以是靶RNA表达的减少。在一些情况下，敲低可以通过mRNA的编辑来实现。在一些情况下，敲低可以通过靶向靶RNA的非翻译区，如3'UTR、5'UTR或两者来实现。在一些情况下，敲低可以通过靶向靶RNA的编码区来实现。在一些情况下，敲低可以由RNA编辑酶(例如，ADAR)介导。在一些情况下，RNA编辑酶可以通过RNA中多个腺苷的水解脱氨作用导致敲低。RNA中多个腺苷的水解脱氨作用可以被称为超编辑。在一些情况下，超编辑可以在顺式(例如，在Alu元件中)或反式(例如通过工程化多核苷酸在靶RNA中)中发生。在一些情况下，RNA编辑酶可以通过编辑靶RNA以包括提前终止密码子或阻止靶RNA翻译的起始(由于靶RNA中的编辑)而导致敲低。

在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的所述工程化多核苷酸用于促进LRRK2 mRNA的编辑：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。在一些实施例中，包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的所述工程化多核苷酸用于促进与LRRK2 mRNA的第6055个核苷酸相对应的核苷酸的编辑：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182，所述LRRK2 mRNA具有SEQ ID NO:6的序列。在一些实施例中，所述工程化多核苷酸包括与SEQ IDNO:183-SEQ ID NO:192中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，包括与SEQ ID NO:183-SEQ ID NO:192中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的所述工程化多核苷酸用于促进SNCA mRNA的编辑。在一些实施例中，包括与SEQ ID NO:183-SEQ ID NO:192中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的所述工程化多核苷酸用于促进SNCA mRNA(例如，如本文所公开的SNCA mRNA)的翻译起始位点(TIS)的编辑。

在一些实施例中，本文所公开的组合物包括工程化多核苷酸。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向LRRK2 mRNA的区(例如，纠正突变)。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向SNCA mRNA的区(例如，导致SNCA的敲低)。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向MAPTmRNA的区。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向PINK1 mRNA的区。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向GBA mRNA的区。在一些实施例中，组合物包括一种或多种不同的工程化多核苷酸。例如，组合物包括靶向LRRK2 mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸。在一些实施例中，组合物包括靶向GBA mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸。在一些实施例中，组合物包括靶向PINK1 mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸。在一些实施例中，组合物包括靶向Tau mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCAmRNA的区的工程化多核苷酸。在一些实施例中，组合物包括靶向LRRK2 mRNA的区的工程化多核苷酸、靶向Tau的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸。

在一些实施例中，一种或多种工程化多核苷酸在相同载体(例如，本文所公开的载体)中编码。在一些实施例中，在相同载体中编码的一种或多种工程化多核苷酸是相同的工程化多核苷酸(例如，靶向LRRK2 mRNA的相同的区)。在一些实施例中，在相同载体中编码的一种或多种工程化多核苷酸是不同的工程化多核苷酸(例如，靶向LRRK2mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸)。在一些实施例中，两种、三种、四种或五种不同的工程化多核苷酸在相同载体中编码。在一些实施例中，一种或多种工程化多核苷酸在载体中独立地编码。

合适的靶标

本文所提供的组合物和方法可以用于靶向合适的RNA多核苷酸和其部分。在一些情况下，合适的RNA包括非蛋白编码区、蛋白编码区或两者。示例性非蛋白编码区包含但不限于3'非翻译区(3'UTR)、5'非翻译区(5'UTR)，poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)或其任何组合。

在一些情况下，用于靶向的合适的RNA包含但不限于：前体mRNA、前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA、小RNA和其任何组合。

示例性靶标可以包括富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)、α-突触核蛋白(SNCA)、葡糖神经酰胺酶β(GBA)、PTEN诱导的激酶1(PINK1)、Tau、其变体、其突变的版本、这些中的任一种的生物活性片段和其组合。

富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)

富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)与帕金森氏病和克罗恩氏病等免疫相关病症的家族病例和散发病例有关。其别名包含LRRK2、AURA17、DARDARIN、PARK8、RIPK7、ROCO2或富含亮氨酸重复序列激酶2。LRRK2基因由51个外显子构成并编码预测分子量为约286kDa的2527个氨基酸蛋白。编码的产物是具有激酶和GTP酶活性的多结构域蛋白。LRRK2可以在各种组织和器官中发现，所述组织和器官包含但不限于肾上腺、阑尾、骨髓、脑、结肠、十二指肠、子宫内膜、食道、脂肪、胆囊、心脏、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脾脏、胃、睾丸、甲状腺和膀胱。LRRK2可以广泛表达，但通常在脑、肾脏和肺组织中更为丰富。在细胞层面，LRRK2已经在星形胶质细胞、内皮细胞、小神经胶质细胞、神经元和外周免疫细胞中发现。

LRRK2中已鉴定出超过100多种氨基酸突变；通过分离分析，已示出其中的六种-G2019S、R1441C/G/H、Y1699C和I2020T可导致帕金森氏病。G2019S和R1441C是遗传病例中最常见的致病突变。在散发病例中，这些突变示出了年龄依赖性外显率：当年龄从50岁增加到70岁时，携带导致疾病发生的G2019S突变的个体百分比从17％跃升至85％。在一些情况下，携带突变的个体永远不会患上所述疾病。

在其催化核心，LRRK2含有复合蛋白质的Ras(Roc)、ROC的C末端(COR)和激酶结构域。多个蛋白质-蛋白质相互作用结构域侧接此核心：在由C末端WD40结构域连接的N末端中发现了犰狳重复序列(ARM)区、锚蛋白重复序列(ANK)区和富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域。G2019S突变位于激酶结构域内。已示出其能增加激酶活性。R1441C/G/H和Y1699C突变可以降低Roc结构域的GTPase活性。全基因组关联研究发现，LRRK2中的常见变异会增加发生散发性帕金森氏病的风险。虽然其中一些变异是影响蛋白质的结合或催化活性的非保守突变，但其它变异会调节其表达。这些结果表明特异性等位基因或单倍型可以调节LRRK2的表达。

促炎信号上调了各种免疫细胞类型中的LRRK2表达，从而表明LRRK2是免疫应答中的关键调节因子。研究发现，全身和中枢神经系统(CNS)炎症都与帕金森氏病的症状有关。此外，与帕金森氏病相关的LRRK2突变调节其对炎性刺激应答的表达水平。LRRK2中的许多突变与免疫相关病症，如炎症性肠病(例如，克罗恩氏病)相关。例如，G2019S和N2081D两者均增加了LRRK2的激酶活性，并且在特定人群中的克罗恩氏病患者中表现过度。由于LRRK2在这些病症中的关键作用，所以其是帕金森氏病和克罗恩氏病的重要治疗靶标。具体地，许多突变，如包含G2019S的点突变在这些疾病的发生中发挥作用，从而使得LRRK2成为有吸引力的治疗策略，如RNA编辑。

LRRK2由表1的mRNA序列编码。在一些情况下，可以利用本文所提供的组合物靶向LRRK2的区。在一些情况下，LRRK2 mRNA的外显子或内含子的至少一部分可以被如本文所描述的工程化多核苷酸靶向。在一些实施例中，LRRK2 mRNA的非编码序列的区的至少一部分，如5'UTR和3'UTR可以被如本文所描述的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，编辑5'UTR的核苷酸碱基可以导致调节靶RNA的翻译，如编码LRRK2多肽的多核苷酸。在其它情况下，LRRK2 mRNA的编码序列的区可以被如本文所描述的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，本文所描述的工程化多核苷酸靶向的区包括来自靶RNA的区，其中所述靶RNA包括与SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:14中任一个的至少80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。在一些情况下，本文所描述的工程化多核苷酸靶向的区包括来自靶RNA的区，其中所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中任一个的100％序列同一性。靶RNA的合适的区包含但不限于重复序列结构域、复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、激酶结构域、WD40结构域和Roc的C末端(COR)结构域和其组合。在一些方面，靶RNA的合适的靶区可以位于LRRK2的激酶结构域中。在一些实施例中，靶RNA的区是长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个或400个核苷酸的任何区，所述区来自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中任一个。在一些实施例中，如本文所描述的工程化多核苷酸与来自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个的如本文所描述的区具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％互补性。

在一些情况下，LRRK2基因的外显子被如本文所描述的工程化多核苷酸靶向。例如，靶RNA的合适的靶区可以包括LRRK2的外显子41。外显子41中的核苷酸密码子与突变有关，所述突变包括位于外显子41编码的蛋白激酶结构域内的甘氨酸至丝氨酸取代(G2019S)。

在一实施例中，可以利用本文所提供的组合物和方法靶向特异性核苷酸残基。与如表1中所提供的野生型序列相比，特异性核苷酸残基可以包括点突变。在一些情况下，靶核苷酸残基可以是SEQ ID NO:6的LRRK2 mRNA的位置6190。因此，在一些实施例中，工程化多核苷酸例如靶向包括SEQ ID NO:6的位置6190的核苷酸残基的区。在一些实施例中，工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。

表1：人LRRK2 mRNA同种型序列。从NCBI LRRK2基因ID：120892获得序列；组装GRCh38.p13(GCF_000001405.39)；NC_000012.12(40224890..40369285)

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在一些方面，来自编码LRRK2多肽序列的RNA序列的区被如本文所公开的工程化多核苷酸靶向。由先前提供的同种型编码的示例性LRRK2多肽序列如在表2中所示出的。编码来自表2的任何同种型的多核苷酸序列的任何核苷酸可以被如本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，可以利用本文所提供的组合物和方法靶向编码与同种型1相关的序列的2,521个残基中的任一个残基的核苷酸。在一些情况下，靶核苷酸可以编码位于同种型1的核苷酸残基1-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900、1901-2000、2001-2100、2101-2200、2201-2300、2301-2400、2401-2500、2501-2521中的氨基酸残基。

表2：与表1中所提供的同种型相关的人LRRK2多肽序列

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具体地，LRRK2多肽突变G2019S被认为在一些种族的帕金森氏病中发挥重要作用。所述突变可以是常染色体显性突变，并且已经估计所述突变的终生外显率为约31.8％。在人基因组中，导致此错义突变的SNP被注释为rs34637584，并且是基因组水平处的G至A取代(6055G>A)。此LRRK2突变可以被称为G2019S或6055G>A，并且在chr12:40734202处或附近发现。研究表明，G2019S突变会增加LRRK2激酶活性，并且在蛋白的激活结构域或蛋白激酶样结构域内发现。在一些情况下，利用本文所提供的组合物进行纠正的靶氨基酸残基可以是SEQ ID NO:15的LRRK2多肽的残基2019。因此，本文所公开的工程化多核苷酸可以靶向包括编码核苷酸密码子的序列的靶RNA的区，所述核苷酸密码子编码SEQ ID NO:15的LRRK2多肽的氨基酸残基2019。可以利用本文所提供的组合物和方法逆转的另外的示例性氨基酸残基突变在表3中示出。因此，本文所公开的工程化多核苷酸可以靶向包括编码核苷酸密码子的序列的靶RNA的区，所述核苷酸密码子编码如在表3中所示出的氨基酸残基突变。在一些实施例中，本文所公开的工程化多核苷酸有助于编辑编码氨基酸残基突变，如表3中所示出的氨基酸残基突变的密码子的核苷酸。在一些实施例中，编码氨基酸残基突变的密码子的核苷酸的编辑在翻译经编辑的密码子时产生经纠正的氨基酸残基。

表3：LRRK2同种型1中的示例性蛋白质突变和可以靶向的对应的外显子

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α-突触核蛋白(SNCA)

α-突触核蛋白是家族性帕金森氏病的主要致病基因。其别名包含NACP、PARK1、PARK4、PD1、突触核蛋白α或SNCA。α-突触核蛋白基因由5个外显子构成并编码预测分子量为约14.5kDa的140个氨基酸蛋白。编码产物是具有未知功能的内在无序蛋白。通常，α-突触核蛋白是单体。在某些应力条件或其他未知原因下，α-突触核蛋白自聚集成低聚物。α-突触核蛋白在脑中高度表达，但在肾上腺、阑尾、骨髓、结肠、十二指肠、子宫内膜、食道、脂肪、胆囊、心肾、肝脏、肺、淋巴结、卵巢、胎盘、前列腺、皮肤、甲状腺、膀胱、骨骼肌和胰腺中也有发现。在脑中，α-突触核蛋白位于神经元的突触前末端，并与其它蛋白质和磷脂相互作用。α-突触核蛋白的结构域结构包括N末端A2脂质结合α-螺旋结构域、非淀粉样蛋白β组分(NAC)结构域和C末端酸性结构域。脂质结合结构域由五个KXKEGV不完全重复序列构成。NAC结构域由具有VGGAVVTGV共有序列的GAV基序和三个GXXX亚基序构成，其中X是Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser或Met中的任一个。C末端酸性结构域含有具有DPDNEA共有序列的铜结合基序。分子上，α-突触核蛋白被认为在神经元传递和DNA修复中发挥作用。

α-突触核蛋白的病理聚集是一组疾病的定义性特征，所述疾病包含帕金森氏病、帕金森氏病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩(MSA)和单纯性自主神经衰竭(PAF)。五种错义突变—A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E和A53T—是家族性帕金森氏病的致病因素。这些突变位于两个α-螺旋区的N末端。其它错义突变，如A18T、A29S和A53V，也被证明与帕金森氏病有关。此外，全基因组关联研究已将α-突触核蛋白中的许多多态性鉴定为帕金森氏病的风险因素。拷贝数变异，如重复，也常见于许多患者中，并且在一些帕金森氏病病例中为体细胞突变。

α-突触核蛋白可以形成“朊病毒样”聚集体，并且通过连接的神经元网络扩散。LRRK2 G2019S突变已示出可促进小鼠和人模型两者中的α-突触核蛋白聚集。在体外LRRK2被敲除的神经元中，α-突触核蛋白聚集也减少。α-突触核蛋白与LRRK2之间的强遗传相互作用效应及其在帕金森氏病中的重要作用表明，其是组合疗法的有效候选靶标。

在一些情况下，可以利用本文所提供的组合物靶向α-突触核蛋白的区。在一些情况下，α-突触核蛋白mRNA的区可以被本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，α-突触核蛋白mRNA的外显子或内含子的区可以被本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在一些实施例中，α-突触核蛋白mRNA的非编码序列的区，如5'UTR和3'UTR可以被本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在其它情况下，α-突触核蛋白mRNA的编码序列的区可以被本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，多核苷酸包括可以与表4的序列的至少一部分杂交的靶向序列。在一些情况下，多核苷酸包括可以与序列的至少一部分杂交的靶向序列，所述序列的至少一部分包括与表4的序列的至少约80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。在一些实施例中，多核苷酸包括可以与序列的至少一部分杂交的靶向序列，所述序列的至少一部分包括与表4的序列的至少约80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。在其它情况下，SNCA mRNA的编码序列的区可以被如本文所描述的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，本文所描述的工程化多核苷酸靶向的区包括来自靶RNA的区，其中所述靶RNA包括与表4的序列的至少约80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。在一些情况下，本文所描述的工程化多核苷酸靶向的区包括来自靶RNA的区，其中所述靶RNA包括与表4的序列的100％序列同一性。合适的区包含但不限于N末端A2脂质结合α-螺旋结构域、非淀粉样蛋白β组分(NAC)结构域、氨基酸磷酸化/糖基化位点或C末端酸性结构域。在一些实施例中，靶RNA的区是长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个或400个核苷酸的任何区，所述区来自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个。在一些实施例中，如本文所描述的工程化多核苷酸与来自表4的序列的如本文所描述的区具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％互补性。

在一些情况下，可以利用本文所提供的组合物靶向α-突触核蛋白的区。在一些情况下，α-突触核蛋白mRNA的区可以用本文所公开的用于敲低的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，α-突触核蛋白mRNA的外显子或内含子的区可以被本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在一些实施例中，α-突触核蛋白mRNA的非编码序列的区，如5'UTR和3'UTR可以被本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在其它情况下，α-突触核蛋白mRNA的编码序列的区可以被本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，多核苷酸包括可以与表4的序列的至少一部分或区杂交的靶向序列。在一些情况下，多核苷酸包括可以与序列的至少一部分或区杂交的靶向序列，所述序列的至少一部分包括与表4的序列的至少约80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。在其它情况下，SNCA mRNA的编码序列的区可以被如本文所描述的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，本文所描述的工程化多核苷酸靶向的区包括来自靶RNA的区，其中所述靶RNA包括与表4的序列的至少约80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。在一些情况下，本文所描述的工程化多核苷酸靶向的区包括来自靶RNA的区，其中所述靶RNA包括与表4的序列的100％序列同一性。合适的区包含但不限于N末端A2脂质结合α-螺旋结构域、非淀粉样蛋白β组分(NAC)结构域或C末端酸性结构域。在一些实施例中，靶RNA的一部分或区是长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个或400个核苷酸的任何部分或任何区，所述部分或区来自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个。在一些实施例中，如本文所描述的工程化多核苷酸与来自表4的序列的如本文所描述的区具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％互补性。

在一些方面，α-突触核蛋白mRNA序列被如本文所公开的工程化多核苷酸靶向。示例性全mRNA序列在表4中示出。在一些情况下，可以利用本文所提供的组合物和方法靶向序列的3,177个核苷酸中的任一个。在一些情况下，α-突触核蛋白mRNA的靶核苷酸可以位于核苷酸1-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900、1901-2000、2001-2100、2101-2200、2201-2300、2301-2400、2401-2500、2501-2600、2601-2700、2701-2800、2801-2900、2901-3000、3001-3100和/或3101-3177中。

表4：人α-突触核蛋白mRNA同种型序列。源自与基因ID 6622对应的NCBI SNCA序列的序列；组装GRCh38.p13(GCF_000001405.39)；NC_000004.12(89724099..89838324，补体)。

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在一些情况下，可以利用本文所提供的组合物靶向α-突触核蛋白多肽的区。合适的区包含但不限于N末端A2脂质结合α-螺旋结构域、非淀粉样蛋白β组分(NAC)结构域或C末端酸性结构域。

在一些情况下，靶残基可以位于残基1-10、10-20、20-40、40-60、60-80、80-100、100-120或120-140、其重叠部分和其组合中。

在一些方面，来自编码α-突触核蛋白多肽序列的RNA序列的区被如本文所公开的工程化多核苷酸靶向。由如本文所公开的工程化多核苷酸靶向的mRNA序列编码的示例性α-突触核蛋白多肽序列在表5中示出。编码表5的肽的多核苷酸序列的任何核苷酸可以被如本文所公开的工程化多核苷酸靶向。在一些情况下，靶核苷酸可以编码位于表5的肽的残基1-10、10-20、20-40、40-60、60-80、80-100、100-120或120-140、其重叠部分和其组合中。

表5：与表4的同种型相关的人α-突触核蛋白(SNCA)多肽序列

在一些实施例中，本文所公开的工程化多核苷酸有助于编辑编码残基突变，如表6中所示出的残基突变的密码子的核苷酸。在一些实施例中，编码残基突变的密码子的核苷酸的编辑在翻译经编辑的密码子时产生经纠正的残基。

可以利用本文所提供的组合物靶向的示例性区可以包含但不限于外显子2或外显子3。因此，本文所公开的工程化多核苷酸可以靶向包括编码外显子2或外显子3的序列的靶RNA的区。在一些情况下，编码SNCA多肽序列的氨基酸残基的密码子的靶核苷酸是以下氨基酸残基中的任一个：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139和/或140。

在一些实施例中，本文所公开的工程化多核苷酸有助于编码氨基酸残基突变的密码子的核苷酸的编辑，所述氨基酸残基突变如SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的α-突触核蛋白多肽的位置30、46或53处的氨基酸残基。在其它情况下，编码氨基酸残基突变残基的密码子的核苷酸可以是位置49(外显子3)或位置136(外显子6)处的氨基酸，或位置534(3'UTR)或位置926(3'UTR)处的核苷酸。这些氨基酸残基突变列于表6中。在一些实施例中，本文所公开的工程化多核苷酸有助于编辑编码氨基酸残基突变，如表6中所示出的氨基酸残基突变的密码子的核苷酸。在一些实施例中，编码氨基酸残基突变的密码子的核苷酸的编辑在翻译经编辑的密码子时产生经纠正的氨基酸残基。在一些实施例中，工程化多核苷酸促进SNCA mRNA的翻译起始位点(TIS)的编辑(例如，编辑ATG密码子的A)。在一些实施例中，TIS的编辑使得来自经编辑的SNCA mRNA的SNCA多肽的表达被敲低。

表6：与来自表5中的相关多肽序列的所提供的错义、无义和移码突变相关的SNCA外显子。

SNCA的区	蛋白质突变
		外显子2	A30P
外显子3	E46K；A53T

Tau

Tau蛋白(Tau-p)由Tau-MAPT的六种mRNA同种型编码。Tau-p是微管结合蛋白，其对微管的稳定性和运输很重要。其主要在CNS的神经元中表达。过度磷酸化的突变Tau蛋白在人脑中聚集成神经纤维缠结(NFT)导致一组称为Taupathies的神经退行性疾病，包含帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆症(FTD)、慢性创伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹和皮质基底节变性。Tau蛋白也可以与阿尔茨海默氏病相关，蛋白水解Tau切割片段也可以直接神经毒性。因此，大量减少Tau形成的多重策略对于有效治疗神经退行性疾病非常重要。

在一实施例中，可以利用本文所提供的组合物和方法靶向特异性核苷酸。示例性Tau mRNA序列在表7中示出。在一些情况下，靶核苷酸可以位于靶序列的任何位置。在一些情况下，靶核苷酸可以位于Tau mRNA的核苷酸残基1-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900、1901-2000、2001-2100、2101-2200、2201-2300、2301-2400、2401-2500、2501-2600、2601-2700、2701-2800、2801-2900、2901-3000、3001-3100、3101-3200、3201-3300、3301-3400、3401-3500、3501-3600、3601-3700、3701-3800、3801-3900、3901-4000、4001-4100、4101-4200、4201-4300、4301-4400、4401-4500、4501-4600、4601-4700、4701-4800、4801-4900、4901-5000、5001-5100、5101-5200、5201-5300、5301-5400、5401-5500、5501-5600、5601-5700、5701-5800、5801-5900、5901-6000、6001-6100、6101-6200、6201-6300、6301-6400、6401-6500、6501-6600和/或6601-6644或其任何组合中。在一些实施例中，工程化多核苷酸促进MAPT mRNA的翻译起始位点(TIS)的编辑(例如，编辑ATG密码子的A)。在一些实施例中，TIS的编辑导致来自经编辑的MAPT mRNA的Tau多肽的表达被敲低。

表7：人MAPT mRNA同种型序列。从NCBI MAPT基因ID：4137获得序列；组装GRCh38.p13(GCF_000001405.39)；NC_000017.11(45894538..46028334)

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PTEN诱导的激酶1(PINK1)

PINK1编码线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其广泛表达，其中在心脏、肌肉和睾丸中表达最高。其在应激期间保护线粒体功能、线粒体质量控制、线粒体分裂和线粒体流动性方面发挥作用。在神经系统中，PINK1也被线粒体处理并释放以调节神经元分化。此基因的突变已被证明会导致路易体的形成，并导致一种形式的常染色体隐性帕金森氏病。

在一实施例中，可以利用本文所提供的组合物和方法靶向特异性核苷酸残基。示例性全PINK1 mRNA序列在表8中示出。在一些情况下，靶核苷酸残基可以位于利用本文所提供的组合物和方法可以靶向的序列的2,657个核苷酸残基的任何位置。在一些情况下，靶核苷酸残基可以位于PINK1 mRNA的核苷酸残基1-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900、1901-2000、2001-2100、2101-2200、2201-2300、2301-2400、2401-2500、2501-2600、2601-2657或其任何组合中。

在一些实施例中，工程化多核苷酸促进PINK1 mRNA的翻译起始位点(TIS)的编辑(例如，编辑ATG密码子的A)。在一些实施例中，TIS的编辑导致来自经编辑的PINK1mRNA的PINK1多肽的表达被敲低。

表8：人PINK1 mRNA同种型序列。从NCBI PINK1基因ID：65018获得序列；组装GRCh38.p13(GCF_000001405.39)；NC_000001.11(20633458..20651511)

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葡糖神经酰胺酶β(GBA)

GBA，也称为β-葡糖脑苷脂酶，编码参与糖脂代谢的溶酶体膜相关酶。GBA在膜生物发生期间切割葡糖脑苷脂的β-葡萄糖苷键。GBA蛋白含有三个结构域(I、II和II)。结构域I是催化活性所必需的。结构域III与底物结合并含有活性位点。GBA基因突变引起的缺陷突变与帕金森氏病和高雪氏病有关。假设GBA的功能增益突变可以促进α-突触核蛋白的聚集，而功能丧失突变可能影响α-突触核蛋白的处理和清除。

在一实施例中，可以利用本文所提供的组合物和方法靶向特异性核苷酸残基。示例性全GBA mRNA序列在表9中示出。在一些情况下，靶核苷酸残基可以位于利用本文所提供的组合物和方法可以靶向的序列的2,344个核苷酸残基的任何位置。在一些情况下，靶核苷酸残基可以位于GBA mRNA的核苷酸残基1-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900、1901-2000、2001-2100、2101-2200、2201-2300、2301-2344或其任何组合中。在一些实施例中，工程化多核苷酸促进GBAmRNA的翻译起始位点(TIS)的编辑(例如，编辑ATG密码子的A)。在一些实施例中，TIS的编辑导致来自经编辑的GBA mRNA的GBA多肽的表达被敲低。

表9：人GBA mRNA同种型序列。从NCBI GBA基因ID：2629获得序列；组装GRCh38.p13(GCF_000001405.39)；NC_000001.11(155234452..155244627，补体)

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LRRK2的基因组编辑

在一些实施例中，可以使用基因组编辑来改变LRRK2基因。基因组编辑可以包括CRISPR/Cas相关蛋白、RNA向导的核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、这些中的任一个的功能部分、这些中的任一个的融合蛋白或其任何组合。在一些实施例中，CRISPR/Cas相关蛋白可以包括CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些实施例中，CRISPR/Cas相关蛋白可包含可以包括1类或2类CRISPR/Cas蛋白。2类CRISPR/Cas相关蛋白可以包括II型CRISPR/Cas蛋白、V型CRISPR/Cas蛋白、VI型CRISPR/Cas蛋白。CRISPR/Cas相关蛋白可以包括Cas9蛋白、Cas 12蛋白、Cas13蛋白、这些蛋白中的任一种的功能部分、这些蛋白中的任一种的融合蛋白或其任何组合。CRISPR/Cas相关蛋白可以包括野生型或变体CRISPR/Cas相关蛋白、这些蛋白中的任一种的功能部分、这些蛋白中的任一种的融合蛋白或其任何组合。CRISPR/Cas相关蛋白可以包括碱基编辑器。碱基编辑器可以包括胞苷脱氨酶、脱氧腺苷脱氨酶、这些中的任一个的功能部分、这些中的任一个的融合蛋白或其任何组合。CRISPR/Cas相关蛋白可以包括逆转录酶。逆转录酶可以包括莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶或禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶。

如本文所描述的CRISPR/Cas相关蛋白通过其结合的向导RNA靶向基因组中的特异性靶DNA序列。向导RNA包括与靶DNA内的靶序列互补的序列，因此将结合的CRISPR/Cas蛋白靶向靶DNA内的具体位置(靶序列)。当靶向特异性靶DNA序列时，CRISPR/Cas相关蛋白可以在基因组中产生单链断裂、两条单链断裂、双链断裂、两条双链断裂或其任何组合。当CRISPR/Cas相关蛋白靶向特异性靶DNA序列时，可能不会在基因组中产生任何断裂。CRISPR/Cas相关蛋白向导RNA复合物可以在基因组中形成钝端双链断裂、1碱基对(bp)交错切口、2-bp交错切口、具有多于2个的碱基对的交错切口或其任何组合。双链DNA断裂可以通过末端连接机制或同源定向修复来修复。双链DNA断裂还可以通过末端连接机制或具有双链供体DNA或单链寡核苷酸供体DNA的同源定向修复来修复。基因组中的编辑可以包括随机或预选的插入、缺失、碱基取代、倒位、染色体易位、插入。

向导RNA可以包括单向导RNA(sgRNA)、双向导RNA或工程化主要编辑向导RNA(pegRNA)。向导RNA可以包括crRNA和tracrRNA。crRNA可以包括与靶DNA或基因座中的靶序列杂交的靶向序列。tracrRNA可以包括可以形成茎环结构的序列。此类茎环结构可以结合CRISPR/Cas相关蛋白以激活CRISPR/Cas相关蛋白的核酸酶活性。sgRNA可以在一个RNA分子中包括crRNA和tracrRNA。双向导RNA可以在两个RNA分子中包括crRNA和tracrRNA。pegRNA可以包括包括基因组中的预选编辑或序列的序列。在此类编辑中，预选序列与带切口的/切割DNA链的切割和释放的3'端杂交以形成引物-模板复合物，其中带切口的/切割DNA链的切割、释放和杂交的3'端可以充当引物，而pegRNA的预选编辑或序列可以充当后续反应的模板，包含但不限于逆转录。

载体

本文所提供的组合物(例如，工程化多核苷酸)可以通过任何合适的方式递送。在一些情况下，合适的方式包括载体。可以使用任何载体系统，包含但不限于：质粒载体、微环载体、线性DNA载体、狗骨载体(doggy bone vectors)、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、脂质体、纳米颗粒、外泌体、细胞外囊泡、纳米网、其经修饰的版本、其良好生产实践版本、其嵌合体和其任何组合。在一些情况下，载体可以用于引入本文所提供的多核苷酸。在一些实施例中，纳米颗粒载体可以包括基于聚合物的纳米颗粒、基于氨基脂的纳米颗粒、金属纳米颗粒(如基于金的纳米颗粒)、这些中的任一个的一部分或其任何组合。在一些情况下，通过载体递送的多核苷酸(例如，工程化多核苷酸)包括与本文所提供的靶RNA的区杂交的靶向序列。

本文所提供的载体可以用于递送本文所提供的多核苷酸组合物。在一些情况下，使用单个载体递送至少约2个、3个、4个或至多5个多核苷酸。在一些情况下，使用单个载体递送至少约2个、3个、4个或至多5个不同的多核苷酸。在一些情况下，使用单个载体递送至少约2个、3个、4个或至多5个相同的多核苷酸。在一些情况下，递送多个载体。在一些情况下，多个载体递送可以是并流或按顺序的。

载体可以用于递送核酸。载体可以包括DNA，如双链DNA或单链DNA。载体可以包括RNA。在一些情况下，RNA可以包括碱基修饰。载体可以包括重组载体。载体可以是从天然存在的载体修饰的载体。载体可以包括非天然存在的载体的至少一部分。可以利用任何载体。病毒载体可以包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、逆转录病毒载体、这些载体中的任一个的一部分或其任何组合。在一些情况下，载体可以包括AAV载体。载体可以经修饰以包含经修饰的VP蛋白(如经修饰以包含VP1蛋白、VP2蛋白或VP3蛋白的AAV载体)。一方面，AAV载体是重组AAV(rAAV)载体。rAAV可以由与野生型AAV(wtAAV)中发现的基本上相似的衣壳序列和结构组成。然而，rAAV包封了基本上没有AAV蛋白编码序列的基因组，并在其位置设计了治疗基因表达盒，如主题多核苷酸。在一些情况下，病毒来源的序列可以是ITR，在载体生产期间可能需要所述ITR来指导基因组复制和包装。合适的AAV载体可以选自任何AAV血清型或血清型的组合。例如，AAV载体可以是以下中的任一个：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68或其任何组合。在一些情况下，基于其自然取向选择载体。在一些情况下，基于其跨血脑屏障的能力选择载体血清型。AAV9和AAV10已被证明能够跨血脑屏障以转导神经元和胶质细胞。一方面，AAV载体是AAV2、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9。在一些情况下，AAV载体是至少两种血清型的嵌合体。一方面，AAV载体是血清型AAV2和AAV5。在一些情况下，嵌合AAV载体包括来自AAV2的rep和ITR序列以及来自AAV5的帽序列。在一些情况下，嵌合AAV载体包括来自AAV2的rep和ITR序列以及来自任何其它AAV血清型的帽序列。在一些实施例中，AAV载体可以是自互补的。在一些情况下，AAV载体可以包括反向末端重复序列。在其它情况下，AAV载体可以包括具有突变的末端解链位点的反向末端重复(scITR)序列。在一些情况下，可以将来自本文所提供的所有不同AAV血清型的rep、帽和ITR序列混合并匹配。在一些情况下，AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。在一些情况下，载体可以是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。在一些情况下，AAV载体包括包括含来自第一AAV血清型的复制基因和反向末端重复序列以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白的基因组。在一些情况下，AAV载体可以是嵌合的，并且可以是：AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。在一些情况下，AAV载体的反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。在一些情况下，突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。在一些情况下，合适的AAV载体可以被进一步修饰以涵盖如在衣壳或rep蛋白中的修饰。修饰还可以包含缺失、插入、突变和其组合。在一些情况下，对载体进行修饰以降低免疫原性，从而允许重复给药。在一些情况下，当进行重复给药以降低和/或消除免疫原性时，所使用的载体的血清型发生变化。

在一些实施例中，AAV载体可以包括每个病毒基因组2至6个拷贝的工程化多核苷酸。在一些情况下，AAV载体可以包括每个病毒基因组1至2个、1至3个、1至4个、1至5个、1至6个、1至7个、1至8个、1至9个、1至10个、2至3个、2至4个、2至5个、2至6个、2至7个、2至8个、2至9个或2至10个拷贝。在一些情况下，AAV载体可以包括每个病毒基因组1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个拷贝。在一些实施例中，AAV载体可以包括每个病毒基因组1至5个、1至10个、1至15个、1至20个、1至25个、1至30个、1至35个、1至40个、1至45个或1至50个拷贝。

载体可以通过向受试者施用，通常通过全身施用(例如，静脉内、器官实质内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部施涂或其组合来体内递送。可以进行各种施用。在一些情况下，载体的施用进行1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。还可以调节施用频率。一方面，本文所提供的载体每小时、每天、每周、每月、每两个月、每年、每两年或每2年、每4年、每6年或每8年施用一次。

在一些情况下，本文所提供的载体可以整合到受试者的基因组中。这可以用于实现转基因表达和/或多肽表达的延长表达。

本文所提供的载体可以用于转染靶细胞。靶细胞可以在身体的任何组织和器官中找到。在一些情况下，在与疾病相关的组织或器官中发现靶细胞。疾病可以是CNS疾病或胃肠道疾病。在一些情况下，疾病可以是帕金森氏病和/或克罗恩氏病。在一些情况下，疾病可以是路易体痴呆、多系统萎缩(MSA)、戈谢病、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆症(FTD)、慢性创伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹或皮质基底节变性。

用于治疗帕金森氏病的合适的靶细胞可以包含神经元或神经胶质细胞。用于治疗帕金森氏病的合适的靶神经元可以包含多巴胺能(DA)神经元或去甲肾上腺素(NE)神经元。用于治疗帕金森氏病的合适的靶多巴胺能神经元可以包含腹侧中脑中的多巴胺能神经元。用于治疗帕金森氏病的合适的靶多巴胺能神经元还可以包含A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、Aaq或端脑组多巴胺能神经元。用于治疗帕金森氏病的合适的靶神经胶质细胞可以包含星形胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、寡树突胶质细胞、卫星细胞或施万细胞(Schwann cells)。用于治疗帕金森氏病的合适的靶小胶质细胞可以包含致密的、纵向分支的或径向分支的小胶质细胞。

用于治疗克罗恩氏病的合适的靶细胞是：树突细胞、嗜酸性粒细胞、上皮内淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞或T-reg细胞。

在一些情况下，经受处理的细胞可以包括人细胞。在一些情况下，经受处理的细胞可以包括白细胞。在一些实施例中，经受处理的细胞可以包括淋巴细胞。在一些情况下，经受处理的细胞可以包括T细胞。在一些情况下，经受处理的细胞可以包括辅助性CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、记忆T细胞、调节性CD4+T细胞、自然杀伤T细胞、粘膜相关T细胞、γδT细胞或其任何组合。在一些实施例中，经受处理的细胞可以包括B细胞。在一些情况下，经受处理的细胞可以包括浆母细胞、浆细胞、淋巴浆细胞样细胞、记忆B细胞、滤泡B细胞、边缘区B细胞、B-1细胞、调节性B细胞或其任何组合。

用于治疗CNS疾病的合适的靶细胞可以包含神经元或神经胶质细胞。

在一些情况下，用本文所描述的编码多核苷酸和/或裸多核苷酸的任何载体的靶细胞的转染效率或编辑效率可以是或可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％。转染效率或编辑效率可以通过评估疾病负担来确定。转染效率还可以通过评估疾病症状的减轻来确定。在一些情况下，编辑效率可以是治疗有效的，这意味着编辑达到可以导致经治疗的受试者的表型改变的水平。表型改变可以包括通过与突变相关的症状的水平测量的疾病的减轻或消除。

非病毒载体方法

在一些情况下，本文所提供的组合物可以在没有载体的情况下递送。非病毒方法可以包括裸递送包括多核苷酸等的组合物。在一些情况下，本文所提供的修饰可以被掺入到多核苷酸中，以在作为裸多核苷酸递送时增加稳定性并对抗降解。在其它情况下，非病毒方法可以利用纳米颗粒、脂质体等。

使用方法

本文所提供的组合物可以用于本文所提供的方法中。在一些情况下，方法包括至少部分地预防、减轻和/或治疗疾病或病状，或疾病或病状的症状。本公开的方法可以在受试者中进行。受试者可以是人或非人。受试者可以是哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、牛、狗、猪、绵羊、马)。受试者可以是脊椎动物或无脊椎动物。受试者可以是实验动物。受试者可以是患者。受试者可能患有疾病。受试者可以表现出疾病的症状。受试者可以不表现出疾病的症状，但仍然患有疾病。受试者可以在护理人员的医疗护理下(例如，受试者住院并由医生治疗)。

在一些情况下，疾病属是中枢神经系统(CNS)疾病。示例性CNS疾病可以是帕金森氏病。

帕金森氏病是一种影响运动系统的进行性退行性病症。早期症状包括震颤、僵硬、运动缓慢和行走困难。也可能出现认知和行为问题。痴呆在疾病的晚期变得很常见。其它症状包括抑郁症、焦虑以及感觉、睡眠和情绪问题。目前，尚无治愈方法。帕金森氏病的病因不明，但涉及遗传和环境因素。其它风险因素包括年龄和性别。

帕金森氏病的诊断可以基于震颤或四肢和下颌的无意识和有节奏的运动等症状；四肢、肩膀或颈部的肌肉僵硬或不自然；自发运动的丧失；自动运动的丧失；姿势；不稳定的行走或平衡；抑郁症；或痴呆。医生可以评估病史和神经系统检查。磁共振成像(MRI)、正电子发射型计算机断层显象(PET)和单光子发射计算机断层显象(SPECT)扫描，如多巴胺转运体扫描(DaTscan)也可以用于支持诊断。

帕金森氏病可以通过统一帕金森氏病评定量表(UPDRS)、Hoehn和Yahr分期或Schwab和England日常生活活动能力评定进行监测。

在一些实施例中，工程化多核苷酸用于治疗帕金森氏病。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向LRRK2 mRNA的区(例如，纠正突变)。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向SNCA mRNA的区(例如，导致SNCA的敲低)。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向MAPT mRNA的区。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向PINK1 mRNA的区。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向GBA mRNA的区。在一些实施例中，一种或多种不同的工程化多核苷酸用于治疗帕金森氏病。例如，靶向LRRK2 mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸用于治疗帕金森氏病。在一些实施例中，靶向GBA mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸用于治疗帕金森氏病。在一些实施例中，靶向PINK1mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸用于治疗帕金森氏病。在一些实施例中，靶向Tau mRNA的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸用于治疗帕金森氏病。在一些实施例中，靶向LRRK2 mRNA的区的工程化多核苷酸、靶向Tau的区的工程化多核苷酸和靶向SNCA mRNA的区的工程化多核苷酸用于治疗帕金森氏病。

在一些情况下，疾病是胃肠道(GI)疾病。示例性GI疾病可以是克罗恩氏病。克罗恩氏病是一种影响GI道的炎症性肠病。克罗恩氏病会引起消化道的炎症，从而导致腹痛、疲劳、发热、腹泻、营养不良、口腔溃疡和体重减轻。克罗恩氏病的病因不明；环境、免疫系统和微生物群等因素被认为与此有关。克罗恩氏病目前尚无已知的治愈方法。风险因素包含年龄、种族、遗传、非甾体抗炎药和吸烟。

克罗恩氏病的诊断可以基于血液检测、结肠镜检查、计算机断层显象(CT)扫描、MRI、胶囊内镜检查或气囊辅助小肠镜检查。

克罗恩氏病可以通过质量指标进行监测。克罗恩氏病的质量指标可以包括美国胃肠病学会的问责措施、克罗恩氏病和结肠炎基金会的改善措施、Grupode Trabajoen Enfermedad de Crohn y Colitis ulcerosa(西班牙国家IBD学会)的IBD卓越中心(西班牙)、与国际健康结果测量联合会的国际倡议一致、加拿大质量改善措施的加拿大IBD的度量或“明智选择”的5项劣质护理过程措施(加拿大)。克罗恩氏病的质量指标还可以包括美国胃肠病学协会(AGA)IBD绩效指标、克罗恩氏病和结肠炎基金会(CCFA)过程和结果测量指标、国际健康结果测量联合会IBD标准集、ImproveCareNow或IBD Qorus。

在一些实施例中，工程化多核苷酸用于治疗克罗恩氏病。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向LRRK2 mRNA的区(例如，纠正突变)。

在一些实施例中，工程化多核苷酸用于治疗路易体痴呆。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向LRRK2 mRNA的区。

在一些实施例中，工程化多核苷酸用于治疗多系统萎缩(MSA)。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向SNCA的区。

在一些实施例中，工程化多核苷酸用于治疗高雪氏病。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向GBA mRNA的区。

在一些实施例中，工程化多核苷酸用于治疗Tau蛋白病(Taupathy)。在一些实施例中，工程化多核苷酸用于治疗阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆症、慢性创伤性脑病、进行性核上性麻痹或皮质基底节变性。在一些实施例中，工程化多核苷酸靶向MAPT mRNA的区。

在一些情况下，疾病或病状与编码ABCA4、AAT、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、APP、Tau、GBA、PINK1、RAB7A、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894G>A、PCSK9起始位点或SCNN1A起始位点的DNA分子或RNA分子、这些中的任一个的片段或其任何组合中的突变相关。在一些实例中，由编码ABCA4、AAT、SERPINA1、SERPINA1E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、APP、Tau、GBA、PINK1、RAB7A、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894G>A、PCSK9起始位点或SCNN1A起始位点的突变的DNA分子或RNA分子、这些中的任一个的片段或其任何组合编码的蛋白质至少部分地导致疾病的发病或进展。在一些实例中，DNA或RNA分子中的突变与其它方面相同的参考DNA或RNA分子有关。

药物组合物

本文所提供的组合物和方法可以利用药物组合物。全文所描述的组合物可以被调配成药物并且用于治疗被诊断患有疾病的有需要的人或哺乳动物。在一些情况下，药物组合物可以预防性地使用。

本公开的载体可以以任何合适的剂量施用于受试者。合适的剂量可以是至少约5x10⁷至50×10¹³基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是至少约5x 10⁷、6x 10⁷、7x 10⁷、8x 10⁷、9x 10⁷、10x 10⁷、11x 10⁷、15x 10⁷、20x 10⁷、25x 10⁷、30x 10⁷或50x 10⁷基因组拷贝/mL。在一些实施例中，合适的剂量可以是约5x 10⁷至6x 10⁷、6x 10⁷至7x 10⁷、7x10⁷至8x 10⁷、8x 10⁷至9x 10⁷、9x 10⁷至10x 10⁷、10x 10⁷至11x 10⁷、11x 10⁷至15x 10⁷、15x10⁷至20x 10⁷、20x 10⁷至25x 10⁷、25x 10⁷至30x 10⁷、30x10⁷至50x 10⁷或50x 10⁷至100x10⁷基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是约5x 10⁷至10x 10⁷、10x 10⁷至25x10⁷或25x 10⁷至50x 10⁷基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是至少约5x 10⁸、6x 10⁸、7x 10⁸、8x 10⁸、9x 10⁸、10x10⁸、11x 10⁸、15x 10⁸、20x 10⁸、25x 10⁸、30x 10⁸或50x10⁸基因组拷贝/mL。在一些实施例中，合适的剂量可以是约5x 10⁸至6x 10⁸、6x 10⁸至7x10⁸、7x 10⁸至8x 10⁸、8x 10⁸至9x 10⁸、9x 10⁸至10x 10⁸、10x 10⁸至11x 10⁸、11x 10⁸至15x10⁸、15x 10⁸至20x 10⁸、20x 10⁸至25x 10⁸、25x 10⁸至30x 10⁸、30x 10⁸至50x 10⁸或50x 10⁸至100x 10⁸基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是约5x 10⁸至10x 10⁸、10x10⁸至25x 10⁸或25x 10⁸至50x 10⁸基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是至少约5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、10×10⁹、11×10⁹、15×10⁹、20×10⁹、25×10⁹、30×10⁹或50×10⁹基因组拷贝/mL。在一些实施例中，合适的剂量可以是约5×10⁹至6×10⁹、6×10⁹至7×10⁹、7×10⁹至8×10⁹、8×10⁹至9×10⁹、9×10⁹至10×10⁹、10×10⁹至11×10⁹、11×10⁹至15×10⁹、15×10⁹至20×10⁹、20×10⁹至25×10⁹、25×10⁹至30×10⁹、30×10⁹至50×10⁹或50×10⁹至100×10⁹基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是约5×10⁹至10×10⁹、10×10⁹至25×10⁹或25×10⁹至50×10⁹基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是至少约5x 10¹⁰、6x 10¹⁰、7x 10¹⁰、8x 10¹⁰、9x 10¹⁰、10x 10¹⁰、11x 10¹⁰、15x 10¹⁰、20x 10¹⁰、25x 10¹⁰、30x 10¹⁰或50x 10¹⁰基因组拷贝/mL。在一些实施例中，合适的剂量可以是约5x10¹⁰至6x 10¹⁰、6x 10¹⁰至7x 10¹⁰、7x 10¹⁰至8x 10¹⁰、8x 10¹⁰至9x 10¹⁰、9x 10¹⁰至10x 10¹⁰、10x 10¹⁰至11x 10¹⁰、10x 10¹⁰至15x 10¹⁰、15x 10¹⁰至20x 10¹⁰、20x 10¹⁰至25x 10¹⁰、25x10¹⁰至30x 10¹⁰、30x 10¹⁰至50x 10¹⁰或50x 10¹⁰至100x 10¹⁰基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是约5x 10¹⁰至10x 10¹⁰、10x 10¹⁰至25x 10¹⁰或25x 10¹⁰至50x 10¹⁰基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是至少约5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹、9×10¹¹、10×10¹¹、11×10¹¹、15×10¹¹、20×10¹¹、25×10¹¹、30×10¹¹或50×10¹¹基因组拷贝/mL。在一些实施例中，合适的剂量可以是约5×10¹¹至6×10¹¹、6×10¹¹至7×10¹¹、7×10¹¹至8×10¹¹、8×10¹¹至9×10¹¹、9×10¹¹至10×10¹¹、10×10¹¹至11×10¹¹、11×10¹¹至15×10¹¹、15×10¹¹至20×10¹¹、20×10¹¹至25×10¹¹、25×10¹¹至30×10¹¹、30×10¹¹至50×10¹¹或50×10¹¹至100×10¹¹基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是约5×10¹¹至10×10¹¹、10×10¹¹至25×10¹¹或25×10¹¹至50×10¹¹基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是至少约5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²、9×10¹²、10×10¹²、11×10¹²、15×10¹²、20×10¹²、25×10¹²、30×10¹²或50×10¹²基因组拷贝/mL。在一些实施例中，合适的剂量可以是约5×10¹²至6×10¹²、6×10¹²至7×10¹²、7×10¹²至8×10¹²、8×10¹²至9×10¹²、9×10¹²至10×10¹²、10×10¹²至11×10¹²、11×10¹²至15×10¹²、15×10¹²至20×10¹²、20×10¹²至25×10¹²、25×10¹²至30×10¹²、30×10¹²至50×10¹²或50×10¹²至100×10¹²基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是约5×10¹²至10×10¹²、10×10¹²至25×10¹²或25×10¹²至50×10¹²基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是至少约5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³、9×10¹³、10×10¹³、11×10¹³、15×10¹³、20×10¹³、25×10¹³、30×10¹³或50×10¹³基因组拷贝/mL。在一些实施例中，合适的剂量可以是约5×10¹³至6×10¹³、6×10¹³至7×10¹³、7×10¹³至8×10¹³、8×10¹³至9×10¹³、9×10¹³至10×10¹³、10×10¹³至11×10¹³、11×10¹³至15×10¹³、15×10¹³至20×10¹³、20×10¹³至25×10¹³、25×10¹³至30×10¹³、30×10¹³至50×10¹³或50×10¹³至100×10¹³基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是约5×10¹³至10×10¹³、10×10¹³至25×10¹³或25×10¹³至50×10¹³基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是至少约5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³、9×10¹³、10×10¹³、11×10¹³、15×10¹³、20×10¹³、25×10¹³、30×10¹³或50×10¹³基因组拷贝/mL。在一些实施例中，合适的剂量可以是约5×10¹³至6×10¹³、6×10¹³至7×10¹³、7×10¹³至8×10¹³、8×10¹³至9×10¹³、9×10¹³至10×10¹³、10×10¹³至11×10¹³、11×10¹³至15×10¹³、15×10¹³至20×10¹³、20×10¹³至25×10¹³、25×10¹³至30×10¹³、30×10¹³至50×10¹³或50×10¹³至100×10¹³基因组拷贝/mL。在一些情况下，合适的剂量可以是约5×10¹³至10×10¹³、10×10¹³至25×10¹³或25×10¹³至50×10¹³基因组拷贝/mL。

在一些情况下，向个体施用的病毒颗粒的剂量可以是任何至少约1x 10⁷至约1x10¹³基因组拷贝/kg体重。在一些实施例中，向个体施用的病毒颗粒的剂量可以是1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷、4x10⁷、5x10⁷、6x10⁷、7x10⁷、8x10⁷或9x10⁷基因组拷贝/kg体重。在一些实施例中，向个体施用的病毒颗粒的剂量可以是1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸基因组拷贝/kg体重。在一些实施例中，向个体施用的病毒颗粒的剂量可以是1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹或9×10⁹基因组拷贝/kg体重。在一些实施例中，向个体施用的病毒颗粒的剂量可以是1x10¹⁰、2x10¹⁰、3x10¹⁰、4x10¹⁰、5x10¹⁰、6x10¹⁰、7x10¹⁰、8x10¹⁰或9x10¹⁰基因组拷贝/kg体重。在一些实施例中，向个体施用的病毒颗粒的剂量可以是1×10¹¹、2×10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹或9×10¹¹基因组拷贝/kg体重。在一些实施例中，向个体施用的病毒颗粒的剂量可以是1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²或9×10¹²基因组拷贝/kg体重。在一些实施例中，向个体施用的病毒颗粒的剂量可以是1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³或9×10¹³基因组拷贝/kg体重。

在一些情况下，本文所提供的组合物与二级疗法结合使用、在二级疗法之前、期间和/或之后使用。二级疗法可以与本文所提供的疾病如CNS和/或GI疾病的治疗相关。

在一些情况下，帕金森氏病采用二级疗法。帕金森氏病的治疗可以包括药物治疗、外科手术、改变生活方式或物理疗法。药物可以增加或取代多巴胺。例如，左旋多巴可以是多巴胺的前体。其可以与卡比多巴一起服用，所述卡比多巴可以保护左旋多巴在脑外早期转化为多巴胺。卡比多巴-左旋多巴可以口服或直接向小肠输注。多巴胺激动剂，如普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、罗替戈汀(rotigotine)和阿朴吗啡(apomorphine)模拟多巴胺作用。多巴胺激动剂可以口服或注射。单胺氧化酶B抑制剂，如司来吉兰(selegiline)、雷沙吉兰(rasagiline)、沙芬酰胺(safinamide)可以抑制脑多巴胺的分解。儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂，如恩他卡朋(entacapone)和托卡朋(tolcapone)可以通过抑制多巴胺的分解来延长左旋多巴疗法的效果。还可以使用抗胆碱能药物，如苯托品(benztropine)和苯海索(trihexyphenidyl)以及金刚烷胺。益生菌治疗，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可以用于治疗帕金森氏病患者。外科手术可以包括深部脑刺激，如打开弹出的对话框深部脑刺激。电极可以植入大脑中并与发生器连接，所述发生器可以向大脑发送电脉冲，以减少帕金森氏病症状。在一些情况下，二级疗法包括深部脑刺激。

在一些情况下，克罗恩氏病采用二级疗法。克罗恩氏病的治疗可以包括药物治疗、营养疗法或外科手术。药物可以包括抗炎药物、免疫系统抑制剂、抗生素或其它药物。抗炎药物可以包括皮质类固醇和5-氨基水杨酸盐。皮质类固醇可以包括泼尼松(prednisone)和布地奈德(budesonide)(Entocort EC)。5-氨基水杨酸盐可以包括柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)或氨水杨酸(mesalamine)。免疫系统抑制剂可以包括硫唑嘌呤(azathioprine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、甲氨蝶呤(methotrexate)、那他珠单抗(natalizumab)、维多珠单抗(vedolizumab)或优特克单抗(ustekinumab)。抗生素可以包括环丙沙星(ciprofloxacin)或甲硝唑(metronidazole)。药物还可以包括抗腹泻药、止痛药、铁补充剂、维生素B-12补充剂、钙补充剂或维生素D补充剂。抗腹泻药可以包括纤维补充剂或洛哌丁胺(loperamide)。纤维补充剂可以包括洋车前子壳粉(psyllium powder)或甲基纤维素。止痛药可以包括对乙酰氨基酚。止痛药可以不包括布洛芬(ibuprofen)或萘普生钠(naproxen sodium)。营养疗法可以包括肠内营养或肠外营养。营养疗法可以与本文所提到的药物组合。外科手术可以包括去除消化道的受损部分并重新连接健康部分。外科手术可以包括闭合瘘管或引流脓肿。

二级疗法可以以任何合适的剂量施用。在一些情况下，剂量包括：受试者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、或至多约1000mg/m²。这些剂量可以每天、每周、每月或每年施用。这些剂量可以施用一次或多次。

在一些情况下，本文所提供的药物组合物或二级疗法可以通过任何途径单独施用或与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用，并且此类施用可以以单剂量和多剂量进行。更具体地，药物组合物可以与各种药学上可接受的惰性载体以片剂、胶囊、糖锭、锭剂、水果硬糖、粉剂、喷雾剂、水性悬浮液、可注射溶液、酏剂、糖浆剂等形式组合。此类载体包含固体稀释剂或填充剂、无菌水介质和各种无毒有机溶剂等。此外，此类口服药物调配物可以通过通常用于此类目的的类型的各种药剂适当地增甜和/或调味。

本文所公开的组合物的施用或施涂可以进行持续至少约至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天或100天的连续或非连续天数的治疗持续时间。在一些情况下，治疗持续时间可以是约1天至约30天、约2天至约30天、约3天至约30天、约4天至约30天、约5天至约30天、约6天至约30天、约7天至约30天、约8天至约30天、约9天至约30天、约10天至约30天、约11天至约30天、约12天至约30天、约13天至约30天、约14天至约30天、约15天至约30天、约16天至约30天、约17天至约30天、约18天至约30天、约19天至约30天、约20天至约30天、约21天至约30天、约22天至约30天、约23天至约30天、约24天至约30天、约25天至约30天、约26天至约30天、约27天至约30天、约28天至约30天或约29天至约30天。本文所公开的组合物的施用或施涂可以进行持续至少约1周、至少约1个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约15年、至少约20年或更长时间的治疗持续时间。施用可以在受试者一生中重复进行，如在受试者的一生中每月施用一次或每年施用一次。施用可以在受试者生命的大部分时间内重复进行，如每月施用一次或每年施用一次，持续至少约1年、5年、10年、15年、20年、25年、30年或更长时间。

在一些情况下，本文所公开的组合物的施用或施涂可以每天进行至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次或24次。在一些情况下，本文所公开的组合物的施用或施涂可以每周进行至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次或21次。在一些情况下，本文所公开的组合物的施用或施涂可以每月进行至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次、25次、26次、27次、28次、29次、30次、31次、32次、33次、34次、35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次、45次、46次、47次、48次、49次、50次、51次、52次、53次、54次、55次、56次、57次、58次、59次、60次、61次、62次、63次、64次、65次、66次、67次、68次、69次、70次、71次、72次、73次、74次、75次、76次、77次、78次、79次、80次、81次、82次、83次、84次、85次、86次、87次、88次、89次或90次。

在一些情况下，组合物可以以单剂量或分剂量施用/施涂。在一些情况下，本文所描述的组合物可以在第一时间点和第二时间点施用。在一些情况下，可以施用组合物，使得第一次施用在另一次施用之前被施用，其中施用时间的差异为1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、4天、7天、2周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长时间。

在一些实施例中，本文所公开的组合物可以呈单位剂型或多剂型。例如，本文所描述的药物组合物可以呈单位剂型。如本文所使用的，单位剂型是指物理上离散的单位，其适于向人或非人受试者(例如，宠物、家畜、非人灵长类等)施用并单独包装。每个单位剂量可以含有预定数量的活性成分，所述活性成分可以足以与药物载体、稀释剂、赋形剂或其任何组合一起产生所期望的治疗效果。单位剂型的实例可以包含安瓿、注射器以及单独包装的片剂和胶囊。在一些情况下，单位剂型可以被包括在食物，例如巧克力中。在一些情况下，单位剂型可以以其分数或倍数施用。多剂型可以是包装在单个容器中的多个相同的单位剂型，其可以以分离的单位剂型施用。多剂型的实例可以包含小瓶、瓶装片剂或胶囊、瓶装软糖或以品脱或加仑为单位的瓶子。在一些情况下，多剂型可以包括不同的药物活性剂。在一些实施例中，单位剂型可以是一人份。在一些情况下，多剂型可以具有多于约：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或200个一人份。在一些实施例中，多剂型可以具有小于约：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或200个一人份。在一些情况下，多剂型可以具有约：1个一人份至约200个一人份、1个一人份至约20个一人份、5个一人份至约50个一人份、10个一人份至约100个一人份或约30个一人份至约150个一人份。

本文所描述的组合物可以包括赋形剂。赋形剂可以包括低温防腐剂，如DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其任何组合。赋形剂可以包括低温防腐剂，如蔗糖、海藻糖、淀粉、这些中的任一个的盐、这些中的任一个的衍生物或其任何组合。赋形剂可以包括pH剂(以使组合物的组分的氧化或降解最小化)、稳定剂(以防止组合物的组分的改性或降解)、缓冲剂(以增强温度稳定性)、增溶剂(以增加蛋白质溶解度)或其任何组合。赋形剂可以包括表面活性剂、糖、氨基酸、抗氧化剂、盐、非离子型表面活性剂、增溶剂、甘油三酯、醇或其任何组合。赋形剂可以包括碳酸钠、乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白(HSA)、山梨醇、蔗糖、海藻糖、聚山梨醇酯80、磷酸钠、蔗糖、磷酸二钠、甘露醇、聚山梨醇酯20、组氨酸、柠檬酸盐、白蛋白、氢氧化钠、甘氨酸、柠檬酸钠、海藻糖、精氨酸、乙酸钠、乙酸盐、HCl、乙二胺四乙酸二钠、卵磷脂、甘油、黄原胶橡胶、大豆异黄酮、聚山梨醇酯80、乙醇、水、替普瑞酮(teprenone)或其任何组合。赋形剂可以是《药用赋形剂手册(Handbook ofPharmaceutical Excipients)》,美国制药协会(American Pharmaceutical Association)(1986)中所描述的赋形剂。

合适的赋形剂的非限制性实例可以包含缓冲剂、防腐剂、稳定剂、结合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、增味剂、甜味剂、着色剂。在一些情况下，赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例可以包含柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。可以在药物调配物中使用碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其它钙盐或其组合作为缓冲剂。

赋形剂可以包括防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例可以包含抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。抗氧化剂可以进一步包含但不限于EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和N-乙酰基半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂可以包含井冈霉素A(validamycin A)、TL-3、正钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、二异丙基氟磷酸酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、颗粒酶抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗菌剂、氧化酶抑制剂或其它抑制剂。

药物调配物可以包括作为赋形剂的结合剂。合适的结合剂的非限制性实例可以包含淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、低聚糖和其组合。

可以在药物调配物中使用的结合剂可以选自淀粉，马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖类，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糊精；天然和合成树胶；明胶；纤维素衍生物，如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇，如山梨糖醇、木糖醇、甘露醇、水或其组合。

药物调配物可以包括作为赋形剂的润滑剂。合适的润滑剂的非限制性实例可以包含硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、氢化蓖麻油、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁以及轻矿物油。可以在药物调配物中使用的润滑剂可以选自金属硬脂酸盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山嵛酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属月桂基硫酸盐(如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石或其组合。

在一些情况下，药物调配物可以包括作为赋形剂的分散增强剂。合适的分散剂的非限制性实例可以包含作为高HLB乳化剂表面活性剂的淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、经纯化的木质纤维素、羟基乙酸淀粉钠、异无定形硅酸盐和微晶纤维素。

在一些实施例中，药物调配物可以包括作为赋形剂的崩解剂。在一些情况下，崩解剂可以是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例可以包含淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉，甜味剂，粘土，如膨润土，微晶纤维素，海藻酸盐，羟基乙酸淀粉钠，胶，如琼脂、瓜尔胶、槐豆胶、卡那亚胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施例中，崩解剂可以是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例可以包含碳酸氢钠与柠檬酸的组合以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

药物组合物可以包括稀释剂。稀释剂的非限制性实例可以包含水、甘油、甲醇、乙醇和其它类似的生物相容性稀释剂。在一些情况下，稀释剂可以是酸的水溶液，如乙酸、柠檬酸、马来酸、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸或类似物。在其它情况下，稀释剂可以选自包括以下的组：碱金属碳酸盐如碳酸钙；碱金属磷酸盐如磷酸钙；碱金属硫酸盐如硫酸钙；纤维素衍生物如纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素；氧化镁、糊精、果糖、右旋糖、棕榈酸甘油酯、乳糖醇、胆碱、乳糖、麦芽糖、甘露醇、二甲基硅油、山梨糖醇、淀粉、预胶化淀粉、滑石、木糖醇和/或无水化合物、水合物和/或其药学上可接受的衍生物或其组合。

药物组合物可以包括载体。载体可以是天然存在的或非天然存在的载体、惰性的(例如，可检测的药剂或标记)或活性的，如佐剂、稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包含药学上可接受的载体。载体还可以包含药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包含单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生糖，如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合存在，单独或组合占重量或体积的1-99.99％。示例性蛋白质赋形剂包含血清白蛋白如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲能力中起作用的代表性氨基酸组分、抗体组分或两者包含丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。在本技术的范围内也可预期碳水化合物赋形剂，其实例包含但不限于单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(山梨醇)和肌醇。

治疗(treating)或治疗(treatment)可以包括获得所期望的药理作用、生理作用或其任何组合。在一些情况下，治疗可以逆转由疾病或病状引起的不良影响。在一些情况下，治疗可以稳定疾病或病状。在一些情况下，治疗可以延缓疾病或病状的进展。在一些情况下，治疗可以导致疾病或病状的消退。在一些情况下，治疗可以至少部分地预防这些中的任一个的疾病、病状或症状的发生。在一些实施例中，可以测量治疗的效果。在一些情况下，可以在施用组合物之前和之后比较测量结果。例如，与治疗后的图像相比，受试者可以具有治疗前的医学图像，以示出癌症消退。在一些情况下，与治疗前的血液检测相比，受试者在治疗后的血液检测结果可能有所改善。在一些情况下，可以将测量结果与标准值进行比较。

试剂盒

本文所描述的任何组合物都可以包括在试剂盒中。在非限制性实例中，试剂盒中可以包括载体、多核苷酸、肽、产生本文所提供的多核苷酸的试剂和其任何组合。在一些情况下，试剂盒组分以合适的容器装置提供。

试剂盒可以包括适当等分的组合物。试剂盒的组分可以以水介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置将通常包含组分可以放置于其中并且优选地是适当等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。当试剂盒中存在多于一种组分时，试剂盒通常还将含有另外的组分可以单独放置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然而，小瓶中可以包括组分的各种组合。试剂盒通常还包含一种用于以紧密封闭的方式容纳组分以供商业销售的装置。此类容器可以包含将期望的小瓶保留在其中的注射或吹气模制的塑料容器。

然而，试剂盒的组分也可以作为干燥粉末提供。当试剂和/或组分以干燥粉末的形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重组粉末。设想了也可以在另一个容器装置中提供溶剂。

在一些实施例中，试剂盒可以包括如本文所公开的工程化多核苷酸(例如，工程化向导RNA)、前体工程化多核苷酸(例如，前体工程化向导RNA)、包括工程化多核苷酸(例如，工程化向导RNA或前体工程化向导RNA)的载体、或工程化多核苷酸的核酸(例如，工程化向导RNA或前体工程化向导RNA)、或药物组合物和容器。在一些情况下，容器可以是塑料、玻璃、金属或其任何组合。

在一些情况下，包括本文所描述的组合物的包装产品可以被正确地标记。在一些情况下，可以根据良好制造规范(cGMP)和标签规定制造本文所描述的药物组合物。在一些情况下，本文所公开的药物组合物可以是无菌的。

尽管本文中已经示出并且描述了优选实施例，但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，此类实施例仅作为实例提供。本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和取代。应当理解，可以采用本文所描述的实施例的各种替代方案。预期的是以下权利要求限定范围以及本文覆盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

带编号的实施例#1

实施例1.一种工程化多核苷酸，其包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA的所述区：(a)至少部分地编码：富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽、α-突触核蛋白(SNCA)多肽、葡糖神经酰胺酶β(GBA)多肽、PTEN诱导的激酶1(PINK1)多肽或Tau多肽；(b)包括接近(a)的序列；或(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成至少部分地募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA缔合时促进：所述靶RNA的所述区的多核苷酸的核苷酸的碱基的编辑；所述LRRK2多肽、所述SNCA多肽、所述GBA多肽、所述PINK1多肽的表达的调节；或其组合。

实施例2.根据实施例1所述的工程化多核苷酸，其包括(b)，其中与至少部分地编码所述LRRK2多肽、所述SNCA多肽、所述GBA多肽、所述PINK1多肽或Tau多肽的所述靶RNA的所述区接近的序列包括3'非翻译区(3'UTR)的至少一部分。

实施例3.根据实施例1所述的工程化多核苷酸，其包括(b)，其中与至少部分地编码所述LRRK2多肽、所述SNCA多肽、所述GBA多肽、所述PINK1多肽或Tau多肽的所述靶RNA的所述区接近的序列包括5'非翻译区(5'UTR)的至少一部分。

实施例4.根据实施例3所述的工程化多核苷酸，其中所述5'UTR的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽、所述SNCA多肽、所述GBA多肽、所述PINK1多肽或所述Tau多肽的基因翻译。

实施例5.根据实施例3所述的工程化多核苷酸，其中所述5'UTR的区的多核苷酸的核苷酸的碱基的编辑导致促进调节以下的mRNA翻译：所述LRRK2多肽、所述SNCA多肽、所述GBA多肽、所述PINK1多肽或所述Tau多肽。

实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区至少部分地编码所述LRRK2多肽。

实施例7.根据实施例6所述的工程化多核苷酸，其中至少部分地编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA的所述区包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。

实施例8.根据实施例6至7中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。

实施例9.根据实施例1至5中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区至少部分地编码所述SNCA多肽，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述SNCA多肽的表达。

实施例10.根据实施例1至5中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区至少部分地编码所述GBA多肽，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述GBA多肽的表达。

实施例11.根据实施例1至5中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区至少部分地编码所述PINK1多肽，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述PINK1多肽的表达。

实施例12.根据实施例1至5中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区至少部分地编码所述Tau多肽，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述Tau多肽的表达。

实施例13.根据实施例1至12中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶向序列的长度为约：40个、60个、80个、100个或120个核苷酸。

实施例14.根据实施例13所述的工程化多核苷酸，其中所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。

实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的工程化多核苷酸，其中与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。

实施例16.根据实施例15所述的工程化多核苷酸，其中不互补的所述至少一个核苷酸是腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。

实施例17.根据实施例1至16中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。

实施例18.根据实施例17所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA是mRNA。

实施例19.根据实施例6至7中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区包括至少部分地编码以下的区：所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。

实施例20.根据实施例19所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区包括至少部分地编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域的区。

实施例21.根据实施例18所述的工程化多核苷酸，其中与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。

实施例22.根据实施例21所述的工程化多核苷酸，其中所述突变包括多态性。

实施例23.根据实施例1至22中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。

实施例24.根据实施例23所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。

实施例25.根据实施例24所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。

实施例26.根据实施例1至25中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。

实施例27.根据实施例26所述的工程化多核苷酸，其包括所述ADAR多肽或其生物活性片段，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。

实施例28.根据实施例23至25中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。

实施例29.根据实施例28所述的工程化多核苷酸，其中所述GluR2序列包括与SEQID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。

实施例30.根据实施例29所述的工程化多核苷酸，其中所述GluR2序列包括SEQ IDNO:1。

实施例31.根据实施例1至22中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。

实施例32.根据实施例1至31中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括：凸起、发夹、内环、结构化基序和其任何组合。

实施例33.根据实施例32所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括所述凸起。

实施例34.根据实施例33所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起是不对称凸起。

实施例35.根据实施例33所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起是对称凸起。

实施例36.根据实施例33至35中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起的长度为1-29个核苷酸。

实施例37.根据实施例32所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括所述发夹。

实施例38.根据实施例32所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括所述内环。

实施例39.根据实施例32所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括所述结构化基序。

实施例40.根据实施例39所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。

实施例41.根据实施例40所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。

实施例42.根据实施例40所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。

实施例43.根据实施例1至42中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括主链，所述主链包括共价连接在一起的多个糖和磷酸部分，并且其中所述主链包括5'还原羟基、3'还原羟基或两者。

实施例44.根据实施例43所述的工程化多核苷酸，其中所述主链中的所述5'还原羟基中的每一个通过磷酸二酯键与所述3'还原羟基中的每一个连接。

实施例45.根据实施例1至42中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括主链，所述主链包括多个共价连接在一起的糖和磷酸部分，并且其中所述主链缺少5'还原羟基、3'还原羟基或两者。

实施例46.根据实施例1至40中任一项所述的工程化多核苷酸，其中当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。

实施例47.根据实施例41所述的工程化多核苷酸，其中所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链体。

实施例48.根据实施例6至8中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶向序列能够与至少部分地编码LRRK2多肽序列的RNA至少部分地结合，所述LRRK2多肽序列包括与由BLAST测定的SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少一部分的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。

实施例49.根据实施例48所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少一部分的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72。

实施例50.根据实施例1至49中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。

实施例51.根据实施例1至50中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。

实施例52.根据实施例51所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括所述RNA。

实施例53.一种工程化多核苷酸，其包括与靶RNA的区至少部分地杂交的靶向序列，其中所述靶RNA的所述区：

(a)至少部分地编码选自由以下组成的组的多肽:α-突触核蛋白(SNCA)、葡糖神经酰胺酶β(GBA)、PTEN诱导的激酶1(PINK1)和Tau；

(b)包括接近(a)的序列；或

(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成：促进RNA编辑实体对所述靶RNA的所述区的多核苷酸的核苷酸的碱基的编辑；促进调节所述SNCA、所述GBA、所述PINK1、所述Tau的表达；或其组合。

实施例54.根据实施例53所述的工程化多核苷酸，其包括调节SNCA、GBA、PINK1或Tau的表达，其中所述调节导致编码所述SNCA、所述GBA、所述PINK1或所述Tau的多肽的表达减少。

实施例55.一种载体，其包括：(a)根据实施例1至52中任一项所述的工程化多核苷酸；(b)根据实施例53至54中任一项所述的工程化多核苷酸；或(c)(a)和(b)两者。

实施例56.根据实施例55所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

实施例57.根据实施例56所述的载体，其中所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。

实施例58.根据实施例57所述的载体，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。

实施例59.根据实施例57至58中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。

实施例60.根据实施例57至59中任一项所述的载体，其中所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。

实施例61.根据实施例59至60中任一项所述的载体，其中所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。

实施例62.根据实施例61所述的载体，其中所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。

实施例63.一种呈单位剂型的药物组合物，所述药物组合物包括：(a)根据实施例1至52中任一项所述的工程化多核苷酸；(b)根据实施例53至54中任一项所述的工程化多核苷酸、根据实施例55至62中任一项所述的载体或其任何组合；以及(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

实施例64.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将根据实施例1至54中任一项所述的工程化多核苷酸与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合。

实施例65.一种分离的细胞，其包括根据实施例1至54中任一项所述的工程化多核苷酸、根据实施例55至62中任一项所述的载体或两者。

实施例66.一种试剂盒，其在容器中包括根据实施例1至54中任一项所述的工程化多核苷酸、根据实施例55至62中任一项所述的载体或两者。

实施例67.一种制备试剂盒的方法，所述方法包括将根据实施例1至54中任一项所述的工程化多核苷酸、根据实施例55至62中任一项所述的载体或两者加入容器中。

实施例68.一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：(a)根据实施例55至62中任一项所述的载体；(b)根据实施例63所述的药物组合物；或(c)(a)和(b)。

实施例69.一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：包括或编码工程化多核苷酸的载体，其中所述工程化多核苷酸包括与靶RNA的区至少部分地杂交的靶向序列，其中所述靶RNA的所述区：(a)至少部分地编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；(b)包括接近(a)的序列；或(c)包括(a)和(b)，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成促进RNA编辑实体对所述靶RNA的所述区的多核苷酸的核苷酸的碱基的编辑，调节所述LRRK2多肽的表达，或其任何组合；由此治疗或预防有需要的受试者中的所述疾病或病状。

实施例70.根据实施例69所述的方法，其中所述靶RNA的所述区包括接近(a)的序列。

实施例71.根据实施例70所述的方法，其中所述接近(a)的序列包括3'非翻译区(3'UTR)的至少一部分。

实施例72.根据实施例70所述的方法，其中所述接近(a)的序列包括5'非翻译区(5'UTR)的至少一部分。

实施例73.根据实施例72所述的方法，其中对所述5'UTR的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。

实施例74.根据实施例73所述的方法，其中对所述5'UTR的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的编辑使得促进调节所述LRRK2多肽的mRNA翻译。

实施例75.根据实施例69至74中任一项所述的方法，其中所述接近(a)的序列包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。

实施例76.根据实施例69至75中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。

实施例77.根据实施例69至76中任一项所述的方法，其中所述靶RNA的所述区至少部分地编码所述LRRK2多肽。

实施例78.根据实施例69至77中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸被配置成促进所述RNA编辑实体对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的编辑。

实施例79.根据实施例69至78中任一项所述的方法，其中所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。

实施例80.根据实施例79所述的方法，其中不互补的所述至少一个核苷酸是腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。

实施例81.根据实施例69至80中任一项所述的方法，其中所述施用包括施用治疗有效量的所述载体。

实施例82.根据实施例69至81中任一项所述的方法，其中所述施用至少部分地治疗或预防所述有需要的受试者的所述疾病或所述病状的至少一种症状。

实施例83.根据实施例69至82中任一项所述的方法，其中所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、microRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、YRNA和hnRNA

实施例84.根据实施例83所述的方法，其中所述靶RNA是所述mRNA。

实施例85.根据实施例69至84中任一项所述的方法，其中所述靶RNA的所述区包括至少部分地编码以下的区：所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。

实施例86.根据实施例85所述的方法，其中所述靶RNA的所述区至少部分地编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。

实施例87.根据实施例所述86的方法，其中所述LRRK2多肽的所述激酶结构域包括相对于野生型LRRK2多肽的突变。

实施例88.根据实施例69至87中任一项所述的方法，其中与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括核苷酸突变。

实施例89.根据实施例69至88中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸能够募集RNA编辑实体。

实施例90.根据实施例所述89的方法，其中所述工程化多核苷酸缺少RNA编辑实体募集结构域。

实施例91.根据实施例所述89的方法，其中所述工程化多核苷酸进一步包括RNA编辑实体募集结构域，其至少一部分能够至少瞬时地与所述RNA编辑实体缔合。

实施例92.根据实施例91所述的方法，其中所述RNA编辑实体募集结构域募集所述RNA编辑实体。

实施例93.根据实施例91至92中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。

实施例94.根据实施例93所述的方法，其中所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。

实施例95.根据实施例69至94中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。

实施例96.根据实施例95所述的方法，其包括所述ADAR多肽或其生物活性片段，所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。

实施例97.根据实施例91至96中任一项所述的方法，其中所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。

实施例98.根据实施例97所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括至少两个GluR2序列。

实施例99.根据实施例97至98中任一项所述的方法，其中所述GluR2序列包括与SEQ ID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。

实施例100.根据实施例99所述的方法，其中所述GluR2序列包括SEQ ID NO:1。

实施例101.根据实施例91至96中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸缺少GluR2序列。

实施例102.根据实施例69至101中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸进一步包括结构特征，并且其中所述结构特征包括：凸起、发夹、内环、结构化基序和其任何组合。

实施例103.根据实施例102所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括所述凸起。

实施例104.根据实施例103所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括至少2个、3个、4个或至多5个凸起。

实施例105.根据实施例103至104中任一项所述的方法，其中所述凸起的长度为1-29个核苷酸。

实施例106.根据实施例103至105中任一项所述的方法，其中所述凸起是不对称凸起。

实施例107.根据实施例103至105中任一项所述的方法，其中所述凸起是对称凸起。

实施例108.根据实施例102所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括所述发夹。

实施例109.根据实施例102所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括所述内环。

实施例110.根据实施例109所述的方法，其中所述内环是不对称环。

实施例111.根据实施例109所述的方法，其中所述内环是对称环。

实施例112.根据实施例102所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括所述结构化基序。

实施例113.根据实施例112所述的方法，其中所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。

实施例114.根据实施例113所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括所述凸起和所述发夹。

实施例115.根据实施例113所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括所述凸起和所述内环。

实施例116.根据实施例69至115中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括主链，所述主链包括共价连接在一起的多个糖和磷酸部分，并且其中所述主链包括5'还原羟基、3'还原羟基或两者。

实施例117.根据实施例116所述的方法，其中所述主链中的所述5'还原羟基中的每一个通过磷酸二酯键与所述3'还原羟基中的每一个连接。

实施例118.根据实施例69至115中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括主链，所述主链包括共价连接在一起的多个糖和磷酸部分，并且其中所述主链缺少5'还原羟基、3'还原羟基或两者。

实施例119.根据实施例69至118中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的至少一部分与所述靶RNA杂交，由此形成两条杂交多核苷酸链。

实施例120.根据实施例119所述的方法，其中所述两条杂交多核苷酸链形成双链体。

实施例121.根据实施例69至120中任一项所述的方法，其中所述靶向序列能够与序列至少部分地结合，所述序列包括与由BLAST测定的SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少一部分的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。

实施例122.根据实施例69至121中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括与选自SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72的序列的至少一部分的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。

实施例123.根据实施例69至122中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基被修饰，由此产生经编辑的RNA，并且其中所述经编辑的RNA在被翻译时产生野生型LRRK2多肽。

实施例124.根据实施例69至123中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸被配置成通过促进对编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的编辑，将选自表3的突变体残基还原为所述LRRK2多肽的对应的野生型残基。

实施例125.根据实施例69至124中任一项所述的方法，其中所述载体进一步包括或编码第二工程化多核苷酸。

实施例126.根据实施例69至124中任一项所述的方法，其进一步包括施用包括或编码第二工程化多核苷酸的第二载体。

实施例127.根据实施例125至126中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸包括与第二靶RNA的区至少部分地杂交的第二靶向序列。

实施例128.根据实施例127所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸的所述第二靶向序列与所述第二RNA的所述区至少部分地互补。

实施例129.根据实施例127至128中任一项所述的方法，其中所述第二靶RNA至少部分地编码包括以下的多肽：α-突触核蛋白(SNCA)、葡糖神经酰胺酶β(GBA)、PTEN诱导的激酶1(PINK1)、Tau、这些中任一种的生物活性片段或其任何组合。

实施例130.根据实施例129所述的方法，其中所述第二靶RNA至少部分地编码所述SNCA多肽或其生物活性片段。

实施例131.根据实施例127至130中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸被配置成促进所述RNA编辑实体对所述第二靶RNA的区的多核苷酸的核苷酸的碱基的编辑。

实施例132.根据实施例131所述的方法，其中所述编辑使由所述第二靶RNA编码的多肽的表达降低。

实施例133.根据实施例69至132中任一项所述的方法，其中所述载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。

实施例134.根据实施例133所述的方法，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。

实施例135.根据实施例133至134中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。

实施例136.根据实施例133至135中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。

实施例137.根据实施例135至136中任一项所述的方法，其中所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。

实施例138.根据实施例137所述的方法，其中所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。

实施例139.根据实施例69至132中任一项所述的方法，其中所述载体是微环载体。

实施例140.根据实施例69至132中任一项所述的方法，其中所述载体是DNA载体。

实施例141.根据实施例69至140中任一项所述的方法，其中所述载体包括与由BLAST测定的SEQ ID NO:78-80中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。

实施例142.根据实施例69至141中任一项所述的方法，其中靶向部分包括与由BLAST测定的SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72的至少一部分的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。

实施例143.根据实施例142所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包括SEQ IDNO:66-SEQ ID NO:72的序列。

实施例144.根据实施例69至143中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是中枢神经系统(CNS)、胃肠(GI)道或两者的疾病或病状。

实施例145.根据实施例144所述的方法，其中所述疾病是所述两者的疾病，并且其中所述疾病是帕金森氏病。

实施例146.根据实施例144所述的方法，其中所述疾病是所述GI道的疾病，并且其中所述疾病是克罗恩氏病。

实施例147.根据实施例69至146中任一项所述的方法，其进一步包括施用二级疗法。

实施例148.根据实施例147所述的方法，其中所述二级疗法与所述载体同时或顺序施用。

实施例149.根据实施例147至148所述的方法，其中所述二级疗法包括以下中的至少一种：益生菌、卡比多巴、左旋多巴、MAO B抑制剂、儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂、抗胆碱能药、金刚烷胺、深部脑刺激、这些中的任一种的盐或其任何组合。

实施例150.根据实施例147至149中任一项所述的方法，其中所述载体、所述二级疗法或两者的所述施用独立地进行至少约：每日1次、每日2次、每日3次、每日4次、每周一次、每周两次、每周3次、两周一次、两月一次、每月一次或每年一次。

实施例151.根据实施例69至150中任一项所述的方法，其进一步包括监测所述受试者的所述疾病或病状。

实施例152.根据实施例69至151中任一项所述的方法，其中所述载体包括在呈单位剂型的药物组合物中。

实施例153.根据实施例69至152中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述施用之前被诊断患有所述疾病或所述病状。

实施例154.根据实施例153所述的方法，其中所述诊断是通过体外测定进行的。

实施例155.根据实施例69至154中任一项所述的方法，其中如通过测序所测量的，对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的所述编辑包括至少约3％、5％、10％、15％或20％的编辑。

实施例156.根据实施例155所述的方法，其中所述第二靶RNA至少部分地编码所述SNCA多肽，并且其中ADAR多肽对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的所述编辑产生经修饰的多肽，所述经修饰的多肽与由所述靶RNA编码的未经修饰的多肽相比包括残基的变化，所述残基的变化包括：(a)在与SEQ ID NO:15的所述LRRK2多肽的位置2019相对应的位置处的腺嘌呤到肌苷的变化；(b)在与SEQ ID NO:34的所述SNCA多肽的位置30或53相对应的位置处的腺嘌呤到肌苷的变化；或(c)(a)和(b)。

带编号的实施例#2

实施例1.一种工程化多核苷酸，其包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：

(a)编码：富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽、α-突触核蛋白(SNCA)多肽、葡糖神经酰胺酶β(GBA)多肽、PTEN诱导的激酶1(PINK1)多肽或Tau多肽；

(b)包括非编码序列；或

(c)包括(a)和(b)，

其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑，来自所述靶RNA的所述LRRK2多肽、所述SNCA多肽、所述GBA多肽、所述PINK1多肽、所述Tau多肽的翻译的调节；或其组合。

实施例2.根据实施例1所述的工程化多核苷酸，其中所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个或120个核苷酸。

实施例3.根据实施例1或2所述的工程化多核苷酸，其中所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。

实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的工程化多核苷酸，其中与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。

实施例5.根据实施例4所述的工程化多核苷酸，其中不互补的所述至少一个核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。

实施例6.根据实施例4所述的工程化多核苷酸，其中不互补的所述至少一个核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。

实施例7.根据实施例4至6中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述A是用于编辑的所述靶RNA的所区中所述核苷酸的所述碱基。

实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。

实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA是mRNA。

实施例10.根据实施例1至9中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。

实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括凸起。

实施例12.根据实施例11所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起是不对称凸起。

实施例13.根据实施例11所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起是对称凸起。

实施例14.根据实施例11至13中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起的长度为1-4个核苷酸。

实施例15.根据实施例1至10中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括发夹。

实施例16.根据实施例1至10中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括内环。

实施例17.根据实施例16所述的工程化多核苷酸，其中所述内环的每一侧上的所述内环的长度为5-50个核苷酸。

实施例18.根据实施例16或17所述的工程化多核苷酸，其中所述内环的每一侧上的所述内环的长度为6个核苷酸。

实施例19.根据实施例1至18中任一项所述的工程化多核苷酸，其包括至少两个内环。

实施例20.根据实施例1至19中任一项所述的工程化多核苷酸，其包括两个内环。

实施例21.根据实施例20所述的工程化多核苷酸，其中所述两个内环是对称内环。

实施例22.根据实施例20或21所述的工程化多核苷酸，其中所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。

实施例23.根据实施例16所述的工程化多核苷酸，其中所述内环是不对称内环。

实施例24.根据实施例1至23中任一项所述的工程化多核苷酸，其包括结构化基序。

实施例25.根据实施例24所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括以下中的至少两种：凸起、发夹和内环。

实施例26.根据实施例25所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。

实施例27.根据实施例25所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。

实施例28.根据实施例1至27中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。

实施例29.根据实施例1至28中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。

实施例30.根据实施例29所述的工程化多核苷酸，其中所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。

实施例31.根据实施例1至30中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。

实施例32.根据实施例31所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。

实施例33.根据实施例31或32所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。

实施例34.根据实施例31至33中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。

实施例35.根据实施例34所述的工程化多核苷酸，其中所述GluR2序列包括与SEQID NO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。

实施例36.根据实施例34所述的工程化多核苷酸，其中所述GluR2序列包括SEQ IDNO:1。

实施例37.根据实施例1至36中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。

实施例38.根据实施例1至37中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。

实施例39.根据实施例1至38中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。

实施例40.根据实施例1至39中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。

实施例41.根据实施例1至40中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。

实施例42.根据实施例1至41中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。

实施例43.根据实施例42所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区的所述5'UTR的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽、所述SNCA多肽、所述GBA多肽、所述PINK1多肽或所述Tau多肽的基因翻译。

实施例44.根据实施例42所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑导致促进调节以下的mRNA翻译：所述LRRK2多肽、所述SNCA多肽、所述GBA多肽、所述PINK1多肽或所述Tau多肽。

实施例45.根据实施例1至44中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。

实施例46.根据实施例45所述的工程化多核苷酸，其中编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。

实施例47.根据实施例45或46所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。

实施例48.根据实施例1至44中任一项所述的工程化多核苷酸，其中靶RNA编码所述SNCA多肽，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述SNCA多肽的表达。

实施例49.根据实施例1至44中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述GBA多肽，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述GBA多肽的表达。

实施例50.根据实施例1至44中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述PINK1多肽，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述PINK1多肽的表达。

实施例51.根据实施例1至44中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述Tau多肽，并且其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述Tau多肽的表达。

实施例52.根据实施例45至47中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。

实施例53.根据实施例52所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。

实施例54.根据实施例1至53中任一项所述的工程化多核苷酸，其中与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。

实施例55.根据实施例1至54中任一项所述的工程化多核苷酸，其中与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。

实施例56.根据实施例54或55所述的工程化多核苷酸，其中所述突变包括多态性。

实施例57.根据实施例54至56中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述突变是G至A突变。

实施例58.根据实施例1至47、52、53或55至57中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA包括与SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

实施例59.根据实施例1至47、52、53或55至58中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

实施例60.根据实施例1至47、52、53或55至59中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15的G2019S相对应的突变。

实施例61.根据实施例1至47、52、53或55至60中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述碱基的所述编辑是与SEQ ID NO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。

实施例62.根据实施例1至47、52、53或55至61中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。

实施例63.根据实施例1至44、48、54、56或57中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA包括与SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:33中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

实施例64.根据实施例1至44、48、54、56、57或63中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA编码SCNA多肽，所述SCNA多肽包括与SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:36中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

实施例65.根据实施例1至44、48、54、56、57、63或64中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码SNCA多肽，所述SNCA多肽包括与表6的突变相对应的突变，或表6的突变的任何组合。

实施例66.根据实施例1至44、48、54、56、57或63至65中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述碱基的所述编辑是编码SNCA多肽的所述靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。

实施例67.根据实施例1至44、49、54、56或57中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA包括与SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:48中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

实施例68.根据实施例1至44、49、54、56、57或67中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述碱基的所述编辑是编码Tau多肽的所述靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。

实施例69.根据实施例1至44、50、54、56或57中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA包括与SEQ ID NO:49的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

实施例70.根据实施例1至44、50、54、56、57或69中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述碱基的所述编辑是编码PINK1多肽的所述靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。

实施例71.根据实施例1至44、50、54、56或57中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA包括与SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:54中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

实施例72.根据实施例1至44、51、54、56、57或71中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述碱基的所述编辑是编码GBA多肽的所述靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。

实施例73.根据实施例1至47、52、53或55至62中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ ID NO:182。

实施例74.根据实施例1至44、48、54、56、57或63至66中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:183-SEQ ID NO:192中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。

实施例75.根据实施例1至74中任一项所述的工程化多核苷酸，其中当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。

实施例76.根据实施例75所述的工程化多核苷酸，其中所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链体。

实施例77.根据实施例1至76中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。

实施例78.根据实施例1至77中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。

实施例79.根据实施例78所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括所述RNA。

实施例80.一种工程化多核苷酸，其包括与靶RNA的区至少部分地杂交的靶向序列，其中所述靶RNA：

(a)编码选自由以下组成的组的多肽：富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)、α-突触核蛋白(SNCA)、葡糖神经酰胺酶β(GBA)、PTEN诱导的激酶1(PINK1)和Tau；

(b)包括非编码序列；或

(c)包括(a)和(b)，其中所述工程化多核苷酸被配置成：促进RNA编辑实体对所述靶RNA的所述区的核苷酸的碱基的编辑；促进调节所述LRRK2、SNCA、所述GBA、所述PINK1、所述Tau的表达；或其组合。

实施例81.一种载体，其包括：(a)根据实施例1至79中任一项所述的工程化多核苷酸；(b)根据实施例80所述的工程化多核苷酸；或(c)(a)和(b)两者。

实施例82.根据实施例81所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

实施例83.根据实施例82所述的载体，其中所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。

实施例84.根据实施例83所述的载体，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。

实施例85.根据实施例83至84中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。

实施例86.根据实施例83至85中任一项所述的载体，其中所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。

实施例87.根据实施例85至86中任一项所述的载体，其中所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。

实施例88.根据实施例87所述的载体，其中所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。

实施例89.一种呈单位剂型的药物组合物，所述药物组合物包括：(a)根据实施例1至79中任一项所述的工程化多核苷酸；(b)根据实施例80所述的工程化多核苷酸、根据实施例81至88中任一项所述的载体或其任何组合；以及(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

实施例90.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将根据实施例1至80中任一项所述的工程化多核苷酸与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合。

实施例91.一种分离的细胞，其包括根据实施例1至80中任一项所述的工程化多核苷酸、根据实施例81至88中任一项所述的载体或两者。

实施例92.一种试剂盒，其在容器中包括根据实施例1至80中任一项所述的工程化多核苷酸、根据实施例81至88中任一项所述的载体或两者。

实施例93.一种制备试剂盒的方法，所述方法包括将根据实施例1至80中任一项所述的工程化多核苷酸、根据实施例81至88中任一项所述的载体或两者加入容器中。

实施例94.一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：(a)根据实施例81至88中任一项所述的载体；(b)根据实施例89所述的药物组合物；或(c)(a)和(b)。

实施例95.根据实施例94所述的方法，其中所述施用包括施用治疗有效量的所述载体。

实施例96.根据实施例94或95所述的方法，其中所述施用至少部分地治疗或预防所述有需要的受试者的所述疾病或所述病状的至少一种症状。

实施例97.根据实施例94至96中任一项所述的方法，其中所述载体进一步包括或编码第二工程化多核苷酸。

实施例98.根据实施例94至96中任一项所述的方法，其进一步包括施用包括或编码第二工程化多核苷酸的第二载体。

实施例99.根据实施例97或98所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸包括与第二靶RNA的区至少部分地杂交的第二靶向序列。

实施例100.根据实施例99所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸的所述第二靶向序列与所述第二靶RNA的所述区至少部分地互补。

实施例101.根据实施例99或100中的实施例中任一项所述的方法，其中所述第二靶RNA编码包括以下的多肽：α-突触核蛋白(SNCA)、葡糖神经酰胺酶β(GBA)、PTEN诱导的激酶1(PINK1)、Tau、这些中任一种的生物活性片段或其任何组合。

实施例102.根据实施例101所述的方法，其中所述第二靶RNA编码所述SNCA多肽或其生物活性片段。

实施例103.根据实施例97至102中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸被配置成促进所述RNA编辑实体对所述第二靶RNA的区的多核苷酸的核苷酸的碱基的编辑。

实施例104.根据实施例103所述的方法，其中所述编辑使由所述第二靶RNA编码的多肽的表达降低。

实施例105.根据实施例94至104中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是中枢神经系统(CNS)、胃肠(GI)道或两者的疾病或病状。

实施例106.根据实施例105所述的方法，其中所述疾病是所述两者的疾病，并且其中所述疾病是帕金森氏病。

实施例107.根据实施例105所述的方法，其中所述疾病是所述GI道的疾病，并且其中所述疾病是克罗恩氏病。

实施例108.根据实施例94至107中任一项所述的方法，其进一步包括施用二级疗法。

实施例109.根据实施例108所述的方法，其中所述二级疗法与所述载体同时或顺序施用。

实施例110.根据实施例108至109所述的方法，其中所述二级疗法包括以下中的至少一种：益生菌、卡比多巴、左旋多巴、MAO B抑制剂、儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂、抗胆碱能药、金刚烷胺、深部脑刺激、这些中的任一种的盐或其任何组合。

实施例111.根据实施例108至110中任一项所述的方法，其中所述载体、所述二级疗法或两者的所述施用独立地进行至少约：每日1次、每日2次、每日3次、每日4次、每周一次、每周两次、每周3次、两周一次、两月一次、每月一次或每年一次。

实施例112.根据实施例94至111中任一项所述的方法，其进一步包括监测所述受试者的所述疾病或病状。

实施例113.根据实施例94至112中任一项所述的方法，其中所述载体包括在呈单位剂型的药物组合物中。

实施例114.根据实施例94至113中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述施用之前被诊断患有所述疾病或所述病状。

实施例115.根据实施例114所述的方法，其中所述诊断是通过体外测定进行的。

实施例116.根据实施例94至115中任一项所述的方法，其中如通过测序所测量的，对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的所述编辑包括至少约3％、5％、10％、15％或20％的编辑。

实施例117.根据实施例116所述的方法，其中所述第二靶RNA编码所述SNCA多肽，并且其中ADAR多肽对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的所述编辑产生经修饰的多肽，所述经修饰的多肽与由所述靶RNA编码的未经修饰的多肽相比包括残基的变化，所述残基的变化包括：(a)在与SEQ ID NO:15的所述LRRK2多肽的位置2019相对应的位置处的腺嘌呤到肌苷的变化；(b)在与SEQ ID NO:34的所述SNCA多肽的位置30或53相对应的位置处的腺嘌呤到肌苷的变化；或(c)(a)和(b)。

实例

实例1：引入体外转录(IVT)的向导RNA(示例性主题工程化多核苷酸)

gBlocks^TM基因片段购自IDT并且用于产生IVT向导RNA，表10。

表10：向导RNA gBlocks^TM

格式指示每种构建体的各种元件：

非转录的T7启动子元件(小写)；引物结合(带下划线)；募集序列(GluR2)为斜体；^表示核苷酸错配；*表示当向导RNA与靶区杂交时将形成凸起的核苷酸；#表示当向导RNA与靶区杂交时将形成环的核苷酸。

使用购自IDT的gBlocks产生体外转录的向导RNA(示例性工程化多核苷酸序列)。IVT反应列于表11中，以及引物列于表12中。按照Q5 PCR方案(60℃退火)，随后通过凝胶电泳进行确认，为所有向导制作IVT模板，图1。

表11：示例性IVT方案

试剂	数量	浓度
			无核酸酶水	5μl
10X反应缓冲液	2μl
			ATP(100mM)	2μl	最终10mM
GTP(100mM)	2μl	最终10mM
			UTP(100mM)	2μl	最终10mM
CTP(100mM)	2μl	最终10mM
			模板DNA	3μl	1μg
T7 RNA聚合酶混合物	2μl
			总反应体积	20μl

简言之，表11中所示出的IVT方案用于产生IVT向导RNA(示例性工程化多核苷酸序列)。将试剂混合并在37℃下温育过夜(过夜IVT#通常会产生很大的产率)。对于DNase处理，添加了以下内容：将70μl无核酸酶水、10μl的10X DNase I缓冲液和2μl的DNase I(无RNase)混合并在37℃下温育持续30分钟。柱纯化如在图2中所示出的。将经纯化的IVT产生的多核苷酸RNA调整至1ug/ul(约25nmol)。

表12：示例性IVT引物

SEQ ID NO:	引物	序列
			63	LRRK2_RP_gen	TTTTCACACTGTATCCCAATG
64	LRRK2_RP_EIE	TTAGTCACAGGTGTATCCC
			65	LRRK2_RP_intG2	TTTTCACACTGTATCCCAATG

当与靶RNA链杂交时，经纯化的IVT产生的多核苷酸RNA的二级结构在图3A-H中示出。

示例性向导工程化多核苷酸在表13中示出。合适的工程化多核苷酸序列可以包括与表13的序列中的任一序列的约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。示例性工程化多核苷酸可以促进SEQ ID NO:6的LRRK2 mRNA序列的位置6190处的单个碱基对突变的逆转。

表13：示例性工程化多核苷酸序列和对应的靶mRNA序列(工程化多核苷酸靶向的LRRK2序列的区)。

格式指示每种构建体的各种元件：

募集序列(GluR2)为斜体；^表示核苷酸错配；*表示将形成凸起的核苷酸；#表示将形成环的核苷酸；下划线表示将形成发夹的一部分的核苷酸。

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实例2：将IVT向导RNA导入到含有G2019S LRRK2突变的细胞中

含有一个编码LRRK2(杂合的)中G2019S突变的突变等位基因的EBV转化的B细胞，LCL购自Coriell研究所(Coriell Institute)。具体地，供体ND000264在整个这些实验中用于评估ADAR介导的编辑、向野生型等位基因的逆转、A>G转化。

针对LRRK2 RNA测试了7个IVT产生的工程化多核苷酸(例如，向导)以及针对RAB7ARNA测试了1个IVT工程化多核苷酸。所有工程化多核苷酸均使用龙沙公司X核转染用程序EH100在LCL细胞中进行核转染。在每个反应条件下，约40nmol或60nmol的每种IVT产生的工程化多核苷酸被核转染到约2x 10⁵个LCL细胞中。将反应分成2个孔，每个孔含有1x 10⁵个细胞，以便在3小时或7小时收集所述细胞以进行RNA分离。收集时，将细胞以1,500x g旋转持续1分钟，然后去除培养基，并且然后向每个孔中添加180ul的RLT缓冲液+BMe。使用Qiagen(凯杰公司)RNeasy方案和试剂盒分离RNA，随后使用新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)(NEB)ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒。

位于靶区之外的LRRK2 mRNA特异性引物用于扩增IVT产生的工程化多核苷酸靶向的区，表14。这些引物与任何IVT产生的工程化多核苷酸无序列重叠。LRRK2引物1(LRRK2_1)和2(LRRK_2_2)用于扩增mRNA，并且引物4(LRRK2_4)用于靶区的测序。将测序工作外包给Genewhiz公司(Genewhiz)。分析桑格迹线以评估每种IVT产生的工程化多核苷酸的编辑效率。

表14：LRRK2 mRNA特异性引物

SEQ ID NO	引物名称	序列
			75	LRRK2_1	CGTAGCTGATGGTTTGAGATACCT
76	LRRK2_2	ACCAAATGAATAAACATCAGCCTGTTG
			77	LRRK2_4	TTTCCTCTGGCAACTTCAGGTG

实例3：通过靶向LRRK2的工程化多核苷酸纠正细胞中的致病性G2019S突变

测序可以包括毛细管测序、无亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐测序、TET辅助的亚硫酸氢盐(TAB)测序、ACE-测序、高通量测序、Maxam-Gilbert测序、大规模并行签名测序(massively parallel signature sequencing)、Polony测序、454焦磷酸测序、桑格测序、因美纳测序(Illumina sequencing)、SOLiD测序、Ion Torrent(离子激流公司)半导体测序、DNA纳米球测序、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔测序、鸟枪法测序(shot gun sequencing,)、RNA测序、Enigma测序或其任何组合。

使用不同的示例性工程化多核苷酸(例如，向导RNA)，如LRRK2_FlipIntGluR2(SEQID NO:71，标记为IntFlip)、LRRK2_0.100.50(SEQ ID NO:66，标记为0.100.50)、LRRK2_1.100.50(SEQ ID NO:67，标记为1.100.50)和对照工程化多核苷酸来编辑在位置6055处具有A突变的编码致病性G2019S突变蛋白的LRRK2 mRNA。用工程化多核苷酸处理编码G2019S突变的等位基因杂合的EBV转化的B细胞。

所有工程化多核苷酸均使用龙沙公司X核转染用程序EH100在LCL细胞中进行核转染。在每个反应条件下，约40nmol或60nmol的每种IVT工程化多核苷酸被核转染到约2x 10^5个LCL细胞中。将反应分成2个孔，每个孔含有1x 10^5个细胞，以便在3小时或7小时收集所述细胞以进行RNA分离。收集时，将细胞以1,500x g旋转持续1分钟。然后去除培养基。向每个孔中添加180ul的RLT缓冲液+BMe。使用凯杰公司RNeasy方案和试剂盒从细胞中分离RNA。新英格兰生物实验室(NEB)ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒用于从分离的RNA中合成cDNA。通过桑格测序对LRRK2的cDNA进行测序。将测序工作外包给Genewhiz公司。分析桑格迹线以评估每种工程化多核苷酸的编辑效率。

通过在第6055个核苷酸处具有G(经编辑的)的LRRK2 mRNA和具有A(未经编辑的)的LRRK2 mRNA的示踪信号的差异来计算RNA编辑效率，即LRRK2中的A>G转化。如在图4中所示出的，LRRK2_FlipIntGluR2能够实现14％的编辑效率，从而将7％的致病性A突变转化成G。到7小时，LRRK2_0.100.50和LRRK2_1.100.50也示出了可比较的编辑效率。

实例4：通过靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸纠正帕金森氏病患者中致病性

G2019S突变的基因疗法

诊断患有G2019S突变的帕金森氏病患者可以用表13中所列的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)中的任何工程化多核苷酸进行治疗。可以通过各种方法制备工程化多核苷酸(例如，向导RNA)。例如，如实例1和实例2中所展示的，可以通过PCR和IVT法制备工程化多核苷酸(例如，向导RNA)，并通过侧脑室注射直接注射到患者的脑中。

也可以将如表10中所列的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的序列(其中其T7启动子序列被U7、U1、U6、H1或7SK启动子序列取代)克隆到病毒载体，如腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或逆转录病毒载体中。具有工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的序列的病毒载体可以通过侧脑室注射直接注射到患者的脑中。如表10中所列的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的序列(其中其T7启动子序列被U7、U1、U6、H1或7SK启动子序列取代)可以通过PCR或gBlocks^TM基因片段制备。然后可以将工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的序列与纳米颗粒或树枝状大分子连接，用于侧脑室注射到患者的脑中。

RNA编辑的监测如下：一周后收集约1x 10^5个进行RNA分离。收集时，将细胞以1,500x g旋转持续1分钟。去除培养基。向每个孔中添加180ul的RLT缓冲液+BMe。使用凯杰公司RNeasy方案和试剂盒从细胞中分离RNA。新英格兰生物实验室(NEB)ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒用于从分离的RNA中合成cDNA。通过桑格测序对LRRK2的cDNA进行测序。分析桑格迹线以评估每种工程化多核苷酸(例如，IVT向导)的编辑效率。通过在第6055个核苷酸处具有G(经编辑的)和A(未经编辑的)的LRRK2 mRNA的示踪信号的差异来计算RNA编辑效率，即LRRK2 mRNA中的A>G转化。

实例5：通过靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸纠正克罗恩氏病患者中致病性突变的基因疗法

具有致病性突变的克罗恩氏病患者可以通过具有靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的基因疗法进行治疗。如果患者被诊断患有G2019S突变，则实例1-4中所展示的工程化多核苷酸例如，向导RNA)可以用于基因疗法。如果克罗恩氏病患者被诊断患有另一种突变，如N2081D突变，则将合成其它工程化多核苷酸(例如，向导RNA)。将构建工程化多核苷酸(例如，向导RNA)以在编码N2081D突变蛋白的RNA的第6243个核苷酸处将A转化成G。工程化多核苷酸(例如，向导RNA)可以通过PCR和IVT制备并静脉内注射到患者体内。

具有上游U7、U1、U6、H1或7SK启动子的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的序列也可以被克隆到病毒载体，如腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或逆转录病毒载体，或如表15中所提供的任何示例性载体中。可以将包括编码工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的序列的病毒载体静脉内注射到患者体内。

也可以通过PCR或gBlocks^TM基因片段制备具有上游U7、U1、U6、H1或7SK启动子的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的序列。然后可以将工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的序列与纳米颗粒或树枝状大分子连接，用于静脉内注射到患者体内。

RNA编辑的监测如下：一周后收集约1x 10^5个进行RNA分离。收集时，将细胞以1,500x g旋转持续1分钟。去除培养基。向每个孔中添加180ul的RLT缓冲液+BMe。使用凯杰公司RNeasy方案和试剂盒从细胞中分离RNA。新英格兰生物实验室(NEB)ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒用于从分离的RNA中合成cDNA。通过桑格测序对LRRK2的cDNA进行测序。分析桑格迹线以评估每种IVT向导的编辑效率。通过在第6243个核苷酸处具有G(经编辑的)和A(未经编辑的)的LRRK2 mRNA的示踪信号的差异来计算RNA编辑效率，即LRRK2中的A>G转化。

表15：可以编码主题多核苷酸的示例性载体

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实例6：LRRK2和SNCA的多重靶向

由于LRRK2(G2019S)或SNCA的多态性与特发性帕金森氏病的风险增加相关，同时操纵LRRK2和SNCA mRNA可能是一种有用的治疗方法。如本公开所展示的，RNA编辑是模块化的；RNA编辑酶和RNA靶向工程化多核苷酸(例如，gRNA)是两个不同的实体。因此，RNA编辑可以是多重进行的，以同时纠正多个不同的靶RNA。例如，为了治疗具有LRRK2(G2019S)和SNCA贡献多态性的特发性帕金森氏病患者，产生了两种不同的工程化多核苷酸序列。第一工程化多核苷酸可以包括表13中所列的工程化多核苷酸(向导RNA)的序列。如在实例3中所展示的，这些第一工程化多核苷酸(例如，向导RNA)可以编辑mRNA以产生翻译时包括G2019S(第6055个核苷酸处的G>A转化)的经修饰的多肽。第二工程化多核苷酸(向导RNA)可以靶向SNCA的起始ATG。其可以将ATG的起始A的任何核苷酸转化成G。由于去除了起始ATG，所以SNCA的表达应该减少。这两个工程化多核苷酸序列可以包括上游U7、U1、U6、H1、7SK启动子。可以将编码两个工程化多核苷酸的DNA序列克隆到单个病毒载体，如腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或逆转录病毒载体中—所述病毒载体转录这些DNA序列以产生工程化多核苷酸序列。通过侧脑室注射将载体注入到患者的脑中。

LRRK2的RNA编辑监测如下：一周后收集约1x 10^5个进行RNA分离。收集时，将细胞以1,500x g旋转持续1分钟。去除培养基。向每个孔中添加180ul的RLT缓冲液+BMe。使用凯杰公司RNeasy方案和试剂盒从细胞中分离RNA。新英格兰生物实验室(NEB)ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒用于从分离的RNA中合成cDNA。通过桑格测序对LRRK2的cDNA进行测序。分析桑格迹线以评估每种IVT向导的编辑效率。通过在第6055个核苷酸处具有G(经编辑的)和A(未经编辑的)的LRRK2 mRNA的示踪信号的差异来计算RNA编辑效率，即LRRK2 mRNA中的A>G转化。

SNCA的表达水平监测如下：使用蛋白质印迹、ELISA和SNCA蛋白水平的中尺度发现(MSD)分析评估SNCA蛋白的敲低。

实例7：编辑RAB7A和SNCA mRNA

在此实例中，使用不同的工程化多核苷酸(例如，向导RNA构建体)编辑RAB7a和α-突触核蛋白(SNCA)的不同区。对于RAB7a，外显子1、2和3'UTR被靶向以进行编辑，而起始密码子和SNCA的3'UTR被靶向。图5A示出了人SNCA的外显子结构的示意图。外显子示出为片段；编码区在上面用黑线表示。向导RNA靶向位点的位置如箭头所示；PCR引物在顶部示出。

使用没有3'发夹的hU6启动子或具有3'SmOPT U7发夹的mU7或hU7启动子表达靶向人RAB7A外显子1、外显子3或3'UTR、或人SNCA起始密码子或3'UTR的100nt工程化多核苷酸(例如，向导RNA)。图5B总结了在存在或不存在ADAR2过表达的情况下使用不同的工程化多核苷酸(例如，向导RNA构建体)进行SNCA编辑的结果。U7启动子与3'SmOPT U7发夹组合，增强了每个靶位点处的ADAR编辑(通过桑格测序测量)。虽然靶向3'UTR的构建体在内源性相对于过表达的ADAR水平下的效果相当，但靶向其它区的构建体仍然受益于ADAR2过表达。

为了确认是否发生差异外显子选择，分离了源自经编辑的转录物的cDNA，并使用指定的引物进行PCR扩增。如果外显子结构保持不变，则跨RAB7a的编码决定序列的RAB7a引物会产生437bp的扩增子。如果跳跃RAB7a的外显子3，则预期扩增子为310bp。使用SNCA引物，预期PCR扩增子为323bp。图5C示出了RAB7a的外显子3跳跃最小，并且存在显著的SNCA扩增子。

图5D示出了桑格测序色谱图，所述桑格测序色谱图示出了在SNCA转录物的靶腺苷处的特异性编辑。框指示中靶编辑位点。

实例8：K562细胞中SNCA的3'UTR的中靶和脱靶编辑

本文公开了在U7启动子下并且还包括smOPT发夹序列的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的组合物。所述工程化多核苷酸(例如，向导RNA)可以与与SNCA对应的靶RNA序列的区杂交，以促进腺苷的ADAR介导的编辑(参见图6A-图6C)。通过在过表达SNCA的K562细胞中转染工程化多核苷酸(例如，向导RNA)来评估SNCA转录物的编辑。将1.5μg的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)通过核转染(龙沙公司)转染到2x 10⁵SNCA-过表达K562细胞中。转染后40和72小时测量RNA编辑。图6A是桑格序列色谱图，所述桑格序列色谱图示出了中靶编辑(由“靶标A”表示)为91％。图6B是示出在小鼠U7启动子或人U7启动子下，在有和没有ADAR2的K562细胞中在40小时和72小时时间点处的中靶编辑的图。在持续的时间段内，观察到高水平的编辑(所有构建体均大于40％)。图6C描绘了示出恰好在脱靶A的5'具有G的腺苷的脱靶编辑的图。

实例9：用于编辑LRRK2的优化的工程化多核苷酸

本文公开了用于编辑LRRK2的优化的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)。图8和图9示出了与具有完美双链体的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)或具有单个A-C错配的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的编辑动力学相比，两个优化的排名靠前的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的编辑动力学。与其它工程化多核苷酸(例如，向导RNA)设计相比，排名靠前的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的K_obs增加了30倍。图10B示出了与图10A中所示出的具有完美双链体的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)或具有单个A-C错配的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的编辑频率相比，优化的排名靠前的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的编辑频率。优化的排名靠前的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的中靶靶碱基编辑大于80％，而具有完美双链体的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)或具有单个A-C错配的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)仅提供小于20％的中靶编辑。

实例10：具有SmOPT和U7发夹并靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸

此实例描述了在U1启动子、SmOPT序列和U7发夹控制下的本公开的优化的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)，其中工程化多核苷酸(例如，向导RNA)被设计成靶向LRRK2。测试了靶向编码LRRK2 G2019S突变的核苷酸的两者均具有SmOPT和U7发夹的两种工程化多核苷酸(例如，向导RNA)设计。第一向导(“V0118 0.100.50”)含有100个碱基，其中LRRK2 mRNA中的靶标A跨向导中位置50处的碱基编辑。第二向导(“V0118 0.100.80”)含有100个碱基，其中LRRK2中的靶标A跨向导中位置80处的碱基编辑。在用携带LRRK2小基因的piggyBac载体转染的WT HEK293细胞中，测试了工程化多核苷酸(例如，向导RNA)促进编码G2019S LRRK2突变的密码子的核苷酸的ADAR介导的RNA编辑的能力。WT HEK293细胞自然地表达ADAR1。在测试通过ADAR1和ADAR2介导的RNA编辑的实验中，ADAR2通过携带LRRK2小基因的同一piggyBac载体在细胞中过表达。piggyBac构建体的示意图在图11中示出。实验仅在ADAR1(图12A)或ADAR1和ADAR2(图12B)存在的情况下进行。GFP质粒用作对照。图12A和图12B示出了含有SmOPT和U7发夹的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)仅在ADAR1存在的情况下促进了8％的中靶编辑效率，并且在ADAR1和ADAR2存在的情况下促进了28％的中靶编辑效率。图12A和图12B示出了含有SmOPT和U7发夹的工程化多核苷酸(例如，向导RNA)仅在ADAR1存在的情况下促进了19％的中靶编辑效率，并且在ADAR1和ADAR2存在的情况下促进了58％的中靶编辑效率。另外的实验证明，第一工程化多核苷酸(例如，第一向导RNA)(“V01180.100.50”)的吉布斯自由能(δG)为-161.98kcal/mol，并且第二工程化多核苷酸(例如，第二向导RNA)(“V0118 0.100.80”)的δG为-169.44kcal/mol。两个工程化多核苷酸(例如，向导RNA)的结构在图12A-图12B的图的下方示出。如在结构图中所看到的，第二工程化多核苷酸(例如，第二向导RNA)(“V0118 0.100.50”)与靶RNA的靶区形成了双链体RNA的更长的连续延伸。测试的序列在下表16中示出。

表16：示例性LRRK2工程化多核苷酸(例如，向导RNA)

实例11：用环状工程化多核苷酸进行LRRK2编辑

此实例描述了用本公开的环状工程化多核苷酸进行LRRK2编辑。用500ng编码环状工程化多核苷酸的质粒转染20,000个细胞。测试的细胞包含HEK293细胞，所述HEK293细胞表达内源性ADAR1，用携带携带编码G2019S突变的核苷酸突变(图19的对应数据，顶图)的LRRK2小基因的piggyBac载体转染；以及HEK293细胞，所述HEK293细胞表达内源性ADAR1，用携带ADAR2的piggyBac载体和携带编码G2019S突变的核苷酸突变的LRRK2小基因转染。

转染后48小时分离RNA，并将其转化到cDNA文库中。进行PCR和桑格测序分析。使用EditR程序确定编辑百分比。环状工程化多核苷酸100个碱基长，其中A/C错配被设计成距向导的5'端的80个碱基。环状工程化多核苷酸(SEQ ID NO:83)包括5'-CTGGCAACTTCAGGTGCACGAAACCCTGGTGTGCCCTCTGATGTTCTTATCCCCAT TCTACAGCAGTACTGAGCAATGCCGTAGTCAGCAATCTTTGCAA-3'的序列。图13示出了编码G2019S突变的密码子的核苷酸的中靶和脱靶ADAR1编辑和ADAR1+ADAR2编辑的图。

实例12：体外编辑iPSC源性LRRK2-G2019S多巴胺能神经元中的LRRK2 mRNA

此实例描述了可以表达LRRK2-G2019S突变蛋白的诱导多能干细胞(iPSC)源性神经元的体外编辑。对iPSC神经元的培养、诱导、成熟、转染或转导进行了优化，以通过工程化多核苷酸筛选编辑。通过TaqMan qPCR、流式细胞术和免疫荧光对每种多巴胺能神经元表型进行表征和验证。然后用靶向编码LRRK2-G2019S突变的密码子的核苷酸的工程化多核苷酸转染或转导iPSC、神经干细胞(NSC)、神经祖细胞(NPC)或源性神经元细胞，并使用编码LRRK2-G2019S基因座的序列的桑格测序、ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。使用LRRK2蛋白的LC-MS/MS以及LRRK2底物(例如磷酸-Rab(-8，-10，-35)，LRRK2自身磷酸化)的蛋白质印迹和中尺度发现(MSD)分析评估翻译成LRRK2蛋白的LRRK2 mRNA的体外生化编辑。

实例13：hLRRK2-G2019S小鼠的原代皮层神经元中的LRRK2 mRNA的离体编辑

此实例描述了在分离自hLRRK2-G2019S小鼠的原代皮层神经元中对编码LRRK2-G2019S突变的密码子的核苷酸的离体编辑。在转染或转导工程化多核苷酸之前，对来自hLRRK2-G2019S小鼠的原代神经元的原代显微解剖和培养进行了优化。然后用靶向编码LRRK2-G2019S突变的mRNA的工程化多核苷酸转染分离的皮层神经元，并使用编码基因座的LRRK2-G2019S的桑格测序、ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。进一步地，使用LRRK2蛋白的LC-MS/MS以及LRRK2底物(例如磷酸-Rab(-8，-10，-35)，LRRK2自身磷酸化)的蛋白质印迹和MSD分析评估翻译成LRRK2蛋白的LRRK2 mRNA的离体生化编辑。

实例14：hLRRK2-G2019S小鼠中LRRK2 mRNA的体内编辑

此实例描述了在hLRRK2-G2019S小鼠中对编码LRRK2-G2019S的mRNA的体内编辑。将靶向编码LRRK2-G2019S突变的mRNA的工程化多核苷酸通过侧脑室、脑实质内、脑池内或鞘内注射向hLRRK2-G2019S小鼠的大脑施用。然后从hLRRK2-G2019S小鼠中分离脑组织，并进行处理以分离LRRK2核酸和蛋白。使用编码LRRK2-G2019S的基因座的ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。进一步地，使用LRRK2蛋白的LC-MS/MS以及LRRK2底物(例如磷酸-Rab(-8，-10，-35)，LRRK2自身磷酸化)的蛋白质印迹和MSD分析评估翻译成LRRK2蛋白的LRRK2 mRNA的体内生化编辑。

实例15：LUHMES和iPSC源性多巴胺能神经元中SNCA mRNA的体外编辑

此实例描述了LUHMES和iPSC源性多巴胺能神经元中的体外SNCA编辑。对LUHMES和iPSC源性神经元的培养、诱导、分化、转染和转导进行了优化，以通过工程化多核苷酸筛选编辑。通过TaqMan qPCR、流式细胞术和免疫荧光对每种多巴胺能神经元表型进行表征和验证。然后用靶向SNCA的工程化多核苷酸转染或转导神经元，并使用SNCA基因座的qPCR、ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。使用蛋白质印迹、ELISA和SNCA蛋白水平的MSD分析评估SNCA蛋白的体外生化敲低。

实例16：hSNCA小鼠的原代皮层神经元中的SNCA mRNA的离体编辑

此实例描述了分离自hSNCA小鼠的原代皮层神经元中的SNCA mRNA编辑和SNCA蛋白的离体敲低。在转染或转导工程化多核苷酸之前，对来自SNCA小鼠的原代神经元的原代显微解剖和培养进行了优化。然后用靶向SNCA的工程化多核苷酸转染或转导分离的皮层神经元，并使用SNCA基因座的qPCR<ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。进一步地，使用蛋白质印迹、ELISA和SNCA蛋白水平的MSD分析评估SNCA蛋白的离体生化敲低。

实例17：hSNCA小鼠中SNCA mRNA的体内编辑

此实例描述了hSNCA小鼠中的体内SNCA编辑。将靶向SNCA的工程化多核苷酸通过侧脑室、脑实质内、脑池内或鞘内注射向hSNCA小鼠的大脑施用。然后从hSNCA小鼠中分离脑组织，并进行处理以分离SNCA核酸和蛋白。使用SNCA基因座的qPCR，ddPCR和扩增子下一代测序对编辑效率进行定量。进一步地，使用蛋白质印迹、ELISA和SNCA蛋白水平的MSD分析，从分离的SNCA蛋白中评估SNCA蛋白的体内生化敲低。

实例18：包括靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸

此实例描述了靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸。被靶向的LRRK2 mRNA的区是LRRK2 mRNA的位置6055处的A，其编码致病性G2019S突变蛋白。

将包括表17的工程化多核苷酸序列(和对照工程化多核苷酸序列)以及工程化多核苷酸靶向的区的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑工程化多核苷酸靶向的区的条件下接触。随后使用下一代测序(NGS)评估工程化多核苷酸靶向的区以进行编辑。

图14-图19示出了用于靶向LRRK2的对照工程化多核苷酸设计，如通过测序确定的每种工程化多核苷酸随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。LRRK1_向导02_TTHY2_128_gID_03565__v0093是5'-TACAGCAGTACTGAGCAATGCTGTAGTCAGC AATCTTTGCAATGA–3'(SEQ IDNO:84)。LRRK1_向导03_Glu2bRG_128_gID_03961__v0090是5'-TACAGCAGTACTGAGCAATGCCGTAGTCAG CAATCTTTGCAATGA–3'(SEQ ID NO:85)。

图20-图121示出了用于靶向LRRK2 RNA的示例性工程化多核苷酸设计，如通过测序确定的每种工程化多核苷酸随时间变化的编辑百分比，以及在待编辑的靶标A处的编辑(“x轴线上的0”)和在脱靶位置处的RNA编辑(在非“0”位置表示为黑条)。

与图20-图121对应的示例性工程化多核苷酸序列在表17中示出。

表17：靶向LRRK2 mRNA的示例性工程化多核苷酸序列

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实例19：包括靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸

此实例描述了用本公开的工程化多核苷酸进行LRRK2编辑。将包括表18的工程化多核苷酸序列以及工程化多核苷酸靶向的区的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑工程化多核苷酸靶向的区的条件下接触。随后使用下一代测序(NGS)评估工程化多核苷酸靶向的区以进行编辑。

图122示出了靶向LRRK2 mRNA的示例性工程化多核苷酸序列的热图和结构。热图提供了在10分钟时间点处的编辑曲线的可视化。用于中靶编辑的5个工程化多核苷酸(不具有-2过滤器)位于左图中，并且右图描绘了具有最小-2编辑的用于中靶编辑的5个工程化多核苷酸。对应的预测二级结构位于热图下面。

与图122对应的示例性工程化多核苷酸序列在表18中示出。

表18：靶向LRRK2 mRNA的示例性工程化多核苷酸序列

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实例20：包括哑铃设计并靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸

此实例描述了包括哑铃设计并靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸。工程化多核苷酸中的哑铃设计包括两个对称环，其中待编辑的靶标A位于两个对称环之间以用于靶标A的选择性编辑。两个对称环各自由dsRNA靶标的工程化多核苷酸侧上的6个核苷酸和dsRNA底物的靶RNA侧上的6个核苷酸形成。在此实例中，靶标A是LRRK2 mRNA的位置6055处的A，其编码致病性G2019S突变蛋白。具有哑铃设计并靶向LRRK2mRNA的示例性工程化多核苷酸在表19和图123中示出。

表19：示例性哑铃型工程化多核苷酸序列

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将包括表19的工程化多核苷酸序列以及工程化多核苷酸靶向的区的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑工程化多核苷酸靶向的区的条件下接触。随后使用下一代测序(NGS)评估工程化多核苷酸靶向的区以进行编辑。

图124-图127示出了示例性哑铃型工程化多核苷酸序列的编码G2019S突变的密码子的核苷酸的中靶和脱靶ADAR1编辑和ADAR1+ADAR2编辑的图(参见表19)。

实例21：靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸

此实例描述了靶向LRRK2 mRNA的工程化多核苷酸。将包括表20的工程化多核苷酸序列以及工程化多核苷酸靶向的区的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑工程化多核苷酸靶向的区的条件下接触。随后使用下一代测序(NGS)评估工程化多核苷酸靶向的区以进行编辑。表20的工程化多核苷酸示出了编码LRRK2 G2019S的mRNA的位置6055处的A核苷酸的特异性编辑。

表20：靶向LRRK2 mRNA的示例性工程化多核苷酸

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实例22：靶向SNCA mRNA的工程化多核苷酸

此实例描述了靶向SNCA mRNA的工程化多核苷酸。将包括表20的工程化多核苷酸序列以及工程化多核苷酸靶向的区的序列的自退火RNA结构与RNA编辑实体(例如，重组ADAR1和/或ADAR2)在允许编辑工程化多核苷酸靶向的区的条件下接触。随后使用下一代测序(NGS)评估工程化多核苷酸靶向的区以进行编辑。表21的工程化多核苷酸示出了SNCAmRNA的翻译起始位点(TIS)处的A核苷酸的特异性编辑。

表21：靶向SNCA mRNA的示例性工程化多核苷酸

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Claims (112)

1.一种工程化多核苷酸，其包括与靶RNA的区至少部分地互补的靶向序列，其中所述靶RNA：

(a)编码富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)多肽；

(b)包括非编码序列；或

(c)包括(a)和(b)，

其中所述工程化多核苷酸被配置成在与所述靶RNA的所述区结合时与所述靶RNA缔合，以形成募集RNA编辑实体的结构特征，其中所述RNA编辑实体在与所述工程化多核苷酸和所述靶RNA的所述区缔合时促进：所述靶RNA的所述区中核苷酸的碱基的编辑、所述LRRK2多肽的翻译的调节或两者。

2.根据权利要求1所述的工程化多核苷酸，其中所述靶向序列的长度为约：40个、45个、60个、80个、100个、120个、200个或300个核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的工程化多核苷酸，其中所述靶向序列的长度为约100个核苷酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化多核苷酸，其中与所述靶RNA的所述区至少部分地互补的所述靶向序列包括与所述靶RNA的所述区中的核苷酸不互补的至少一个核苷酸。

5.根据权利要求4所述的工程化多核苷酸，其中不互补的所述至少一个核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在A/C错配中。

6.根据权利要求4所述的工程化多核苷酸，其中不互补的所述至少一个核苷酸是所述靶RNA的所述区中的腺苷(A)，并且其中所述A包括在内环或凸起中。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述A是用于编辑的所述靶RNA的所述区中所述核苷酸的所述碱基。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA选自包括以下的组：mRNA、前mRNA、tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、exRNA、scaRNA、YRNA、eRNA和hnRNA。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA是mRNA。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括：凸起、发夹、内环和其任何组合。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括凸起。

12.根据权利要求11所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起是不对称凸起。

13.根据权利要求11所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起是对称凸起。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述凸起的长度为1-4个核苷酸。

15.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括发夹。

16.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括内环。

17.根据权利要求16所述的工程化多核苷酸，其中所述内环的长度为5-50个核苷酸。

18.根据权利要求16或17所述的工程化多核苷酸，其中所述内环的长度为6个核苷酸。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的工程化多核苷酸，其包括至少两个内环。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的工程化多核苷酸，其包括两个内环。

21.根据权利要求20所述的工程化多核苷酸，其中所述两个内环是对称内环。

22.根据权利要求20或21所述的工程化多核苷酸，其中所述两个内环是对称内环，并且所述两个内环的每一侧的长度为6个核苷酸。

23.根据权利要求16所述的工程化多核苷酸，其中所述内环是不对称内环。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的工程化多核苷酸，其包括结构化基序。

25.根据权利要求24所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括以下中的至少两种：所述凸起、所述发夹和所述内环。

26.根据权利要求25所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括所述凸起和所述发夹。

27.根据权利要求25所述的工程化多核苷酸，其中所述结构化基序包括所述凸起和所述内环。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸缺少募集结构域。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA，ADAR)多肽或其生物活性片段，或作用于tRNA的腺苷脱氨酶(ADAT)多肽或其生物活性片段。

30.根据权利要求29所述的工程化多核苷酸，其中所述ADAR多肽或其生物活性片段包括ADAR1或ADAR2。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸进一步包括能够募集所述RNA编辑实体的RNA编辑实体募集结构域。

32.根据权利要求31所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少1至约75个核苷酸。

33.根据权利要求31或32所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域的长度为至少30-50个核苷酸。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述RNA编辑实体募集结构域包括谷氨酸离子型受体AMPA型亚基2(GluR2)序列。

35.根据权利要求34所述的工程化多核苷酸，其中所述GluR2序列包括与SEQ IDNO:1的至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。

36.根据权利要求34所述的工程化多核苷酸，其中所述GluR2序列包括SEQ IDNO:1。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区的长度为5至600个核苷酸、长度为40至400个核苷酸或长度为80至120个核苷酸。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区的长度为50至200个核苷酸。

39.根据权利要求1至38中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区的长度为约100个核苷酸。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA的所述区包括与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。

41.根据权利要求1至40中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述非编码序列包括3'非翻译区(3'UTR)。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述非编码序列包括5'非翻译区(5'UTR)。

43.根据权利要求42所述的工程化多核苷酸，其中对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得至少部分地调节所述LRRK2多肽的基因翻译。

44.根据权利要求42所述的工程化多核苷酸，其中对所述靶RNA的所述区的所述5'UTR中的所述碱基的编辑使得促进所述LRRK2多肽的调节mRNA翻译。

45.根据权利要求1至44中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述LRRK2多肽。

46.根据权利要求45所述的工程化多核苷酸，其中编码所述LRRK2多肽的所述靶RNA包括以下中的至少一部分：poly(A)尾、微RNA应答元件(MRE)、富含AU的元件(ARE)、hnRNP结合位点或其任何组合。

47.根据权利要求45或46所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸被配置成调节所述LRRK2多肽的表达。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的重复序列结构域、所述LRRK2多肽的复合物的Ras(Ras-of-complex，Roc)GTP酶结构域、所述LRRK2多肽的激酶结构域、所述LRRK2多肽的WD40结构域或所述LRRK2多肽的Roc的C末端(COR)结构域。

49.根据权利要求48所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码所述LRRK2多肽的所述激酶结构域。

50.根据权利要求1至49中任一项所述的工程化多核苷酸，其中与编码野生型多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。

51.根据权利要求1至50中任一项所述的工程化多核苷酸，其中与编码野生型LRRK2多肽的在其它方面相当的区相比，所述靶RNA的所述区包括突变。

52.根据权利要求50或51所述的工程化多核苷酸，其中所述突变包括多态性。

53.根据权利要求50至52中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述突变是G至A突变。

54.根据权利要求1至53中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA包括与SEQ IDNO:5-SEQ ID NO:14中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

55.根据权利要求1至54中任一项所述的工程化多肽，其中所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:24中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

56.根据权利要求1至55中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与SEQ ID NO:15的G2019S相对应的突变。

57.根据权利要求1至56所述的工程化多核苷酸，其中所述碱基的所述编辑是与SEQ IDNO:5中的第6055个核苷酸相对应的A的编辑。

58.根据权利要求1至57中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶RNA编码LRRK2多肽，所述LRRK2多肽包括与表3的突变相对应的突变，或表3的突变的任何组合。

59.根据权利要求1至58中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括与以下中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性：SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:86-SEQ IDNO:182。

60.根据权利要求1至59中任一项所述的工程化多核苷酸，其中当所述工程化多核苷酸与所述靶RNA的所述区缔合时，所述缔合包括杂交多核苷酸链。

61.根据权利要求60所述的工程化多核苷酸，其中所述杂交多核苷酸链至少部分地形成双链RNA双链体。

62.根据权利要求1至61中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸进一步包括化学修饰。

63.根据权利要求1至62中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括RNA、DNA或两者。

64.根据权利要求63所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括所述RNA。

65.一种载体，其包括根据权利要求1至64中任一项所述的工程化多核苷酸。

66.根据权利要求65所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

67.根据权利要求66所述的载体，其中所述病毒载体是AAV载体，并且其中所述AAV载体来自具有选自以下的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAV13、AAV 14、AAV 15、AAV 16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16和AAVhu68。

68.根据权利要求67所述的载体，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体、杂交AAV载体、嵌合AAV载体、自互补AAV(scAAV)载体、单链AAV或其任何组合。

69.根据权利要求67至68中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包括来自第一AAV血清型的包括复制基因和反向末端重复序列的基因组以及来自第二AAV血清型的衣壳蛋白。

70.根据权利要求67至69中任一项所述的载体，其中所述AAV载体是AAV2/5载体、AAV2/6载体、AAV2/7载体、AAV2/8载体或AAV2/9载体。

71.根据权利要求67至70中任一项所述的载体，其中所述反向末端重复序列包括5'反向末端重复序列、3'反向末端重复序列和突变的反向末端重复序列。

72.根据权利要求71所述的载体，其中所述突变的反向末端重复序列缺少末端解链位点。

73.一种呈单位剂型的药物组合物，所述药物组合物包括：(a)根据权利要求1至64中任一项所述的工程化多核苷酸；根据权利要求65至72中任一项所述的载体或其任何组合；以及(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

74.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将根据权利要求1至64中任一项所述的工程化多核苷酸与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合。

75.一种分离的细胞，其包括根据权利要求1至64中任一项所述的工程化多核苷酸、根据权利要求65至74中任一项所述的载体或两者。

76.一种试剂盒，其在容器中包括根据权利要求1至64中任一项所述的工程化多核苷酸、根据权利要求65至74中任一项所述的载体或两者。

77.一种制备试剂盒的方法，所述方法包括将根据权利要求1至64中任一项所述的工程化多核苷酸、根据权利要求65至74中任一项所述的载体或两者加入容器中。

78.一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：(a)根据权利要求65至74中任一项所述的载体；(b)根据权利要求73所述的药物组合物；或(c)(a)和(b)。

79.根据权利要求78所述的方法，其中所述施用包括施用治疗有效量的所述载体。

80.根据权利要求78或79所述的方法，其中所述施用至少部分地治疗或预防所述有需要的受试者的所述疾病或所述病状的至少一种症状。

81.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述载体进一步包括或编码第二工程化多核苷酸。

82.根据权利要求78至81中任一项所述的方法，其进一步包括施用包括或编码第二工程化多核苷酸的第二载体。

83.根据权利要求81或82所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸包括与第二靶RNA的区至少部分地杂交的第二靶向序列。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸的所述第二靶向序列与所述第二靶RNA的所述区至少部分地互补。

85.根据权利要求83或84中的权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二靶RNA编码包括以下的多肽：α-突触核蛋白(SNCA)、葡糖神经酰胺酶β(GBA)、PTEN诱导的激酶1(PINK1)、Tau、这些中任一种的生物活性片段或其任何组合。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述第二靶RNA编码所述SNCA多肽或其生物活性片段。

87.根据权利要求81至86中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸被配置成促进所述RNA编辑实体对所述第二靶RNA的区的多核苷酸的核苷酸的碱基的编辑。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述编辑使由所述第二靶RNA编码的多肽的表达降低。

89.根据权利要求81至88中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:33中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

90.根据权利要求81至89中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸编码SCNA多肽，所述SCNA多肽包括与SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:36中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

91.根据权利要求81至90中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸编码SNCA多肽，所述SNCA多肽包括与表6的突变相对应的突变，或表6的突变的任何组合。

92.根据权利要求81至91中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸促进编码SNCA多肽的所述第二靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。

93.根据权利要求81至88中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:48中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

94.根据权利要求81至88或93中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸促进编码Tau多肽的所述第二靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。

95.根据权利要求81至88中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:49的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

96.根据权利要求81至88或95中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸促进编码PINK1多肽的所述第二靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。

97.根据权利要求81至88中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:50-SEQ ID NO:54中的任一个的至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

98.根据权利要求81至88或97中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸促进编码GBA多肽的所述第二靶RNA的翻译起始位点的腺苷(A)的编辑。

99.根据权利要求81至92中任一项所述的方法，其中所述第二工程化多核苷酸包括与SEQ ID NO:183-SEQ ID NO:192中的任一个的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性。

100.根据权利要求78至99中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是中枢神经系统(CNS)、胃肠(GI)道或两者的疾病或病状。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述疾病是所述两者的疾病，并且其中所述疾病是帕金森氏病(Parkinson’s Disease)。

102.根据权利要求100所述的方法，其中所述疾病是所述GI道的疾病，并且其中所述疾病是克罗恩氏病(Crohn’s disease)。

103.根据权利要求78至102中任一项所述的方法，其进一步包括施用二级疗法。

104.根据权利要求103所述的方法，其中所述二级疗法与所述载体同时或顺序施用。

105.根据权利要求103至104所述的方法，其中所述二级疗法包括以下中的至少一种：益生菌、卡比多巴(carbidopa)、左旋多巴(levodopa)、MAO B抑制剂、儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂、抗胆碱能药、金刚烷胺(amantadine)、深部脑刺激、这些中的任一种的盐或其任何组合。

106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法，其中所述载体、所述二级疗法或两者的所述施用独立地进行至少约：每日1次、每日2次、每日3次、每日4次、每周一次、每周两次、每周3次、两周一次、两月一次、每月一次或每年一次。

107.根据权利要求78至106中任一项所述的方法，其进一步包括监测所述受试者的所述疾病或病状。

108.根据权利要求78至107中任一项所述的方法，其中所述载体包括在呈单位剂型的药物组合物中。

109.根据权利要求78至108中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述施用之前被诊断患有所述疾病或所述病状。

110.根据权利要求109所述的方法，其中所述诊断是通过体外测定进行的。

111.根据权利要求78至110中任一项所述的方法，其中如通过测序所测量的，对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的所述编辑包括至少约3％、5％、10％、15％或20％的编辑。

112.根据权利要求111所述的方法，其中所述第二靶RNA编码所述SNCA多肽，并且其中ADAR多肽对所述靶RNA的所述区的所述多核苷酸的所述核苷酸的所述碱基的所述编辑产生经修饰的多肽，所述经修饰的多肽与由所述靶RNA编码的未经修饰的多肽相比包括残基的变化，所述残基的变化包括：

(a)在与SEQ ID NO:15的所述LRRK2多肽的位置2019相对应的位置处的腺嘌呤到肌苷的变化；

(b)在与SEQ ID NO:34的所述SNCA多肽的位置30或53相对应的位置处的腺嘌呤到肌苷的变化；或

(c)(a)和(b)。