DE102015009929A1

DE102015009929A1 - Katalytische Oligonukleotide mit Cap-Strukturen

Info

Publication number: DE102015009929A1
Application number: DE102015009929.9A
Authority: DE
Inventors: Ben Hudjetz; André Mäurer; Carola Wilczek; Holger Hoff
Original assignee: Erdmann Tech GmbH; Erdmann Technologies GmbH
Current assignee: Erdmann Tech GmbH; Erdmann Technologies GmbH
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2017-02-02

Abstract

Die Erfindung betrifft ein katalytisches Oligonukleotid, mit einer ersten Teilsequenz, welche enzymatische Aktivität gegenüber einer vorgegebenen Target Nukleinsäuresequenz aufweist, und mit zumindest einer zweiten Teilsequenz, welche an einem der Enden der ersten Teilsequenz unmittelbar anschließend gebunden ist, aber nicht an die Target Nukleinsäuresequenz bindet. Die Erfindung betrifft des Weiteren verschiedene Verwendungen solcher Oligonukleotide, pharmazeutische Zusammensetzungen mit solchen Oligonukleotiden sowie Verfahren zur Herstellung solcher Oligonukleotide und pharmazeutischen Zusammensetzungen.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft katalytisch aktive Oligonukleotide, welche sequenzspezifisch andere Nukleinsäuren, insbesondere RNA, durch hydrolytische Aktivität zerschneiden und Cap-Strukturen umfassen. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ferner pharmazeutische Zubereitungen hiervon.
Technischer Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Nukleinsäuren haben in den letzten 20 Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen unter anderem als Hoffnungsträger für neuartige Wirkstoffe (Khachigian LV, Nucleic Acid Therapeutics 2000) und für Anwendungen in der Molekularbiologie (Breaker R., Nature, 2004). Katalytisch aktive Nukleinsäuren, darunter enzymatische Ribonukleinsäuren (Ribozyme, Kruger K, Cell, 1982) undenzymatische Desoxyribonukleinsäuren (DNAzyme, Santoro, PNAS, 1997), kommen insbesondere in der medizinischen Anwendung als innovative Wirkstoffe bei Mensch und Tier in Betracht.
Das medizinische Potential solcher Enzyme liegt im Wesentlichen darin, dass sie zelluläre Zielstrukturen, insbesondere RNA, sequenzspezifisch zerschneiden können. Ihre Spezifität macht sie niedermolekularen Wirkstoffen überlegen, die typischerweise nicht nur mit dem Target, sondern auch mit strukturell verwandten Proteinen interagieren können (Swingle et al., Methods Mol Biol. 2007). Darüber hinaus sind sie allgemein in der Medizin von großem Interesse, weil sie krankheitsrelevante RNA-Moleküle reduzieren können. Zum Beispiel lässt sich das RNA-Molekül des Gens H19 in einer Vielzahl von Tumorgeweben nachweisen, (vgl. Yarmishyn and Kurochkin, Front Genet. 2015) was es als Substrat für maßgeschneiderte katalytische Oligonukleotide interessant macht. Tatsächlich haben verschiedene Arbeitsgruppen gezeigt, dass sich das Tumorwachstum durch Inaktivierung von H19 RNA inhibieren lässt (z. B. Matouk et al., PlosOne 2007). Aber auch bei der Bekämpfung von pathogenen Mikroorganismen ergeben sich Angriffspunkte für Wirkstoffe auf enzymatischer Nukleinsäurebasis, welche z. B. bei Viren gezielt entweder das virale Genom oder essentielle virale RNA-Moleküle zerschneiden und somit das Virus an der Replikation hindern können.
Grundsätzlich kommen für die medizinische Verwendung von katalytischen Oligonukleotiden sowohl Ribozyme als auch DNAzyme in Betracht. Nachteil solcher unmodifizierter Enzyme ist ihre geringe Stabilität gegenüber dem Abbau durch zelluläre Exo- und Endonukleasen (Beigelman et al. J Biol Chem 1995, Schubert et al. 2003). Eine bekannte Methode, um diese Enzyme für ihre Anwendbarkeit als Wirkstoff zu optimieren, ist der Nukleotidaustausch der katalytischen Oligonukleotide durch sogenannte Nukleotidanaloga. Diese umfassen dem Fachmann bekannte chemische Modifikationen an Nukleotiden, namentlich an der Base, dem Zucker und/oder der Phosphatgruppe. Nähere Ausführungen hierzu sind beispielsweise den Publikationen Verma/Eckstein, Annu Rev Biochem 1998 und Beigelman et al., J Biol Chem 1995, zu entnehmen.
Der Einbau solcher chemischer Modifikationen kann grundsätzlich an jeder Nukleotidposition eines Oligonukleotids stattfinden. Sproat et al., Nucl. Acid Res. 1989, konnten beispielsweise durch Einbau von 2-O-methyl-modifizierten Nukleotiden und invertierten D-Nukleotiden in die Bindungsarme und in das katalytische Zentrum eines Ribozyms die Nukleaseresistenz steigern. Auch Pieken W. et al., Science 1991, erzielten eine erhöhte Stabilität durch Einbau von 2'-Fluoro- und 2'-Amino-modifizierten Nukleotiden in das katalytische Zentrum eines Hammerhead-Ribozyms.
In ähnlicher Weise lassen sich auch DNAzyme durch Austausch unmodifizierter Nukleotide gegen Nukleotidanalogastabilisierengegen zellulären Nukleaseabbau, wie beispielsweise Schubert S et al., Nucleic Acids Res. 2003, mit dem Einbau eines invertierten Nukleotids am 3'-Ende gezeigt haben. Andere Nukleotidanaloga, welche prinzipiell geeignet sind, um als Cap-Struktur zur Stabilität des Enyzms beizutragen, sind aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. Matulic-Adamic et al. US 5,998,203 ). Matulic-Adams aaO. zeigen dabei eine Gruppe verschiedener Nukleotidanaloga auf, die geeignet sind, die Stabilität gegen den Abbau durch zelluläre Nukleasen zu erhöhen. Dabei können die Nukleotidanaloga jeweils als einzelnes Monomer am 5'- und/oder 3'-Ende in Form einer Cap-Struktur verwendet werden. Allerdings kommen nicht alle diese Nukleotidanaloga als Bestandteile therapeutisch wirkender Nukleinsäuren in Betracht. So erhöhen zwar beispielsweise Phosphorothioate im Phosphatgerüst die katalytische Aktivität/Stabilität des Enzyms, gleichzeitig besitzen sie aber ein immunogenes und/oder toxisches Potential (Iannitti T et al., Curr Drug Targets (2014)). Gleiches gilt für andere chemische Modifikationen (vgl. Swayze et al., Nucleic Acids Res. 2007). Demgegenüber gelten L-Nukleotide, als der stereoisomeren der D-Nukleotide, sowohl unmodifiziert (Vater et al., Drug Discov Today. 2015) als auch modifiziert (Vyas et al. PNAS, 2014) als nicht-toxisch und nicht-immunogen.
Natürliche Nukleasen können L-Nukleotide in Nukleinsäuren nicht als Substrat erkennen und demzufolge nicht abbauen. Diese Eigenschaft der L-Nukleotide lässt sich für Cap-Strukturen katalytischer Nukleinsäuren verwenden (Matulic-Adamic US Patent 5,998,203 ). Matulic-Adamic et al. verwenden Cap-Strukturen mit nur jeweils einem L-Nukleotid am 5'- und 3-'Ende der beschriebenen Enzyme aus Gründen der Stabilität.
Technisches Problem der Erfindung
Wünschenswert ist jedoch insbesondere für die therapeutische Verwendung eines katalytischen Oligonukleotids neben seiner Stabilität gegen den Abbau von zellulären Nukleasen vor allem die Beibehaltung seiner katalytischen Aktivität oder sogar einer Steigerung derselben.
Wünschenswert ist es insbesondere für die medizinische Verwendung, katalytische Oligonukleotide umfassendCap-Strukturen bereitzustellen, die zugleich die Stabilität wie die katalytische Aktivität erhöhen und welche nicht-toxisch und nicht-immunogen sind. Vorzügswürdig sind katalytische Oligonukleotide umfassend Cap-Strukturen, welche einfach herzustellen und dem jeweiligen katalytischen Oligonukleotid am 5'- und/oder 3'-Ende anfügbar sind. Ein weiteres vorzugswürdiges Merkmal der Lösung sollte sein, dass die Steigerung der katalytischen Aktivität dort besonders auftritt, wo das ungecappte katalytische Oligonukleotid eine geringe Turnoverrate besitzt und wo es zu therapeutischen Zwecken beispielsweise einen oder mehrere Linker und hieran verknüpften Aptamere usw. umfasst, die seine Turnoverrate nachteilig beeinflussen können. Eine hohe Turnoverrate als Ergebnis solcherart gecappten katalytischen Oligonukleotide ist wünschenswert beispielsweise zur Inhibierung von hochexprimierten Targets, wie zum Beispiel viralen Genexpressionsprodukten.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsbeispiele
Die Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert. Hierbei entspricht die erste Teilsequenz der folgend als „Enzym” bezeichneten Teilsequenz und die zweiten Teilsequenzen entsprechen den folgend als N_o bzw. N_p bezeichneten Teilsequenzen.
Die Erfinder haben gefunden, dass durch Verwendung einer definierten Zahl insbesondere an L-Nukleotiden am 5'- und/oder 3'-Ende eines Enzyms gegenüber nicht gecappten Enzymen unerwarteterweise nicht nur die Stabilität der katalytischen Oligonukleotide weiter erhöht wird, sondern insbesondere ihre katalytische Aktivität. Der Effekt der gesteigerten katalytischen Aktivität durch die Verwendung von L-Nukleotiden am 5'- und/oder 3'-Ende wird überdies begleitet von dem Vorteil eines überlegenen Nebenwirkungsprofilsin Bezug auf Toxizität und Immunogenität. Der Effekt tritt dabei umso deutlicher zutage, je niedriger die katalytische Ausgangsaktivität des ungecappten Enzyms liegt. Damit lassen sich über den Stand der Technik hinaus wünschenswerte und überlegene Eigenschaften für eine pharmazeutische Verwendung erzielen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, katalytische Oligonukleotide bereit zustellen, welche die vorstehend dargelegten Anforderungen erfüllen bzw. die dargelegten Nachteile nicht mehr aufweisen. Dies wird erreicht durch ein katalytisches Oligonukleotid, umfassend eine definierte Zahl von vorzugsweise L-Nukleotiden jeweils angehängt an den 5'- und/oder 3' Enden, zur Steigerung der Stabilität und der katalytischen Aktivität und welche den Vorzug einer möglichst geringen Toxizität und Immunogenität besitzen.
Die vorliegende Erfindung lehrt daher katalytische Oligonukleotide mit folgender Sequenz: [5']N_o-E-N_p[3'] mit E = Enzym mit zur Targetsequenz komplementären Bindungsarmen aus 6–15 Nukleotiden, bevorzugt 8–12 Nukleotiden, höchst bevorzugt 9–10 Nukleotiden und dem katalytischen Zentrum, ausgewählt aus der Gruppe der
DNAzyme:, 10–23'-DNAzym, 8–17-DNAzym (Santoro und Joyce, PNAS 1997); wobei die Aufzählung nur beispielhaft und nicht ausschließlich gemeint ist,
oder
Ribozymen, insbesondere Hammerhead-Ribozyme, Hairpin-Ribozyme, Hepatitis Delta Virus, VS RNA (Ward W et al. Chem. Rev. 2014).
oder
katalytischen Oligonukleotide, beinhaltend eine Mischung von Ribonukleotiden und Desoxyribonukleotiden (Perreault JP et al.,Nature 1990).
wobei das Enyzm aus D- und/oder L-Nukleotiden (Klussmann et al., Nature Biotech. 1996) und/oder D- und/oder L-Nukleotidanaloga besteht,
wobei die L-Nukleotidanaloga und ihre Synthese dem Fachmann bekannt sind
wobei die D-Nukleotidanaloga ausgewählt sind aus der Gruppe M, umfassend:
2'-0-Alkyl (z. B. 2'-0-allyl; Sproat et al., 1990. Nucleic Acids Res., 18: 41), 2'-O-Alkylthioalkyl (z. B. 2'-O-Methylthiomethyl; Karpeisky et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides 16, 955–958), 2'-C-Alkyl (Beigelman et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 25702), 2,6-Diaminopurin (Strobel et al., 1994, Biochemistry 33(46), 13824–13835), 2'-(N-alanyl)amino-2'-deoxynucleotide, 2'-(N-beta-alanyl)amino; 2'-deoxy-2'-(lysy)amino, 2'-O-amino (Karpeisky et al, 1998 Tetrahedron Lett. 39, 1131–1134), 2'-deoxy-2'-(N-histidyl)amino, 5-Methyl (Strobel, supra), 2'-(N-b-carboxamidine-beta-alanyl)amino, 2'-Deoxy-2'-(N-beta-alanyl) (Matulic-Adamic et al, 1995, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 5, 2721–2724), 5'-modifizierte Nukleoside (Mikhailov et al., 1991, Nucleosides and Nucleotides, 10, 393–343; Saha et al., 1995, J. Org. Chem., 60, 788–789; Beigelman et al., 1995 Nucleosides and Nucleotides, 14, 901–905); Xylofuranosyl, 1–5-Anhydrohexitol (Rosemeyer et al, 1991, Helvetica Chem. Ada, 74, 748; Seda et al, 1994, Helvetica Chem. Acta, 77, 883; Seela et al., 1996, Helvetica Chem. Acta, 79, 1451); Inosin, Purine, Pyridin-4-on, Pyridin-2-on, Phenyl, Pseudouracil, 2,4,6-Trimethoxybenzen, 3-Methyluracil, Dihydrouridin, Naphthyl, Aminophenyl, 5-Alkylcytidin (z. B. 5-Methylcytidin), 5-Alkyluridin (z. B. Ribothymidin), 5-Halouridin (z. B. 5-Bromouridin) oder 6-Azapyrimidin oder 6-Alkylpyrimidin (z. B. 6-Methyluridin), Propin (Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090), LNA(BNA)s (bizyklische Nukleinsäuren oder ,locked nucleic acids'; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455–456) sowie weitere, dem Fachmann geläufige Beispiele und Syntheseverfahren von chemischen Modifikationen an Basen und Zuckern, beispielsweise 3-(β-D-Ribofuranosyl)-2-fluoropyridin (Matulic-Adamic et al., US6248878 B1 ).
Als 3'- und 5'-Cap-Strukturen besonders geeignete, aber nicht limitierende D-Nukleotid-Analoga:
Invertierte abasische Reste, 5'-Methylen-Nukleotide; 1-(Beta-D-erythrofuranosyl)nukleotide, 4'-Thionukleotide, carbozyklische Nukleotide; Alpha-Nukleotide; Phosphorodithioat-Linker; Threo-pentofuranosyl-Nukleotide; azyklische 3',4'-Seco-Nukleotide; azyklische 3,4-Dihydroxybutyl-Nukleotide; azyklische 3,5-Dihydroxypentyl-Nukleotide, 3'-3'-invertierte Nukleotidreste; 3'-3'-invertierte abasische Reste; 3'-2'-invertierteNukleotidreste; 3'-2'-invertierte abasische Reste; 1,4-Butandiol-Phosphat; 3'-Phosphoramidate; Hexylphosphate; Aminohexylphosphate; 3'-Phosphate; 3'-Phosphorothioate; Phosphorodithioate; verbrückende oder nicht verbrückende Methylphosphonat-Reste und 5'-Mercapto-Reste, 4',5'-Methylennukleotide; 5'-Amino-alkylphosphate; 1,3-Diamino-2-propylphosphate, 3-Aminopropylphosphate; 6-Aminohexylphosphate; 1,2-Aminododecylphosphate; Hydroxypropylphosphate; 5'-5'-invertierte Nukleotidreste; 5-5'-invertierte abasische Reste; 5'-Phosphoramidate; 5'-Phosphorothioate; 1,4-Butandiolphosphate; 5'-Amino; und verbrückende oder nicht verbrückende 5'-Phosphoramidate (ausführlich Beigelman et al., WO 9726270 , und Beaucage und Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 6123)
mit N als L-Nukleotide und/oder L-Nukleotidanaloga und/oder als zur Targetsequenz nicht komplementäreD-Nukleotide und/oder D-Nukleotidanaloga ausgewählt aus der Gruppe M,
mit o = 0–30 bevorzugt 2–8, höchst bevorzugt 2–3 und p = 1–30 bevorzugt 2–8, höchst bevorzugt 2–3
AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein katalytisches Oligonukleotid, das in der Lage ist, eine Substrat-RNA als Zielsequenz sequenzspezifisch zu zerschneiden. Dabei ist es für die Ausführbarkeit der Erfindung unerheblich, ob das katalytische Oligonukleotid zur Gruppe der DNAzyme oder Ribozyme oder einer Mischung hieraus gehört. Die Zielsequenz kann jedes RNA-Molekül von Interesse sein, beispielsweise die H19 RNA, welche in zahlreichen Tumorgeweben exprimiert ist und welche inhibiert werden soll. Dabei erfolgt die Inhibierung über das hydrolytische Zerschneiden der Zielsequenz an der jeweiligen Schnittstelle. Der Fachmann kann beispielsweise die passende Schnittstelle, die sich für einen enzymatischen Angriff eignet, mit den üblichen bioinformatorischen Methoden heraus finden. Anhand der so gefundenen Sequenz wird der Fachmann sich in für ein katalytisches Oligonukleotid entscheiden, das sich zur Erzielung des erfindungsgemäßen Zwecks, nämlich einer hohen Stabilität und hohen katalytischen Aktivität eignet mit zur Targetsequenz komplementären Bindungsarmen aus 6–15 Nukleotiden, bevorzugt 8–12 Nukleotiden, höchst bevorzugt 9–10 Nukleotiden und das eine definierte Anzahl an L- und/oder nicht-komplementären D-Nukleotiden am 5'- und/oder 3'- Ende umfasst. [Ausführungsform 1],
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid höchstens 8 L-Nukleotide am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 2] In einer Variante dieser Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 2, höchstens 8 L-Nukleotide am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 2a]
In einer bevorzugten Variante dieser Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 2, höchstens 3 L-Nukleotide am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 2b]
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 1, höchstens 8 L- oder zur Targetsequenz nicht-komplementäre D-Nukleotide am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 3] In einer Variante dieser Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 2, höchstens 8 L- oder zur Targetsequenz nicht-komplementäre D-Nukleotide am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 3a]
In einer bevorzugten Variante dieser Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 2, höchstens 3 L- oder zur Targetsequenz nicht-komplementäre D-Nukleotide am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 3b]
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid höchstens 8 L-Nukleotide oder zur Targetsequenz nicht-komplementäre D-Nukleotidanaloga am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 4] In einer Variante dieser Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 2, höchstens 8 L-Nukleotide oder zur Targetsequenz nicht-komplementäre D-Nukleotidanaloga am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 4a]
In einer bevorzugten Variante dieser Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 2, höchstens 3 L-Nukleotide oder zur Targetsequenz nicht-komplementäre D-Nukleotidanaloga am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 4b]
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 1, höchstens 8 L-Nukleotid- oder zur Targetsequenz nicht-komplementäre L-Nukleotidanaloga am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 5]
In einer Variante dieser Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 2, höchstens 8 L-Nukleotid- oder L-Nukleotidanaloga am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 5a]
In einer bevorzugten Variante dieser Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäß verwendete katalytische Oligonukleotid mindestens 2, höchstens 3 L-Nukleotid- oder L-Nukleotidanaloga am 5'- und/oder 3'-Ende. [Ausführungsform 5b]
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Enzym am 5'- und/oder 3'-Ende mindestens 7 und höchstens 30 Nukleotiden, wobei einige Nukleotide und/oder Nukleotidanaloga an einem oder beiden Enden zu Nukleotiden und/oder Nukleotidanaloga am selben Ende komplementär sein können und so einen doppelsträngigen Bereich ausbilden können. [Ausführungsform 6]
Des Weiteren kann das erfindungsgemäße Enzym in seiner jeweiligen Ausführungsform als pharmazeutische Zubereitung zur Anwendung am Menschen oder Tier verwendet werden [Ausführungsform 7]
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Enzym in einer pharmazeutischen Zubereitung zur Vorbeugung und/oder Behandlung einer Krankheit, beispielsweise einer Tumorerkrankung oder einer Infektion mit Mikroorganismen, verwendet. Die Krankheit kann infolge Überexpression eines für die jeweilige Krankheit ursächlichen Gens entstanden sein, beispielsweise das H19Gen oder durch virale oder bakterielle Infektion. Als virale Infektion kommt beispielsweise die Infektion mit einem Picornavirus in Betracht. [Ausführungsform 7b]
In einer weiteren Ausführungsform wird das jeweilige erfindungsgemäße Enzym am 5' und/oder 3'-Ende mit weiteren Nucleotiden oder mit Proteinen versehen. Diese 5' Erweiterungen können dabei sowohl für erhöhte Stabilität, gezielte Wirkstoffabgabe in bestimmten Zielzellen oder Zielgeweben, gezielte Lokalisierung der Enzyme in den Zielzellen, zur Unterstützung der intrazellulären Freisetzung, eine Immobilisierung auf Trägermaterialien oder eine Markierung mit Farbstoffen oder Quenchern darstellen. Modifikationen am 5'-Ende des Enzyms können unter Umständen zu einer Reduktion der katalytischen Aktivität führen, wobei die katalytische Aktivität durch Einführung von L-Nucleotiden am 5'- und 3' Ende wiederhergestellt werden kann. [Ausführungsform 8]
In einer weiteren Ausführungsform können mehrere erfindungsgemäße, katalytische Oligonukleotide in Kombination oder gemeinsam prophylaktisch wie therapeutisch verwendet werden gegen mindestens einkrankheitsverursachendes und/oder krankheitsförderndes RNA-Molekül. Diese sind meist individuell ausgeprägt und können daher vorzugsweise im Wege der bioinformatorischen Informationsgewinnung durch etablierte bioinformatorische Verfahren angesprochen werden. [Ausführungsform 9]

In einer weiteren Ausführungsform können mehrere erfindungsgemäße, katalytische Oligonukleotide in Kombination oder gemeinsam prophylaktisch wie therapeutisch verwendet werden gegen mindestens eine Schnittstelle innerhalb desselben krankheitsverursachenden und/oder krankheitsfördernden RNA-Moleküls. Diese sind meist individuell ausgeprägt und können daher vorzugsweise im Wege der bioinformatorischen Informationsgewinnung durch etablierte bioinformatorische Verfahren angesprochen werden. [Ausführungsform 10] Definitionen

Armlänge:	Zahl der Nukleotide eines katalytisch aktiven Oligonukleotids, die mit der Zielsequenz eine Basenpaarung eingehen
Basenpaarung:	Über Wasserstoffbrücken vermittelte Interaktion zwischen zwei Basen gemäß einer „Watson-Crick” Basenpaarung: A-T oder U (Adenin und Thymin oder Uracil), G-C (Guanin und Cytosin)
Cap-Nukleotide	Dem aktiven Enzym am 5'- und/oder 3'-Ende kovalent verknüpfte Nukleotide und/oder Nukleotidanaloga
Cap-Struktur:	Modifikationen am 5'- und/oder 3'-Ende eines katalytisch aktiven Oligonukleotids, die nicht Teil des Enzyms sind.
Chemische Modifikation:	Veränderung an der Grundstruktur (Phosphatgruppe, Zucker, Base) eines Nukleotids oder Oligonukleotids
DNAzym:	Katalytisch aktives Oligonukleotid aufgebaut aus Desoxyribonukleotiden, die im Zielstruktur bindenden Bereich komplementär aufgebaut sind.
Immunogenität	Eigenschaft und Maß eines Oligonukleotids zur Auslösung einer Immunantwort
Katalytisch aktive Oligonukleotide:	Enzymatisch aktive RNA- oder DNA-Moleküle aufgebaut aus Desoxy- und/oder Ribonukleotiden oder einer Mischung hieraus, umfassend Cap-Strukturen, welche verschiedene Reaktionen katalysieren und dadurch RNA sequenzspezifisch zerschneiden können
Katalytische Aktivität:	Maß für die Wirksamkeit katalytisch aktiver Oligonukleotide
Katalytisches Zentrum:	Konservierter Bereich eines katalytisch aktiven Oligonukleotids, beinhaltend alle Nukleotide außerhalb der Bindungsarme und der Cap-Strukturen (z. B. Abbildung X)
Komplementäre Basenpaarung:	Begriff wie hier gebraucht umfasst Paarungen von Adenin (A) mit Thymidin (T) oder Uracil (U) oder von Cytosin (C) mit Guanin (G). Angemerkt ist, dass auch seltenere Basenpaarungen, wie sie gelegentlich in der Natur vorkommen, nicht ausgeschlossen sind. Ebenfalls wie hier gebraucht sind auch Basenpaarungen von Inosin (I) mit Cytosin (C) oder Uracil (U) oder Adenin (A) umfasst.
Nukleotid:	Monomere Einheit eines RNA- oder DNA-Moleküls, aufgebaut aus einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Base, einem Zuckerrest (Pentose) und einer Phosphatgruppe. Die Base ist über den glykosidischen Kohlenstoff mit dem Zuckerrest verknüpft, dieser wiederum über die 3'- oder 5'-Position mit einer Phosphatgruppe.
Nukleotidanaloga	Chemisch modifizierte D- oder L-Nukleotide
Ribozym:	Katalytisch aktives Oligonukleotid, aufgebaut aus Ribonukleotiden.
Stabilität:	Widerstandsfähigkeit von Oligonukleotiden gegen den Abbau durch Nukleasen.
Turnoverrate	Ist gleichbedeutend mit der Umsatzrate des katalytisch aktiven Enzyms, welche angibt, welcher Anteil der eingesetzten Zielsequenz in einer bestimmten Zeit hydrolytisch gespaltet wird.
Zielsequenz:	Eine Sequenz in dem zu schneidenden RNA Molekül, welche komplementär zu den Bindungsarmen des Enzyms ist, und welche eine spezifische Spaltstelle besitzt.

MEDIZINISCHE VERWENDUNGEN
H19 RNA und Tumorerkrankungen
Die vorliegende Erfindung lässt sich verwenden zur Inaktivierung der H19 RNA und somit zur Tumorbekämpfung. H19 RNA ist eine lange, nicht-kodierende RNA von 2,3 kb Länge, die nur maternal während der Embryonalentwicklung exprimiert. Die Expression der H19 RNA wird in ausdifferenzierten, adulten Zellen herunterreguliert, sodass im gesunden Gewebe Erwachsener keine oder nur eine sehr geringe Expression nachweisbar ist. Allerdings konnte eine Re-Expression der H19 RNA in über 30 unterschiedlichen Tumorgeweben nachgewiesen werden, darunter, aber nicht abschließend, im Gehirn, Magen, Pankreas, Niere, Dickdarm, Prostata, Haut, Muskeln. Neben der tumorspezifischen Expression der H19 RNA macht auch die Funktion der H19 RNA als Onkogen die H19 RNA zu einem sehr gut geeigneten Target zur Behandlung von Krebs. So wurde gezeigt, dass die Hochregulation der H19 RNA zu einer Verstärkung der Migration und Invasion von Tumorzellen und damit auch zu einer erhöhten Metastasenbildung führt (z. B. Ma C et al., Tumor Biol., 2014). Außerdem bewirkt die Hochregulation der H19 RNA in Tumorzellen eine verstärkte Proliferation (Yang F et al., FEBS J., 2012). Im Gegensatz dazu konnte nachgewiesen werden, dass eine Herunterregulation der H19 RNA sowohl die Proliferation der Tumorzellen hemmt, als auch die Apoptose von Krebszellen induziert (Yu LL et al., BMC Cell Biol., 2013). Die Spaltung der H19 RNA mit Hilfe von katalytisch aktiven Nukleinsäuren wird zu einem Abbau der H19 RNA und damit zu einer Herunterregulation der H19 Expression führen. Dies wiederum wird die Inhibition des Zellzyklus zur Folge haben und zur Induktion von Apoptose in den Tumorzellen führen. Die Anwendung von H19 spezifischen Spiegelzymen zur Behandlung von Krebs ist sowohl lokal als auch systemisch möglich. Lokale Anwendungen wären dabei z. B. die intratumorale Injektion von Spiegelzymen, die Formulierung in einer Creme und die Auftragung auf die Haut oder aber die Anwendung eines Sprays und die Inhalation von Spiegelzymen zur Behandlung von Lungenkrebs oder Lungenmetastasen. Für die systemische Anwendung könnten H19 spezifische Spiegelzyme in liposomalen oder nanopartikulären Formulierungen intravenös verabreicht werden. Zurzeit sind z. B. Liposomen erhältlich, die ein spezifisches Targeting zur Leber oder der Lunge erlauben.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für die vorliegende Erfindung eröffnet sich auf dem Gebiet der Autoimmunerkrankungen durch Adressierung der H19 RNA.
H19 RNA und Autoimmunerkrankungen
Synovialzellen aus Gelenken von Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie z. B. der Rheumatoiden Arthritis, Psoriasis Arthritis, Reaktiven Arthritis oder einer peripheren Arthritis innerhalb der Spondylitis ankylosans haben viele Gemeinsamkeiten mit Krebszellen, wie eine hohe Proliferationsrate und invasives Wachstum in benachbartes Gewebe. Und auch in diesen Synovialzellen aus Patienten mit Rheumatoider Arthritis konnte eine hohe Expression der H19 RNA detektiert werden (Stuhlmüller B et al., Am J Path., 2003). Aufgrund der Ähnlichkeiten zu Tumorzellen ist anzunehmen, dass auch in den Synovialzellen entzündeter Gelenke die H19 RNA für die hohe Proliferation und das invasive Wachstum verantwortlich ist. Daher ist auch hier eine Behandlung mit H19 RNA spezifischen Spiegelzymen möglich. Daher könnte eine systemische oder lokale Behandlung mit H19 spezifischen Spiegelzymen zu einer symptomatischen Verbesserung von Autoimmunerkrankungen führen.
Coxsackie-Viren und Myokarditis
Coxsackie-Viren (Synonyme: Coxsackievirus-Infektion; Coxsackievirus-Krankheit; Hand-Fuß-Mund-Exanthem; ICD-10 634.1: Infektion durch Enteroviren nicht näher bezeichneter Lokalisation) sind RNA-Viren und zählen zur Gattung der Enteroviren, zur Familie der Picornaviren. Es werden die Serotypen A und B unterschieden, die sich wiederum in mehrere Untergruppen einteilen lassen. Zu den Picornaviren zählen gleichzeitig auch die Polioviren (Erreger der Poliomyelitis/Kinderlähmung) sowie das Hepatitis A-Virus.
Coxsackie-Viren gelten als Erreger vieler verschiedener Erkrankungen. Der Mensch stellt zurzeit das einzige relevante Erregerreservoir dar. Die Infektionen treten weltweit auf und haben eine hohe Durchseuchung. Die Kontagiosität (Ansteckungskraft bzw. Übertragungsfähigkeit des Erregers) ist hoch. Die Erreger sind relativ unempfindlich gegen Desinfektionsmittel. Die Übertragung des Erregers (Infektionsweg) erfolgt fäkal-oral (Infektionen, bei dem mit dem Stuhl (fäkal) ausgeschiedene Erreger über den Mund (oral) aufgenommen werden. Auch ist eine Übertragung durch Sekrete des Respirationstraktes (Atmungsapparat) oder eine Schmierinfektion (z. B. bei Konjunktivitis/Bindehautentzündung) möglich. Die Erkrankung tritt vorwiegend bei Kindern auf.
Die Therapie erfolgt symptomatisch. Der Verlauf ist meist mild. Komplikationen werden bei Infektionen mit dem Coxsackie-B-Virus beobachtet. Diese können u. a. eine Meningitis (Hirnhautentzündung), Meningoenzephalitis (Hirnhaut-Gehirn-Entzündung), Myokarditis (Herzmuskelentzündung) oder Perikarditis (Herzbeutelentzündung) sein.
In der Regel verlaufen virus-induzierte Herzmuskelentzündungen akut. Die 10-Jahres-Mortalität der akuten Myokarditis beträgt bis zu 45%, Enterovirusinfektionen weisen sogar eine Mortalität von bis zu 67% auf (McCarthy, III et al., 2000; Felker et al., 2000). Virusinduzierte Entzündungen des Herzens gehen mit Schädigung der kardialen Myozyten und einer leuko- bzw. lymphozytären Entzündungszellinfiltration einher, wobei das klinische Bild und der Schweregrad variieren. Akut verlaufende Myokarditis heilt in der Mehrzahl der Fälle ohne erkennbare Störungen aus, bei schwereren Fällen kommt es dagegen zu einer ausgebreiteten Myozytenlyse mit Fibrose und Vernarbung des Gewebes, die zu einer akuten Herzinsuffizienz führen. Im chronischen Verlauf kann die Myokarditis weiterhin die Ausbildung einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) bedingen, die von -Virenauffälligen Strukturveränderungen des Herzmuskels begleitet wird und zu einer fortschreitenden Verschlechterung der kardialen Pumpfunktion führt. In Deutschland liegt derzeit die Prävalenz der Herzinsuffizienz bei ca. 1,5 Mio. Patienten, so dass davon auszugehen ist, dass mindestens 500.000 Patienten an einer DCM leiden. Vor allem bei jüngeren Menschen (3.–5. Lebensdekade) ist sie dabei häufiger vertreten. Da die Krankheit zurzeit nur symptomatisch behandelt werden kann, stellt die DCM trotz neuer verbesserter Therapieformen neben der koronaren Herzkrankheit die Hauptursache für eine Herztransplantation. Die Therapie virusbedingter Kardiomyopathien basiert gegenwärtig hauptsächlich auf symptomatischen Behandlungsschemata, und trotz neuer medikamentöser Therapiemaßnahmen, liegt bei der DCM die 5-Jahres-Mortalität noch immer über 50% (Dec and Fuster, 1994). Letztendlich stellt neben der symptomatischen medikamentösen Behandlung die Herztransplantation für die meisten Patienten die derzeit einzige akzeptierte palliative Therapieoption dar.
PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
Die vorliegende Erfindung kann als pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden. Zweck der pharmazeutischen Zusammensetzung ist die Behandlung oder das Verhindern des Auftretens einer Krankheit in Mensch oder Tier oder die Kombination aus beiden Behandlungsformen. Dabei kann das erfindungsgemäße katalytische Oligonukleotid zur Spaltung von (endogenen oder auch exogenen, beispielsweise aus viralen oder bakteriellen Quellen in Verfolgung einer Infektion stammenden) Nukleinsäuren, im wesentlichen RNA, aber auch DNA, eingesetzt werden. In Bezug auf das Schneiden von DNA ist ergänzend auf die Literaturstellen Lu, Y. et al., Current Opinions in Biotechnology, 2006, oder Jiang, D., et al., FEBS 2010 zu verweisen.
Insbesondere können damit Krankheiten therapiert werden, welche mit einer bestimmten RNA bzw. DNA, oder der Überexpression eines dadurch kodierten Expressionsproduktes einhergehen. Das erfindungsgemäße, katalytische Oligonukleotid wird folglich als Inhibitor in Hinblick auf dieses Expressionsprodukt funktionieren, nämlich indem die Expression unterbunden oder reduziert wird durch Spaltung der dafür kodierenden RNA bzw. DNA. Dabei ist die spezifische Targetsequenz (also der zu spaltenden bzw. zu bindenden RNA bzw. DNA) im Rahmen der Erfindung insoweit irrelevant, als dass damit beliebige Targets inhibiert werden können. Es ist lediglich notwendig, das erfindungsgemäße, katalytische Oligonukleotid, dessen Sequenz der Sequenz der Targetsequenz im Bereich der ausgewählten Spaltstelle in der beschriebenen Weise anzupassen. Damit lassen sich grundsätzlich beliebige Indikationen erfassen, sofern die zu therapierende Erkrankung ursächlich mit der betreffenden Targetsequenz zusammenhängt.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung in pharmakologisch wirksamer Dosis. Dabei wird das erfindungsgemäße Oligonukleotid typischerweise mit galenischen Hilfs und/oder Trägerstoffen gemischt. Es ist im Rahmen der Herrichtung auch möglich, fachübliche Substanzen, welche die Endozytose (des Oligonukleotids) fördern, entweder kovalent an das Oligonukleotid zu koppeln, oder der Zusammensetzung separat beizumengen.
Grundsätzlich können ein oder mehrere physiologisch verträgliche Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe mit dem erfindungsgemäßen Oligonukleotid gemischt und die Mischung galenisch zur lokalen oder systemischen Gabe, insbesondere – aber nicht ausschließlich – oral, parenteral, zur Infusion bzw. Infundierung in ein Zielorgan, zur Injektion (z. B. i. V., i. m., intrakapsulär oder intralumbal), zur Applikation in Zahntaschen (Raum zwischen Zahnwurzel und Zahnfleisch) und/oder zur Inhalation hergerichtet werden. Die Auswahl der Zusatz und/oder Hilfsstoffe wird von der gewählten Darreichungsform abhängen. Die galenische Herrichtung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann dabei in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Mg<++>, Pb<++>, Mn<++>, Ca<++>, CaCl<+>, Na+, +, Li+ oder Cyclohexylammonium, bzw. Cl<–>, Br<–>, Acetat, Trifluoracetat, Propionat, Laktat, Oxalat, Malonat, Maleinat, Citrat, Benzoat, Salicylat, Putrecin, Cadaverin, Spermidin, Spermin, usw. in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i. v., i. p., i. m., s. c.) oder Vernebelung (Aerosole), Zubereitungsformen zur Trockenpulverinhalation, transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Auch ist es möglich, den Wirkstoff in vorzugsweise biologisch abbaubaren Nanokapseln zu verkapseln oder in Poren poröser Nanopartikel, biologisch abbaubar oder stabil, einzubringen, beispielsweise zur Herstellung einer Zubereitung zur Inhalation. Aber auch der Einsatz von Nanopartikeln aus D- und L-Nukleinsäuren ist möglich, beispielsweise für das Zelltargeting (Zhao, W. et al, Nanotechnology, 2011). Weitere, für das Delivery der vorliegenden Erfindung zum zellulären Target in Betracht kommende pharmazeutische Formulierungen lassen sich für den Fachmann auf der Grundlage von beispielsweise Liposomenkomplexen oder Mikroemulsionen (vgl. Bali et al. Recent Pat Drug Delv. Formul 2008) herstellen.
Als Hilfsstoffe seien beispielsweise Natriumcarbonate, Magnesiumcarbonat, Magnesiumbicarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker oder Cyklodextrine, Cyklodextrin-basierte Polymere, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße, pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens eine erfindungsgemäß verwendete Substanzkombination in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Dosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist. Als Verdünnungsmittel kommen Polyglykole, Wasser, Dimethylsulfoxid (beispielsweise für Präparationen zur Behandlung von Hauterkrankungen oder Rheuma) und Pufferlösungen in Frage. Geeignete Puffersubstanzen sind beispielsweise N,N'-Dibenzylethylendiamin, Diethanolamin, Ethylendiamin, N-Methylglucamin, N-Benzylphenethylamin, Diethylamin, Phosphat, Natriumbicarbonat, oder Natriumcarbonat. Es kann aber auch ohne Verdünnungsmittel gearbeitet werden. Physiologisch verträgliche Salze sind Salze mit anorganischen oder organischen Säuren, wie z. B. Milchsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Citronensäure, p-Toluolsulfonsäure, oder mit anorganischen oder organischen Basen, wie z. B. NaOH, KOH, Mg(OH)2, Diethanolamin, Ethylendiamin, oder mit Aminosäuren, wie Arginin, Lysin, Glutaminsäure usw. oder mit anorganischen Salzen, wie CaCl2, NaCl oder deren freie Ionen, wie Ca<2+>, Na<+>, Pb<++>, Cl<->, S04<2-> bzw. entsprechende Salze und freien Ionen des Mg<++> oder Mn<++>, oder Kombinationen hieraus. Sie werden nach Standardmethoden hergestellt. Vorzugsweise wird ein pH-Wert im Bereich zwischen 5 und 9, insbesondere zwischen 6 und 8, eingestellt.

*Anm: L-Nukleotide sind in Klammern dargestellt. Schnittstellen sind unterstrichen.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
: Stabilität verschiedener Varianten von katalytischen Desoxyribonukleotiden
: Einfluss verschiedener Längen aus Cap-Nukleotiden auf die Stabilität von katalytischen Desoxyribonukleotiden
: Steigerung der katalytischen Aktivität von katalytischen Desoxyribonukleotiden mit Bindungsarmen von 6-Nukleotiden Länge und L-Nukleotiden unterschiedlicher Anzahl als Cap-Struktur
: Steigerung der katalytischen Aktivität von katalytischen Desoxyribonukleotiden mit Bindungsarmen von 9-Nukleotiden Länge und L-Nukleotiden unterschiedlicher Anzahl als Cap-Struktur
: Einfluss einerCap-Struktur mit 4–5 Nukleotiden am 5' und 3' Ende auf die katalytische Aktivität von Desoxyribonukleotiden mit Bindungsarmen von 9-Nukleotiden Länge
: Stabilität verschiedener Varianten von katalytischen Desoxyribonukleotiden
: Einfluss einerCap-Struktur mit 2 Nukleotiden am 5' und 3' Ende auf die katalytische Aktivität von Desoxyribonukleotiden mit Bindungsarmen von 10-Nukleotiden Länge
: Stabilität verschiedener Varianten von katalytischen Desoxyribonukleotiden
: Einfluss einerCap-Struktur mit 2 Nukleotiden am 5' und 3' Ende auf die katalytische Aktivität von Desoxyribonukleotiden mit Bindungsarmen von 10-Nukleotiden Länge
: Schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen DNAzyms
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele beschreiben die Stabilität und katalytische Aktivität der erfindungsgemäßen Oligonukleotide umfassend angehängte Nukleotide an 5' und-/oder 3' Enden. Die aufgeführten Beispiele sind nicht limitierend und beschränken die Erfindung nicht.
Beispiel 1:
Material und Methoden:
Sequenzen:
Nukleotide in L-Konformation sind in Klammern dargestellt.
Stabilitätstest:
Die Dz Varianten wurden in einer Konzentration von 10 μM eingesetzt und in 10% bzw. 50% FKS inkubiert. Nach den angegebene Zeiten wurde ein Aliquot von 10 μl des Ansatzes abgenommen und mit 10 μl eines 2 × Ladepuffers (90% Formamide, 20 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% Xylencyanol, 0,1% Bromophenol Blue, 10% Glycerol) versetzt. Bis zur Analyse mittels eines 20%igen PAA-Geles (7M Urea) wurden die Proben bei –20°C gelagert. Die Dz wurden mit Hilfe einer Färbung des Geles in Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Hydrolyse Assays:
Die am 5'-Ende mit 6-FAM markierte Target RNA wurde in einer Konzentration von 0,4 μM eingesetzt und zusammen mit den Dz in einer Konzentration von 0,04 μM inkubiert. Der Puffer enthält 10 mM Spermidine, 50 mM Tris (pH 7,5) und 160 mM KCl. Nach einem Denaturierungsschritt von 73°C für 2 Minuten und Abkühlen auf 37°C wird MgCl₂ in einer Konzentration von 10 mM zugegeben. Die Hydrolyse erfolgte für die angegebenen Zeiten bei 37°C. Nach den angegebene Zeiten wurde ein Aliquot von 10 μl des Ansatzes abgenommen und mit 10 μl eines 2 × Ladepuffers (90% Formamide, 20 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% Xylencyanol, 0,1% Bromophenol Blue, 10% Glycerol) versetzt. Bis zur Analyse mittels eines 20%igen PAA-Geles (7M Urea) wurden die Proben bei –20°C gelagert. Die Target RNA wurde über die 6-FAM Markierung im Amersham Imager 600 sichtbar gemacht. Die Banden wurden mithilfe der Amersham Imager 600 Software quantifiziert.
zeigt die Stabilität der verschiedenen DNAzym (Dz) Dz Varianten mit einer Länge der Hybridisierungsarme von 9 Nukleotiden in 10% fötalem Kälberserum (FKS) bei 37°C über einen Zeitraum von 48 h. Folgende Dz Varianten wurden untersucht: H19(1410)-(9): unmodifiziertes Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden; H19(1410)-(9)-3L(3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und 3 L-Nukleotiden am 3'-Ende; H19(1410)-(9)-3L(5'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und 3 L-Nukleotiden am 5'-Ende; H19(1410)-(9)-2L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende; H19(1410)-(9)-3L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 3 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende. Die Dz Varianten wurden in einer Konzentration von 10 μM eingesetzt und in 10% FKS bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Die Dz Varianten wurden durch Färbung des PAA-Geles mittels Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Während das unmodifizierte Dz 8 Stunden lang nachweisbar ist, kann die Variante mit 3 L-Nukleotiden nur am 3'-Ende auch nach 24 h noch nachgewiesen werden. Eine Modifikation nur des 5'-Endes mit 3 L-Nukleotiden hat keinen großen Einfluss auf die Stabilität von Dz. Auch eineCap-Struktur mit nur 2 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende erhöht die Stabilität gegen den Abbau durch Exonukleasen, aber etwas geringer als eineCap-Struktur mit jeweils 3 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende. Ein Dz mit einer Modifikation sowohl des 5'- als auch 3'-Endes mit 3 L-Nukleotiden zeigt die höchste Stabilität und ist auch noch nach 48 h nachweisbar.
zeigt den Einfluss von längeren Cap-Strukturen aus L-Nukleotiden auf die Stabilität von verschiedenen Dz Varianten in 50% FKS bei 37°C über einen Zeitraum von 48 h. Folgende Dz Varianten wurden eingesetzt: H19(1410)-(9): unmodifiziertes Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden; H19(1410)-(9)-3L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 3 L-Nukleotiden am 5' und 3'-Ende; H19(1410)-(9)-4L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 4 L-Nukleotiden am 5'-Ende und 3'-Ende; H19(1410)-(9)-5L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 5 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende. Die Dz Varianten wurden in einer Konzentration von 10 μM eingesetzt und in 50% FKS bei 37°C inkubiert. Die Dz Varianten wurden durch Färbung des PAA-Geles mittels Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Während das unmodifizierte Dz maximal 2 Stunden nachweisbar ist, kann die Variante mit 3 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende auch nach 8 h noch nachgewiesen werden. Eine Verlängerung derCap-Struktur aus L-Nukleotiden auf 4 oder 5 L-Nukleotide am 5'- und 3'-Ende hat keinen signifikanten Einfluss auf die Stabilität. Auch diese beiden Varianten sind bis zu 8 h in 50% FKS detektierbar und nach 16 h praktisch vollständig abgebaut.
zeigt die Steigerung der katalytischen Aktivität von Dz mit Hybridisierungsarmen von 6 Nukleotiden Länge durch das Cap-Struktur der 5'- und 3'-Enden mit L-Nukleotiden. Folgende Dz Varianten wurden eingesetzt: H19(1410)-(6): unmodifiziertes Dz mit Armlängen von 6 Nukleotiden; H19(1410)-(6)-1L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 6 Nukleotiden und je 1 L-Nukleotid am 5'- und 3'-Ende; H19(1410)-(6)-2L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 6 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende; H19(1410)-(6)-3L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 6 Nukleotiden und je 3 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende. Die am 5'-Ende mit 6-FAM markierte Target RNA (14 Nukleotide) wurde hierfür in einer Konzentration von 0,4 μM eingesetzt und mit den Dz Varianten in einer Konzentration von 0,04 μM inkubiert, also in einem Unterschuss von 0,1 × („multiple-turnover” Bedingungen). Nach einem Denaturierungsschritt von 73°C für 2 Minuten und Zugabe von 10 mM MgCl2 erfolgte die Hydrolyse in Tris Puffer (50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM Spermidine, 160 mM KCl) für die angegebenen Zeiten bei 37°C. Die RNA wurde anschließend auf einem 20% PAA-Gel (7M Urea) aufgetrennt. Die Target RNA wurde über die 6-FAM Markierung im Amersham Imager 600 sichtbar gemacht. Die Banden wurden mithilfe der Amersham Imager 600 Software quantifiziert. Dabei hat ein Cap-Struktur mit nur einem L-Nukleotid am 5'- und 3'-Ende nur einen minimalen Effekt auf die hydrolytische Aktivität von Dz (grau, durchgezogenen Linie) und zeigt eine mit dem unmodifizierten Dz fast identische Kurve (grau, gepunktete Linie). Eine Modifikation mit 2 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende erhöht dagegen deutlich die Aktivität des Dz (schwarz, gepunktete Linie). Eine Modifikation mit 3 L-Nukleotiden sowohl am 5'- als auch 3'-Ende (schwarz, durchgezogene Linie) hat im Vergleich zu einem Cap-Struktur mit je 2 L-Nukleotiden nochmals eine deutliche Verbesserung der katalytischen Aktivität zur Folge.
zeigt, dass eine Steigerung der katalytischen Aktivität durch die Modifikation des 5'- und des 3'-Endes mit jeweils 3 L-Nukleotiden auch bei Enzymen mit optimierter Armlänge von 9 Nukleotiden nachweisbar ist. Folgende Dz Varianten wurden eingesetzt: H19(1410)-(9): unmodifiziertes Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden; H19(1410)-(9)-3L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 3 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende; H19(1410)-SZ-(9): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und 2 L-Nukleotiden an Position 16 und 17; H19(1410)-SZ-(9)-3L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und 2 L-Nukleotiden an Position 16 und 17 sowie je 3 L-Nukleotiden am 5:- und 3'-Ende. Die am 5'-Ende mit 6-FAM markierte Target RNA (31 Nukleotide) wurde hierfür in einer Konzentration von 0,4 μM eingesetzt und mit den Dz Varianten in einer Konzentration von 0,04 μM inkubiert, also in einem Unterschuss von 0,1 × („multiple-turnover” Bedingungen). Nach einem Denaturierungsschritt von 73°C für 2 Minuten und Zugabe von 10 mM MgCl2 erfolgte die Hydrolyse für die angegebenen Zeiten bei 37°C in Tris Puffer (50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM Spermidine, 160 mM KCl). Die RNA wurde anschließend auf einem 20% PAA-Gel (7M Urea) aufgetrennt. Die Target RNA wurde über die 6-FAM Markierung im Amersham Imager 600 sichtbar gemacht. Die Banden wurden mithilfe der Amersham Imager 600 Software quantifiziert. Das Dz mit 2 L-Nukleotid Modifikationen im konserviertem Bereich („SZ4”) zeigt nur eine geringe katalytische Aktivität (grau, gepunktete Linie), die deutlich gesteigert werden kann durch das Cap-Struktur mit jeweils 3 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende (grau, durchgezogene Linie). Auch die Aktivität des ohnehin schon sehr guten und in seiner Armlänge optimierten Dz (schwarz, gepunktete Linie) wird durch die Modifikation des 5'- und 3'-Endes mit je 3 L-Nukleotiden weiter erhöht (schwarz, durchgezogene Linie).
Eine Erweiterung des Cap-Strukturs auf 4 oder 5 L-Nukleotide am 5'- und 3'-Ende hat eine weitere, aber nur geringe, Steigerung der Aktivität zur Folge, wie aus der ersichtlich. Folgende Dz Varianten wurden eingesetzt: H19(1410)-(9)-31(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 3 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende; H19(1410)-(9)-4L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 4 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende; H19(1410)-(9)-5L(5' + 3'): Dz mit Armlängen von 9 Nukleotiden und je 5 L-Nukleotiden am 5'-und 3'-Ende. Die am 5'-Ende mit 6-FAM markierte Target RNA (31 Nukleotide) wurde hierfür in einer Konzentration von 0,4 μM eingesetzt und mit den Dz Varianten (Armlänge von 9 Nukleotiden) in einer Konzentration von 0,04 μM inkubiert, also in einem Unterschuss von 0,1 × („multiple-turnover” Bedingungen). Nach einem Denaturierungsschritt von 73°C für 2 Minuten und Zugabe von 10 mM MgCl2 erfolgte die Hydrolyse für die angegebenen Zeiten bei 37°C in Tris Puffer (50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM Spermidine, 160 mM KCl). Die RNA wurde anschließend auf einem 20% PAA-Gel (7M Urea) aufgetrennt. Die Target RNA wurde über die 6-FAM Markierung im Amersham (mager 600 sichtbar gemacht. Die Banden wurden mithilfe der Amersham (mager 600 Software quantifiziert. zeigt, dass eine weitere Verlängerung des L-Cap-Strukturs über 3 Nukleotide hinaus nur noch eine minimale Verbesserung der katalytischen Aktivität zur Folge hat. Ein Cap-Struktur mit 3 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende (grau, durchgezogene Linie) zeigt eine hohe katalytische Aktivität, die durch ein Cap-Struktur mit 4 L-Nukleotiden (schwarz, gepunktete Linie) und 5 L-Nukleotiden (schwarz, durchgezogene Linie), geringfügig gesteigert werden kann.
Beispiel 2
Erhöhte Stabilität und enzymatische Aktivität von am 5'- und 3'-Ende mit jeweils 2 L-Nukleotiden modifizierten DNAzymen
Material und Methoden
Nukleotidsequenzen:
Sequenz der Zielstruktur Cox1:
Als Zielsequenz wurde ein 23 Nukleotid langes, chemisch synthetisiertes Oligoribonucleotid verwendet, basierend auf der Cox1 Zielstruktur im Coxsackie Virus B3 Genom (Stamm Nancy, Genbank: 33854). Die Zielstruktur liegt im Genom des Coxsackie Virus B3 und ist auch in der Gattung Enterovirus (Schwerpunkt: Spezies Humanes Enterovirus A und B) genetisch hoch konserviert. Die Identifikation der geeigneten Zielstruktur erfolgte mittel bioinformatischer Datenbanken (NCBI nucleotide database: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide) und Methoden (ClustaIW: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. Die Zugänglichkeit der Zielstruktur für Antisense- bzw. siRNA-Moleküle wurde experimentell bereits beschrieben (Cox1: Lee et. al. J Gen Virol. 2007; Cox2: Dutkiewicz et. Al. FEBS Lett. 2008). Zusätzlich wurde die RNA-Sekundärstruktur mittels der Software Mfold (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold) im Bereich der Zielstruktur modelliert.
Sequenzen der eingesetzten katalytischen Desoxyribonukleotide:
Die für die Stabilitätsuntersuchungen und zur Spaltung verwendeten katalytisch aktiven Sequenzen besaßen die im Folgenden dargestellten Nukleotidsequenzen (D-Nucleotide sind normal, L-Nucleotide sind in Klammern dargestellt:
Alle verwendeten DNAzyme und die beschriebene Zielsequenz wurden von Biomers (Ulm) hergestellt. Die Synthesen wurden mittels Phosphoramidit-Standardverfahren durchgeführt.
Stabilitätsassay
Zur Charakterisierung der Stabilität unter Zellkulturbedingungen wurden die beschriebenen DNAzyme mit einer Konzentration von 200 nM in Zellkulturmedium (DMEM, 1% Glutamin, 10% FCS) bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden aus dem Zellkulturmedium 10 μl entnommen, die Probe mit 10 μl Gel-Ladepuffer (90% Formamid, 20 mM EDTA pH 8,0, 0,1% Xylencyanol, 0,1% Bromphenolblau, 10% Glycerol) versetzt und mittels Gelelektrophorese auf einem 20-prozentigem Polyacrylamidgel (1:30 Acrylamid:Bisacrylamid) in Gegenwart von 7M Harnstoff aufgetrennt. Die Polyacrylamidgele wurden mit einer Geldokumentation aufgenommen und die Intensität der Fluoreszenz mittels Bilddokumentationssoftware ausgewertet.
In vitro Hydrolyse Assay:
Der Test zur Charakterisierung der enzymatischen Aktivität wurde in einem Reaktionsvolumen von 10 μl durchgeführt, das Substrat RNA (0,4 μM), Tris-HCl Puffer (50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl) und DNAzym (0,04 μM) enthielt. Der Reaktionsmix wurde bei 73°C für 2 min erhitzt und anschließend auf 37°C abgekühlt und bis zu 20 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion mit 10 μl Gel-Ladepuffer (90% Formamid, 20 mM EDTA pH 8,0, 0,1% Xylencyanol, 0,1% Bromphenolblau, 10% Glycerol) abgestoppt und der Reaktionsmix mittels Gelelektrophorese auf einem 20-prozentigem Polyacrylamidgel (1:30 Acrylamid:Bisacrylamid) in Gegenwart von 7M Harnstoff aufgetrennt. Die Polyacrylamidgele wurden mit einer Geldokumentation aufgenommen und die Intensität der Fluoreszenz mittels Bilddokumentationssoftware ausgewertet.
zeigt den Einfluss von längeren Cap-Strukturen aus L-Nukleotiden auf die Stabilität von verschiedenen Dz-Cox1 Varianten in Zellkulturmedium (DMEM, 10% FKS, Biochrom) bei 37°C über einen Zeitraum von 0–48 h. Folgende DNAzym (Dz) Varianten wurden eingesetzt: Dz-Cox1-E1 (unmodifiziertes Dz mit Armlängen von 10) Nukleotiden; Dz-Cox1-E2 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5' Ende); Dz-Cox1-E3 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 3'-Ende); Dz-Cox1-E4 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5' und 3'-Ende). Die Dz Varianten wurden in einer Konzentration von 100 nM eingesetzt und in Zellkulturmedium (DMEM, 10% FKS) bei 37°C inkubiert. Die Dz Varianten wurden durch Anregung des Cy5 Farbstoffes sichtbar gemacht. Während das unmodifizierte Dz schon bei 2 Stunden nicht mehr nachweisbar ist, kann die Variante mit 2 L-Nukleotiden am 5'- und 3'-Ende auch nach 20 h noch nachgewiesen werden.
zeigt die Steigerung der katalytischen Aktivität von Dz mit Hybridisierungsarmen von 10 Nukleotiden Länge durch das Cap-Struktur der 5'- und 3'-Enden mit L-Nukleotiden. Folgende Dz Varianten wurden eingesetzt: Dz-Cox1-E1 (unmodifiziertes Dz mit Armlängen von 10) Nukleotiden; Dz-Cox1-E2 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5' Ende); Dz-Cox1-E3 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 3'-Ende); Dz-Cox1-E4 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5' und 3'-Ende). Die am 5'-Ende mit 6-FAM markierte Target-RNA wurde hierfür in einer Konzentration von 0,4 μM eingesetzt und mit den Dz Varianten in einer Konzentration von 0,04 μM inkubiert, also in einem Unterschuss von 0,1 × („multi-turnover” Bedingungen). Nach einem Denaturierungsschritt von 73°C für 2 Minuten und Zugabe von 10 mM MgCl₂ erfolgte die Hydrolyse in Tris-Puffer (50 mM Tris, pH 7,5) für die angegebenen Zeiten bei 37°C. Der Reaktionsansatz wurde anschließend auf einem 20-prozentigem Polyacrylamidgel (7M Urea) aufgetrennt. Die Target RNA wurde über die 6-FAM Markierung im Amersham Imager 600 sichtbar gemacht. Die Banden wurden mithilfe der Amersham (mager 600 Software quantifiziert. Dabei hat ein Cap-Struktur am 5'- und 3'-Ende einen positiven Effekt auf die hydrolytische Aktivität von Dz-Cox1-E2, Dz-Cox1-E3, Dz-Cox1-E4 (gestrichelte Liniengegenüber dem dem unmodifizierten Dz-Cox1-E1 (durchgezogene Linie).
Beispiel 3:
Erhöhte Stabilität und enzymatische Aktivität von am 5'- und 3'-Ende mit L-Nukleotiden modifizierten DNAzymen.
Material und Methoden
Nukleotidsequenzen:
Sequenz der Zielstruktur Cox2:
Als Zielsequenz wurde ein 23 Nukleotid langes, chemisch synthetisiertes Oligoribonukleotid verwendet. Die Zielstruktur wurde mittels bioinformatorischer Methoden wie in Beispiel 2 beschrieben ausgewählt. Die Sequenz war wie folgt:
Sequenzen der eingesetzten katalytischen Desoxyribonukleotide:
Die für die Stabilitätsuntersuchungen und zur Spaltung verwendeten katalytisch aktiven Sequenzen besaßen die im Folgenden dargestellten Nukleotidsequenzen (L-Nukleotide sind in Klammern dargestellt):
Alle verwendeten DNAzyme wurden von Biomers (Ulm) hergestellt. Die Synthesen wurden mittels Phosphoramidit-Standardverfahren durchgeführt.
Stabilitätsassay
Zur Charakterisierung der Stabilität unter Zellkulturbedingungen wurden die beschriebenen DNAzyme mit einer Konzentration von 200 nM in Zellkulturmedium (DMEM, 1% Glutamin, 10% FCS) bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden aus dem Zellkulturmedium 10 μl entnommen, die Probe mit 10 μl Gel-Ladepuffer (90% Formamid, 20 mM EDTA pH 8,0, 0,1% Xylencyanol, 0,1% Bromphenolblau, 10% Glycerol) versetzt und mittels Gelelektrophorese auf einem 20-prozentigem Polyacrylamidgel (1:30 Acrylamid:Bisacrylamid) in Gegenwart von 7M Harnstoff aufgetrennt. Die Polyacrylamidgele wurden mit einer Geldokumentation aufgenommen und die Intensität der Fluoreszenz mittels Bilddokumentationssoftware ausgewertet.
In vitro Hydrolyse Assay:
Der Test zur Charakterisierung der enzymatischen Aktivität wurde in einem Reaktionsvolumen von 10 μl durchgeführt, das Substrat RNA (0,4 μM), Tris-HCl Puffer (50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl) und DNAzym (0,04 μM) enthielt. Der Reaktionsmix wurde bei 73°C für 2 min erhitzt und anschließend auf 37°C abgekühlt und bis zu 20 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion mit 10 μl Gel-Ladepuffer (90% Formamid, 20 mM EDTA pH 8,0, 0,1% Xylencyanol, 0,1% Bromphenolblau, 10% Glycerol) abgestoppt und der Reaktionsmix mittels Gelelektrophorese auf einem 20-prozentigem Polyacrylamidgel (1:30 Acrylamid:Bisacrylamid) in Gegenwart von 7M Harnstoff aufgetrennt. Die Polyacrylamidgele wurden mit einer Geldokumentation aufgenommen und die Intensität der Fluoreszenz mittels Bilddokumentationssoftware ausgewertet.
zeigt den Einfluss von längeren Cap-Strukturen aus L-Nukleotiden auf die Stabilität von verschiedenen Dz-Cox2 Varianten in Zellkulturmedium (DMEM, 10% FKS, Biochrom) bei 37°C über einen Zeitraum von 0–48 h. Folgende DNAzym (Dz) Varianten wurden eingesetzt: Dz-Cox2-E1 (unmodifiziertes Dz mit Armlängen von 10) Nukleotiden; Dz-Cox2-E2 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5' Ende); Dz-Cox2-E3 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 3'-Ende); Dz-Cox2-E4 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5' und 3'-Ende).
Die Dz Varianten wurden in einer Konzentration von 100 nM eingesetzt und in Zellkulturmedium (DMEM, 10% FKS) bei 37°C inkubiert. Die Dz Varianten wurden durch Anregung des Cy5 Farbstoffes sichtbar gemacht. Während das unmodifizierte Dz schon nach 2 Stunden nicht mehr nachweisbar ist, kann die Variante mit 2 L-Nukleotiden am 5'-und 3'-Ende auch nach 20 h noch nachgewiesen werden.
zeigt die Steigerung der katalytischen Aktivität von Dz mit Hybridisierungsarmen von 10 Nukleotiden Länge durch das Cap-Struktur der 5'- und 3'-Enden mit L-Nukleotiden.

Folgende Dz Varianten wurden eingesetzt: Dz-Cox2-E1 (unmodifiziertes Dz mit Armlängen von 10) Nukleotiden; Dz-Cox2-E2 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5' Ende); Dz-Cox2-E3(Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 3'-Ende); Dz-Cox2-E4 (Dz mit Armlängen von 10 Nukleotiden und je 2 L-Nukleotiden am 5' und 3'-Ende). Die am 5'-Ende mit 6-FAM markierte Target-RNA wurde hierfür in einer Konzentration von 0,4 μM eingesetzt und mit den Dz Varianten in einer Konzentration von 0,04 μM inkubiert, also in einem Unterschuss von 0,1 × („multi-turnover” Bedingungen). Nach einem Denaturierungsschritt von 73°C für 2 Minuten und Zugabe von 10 mM MgCl2 erfolgte die Hydrolyse in Tris-Puffer (50 mM Tris (pH 7,5)) für die angegebenen Zeiten bei 37°C. Der Reaktionsansatz wurde anschließend auf einem 20-prozentigem Polyacrylamidgel (7M Urea) aufgetrennt. Die Target-RNA wurde über die 6-FAM Markierung im Amersham Imager 600 sichtbar gemacht. Die Banden wurden mithilfe der Amersham Imager 600 Software quantifiziert. Dabei hat ein Cap-Struktur am 5'- und 3'-Ende einen positiven Effekt auf die hydrolytische Aktivität von Dz-Cox2-E2, Dz-Cox2-E3, Dz-Cox2-E4 (gestrichelte Liniengegenüber dem dem unmodifizierten Dz-Cox2-E1 (durchgezogene Linie). ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

6-FAM	6-Carboxyfluorescin (Fluoreszenzfarbstoff)
°C	Grad Celsius
μl	Mikroliter
μM	Mikromolar
%	Prozent
A	Adenin
C	Cytosin
Ca	Calcium
Cl	Chlor
Cox	Coxsackie-Virus
CRE	cis-acting replication element
Cy5	Cyanin-5 (Fluoreszenzfarbstoff)
DCM	Dilatative Kardiomyopathie
DMEM	Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DNA	Desoxyribonukleinsäure
Dz	DNAzym
EDTA	Ethylendiamintetraacetat
FKS	Fötales Kälberserum
G	Guanin
h	Stunde
HCl	Chlorwasserstoff
KOH	Kaliumhydroxid
M	Molar
Mg(OH)₂	Magnesiumhydroxid
min	Minute
mM	Millimolar
Mn	Mangan
mRNA	messenger RNA (Boten-RNA)
Na	Natrium
NaOH	Natriumhydroxid
NCBl	National Center for Biotechnology Information
ncRNA	non-coding RNA
PAA	Polyacrylamid
Pb	Blei
RNA	Ribonukleinsäure
rRNA	Ribosomale RNA
shRNA	small hairpin RNA
siRNA	small interfering RNA
SO₄	Sulfat
T	Thymin
tRNA	Transfer-RNA
Tris	Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U	Uracil
UTR	untranslated region (Untranslatierter Bereich)

Potentielle Schnittstellen bzw. Targets für erfindungsgemäße katalytische Oligonukleotide: HH-Ribozym Schnittstellen (GTC) >gi|323419|gb|M33854.1|CXA3CG Coxsackievirus B3 (CVB3) 5'UTR

8–17 DNAzym Schnittstellen (AG) >gi|323419|gb|M33854.1|CXA3CG Coxsackievirus B3 (CVB3) 5'UTR

10–23 DNAzym Schnittstellen (AT) >gi|323419|gb|M33854.1|CXA3CG Coxsackievirus B3 (CVB3) 5'UTR

10–23 DNAzym Schnittstellen (GT) >gi|323419|gb|M33854.1|CXA3CG Coxsackievirus B3 (CVB3) 5'UTR

HH-Ribozym Schnittstellen (GTC) >gi|323419|gb|M33854.1|CXA3CG Coxsackievirus B3 (CVB3) CRE

8–17 DNAzym Schnittstellen (AG) >gi|323419|gb|M33854.1|CXA3CG Coxsackievirus B3 (CVB3) CRE

10–23 DNAzym Schnittstellen (AT) >gi|323419|gb|M33854.1|CXA3CG Coxsackievirus B3 (CVB3) CRE

10–23 DNAzym Schnittstellen (GT) >gi|323419|gb|M33854.1|CXA3CG Coxsackievirus B3 (CVB3) CRE

HH-Ribozym Schnittstellen (GTC) >gi|57862814|ref|NR_002196.1| Homo sapiens H19, imprinted maternally expressed transcript (non-protein coding) (H19), long non-coding RNA

8–17 DNAzym Schnittstellen (AG) >gi|57862814|ref|NR_002196.1| Homo sapiens H19, imprinted maternally expressed transcript (non-protein coding) (H19), long non-coding RNA

10–23 DNAzym Schnittstellen (AT) >gi|57862814|ref|NR_002196.1| Homo sapiens H19, imprinted maternally expressed transcript (non-protein coding) (H19), long non-coding RNA

10–23 DNAzym Schnittstellen (GT) >gi|57862814|ref|NR_002196.1| Homo sapiens H19, imprinted maternally expressed transcript (non-protein coding) (H19), long non-coding RNA

SEQUENCE LISTING

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Katalytisches Oligonukleotid, mit einer ersten Teilsequenz, welche enzymatische Aktivität gegenüber einer vorgegebenen Target Nukleinsäuresequenz aufweist, und mit zumindest einer zweiten Teilsequenz, welche an einem der Enden der ersten Teilsequenz unmittelbar anschließend gebunden ist, aber nicht an die Target Nukleinsäuresequenz bindet.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, wobei zwei gleiche oder verschiedene zweite Teilsequenzen eingerichtet sind, wobei die zweiten Teilsequenzen jeweils an einem Ende der ersten Teilsequenz unmittelbar anschließend gebunden sind und beide nicht an die Target Nukleinsäuresequenz binden.
Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Teilsequenz ein Ribozym oder ein DNAzym ist.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste Teilsequenz aus D-Nukleinsäuren und/oder L-Nukleinsäuren und/oder deren Derivaten oder Analogen gebildet ist.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die zweite Teilsequenz bzw. die zweiten Teilsequenzen aus D-Nukleinsäuren und/oder L-Nukleinsäuren und/oder deren Derivate oder Analog gebildet ist bzw. sind.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Endbereiche der ersten Teilsequenz an die Target-Nukleinsäure jeweils auf einander gegenüberliegenden Seiten bezüglich einer vorgegebenen Schnittstelle der Target-Nukleinsäure an die Target-Nukleinsäure binden.
Oligonukleotid nach Anspruch 6, wobei die Endbereiche der ersten Teilsequenz gleiche oder verschiedene Längen im Bereich von 1 bis 30, insbesondere 6 bis 15, vorzugsweise 8 bis 12, beispielsweise 9 oder 10, Nukleotiden aufweisen.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7) wobei die zweiten Teilsequenzen gleiche oder verschiedene Längen im Bereich von 1 bis 30, insbesondere 2 bis 8, vorzugsweise 2 bis 3 Nukleotiden aufweisen und wobei im Falle der Längen im Bereich bis zu 30 Nukleotiden die zweite Teilsequenz vorzugsweise eine Hairpin-Struktur enthält.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die erste Teilsequenz aus natürlichen D-Nukleotiden oder diesen entsprechenden L-Nukleotiden besteht.
Oligonukleotid nach Anspruch 9, wobei die zweite Teilsequenz aus einem L-Nukleotid bzw. aus L-Nukleotiden besteht, und wobei vorzugsweise zwei zweite Teilsequenzen eingerichtet sind.
Oligonukleotid nach Anspruch 9 oder 10, wobei die erste Teilsequenz mit ihren Endbereichen an eine vorgegebene Schnittstelle einer endogenen RNA, insbesondere an H19 RNA bindet.
Oligonukleotid nach Anspruch 9 oder 10, wobei die erste Teilsequenz mit ihren Endbereichen an eine vorgegebene Schnittstelle einer viralen RNA, insbesondere an eine Coxsackie-Virus RNA, bindet.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung, welche mit einer Überexpression einer endogenen RNA oder DNA, oder mit einer Infektion mit einer exogenen RNA oder DNA einher geht.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Oligonuleotid nach einem der Ansprüche 13 sowie, wobei das Oligonukleotid optional mit pharmazeutischen Hilfsstoffen und/oder Adjuvans und/oder Transportvermittlern für den Transport von Nukleinsäuren durch Zellmembrane gemischt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14 zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung, welche mit einer Überexpression einer endogenen RNA oder DNA, oder mit einer Infektion mit einer exogenen RNA oder DNA einher geht.
Verwendung eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung, welche mit einer Überexpression einer endogenen RNA oder DNA, oder mit einer Infektion mit einer exogenen RNA oder DNA einher geht.
Verfahren zur Herstellung eines Oliginukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei in einer Target Nukleinsäuresequenz eine Schnittstelle identifiziert und/oder ausgewählt wird, wobei die Endbereiche der ersten Teilsequenz zur Bindung an der Target Nukleinsäuresequenz, beidseitig der Schnittstelle, insbesondere als Watson-Crick-Paarung, bestimmt werden, wobei jedes Nukleotid der Endbereiche an ein Nukleotid der Target Nukleinsäure bindet, wobei das Nukleotid oder die Nukleotide der zweiten Teilsequenz(en) mit der Maßgabe ausgewählt werden, dass keine Watson-Crick-Paarung mit gegenüber liegenden Nukleotiden der Target Nukleinsäuresequenz gebildet wird.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Oligonukleotid galenisch hergerichtet wird, insbesondere indem das Oligonukleotid in pharmakologisch wirksamer Dosis mit pharmazeutischen Hilfsstoffen und/oder Adjuvans und/oder Transportvermittlern für den Transport von Nukleinsäuren durch Zellmembrane gemischt wird.
Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung, welche mit einer Überexpression einer endogenen RNA oder DNA, oder mit einer Infektion mit einer exogenen RNA oder DNA einher geht, wobei einer die Behandlung oder Prophylaxe benötigenden Person eine physiologisch wirksame Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15 dargereicht wird.