BRPI0713111A2

BRPI0713111A2 - oligonucleotìdeos que afetam a expressão das fosfodiesterases

Info

Publication number: BRPI0713111A2
Application number: BRPI0713111-9A
Authority: BR
Inventors: Paolo Renzi; Luc Paquet; Helene D Anjou
Original assignee: Topigen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-18
Publication date: 2012-04-17
Also published as: WO2007134451A1; KR20090035662A; MX2008014750A; CA2652539A1; US20100048673A1; AU2007252192B2; JP2009537118A; CN101448847A; EP2019835A4; EP2019835A1; US7982028B2; RU2008150373A; AU2007252192A1; US20110086901A9

Abstract

OLIGONUCLEOTìDEOS QUE AFETAM A EXPRESSãO DAS FOSFODIESTERASES. A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos anti-sentido, terapêuticos, direcionados contra genes que codificam fosfodiesterases (PDE) e o uso destes oligonucleotídeos anti-sentido em combinação. Esses oligonucleoti'deos anti-sentido podem ser usados como ferramentas analíticas e/ou como agentes terapêuticos no tratamento de doença associada ao cAMP celular reduzido em um paciente, tais como doenças inflamatórias do aparelho respiratório incluindo, por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), síndrome de angústia respiratória aguda, bronquite, bronquite crónica, silicose, fibrose pulmonar, rejeição a aloenxerto pulmonar, rinite alergia e sinusite crónica, bem como outras condições onde um aumento no AMP cíclico ou uma redução nos níveis da PDE é benéfico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "OLIGONU- CLEOTÍDEOS QUE AFETAM A EXPRESSÃO DAS FOSFODIESTERA- SES".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente US 60/801.384 depositado em 19 de maio de 2006.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos, reagentes e composi- ções de uso para terapia com base em oligonucleotídeo anti-sentido. Em particular, a invenção refere-se à aplicação de terapia com base em oligonu- cleotídeo anti-sentido ao tratamento de doenças associadas à cAMP em um paciente, incluindo por exemplo, doença relacionada à PDE, tais como con- dições inflamatórias e câncer. A invenção também refere-se a métodos de terapia gênica e métodos para identificar nova estratégia com base em anti- sentido, em que AMP cíclica fosfodiesterases estão envolvidas.

Antecedentes da Invenção

O epitélio alveolar e das vias aéreas é reconhecido como uma barreira dinâmica que desempenha um importante papel na regulagem das respostas inflamatórias e metabólicas ao estresse oxidativo, sepse, endoto- xemia, e outras doenças críticas no pulmão. O epitélio respiratório, em parti- cular, é um alvo primário das condições inflamatórias/infecções inflamatórias na interface epitelial-sangüinea, e é por si próprio capaz de amplificar um sinal inflamatório ao recrutar células inflamatórias e produzir mediadores in- flamatórios.

Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (COPD) é um exemplo de uma doença inflamatória da via respiratória e alveolar, em que se acredita que a supra-regulação da inflamação desempenha uma função. A inflama- ção na COPD é caracterizada por infiltração aumentada de neutrófilos, linfó- citos positivos a CD8, e macrófagos nas vias aéreas. Neutrófilos e macrófa- gos desempenham um importante papel na patogênese da inflamação nas vias aéreas na COPD devido a sua capacidade de liberar vários mediadores incluindo elastase, metaloproteases, e radicais de oxigênio que promovem inflamação e lesão tecidual. Foi sugerido que o acúmulo de células inflama- tórias nas vias aéreas dos pacientes com COPD é desencadeado pela libe- ração aumentada de citocinas e quimiocinas pró-inílamatórias que atraem as células infiamatórias para as vias aéreas, ativam as mesmas e mantêm a sua presença. As células, que estão presentes, também liberam enzimas (como metaloproteases) e radicais de oxigênio que têm efeito negativo no tecido e perpetuam a doença. Tem sido mostrado que uma ampla faixa de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias aumenta dentro dos pulmões de pacientes com COPD. Dentre essas, um papel importante é desempenhado pelo fator alfa de necrose tumoral (TNF-alfa), fator estimulador de colônias de macrófagos (GM-CSF) e interleucina 8 (IL-8), que são aumentados nas vias aéreas de pacientes com COPD.

Outros exemplos de doenças respiratórias, nas quais a inflama- ção parece desempenhar um papel, incluem: asma, tosse eosinofílica, bron- quite, rejeição aguda e crônica a aloenxerto de pulmão, sarcoidose, fibrose pulmonar, rinite e sinusite. Asma é definida por inflamação das vias aéreas, obstrução reversível e hiperrespondimento das vias aéreas. Nessa doença, as células infiamatórias, que estão envolvidas, são predominantemente eo- sinófilos, linfócitos T e mastócitos, embora neutrófilos e macrófagos possam ser também importantes. Uma ampla faixa de citocinas e quimiocinas foi mostrada como tendo sido aumentada nas vias aéreas e desempenha uma função na patofisiologia desta dessa doença ao promover inflamação, obs- trução e hiperrespondimento.

Tosse eosinofílica é caracterizada por tosse crônica e a presen- ça de células infiamatórias, na maior parte eosinófilos, dentro das vias aé- reas dos pacientes em ausência de obstrução das vias aéreas ou hiperres- pondimento. Várias citocinas e quimiocinas são aumentadas nessa doença, embora elas sejam na maioria direcionadas aos eosinófilos. Os eosinófilos são recrutados e ativados dentro das vias aéreas e liberam, potencialmente, enzimas e radicais de oxigênio que desempenham uma função na perpetua- ção da inflamação e tosse.

Bronquite aguda é uma doença aguda que ocorre durante uma infecção ou evento irritante, por exemplo, por poluição, poeira, gás ou produ- tos químicos, das vias aéreas inferiores. A bronquite crônica é definida pela presença de tosse e produção de flegma na maioria dos dias, por pelo me- nos 3 meses do ano, por 2 anos. Podem ser também encontradas dentro das vias aéreas, durante bronquite aguda ou crônica, células inflamatórias, predominantemente neutrófilos, com uma série de quimiocinas e citocinas. Acredita-se que esses mediadores tenham uma função na inflamação, sin- tomas e produção de muco que ocorrem durante estas doenças.

Transplante de pulmão é realizado em pacientes com doença pulmonar em estágio terminal. Rejeição aguda a aloenxerto e, mais impor- tantemente, crônica, ocorre quando as células inflamatórias do nosso corpo, linfócitos, não reconhecem o órgão doador como "seu". Células inflamatórias são recrutadas por quimiocinas e citocinas e liberam uma vasta coleção de enzimas que levam à destruição de tecidos e, no caso da rejeição crônica, a uma doença chamada de bronquite obliterante.

Sarcoidose é uma doença de causa desconhecida, na qual gra- nulomas não-caseificantes, crônicos, ocorrem dentro do tecido. O pulmão é o órgão mais comumente afetado. A lavagem broncoalveolar pulmonar mos- tra um aumento principalmente nos linfócitos, macrófagos e algumas vezes neutrófilos e eosinófilos. Essas células são também recrutadas e ativadas por citocina e quimiocinas e acredita-se que estejam envolvidas na patogê- nese da doença.

Fibrose pulmonar é uma doença do tecido pulmonar caracteriza- da por fibrose progressiva e crônica (formação de cicatriz), que levará à in- suficiência respiratória crônica. Tipos e causas diferentes da fibrose pulmo- nar existem, mas são todas caracterizadas por influxo e persistência das células inflamatórias, ativação e proliferação de fibroblastos com deposição de colágeno no tecido pulmonar. Esses eventos parecem estar relacionados à liberação de citocinas e quimiocinas dentro do tecido pulmonar.

Rinite aguda é uma doença aguda que ocorre durante uma in- fecção ou evento irritante, por exemplo, por poluição, poeira, gás ou produ- tos químicos, do nariz ou das vias aéreas superiores. A rinite crônica é defi- nida pela presença do nariz escorrendo constantemente, congestão nasal, espirro e prurido. Também podem ser encontradas dentro da vias aéreas superiores, durante rinite aguda ou crônica, células inflamatórias com uma ampla faixa de quimiocinas e citocinas. Acredita-se que esses mediadores desempenhem um papel na inflamação, sintomas e produção de muco que ocorrem durante estas doenças.

Sinusite aguda é uma doença infecciosa usualmente aguda dos seios, caracterizada por congestão nasal, escorrimento, flegma purulenta, cefaléia ou dor no seio, com ou sem febre. Sinusite crônica é definida pela persistência por mais de 6 meses dos sintomas da sinusite aguda. Pode-se também encontrar durante a sinusite aguda ou crônica dentro a vias aéreas superiores e seios, células inflamatórias com uma ampla faixa de quimioci- nas e citocinas. Acredita-se que esses mediadores desempenhem um papel na inflamação, sintomas e produção de flegma que ocorrem durante essas doenças.

Há um volume crescente de evidências que sugere uma ligação íntima entre a inflamação e as doenças neoplásicas. O microambiente tumo- ral é conformado por células que entram nele, e suas funções refletem as condições locais. Alterações sucessivas que ocorrem no sítio do tumor du- rante a progressão do tumor se assemelham à inflamação crônica. Essa re- ação inflamatória crônica parece ser significantemente orquestrada pelo tu- mor, e parece promover a sobrevivência do tumor. Ficou evidente que res- postas inflamatórias precoces e persistentes observadas em ou em torno dos neoplasmas em desenvolvimento regula vários aspectos do desenvolvi- mento do tumor (remodelação de matriz, angiogênese, potencial maligno) por proporcionar diversos mediadores implicados em manter a homeostasia de tecido, por exemplo, fatores de crescimento e de sobrevivência solúveis, enzimas remodeladoras de matriz, espécies de oxigênio reativo e outras mo- léculas bioativas.

Conforme descrição acima, essas doenças respiratórias inflama- tórias ou doenças, nas quais a inflamação desempenha um papel crítico, são todas caracterizadas pela presença de mediadores que recrutam e ativam diferentes células inflamatórias, que liberam enzimas ou radicais de oxigênio provocando sintomas, a persistência da inflamação e quando crônicas, a destruição ou rompimento do tecido normal.

Uma abordagem terapêutica lógica seria infra-regular a produ- ção de citocinas e de quimiocinas e a resposta celular inflamatória. Isso tem sido realizado em todas as doenças descritas acima através do emprego ou de corticosteróides tópicos ou sistêmicos com níveis diferentes de sucesso. Os corticosteróides são imunossupressivos e têm efeitos não somente sobre as células inflamatórias, mas também sobre outras células do corpo que Ie- vam à toxidez, quando administrados cronicamente.

Apesar da disponibilidade de medicamentos para COPD, asma e outras doenças respiratórias inflamatórias, a prevalência e a morbidez des- tas doenças permaneceram estáveis ou aumentaram. É óbvio que há uma necessidade médica não satisfeita quanto à terapia das doenças respirató- rias inflamatórias, e agentes terapêuticos inovadores são requeridos com urgência. A terapia com base em oligonucleotídeo anti-sentido oferece uma nova abordagem alternativa para diminuir, seletivamente, a expressão de genes específicos sem os efeitos tóxicos indesejáveis das estratégias tera- pêuticas tradicionais. Terapias anti-sentido estão sendo investigadas para o tratamento de várias doenças, Tem sido previamente mostrado que oligonu- deotídeos anti-sentido direcionados contra receptores para mediadores in- flamatórios podem ser administrados aos pulmões e infra-regulam seus al- vos conforme descrito no W09966037.

Uma abordagem terapêutica que reduziria a liberação de citoci- nas e quimiocinas pró-inflamatórias por uma ampla faixa de células, enquan- to teria um efeito reduzido sobre a liberação dos mediadores antiinflamató- rios ou enzimas antiinflamatórias, pode ser vantajosa sobre as terapias cor- rentes para doenças respiratórias inflamatórias ou para qualquer outra doen- ça inflamatória sistêmica.

Os nucleotídeos cíclicos, cAMP e cGMP, são os segundos men- sageiros ubíquos que participam da sinalização de vias e de mecanismos de transdução. Células mamíferas têm desenvolvido um complexo e altamente conservado complemento de enzimas que regulam a geração e inativação de nucleotídeos cíclicos através de mecanismos, múltiplos e complexos, de alimentação de avanço e de retroalimentação. Ambas as cAMP e cGMP são formadas a partir de seus respectivos tritosíatos (ATP e GTP) pela atividade catalítica de adenilil (adenilato) ou guanilil (guaniiato) ciclase, respectivamen- te, conforme descrito por Essayan D. M. Cyclic nucleotide phosphodiestera- se (PDE) inhibitors and immunomodulation. Biochem. Pharmacol., 1999, 57, 965-973. Inativação de cAMP/cGMP é obtida por clivagem hidrolítica da liga- ção 3'-fosfodiéster catalisada pelas fosfodiesterases dependentes de nucleo- tídeos cíclicos (PDEs), resultando na formação do 5'-monofosfato inativo, correspondente, conforme descrito por Essayan, 1999 e Perry M.J. e Higgs G.A. Chemotherapeutic potential of phosphodiesterase inhibitors. 1998, Curr Opin Chem Biol. 4:472-81.

Foi demonstrado que a resposta inflamatória e sua progressão são altamente sensíveis a modulações nos níveis de estado constante de nucleotídeos cíclicos para modulações, onde as células alvo, quanto a seus efeitos, se estendem além das células imunes para incluir células acessó- rias, tais como células da musculatura lisa das vias áreas, epiteliais e endo- teliais, e neurônios conforme descrito por Perry e Higgs, 1998; Essayan, 1999. A esse respeito, o conceito emergente de que a modulação de nucleo- tídeos cíclicos intracelulares desempenha um papel principal na regulação do meio inflamatório foi recentemente evoluído para alvejar e melhorar as respostas inflamatórias/auto-imunes. As PDEs de nucleotídeos cíclicos são uma grande família de multi-genes em crescimento, que compreende pelo menos 11 famílias de enzimas PDE. O perfil de inibidores de PDE seletivos e não seletivos in vitro e in vivo sugere, portanto, uma utilidade terapêutica potencial como antidepressivos, imunomoduladores, tocolíticos, inótropos/ cronótropos, e agentes citoprotetores.

cAMP intracelular parece ter um papel fundamental, não somen- te no relaxamento, ativação e proliferação da musculatura lisa, mas também na modulação dos mediadores de liberação por células inflamatórias. Níveis de cAMP reduzidos podem levar à produção aumentada de mediadores in- flamatórios tais como TNF-alfa, GM-CSF, e IL-8 nas células epiteliais das vias aérèas.

Entendimento dos mecanismos moleculares do papel regulador das citocinas na homeostasia celular, bem como nas doenças antiinflamató- rias/auto-imunes/infecciosas tem começado a proporcionar novas aborda- gens para que sejam projetadas estratégias terapêuticas para intervenções farmacológicas. Uma tal abordagem é o potencial quimioterapêutico de blo- queio da enzima PDE, que revelou esquema de diversidade e complexidade fenomenal que promete produtos terapêuticos para um largo espectro de estados doentios. Um entendimento da mecânica da inibição de PDE está centrado nas propriedades imunorreguladoras dos nucleotídeos cíclicos (cAMP/cGMP), pavimentando, assim, um canal através do qual aplicações terapêuticas antiinflamatórias poderiam ser claramente entendidas.

A resposta inflamatória e sua progressão são altamente sensí- veis às modulações nos níveis em estado constante de nucleotídeos cícli- cos, onde a células alvo para seus efeitos se estendem além das células imunes para incluir células estruturais, tais como células epiteliais, da mus- culatura lisa, e células endoteliais, e neurônios (Perry e Higgs, 1998; Essa- yan, 1999). A modulação dos nucleotídeos cíclicos intracelulares desempe- nha um papel principal na regulação da resposta inflamatória. As PDEs de nucleotídeos cíclicos são uma família multigênica grande e crescente, com- preendendo pelo menos 11 famílias de PDE. PDEs diferem em sua distribui- ção tecidual e celular, bem como em duas características moleculares e físi- co-químicas, incluindo seqüências de nucleotídeos e de proteínas, especifi- cidade para substrato, sensibilidade a inibidor, e exigências de cofatores. Dentro das diferentes famílias, isoformas específicas para tecido são gera- das do mesmo gene por splicing alternativo de mRNA e uso de promotor diferencial.

A família de PDE4 específica para cAMP é uma das PDEs mais estudadas. Enzimas dentro desta família são encontradas na maioria das células pró-inflamatórias e imunes, onde elas desempenham um papel cha- ve na regulação do metabolismo da cAMP. Enzimas PDE4 são expressas em macrófagos, neutrófilos, células T CD8+ citotóxicas, células epiteliais bronquiais, e células da musculatura lisa das vias aéreas. Além disso, inibi- dores de PDE4 modulam inflamação em modelos de animais de doenças respiratórias, sugerindo que PDE4 pode representar um alvo adequado em uma estratégia com base em produtos terapêuticos para intervenção com inibidores de moléculas pequenas. Fármacos anti-PDE4 inibem a hidrólise da cAMP intracelular, que, por sua vez, proporciona broncodilatação e su- pressão da resposta inflamatória. Inibidores de PDE4 seletivos, tais como cilomilast e roflumilast, são ativos em modelos de animal de inflamação de neutrófilos (Bundschuch DS et ai., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001, 297: 280- 290). Embora o uso de inibidores de PDE4 para o tratamento de inflamação das vias aéreas esteja sob investigações clínicas intensivas, vários inibido- res foram rejeitados devido a sua toxicidade, seus efeitos colaterais limitado- res de dose, dos quais náusea e vômitos são as manifestações fisiológicas mais comuns. Consequentemente, melhorar a razão terapêutica dos inibido- res de PDE4 fez surgir um grande desafio que é ainda um importante campo de investigação.

Considerando a distribuição de enzimas nos tecidos alvo, com a atividade alta da PDE3 e da PDE4 nas células da musculatura lisa das vias aéreas e inflamatórias, inibidores seletivos destas enzimas podem incremen- tar a terapia de obstrução crônica ao fluxo aéreo. Geralmente, inibidores de moléculas pequenas focaram em um ou vários PDE sem avaliar os efeitos prejudiciais potenciais de inibir todas as isoenzimas de uma PDE. Por exem- plo, foi sugerido que a maior parte da toxicidade atribuída aos antagonistas de PDE4 ocorre através da inibição do isótipo D de PDE4. Além disso, como mostrado aqui, a inibição de certas isoenzimas de PDEs não reduz todos os mediadores pró-inflamatórios, contudo, uma combinação de oligonucleotí- deos específicos para isótipos pode levar a um efeito que é muito mais am- plo quando a combinação certa de oligonucleotídeos anti-sentido é empregada.

A família de PDE3 contém dois genes diferentes, PDE3A e PDE3B, que são inibidos por cGMP e exibem uma alta afinidade com cAMP. Cada gene de PDE3 codifica pelo menos duas isoformas de splice. O PDE3A é mais abundante em adipócitos e células hepáticas. Contudo, os dados iniciais de experimentos químicos com inibidores de PDE3 seletivos ou uma combinação com inibidores de PDE4 têm sido um tanto decepcio- nantes e têm diminuído as expectativas consideravelmente, já que esses fármacos tiveram eficácia limitada e seu uso era clinicamente limitado pelos seus efeitos colaterais.

PDE7 foi primeiramente isolada de um glioblastoma humano. PDE7A codifica uma PDE específica de cAMP, que é insensível a cGMP e a inibidores de PDE3 e de PDE4, e tem uma seqüência de aminoácidos distin- ta de outras cAMP PDEs. Em humanos, dois genes (PDE7A e PDE7B) fo- ram caracterizados. O gene PDE7A codifica três isoenzimas (PDE7A1, PDE7A2, e PDE7A3) derivadas do mesmo gene por splicing alternativo de mRNA. Em humanos, mRNA de PDE7A2 é expresso abundantemente no músculo esquelético, coração, e rim, ao passo que nos testículos, pulmão, e no sistema imunológico (timo, baço, linfonodo, leucócitos sangüíneo) são fontes ricas de PDE7A1. Além disso, linfócitos T humanos ativados, mas não naíve, expressam a variante splice PDE7A3. Em contraste, PDE7B existe como uma isoenzima simples em humanos, ela compartilha -70% de simila- ridade de seqüência com PDE7A, mas com propriedades cinéticas distintas. PDE7B é expressa predominantemente no cérebro e em vários outros teci- dos incluindo fígado, coração, glândulas da tireóide, e musculatura esquelé- tica. Foi demonstrado que a estimulação de células T naíve humanas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 promove a produção de IL-2 e a ampliação clonal. Esses efeitos foram atribuídos à PDE7A e a infra-regulação desta enzima previne a proliferação de linfócitos (Li L et al., Science, 1999, 283, 848-851).

A família da PDE4 contém 4 genes diferentes (PDE4 A-D). Devi- do ao splicing alternativo de genes, múltiplas variantes de splice são repor- tadas e classificadas em dois grupos principais, as formas longas e as for- mas curtas. Os produtos gênicos de PDE4A, BeD são encontrados na mai- or parte das células imunes e inflamatórias. Esses estão presentes tanto constitutivamente como depois da ativação, conforme descrito por Burnouf C. em Pruniax M.P. Current Pharmaceutical Design 2002; 8:1255-12965. A inibição de todos ou de certos isótipos de PDE4 está associada à infra- reguiação de vários mediadores inflamatórios; contudo, um aumento de cer- tas citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL-6) tem sido descrito (Gi- embycz M.A. Expert Opin Invest Drugs 2001, 10:1361 -1379).

Portanto, seria desejável inibir todas as três enzimas PDE; con- tudo, esta abordagem pode ser problemática devido à toxicidade que tem sido descrita com a administração de inibidores de cada uma dessas enzi- mas. A aplicação tópica de oligonucleotídeos anti-sentido poderia evitar a toxicidade sistêmica da inibição da enzima, mas parece que existem muitas isoenzimas desta PDE para tornar esta abordagem prática. A inibição de um ou vários isótipos de enzimas PDE podem não ser tão eficazes quando a inibição completa de PDE, já que outros isótipos estariam presentes para terem seus efeitos pró-inflamatórios.

Portanto, parecia ser desejável procurar um modo de infra- regular os mediadores pró-inflamatórios e suas células enquanto menos me- diadores antiinflamatóríos ou enzimas inibidoras para a terapia das doenças respiratórias inflamatórias seriam afetados. Logo, é aqui proposta a aplica- ção terapêutica de uma combinação de oligonucleotídeos anti-sentido dire- cionados contra isótipos selecionados de enzimas PDE como uma terapia para doenças respiratórias antiinflamatórias ou qualquer doença, em que AMP cíclica desempenhe um papel.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona compostos de oligonucleotídeo anti-sentido que são eficazes na infra-regulação de genes de isótipos de PDE contra os quais eles são direcionados bem como compostos de oligo- nucleotídeos anti-sentido selecionados que são eficazes na infra-regulação não somente dos genes de isótipos de PDE contra os quais eles são dire- cionados, mas também outros genes relacionados, inclusive outros genes de isótipos de PDE, genes inflamatórios e mitogênicos.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição que compreende pelo menos 2 compostos de oligonucleotídeos anti-sentido, em que cada oligonucleotídeo anti-sentido é capaz de infra- regular um gene diferente. Em algumas modalidades deste aspecto, a com- binação dos pelo menos 2 compostos de oligonucleotídeos anti-sentido leva a uma infra-regulação de cada um dos genes que é mais que a capacidade aditiva de cada anti-sentido em infra-regular cada gene individualmente. Em outras modalidades, a presente invenção também proporciona uma compo- sição que compreende pelo menos 2 compostos de oligonucleotídeos anti- sentido, em que cada composto de oligonucleotíde anti-sentido é capaz de infra-regular um gene diferente, estando cada composto de oligonucleotídeo anti-sentido presente em uma concentração na qual o composto de oligonu- cleotídeo anti-sentido é praticamente ineficaz, ele mesmo, na infra-regulação do gene ao qual ele é direcionado contra, a combinação dos pelo menos 2 compostos de oligonucleotídeo anti-sentido leva a uma infra-regulação signi- ficante de cada um dos genes contra os quais os compostos de oligonucleo- tídeo anti-sentido são direcionados e opcionalmente outros genes relaciona- dos. Em ainda outras modalidades desse aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição que compreende uma combinação de pelo menos dois compostos de oligonucleotídeo anti-sentido em que cada um deles é direcionado contra um gene alvo de PDE diferente e em que cada um é eficaz para infra-regular ou inibir um gene alvo de PDE, em que cada composto de oligonucleotídeo está presente na combinação em uma con- centração na qual ele exibe menos que 20% de inibição de seu gene alvo, em que a combinação dos compostos de oligonucleotídeo exibe mais que 20% de inibição e pelo menos dobra a inibição de pelo menos um dos genes alvo.

A presente invenção proporciona ainda um oligonucleotídeo efi- caz nas composições e métodos da presente invenção que têm uma se- qüência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NQs: 1 a 92 e 113 a 126.

A presente invenção proporciona ainda composições farmacêu- ticas que compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável e um oligo- nucleotídeo da presente invenção ou uma combinação de pelo menos dois oligonucleotídeos anti-sentido conforme descritos acima. A presente inven- ção proporciona também o uso de tais composições no tratamento e/ou na prevenção de doenças respiratórias infiamatórias e outras doenças relacio- nadas à inflamação.

As combinações da presente invenção parecem exercer ação inibidora por uma abordagem que foi denominada nocaute de genes múlti- plos. O nocaute de genes múltiplos engloba situações, nas quais:

1) um oligonucleotídeo infra-regula não somente o gene con- tra o qual ele é direcionado, mas também outros genes re- lacionados; e/ou

2) uma combinação de pelo menos 2 oligonucleotídeos anti- sentido, cada um presente em uma concentração na qual o oligonucleotídeo anti-sentido é praticamente ineficaz para infra-regular o gene contra o qual ele é direcionado por si só, em que a combinação leva a uma significativa infra- regulação de ambos os genes contra os quais o oligonu- cleotídeos são direcionados contra e opcionalmente outros genes relacionados.

A presente invenção usa a abordagem acima para proporcionar métodos, composições e kits para tratar e/ou prevenir doença associada à cAMP reduzida em paciente, incluindo doença relacionada à PDE, doença inflamatória que inclui doenças infiamatórias e mais particularmente COPD e asma, e outras doenças nas quais a inflamação desempenha um papel im- portante, inclusive câncer.

A invenção proporciona também métodos, reagentes e composi- ções para reduzir a expressão e, consequentemente, a atividade de cAMP fosfodiesterases cíclicas e, assim, é mantido o equilíbrio correto de produção de cAMP e citocina/quimiocina intracelulares.

A invenção proporciona ainda métodos e ferramentas para iden- tificar/selecionar in vitro, in vivo e ex vivo, combinações de novos compostos, fármacos e vacinas de oligonucleotídeos anti-sentido que são capazes de interferirem com a expressão de PDE e elevarem o nível de c-AMP intracelu- lar.

A presente invenção proporciona também terapia e métodos de transíecção com base em gene, em que um ou mais compostos de oligonu- cleotídeo anti-sentido são usados para transíecção de células ou distribuídos para humanos e animais para interferirem com a expressão de genes de isótipos de PDE.

A presente invenção proporciona ainda oligonucleotídeos anti- sentido eficazes contra isótipos de PDE3, tais como PDE3A e PDE3B; isóti- pos de PDE4 tais como PDE4A, PDE4B e PDE4D e isótipos de PDE7 tal como PDE7A, entre outras PDEs.

De acordo com um outro amplo aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para aumentar pelo menos uma estabilidade de nuclease e a atividade de inibição de gene alvo de um oligonucleotídeo anti- sentido, que compreende repor pelo menos um nucleotídeo do oligonucleo- tídeo com um nucleotídeo modificado com arabinose, preferivelmente 2'- desóxi-2'-fluorarabinonucleotídeo (FANA).

Outros objetos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão aparentes mediante leitura da seguinte descrição não restritiva de várias modalidades preferidas feitas com referência aos desenhos acompanhantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A presente invenção será agora descrita, em maiores detalhes, com respeito aos desenhos apensos, nos quais:

A figura 1 mostra a eficácia de AON diferentes na inibição de seu nocaute alvo específico. (A) células A549 foram transferidas com AON específico alvejando PDE3A, PDE3B, PDE7A, PDE4A, PDE4B, ou PDE4D por 24 horas usando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, razão de 1 μg de oli- gonucleotídeo: 1μ.Ι_ de Lipofectamine® 2000) e 200 ng a 400 ng de AON (AS) ou a seqüência de pareamento errôneo correspondente (Mi/Sentido). Níveis de expressão de PDE3B, PDE4A e mRNA de PDE4B foram quantificados usando o ensaio Quantigene® (Panomics). PCR em tempo real foi usado para quantificar a expressão de PDE3A, PDE7A e PDE4D. A expressão de PDE foi normalizada para a expressão de um gene de controle (β2Μ, Ppib ou HPRT). Os dados expressos como % de inibição média relativa ao nível de expressão nas células não tratadas (**p<0,01, ***p<0,001, n=3). (B) Célu- las 293 transfectadas durante a noite com AON que alveja mais que uma isoforma de PDE4. O nível de expressão de mRNA de isoforma de PDE4 foi quantificado usando PCR em tempo real e normalizado para a expressão do gene de controle β2Μ. Os dados expressam a % de inibição média para ní- vel de expressão de células transfectadas com AON de sentido relevante ou de pareamento errôneo.

A figura 2 mostra o efeito biológico sobre o AON nas células epi- teliais do pulmão. Células A549 transfectadas durante a noite com AON con- forme descrição acima foram estimuladas com IL-1 β (10 mg/mL) por 4 horas para induzir a secreção de quimiocinas (IL-8, MCP-1) e citocina (GM-SCF). Os sobrenadantes de células foram colhidos e os níveis de quimioci- nas/citocinas determinados usando ELISA. Dados expressos em % de inibi- ção média da secreção específica que compara os níveis de secreção entre células alvejadas com PDE-AON com células alvejadas com AON de pare- amento errôneo/sentido.

A figura 3 mostra o efeito biológico de AON sobre células imu- nes. PBMCs humanas transfectadas com AON por 20 h usando o reagente lipídico Escort IV (1 μς de AON:0,5 μΙ_ de Lipídio) foram então estimuladas com PHA (10 μg/mL)) por 6 horas. Os sobrenadantes de células foram colhi- dos e os níveis de citocinas TNF-α e IL-2 secretadas pelas PBMCs em res- posta a PHA foram avaliados usando ELISA (BD Biosciences). A redução de citocina foi comparada aos níveis de células estimuladas com PHA em au- sência de distribuição de AON. Dados expressos como % de inibição de AON relativa aos níveis de inibição de citocina específica observada com AON de seqüência de pareamento errôneo ou de controle de sentido (eixo à esquerda). Lisados de células foram colhidos para determinação de cAMP usando cAMP EIA (Cayman Chemical) como uma medida da atividade de PDE. Aumento de níveis comparados de cAMP em células estimuladas por PHA em ausência de distribuição de AON. Dados expressos como % do aumento específico de cAMP relativos aos níveis obtidos com AON de se- qüência de pareamento errôneo ou de controle de sentido (eixo à direita). Dados expressos como % de alteração média ± SE de entre 9 e 15 doadores.

A figura 4 mostra a potência de AON contendo 2'F-ANA na inibi- ção de expressão de gene alvo. Células A549 transferidas por 24 horas com AON específico de PDE4D composto de PS-DNA ou compostos com modifi- cações de PS-FANA ou seqüências de pareamento errôneo corresponden- tes usando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, 1 μg de ΑΟΝ:1μL de Lipofec- tamine® 2000) nas doses indicadas (A). O nível de expressão de mRNA de PDE4D de genes alvo foi quantificado usando o ensaio Quantigene® (Pano- mics) e foi normalizado para expressão de gene β2Μ. Os dados expressos como % de inibição específica relativa ao nível de expressão em células co- mo a seqüência de controle de sentido. Células A549 transfectadas por 24 horas com modificações de PS-FANA ou seqüências de pareamento errôneo correspondentes usando Lipofectamine® (Invitrogen, 1 μg de AON:1 μl de Lipofectamine® 2000) com uma dose simples para pontos de tempo diferen- tes (8, 24 ou 48 horas) (Β). O nível de expressão de mRNA de PDE4D de genes alvo foi quantificado usando o ensaio Quantigene® (Panomics) e foi normalizada para expressão de gene β2Μ. Os dados expressos como % de inibição específica relativa ao nível de expressão em células tratadas com a seqüência de controle de sentido. Legendas embaixo da figura demonstram as modificações com FANA no AON (específico de PDE4) TOP 1497.

A figura 5 mostra o efeito de AON contendo 2'F-ANA sobre os efeitos biológicos das células epiteliais no pulmão. Células A549 transfecta- das com AON específico dual para PDE4B/AD composto de PS-DNA (TOP 1545) ou modificado com FANA (PS-FANA, TOP 1545-F3) durante a noite e foram então estimuladas com IL-1β (10 ng/mL) por 4 horas. Os sobrenadan- tes foram analisados com respeito à secreção de IL-8 e MCP-1 por ELISA (BD Biosciences) com níveis normalizados para viabilidade de células pelo ensaio AlamarBIue®. Dados expressos como % de inibição média relativa ao nível de expressão em células tratadas com seqüência de controle de senti- do (**p<0,01, n=3).

A figura 6 mostra o efeito de AON contendo 2'-F-ANA em células imunes. (A) PBMCs humanas transfectadas com PDE4B/4D AON (TOP 1545) dual modificado com FANA ou AON (TOP 1731) específico de PDE7A modificado com FANA ou ambos por 20 horas, e foram então estimuladas com PHA (10 .ug/mL) por 6 horas. Expressão de mRNA de genes alvo foi avaliada usando o ensaio Quantigene® (Panomics) com todos os nível de expressão de gene de PDE normalizados para expressão de gene β2Μ. Da- dos expressos como % específica de inibição da expressão de mRNA para PDE4B (n=8), PDE4D (n=6) e PDE7A (n=8) com relação aos níveis nas cé- lulas transfectadas com AON sentido. Valores P determinados para teste-t não pareados indicados nas colunas de comparação. (B) Sobrenadantes das células foram colhidos e os níveis de citocinas TNF-α e IL-2 secretadas por PBMCs em resposta à PHA foram avaliados usando ELISA (Medicorp). De- créscimo de citocina foi comparado com os níveis nas células estimuladas com PHA em ausência de distribuição de AON. Dados expressos como % de inibição de AON com relação aos níveis de inibição observados com a mesma dose de oligonucleotídeos de pareamento errôneo ou de controle de sentido. Dados expressos como % média de alteração ± SE de entre 8 doa- dores.

A figura 7 mostra a inibição da expressão do gene de timidilato sintase (TYMS) em células 293 transfectadas com AON (TOP-1545-F3) es- pecífico de PDE4B/AD ou AON (TOP- 1549) específico de TYMS usando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, razão de μg de oligonucleotídeo:1 μΙ_ de Lipofectamine® 2000) e 200 ng, 400 ng e 800 ng de AON TOP-1545-F3 ou TOP-1549. PCR em tempo real foi usada para quantificar a expressão de TYMS que foi normalizada para a expressão de um gene de controle (Ppib). Dados expressos como % de inibição média relativa ao nível de expressão das células transfectadas com AON sentido ou pareamento errôneo.

A figura 8 mostra a eficácia de (A) TOP1572-F2 na redução da expressão de mRNA de PDE4B e (B) TOP1731-F3 na redução da expressão de mRNA de PDE7A na linhagem de células de macaco CYNOM-K1. As células foram transfectadas por 24 horas com 250 nM de AON ou controle correspondente complexado para Lipoíectamine® 2000 em uma razão de 1 μς de oligo: 2 μΐ_ de lipídio em meios isentos de antibióticos. Os níveis de expressão de mRNA de PDE4D, PDE4B e PDE7A foram medidos por RT- PCR com quantificação relativa para a expressão do gene de controle de PPIB. A porcentagem de inibição de mRNA de PDE foi determinada com relação ao nível de gene em células não transfectadas. Análise estatística foi realizada usando Anova de um caminho seguido por comparação de Dun- nett, **p<0,01.

A figura 9 mostra a eficácia de TOP1572-F2 e TOP1545 na re- dução (A) da expressão de mRNA de PDF4D e (B) na secreção da proteína MCP-1 em células epiteliais bronquiais, humanas, normais (NHBE). As célu- las foram transfectadas por 24 horas com 250 nM de AON ou controle cor- respondente complexado para Lipoíectamine® 2000, em uma razão de 1 μg de oligo: 1 μL de lipídio em meios isentos de antibióticos. As células foram estimuladas por 4 horas com citomix (500 U/mL de TNF-α + 10 ng/mL de ILI-β + 10 ng/mL de IFNy) no final do período de transfecção. A secreção da proteína MCP-1 foi medida no sobrenadante por ELISA com normalização para a viabilidade celular conforme medida por ensaio de AIamarBIue. O ní- vel de expressão de mRNA de PDE4D foi medido por RT-PCR com quantifi- cação relativa para a expressão do gene de controle B2M. A porcentagem de inibição foi determinada com relação às células tratadas com o controle correspondente. Análise estatística foi realizada usando o teste t, *p<0,05, ***p<0,001.

A figura 10 mostra a eficácia do oligonucleotídeo anti-sentido (AON) TOP 1572 na inibição da secreção de citocina por PBMCs humanas estimuladas com PHA. As PBMCs foram transfectadas ou com TOP 1572 (6,2nM) ou com um AON de controle relevante (TOP 1572s, 6,3nM) durante a noite e então estimuladas no dia seguinte com PHA mitogênico (10 μg/mL) por 6 horas. Os níveis de citocinas, IL-2 (A) e TNF-α (B) nos sobrenadantes de células foram quantificados usando ELISA. Os dados representam valo- res médios de poços em triplicata ± SE de IL-2 (pg/mL) ou TNF-α (ng/mL). Análise estatística foi realizada usando ANOVA de um caminho seguido pelo teste de comparação múltipla comparando-se os níveis de citocina seguinte à transfecção de AON para as células estimuladas com PHA1 ou para as células tratadas com AON de controle, relevantes, **p<0,01 e ***p<0,001. A porcentagem de inibição da secreção de citocina é relativa aos níveis obti- dos em resposta à PHA.

A figura 11 mostra a eficácia do AON TOP 1731 na inibição da secreção de citocina por PBMCs humanas estimuladas com mitógenos. PBMCs foram transfectadas ou com TOP1731 (3,1 nM) ou AON de controle relevantes (TOP 1731s, 3,1 nM) complexadas com Escort IV durante a noite e então estimuladas no dia seguinte com PHA mitogênica (10 μg/mL) por 6 horas. Os níveis de citocinas IL-2 (A) e TNF-α (B) em sobrenadantes de cé- lulas foram quantificados por ELISA. Os dados representam valores médios de poços em triplicata ± SE de IL-2 (pg/mL) ou TNF-oc (ng/mL). A análise estatística foi realizada usando-se ANOVA de um caminho seguido por um teste de comparação múltipla de Bonferroni comparando os níveis de citoci- na depois de tratamento com AON para as células estimuladas com PHA ou para as células tratadas com AON de controle relevante, *** p<0,001. A por- centagem de inibição da secreção de citocina é relativa aos níveis obtidos em resposta à PHA.

A figura 12 mostra a eficácia intensificada quando TOP 1572 e TOP 1731 modificado coms F'ANA são combinados na redução da secreção de citocina por PBMCs estimuladas com PHA. PBMCs humanas foram transfectadas durante a noite com TOP 1572-F2 (3,1 e 6,3nM), TOP1731-F3 (3,1 e 6,3nM) ou ambos AON (3,1 nM cada, total de 6,3nM). No dia seguinte as PBMCs foram estimuladas com PHA (10 μg/mL) por 6 horas e então os níveis de citocina IL-2 em sobrenadantes de células foram quantificados por ELISA. A porcentagem de inibição da secreção de IL-2 foi determinada em comparação com os níveis produzidos por células não transfectadas seguin- te à estimulação com PHA. Os valores representam a média ± SE.

A figura 13 compara a eficácia do TOP1572 (PS-DNA) com a eficácia do TOP1572-F1, TOP1572-F2 e TOP1572-F3 (versões PS-FANA) na redução de (A) expressão de PDE4D e (B) de mRNA de PDE4B na linha- gem de células 293. As células foram transfectadas por 24 horas, 48 horas ou 72 horas com 250nM de AON ou com controle correspondente comple- xado para Lipofectamine® 2000 em uma razão de 1 (xg de oligo: 1 μL de lipí- dio em meios isentos de antibióticos. Os níveis de expressão de mRNA de PDE4D e PDE4B foram medidos por RT-PCR com quantificação relativa para a expressão de gene de controle de PPIB. A porcentagem de inibição de mRNA de PDE específica foi determinada com relação ao nível de gene em células transfectadas com o controle correspondente.

A figura 14 compara a eficácia do TOP1731 (PS-DNA) com a eficácia do TOP1731-F3, (PS-FANA) na redução da expressão de mRN de PDE7A na linhagem de células A549. As células foram transfectadas por 48 horas com 250nM, 125nM ou 75nM de AON ou oligo de controle correspon- dente complexado para Lipofectamine® 2000 em uma razão de 0,8 μg de oligo: 1 μl de lipídio em meios isentos de antibióticos. O nível de expressão de mRNA de PDE7A foi medido por ensaio Quantigene® com quantificação relativa para a expressão do gene de controle B2M. A porcentagem da inibi- ção de mRNA de PDE foi determinada com relação ao nível de gene em cé- lulas transfectadas com o controle correspondente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS

A Tabela 1A define os oligonucleotídeos anti-sentido de PDE7A humana de acordo com a presente invenção.

A Tabela 1b identifica os oligonucleotídeos anti-sentido de PDE3A humana de acordo com a presente invenção.

A Tabela 1c identifica os oligonucleotídeos anti-sentido com es- pecificidade dual contra mais que uma isoforma de PDE4 (ou PDE4A/4D ou PDE4B/4D) de acordo com a presente invenção. Pareamentos errôneos de pares de base entre as isoformas de PDE4 nas seqüências de AON estão sublinhados. A reposição de pares de base com inosina em AON está indi- cada pela letra I.

A Tabela 1d identifica oligonucleotídeos anti-sentido com especi- ficidade contra PDE3B, PDE4D e PDE7A e especificidade dual contra PDE4A e 4Β.

A Tabela 2a identifica os oligonucleotídeos anti-sentido de PDE7A humana contendo bases FANA de acordo com a presente invenção. Bases modificadas com FANA estão indicadas por letras em negrito.

A Tabela 2b identifica os oligonucleotídeos anti-sentido de PDE3A humana contendo bases FANA de acordo com a presente invenção. Bases modificadas com FANA estão indicadas por letras em negrito.

A Tabela 2c identifica os oligonucleotídeos anti-sentido de PDE3B humana contendo bases FANA de acordo com a presente invenção. Bases modificadas com FANA estão indicadas por letras em negrito.

A Tabela 2d identifica os oligonucleotídeos anti-sentido de PDE4A humana contendo bases FANA de acordo com a presente invenção. Bases modificadas com FANA estão indicadas por letras em negrito.

A Tabela 2e identifica os oligonucleotídeos anti-sentido de PDE4D humana contendo bases FANA de acordo com a presente invenção. Bases modificadas com FANA estão indicadas por letras em negrito.

A Tabela 2f identifica os oligonucleotídeos anti-sentido de PDE4B humana contendo bases FANA de acordo com a presente invenção. Bases modificadas com FANA estão indicadas por letras em negrito.

A Tabela 2g identifica os oligonucleotídeos anti-sentido humano com especificidade dual contra mais que uma isoforma de PDE4A e conten- do bases FANA de acordo com a presente invenção. Bases modificadas com FANA estão indicadas por letras em negrito.

A Tabela 3 mostra iniciadores de oligonucleotídeos humanos usados na PCR em tempo real.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção refere-se a compostos com base em oligonucleotí- deo anti-sentido, composições terapêuticas e métodos para o tratamento de uma doença associada à cAMP celular reduzida e/ou doença associada a níveis elevados de pelo menos uma PDE. A invenção tem por objetivo au- mentar o nível de cAMP em células, enquanto é diminuído o nível de media- dores pró-inflamatórios bem como de enzimas que são liberadas por células inflamatórias.

Para obter esses efeitos, a presente invenção utiliza, em um de seus aspectos, o que é aqui referido por "nocaute de genes múltiplos". No- caute de genes múltiplos refere-se à inibição ou infra-regulação de genes múltiplos por um de um composto de oligonucleotídeos simples de acordo com a presente invenção, que infra-regula não somente o gene de isoenzi- ma contra o qual ele é também direcionado, mas também gene(s) relaciona- do(s), ou por uma combinação de pelo menos dois compostos de oligonu- cleotídeos anti-sentido, em que cada um infra-regula um gene de isoenzima diferente.

Doenças associadas aos níveis reduzidos de cAMP celular in- cluem doenças nas quais há níveis aumentados de pelo menos uma PDE específica de cAMP (isto é, um doença relacionada à PDE).

O termo "infra-regular" é usado aqui para referir-se à inibição pelo menos parcial da expressão de um gene. De acordo com a invenção, um composto de oligonucleotídeo anti-sentido infra-regula ou inibe um gene contra o qual ele é direcionado, isto é, um gene para o qual o composto de oligonucleotídeo anti-sentido exibe complementaridade de seqüência sufici- ente para causar a inibição.

O termo "genes relacionados" refere-se a outros genes que po- dem também desempenhar um papel na patofisiologia da doença associa- das à cAMP celular reduzida e/ou níveis aumentados de pelo menos uma PDE mas para o qual o composto anti-sentido de oligonucleotídeo não é complementar, ou completamente ou parcialmente. Tais genes incluem, mas sem limitação, genes que codificam enzimas de PDE ou isótipos, mediado- res, por exemplo, citocinas ou quimiocinas e genes que codificam enzimas. Exemplos de mediadores incluem IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, 11-15 e TNF-alfa. E- xemplos de enzimas apropriadas incluem, mas sem limitação, metaloprotei- nases de matriz (MMPs), tais como MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 e MMP-12.

De acordo com a presente invenção, os compostos de oligonu- cleotídeo anti-sentido (AÕN) são aqui definidos como oligonucleotídeos na- turais ou modificados, preferivelmente resistentes à nuclease, que exibem complementaridade ao DNA ou ao mRNA que codifica uma proteína alvo particular de modo que eles são capazes de interferir com a transcrição ou tradução do mRNA e/ou de induzir a atividade de RNase ou similar à RNase e assim funcionarem para reduzir a expressão da proteína alvo. A expressão da proteína alvo é reduzida quando o composto de oligonucleotídeo hibridiza para o DNA ou mRNA alvo, assim interferindo/prevenindo sua transcri- ção/tradução. Os presentes compostos de oligonucleotídeo devem ser, as- sim, suficientemente complementares ao ácido nucléico ao qual ele é dire- cionado de modo a hibridizar para o mesmo. Deste modo, embora em uma modalidade mais preferida os compostos de oligonucleotídeo sejam 100% complementares ao ácido nucléico ao qual eles são direcionados, 100% de complementaridade não são necessários para que a hibridização ocorra en- tre um composto de oligonucleotídeo e o ácido nucléico ao qual ele é dire- cionado, como o técnico versado apreciará. Como tal, em algumas modali- dades, os compostos de oligonucleotídeo podem ser de cerca de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60% e 50% complementares ao ácido nucléico ao qual ele são direcionados.

Os termos "ácido nucléico" e "molécula de ácido nucléico", como usados intercambiavelmente aqui, referem-se a uma molécula compreendida de nucleotídeos, isto é, ribonucleotídeos, desorribonucleotídeos ou ambos.

O termo inclui monômeros e polímeros de ribonucleotídeos e desoxirribonu- cleotídeos, com o ribonucleotídeo e/ou os desoxirribonucleotídeos estando conectados juntos, no caso dos polímeros, via ligações 5' a 3'. Contudo, as ligações podem incluir qualquer uma das ligações conhecidas na síntese de ácido nucléico, incluindo, por exemplo, ligações 5' a 2'. Os nucleotídeos u- sados na molécula de ácido nucléico podem ser naturais ou podem ser aná- logos produzidos sinteticamente que são capazes de formar relações de pa- res de base com pares de base naturais. Exemplos de bases não naturais que são capazes de formar reações de pareamento de base incluem, sem limitação, análogos de aza e desaza primidina, análogos de aza e desaza purina, e outros análogos de base heterocíclica, em que um ou mais dos átomos de carbono e nitrogênio dos anéis de purina e de pirimidina foram substituídos por heteroátomos, por exemplo, oxigênio, enxofre, selênio, fós- foro, e similares.

A invenção aqui refere-se também a modificações em oligonu- cleotídeo(s) anti-sentido que não afetam de modo significantemente adverso a sua atividade de redução ou inibição de expressão de uma proteína alvo, mas que podem intensificar essa atividade.

Os presentes compostos de oligonucleotídeos anti-sentido po- dem ser também modificados por inserção ou deleção de 1 ou mais bases sem afetar de modo significantemente adverso a sua atividade. Em particu- lar, a adição ou deleção de bases nas extremidades terminais dos oligonu- cleotídeos que exibem 100% de complementação ao gene contra o qual eles são direcionados, pode ser feita sem perda significante da atividade inibido- ra. Tais modificações podem ser feitas de modo a aumentar a atividade ou para proporcionar estabilidade intensificada do oligonucleotídeo. Além disso, a substituição de 1 ou mais bases nos presentes compostos de oligonucleo- tídeo anti-sentido pode ser também efetuada sem afetar adversamente a atividade, por exemplo, substituição de purina com uma outra purina (adeni- na, guanina) e pirimidina com pirimidina (citosina, timina, uracila).

Os compostos de oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a presente invenção incluem também siRNAs (RNAs de pequena interferên- cia), e RISCs (complexos silenciadores induzidos por RNA) contendo os mesmos que resultam da abordagem de RNAi (interferência de RNA). A a- bordagem de interferência de RNA (RNAi)1 que foi descrita recentemente, é considerada como uma nova ferramenta para a inibição de expressão de gene alvo. Como já era conhecido de há muitos, RNAi é baseado em um mecanismo de defesa anti-viral antigo em eucariotos inferiores. Ele é induzi- do por RNA de fita dupla e seu processamento para 21-23 nt de RNAs de pequena interferência (siRNAs), que provocam a degradação de mRNA en- dógeno homólogo depois da hibridização para o mRNA alvo em um modo de fita simples com o auxílio do complexo RISC. O modo que RNAi trabalha está ainda para ser inteiramente elucidado, mas ele já serve como uma a- bordagem de primeira escolha para gerar fenótipos com perda de função dentre a ampla variedade das espécies eucarióticas, tais como nematódeos, moscas, plantas, fungos e mamíferos.

Compostos de oligonucleotídeos anti-sentido de acordo com a presente invenção incluem também ribozimas e seqüências de nucleotídeos curtas, RNA ou DNA de fita dupla ou simples, que podem incorporar modifi- cações químicas conforme descrição acima, capazes de inibirem transcrição e/ou inibição de genes in vitro e/ou in vivo.

As composições e métodos da presente invenção, em um as- pecto, embora sem se estar ligado por um modo de ação particular, parecem agir por um mecanismo que foi denominado de "nocaute de genes múlti- plos". Nocaute de genes múltiplos no contexto de presente invenção refere- se a:

1) um composto de oligonucleotídeo anti-sentido que infra- regula não somente o gene contra o qual ele é direcionado, mas também infra-regula outros genes relacionados;

2) uma combinação de pelo menos 2 compostos de oligonu- cleotídeos anti-sentido, em que cada um é capaz de infra- regular um gene, em que cada um está presente em uma concentração na qual o composto de oligonucleotídeos an- ti-sentido é, por ele mesmo, praticamente ineficaz em infra- regular um gene contra o qual ele é direcionado, em que a combinação leva à infra-regulação significante de ambos genes contra os quais os oligonucleotídeos são direciona- dos e podem também infra-regular outros genes relaciona- dos. Esse efeito foi inicialmente descrito no Pedido de Pa- tente PCT, da aqui requerente, publicado como WO 05/030787.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma composi- ção que compreende pelo menos dois compostos oligonucleotídeos anti- sentido, em que cada composto anti-sentido é capaz de infra-regular um ge- ne diferente. Em algumas modalidades deste aspecto, a combinação dos pelo menos 2 compostos de oiigonucleotídeo anti-sentido leva a uma signifi- cante infra-regulação de cada um dos genes que é mais que a capacidade aditiva de cada anti-sentido de infra-regular cada gene individualmente.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma composi- ção farmacêutica para tratar e/ou prevenir doença associada à cAMP celular reduzida e/ou níveis elevados de pelo menos uma PDE1 em que a dita com- posição compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e pelo menos dois compostos de oiigonucleotídeo anti-sentido, em que cada oiigonucleotí- deo é direcionado contra pelo menos uma parte de um gene que codifica um PDE alvo diferente, sendo que cada oiigonucleotídeo é capaz de infra- regular o gene alvo contra o qual ele é direcionado, estando cada oiigonu- cleotídeo presente em uma concentração na qual ele exibe menos que 20% de inibição de seu gene de PDE alvo, a combinação exibindo maior que 20% de inibição e pelo menos duplicando a inibição de pelo menos um dos genes alvo e opcionalmente outros genes relacionados.

Como aquele versado na técnica apreciará a combinação de compostos de oiigonucleotídeo, de acordo com presente invenção, em con- centrações muito baixas, por exemplo, concentrações que exibem uma inibi- ção de pelo menos 20%. A menor concentração em que cada composto de oligonucleotídeos pode ser usado para formar uma combinação de acordo com a presente invenção variará, e esta concentração pode ser aquela na qual 0,5% de inibição é obtida, ou aquela concentração na qual 1% a 5% de inibição são obtidas. A presente invenção proporciona uma composição far- macêutica para tratar e/ou prevenir uma doença associada à cAMP celular reduzida e/ou níveis elevados de pelo menos uma PDE, em que a dita com- posição compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e pelo menos dois oligonucleotídeos anti-sentido em que cada um é capaz de infra-regular um gene alvo diferente, em que pelo menos um dos oligonucleotídeos está presente em uma concentração na qual é, por si só, praticamente ineficaz, por exemplo, uma concentração que exibe menos que 20% de inibição do gene alvo, em que a combinação de oligonucleotídeos exibe mais que 20% de inibição e pelo menos duplica a inibição de pelo menos um dos genes alvo, e opcionalmente de outros genes relacionados.

A presente invenção proporciona ainda o uso de uma combina- ção de pelo menos dois compostos de oligonucleotídeo anti-sentido para tratar e/ou prevenir doença associada à cAMP celular reduzida, tal como doença inflamatória respiratória, em que cada composto de oligonucleotídeo é direcionado contra um gene que codifica isótipo de PDE diferente, sendo cada composto de oligonucleotídeo capaz de infra-regular o gene contra o qual ele é direcionado, em que os compostos de oligonucleotídeo anti- sentido estão presentes em uma concentração na qual cada oligonucleotí- deo é, por si só, praticamente ineficaz para infra-regular o gene contra o qual ele é direcionado, sendo a combinação dos pelo menos dois compostos de oligonucleotídeo eficazes para infra-regular pelo menos um dos genes contra o qual os compostos de oligonucleotídeo são direcionados e opcionalmente outro genes relacionados.

A presente invenção proporciona ainda um método para tratar e/ou prevenir doença associada à cAMP celular, tal como doença respirató- ria inflamatória, em que o método compreende administrar a um paciente pelo menos dois compostos de oligonucleotídeo anti-sentido, em que cada um é capaz de infra-regular um gene de PDE alvo diferente, sendo os com- postos de oligonucleotídeo administrados em uma concentração na qual ca- da composto de oligonucleotídeo é, por si próprio, ineficaz para infra-regular o seu gene alvo, por exemplo, uma concentração que exibe menos que 20% de inibição do gene alvo, em que a combinação dos compostos de oligonu- cleotídeos é eficaz para infra-regular pelo menos um dos genes contra o qual os compostos de oligonucleotídeos são direcionados e opcionalmente outros genes relacionados.

A presente invenção proporciona ainda o uso de uma composi- ção farmacêutica, conforme descrita acima, na fabricação de um medica- mento para tratar e/ou prevenir doença associada à cAMP celular ou níveis de PDE específica de cAMP (doença relacionada à PDE) tais como doença inflamatória e câncer. A doença inflamatória à qual os presentes métodos e composições são direcionados é geralmente definida como doenças nas quais células e/ou mediadores inflamatórios estão presentes. Exemplos de doenças inflamatórias incluem, mas sem limitação, esclerose múltipla, der- matite de contato, doenças oculares alérgicas e não alérgicas, artrite reuma- tóide, choque séptico, osteoporose e distúrbios cognitivos. Doença respirató- ria inflamatória à qual os presentes métodos e composições são direciona- dos é geralmente definida como doenças do aparelho respiratório e pulmões onde as células e mediadores inflamatórios estão presentes. Exemplos de doença respiratória inflamatória incluem, mas sem limitação, COPD, asma, tosse eosinofílica, bronquite, rejeição aguda e crônica a aloenxerto de pul- mão, sarcoidose, fibrose pulmonar, rinite e sinusite.

A presente invenção proporciona ainda o uso de uma composi- ção farmacêutica conforme descrita acima na fabricação de um medicamen- to para tratar e/ou prevenir doença em que AMP cíclica reduzida está envol- vida na fisiopatologia.

A presente invenção proporciona ainda métodos para modificar oligonucleotídeos anti-sentido de modo que possam alcançar o nucleotídeo alvo e/ou ser mais eficazes contra o gene alvo para tratar e/ou prevenir do- enças respiratórias inflamatórias.

A presente invenção proporciona ainda uma formulação, que inclui a composição descrita acima, em que a formulação é sistêmica e/ou tópica.

A presente invenção proporciona um método in vivo para distri- buir uma composição farmacêutica para um polinucleotídeo alvo, que com- preende administrar a um paciente a composição conforme descrita acima em combinação com um tensoativo que permite que a composição atinja o(s) gene(s) alvo.

Preferivelmente, os pacientes ou indivíduos que podem ser tra- tados usando os compostos de oligonucleotídeo anti-sentido da presente invenção incluem, mas sem limitação, invertebrados, vertebrados, pássaros, mamíferos tais como porcos, cabras, carneiros, vacas, cachorros, gatos, e, particularmente, humanos. Os compostos de oligonucleotídeo de acordo coma presente invenção são desenhados para serem apropriados para o animal particular a ser tratado. Em particular, a seqüência dos compostos de oligonucleotídeo anti-sentido variará com o paciente que está sendo tratado por causa das diferenças genômicas entre as espécies.

A presente invenção proporciona ainda oligonucleotídeos anti- sentido eficazes contra, por exemplo, capazes de inibirem a expressão da família de enzimas PDE, incluindo, mas sem limitação, PDE3, PDE4 e PDE7. Como será apreciado por aquele versado na técnica, cada subtipo de PDE pode incluir também isótipos. Por exemplo, o subtipo de PDE3 inclui os isótipos de PDE3A e PDE3B; o subtipo de PDE4 inclui os isótipos PDE4A, PDE4B, PDE4C, e PDE4D; e o subtipo de PDE7 inclui os isótipos PDE7A1, PDE7A2, PDE7A3 e PDE7B.

Quando usado aqui, a frase "concentração na qual o composto de oligonucleotídeo anti-sentido é praticamente ineficaz" refere-se ao uso de cada composto de oligonucleotídeo, quando considerado sozinho, em uma concentração na qual praticamente não é observada infra-regulação para o gene contra o qual o composto de oligonucleotídeo é direcionado (em uma concentração na qual menos que 20% de inibição do gene alvo são exibi- dos). Isso contrasta com o efeito da combinação de pelo menos dois com- postos de oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção, cada um presente em uma concentração na qual eles são ineficazes, sozinhos, para infra-regular o gene contra o qual eles são direcionados (em uma concentra- ção na qual menos que 20% de inibição são exibidos), exibindo, esta combi- nação, mais que 20% de inibição e sendo eficaz para pelo menos duplicar os compostos que são direcionados.

O termo "oligonucleotídeo", como usado aqui, refere-se a uma molécula de ácido nucléico que compreende cerca de 1 a cerca de 100 nu- cleotídeos, mais preferivelmente, de 1 a 80 nucleotídeos, e ainda mais prefe- rivelmente de cerca de 4 a cerca de 35 nucleotídeos. O termo "oligonucleotí- deo" inclui também oligonucleotídeos modificados e compostos de oligonu- cleotídeos como estabelecido acima.

Os termos "oligonucleotídeo modificado" e "molécula de ácido nucléico modificada", como usado aqui, incluem oligonucleotídeos com uma ou mais modificações químicas no nível molecular das estruturas molecula- res naturais de todas ou quaisquer das bases de ácido nucléico, frações de açúcar, ligações de fosfato de internucleosídeo, bem como moléculas tendo substituintes adicionados, tais como diaminas, colesterila ou outros grupos lipofílicos, ou uma combinação de modificações nestes sítios. As ligações de fosfato de internucleosídeo podem ser fosfodiéster, fosfotriéster, fosforami- dato, siloxano, carbonato, éster carboximetílico, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforanidato em ponte, fosfanato de metileno em ponte, fosforotioa- to, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato em ponte e/ou ligações de sulfona internucleotídeo, ou ligações 3'-3'-, 2'-5" ou 5'-5\ e combinações de tais ligações similares (para produzirem oligonucleotídeos modificados na cadeia principal, mistos). As modificações podem ser internas (simples ou repetidas) ou na(s) extremidade(s) da molécula de oligonucleotídeo e podem incluir adições à molécula das ligações de fosfato de internucleosídeo, tais como colesterila, compostos de diamina com números variáveis de resíduos de carbono entre grupos amino e modificações na ribose terminal, desoxirri- bose e fosfato, que clivam ou reticulam para as cadeias opostas ou para as enzimas associadas ou para outras proteínas. Grupos hidrofílicos, tal como ribose-dialdeído, podem ser covalentemente ligados a um grupo epsílon- amino do resíduo Iisila de tal proteína. Um grupo nucleofílico, tal como n- etilmaleimida limitado a um oligômero poderia se ligar covalentemente à ex- tremidade 5' de um mRNA ou a um outro sítio eletrofílico. O termo "oligonu- cleotídeos modificados" inclui também oligonucleotídeos compreendendo modificações nas frações açúcar tais como ribonucleotídeos substituídos em 2', ou monômeros de desoxirribonucleotídeos, quaisquer dos quais estão conectados juntos via ligações 5' a 3'. Os oligonucleotídeos modificados po- dem ser também compreendidos de PNA ou de cadeias principais modifica- das com morfolino, onde a especificidade alvo da seqüência é mantida.

Opcionalmente, os oligonucleotídeos presentemente descritos podem ser formulados com uma variedade de moléculas de veículos fisioló- gicos. Os oligonucleotídeos presentemente descritos podem ser também complexados com moléculas que intensificam sua capacidade de entrar nas células alvo. Exemplos de tais moléculas incluem, mas sem limitação, car- boidratos, poliaminas, aminoácidos, peptídeos, Iipidios3 e moléculas vitais ao crescimento celular. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser combina- dos com um lipidio, em que a emulsão de oligonucleotídeo/lipídio, ou sus- pensão lipossômica pode, entre outros, aumentar eficazmente a meia-vida in vivo do oligonucleotídeo.

Alternativamente, os oligonucleotídeos direcionados aos alvos de PDE podem ser também protonados/acidificados para funcionarem em uma função dual como inibidores de fosfodiesterase e agentes antibacteria- nos. Por conseguinte, uma outra modalidade da invenção presentemente descrita é o uso de um oligonucleotídeo terapêutico que modula PDE que é adicionalmente protonado/acidificado para aumentar a absorção, aperfeiçoar o encapsulamento em lipossomos, de modo que ele pode servir também como um antibiótico. Adicionalmente, o oligonucleotídeo pode ser complexa- do com uma variedade de compostos bem estabelecidos ou estruturas que, por exemplo, ainda intensifica a estabilidade in vivo do oligonucleotídeo, ou de outro modo intensificam suas propriedades farmacológicas (por exemplo, aumentam a meia-vida in vivo, reduzem a toxicidade, etc.).

O termo "cadeia principal de ácido nucléico", como usado aqui, refere-se à estrutura dos nucleotídeos que se ligam à fração química em uma molécula. Isso pode incluir estruturas formadas de quaisquer e todos os meios de nucleotídeos que se ligam quimicamente. Uma cadeia principal modificada, como usada aqui, inclui modificações na ligação química entre os nucleotídeos, bem como outras modificações que podem ser usadas para intensificar a estabilidade e a afinidade, tais como modificações para a estru- tura de açúcar. Por exemplo, um [alfa]-anômero de desoxirribose pode ser usado, onde a base é invertida com respeito ao [beta]-anômero natural. Em uma modalidade preferida, o 2'-OH do grupo açúcar pode ser alterado para 2'-0-alquila ou 2'-0-alquil-n(0-alquila), que proporciona resistência à degra- dação sem comprometer a afinidade.

Os termos "acidificação" e "protonação/acidificação", como usa- dos aqui, se referem ao processo pelo qual prótons (ou íons hidrogênio posi- tivos) são adicionados aos sítios receptores de prótons em um ácido nucléi- co. Os sítios receptores de prótons incluem os grupos amina nas estruturas de base do ácido nucléico e o fosfato das ligações de fosfodiéster. Conforme o pH diminui, o numero desses sítios receptores, que são protonados, au- menta, resultando em um ácido nucléico mais altamente protona- do/acidificado.

O termo "ácido nucléico protonado/acidificado" refere-se a um ácido nucléico que, quando dissolvido em água a uma concentração de a- proximadamente 16 A260 por ml_, tem um pH inferior ao pH fisiológico, isto é, menor que aproximadamente pH 7. Ácidos nucléicos modificados, ácidos nucléicos resistentes à nuclease, e ácidos nucléicos anti-sentido devem ser entendidos como estando englobados nesta definição. Geralmente, ácidos nucléicos são protonados/acidificados por adição de prótons aos sítios reati- vos sobre um ácido nucléico, embora outras modificações que reduzirão o pH do ácido nucléico podem ser também usadas e é pretendido aqui que elas estejam incluídas neste termo.

O termo "bloqueado na extremidade", como usado aqui, refere- se a um ácido nucléico com uma modificação química no nível molecular que previne a degradação dos nucleotídeos selecionados, por exemplo, por ação da nuclease. Essa modificação química é posicionada de modo que ela proteja a parte integral do ácido nucléico, por exemplo, a região de codifica- ção de um oligonucleotídeo anti-sentido. Um bloco de extremidade pode ser um bloco de extremidade 3' ou um bloco de extremidade 5'. Por exemplo, o bloco de extremidade 3' pode estar na posição máxima de 3' da molécula, ou pode estar interna às extremidades 3', com a condição que ela seja 3' das seqüências integrais do ácido nucléico.

O termo "substancialmente resistente à nuclease" refere-se aos ácidos nucléicos que são resistentes à degradação por nuclease, em compa- ração com ácidos nucléicos naturais ou não modificados. Os ácidos nucléi- cos modificados da invenção são pelo menos 1,25 vezes mais resistentes à degradação por nuclease, ainda mais preferivelmente pelo menos 5 vezes mais resistentes, e de maior preferência pelo menos 10 vezes mais resisten- tes que seu equivalente não modificado. Tais ácidos nucléicos substancial- mente resistentes à degradação por nuclease incluem, mas sem limitação, ácidos nucléicos com cadeias principais modificadas tais como fosforotiona- tos, metilfosfonatos, etilfosfotriésteres, 2!-0-metilfosforotioatos, 2'-0-metil-p- etóxi ribonucleotídeos, 2'-0-alquilas, 2!-0-alquil-n(0-aiquila), 3'-0-alquilas, 3'-0-alquil-n(0-alquilas). 2'-flúor, 2'-desóxi-eritropentofuranosilas, 2'-0-metil ribonucleosídeos, carbamatos de metila, carbonatos de metila, bases inverti- das (por exemplo, Ts invertidos), ou versões quiméricas dessas cadeias laterais.

O termo "substancialmente resistente a ácido", como usado a- qui, refere-se a ácidos nucléicos que são resistentes à degradação com áci- do em comparação com os ácidos nucléicos não modificados. Tipicamente, a resistência a ácido relativa de um ácido nucléico será medida comparando- se a degradação percentual de um ácido nucléico resistente com a degrada- ção percentual de seu equivalente não modificado (isto é, um ácido nucléico correspondente com cadeia principal "normal", bases, e ligações de fosfodi- éster). Um ácido nucléico que é resistente a ácido é preferivelmente pelo menos 1,5 vezes mais resistente à degradação por ácido, pelo menos 2 ve- zes mais resistente, ainda mais preferivelmente, pelo menos 5 vezes mais resistente, e de maior preferência pelo menos 10 vezes mais resistente que seu equivalente não modificado.

Os termos "oligonucleotídeo de PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A, PDE7B", como usados aqui, se referem, cada um, a um oligonucleotídeo que é alvejado, respectivamente, para as seqüências que afetam a expressão ou a atividade de PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A, PDE7B. Essas incluem, mas sem limitação, seqüências de codificação de DNA de PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A, PDE7B; seqüências de promotores de DNA de PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A, PDE7B; seqüências de intensificadores de DNA de PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A, PDE7B, mRNA codifica com PDE3A, PDE3B, PDE4A. POE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A, PDE7B, e similares Como discutido acima, uma modalidade da presente invenção proporciona oligonucleotídeos anti-sentido alvejados para seqüências que afetam a expressão ou a atividade de PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4D, PDE7A. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos anti-sentido po- dem ter uma das seqüências identificadas nas Tabelas 1a-d ou Tabelas 2a- g. Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo anti-sentido pode compre- ender fragmentos ou variantes dessas seqüências, como será entendido por aquele versado na técnica, que podem alterar a formação e/ou comprimento do oligonucleotídeo, mas que mantêm ou aumentam a atividade do oligonu- cleotídeo para infra-regular a expressão de gene. Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona combinações de pelo menos dois oligonu- cleotídeos anti-sentido que têm as seqüências identificadas nas Tabelas 1a- d ou Tabelas 2a-g.

A comparação da eficácia de um oligonucleotídeo simples está ilustrada, mas sem limitação, na figura 1a, figura 1b e figura 5. Por exemplo, na figura 1a, TOP 1512 (SEQ ID N9:91), que é direcionado contra as PDE4A e PDE4B humanas, inibe ambos estes alvos in vitro. Similarmente, a figura 1b mostra TOP 1545 (SEQ ID Ne: 14) e TOP 1556 (SEQ ID Ng:24), que reco- nhecem as seqüências compartilhadas por PDE4B e PDE4D, demonstram a inibição de ambas as seqüências alvo. TOP 1507 (SEQ ID N9:10) e TOP 1508 (SEQ ID N9:11), que reconhecem as seqüências compartilhadas por PDE4A e PDE4D funcionam para inibirem ambos os genes alvo.

A comparação de eficácia das combinações de pelo menos 2 compostos de oligonucleotídeo é ilustrada, mas sem limitação, nas figuras 6a e 12. Por exemplo, na figura 6 a combinação de TOP 1545-F3 (SEQ ID Ne:85) e TOP-1731-F2 (SEQ ID NQ:53) mostram um efeito maior na expres- são decrescente de PDE4B, PDE4D e PDE7A que o mostrado por qualquer um dos oligonucleotídeo em seus alvos respectivos, quando usados sozi- nhos. Na figura 6b a combinação de TOP-1545-F3 (SEQ ID N9:85) e TOP- 1731-F2 (SEQ ID NQ:53) mostram um efeito maior da inibição de secreção de IL-2 que quando usados sozinhos.

Muitas combinações de compostos de oligonucleotídeo anti- sentido podem ser usadas de acordo com a presente invenção, em que a combinações levam ao nocaute de genes múltiplos conforme descrição aci- ma. Exemplos de combinações de oligonucleotídeos anti-sentido podem in- cluir, mas sem limitação, peio menos um composto de oligonucleotídeo dire- cionado contra PDE3 com pelo menos um composto de oligonucleotídeo direcionado contra PDE7. Um exemplo alternativo de uma combinação pode incluir pelo menos um oligonucleotídeo direcionado contra PDE4 e pelo me- nos um oligonucleotídeo direcionado contra PDE7. Um exemplo alternativo de uma combinação pode incluir pelo menos um oligonucleotídeo direciona- do contra PDE3, pelo menos um oligonucleotídeo direcionado contra PDE4 e pelo menos um oligonucleotídeo direcionado contra PDE7. Tais compostos de oligonucleotídeo anti-sentido podem ser selecionados de, mas sem limi- tação, os oligonucleotídeos fornecidos nas Tabelas 1a-d e nas Tabelas 2a- 2g.

Os termos "tratamento", "tratar", "terapia" e similares são usados aqui geralmente com o significado de obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente uma doença ou sintoma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou atenuação de um efei- to adverso atribuível à doença. "Tratamento" como usado aqui engloba qual- quer tratamento de uma doença em um paciente conforme previamente de- finido, particularmente um humano, e inclui:

(a) prevenir que uma doença ocorra em um paciente que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnostica- do como tendo a mesma;

(b) inibir uma doença, isto é, impedir o seu desenvolvimento; ou

(c) aliviar uma doença, isto é, fazer com que a doença regrida.

O termo "farmaceuticamente aceitável", como usado aqui com respeito a veículos, tensoativos e composições, refere-se a substâncias que são aceitáveis para uso no tratamento de um paciente, que são atóxicas ou de outro modo aceitáveis para administração por quaisquer das vias aqui descritas.

A invenção é geralmente direcionada ao tratamento de pacientes pela administração de quantidades terapeuticamente eficazes de compostos de oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a presente invenção, incluin- do siRNA, ribozima, seqüências de nucleotídeos curtas como de fita simples ou dupla incluindo RNA e/ou DNA que podem ser complementares a um á- cido nucléico alvo, ou podem ser opcionalmente modificadas conforme des- crição acima, um oligonucleotídeo de RNA tendo uma parte do dito oligonu- cleotídeo de RNA capaz de hibridizar com RNA para formar um duplex de oligonucleotídeo-RNA, ou um oligonucleotídeo quimérico, que infra-regulará ou inibirá a expressão de um gene endógeno in vivo.

Por quantidade "terapeuticamente eficaz" deve-se entender uma quantidade atóxica, mas suficiente, de um composto de oligonucleotídeo anti-sentido para proporcionar o efeito terapêutico desejado. No presente caso, aquela dose do composto de oligonucleotídeo anti-sentido eficaz para aliviar, atenuar, ou prevenir os sintomas da condição ou da doença que está sendo tratada, por exemplo, doença associada à cAMP celular reduzida, do- ença relacionada à PDE, doença inflamatória tal como doença respiratória inflamatória.

As composições farmacêuticas proporcionadas aqui compreen- dem compostos de oligonucleotídeo anti-sentido, conforme descrição acima, e um ou mais tensoativos farmaceuticamente aceitáveis. Tensoativos e componentes de tensoativo adequados para intensificar a absorção dos oli- gonucleotídeos da invenção foram previamente descritos na Publicação de Pedido de Patente US 2003/0087845, cujo conteúdo é aqui incorporado com respeito aos tensoativos. Esse pedido estabelece que tensoativos adequa- dos "... incluem formas sintéticas ou naturais bem como inteiras e truncadas de tensoativo proteína A, tensoativo proteína B, tensoativo proteína C, ten- soativo proteína D e tensoativo proteína E, fosfatidilcolina dissaturada (dife- rente de dipalmitoíla), dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilcolina, fosfatidilglice- rol, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina; ácido fosfatídico, ubiquinonas, lisofosfatidiíetanolamina, lisofosfatidilcolina, palmitoil-lisofosfati- dilcolina; desidroepiandrosterona, dolicóis, ácido sulfatídico, glicero!-3- fosfato, fosfato de diidroxiacetona: glicero!, glicero-3-fosfocolina, disidroxia- cetona, palmitato, citidina difosfato (CDP) diacilglicerol, CDP colina, colina, fosfato de colina; bem como corpos Iamelares naturais e artificiais, que são os veículos carreadores naturais para os componentes de tensoativo, ácidos graxos ômega-3, ácido poliênico, ácido poiienóico. lecitina, ácido palmitínico, copolímeros em bloco não iônicos de óxidos de etileno ou de propileno, poli- oxipropileno, monomérico e polimérico, polixoietileno, monomérico e polimé- rico, poli(vinil amina) com dextrana, e/ou cadeias laterais de alcanoíla, Brij 35, Triton X-100 e tensoativos sintéticos ALEC, Exosurf, Survan e Atovaquo- na, entre outros. Esses tensoativos podem ser usados como o único ou par- te de um tensoativo de componentes múltiplos em uma formulação, ou adi- ções covalentemente ligadas às extremidades 5' e/ou 3' dos oligonucleotí- deos anti-sentido (oligos)."

O componente anti-sentido das presentes composições, que in- clui a combinação de pelo menos dois compostos de oligonucleotídeos, po- de estar contido em uma composição farmacêutica dentro de uma partícula ou vesícula lipídica, tal como Iipossomo ou microcristal. Conforme descrição na Patente US 6.025.339, as partículas lipídicas podem ser de qualquer es- trutura adequada, tal como unilamelar ou plurilamelar, desde que o oligonu- cleotídeo anti-sentido esteja contido aí. Lipídios carregados positivamente carregados tal como metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleoilóxi)propil]-N,N,N-timetil- amônio, ou "DOTAP", são particularmente preferidos para tais partículas e vesículas. A preparação de tais partículas de lipídios é bem conhecida. Vide, por exemplo, as Patentes US 4.880.635 de Janoff e et al.; US 4.906.477 de Kurono et al.; US 4.911.928 de Wallach; US 4.917.951 de Wallach; US 4.920.016 de Allen et al.; US 4.921.757 de Wheatley et al.; etc.

A composição da invenção pode ser administrada por qualquer meio que transporte o composto de oligonucleotídeo anti-sentido para o sítio desejado, tal como o pulmão. Os compostos anti-sentido descritos aqui po- dem ser administrados aos pulmões de um paciente por qualquer meio ade- quado, mas são preferivelmente administrados por inalação de um aerosol compreendido de partículas respiráveis que compreendem o composto anti- sentido.

A composição da presente invenção pode ser administrada ao sistema respiratório como uma formulação que inclui partículas de tamanho respirável, por exemplo, partículas de um tamanho suficientemente pequeno para passarem através do nariz, boca e Iaringe mediante inalação e através dos brônquios e alvéolos dos pulmões. Em geral, as partículas respiráveis variam de cerca de 0,5 a 10 mícrons de tamanho. Partículas de tamanho não respirável que são incluídas no aerosol tendem a se depositar na gar- ganta e serem engolidas, e a quantidade de partículas não respiráveis no aerosol é preferivelmente assim minimizada. Para administração nasal, um tamanho de partícula na faixa de 10-500 μηη é preferido para assegurar a retenção na cavidade nasal.

Composições farmacêuticas líquidas do composto ativo o(s) composto(s) de oligonucleotídeo anti-sentido para produção de um aerosol podem ser preparadas por combinação do composto anti-sentido com um veículo adequado, tal como água estéril isenta de pirogênio ou solução sali- na tamponada com fosfato.

Uma composição sólida particulada, que compreende o compos- to anti-sentido pode conter opcionalmente um dispersante que serve para facilitar a formação de m aerosol, bem como de outros compostos terapêuti- cos. Um dispersante adequado é a lactose, que pode ser misturada com o composto anti-sentido em uma razão adequada, por exemplo, uma razão de 1 a 1 em peso.

As composições anti-sentido podem ser administradas em uma quantidade eficaz anti-broncoconstrição, anti-alergia(s) e/ou antiinfiamatória, cuja quantidade depende do grau da doença que está sendo tratada, da condição do paciente, da formulação particular, da via de administração, do tempo de administração ao paciente, etc. Em geral, as concentrações intra- celulares do oligonucleotídeo de 0,05 a 50μΜ, ou mais particularmente 0,2 a 5pM,são desejáveis. Para administração a um paciente mamífero tal como o homem, á dosagem de cerca de 0,001, 0,01, 0,1, ou 1 mg/kg até cerca de 50, ou 100 mg/kg ou mais é tipicamente empregada. Contudo, outras doses são também contempladas. Dependendo da solubilidade do composto ativo em qualquer formulação particular, a dose diária pode ser dividida entre uma ou várias administrações da dose unitária.

Os aerosóis de partículas líquidas que compreendem o compos- to anti-sentido podem ser produzidos por quaisquer meios adequados, tal como um nebulizador. Nebulizadores são dispositivos comercialmente dis- poníveis que transformam soluções ou suspensões do ingrediente ativo em uma névoa terapêutica de aerosol por meio da aceleração de um gás com- primido, tipicamente oxigênio ou ar, através de um orifício para tipo venturi ou por meio de agitação ultra-sônica. Formulações adequadas para uso em nebulizadores compreendem o ingrediente ativo de oligonucleotídeo anti- sentido em um veículo líquido em uma quantidade de até 40% p/p, preferi- velmente menos que 20% p/p da formulação. O veículo é tipicamente água ou solução alcoólica aquosa diluída, preferivelmente tornada isotônica com fluidos corpóreos pela adição de, por exemplo, cloreto de sódio. Aditivos op- cionais incluem conservantes se a formulação não é preparada estéril, por exemplo, hidroxibenzoato de metila, antioxidantes, antibacterianos, flavori- zantes, óleos voláteis, agentes tampão e emulsificantes e outros tensoativos de formulação.

Os aerosóis de partículas sólidas compreendendo o(s) compos- to(s) ativo(s) de oligonucleotídeo e um tensoativo farmaceuticamente aceitá- vel podem ser igualmente produzidos com qualquer gerador de aerosol de medicamento, particulado, sólido. Gerador de aerosol para administrar medi- camentos particulados sólidos a um paciente produz partículas que são res- piráveis, conforme explicação acima, e geram um volume de aerosol que contém uma dose medida predeterminada de um medicamento, em uma taxa adequada para administração a humanos. O ingrediente ativo de oligo- nucleotídeo compreende tipicamente de 0,1 a 100 p/p da formulação. Um segundo tipo de gerador de aerosol ilustrativo compreende um inalador com dosador. Os inaladores com dosadores são dispensadores de aerosol pres- surizados, contendo tipicamente uma formulação em suspensão ou solução do ingrediente ativo em um propelente líquido. Durante o uso., esses disposi- tivos descarregam a formulação através de uma válvula adaptada para dis- tribuir um volume dosado, tipicamente de 10 a 150 mu.l, para produzir uma aspersão de partículas finas contendo o ingrediente ativo. Os propelentes adequados incluem certos compostos de clorofuorcarbonetos, por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano ou hidrofluo- ralcanos e misturas destes. A formulação pode conter adicionalmente um ou mais co-solventes, por exemplo, etanol, emulsificantes e outros tensoativos de formulação, tal como ácido oléico ou trioleato de sorbitano, antioxidantes e agentes flavorizantes adequados. O aerosol, se formado de partículas só- lidas ou líquidas, pode ser produzido pelo gerador de aerosol em uma taxa de cerca de 1 a 150 litros por minuto.

As formulações da presente invenção podem ser formulações orais, intrabucais, intrapulmonares, retais, intrauterinas, intratumorais, intra- cranianas, nasais, intramusculares, subcutâneas, intratecais, inaláveis, transdérmicas, intradérmicas, intracavitárias, implantáveis, iontoforéticas, oculares, vaginais, intraarticulares, óticas, intravenosas, intramusculares, intraglandulares, interórgão, intralinfáticas, de liberação lenta ou de revesti- mento entérico. Os veículos usados nas formulações podem ser, por exem- pio, veículos sólidos e/ou líquidos.

Referência pode ser feita a "Remington's Pharmaceutical Scien- ces", 17a Edição, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, para outros veículos que seriam adequados para combinação com os seguintes compos- tos de oligonucleotídeos presentes para renderem composições/formulações que são adequados para administração para tratar doença respiratória.

Em um outro aspecto da presente invenção, um artigo de fabri- cação é proporcionado, o qual inclui embalar o material contido dentro dele, que é uma composição de oligonucleotídeo anti-sentido, farmaceuticamente aceitável, que é terapeuticamente eficaz para tratar condições associadas à cAMP celular reduzida, ou aos altos níveis de PDE, incluindo doença infla- matória. Em uma modalidade, a composição compreende um composto de oligonucleotídeo anti-sentido que é eficaz para inibir um gene de PDE, em que o dito composto de oligonucleotídeo é pelo menos 50% complementar ao gene. Em um outro aspecto, a composição compreende pelo menos 2 compostos de oligonucleotídeo anti-sentido, em que cada composto de oli- gonucleotídeo anti-sentido é capaz de infra-regular um gene de PDE diferen- te, estando o composto de oligonucleotídeo anti-sentido em uma concentra- ção na qual o composto de oligonucleotídeo anti-sentido é, por si mesmo, ineficaz para infra-regular o gene contra para o qual ele é direcionado, em que a combinação dos compostos de oligonucleotídeo anti-sentido são efi- cazes para infra-regular pelo menos um dos genes contra o qual os oligonu- cleotídeos anti-sentidos são direcionados.

Em uma modalidade, o material de embalagem do artigo com- preende uma etiqueta que indica que a composição pode ser usada para tratar doença inflamatória e pode incluir adicionalmente uma indicação de que a doença é uma de esclerose múltipla, dermatite de contato, doenças oculares alérgicas e não alérgicas, artrite reumatóide, choque séptico, oste- oporose e distúrbios cognitivos.

Em uma outra modalidade, o material de embalagem do artigo compreende uma etiqueta que indica que a composição pode ser usada pa- ra tratar doença respiratória inflamatória, e pode incluir adicionalmente uma indicação de que a doença é uma de COPD, asma, tosse eosinofílica, bron- quite, rejeição aguda e crônica de aloenxerto no pulmão, sarcoidose, fibrose pulmonar, rinite ou sinusite.

Para os propósitos da presente invenção, o material de embala- gem pode ser qualquer material adequado para embalar uma composição 25 que contém nucleotídeos de acordo com a presente invenção, incluindo gar- rafa ou qualquer outro recipiente, (de plástico ou de vidro), uma caixa, um tubo, ou outro tipo de envoltório protetor. Como será apreciado, a embala- gem pode variar com a natureza da composição de oligonucleotídeo, por exemplo, uma formulação líquida pode ser embalada de modo diferente de uma formulação de aerosol.

A presente invenção é ainda ilustrada em mais detalhes pelos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLOS

Materiais e Reaqentes

Meios AIM-V (Invitrogen, Cat#31035-025); Opti MEM I (Invitro- gen, cat#31985-07, lote #1244206); FBS (Soro Bovino Fetal1 Wisent, cat# 80150); Penicilina1 Estreptomicina (GIBCO, cat# 15140-122); HEPES (Wi- sent, cat# 26060CI) e L-glutamina (Gibco, cat# 25030-081); DMEM/F12 (Wi- sent, cat# 10090CV); Piruvato de Sódio (Wisent, cat# 25000-Ci); PBS Estéril (GIBCO, cat# 25030-081 ); Tripsina a 0,25% e EDTA a 0,01% (Wisent, cat# 25-052-Ci); HBSS (solução salina balanceada de Hank, Wisent, Cat# 21- 022CV); PHA (Fitoemaglutinina, Sigma, cat#L-9132, lot#: 015K88913); Ficoll paque (Amersham, Cat# 17-1440-03); Trizol (Invitrogen, cat#15596-018); Dnase I (Fermentas, cat#EN0521 ); Sistema de Síntese de Primeira Fita Su- perScript para kit RT- PCR (Invitrogen, cat#11904-018); dNTPs (Invitrogen, cat# 10297-018); oligo (dT)12-i8 (Invitrogen, cat#11904-018); Minikit Qiagen RNAeasy (Qiagen, Cat#74106); Tubulação QiaVae 2 (Qiagen, Cat#19403); Vasoconectores Descartáveis (Qiagen, Cat#19407); Reagente de Quantifi- cação RiboGreen (Invitrogen-Molecular Probes, Cat # R-11490); Instrumento de Ciclador de Luz da Roche versão 1.5 (Roche, Cat# 3531414); Capilares LC para reações de 20ml (Roche, cat# 1909339); LC FastStart DNA Master SYBR Green 1 PLUS (100ml) (Roche, Cat# 03752186001 ); tubos K3EDTA(Greiner Bio-one, cat#: 455036B1 10306); Kit para EIA de AMP cí- clica (Cayman, cat.# 581001 ) Kit ELISA para TNF-α humano, (BioSource Cat#CHC-1754, lot# 041703); Kit Elisa para IL-8 humana/CXCL8 ELISA (Bi- osource, eat# CHC1303); Kit ELISA para MCP-1 humana/CCL2 (Biosource, cat# KHC1012); kit para cAMP (Cayman, cat# 581001 ); ELISA para GMCSF humano (Medicorp, cat#CHC0904); ELISA para IL-2 humana (BD Bioscien- ces, cat#555190); leitora de placa de ELISA (filtro de 450 nm, filtro de refe- rência de 650 nm, Biorad, model680); agente de transfecção Escort IV (Sig- ma-AIdrich, cat#3287, lote#094K0565); hlL-1 β (Peprotech, cat.#11195D195); Forskolin (Sigma-AIdrich cat#F3917); Rolipram (Sigma-AIdrich Cat # R6520, Iot # 022K4604); AIamarBIue, (Biosource cat#DAL1100); ligação alta de pla- ca de 12 poços (Costar, cat #665 102); reagente cromógeno TMB para ELI- SA (MediCorp, cat # SB01 ); reagente de transfecção Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, cat#1 1668-019); Kit de Seleção Quantigene® (Panomics, cat# QG- 000-050); 20XSSC (NaCI 3M, diidrato de citrato de sódio 0,3M, pH 7,0); Dodecil sulfato de lítio a 10% p/v (Sigma, cat# L9781 ); Incubadora ajustada a 53°C, 0% CO2; Lavadora de Placas MW96 (Beckman Coulter); Thermo Luminoskan (LabSystem); EMEM (HyClone, cat#SH30024.01); aminoácidos não essenciais (HyClone, cat#30238.01 ); BEBM (Clonetics, cat#CC-3171); kit BEBM (Clonetics, cat#3170); TNF-α humano (Peprotech, cat.#300-01 A); IFNy (Peprotech, cat#315-05).

Cultura de Células

Células 293 (linhagem de célula embrionária de rim, transforma- da, humana; ATCCcat#: CRL-1573) foram cultivadas em DMEM contendo L- glutamina 2mM, aminoácidos não essenciais O,ImM, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, piruvato de sódio 1mM, FBS a 10%, penicilina 100 U/mL e estrep- tomicina 100 pg/mL. A549 (linhas de célula de carcinoma do pulmão huma- no; ATCC) foram cultivados em meios Ham-Fl 2 contendo L-glutamina 2mM; 1,5 g/L de bicarbonato de sódio; FBS a 10%, Penicilina 100 U/mL, Estrepto- micina 100 μg/mL. Células mononucleares, sangüíneas periféricas, humanas (PBMC) (células mononucleares, sangüíneas, perfiéricas) foram obtidas de voluntários saudáveis. PBMC foram isoladas por centrifugação com gradien- te de densidade Ficoll-Hypaque em 2x106 células/mUpoço em placas de 12 poços em meios de cultura AIM-C suplementados com Penicilina 100 U/mL, Estreptomicina 100 μg/mL Células CYNOM-K1 foram cultivadas em EMEM contendo L-glutamina 2mM, aminoácidos não essenciais a 1%, FBS a 10%, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 μg. Células NHBE foram cultiva- das em BEBM (500 mL suplementados com ΒΡΕ, 2 mL; Hidrocrotisona, 0,5 mL; hEGF, 0,5 mL; Epinefrina, 0,5 mL; Transferrina, 0,5 mL; Insulina, 0,5 mL; Ácido retinóico, 0,5 mL; Triiodotironina, 0,05 mL).

Viabilidade das Células

A viabilidade das células foi ensaiada sistematicamente usando o Teste de AlamarBlue, seguindo as instruções do fabricante.

Preparação de Anti-Sentido Anti-sentidos de fosforotioato-DNA (Sigma Gensoys) e anti- sentidos de fosfotiorato-FANA (Topigen, Montreal ou UCDN1 Calgary) foram re-suspensos em água estéril e diluídos em Opti-MEM para transfecção. Re- ferências a oligonucleotídeos de DNA (não FANA) nos exemplos são oligo- nucleotídeos de fosforotioato-DNA.

Tratamento com Anti-Sentido de Células: Linhagem de célula A549:

As células foram tripnizadas e re-suspensas em meio HAM-F12 (0,5 χ 10^5 células/poço em placas de 48 poços) suplementado com soro a 10% em condições privadas de antibiótico, então incubadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte, as células aderentes foram transfectadas com complexos de anti-sentido/Lipofectamina (razão de 1 μg de oligonucieotídeo: 1 μL de Lipofectamina) nas concentrações indicadas na descrição das figu- ras, e incubadas a 37°C' por um determinado período de tempo.

Linhagem de célula 293

As células foram tripsinizadas e re-suspensas (1x105 célu- las/poço em placas de 48 poços) em meio de DMEM suplementado com so- ro a 10% em condições privadas de antibiótico, então incubadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte, as células aderentes foram transfectadas com complexos de anti-sentido/Lipofectamina (razão de 1 μg de oligonucieotídeo: 1 μl. de Lipfectamina) nas concentrações indicadas nas legendas das figuras e incubadas a 37°C, por um determinado período de tempo. PBMC

No dia do isolamento, as PBMCs foram plaqueadas (2,0x10^6/mL em placas de 12 poços) em meios AIM-V. Os anti-sentidos foram complexa- dos com o reagente Escort IV (Sigma) (razão de 1 μg de oligonucieotídeo: 0,5 μl de Escort IV) e foram adicionados nas concentrações indicadas nas figuras. As células foram cultivadas por 18 a 24 horas, a 37°C, CO2 a 5%, umidade.

Linhagem de célula CYNOM-K1

As células foram tripnizads em condições privadas de antibiótico e re-suspensas em meio EMEM suplementado com soro a 10% em condi- ções privadas de antibiótico (0,5x105 células/poço em 200 μL em placas de 48 poços) e então incubadas durante a noite, a 37°C. No dia seguinte, as células aderentes foram transferidas com complexos de anti-sentido/Lipo- fectamina 2000 (razão de 1 μ9 de oligonucleotídeo: 2 μL de Lipofectamina) nas concentrações indicadas nas descrições das figuras e incubadas a 37°C por um determinado período de tempo. Células NHBE

As células foram tripsinizadas e re-suspensas em meio completo de BEMB em condições privadas de antibiótico (1x105 células/poço em 200 μΐ em placas de 48 poços) e então incubadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte, as células aderentes foram transferidas com complexos de anti- sentido/Lipofectamina 2000 (razão de 1 μ9 de oligonucleotídeo: 1 μΙ_ de Li- pofectamina) nas concentrações indicadas nas descrições das figuras e in- cubadas a 37°C por um determinado período de tempo.

Extração de RNA

RNA foi extraído dos precipitados das células de acordo com o protocolo de minikit RNAeasy usando a tubulação QiaVac 24 da Qiagen e tratado com DNase-I de acordo com o procedimento Fermentas. O RNA foi quantificado usando o reagente RiboGreen de acordo com o protocolo do fabricante (Inivitrogen-Molecular Probes).

Transcrição Reversa (RT)

A preparação do cDNA de primeira fita foi realizada usando-se o Sistema de Síntese da Primeira Fita SuperScript para o kit RT-PCR, em um volume de reação total de 20 μΐ_. Um micrograma de RNA foi primeiramente desnaturado a 65°C, por 5 minutos, com 0,5mM de cada um de dNTPs, 0,5 μ9 de oligo (dT)i2-is e resfriado em gelo por pelo menos 1 minuto. A mistura foi incubada a 42°C, por 2 minutos, e uma segunda pré-mistura contendo 1X de Tampão de Primeira Fita, DTT 10mM, e 40 unidades de SuperSricpt II RT foi adicionada. As reações foram incubadas a 42°C, por 10 minutos, a 50°C, por 1 hora, e desativadas por aquecimento a 70°C, por 15 minutos. PCR em tempo real

As misturas reacionais para PCR foram realizadas com 3 μL de reação de cDNA em um volume total de 20 μΙ_ em presença de 0,4mM de cada iniciador de PCR e 4 μΙ_ de LC FastStart DNA Master SYBR Green 1 PLUS. Etapa 1 (Desnaturação): 95°C, 10 minutos (inclinação 20°C/s); Etapa 2(Ciclos χ 40): 95°C, (inclinação 20°C/s); 57°C ou 59°C, 5 segundos, (incli- nação 20°C/s) 72°C, 10 segundos (inclinação 20°C/s); Etapa 3 (Curva de fusão): 95°C, (inclinação 20°C/s); 70°C, 30 segundos (inclinação 20°C/s); 95°C, 0 segundo, (inclinação 0,1°C/s); Etapa 4 (Resfriar): 40°C, 30 segundos (inclinação 20°C/s). As seqüências de iniciadores de PCR usadas para cada gene estão descritas na Tabela 3. A quantificação de produtos da PCR foi realizada usando o programa ReIQuant(Roche).

Ensaio de Quantiqene

As células foram colhidas e Iisadas por 30 minutos a 53°C em 1X da mistura de Iise do kit Quantigen®. Os Iisados de células foram hibridi- zados durante a noite a 53°C em placas de captura Quantigene® na presen- ça de conjuntos de sondas específicas e a expressão de mRNA foi quantifi- cada linearmente usando sinal de luminescência Luminoskan.

Ensaios Celulares: (ELISAs. EIA)

Células 549

No final do período de transfecção, as células A549 foram incu- badas por 4 horas com IL-Ιβ, MCP-1 humano e GM-CSF humano. Os so- brenadantes foram colhidos e analisados usando ELISA quanto a IL-8, MPC- 1 humana e GM-CSF humano.

PBMSC

Depois da transfecção, PHA (10 μg/mL) foi adicionada às células por 6 horas. Algumas células receberam tratamento com Rolipram (10 μg/mL) ou Forskolin (2μΜ) por 30 minutos antes da colheita das células. Os sobrenadantes foram coletados e congelados até o momento de realizar E- LISA para IL-2 e TNF-α, seguindo as diretrizes do fabricante. A determina- ção dos níveis de cAMP intracelular foi realizada em precipitados de células que foram Iisados e os Iisados foram congelados até o momento de realiza- ção EIA para cAMP, de acordo com os protocolos do fabricante.

Células NHBE: A células NHBE foram estimuladas por 4 horas com citomix (500 U/mL de TNF-α + 10 ng/mL de IL1 -β + 10 ng/mL de IFNy) no final do período de transfecção. A secreção da proteína MCP-1 foi medida no sobrenadante por ELISA, com normalização para a viabilidade celular conforme medida por ensaio AIamarBlue.

Exemplo 1: Composição do Anti-sentido e Potência in vitro

A seqüência e a composição dos oligonucleotídeos anti-sentido preparadas neste estudo estão mostradas nas Tabelas 1a, 1b, 1c e 1 d. To- dos os oligonucleotídeos foram purificados por HPLC de troca iônica ou ele- troforese em gel e dessalinizados via cromatografia de exclusão de tamanho usando contas de Sephadex G-25. As potências de algumas seqüências selecionadas e listadas na Tabelas 1a-1d estão demonstradas nas figuras 1a e 1b, que mostram a redução de expressão do gene das isoformas de PDE específicas em células seguinte à transfecção com o AON indicado. A figura 1A mostra que linhagens de células, células A549 para PDE3A, PDE3B e PDE7A ou célula 293 para PDE4A, PDE4B e PDE4D tinham níveis decrescidos de isoformas alvo seguinte à transfecção durante a noite com o AON específico. O nível de expressão de mRNA de PDE foi quantificado usando o ensaio Quantigene® (Panomics) para PDE3A/B, PDE4D e PDE7A e PCR em tempo real foi usado para quantificar a expressão de PDE4A/4B.

Os níveis de isoforma de PDE foram normalizados para a expressão de um gene de controle (β2Μ, Ppib ou HPRT) e estes níveis foram comparados aos níveis de expressão das células não tratadas.

Embora a maioria dos oligonucleotídeos anti-sentido desenha- dos tenha sido específico para isoformas de PDE1 alguns AON, em particular as isoformas para PDE4, demonstraram especificidade dual para nocaute alvo de mais que uma isoforma de PDE4. As seqüências listadas na Tabela 1c descrevem os AON que demonstraram ter mais que um nocaute de gene alvo com o AON simples. A figura 1 demonstra a eficácia desses AON que foram desenhados para especificidade dual alvo. O AON TOP 1545 (SEQ ID NQ:14) e TOP 1556 (SEQ ID N-:24) reconhecem, cada um, seqüências de gene compartilhadas entre â isoforma de PDE4B e a isoforma de PDE4D (Tabela 1c), e demonstram nocaute de gene alvo para PDE4B e PDE4D, enquanto os AON TOP 1507 (SEQ ID NQ:10) e 1508 (SEQ ID Ne:11) são efi- cazes na redução dos níveis de mRNA de PDE4A e PDE4D em células transfectadas e ambas as seqüências de AON compartilhadas entre as iso- formas de PDE4A e PDE4D (Tabela 1c). Os dados são expressos como % de inibição específica determinada por comparação dos níveis de inibição obtidos com as seqüências de pareamento errôneo ou de AON de sentido com a % de inibição obtida com suas respectivas seqüências de AON espe- cíficas de PDE.

Exemplo 2 Efeito da distribuição de AON nas funções biológicas das células

Este exemplo refere-se à eficácia do AON na função biológica de tipos de células diferentes, especificamente da secreção de citocinas e quimiocinas. As citocinas e quimiocinas são mediadores importantes da ati- vação e recrutamento celular. Células epiteliais pulmonares podem desem- penhar um papel na patofisiologia das doenças respiratórias inflamatórias através da secreção das quimiocinas que levam ao recrutamento de células imunes, tais como neutrófilos e monócitos/macrófagos. Os níveis de inter- leucina-8 (IL-8/CXCL8) e proteína-1 quimioatrativa de monócito (MCP- 1/CCL2) são aumentados em pacientes com COPD (Szilasi M et al. Patho- Iogy Oncology Research. 2006 12:52-60). Os níveis de IL-8 e MCP-1 podem estar envolvidos no recrutamento de neutrófilos e macrófagos, respectiva- mente. Ambas a IL-8 e a MCP-1 são secretadas pela linhagem de células epiteliais pulmonares. A549 em resposta ao estímulo com IL-1 β. As células A549 estimuladas também secretam fator estimulador de granulócitos- macrófagos (GM-CSF), uma citocina conhecida por ativar neutrófilos e ma- crófagos para a função intensificada. A figura 2 demonstra a eficácia do AON TOP 1497 (SEQ ID N-:90), que é específico para isoforma de PDE4D, para limitar a secreção de quimiocinas IL-8/CXCL-8 e MCP-1/CCL2 e a citocina GM-CSF nas células A549 seguinte à transfecção de AON, durante a noite, são então estimuladas com IL-1 β por 4 horas. O uso deste ensaio segue a verificação de isofórmas de PDE envolvidas na liberação dos mediadores inflamatórios pelas células epiteliais pulmonares. Na figura 2, a contribuição da PDE4D, através de sua inibição por TOP 1497 (SEQ ID N9:90), nas célu- las A549 está claramente demonstrada ao passo que não há contribuição da PDE5A nestas células para a liberação das quimiocinas e das citocinas em- bora a transfecção com AON TOP 1716 (SEQ ID Ng:92) tenha sido bem su- cedida na redução dos níveis de mRNA deste gene. A figura 2 demonstra alterações funcionais, especificamente a redução do potencial inflamatório através do decréscimo da secreção dos mediadores inflamatório que pode ocorrer nas células epiteliais pulmonares seguinte à transfecção com AON.

A figura 3 demonstra a eficácia do AON para limitar a função biológica de tipos de células diferentes, especificamente as células mononu- cleares sangüíneas periféricas humanas (PBMCs). PBMCs referem-se a uma população mista de células imunes que secretam citocinas, especifica- mente TNF-α que é conhecida por ativar macrófagos e IL-2, que é conheci- da por ativar e estimular células T e células NK. As PBMCs humanas trans- fectadas, durante a noite, com AON alvejando as isoformas de PDE, e então estimuladas no dia seguinte com fitoemaglutina (PHA) secretaram menos TNF-α e IL que as PBMCs transfectadas com seqüências de AON de pare- amento errôneo ou de sentido (Figura 3). A transfecção das PBMCs com o AON descrito levou a uma redução do potencial inflamatório destes tipos de células. Na COPD, a liberação dos mediadores pró-inflamatórios e quimoa- trativos por células inflamatórias e células epiteliais ativadas contribui para ainda níveis aumentados de inflamação (Szilasi M et al. Pathology Oncology Research. 2006 12:52-60).

Espera-se que a inibição da expressão de gene de PDE levaria à atividade de PDE reduzida, que, por sua vez, resultaria em uma constru- ção de células dentro de cAMP. A figura 3 demonstra que a transfecção com AON alvejando isoformas de PDE específicas levaram a níveis aumentados de cAMP intracelular nas PBMCs (eixo a direita). Os dados representam as alterações dos níveis tanto da citocina como da cAMP nas PBMCs seguinte à transfecção com AON específico para PDE em comparação com o níveis depois da transfecção com seqüências de pareamento errôneo ou de senti- do.

As citocinas desempenham um papel crítico na orquestração da inflamação crônica em todas as doenças, incluindo asma e COPD. TNF-α é uma das mais importantes citocinas pró-inflamatórias que é expressa em várias doenças inflamatórias. Níveis de TNF-α são acentuadamente aumen- tados no esputo induzido dos pacientes com COPD (Keatings et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996; 153; 530-534). Além disso, há evidência de que os pacientes com COPD com perda de peso mostram liberação aumen- tada de TNF-α a partir das células circulantes e que TNF-α pode induzir a- poptose das células da musculatura esquelética, resultando em fadiga mus- cular e caquexia que são características encontradas em alguns pacientes com COPD grave (De Godoy et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996, 153, 633-637). TNF-α induz a expressão de gene de várias citocinas pró- inflamatórias incluindo ele mesmo e a IL-8. As citocinas, especificamente TNF-α, estão incluídas nos mediadores que mostraram terem aumentado e/ou desempenhado um papel na patofisiologia das doenças respiratórias inflamatórias e estarem envolvidos na destruição de tecido.

Inibidores de PDE4 provocaram uma redução da liberação das citocinas e quimiocinas das células inflamatórias via um aumento da AMP cíclica intracelular (Torphy, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 157, 351- 370). Em contraste com os corticosteróides, os inibidores de PDE4 têm um potente efeito inibidor sobre neutrófilos (Au et al., Br. J. Pharmacoi. 1998, 123, 1260-1266) indicando que eles podem ser úteis nos tratamentos antiin- flamatórios para COPD. Há evidência preliminar de que um inibidor de PDE4 Cilomilast melhora a função do pulmão e os sintomas dos pacientes com COPD e isto pode ser devido à inibição da citocina (Compton et al., Lancet. 2001, 358, 265-270).

Como o TNF-α é considerado como um denominador comum nas doenças inflamatórias e respiratórias crônicas, esta invenção proporcio- na uma ampla aplicação terapêutica para tratar várias doenças inflamatórias.

Exemplo 3 AON modificado com a química de 2'-F-ANA de- monstra eficácia aumentada e ação prolongada para o nocaute de gene alvo Este exemplo refere-se à eficácia de AON específico para PDE quando as modificações com FANA são feitas na química do AON. As Tabe- las 2a-2g descrevem a composição de AON modificada com resíduos de F- ANA. Na figura 4, as células A549 foram transfectadas por 24 horas com AON TOP 1497 (SEQ ID NQ:90) específico para PDE4D tanto na composi- ção de fosfotiorato (PS-DNA) ou contendo modificações ou contendo modifi- cações da base FANA (PS-FANA; TOP 1497-F1 (SEQ ID N9:72), TOP-1497- F5 (SEQ ID NQ:76), TOP 1497-F6 (SEQ ID N5:77) como indicado na legenda da figura 4. O nocaute de mRNA de PDE4D foi determinado usando o en- saio Quantigene® (Panomics) com níveis de PDE normalizados para a ex- pressão de gene β2Μ. A modificação da seqüência de TOP 1497 com mo- nômeros FANA, (TOP 1497-F1 (SEQ ID NQ:72)) intensificou a eficácia do AON em inibir a expressão do gene alvo em doses entre 100-400 ng, mos- trando, claramente, uma vantagem desta modificação quanto à atividade de AON (Figura 4a). Espera-se que as modificações de 2'-F-ANA intensifiquem a estabilidade do AON1 tornando-o mas resistente à digestão por nucleosi- dase, que prolongaria sua atividade. Na figura 4b, a comparação das formu- lações diferentes de AON, específico para PDE4D, AON TOP 1497 em uma dose simples, com o tempo mostra claramente que o AON contendo 2'-F- ANA sustentou a atividade inibidora até 48 hp em comparação com PS-DINA AON. Nas 48 horas pós-transfecção, nenhuma inibição é observada com a formulação de PS-DNA de AON, contudo, mesmo modificando somente 5 das 19 bases AON TOP 1497-F6 (SEQ ID NQ:77) com 2'-F-ANA, foi suficien- te para sustentar um efeito inibidor para este período de tempo. A inibição sustentada foi aumentada por incorporação de mais resíduos de 2'-F-ANA na seqüência original como mostrada seguinte à transfecção com TOP 1497-F5 (SEQ ID Ns:76) e TOP 1497-F1 (SEQ ID N9:72). A maior quantida- de da composição de 2'-F-ANA em AON produziu o efeito mais prolongado, embora por transfecção durante a noite (24 h), PS-FANA contendo 7 resí- duos produziu um nível similar de inibição que PS-FANA contendo 11 resí- duos.

Exemplo 4 AÕN modificado com química de 2'F-ANA retém a função biológica das células

Este exemplo refere-se à tolerância de modificação da química com 2-F-ANA do AON específico para PDE na redução das respostas infla- matórias das células. Na figura 2, foi demonstrada a eficácia do AON especí- fico para PDE em reduzir a secreção de quimiocina por células epiteliais pulmonares. Na figura 5, o efeito de AON contendo 2'-F-ANA na função bio- lógica de A5D9 foi estudado. As células A549 transfectadas com AON TOP (SEQ ID NQ: 14) específico para PDE4B/4D dual como PS-DNA ou com TOP 1545-F3 (SEQ ID NQ:85) modificado com 2'-F-ANA demonstram níveis maio- res de inibição de secreção de quimiocina quando AON contendo 2'-F-ANA foram transfectados nas células A549 em comparação com AON não modifi- cado.

Essa retenção da eficácia biológica de AON contendo 2'-F-ANA foi demonstrada em células primárias, especificamente PBMCs humanas. Combinação de AON TOP 1545-F3 (SEQ ID N9:53) específico para PDE7A com AON TOP 1731-F2 (SEQ ID Ng:53) específico para PDE7A aumentou a inibição de seus respectivos alvos de gene quando o segundo anti-sentido estava presente, embora a seqüência de anti-sentido não apresentasse ho- mologia com o outro gene alvo (Figura 6a). Na figura 6a as barras sólidas representam a % de inibição específica do mRNA do gene alvo ou de PDE4B, PDE4D ou PDE7A, quando ambos AON são usados em combina- ção com cada um em uma dose baixa (3,2nM) em comparação com o AON usado sozinho, em doses baixas e altas (6,3nM), demonstrando que AON contendo 2-F-ANA retém a função de nocaute de gene alvo nas células imu- ne primárias. Quanto à função biológica, a transfecção de PBMCs com com- binação de TOP 1545-F3 (SEQ ID NQ:85) específico, dual, para PDE4B/4D com AON TOP 1731-F2 (SEQ ID NQ:53) específico para PDE7A acarretou a inibição da secreção de ambos os TNF-α e a IL-2. AON contendo 2'-F-ANA retém sua funcionalidade para reduzir o potencial inflamatório das células imunes.

Os resultados na figura 6a mostram também o efeito intensifica- do que ocorre quando as combinações de AON específico para dois genes alvo diferentes são administradas às células ao mesmo tempo. Embora os AON tenham sido administrados em uma concentração que teve pouco a nenhum efeito sobre seus genes alvo quando empregados sozinhos, quando combinados, os AON induziram uma inibição significante da expressão de gene de seus respectivos alvos (PDE4B e PDE4D para TOP 154-F3 (SEQ ID N9:85), e PDE7A para TOP 1731-F2 (SEQ ID Ne:53)).

Exemplo 5: Efeito do PDE4B/4D AON nos Genes Reguladores

Mitogênicos

A Tabela 1c descreve a seqüência de AON TOP 1545 que tem especificidade dual também tanto para PDE4B quanto para PDE4D. A se- qüência do AON TOP 1549 (SEQ ID NQ:17) tem 100% de homologia com a seqüência de gene da timidilato sintase (TYMS) e 5 pareamentos errôneos de pares de base com PDE4B e PDE4D. O AON TOP 1549 (SEQ ID Ne:17) inibe sua expressão de gene alvo (TYMS) em um modo de resposta de dose (200, 400 e 800 ng) depois de 6 horas de transfecção. Apesar de ter 5 pare- amentos errôneos de pares de base com a seqüência de gene de TYMS, o AON TOP 1545 (SEQ ID Ne: 14) contendo 2'-F-ANA é também eficaz na ini- bição da expressão de gene de TYMS nas céiuias 293 depois de 6 horas de transfecção. TYMS é uma enzima Iimitativa de taxa chave da síntese de DNA e é supra-regulada em alguns cânceres. O AON TOP 1545 (SEQ ID Ng: 14) tem o potencial não somente de inibir a função do PDE através do decréscimo dos níveis de mRNA de PDE4B e PDE4D, mas podem funcionar para inibir a proliferação de células através de seus efeitos sobre a expres- são de gene de TYMS. Essa figura demonstra que TOP 1545 (SEQ ID NQ: 14) é uma nova molécula de anti-sentido que tem especificidade dual pa- ra fosfodiesterase 4 (PDE4) e timidilato sintase (TS).

Os inibidores de PDE4 estão também descritos na literatura co- mo agentes elevadores de cAMP. A inibição de PDE4 bloqueia a ruptura de cAMP em AMP, resultando no acúmulo de cAMP. É bem sabido que altos níveis intracelulares de cAMP podem matar de modo eficaz as células can- cerosas in vitro.

Timidilato sintase (TYMS) é a fonte de monofosfato de timidina para a maior parte dos organismos, que é necessária para síntese de DNA e divisão celular, e é, portanto, um alvo anticâncer óbvio. TYMS não está es- truturalmente relacionada às PDEs1 exceto por uma pequena extensão de 17 nucleotídeos consecutivos em sua região de codificação. TOP 1545 (SEQ ID N9:14) alveja esta região de homologia entre TYMS e PDE4B e PDE4D, fa- zendo com que o TOP 1545 (SEQ ID N9:14) seja um composto anticâncer único.

Exemplo 6: Potência do AON in vitro

Este exemplo mostra a redução da expressão de gene nas célu- las de macaco CYNOM-K1 transfectadas com o AON TOP1572-F2 (SEQ ID N9:122; figura 8A) específico para PDE4D/4B ou 8a) ou AON TOP1731-F3 (SEQ ID NQ:54, figura 8B) específico para PDE7A. Níveis de mRNA de PDE4D e PDE4B foram respectivamente reduzidos em 53% e 66% (Figura 8A) e a expressão de gene de PDE7A foi reduzida em 70% (Figura 8B) em comparação com as células não transfectadas.

Exemplo 7: Efeito da distribuição de AON sob as funções bioló- gicas das células

Este exemplo relata a eficácia do AON TOP1572-F2 (SEu iD N9:122) específico para PDE4D/4D e TOP1545 (SEQ ID N9:14) na redução do nível de expressão de mRNA de PDE4D (Figura 9 A) e a secreção de citocina MCP-1 estimulada nas células NHBE em resposta a uma estimula- ção de 4 horas com citomix (500 U/mL de TNF-α + 10 ng/mL ΙΙ_1-β + 10 ng/mL de IFNy) (Figura 9 B). TOP1572-F2 (SEQ ID N9:122) reduz o nível de expressão de mRNA de PDE4D em 71% em correlação com 34% de inibi- ção da secreção de MCP-1. Similarmente, TOP1545 (SEQ ID N9:14) reduz os níveis de expressão de mRNA de PDE4D em 36% em correlação com 46% de inibição da secreção de MPC-1 com relação às células transfecta- das com os controles correspondentes.

Exemplo 8: Efeito da distribuição de AON sobre o efeito biológi- co nas células

Este exemplo refere-se à eficácia de AON específico para PDE em inibir a secreção de citocinas pró-inflamatórias por células mononuclea- res sangüíneas periféricas humanas (PBMCs). As PBMCs são uma popula- ção mista de leucócitos incluindo linfócitos T, linfócitos B e monóci- tos/macrófagos, todos os quais podem ser estimulados para liberar citocinas pró-inflamatórias. As PBMCs humanas transfectadas durante a noite com TOP 1572 específico para PDE4B/4D (Figura 10) e então estimuladas no dia seguinte com fitoemaglutina mitogênica (PHA, 10 μg/mL) por 6 horas, secre- taram 51% menos da citocina pró-inflamatória IL-2 (Figura 10 A) e 42% me- nos de TNF-α )Figura 10 B) em comparação com aquelas estimuladas com PHA, mas não transfectadas. Similarmente, as PBMCs transfectadas com o AON TOP 1731 específico para PDE7A (Figura 11) secretaram 48% menos IL-2 e 60% menos TNF-α que aquelas PBMCs que não foram transfectadas, mas estimuladas com PHA.

Exemplo 9: Eficácia aumentada da inibição de imunorrespostas quando TOP 1572 e TOP 1731 são combinados

Este exemplo refere-se ao efeito na redução da secreção de IL-2 por PBMCs estimuladas com PHA quando os AON são combinados. As PBMCs transfectadas com 3,1 nM de cada um de TOP 1572-F2 (SEQ ID Ns:122) e TOP 1731-F3 (SEQ iD N5:54) resultaram em um nívei de inibição de IL-2 (33%), que foi maior que os níveis de inibição observados seguinte à transfecção com cada AON sozinho em ambas as doses de 3,1 nM e 6,3nM (Figura 12). Neste exemplo, uma dose baixa de TOP 1572-F2 rendeu menos que 10% de inibição de IL-2, ao passo que uma dose maior (6,3nM) rendeu 24% de inibição de IL-12 (Figura 12). Com respeito ao TOP 1731-F3, uma dose baixa (3,1nM) produziu 20% de inibição de IL-2 e este nível não foi es- tatisticamente aumentado quando a dose foi aumentada para 6,3nM (22% inibição) (Figura 12). A combinação de TOP 1572-F2 com TOP 1731-F3 pa- ra resultar em 33% de inibição de secreção de IL-2 pode ter sido devida ao alvejamento das diferentes isoformas de PDE4B, PDE4D e PDE7A, simulta- neamente (Figura 12).

Exemplo 10: Comparação das químicas de PS-DNA e PS-FANA nas linhagens das células.

Este exemplo compara a eficácia de PS-DNA AON à eficácia de PS-FANA AON na redução da expressão de mRNA alvo. A versão de T0P1572-F2 (SEQ ID Ng: 122) apresenta uma duração de ação mais longa que PS-DNA padrão versão TOP1572 (SEQ ID N9:40) na redução da ex- pressão de mRNA de ambas as PDE4D (Figura 13A) e PDE4B (Figura 13B).

Depois de 72 horas de transfecção nas células 293, o TOP1572-F3 ainda reduz 72% de expressão de mRNA de PDE4B e 55% de mRNA de PDE4D ao passo que a eficácia do TOP 1572 é reduzida em 18% para mRNA de PDE4B e 55% de mRNA de PDE4D Aumento da atividade de FANA AON é também observada em doses mais baixas. A versão TOP1731-F3 (SEQ ID NQ:54) é melhor que a versão PS-DNA TOP1731 (SEQ ID Ng:2) no bloqueio da expressão de mRNA de PDE7A em células A549 transfectadas por 48 horas em doses de 125nM e 75nM (Figura 14).

Embora as modalidades preferidas da invenção tenham sido descritas aqui, será entendido por aqueles versados na técnica que varia- ções podem ser feitas nestas sem se desviar do espírito da invenção ou do escopo das reivindicações apensas. Todos os documentos citados são aqui incorporados a título de referência.

Tabela 1 a.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Tabela 1b.

<table>table see original document page 56</column></row><table> Tabela 1c.

<table>table see original document page 57</column></row><table> Tabela 1d

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Tabela 2a

<table>table see original document page 58</column></row><table> Tabela 2c.

<table>table see original document page 59</column></row><table> Tabela 2g.

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Tabela 3.

<table>table see original document page 60</column></row><table> <table>table see original document page 61</column></row><table> Listagem de Seqüências

<110> Topigen Pharmaceuticals Inc.

<120> Oligonucleotídeos que Afetam a Expressão de Fosfodiesterases

<170> PatentIn versão 3.4

<213> Humano

<221> Miscelâneas

<223> Inosina

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, e 17 são

2'-desóxi-2'-fluorabinonucleotideos

<223> Todos os nueleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioa- to

<223> Ligante de butanodiol

SEQUENCE LISTING

<110> Topigen Pharmaeeuticals Inc.

<120> Oligonucleotídeos que Afetam a Expressão de Fosfodiesterases

<130> 13424-15PCT

<150> US 60/801,384

<151> 2006-05-19

<160> 126

<170> PatentIn versão 3.4

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<400> 1

tcatgagtgg eagctgcaa 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<400> 2

tcatgagtgg cagctgcaat t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Humano

<400> 3

catgagtggc agctgcaatt aa 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<400> 4

gagtggcagc tgcaattaag c

21 <210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<400> 5

atgagtggca gctgcaatta a

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<400> 6

agatcatgag tggcagctgc a

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<400> 7

gagtggcagc tgcaattaa

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<400> 8

gatcatgagt ggcagctgca a

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<400> 9

cctcagcacc agccatgtcg

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gtgcttgtca cacatgg

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

gtcctccaaa gtgtcc

<210> <211> <212>

12 15 DNA <213>

Homo sapiens

<400> 12

ggtctctagc tggtc

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

atggtaatgg tcttc

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

tctgcccatg tctccca

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

aagaccccat ttgttca

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

tctgcccagg tctccca

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

gaggcccatg tctcccg

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

tctgcccatg tctcccaga

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19 tctgcccatg tctcccaca

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

tctgcccatg tctcccagag

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

tctgcccatg tctcccacaa

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

ggttgctcag gtctgcacag t

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

ggttgctcag atctgcacag t

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (11)..(11)

<223> Inosina

<400> 24

ggttgctcag ntctgcacag t

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

tcagcatggt aatggtctt

<210> <211> <212>

26 19 DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (6) .. (6)

<223> Inosina

<400> 26 gccacntcag catggtaat

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (9) . . (9)

<223> Inosina

<400> 27 tacatcaang caagttc

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Inosina

<400> 28 atgtcacagt nttcttc

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (8)..(8)

<223> Inosina

<400> 29 tgtcaatnac cattttcct

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220> . __ .

<221> Região de interesse biológico

<222> (6)..(6) <223> Inosina <220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (12)..(12)

<223> Inosina

<400> 30 gtttcnacca tngtcttca

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (14)..(14)

<223> Inosina

<400> 31 ctttcttagt ttcnaccat

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 32 tctgcacagt gcaccat

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (8) . . (8)

<223> Inosina

<400> 33 gtctgtangg tctctagct

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<222> (5)..(5)

<223> Inosina

<400> 34

tgtanggtct ctagctggt

<210> 35 <211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (15) . . (15)

<223> Inosina

<400> 35

ttcttgactc cactnatct

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (13) . . (13)

<223> Inosina

<400> 36

aatcaagtca tcnccgtgt

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (10)..(10)

<223> Inosina

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (16)..(16)

<223> Inosina

<400> 37 gttgtgatan gccacntca

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de

<222> (4).. (4)

<223> Inosina

<220>

<221> Região de

<222> (13)..(13

<223> Inosina

<400> 38

interesse biológico

interesse biológico attntacatc aangcaagt 19

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (6)..(6)

<223> Inosina

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (15)..(15)

<223> Inosina

<400> 39

tgtttngaca tatcngtt 18

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (11)..(11)

<223> Inosina

<400>

40

19

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 3, 4, 5( 6, 13, 14, 15, 16, 17

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 41

tcatgagtgg cagctgc 17

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221>

Região de interesse biológico <223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 6, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 17

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 42

tcatgagtgg cagctgc 17

<210> 43

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 são 2'-

deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 43

tcatgagtgg cagctgc 17

<210> 44

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 5, 6, 13, 14, 15, 16, 17 são

2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 44

tcatgagtgg cagctgc 17

<210> 45

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 13, 14, 15, 16, 17 são 2'- deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforo- tioato.

<400> 45

tcatgagtgg cagctgc 17

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 18

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 46

gcttaggttc ctttaagt 18

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sao 2'-deoxi-2'-fluoroarabinucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 47

cagatcatga gtcccagctg 20

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 14, 15, 16, 17, 18, 19

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 48

tcatgagtgg cagctgcaa 19 <210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 3, 4, 16, 17, 18, 19 são

2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fos- forotioato.

<400> 49

tcatgagtgg cagctgcaa

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 16, 17, 18, 19 são 2'-deóxi-2'- fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 50

tcatgagtgg cagctgcaa 19

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 51

tcatgagtgg cagctgcaa 19

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano <220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 52

tcatgagtgg cagctgcaat t 21

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 18, 19, 20, 21 são 2'-

deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 53

tcatgagtgg cagctgcaat t 21

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 18, 19, 20, 21 são 2'-deóxi-2'-

fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 54

tcatgagtgg cagctgcaat t 21

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos .

<220> <221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforo-

tioato.

<400> 55

tcatgagtgg cagctgcaat t 21

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 56

gagtggcagc tgcaattaag c 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 57

atgagtggca gctgcaatta a 21

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 14, 15, 16, 17, 18, 19

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 58

gagtggcagc tgcaattaa

19 <210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 59 gatcatgagt ggcagctgca a 21

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 17, 18, 19,

20 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 60

cggccaagca gctgagcacc 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17, 18, 19, 20 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 61 cggccaagca gctgagcacc 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano <220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 62

cggccaagca gctgagcacc 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 63

tcagcagcgt ccgcagccag 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 8, 9, 10, 14, 15, 19, 20 são

2'-deóxi-21-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 64

tcagcagcgt ccgcagccag 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 5, 8, 10, 11, 12, 14, 17, 18

são 21-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220> <221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 65

tcagcagcgt ccgcagccag 20

<210> 66

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 16, 17

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 66

gccacgctcg cgctctc 17

<210> 67

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 3, 7, 8, 9, 15, 16, 17 são 2'- deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 67

gccacgctcg cgctctc 17

<210> 68

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14 são 2' deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 68

gccacgctcg cgctctc

17 <210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 69

cttcaggctg gctttcctc 19

<210> 70

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 3, 4, 8, 9, 12, 13, 16, 17 são 2'-

deóxi-21-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 70

cttcaggctg gctttcctc 19

<210> 71

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 são

2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 71

cttcaggctg gctttcctc 19

<210> 72

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano <220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 15, 16, 17, 18, 19

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 72

ctgcctcctc ttcaacctg 19

<210> 73

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 são 2'-

deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 73

ctgcctcctc ttcaacctg 19

<210> 74

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 são 2'-

deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (10)..(10)

<223> Ligante butanodiol

<400> 74

ctgcctcctn ttcaacctg 19

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220> <221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 5, 6, 15, 16, 17, 18, 19 são 2'-

deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 75

ctgcctcctc ttcaacctg

<210> 76

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 15, 16, 17, 18, 19 são 2'-deóxi- 2' -fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 76

ctgcctcctc ttcaacctg

<210> 77

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 15, 16, 17, 18, 19 são 2 ' -deóxi-2 ' -

fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 77

ctgcctcctc ttcaacctg

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17, 18, 19, 20 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220> <221>

Região de interesse biológico <223> Todos οε nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 78

gaccggtagg tctgtatggt

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17, 18,

19, 20 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (16) .. (16)

<223> Ligante butanodiol

<400> 79

gaccggtagg tctgtntggt

<210> 80 <211> 20 <212> DNA

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,

19, 20 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (16)..(16)

<223> Ligante butanodiol

<400> 80

gaccggtagg tctgtntggt

<210> 81

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220> <221> <223>

Região de interesse biológico

Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, 14, 15, 16, 17 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 81

gtccactggc ggtacag 17

<210> 82

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 14, 15, 16, 17, 18,

19 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<400> 82

ccatgatgcg gtctgtcca 19

<210> 83

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 83

tctgcccatg tctccca 17

<210> 84

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 13, 14, 15, 16, 17 são 2'-deóxi-

2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato. <400> 84

tctgcccatg tctccca 17

<210> 85

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 14, 15, 16, 17 são 2'-deóxi-2'-

fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 85

tctgcccatg tctccca 17

<210> 86

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 11, 12, 15, 16, 17 são 2'-deóxi-

2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 86

tctgcccatg tctccca 17

<210> 87

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 são 2'-

deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 87

tctgcccatg tctccca 17

<210> 88 <211> 17 <212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 7, 8, 9, 14, 15, 16, 17 são 2'-

deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<400> 88

tctgcccatg tctccca I7

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 89

tcagcagcgt ccgcagccag

<210> 90

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 90

ctgcctcctc ttcaacctg

<210> 91

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 91

ccatgatgcg gtctgtcca

<210> 92

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 92

tcatgagtgg cagctgc

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<400> 93

tcaggccatg cactgttact

<210> <211> <212>

94 21 DNA Humano

<400> 94

cctgattctc tcaataagcc c

<210> 95

<211> 22

<212> DNA

<213> Humano

<400> 95

caacagtgac agcagtgaca tt

<210> 96

<211> 22

<212> DNA

<213> Humano

<400> 96

ttgagtccag gttatccatg ac

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<400> 97

gattctttgg gattgggact

<210> 98

<211> 20

<2I2> DNA

<213> Humano

<400> 98

atctttggcc tacaggaacc

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<400> 99

atcaacacca attcggagct

<210> 100

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<400> 100

ccagcaccat gtcgatgac

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<400>

101 tggcagacct gaagacaatg

<210> 102

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<400> 102

aaattcctcc atgatgcgg <210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<400> 103

cagaatatgg tgcactgtgc

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<400> 104

agtctatgaa gcccacctgt g

<210> 105

<211> 28

<212> DNA

<213> Humano

<400> 105

atcagactga agagctttgt aatgacca

<210> 106

<211> 23

<212> DNA

<213> Humano

<400> 106

tggcttatat ccaacacttc gtg

<210> 107

<211> 26

<212> DNA

<213> Humano

<400> 107

caaggactgg tctttctatc tcttgt

<210> 108

<211> 22

<212> DNA

<213> Humano

<400> 108

gtggagcaac ctgctcagat ac <210> 109

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<400> 109

agagcatcta cggtgagcg 19

<210> 110

<211> 17

<212> DNA

<213> Humano

<400> 110

cttccgcacc acctcca 17

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> Humano

<400> 111

aagaatcatc atgtgcgctt 2 0

<210> 112

<211> 23

<212> DNA

<213> Humano

<400> 112

gtgtgtataa agtcacctgg ctt 23

<210> 113

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 113

ggttgctcag atctgcaca 19

<210> 114

<211> 15

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 114

ttgctcagat ctgca 15

<210> 115

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 10, 11, 18, 19, 20, 21 são

2 ' -deóxi-2_' -f luoroarabinonucleotideos .

<220> <221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 115

tcatgagtgg cagctgcaat t 21

<210> 116

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 5, 6, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos .

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<400> 116 tcatgagtgg cagctgcaat t 21

<210> 117

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Regiao de interesse biologico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21 são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (11)..(11)

<223> Inosina

<400> 117

ggttgctcag ntctgcacag t 21

<210> 118

<211> 21

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio- ato.

<220>

<221> Região de interesse biológico <223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 17, 18, 19, 20, 21 são 2'-deóxi-

2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (11)..(11)

<223> Inosina

<400> 118

ggttgctcag ntctgcacag t

<210> 119

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 15, 16, 17, 18, 19 são 2'-deóxi-

2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (4)..(4)

<223> Inosina

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (13) , , (13)

<223> Inosina

<400> 119

attntacatc aangcaagt

<210> 120

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 7, 8, 9, 15, 16, 17, 18, 19 são

2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos .

<22 0>

<221> Região de interesse biológico

<222> (4) . . (4)

<223> Inosina

<220> <221> <222>

Região de interesse biológico (13)..(13) <223> Inosina

<400> 120

attntacatc aangcaagt

<210> 121

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 14, 15, 16, 17, 18, 19

são 2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (11)..(11)

<223> Inosina

<400> 121

ggttgctcag ntctgcaca

<210> 122

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 15, 16, 17, 18, 19 são 2'-deóxi-

2'-fluoroarabinonucleotídeos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (11)..(11)

<223> Inosina

<400> 122

ggttgctcag ntctgcaca

<210> 123

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotio-

ato. <220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 7, 8, 9, 15, 16, 17, 18, 19 são

2'-deóxi-2'-fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (11)..(11)

<223> Inosina

<400> 123

ggttgctcag ntctgcaca 19

<210> 124

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 16, 17, 18, 19 são 2'-deóxi-2'-

fluoroarabinonucleotideos.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (11)..(11) <223> Inosina

<400> 124

ggttgctcag ntctgcaca 19

<210> 125

<211> 19

<212> DNA

<213> Humano

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotideos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotideos nas posições 1, 2, 16, 17, 18, 19 são 2'-deóxi-2'-

fluoroarabinonucleotideos.

<400> 125

ggttgctcag atctgcaca 19

<210> 126

<211> 15

<212> DNA

<213> Humano <220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Todos os nucleotídeos estão ligados por ligações de fosforotioato.

<220>

<221> Região de interesse biológico

<223> Nucleotídeos nas posições 1, 2, 3, 13, 14, 15 são 2'-deóxi-2'-

fluoroarabinonucleotídeos.

<400> 126

ttgctcagat ctgca

15

Claims

1. Oligonucleotídeo que tem uma seqüência de bases selecio- nada do grupo que consiste em (i) SEQ ID N9s: 1-92 e 113-126 e (ii) SEQ ID №s: 1-92 e 113-126 contendo uma inserção, deleção ou substituição de ba- se.

2. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, tendo uma seqüência de bases selecionadas de SEQ ID Nes: 1-92 e 113-126.

3. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, tendo uma cadeia principal de fosfodiéster.

4. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, tendo uma cadeia principal de fosforotioato.

5. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 4, em que pelo menos um nucleotídeo do oligonucleotídeo é um 2'-desóxi-2'-fluorara- binonucleotídeo.

6. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 5, seleciona- do do grupo que consiste nas SEQ ID N-s: 41-88 e 115-126.

7. Composição farmacêutica que compreende pelo menos um oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Composição farmacêutica que compreende pelo menos dois oligonucleotídeos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, em que um primeiro oligonucleotídeo dos pelos menos dois oligonucleotí- deos é direcionado contra PDE7A.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, em que um segundo oligonucleotídeo dos pelo menos dois oligonucleotídeos é direcionado contra PDE4B e PDE4D.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID N9s: 41-88 e 115-126.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID Ng: 2 e SEQ ID NQ: 14.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 2 e SEQ ID Ns: 24.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 2 e SEQ ID Ne: 37.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 2 e SEQ ID Ne: 40.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 2 e SEQ ID N9: 85.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 2 e SEQ ID Ns: 122.

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 53 e SEQ ID N9: 14.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 53 e SEQ ID N9: 24.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 53 e SEQ ID N9: 37.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 53 e SEQ ID N9: 40.

22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 53 e SEQ ID N9: 85.

23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N5: 53 e SEQ ID N9: 122.

24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 54 e SEQ ID NQ: 14.

25. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 54 e SEQ ID N9: 24.

26. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 54 e SEQ ID Ns: 37.

27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 54 e SEQ ID N9:40.

28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 54 e SEQ ID N9: 85.

29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que os pelo menos dois oligonucleotídeos são SEQ ID N9: 54 e SEQ ID N9: 122.

30. Método para tratar um paciente tendo uma doença associa- da ao cAMP reduzido, que compreende administrar uma composição farma- cêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 29.

31. Método para tratar inflamação respiratória em um paciente, que compreende administrar uma composição farmacêutica conforme defini- da em qualquer uma das reivindicações 7 a 29.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que a infla- mação respiratória é causada por qualquer uma de doença pulmonar obstru- tiva crônica, asma, tosse eosinofílica, bronquite, rejeição aguda e crônica de aloenxerto pulmonar, sarcoidose, fibrose pulmonar, rinite, sinusite, infecção viral ou uma doença neoplásica.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a doença é a doença pulmonar crônica obstrutiva.

34. Uso de uma composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 29, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença associada ao cAMP reduzido.

35. Uso de uma composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 29, na preparação de um medicamento para o tratamento de inflamação respiratória.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, em que a inflamação respiratória é causada por qualquer uma de doença pulmonar obstrutiva crô- nica, asma, tosse eosinofílica, bronquite, rejeição aguda e crônica de aloen- xerto pulmonar, sarcoidose, fibrose pulmonar, rinite, sinusite, infecção viral ou uma doença neoplásica.

37. Uso de acordo com a reivindicação 36, em que a doença é doença pulmonar crônica obstrutiva.

38. Uso de uma composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 29, no tratamento de uma doença as- sociada ao cAMP reduzido.

39. Uso de uma composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 29, no tratamento de inflamação respi- ratória.

40. Uso de acordo com a reivindicação 39, em que a inflamação respiratória é causada por qualquer uma de doença pulmonar obstrutiva crô- nica, asma, tosse eosinofílica, bronquite, rejeição aguda e crônica de aloen- xerto pulmonar, sarcoidose, fibrose pulmonar, rinite, sinusite, infecção viral ou uma doença neoplásica.

41. Uso de acordo com a reivindicação 40, em que a doença é doença pulmonar crônica obstrutiva.

42. Composição farmacêutica que compreende dois oligonucleo- tídeos tendo SEQ ID NQ: 54 e SEQ ID N9: 122 juntos com um veículo farma- ceuticamente aceitável.

43. Oligonucleotídeos que é pelo menos 80% complementar a um mRNA de pelo menos um de PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE7A1, PDE7A2, PDE7A3 e PDE7B, em que pelo menos um nu- cleotídeo do oligonucleotídeo é um 2'-desóxi-2'-fluorarabinonucleotídeo.

44. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 43, que é pelo menos 85% complementar ao mRNA.

45. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 43, que é pelo menos 90% complementar ao mRNA.

46. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 43, que é pelo menos 95% complementar ao mRNA.

47. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 43, que é pelo menos 100% complementar ao mRNA.

48. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 43, que tem uma seqüência de bases selecionada do grupo que consiste em (i) SEQ ID Nes: 1-92 e 113-126 e (ii) SEQ ID N9s: 1-92 e 113-126 contendo uma inser- ção, deleção ou substituição de base.

49. Composição farmacêutica que compreende pelo menos um oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 43 a 48, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

50. Composição farmacêutica que compreende pelo menos dois oligonucleotídeos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 43 a 48, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

51. Método para tratar um paciente tendo uma doença associa- da ao cAMP reduzido, que compreende administrar uma composição farma- cêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 49 e 50.

52. Método para tratar um paciente tendo inflamação respirató- ria, que compreende administrar uma composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 49 e 50.

53. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 49 e 50, na preparação de um medicamen- to para o tratamento de uma doença associada ao cAMP reduzido.

54. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 49 e 50, na preparação de um medicamen- to para o tratamento de inflamação respiratória.

55. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 49 e 50, no tratamento de uma doença as- sociada ao cAMP reduzido.

56. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 49 e 50, no tratamento de inflamação respi- ratória.