ES2895099T3 - Compuestos y métodos para la modulación de la expresión de la proteína quinasa miotónica de distrofia (DMPK) - Google Patents
Compuestos y métodos para la modulación de la expresión de la proteína quinasa miotónica de distrofia (DMPK) Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10-30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende una porción de al menos 8 nucleobases contiguas 100% complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 1343-1368 de SEQ ID NO: 1 y/o nucleobases 8603-8619 de SEQ ID NO: 2, donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 90% complementaria a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 medido en la totalidad del oligonucleótido modificado y en donde el compuesto es capaz de inhibir la expresión de DMPK.
Description
DESCRIPCIÓN
Compuestos y métodos para la modulación de la expresión de la proteína quinasa miotónica de distrofia (DMPK)
Campo
[0001] En el presente documento se describen métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión de DMPK ARNm y proteína en un animal. Además, en el presente documento se describen métodos, compuestos y composiciones que comprenden un inhibidor de DMPK para reducir preferentemente el CUGexp DMPK ARN, reducir la miotonía o reducir la spliceopatía en un animal. Dichos métodos, compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, prevenir o mejorar la distrofia miotónica de tipo 1 (DM1) en un animal.
Antecedentes
[0002] La distrofia miotónica de tipo 1 (DM1) es la forma más común de distrofia muscular en adultos con una frecuencia estimada de 1 en 7500 (Harper PS., Myotonic Dystrophy. Londres: W.B. Saunders Company, 2001). DM1 es un trastorno autosómico dominante causado por la expansión de una repetición CTG no codificante en DMPK1. DMPK1 es un gen que codifica una serina/treonina quinasa citosólica (Brook JD, et al., Cell., 1992, 68 (4): 799-808). Las funciones fisiológicas y los sustratos de esta quinasa no se han determinado completamente. La repetición CTG expandida se encuentra en la región no traducida 3' (UTR) de DMPK1. Esta mutación conduce a la dominancia del ARN, un proceso en el que la expresión de ARN que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp) induce disfunción celular (Osborne RJ y Thornton CA., Human Molecular Genetics., 2006, 15 (2): R162-R169).
[0003] El gen de DMPK normalmente tiene 5-37 repeticiones CTG en la región no traducida 3'. En la distrofia miotónica de tipo I, este número se expande significativamente y está, por ejemplo, en el intervalo de 50 a más de 3500 (Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, Londres, ed. 3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol. 20: 572, 2007).
[0004] El tracto de CUGexp interactúa con proteínas de unión de ARN incluyendo proteína de tipo músculo ciego (MBNL), un factor de empalme, y hace que la transcripción mutante se conserve en los focos nucleares. La toxicidad de este ARN proviene del secuestro de proteínas de unión al ARN y la activación de las vías de señalización. Los estudios en modelos animales han demostrado que los fenotipos de DM1 pueden revertirse si se reduce la toxicidad del ARN CUGexp (Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325 (5938): 336-339; Mulders SA, et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU.., 2009, 106 (33): 13915 13920).
[0005] En DM1, el músculo esquelético es el tejido más gravemente afectado, pero la enfermedad también tiene efectos importantes sobre músculo liso y cardíaco, la lente ocular, y el cerebro. Los músculos craneales, distales de las extremidades y del diafragma se ven afectados preferentemente. La destreza manual se ve comprometida temprano, lo que causa varias décadas de discapacidad grave. La edad mediana al morir es de 55 años, generalmente por insuficiencia respiratoria (de Die-Smulders CE, et al., Brain., 1998, 121 (Pt 8): 1557-1563).
[0006] La tecnología antisentido está emergiendo como un medio eficaz para modular la expresión de ciertos productos génicos y por lo tanto puede resultar ser únicamente útil en un número de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación para la modulación de DMPK1. Se demostró que la inyección intramuscular de oligonucleótidos totalmente modificados dirigidos a la repetición CAG en ratones bloquea la formación de complejos CUGexp-MBNLl, dispersa focos nucleares de transcripciones CUGexp, mejora el transporte nucleocitoplasmático y la traducción de las transcripciones CUGexp, libera proteínas MBNL al nucleoplasma, normaliza empalme alternativo de exones dependientes de MBNL y elimina la miotonía en ratones transgénicos que expresan CUGexp (Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325(5938):336-339; WO2008/036406).
[0007] En la actualidad no existe un tratamiento que pueda modificar el curso de DM1. La carga de morbilidad, por tanto, es significativa. Por lo tanto, un objeto en el presente documento es proporcionar compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento de DM1
Resumen
[0008] La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10-30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende una porción de al menos 8 nucleobases contiguas 100% complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 1343-1368 de SEQ ID NO: 1 y/o nucleobases 8603-8619 de SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 90% complementaria a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 medida en la totalidad del oligonucleótido modificado y en donde el compuesto es capaz de inhibir la expresión de DMPK.
[0009] La invención también proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10-30 enlaces nucleósidos en el que el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende una porción de al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 30, 25, 26, 123, 124, 125, 126, 127,
128, 378, 379, 380, 381,382, 383 y 384, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 90% complementaria a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 medida en la totalidad del oligonucleótido modificado y en donde el compuesto es capaz de inhibir la expresión de DMPK.
[0010] La invención también proporciona un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobase como se establece en SEQ ID NO: 30, en donde el oligonucleótido modificado se compone de 16 nucleósidos enlazados y comprende:
a. un segmento de hueco que consta de ocho desoxinucleósidos enlazados;
b. un segmento de ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 5' E-E-K-K; c. un segmento de ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 3' K-K-E-E; d. en el que el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3';
e. donde cada E representa azúcar 2'-O-metoxietilo y cada K representa un azúcar cEt;
f. en el que cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato; y
g. en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
[0011] La invención también proporciona una composición que comprende el compuesto de la invención o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0012] La invención también proporciona un compuesto de la invención o una composición de la invención para uso en un método de tratamiento de distrofia miotónica de tipo 1 en un animal.
[0013] En el presente documento se describen métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de DMPK y tratar, prevenir, retrasar o mejorar una enfermedad relacionada con DMPK y/o un síntoma de la misma. En ciertos casos, los compuestos y composiciones descritos aquí inhiben DMPK mutante o CUGexp DMPK.
[0014] También se describe en el presente un método de reducción de la expresión de DMPK en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado como se describe aquí más dirigido a DMPK.
[0015] También se describe aquí un método para reducir preferentemente CUGexp DMPK con respecto al DMPK de tipo salvaje, reduciendo miotonía, o reduciendo spliceopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, como además se describe en este documento, dirigido a CUGexp DMPK. En ciertos casos, se cree que las transcripciones de CUGexp DMPK son particularmente sensibles a la desactivación antisentido a través de ribonucleasas nucleares (como la RNasa H), debido a su mayor tiempo de residencia en el núcleo, y se cree que esta sensibilidad permite una inhibición antisentido eficaz de las transcripciones de CUGexp DMPK en tejidos relevantes como el músculo a pesar de las barreras de biodistribución para la captación tisular de oligonucleótidos antisentido. Los mecanismos antisentido que no provocan la escisión a través de ribonucleasas nucleares, como los ASO de repetición CAG descritos en, por ejemplo, Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325 (5938): 336-339 y WO2008/036406, no proporcionan la misma ventaja terapéutica.
[0016] También se describe aquí un método para tratar un animal que tiene distrofia miotónica de tipo 1. En ciertos casos, el método incluye administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado como se describe adicionalmente en el presente documento dirigido a DMPK. En ciertos casos, el método incluye la identificación de un animal con distrofia miotónica de tipo 1.
[0017] También se describe aquí un método para tratar, prevenir, retrasar, o aliviar los síntomas y los resultados asociados con el desarrollo de DM1 incluyendo rigidez muscular, miotonía, la desactivación de debilidad distal, debilidad en la cara y músculos de la mandíbula, dificultad para tragar, caída de los párpados (ptosis), debilidad de los músculos del cuello, debilidad en los músculos de brazos y piernas, dolor muscular persistente, hipersomnia, atrofia muscular, disfagia, insuficiencia respiratoria, latidos cardíacos irregulares, daño del músculo cardíaco, apatía, resistencia a la insulina y cataratas. También se describe en el presente documento un método para tratar, prevenir, retrasar o mejorar los síntomas y resultados asociados con el desarrollo de DM1 en niños, incluidos retrasos en el desarrollo, problemas de aprendizaje, problemas de lenguaje y habla y problemas de desarrollo de la personalidad.
[0018] También se describe aquí un método de administración de un oligonucleótido antisentido para contrarrestar el dominio de ARN por la dirección de la escisión de los transcritos de patógenos.
[0019] En ciertas formas de realización, el DMPK tiene una secuencia como se establece en N° de Acceso GenBank NM_001081560.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 1). En determinadas formas de realización,
la DMPK tiene la secuencia establecida en N° de Acceso GenBank NT_011109,15 truncada de los nucleótidos 18540696 a 18555106 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 2). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia establecida en N° de Acceso GenBank NT_039413.7 truncada de los nucleótidos 16666001 a 16681000 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 3). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank NM_032418.1 (incorporada en este documento como SEQ ID NO: 4). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank AI007148.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 5). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank AI304033.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 6). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank BC024150.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 7). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank BC056615.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 8). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se establece en el N° de Acceso GenBank BC075715.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 9). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank BU519245.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 10). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank CB247909.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 11). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank CX208906.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 12). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank CX732022.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 13). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank S60315.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 14). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank S60316.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 15). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank NM_001081562.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 16). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank NM_001100.3 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 17).
Descripción detallada
[0020] Ha de entenderse que tanto la anterior descripción general como la siguiente descripción detallada son a modo de ejemplo y sólo explicativas y no son restrictivas de la invención, según se reivindica. En este documento, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. En este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye" así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
[0021] Los encabezados de sección usados en este documento son sólo para fines de organización y no deben considerarse como limitativos de la materia objeto descrita.
Definiciones
[0022] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de la química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándar para síntesis química y análisis químico.
[0023] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también de 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo de la posición 2' de un anillo de furanosilo. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleótido de 2'-O-metoxietilo" significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro del ± 7% de un valor. Por ejemplo, si se establece que "el compuesto afectó al menos aproximadamente al 70% de inhibición de DMPK", se implica que los niveles de DMPK se inhiben dentro de un intervalo de 63% y 77%.
"Agente farmacéutico activo" significa la sustancia o las sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, un oligonucleótido antisentido dirigido a DMPK es un agente farmacéutico activo.
"Región diana activa" o "región diana" significa una región a la que se dirige uno o más compuestos antisentido
activos.
"Compuestos antisentido activos" significa compuestos antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína.
"Administrado concomitantemente" se refiere a la coadministración de dos agentes de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. No es necesario que los efectos de ambos agentes se manifiesten al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente a un animal e incluye, pero no se limita a la administración por un profesional médico y la autoadministración.
"Agente" significa una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. "Primer agente" significa un compuesto terapéutico de la invención. Por ejemplo, un primer agente puede ser un oligonucleótido antisentido dirigido a DMPk . "Segundo agente" significa un segundo compuesto terapéutico de la invención (por ejemplo, un segundo oligonucleótido antisentido dirigido a DMPK) y/o un compuesto terapéutico que no es DMPK.
"Mejoría" se refiere a una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. La gravedad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. En determinadas formas de realización, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína diana codificada por dicho ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNsno, miARN y repeticiones de satélite.
"Inhibición antisentido" significa reducción de los niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobase que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosilo modificado por el puente de dos átomos de anillo de carbono no geminales. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en el que la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, formando así un sistema de anillo bicíclico.
"Estructura de capa" o "resto de capa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas.
"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes a un individuo. Los dos o más agentes pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes se puede administrar a través de la misma o diferentes vías de
administración. La coadministración comprende la administración paralela o secuencial.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejarse entre bases nucleicas de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"CUGexp DMPK" significa ARN DMPK mutante que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp). El gen de DMPK de tipo salvaje tiene 5-37 repeticiones CTG en la región no traducida 3'. En un "CUGexp DMPK" (como en un paciente con distrofia miotónica de tipo I) este número se amplía significativamente y está, por ejemplo, en el intervalo de 50 a más de 3500 (Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, Londres, ed.3, 2001); Annu.Rev.Neurosci,29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol,20: 572, 2007).
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero que es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.
"DMPK" significa cualquier ácido nucleico o proteína de la proteína quinasa de distrofia miotónica. DMPK puede ser una DMPK mutante que incluye el ácido nucleico CUGexp DMPK.
"Expresión de DMPK" significa el nivel de ARNm transcrito del gen que codifica DMPK o el nivel de proteína traducida del ARNm. La expresión de DMPK se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica tales como transferencia Northern o Western.
"Ácido nucleico de DMPK" significa cualquier ácido nucleico que codifica DMPK. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, un ácido nucleico de DMPK incluye una secuencia de ADN que codifica DMPK, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica DMPK (que incluye ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm o pre-ARN que codifica DMPk . "ARNm de DMPK" significa un ARNm que codifica una proteína DMPK.
"Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionada en una sola administración o en un período de tiempo específico. En ciertos casos, se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en ciertos casos en los que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertos casos, el agente farmacéutico se administra mediante infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para lograr un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar entre los individuos dependiendo de la salud y el estado físico del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación del estado médico del individuo y otros factores relevantes.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de una secuencia de nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en una segunda secuencia de nucleobase de un segundo ácido nucleico. En determinadas formas de realización, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna se puede denominar "segmento de hueco" y las regiones externas se pueden denominar "segmentos de ala".
"Brecha ensanchada" significa un compuesto quimérico antisentido que tiene un segmento de hueco de 12 o más 2'-desoxirribonucleósidos contiguos colocados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
"Hibridación" significa la hibridación de moléculas de ácido nucleico complementarias. En determinadas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana.
"Identificar un animal con distrofia miotónica de tipo 1" significa identificar un animal que ha sido diagnosticado con una distrofia, trastorno o afección miotónica de tipo 1 o identificar un animal predispuesto a desarrollar una distrofia, trastorno o afección miotónica de tipo 1. Por ejemplo, las personas con antecedentes familiares
pueden estar predispuestas a padecer distrofia, trastorno o afección miotónica de tipo 1. Dicha identificación se puede lograr mediante cualquier método, incluida la evaluación del historial médico de una persona y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes que están enlazados o enlazados entre sí mediante un enlace internucleosídico.
"Falta de coincidencia" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en donde una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o diana.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase que no sea adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, enlace internucleosídico modificado o nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleósido modificado y/o un enlace internucleosídico modificado.
"Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un resto de azúcar natural. Los azúcares modificados incluyen restos de azúcar sustituidos y restos de azúcar sustitutos.
"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
"Miotonía" significa una relajación anormalmente lenta de un músculo después de una contracción voluntaria o estimulación eléctrica.
"Ribonucleasa nuclear" significa una ribonucleasa que se encuentra en el núcleo. Las ribonucleasas nucleares incluyen, entre otras, la ARNasa H, incluida la ARNasa HI y la ARNasa H2, la ARNasa bicatenaria drosha y otras ARNasas bicatenarias.
"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace de fosfodiéster 3' a 5'.
"Resto de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, pequeños ácidos ribonucleicos interferentes (ARNip) y microARN (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender una combinación de estos elementos en una sola molécula.
"Nucleobase" significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
"Secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace o modificación de nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar. En determinadas formas de realización, un nucleósido está unido a un grupo fosfato.
"Mimético de nucleósidos" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar de biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar sin furanosa.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Mimético de nucleótidos" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster).
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas unidas que es capaz de hibridar con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, en donde cada nucleósido y cada enlace internucleosídico pueden estar modificados o no modificados, independientemente uno de otro.
"Administración parenteral significa administración mediante inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
"Péptido" significa una molécula formada uniendo al menos dos aminoácidos mediante enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no le imparten efectos toxicológicos no deseados.
"Enlace fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes por un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En determinadas formas de realización, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En determinadas formas de realización, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Reducir preferentemente CUG exp DMPK ARN" se refiere a una reducción preferencial de las transcripciones de ARN de un alelo CUGexp DMPK en relación con las transcripciones de ARN de un alelo DMPK normal.
"Prevenir" se refiere a retrasar o prevenir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas o condiciones.
"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En determinadas formas de realización, los efectos secundarios incluyen reacciones en el lugar de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar. Por ejemplo, niveles elevados de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.
"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una hebra complementaria.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras exhibe efectos mínimos o nulos sobre ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Spliceopatía" significa un cambio en el empalme alternativo de uno o más ARN que conduce a la expresión
de productos de empalme alterados en un tejido particular.
"Administración subcutánea" significa administración justo debajo de la piel.
"Resto de azúcar sustituido" significa un furanosilo distinto de un azúcar natural de ARN o ADN.
"Azúcar" o "resto de azúcar' significa un resto de azúcar natural o un azúcar modificado.
"Sustituto de azúcar' se superpone con el término ligeramente más amplio "mimético de nucleósido", pero está destinado a indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) únicamente. Un sustituto de azúcar es capaz de reemplazar el resto de azúcar natural de un nucleósido, de modo que las subunidades de nucleósidos son capaces de unirse entre sí y/o unirse a otros nucleósidos para formar un compuesto oligomérico que es capaz de hibridar con un compuesto oligomérico complementario. Tales estructuras incluyen anillos que comprenden un número de átomos diferente al del furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6 o 7 miembros); sustitución del oxígeno de un furanosilo por un átomo que no es oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como un reemplazo del oxígeno. Dichas estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para restos de azúcar sustituidos (por ejemplo, sustitutos de azúcar carbocíclicos bicíclicos de 6 miembros que comprenden opcionalmente sustituyentes adicionales). Los sustitutos de azúcar también incluyen reemplazos de azúcar más complejos (p. ej., los sistemas sin anillo de ácido nucleico peptídico). Los sustitutos del azúcar incluyen, sin limitación, morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
"Dirigir" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcrito de ARN diana" se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser dirigido por compuestos antisentido. En determinadas formas de realización, un ácido nucleico diana comprende una región de un ácido nucleico de DMPK.
"Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3'” se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
"Distrofia miotónica de tipo 1" o "DM1" significa un trastorno autosómico dominante causado por la expansión de una repetición CTG no codificante en DMPK. Esta mutación conduce a la dominancia del ARN, un proceso en el que la expresión del ARN que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp) induce una disfunción celular. El tracto CUGexp interactúa con proteínas de unión de ARN y hace que la transcripción mutante se retenga en focos nucleares. La toxicidad de este ARN proviene del secuestro de proteínas de unión al ARN y la activación de las vías de señalización.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases naturales, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos. En determinadas formas de realización, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonudeósido). Ciertas formas de realización
[0024] En la presente memoria se describen métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de DMPK.
[0025] También se describe aquí un método para reducir la expresión de DMPK en un animal que comprende administrar al animal de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado de orientación DMPK.
[0026] También se describe aquí un método para reducir preferentemente CUGexp DMPK ARN, reduciendo miotonía o reduciendo spliceopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a DMPK, en donde el oligonucleótido modificado preferentemente reduce CUGexp DMPK ARN, reduce miotonía o reduce la spliceopatía en el animal.
[0027] También se describe aquí un método de administración de un oligonucleótido antisentido para contrarrestar el dominio de ARN por la dirección de la escisión de los transcritos de patógenos.
[0028] También se describe aquí un método para reducir spliceopatía de Sercal. En determinadas formas de realización,
los métodos proporcionados en el presente documento dan como resultado la inclusión del exón 22. En ciertos casos, el empalme correctivo ocurre en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[0029] También se describe aquí un método para reducir spliceopatía de m-Titin. En ciertos casos, los métodos proporcionados en este documento dan como resultado la inclusión del exón 5. En ciertos casos, el empalme correctivo ocurre en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[0030] También se describe aquí un método para reducir spliceopatía de Clcnl. En ciertos casos, los métodos proporcionados en este documento dan como resultado la inclusión del exón 7a. En ciertos casos, el empalme correctivo ocurre en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[0031] También se describe aquí un método para reducir spliceopatía de Zasp. En ciertos casos, los métodos proporcionados en este documento dan como resultado la inclusión del exón 11. En ciertos casos, el empalme correctivo se produce en los músculos tibial anterior, gastrocnemio, y cuádriceps.
[0032] También se describe aquí un método para tratar un animal con distrofia miotónica de tipo 1 que comprende: a) la identificación de dicho animal con distrofia miotónica de tipo 1, y b) administrar a dicho animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a DMPK. En ciertos casos, la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto administrado al animal reduce preferentemente el CUGexp DMPK ARN, reduce la miotonía o reduce la spliceopatía en el animal.
[0033] También se describe aquí un método de lograr una reducción preferencial de CUGexp DMPK ARN, incluyendo la administración al sujeto sospechoso de tener distrofia miotónica de tipo 1 o tener un CUGexp DMPK ARN Un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región de no repetición de dichos CUGexp DMPK RNA. El oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une a dicho CUGexp DMPk ARN, logra una reducción preferencial del CUGexp DMPK ARN.
[0034] También se describe aquí un método de lograr una reducción preferencial de CUGexp DMPK ARN, incluyendo la selección de un sujeto que tiene distrofia miotónica de tipo 1 o que tiene un CUGexp DMPK ARN y administrar a dicho sujeto un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región de no repetición de dicho CUGexp DMPK ARN. El oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al CUGexp DMPK ARN, activa una ribonucleasa o ribonucleasa nuclear, logrando así una reducción preferencial del CUGexp DMPK ARN en el núcleo.
[0035] También se describe aquí un método de lograr una reducción preferencial de CUGexp DMPK ARN, incluyendo la selección de un sujeto que tiene distrofia miotónica de tipo 1 o que tiene un mutante o CUGexp DMPK ARN y sistémicamente administrar a dicho sujeto un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región de no repetición de dicho CUGexp DMPK ARN. El oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al mutante o CUGexp DMPK ARN, logra una reducción preferencial del mutante o CUGexp DMPK ARN.
[0036] También se describe aquí un método para reducir la miotonía en un sujeto en necesidad de la misma. El método incluye administrar al sujeto un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región de no repetición de un ARN de DMPK, en donde el oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN de DMPK, activa una ribonucleasa o ribonucleasa nuclear, reduciendo así la miotonía. En ciertos casos, el sujeto tiene o se sospecha que tiene distrofia miotónica de tipo 1 o que tiene un DMPK ARN mutante o un CUGexp DMPK ARN. En ciertos casos, el ARN de DMPK se retiene en el núcleo.
[0037] También se describe aquí un método para reducir spliceopatía en un sujeto en necesidad de la misma. El método incluye administrar al sujeto un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región no repetitiva de un ARN de DMPK, en donde el oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN de DMPK, activa una ribonucleasa o ribonucleasa nuclear, reduciendo así la spliceopatía. En ciertos casos, el sujeto tiene o se sospecha que tiene distrofia miotónica de tipo 1 o que tiene un CUGexp DMPK ARN retenido en el núcleo. En determinadas formas de realización, el ARN de DMPK se retiene en el núcleo. En ciertos casos, la spliceopatía es spliceopatía dependiente de MBNL.
[0038] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido antisentido modificado de los métodos es quimérico. En determinadas formas de realización, el oligonucleótido antisentido modificado de los métodos es un gapmer.
[0039] En ciertos casos, la administración es subcutánea. En ciertos casos, la administración es intravenosa.
[0040] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido antisentido modificado de los métodos se dirige a una secuencia no codificante dentro de la región de no repetición de un DMPK ARN. En ciertos casos, el oligonucleótido se dirige a una región codificante, un intrón, una UTR 5' o una UTR 3' del DMPK ARN mutante.
[0041] En ciertas formas de realización de los métodos proporcionados en este documento, la ribonucleasa nuclear es RNasa HI.
[0042] En ciertas formas de realización de los métodos, el DMPK ARN se reduce en el tejido muscular. En determinadas formas de realización, el DMPK ARN CUGexp mutante DMPK ARN se reduce preferentemente.
[0043] En ciertas formas de realización, el DMPK tiene la secuencia como se establece en N° de Acceso GenBank NM_001081560.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 1). En ciertas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en N° de Acceso GenBank NT_011109,15 truncada de los nucleótidos 18540696 a 18555106 (incorporada en este documento como SEQ ID NO: 2). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia establecida en N° de Acceso GenBank NT_039413.7 truncada de los nucleótidos 16666001 a 16681000 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 3). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank NM_032418.1 (incorporada en este documento como SEQ ID NO: 4). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank AI007148.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 5). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank AI304033.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 6). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank BC024150.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 7). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank BC056615.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 8). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank BC075715.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 9). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank BU519245.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 10). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank CB247909.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 11). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank CX208906.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 12). En ciertas formas de realización, el DMPK tiene la secuencia como se establece en N° de Acceso GenBank CX732022.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 13). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank S60315.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 14). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank S60316.1 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 15). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank NM_001081562.1 (incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 16). En determinadas formas de realización, la DMPK tiene la secuencia que se expone en el N° de Acceso GenBank n M_001100.3 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 17).
[0044] En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase reivindicada en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33-874. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 9, al menos 10, o al menos 11, nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33-874.
[0045] En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase reivindicada en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33- 874. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 13, o al menos 14 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33-874.
[0046] En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 15 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase recitada en cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33-874. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 16 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase mencionada en cualquiera de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33-874.
[0047] En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 17 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase reivindicada en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 24, 25, 27, o 28.
[0048] En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 18 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 24 o 25. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 19 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 24 o 25.
[0049] En ciertos casos, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento están dirigidos a cualquiera de las siguientes regiones de SEQ ID NO: 1:1343-1368, 1346-1363, 1346-1361 y 1347-1363. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento están dirigidos a cualquiera de las siguientes regiones de SEQ ID NO: 1:1343-1358 y 1344-1359.
[0050] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una región diana. En ciertos casos, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este
documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343 1368, 1346-1363, 1346-1361 o 1347-1363 de SEQ ID NO: 1. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1358 o 1344-1359 de la SEQ ID NO: 1.
[0051] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 10 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una región diana. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 10 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1368, 1346-1363, 1346-1361 o 1347-1363 de SEQ ID NO: 1. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 10 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1358 o 1344-1359 de la SEQ ID NO: 1.
[0052] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una región diana. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 12 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1368, 1346-1363, 1346-1361 o 1347-1363 de SEQ ID NO: 1. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 12 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1358 o 1344-1359 de la SEQ ID NO: 1.
[0053] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 14 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una región diana. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 14 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1368, 1346-1363, 1346-1361 o 1347-1363 de SEQ ID NO: 1. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 14 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1358 o 1344-1359 de la SEQ ID NO: 1.
[0054] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 16 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una región diana. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 16 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1368, 1346-1363, 1346-1361 o 1347-1363 de SEQ ID NO: 1. En ciertos casos, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 16 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 1343-1358 o 1344-1359 de la SEQ ID NO: 1.
[0055] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento están dirigidos a cualquiera de las siguientes regiones de SEQ ID NO: 2: 8603-8618 y 8604-8619.
[0056] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una región diana. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 8603-8618 o 8604-8619 de SEQ ID NO: 2.
[0057] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 10 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una región diana. En determinadas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 10 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana se dirige a las nucleobases 8603-8618 o 8604-8619 de Se Q ID NO: 2.
[0058] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 12 bases nucleotídicas
contiguas complementarias a una región diana. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 12 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 8603-8618 o 8604-8619 de Se Q ID NO: 2.
[0059] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 14 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una región diana. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 14 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 8603-8618 o 8604-8619 de Se Q ID NO: 2.
[0060] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobases que comprende una región complementaria que comprende al menos 16 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una región diana. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados proporcionados en este documento tienen una secuencia de nucleobase que comprende una región complementaria que comprende al menos 16 nucleobases contiguas complementarias a una región diana, en donde la región diana está dirigida a nucleobases 8603-8618 o 8604-8619 de Se Q ID NO: 2.
[0061] En ciertas formas de realización, el animal es un humano.
[0062] En ciertos casos, los compuestos o composiciones descritas en el presente documento se designan como un primer agente y los métodos descritos en este documento comprenden además la administración de un segundo agente. En ciertos casos, el primer agente y el segundo agente se administran conjuntamente. En ciertos casos, el primer agente y el segundo agente se administran conjuntamente de forma secuencial o concomitante.
[0063] En ciertos casos, la administración comprende la administración parenteral.
[0064] En ciertas formas de realización, el compuesto es un oligonucleótido monocatenario modificado. En ciertos casos, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos un 95% complementario de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-19 según se mide en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertos casos, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-19 según se mide en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En determinadas formas de realización, el compuesto es un oligonucleótido modificado monocatenario. En determinadas formas de realización, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos un 95% complementaria a cualquiera de SEQ ID NO: 1 medida en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En determinadas formas de realización, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a cualquiera de SEQ ID NO: 1 medida en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado.
[0065] En ciertas formas de realización, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos el 90% complementaria a una cualquiera de SEQ ID NO: 1 tal como se mide sobre la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertos casos, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es complementaria en un 85% a cualquiera de las SEQ ID NO: 1 medida en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado.
[0066] En ciertas formas de realización, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos el 90% complementaria a una cualquiera de SEQ ID NO: 2 tal como se mide sobre la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertos casos, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es complementaria en un 85% a cualquiera de SEQ ID NO: 2 medida en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado.
[0067] En ciertas formas de realización, al menos un enlace internucleosídico de dicho oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado. En determinadas formas de realización, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato.
[0068] En ciertas formas de realización, al menos un nucleósido de dicho oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado. En determinadas formas de realización, al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En determinadas formas de realización,al menos un azúcar modificado comprende un puente 2'-O-metoxietilo o 4'-(CH2)n-O-2', en donde n es 1 o 2.
[0069] En determinadas formas de realización, al menos un nucleósido de dicho oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada. En determinadas formas de realización, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
[0070] En determinadas formas de realización, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; b) un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de nucleósidos enlazados. El segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
[0071] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez enlaces desoxinucleósidos; b) un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico de dicho oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato, y cada citosina en dicho oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
[0072] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el oligonucleótido modificado consta de 19 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el oligonucleótido modificado consta de 18 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el oligonucleótido modificado consta de 17 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados.
[0073] También se describe aquí un método para reducir preferentemente CUGexp DMPK ARN, reduciendo miotonía o reduciendo spliceopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados, un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados y un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico de dicho oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato, cada citosina en dicho oligonucleótido modificado es una 5'-metilcitosina.
[0074] En determinadas formas de realización, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consta de ocho desoxinucleósidos enlazados; b) un segmento de ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 5' E-E-K-K; c) un segmento de ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 3' K-K-E-E; y d) en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada E representa azúcar 2'-O-metoxietilo y cada K representa un azúcar cEt.
[0075] En determinadas formas de realización, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consta de siete desoxinucleósidos enlazados; b) un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 5' E-E-E-K-K; c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 3' K-K-E-E-E; y d) en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada E representa azúcar 2'-O-metoxietilo y cada K representa un azúcar cEt.
[0076] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez enlaces desoxinucleósidos; b) un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados; y d) en donde el segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo.
[0077] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez enlaces desoxinucleósidos; b) un segmento de ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; c) un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados; y d) en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar cEt.
[0078] También se describe aquí un método para reducir preferentemente CUGexp DMPK ARN, reduciendo miotonía o reduciendo spliceopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene: a) un segmento de hueco que consta de ocho desoxinucleósidos enlazados; b) un segmento de ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 5' E-E-K-K; c) un segmento de ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 3' K-K-E-E; y d) en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada E representa azúcar 2'-O-metoxietilo y cada K representa un azúcar cEt.
[0079] También se describe aquí un método para reducir preferentemente CUGexp DMPK ARN, reduciendo miotonía o reduciendo spliceopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene: a) un segmento de hueco que consta de siete desoxinucleósidos enlazados; b) un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 5' E-E-E-K-K; c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 3' K-K-E-E-E; y d) en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada E representa azúcar 2'-O-metoxietilo y cada K representa un azúcar cEt.
[0080] También se describe aquí un método para reducir preferentemente CUGexp DMPK ARN, reduciendo miotonía o reduciendo spliceopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene: a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; b) un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados; y d) en donde el segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo.
[0081] También se describe aquí un método para reducir preferentemente CUGexp DMPK ARN, reduciendo miotonía o reduciendo spliceopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene: a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; b) un segmento de ala 5' que consta de tres nucleósidos enlazados; c) un segmento de ala 3' que consta de tres nucleósidos enlazados; y d) en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar cEt.
[0082] También se describe aquí el uso de cualquier compuesto según se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos en el presente documento. Por ejemplo, en el presente documento se describe el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir la distrofia miotónica de tipo 1. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para inhibir la expresión de DMPK y tratar, prevenir, retrasar o mejorar una enfermedad relacionada con DMPK y/o uno de sus síntomas. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para reducir la expresión de DMPK en un animal. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para reducir preferentemente CUGexp DMPK, reducir la miotonía o reducir la spliceopatía en un animal. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar a un animal con distrofia miotónica de tipo 1. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir, retrasar o mejorar los síntomas y resultados asociados con el desarrollo de DM1, que incluyen rigidez muscular, miotonía, debilidad distal incapacitante, debilidad en los músculos de la cara y la mandíbula, dificultad para tragar, párpados caídos (ptosis), debilidad de los músculos del cuello, debilidad en los músculos de brazos y piernas, dolor muscular persistente, hipersomnia, atrofia muscular, disfagia, insuficiencia respiratoria, latidos cardíacos irregulares, daño del músculo cardíaco, apatía, insulina resistencia y cataratas. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para contrarrestar la dominancia del ARN dirigiendo la escisión de las transcripciones patógenas.
[0083] También se describe aquí un kit para tratar, prevenir o mejorar distrofia miotónica de tipo 1 como se describe en el presente documento en donde el kit comprende: a) un compuesto como se describe en este documento; y opcionalmente b) un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. El kit puede incluir además instrucciones o una etiqueta para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar la distrofia miotónica de tipo 1.
[0084] También se describe en la presente memoria cualquier compuesto o composición como se describe en el presente documento, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos descritos aquí. Por ejemplo, en el presente documento se describe un compuesto o composición como se describe en el presente documento para inhibir la expresión de DMPK y tratar, prevenir, retrasar o mejorar una enfermedad relacionada con DMPK y/o uno de sus síntomas. Ciertas formas de realización proporcionan un compuesto o composición como se describe en las reivindicaciones para su uso en la reducción de la expresión de DMPK en un animal. Ciertas formas de realización proporcionan un compuesto o composición como se describe en las reivindicaciones para su uso en la reducción preferencial de CUGexp DMPK, reducción de miotonía o reducción de spliceopatía en un animal. Ciertas formas de realización proporcionan un compuesto o composición como se describe en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento de un animal con distrofia miotónica de tipo 1. Ciertas formas de realización proporcionan un compuesto o composición como se describe en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento, prevención, retraso o mejora de los síntomas y resultados asociados con el desarrollo de DM1 que incluyen rigidez muscular, miotonía, debilidad distal incapacitante, debilidad en los músculos de la cara y la mandíbula, dificultad para deglución, caída de los párpados (ptosis), debilidad de los músculos del cuello, debilidad en los músculos de brazos y piernas, dolor muscular persistente, hipersomnia, atrofia muscular, disfagia, insuficiencia respiratoria, latidos cardíacos irregulares, daño del músculo cardíaco, apatía, resistencia a la insulina y cataratas. Ciertas formas de realización proporcionan un compuesto o composición como se describe en las reivindicaciones para su uso para contrarrestar la dominancia del ARN dirigiendo la escisión de las transcripciones patógenas. También se describen en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobase que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33- 874.
[0085] Se describen aquí también otros compuestos que pueden ser utilizados en los métodos.
[0086] También se describen aquí compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 80, 12 a 50, 12 a 30, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, o 20 nucleósidos enlaces que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33- 874.
[0087] También se describe aquí compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 80, 12 a 50, 12 a 30, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobase que
comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33- 874.
[0088] También se describe aquí compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 80, 12 a 50, 12 a 30, 15 a 30, o 15 a 17 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una porción de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19, o más nucleobases contiguas complementarias a una porción de la misma longitud de nucleobases 1343-1368, 1346-1363, 1346-1361, 1347-1363 o, de la SEQ ID NO: 1.
[0089] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido monocatenario.
[0090] En ciertos casos, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33- 874.
[0091] En ciertas formas de realización, al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado.
[0092] En ciertas formas de realización, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato.
[0093] En ciertas formas de realización, al menos un nucleósido comprende un azúcar modificado.
[0094] En ciertas formas de realización, al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico.
[0095] En ciertas formas de realización, al menos un azúcar modificado es un CET.
[0096] En ciertas formas de realización, al menos un azúcar modificado comprende un 2'-O-metoxietilo.
[0097] En ciertas formas de realización, al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada.
[0098] En ciertas formas de realización, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina. En determinadas formas de realización, cada residuo de citosina comprende una 5-metilcitosina.
[0099] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados.
[0100] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido modificado se compone de 17 nucleósidos enlazados.
[0101] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados.
Compuestos antisentido
[0102] Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
[0103] En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
[0104] En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a DMPK como se describe aquí es de 10 a 30 nucleótidos de longitud. En otras palabras, los compuestos antisentido están en algunas realizaciones de 10 a 30 nucleobases enlazadas. En otros casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 8 a 80, 10 a 80, 12 a 30, 12 a 50, 15 a 30, 15 a 18, 15 a 17, 16 a 16, 18 a 24, 19. a 22, o 20 nucleobases enlazadas. En ciertos casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleobases enlazadas de longitud, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En ciertos casos, los compuestos antisentido de cualquiera de estas longitudes contienen al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de cualquiera de los ejemplos de compuestos antisentido descritos en este documento (por ejemplo, al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33- 874..
[0105] En ciertas formas de realización, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. El oligonucleótido modificado acortado o truncado puede tener un solo nucleósido eliminado del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un oligonucleótido acortado o truncado puede tener dos nucleósidos eliminados del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas desde el extremo 3'. Alternativamente, los nucleósidos eliminados se pueden dispersar a través del oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
[0106] Cuando un solo nucleósido adicional está presente en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional puede estar situado en los extremos 5' o 3' del oligonucleótido. Cuando están presentes dos o más nucleósidos adicionales, los nucleósidos añadidos pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del oligonucleótido. Alternativamente, el nucleósido añadido puede dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene un nucleósido añadido al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
[0107] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de desajuste sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89: 7305-7309, 1992), se ensayó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor grado que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De manera similar, la escisión específica de la diana se logró usando 13 oligonucleótidos antisentido de nucleobase, incluidos aquellos con 1 o 3 desapareamientos.
[0108] Gautschi et al (J. Natl Cancer Inst 93: 463 a 471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido que tiene 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
[0109] Maher y Dolnick (Nuc Acid Res 16: 3341-3358, 1988) ensayó una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases por sí solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
[0110] Las secuencias de nucleótidos que codifican DMPK incluyen, sin limitación, las siguientes secuencias establecidas en N° de Acceso GenBank NM_001081560,1 (incorporado en este documento como SEQ ID NO: 1), N° de Acceso GenBank. NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 hasta 18555106 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2), N° de Acceso GenBank de NT_039413.7 truncado de los nucleótidos 16666.001-16681000 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 3), N° de Acceso GenBank NM_032418.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4), N° de Acceso GenBank AI007148.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5), N° de Acceso GenBank AI304033.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6), N° de Acceso GenBank BC024150.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 7), N° de Acceso GenBank BC056615.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 8), N° de Acceso GenBank BC075715.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 9), N° de Acceso GenBank BU519245.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 10), N° de Acceso GenBank CB247909.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 11), N° de Acceso GenBank CX208906.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 12), N° de Acceso GenBank CX732022.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 13), N° de Acceso GenBank S60315.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 14), N° de Acceso GenBank S60316.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 15), N° de Acceso GenBank NM_001081562.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 16) y N° de Acceso GenBank NM_001100.3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 17). Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el número de Isis (Isis N°) indican una combinación de secuencia y motivo de nucleobase.
[0111] En ciertos casos, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región definida de ácido nucleico. Las regiones definidas estructuralmente para DMPK se pueden obtener mediante el número de acceso de bases de datos de secuencias como NCBI. En determinadas formas de realización, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la región diana.
[0112] El direccionamiento incluye la determinación de al menos un segmento diana con el que se híbrida un compuesto antisentido, de modo que se produce el efecto deseado. En ciertas formas de realización, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico diana de ARNm. En determinadas formas de realización, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
[0113] Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Se pueden superponer varios segmentos diana dentro de una región diana. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un rango definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En determinadas formas de realización, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un rango que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' enumerados en este documento.
[0114] Segmentos diana adecuados pueden encontrarse dentro de una 5' UTR, una región codificante, una 3' UTR, un intrón, un exón, o una conexión de exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una cierta región definida estructuralmente, como el codón de inicio o el codón de parada.
[0115] La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana a otras secuencias de todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de una manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de la diana).
[0116] No puede haber variación en la actividad (por ejemplo, tal como se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En determinadas formas de realización, las reducciones en los niveles de ARNm de DMPK son indicativas de la inhibición de la expresión de la proteína DMPK. Las reducciones en los niveles de una proteína DMPK también son indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos, como la reducción de la miotonía o la reducción de la spliceopatía, pueden ser indicativos de la inhibición del ARNm de DMPK y/o la expresión de proteínas.
Hibridación
[0117] En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en el presente documento y un ácido nucleico de DMPK. El mecanismo más común de hibridación implica el enlace de hidrógeno (p. ej., enlace de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
[0118] La hibridación puede ocurrir en condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.
[0119] Los métodos para determinar si una secuencia se puede hibridar específicamente con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica (Sambrooke y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento se pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de DMPK.
Complementariedad
[0120] Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden unirse por hidrógeno con las correspondientes nucleobases del ácido nucleico diana, tal que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico de DMPK).
[0121] Un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de una DMPK de ácido nucleico tal que segmentos que intervienen o adyacentes no están involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, desajuste o estructura de horquilla).
[0122] En ciertos casos, los compuestos antisentido divulgados en el presente documento, o una porción especificada de los mismos, son, o están al menos 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico de DMPK, una región diana, un segmento diana o una porción específica del mismo. En ciertos casos, los compuestos antisentido son al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos 91%, al menos
92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementario a un ácido nucleico DMPK, una región diana, un segmento diana o porción especificada de los mismos, y contener al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de cualquiera de los ejemplos de compuestos antisentido descritos en este documento (por ejemplo, al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ iD NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 874). El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar usando métodos de rutina y se mide en la totalidad del compuesto antisentido.
[0123] Por ejemplo, un compuesto antisentido en donde 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana, y por lo tanto específicamente hibridan, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes se pueden agrupar o intercalar con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendría 77,8% de complementariedad global con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).
[0124] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o partes especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico diana, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico de DMPK, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en este documento, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejarse de forma precisa con las correspondientes nucleobases de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. También se puede usar completamente complementario en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
[0125] La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está ubicada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido de gapmer.
[0126] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido que son, o son de hasta 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de DMPK, o una porción especificada del mismo.
[0127] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido que son, o son de hasta 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de DMPK, o una porción específica del mismo.
[0128] Los compuestos antisentido proporcionados en este documento también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en este documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 8 bases nucleotídicas de un segmento diana. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 10 nucleobase de un segmento diana. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento
diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios de al menos una porción de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, o más nucleobases de un segmento diana, o un rango definido por dos cualesquiera de estos valores.
Identidad
[0129] Los compuestos antisentido proporcionados en este documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido a una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o porción del mismo. Como se usa en este documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en este documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobase. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en este documento, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en este documento. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula según el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se está comparando.
[0130] En ciertos casos, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idénticos a uno o más de los ejemplos de compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos en este documento.
Modificaciones
[0131] Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato covalentemente vinculado a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, se hace referencia comúnmente a los grupos fosfato como los que forman los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
[0132] Las modificaciones a compuestos antisentido abarcan sustituciones o modificaciones de enlaces internucleosídicos, restos de azúcar, o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren sobre las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por el ácido nucleico diana, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora aumentada.
[0133] Nucleósidos químicamente modificados también se pueden emplear para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos químicamente modificados.
Enlaces internucleosídicos modificados
[0134] El enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace 3' a 5' fosfodiéster. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no naturales, se seleccionan a menudo sobre compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y estabilidad incrementada en presencia de nucleasas.
[0135] Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicoss que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
[0136] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En determinadas formas de realización, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En determinadas formas de realización, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
[0137] Los compuestos antisentido de la invención pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en donde el
grupo azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir estabilidad de nucleasa mejorada, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En determinadas formas de realización, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, entre otros, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5' y 2', la unión de átomos del anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo por S, N(R) o C(R1)(R2 ) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, C1-C12 alquilo o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen el nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos descritos) o sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo por S con sustitución adicional en la posición 2' (consulte la solicitud de patente estadounidense publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, sustitución 5' de un BNA (consulte la solicitud internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un extremo 5'-metilo o un grupo 5'-vinilo).
[0138] Ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 -OCH3 , 2 -OCH2CH3 , 2 -OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, OC1-C10 alquilo, OCF3 , OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2 )2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R)-(CH2 )2-N (Rm)(Rn), donde cada Ri, Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.
[0139] Los ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNA) incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido proporcionados en este documento incluyen uno o más nucleósidos BNA en donde el puente comprende una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos véase la Patente de Estados Unidos 7,399,845, expedida el 15 de julio, 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos del mismo, véase PCT/US2008/068922 publicado como WO/2009/006478, publicado el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos del mismo ver PCT/US2008/064591 publicado como WO/2008/150729, publicado el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N-(CH3)-2' (véase la solicitud de patente estadounidense publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, C1-C12 alquilo, o un grupo protector (véase la patente de EE.UU.
7.427,672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de los mismos, ver PCT/US2008/066154 publicado como WO 2008/154401, publicado el de diciembre 8, 2008).
[0140] Otros nucleósidos bicíclicos que han sido reportados en la literatura publicada (véase, por ejemplo:. Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi y col., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y col., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum y col., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001,3, 239-243; Wahlestedt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 2000, 97, 5633-5638; Singh y col., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Patentes de EE. UU. Núms.: 9.012.421; 8,501,805; 8,546,556; 8,530,640; 7,399,845; 7.053,207; 7.034,133; 6.794.499; 6.770.748; 6,670.461; 6,525,191; Publicaciones de patentes de EE. UU.: 6,268.490; US2008-0039618; US2007-0287831; US2004-0171570; Solicitudes de patente de EE. UU., Números de serie: 12/129,154; Solicitudes internacionales WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 20 04/106356; WO 94/14226; y solicitudes internacionales PCT números: PCT/US2008/068922; PCT/US2008/066154; y PCT/US2008/064591). Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
[0141] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente entre los átomos de carbono 4' y 2' del resto de azúcar pentofuranosil incluyendo, sin limitación, los puentes que comprenden 1 o de 1 a 4 grupos vinculados independientemente seleccionados de entre -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=o )-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- y -N(Ra)-; en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1, 2, 3 o 4; cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, radical de heterociclo, radical de heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico de C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJi, NJ1J2 , SJi, N3 , COOJ1 , acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxil (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1-C12 aminoalquilo sustituido o un grupo protector.
[0142] En ciertas formas de realización, el puente de un resto de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En determinadas formas de realización, el puente es 4 '-c H2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
[0143] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que se definen adicionalmente por la configuración
isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-(CH2)-O-2', puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Previamente, se han incorporado BNA de a-L-metilenoxi (4-CH2-O-2') en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
[0144] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que incluyen los que tienen un puente 4' a 2' en donde dichos puentes incluyen sin limitación, a-L-4'-(CH2)-O-2', p-D-4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH2-S-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH2-CH(CH3)-2' y 4'-(CH2)3-2', en donde R es H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
[0145] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o - N(Rc)-O-CH2 ;
Rc es C1-C12 alquilo o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
[0146] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tiol sustituido.
[0147] En una realización, cada uno de los grupos sustituidos, está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, C1-C6 alquilo, o C1-C6 alquilo sustituido y X es O o NJc.
[0148] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
[0149] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido, C1-C6 alcoxilo, C1-C6 alcoxilo sustituido, acilo, acilo sustituido, C1-C6 aminoalquilo o C1-C6 aminoalquilo sustituido;
[0150] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxi, C1-C12 alcoxi sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2 4 NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1-C12 alquilo sustituido.
[0151] La síntesis y la preparación de nucleósidos bicíclicos de adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo que tienen un puente 4'-CH2-O-2', junto con su oligomerización y las propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos se han descrito (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). La síntesis de nucleósidos bicíclicos también se ha descrito en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
[0152] Los análogos de diversos nucleósidos bicíclicos que tienen grupos puente 4' a 2' tales como 4'-CH2-O-2' y 4'-CH2-S-2', también han sido preparados (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de dúplex de oligodesoxirribonucleótidos que comprenden nucleósidos bicíclicos para su uso como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al., WO 99/14226). Además, se ha descrito en la técnica
la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad restringido conformacionalmente (Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado BNA de 2'-amino y 2'-metilamino y se ha informado previamente de la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.
[0153] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxilo, C1-C12 alcoxilo sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3 , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o qi y qk juntos son =C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1-C12 alquilo sustituido.
[0154] Un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente analógico alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2 ' han sido descritos (Frier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek y col., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).
[0155] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos que incluyen, pero no se limitan a (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CHa)-O-2') BNA (también denominado etilo restringido o cEt), (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BnA, (H) metilen-amino (4'-Ch 2-N(R)-2') BNA, (I) metilo carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BnA, (J) propileno carbocíclico (4'-(Ch 2)3-2') BNA y (K) vinilo BnA como se muestra a continuación.
en donde Bx es el resto de base y R es, independientemente, H, un grupo protector, C1-C6 alquilo o C1-C6 alcoxi.
[0156] En ciertas formas de realización, los nucleósidos se modifican por sustitución del anillo de ribosil con un sustituto de azúcar. Dicha modificación incluye, sin limitación, el reemplazo del anillo de ribosilo con un sistema de anillo sustituto (a veces denominado análogos de ADN) como un anillo de morfolino, un anillo de ciclohexenilo, un anillo de ciclohexilo o un anillo de tetrahidropiranilo como uno que tenga una de las fórmulas:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de unión entre nucleósidos que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto oligomérico o uno de T3 y T4 es un grupo de unión entre nucleósidos que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto oligomérico u oligonucleótido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo terminal 5' o 3'; q1, q2 , q3, q4, qs, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido; y
uno de R1 y R2 es hidrógeno y el otro se selecciona de halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2 , SJ1, N3 , O-C(=X)J1, O-C(=X)NJJ2 , NJ3C(=X)NJJ2 y CN, donde X es O, S o NJ1 y cada Ji, J2 y J3 es, independientemente, H o C1g-C6 alquilo.
[0158] En ciertas formas de realización, q1, q2 , q3, q4, qs, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas formas de realización, al menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En determinadas formas de realización, al menos uno de q1, q2 , q3, q4 , q5 , q6 y q7 es metilo. En determinadas formas de realización, se proporcionan nucleósidos de THP en los que uno de R1 y R2 es F. En determinadas formas de realización, R1 es flúor y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
[0159] Tales sustitutos de azúcar incluyen, pero no se limitan a lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de altritol (ANA) y ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, C. J., Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854).
[0160] En ciertas formas de realización, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden restos de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (véase, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; y las patentes de EE.UU. 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; y 5,034,506).
[0161] Tal como se utiliza aquí, el término "morfolino" significa un sustituto de azúcar que tiene la siguiente estructura:
[0162] En ciertas formas de realización, se pueden modificar morfolinos, por ejemplo mediante la adición o alteración de diversos grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anteriormente. Dichos sustitutos de azúcar se denominan en el presente documento "morfolinos modificados".
[0163] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosil en nucleósidos que se producen naturalmente. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no se limitan a los descritos en la técnica (véase, por ejemplo, la Solicitud PCT publicada WO 2010/036696, de propiedad común, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (6), 1979-1984; Horvath y col., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts y col., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24 (5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33 (8), 2452 2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61 (6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60 (9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13 (6), 479-489; Wang y col., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure y col., Nucleic Acids Research, 2001, 29 (24), 4941-4947; Wang y col., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang y col., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001,20 (4-7), 785-788; Wa ng y col., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud PCT publicada, WO 06/047842; y Solicitud PCT publicada WO 01/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la fórmula:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de unión entre nucleósidos que une el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de unión entre nucleósidos que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo terminal 5' o 3'; y q1, q2 , q3, q4, q5, q6, q7, q8 y q9 son cada uno, independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo, C2-C6 alquinilo sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
[0164] Muchos otros sistemas bicíclicos y anillo sustituto de azúcar tricíclico son también conocidos en la técnica que se pueden utilizar para modificar los nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver por ejemplo el artículo de revisión: Leumann, Christian J., Bioorg Med Chem, 2002, 10, 841-854). Dichos sistemas de anillos pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
[0165] Los métodos para las preparaciones de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, EE. UU.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 y 6,600,032 y la solicitud internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
[0166] En los nucleótidos que tienen restos modificados de azúcar, los restos de nucleobases (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado.
[0167] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK comprenden uno o más nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados. En determinadas formas de realización, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En determinadas formas de realización, los nucleótidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer.
Nucleobases modificadas
[0168] Las modificaciones o sustituciones de nucleobase (o base) son estructuralmente distinguibles, pero funcionalmente intercambiables con nucleobases no modificadas naturales o sintéticas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en el enlace de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobase, incluidas las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278).
[0169] Nucleobases no modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3 ) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
[0170] Restos de bases heterocíclicos también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas por N-2, N-6 y O-6, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
[0171] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinadas formas de realización, los oligonucleótidos antisentido con espacios abiertos dirigidos a un ácido nucleico de DMPK comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinadas formas de realización, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En determinadas formas de realización, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Ciertos motivos de compuesto antisentido
[0172] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK han modificado químicamente subunidades dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a las propiedades de los compuestos antisentido tales como actividad inhibidora mejorada, aumento de la afinidad de unión para un ácido nucleico diana, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
[0173] Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente al menos una región modificada de modo que confieren mayor resistencia a la degradación por nucleasas, aumento de la captación celular, aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana, y/o aumento de la actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN.
[0174] Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En determinadas formas de realización, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE, y 2 -O-CH3 , entre otros), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n=1 o n=2). El motivo de ala-hueco-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la región de ala 5', "Y" representa la longitud de la región del hueco y "Z" representa la longitud de la región de ala 3'. Como se usa en este documento, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente a cada uno de los segmentos de ala 5' y el segmento de ala 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala 5' y el segmento de hueco, o el segmento de hueco y el segmento de ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en este documento puede tener un motivo gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En una realización preferida, Y está entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gapmer incluyen, pero no se limitan a por ejemplo, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6, 5-8-5, 5-7-5, 1-8-1 o 2-6-2.
[0175] En ciertas formas de realización, el compuesto antisentido como un motivo "wingmer'', que tiene una configuración ala-hueco o hueco-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se describió anteriormente para la configuración de gapmer. Por lo tanto, las configuraciones de alas incluyen, pero no se limitan a por ejemplo, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 o 5-13.
[0176] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK poseen un motivo gapmer 5-10-5. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK poseen un motivo gapmer 5-7-5. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK poseen un motivo gapmer 3-10-3. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK poseen un motivo gapmer 4-8-4.
[0177] En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de DMPK tiene un motivo de hueco ensanchado.
[0178] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido de cualquiera de estos motivos de gapmer o wingmer contienen al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de cualquiera de los ejemplos de compuestos antisentido descritos en este documento (por ejemplo, al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ iD NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33- 874.
[0179] En ciertas formas de realización, la presente invención proporciona compuestos oligoméricos que comprenden oligonucleótidos. En ciertas formas de realización, tales oligonucleótidos comprenden una o más modificaciones químicas. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados químicamente comprenden uno o más azúcares modificados. En ciertas formas de realización, oligonucleótidos químicamente modificados comprenden uno o más nucleobases modificadas. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados químicamente comprenden
uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En determinadas formas de realización, las modificaciones químicas (modificaciones de azúcar, modificaciones de nucleobase y/o modificaciones de enlace) definen un patrón o motivo. En ciertas formas de realización, los patrones de modificaciones químicas de restos de azúcar, enlaces internucleosídicos y nucleobases son independientes entre sí. Por tanto, un oligonucleótido puede describirse por su motivo de modificación de azúcar, motivo de enlace internucleosídico y/o motivo de modificación de nucleobase (como se usa en este documento, el motivo de modificación de nucleobase describe las modificaciones químicas de las nucleobases independientes de la secuencia de nucleobases).
Ciertos motivos de azúcar
[0180] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos comprenden uno o más tipos de restos de azúcar modificados y/o restos de azúcar naturales dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o zona del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Dichos motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar discutidas en este documento y/u otras modificaciones de azúcar conocidas.
[0181] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene un motivo de modificación de azúcar gapmer, que comprende dos regiones externas o "alas" y una región interna o "hueco". Las tres regiones de un motivo gapmer (ala 5', hueco y ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en donde al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos del hueco. Específicamente, al menos los restos de azúcar de los nucleósidos de cada ala que están más cerca del hueco (el nucleósido más 3' del ala 5' y el nucleósido más 5' del ala 3') difieren del resto de azúcar de los nucleósidos del hueco vecino, definiendo así el límite entre las alas y el hueco. En determinadas formas de realización, los restos de azúcar dentro del hueco son iguales entre sí. En determinadas formas de realización, el hueco incluye uno o más nucleósidos que tienen un resto de azúcar que difiere del resto de azúcar de uno o más de otros nucleósidos del hueco. En ciertas formas de realización, los motivos de modificación de azúcar de las dos alas son iguales entre sí (gapmer simétrico). En ciertas formas de realización, los motivos de modificación de azúcar de ala 5' difieren del motivo de modificación de azúcar de ala 3' (gapmer asimétrico).
Ciertas alas 5'
[0182] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 1 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 3 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 4 o 5 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 1 a 4 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 1 a 3 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 1 o 2 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 2 a 4 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 2 o 3 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 3 o 4 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 1 nucleósido. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 2 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de nucleósidos enlazados en 3. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 4 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer consta de 5 nucleósidos enlazados.
[0183] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos dos nucleósidos bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos tres nucleósidos bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos cuatro nucleósidos bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de LNA. En determinadas formas de realización, cada nucleósido del ala 5' de un gapmer es un nucleósido bicíclico. En determinadas formas de realización, cada nucleósido del ala 5' de un gapmer es un nucleósido de etilo restringido. En ciertas formas de realización, cada nucleósido del ala 5' de un gapmer es un nucleósido LNA.
[0184] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido sustituido en 2'. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas formas de realización, cada nucleósido del ala 5' de un gapmer es un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas formas de realización, cada nucleósido del ala 5' de un gapmer es un nucleósido sustituido en 2'. En determinadas formas de realización, cada nucleósido del ala 5' de un gapmer es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas formas de realización, cada nucleósido del ala 5' de un gapmer es un nucleósido 2'-OMe.
[0185] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2' sustituido. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un
gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0186] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido sustituido en 2'. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0187] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2' sustituido. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0188] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende tres nucleósidos de etilo restringidos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos bicíclicos y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y dos nucleósidos 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos bicíclicos y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y dos nucleósidos 2'-MOE. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y tres nucleósidos 2'-MOE.
[0189] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende tres nucleósidos LNA. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos LNA y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos l Na y tres nucleósidos 2'-MOE.
[0190] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende tres nucleósidos de etilo restringidos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos bicíclicos y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y dos nucleósidos 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos bicíclicos y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y dos nucleósidos 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y tres nucleósidos 2'-OMe.
[0191] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende tres nucleósidos LNA. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos 2'-OMe. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos LNA y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos lNa y tres nucleósidos 2'-OMe.
[0192] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer tiene un motivo AABB, en donde cada A se selecciona de entre un nucleósido de 2'-MOE y un nucleósido de 2'OMe. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer tiene un motivo AABB, en donde cada B se selecciona entre un nucleósido cEt, LNA, a-L-LNA, ENA y 2'-tio LNA. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer tiene un motivo AABB, en donde cada A representa un nucleósido 2'-MOE y cada B representa un nucleósido de etilo restringido.
[0193] En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gapmer tiene un motivo AAABB, en donde cada A se selecciona de entre un nucleósido de 2'-MOE y un nucleósido de 2'OMe. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer tiene un motivo AABB, en donde cada B se selecciona entre un nucleósido cEt, LNA, a-L-LNA, ENA y 2'-tio LNA. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer tiene un motivo AABB, en donde cada A representa un nucleósido 2'-MOE y cada B representa un nucleósido de etilo restringido.
Ciertas alas 3'
[0194] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 1 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 3 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 4 o 5 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 1 a 4 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 1 a 3 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 1 o 2 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 2 a 4 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 2 o 3 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 3 o 4 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 1 nucleósido. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 2 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de nucleósidos enlazados en 3. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 4 nucleósidos enlazados. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer consta de 5 nucleósidos enlazados.
[0195] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de LNA. En determinadas formas de realización, cada nucleósido del ala 3' de un gapmer es un nucleósido bicíclico. En ciertas formas de realización, cada nucleósido del ala 3' de un gapmer es un nucleósido de etilo restringido. En determinadas formas de realización, cada nucleósido del ala 3' de un gapmer es un nucleósido LNA.
[0196] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos tres nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos cuatro nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido sustituido en 2'. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas formas de realización, cada nucleósido del ala 3' de un gapmer es un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas formas de realización, cada nucleósido del ala 3' de un gapmer es un nucleósido sustituido en 2'. En determinadas formas de realización, cada nucleósido del ala 3' de un gapmer es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas formas de realización, cada nucleósido del ala 3' de un gapmer es un nucleósido 2'-OMe.
[0197] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2' sustituido. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0198] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido sustituido en 2'. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0199] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2' sustituido. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0200] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende tres nucleósidos de etilo restringidos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos bicíclicos y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y dos nucleósidos 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos bicíclicos y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y dos nucleósidos 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y tres nucleósidos 2'-MOE.
[0201] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende tres nucleósidos LNA. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En
determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos 2'-MOE. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos LNA y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos 2'-MOE. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos l Na y tres nucleósidos 2'-MOE.
[0202] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende tres nucleósidos de etilo restringidos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos bicíclicos y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y dos nucleósidos 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos bicíclicos y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y dos nucleósidos de 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos de etilo restringidos y tres nucleósidos 2'-OMe.
[0203] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende tres nucleósidos LNA. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos 2'-OMe. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos LNA y dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos LNA y dos nucleósidos 2'-OMe. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer comprende dos nucleósidos lNa y tres nucleósidos 2'-OMe.
[0204] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer tiene un motivo de BBAA, en donde cada A se selecciona de entre un nucleósido de 2'-MOE y un nucleósido de 2'OMe. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer tiene un motivo BBAA, en donde cada B se selecciona entre un nucleósido cEt, LNA, a-L-LNA, ENA y 2'-tio LNA. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer tiene un motivo BBAA, en donde cada A representa un nucleósido 2'-MOE y cada B representa un nucleósido de etilo restringido.
[0205] En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gapmer tiene un motivo BBAAA, en donde cada A se selecciona de entre un nucleósido de 2'-MOE y un nucleósido de 2'OMe. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer tiene un motivo BBAA, en donde cada B se selecciona entre un nucleósido cEt, LNA, a-L-LNA, ENA y 2'-tio LNA. En determinadas formas de realización, el ala 3' de un gapmer tiene un motivo BBAA, en donde cada A representa un nucleósido 2'-MOE y cada B representa un nucleósido de etilo restringido.
Composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas
[0206] Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con la sustancia activa o inerte farmacéuticamente aceptable para la preparación de composiciones farmacéuticas o formulaciones. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, que incluyen, pero no se limitan a la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis a administrar.
[0207] El compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de DMPK se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se administran por vía parenteral. Por consiguiente, en una realización, en los métodos descritos en el presente documento se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de DMPK y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinadas formas de realización, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En determinadas formas de realización, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
[0208] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquiera sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluyendo un humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a sales de sodio y potasio.
[0209] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinde por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
[0210] Los compuestos antisentido pueden ser unidos covalentemente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos
conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
[0211] Los compuestos antisentido también se pueden modificar para que tengan uno o más grupos estabilizantes que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de los compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, estabilidad nucleasa. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene un ácido nucleico terminal de la degradación de la exonucleasa y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo 5' (tapa 5') o en el extremo 3' (tapa 3'), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de tapones son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapones abásicos desoxi invertidos. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que se pueden usar para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido
[0212] Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de DMPK se pueden probar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para dichos análisis están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, m D) y las células se cultivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor utilizando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a células HepG2, células Hep3B, hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células LLC-MK2.
Las pruebas in vitro de los oligonucleótidos antisentido
[0213] Se describen aquí procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden ser modificados apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
[0214] En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente el 60-80% de confluencia en cultivo.
[0215] Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que típicamente varía de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
[0216] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE® que típicamente varía de 2 a 12 ug/mL por antisentido oligonucleótido 100 nM.
[0217] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de Cytofectin® que típicamente varía de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
[0218] Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye electroporación.
[0219] Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células se recolectan típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que los niveles de ARN o proteína de ácidos nucleicos diana se miden mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos replicados.
[0220] La concentración de oligonucleótidos antisentido utilizados varía de línea celular a línea celular. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan generalmente a concentraciones que variaban de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectina o Citofectina. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
[0221] El análisis de ARN se puede realizar sobre el ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de
ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de niveles diana o expresión
[0222] La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de DMPK se puede ensayar en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede realizar de manera conveniente utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 disponible comercialmente, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de niveles de ARN diana
[0223] La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede lograr por PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el ABI PRISM 7600, 7700, o 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
[0224] Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que se utiliza entonces como el sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT, PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
[0225] Las cantidades diana de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica mediante PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con la diana, multiplexando o por separado. El ARN total se cuantifica utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, L. J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN®.
[0226] Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridarse a un ácido nucleico de DMPK. Los métodos para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER FXPRFSS® (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteína
[0227] La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de DMPK se puede evaluar mediante la medición de los niveles de proteína DMPK. Los niveles de proteína de DMPK se pueden evaluar o cuantificar en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica.
Pruebas in vivo de los compuestos antisentido
[0228] Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad de expresión de inhibición de DMPK y producir cambios fenotípicos. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades, por ejemplo, el modelo de distrofia miotónica (DM1) en ratón HSALR.
[0229] El modelo HSALR de ratón es un modelo establecido para DM1 (Mankodi, A. et al Science 289: 1769, 2000). Los ratones portan un transgén de actina esquelética humana (hACTA1) con 220 repeticiones CTG insertadas en el 3' UTR del gen. La transcripción de hACTA1-CUGexp se acumula en focos nucleares en los músculos esqueléticos y da como resultado una miotonía similar a la de la DM1 humana (Mankodi, A. et al. Mol. Cell 10:35, 2002; Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006). Por tanto, se espera que la mejora de los síntomas de DM1 en el ratón HSALR mediante la inhibición antisentido del transgén hACTA1 predeciría la mejora de síntomas similares en pacientes humanos mediante la inhibición antisentido del transcrito DMPK.
[0230] La expresión de ARN de CUGexp en ratones provoca una remodelación extensa del transcriptoma muscular, gran
parte del cual se reproduce por ablación de MBNL1. Por tanto, se espera que la normalización del transcriptoma en ratones HSALR predeciría la normalización del transcriptoma humano en pacientes con DM1 mediante la inhibición antisentido del transcrito DMPK.
[0231] Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenterales. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, el ARN se aísla del tejido y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico de DMPK. También se miden los cambios en los niveles de proteína DMPK.
Empalme
[0232] La distrofia miotónica (DM1) es causada por expansiones de repetición CTG en la región 3' no traducida del gen de DMPK (Brook, J. D. et al. Cell 68: 799, 1992). Esta mutación conduce a la dominancia del ARN, un proceso en donde la expresión de ARN que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp) induce disfunción celular (Osborne RJ y Thornton CA., Human Molecular Genetics., 2006, 15(2): R162-R169). Tales CUGexp se retienen en los focos nucleares de los músculos esqueléticos (Davis, BM y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 94: 7388, 1997). La acumulación de CUGexp en los focos nucleares conduce al secuestro de proteínas de unión a poli (CUG), como Muscleblind-like 1 (MBLN1) (Miller, JW et al. EMBO J. 19: 4439, 2000). MBLN1 es un factor de empalme y regula el empalme de genes como Serca1, CIC-1, Titin y Zasp. Por lo tanto, el secuestro de MBLN1 por CUGexp desencadena un corte y empalme alternativo mal regulado de los exones de genes que MBLN1 normalmente controla (Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006). La corrección del corte y empalme alternativo en un animal que muestra tal desregulación, tal como, por ejemplo, en un paciente con DM1 y el modelo de ratón HSALR, es un indicador útil de la eficacia de un tratamiento, incluido el tratamiento con un oligonucleótido antisentido.
Ciertos mecanismos antisentido
[0233] La distrofia miotónica (DM1) es causada por expansiones de repetición CTG en la región 3' no traducida del gen de DMPK. En determinadas formas de realización, las expansiones en la región no traducida 3' del gen de DMPK dan como resultado la transcripción de ARN que contiene una repetición CUG expandida, y el ARN que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp) se retiene en los focos nucleares de los músculos esqueléticos. En ciertos casos, la maquinaria celular responsable de exportar ARNm desde el núcleo al citoplasma no exporta ARN que contiene una repetición CUG expandida del núcleo o lo hace de manera menos eficiente. En determinadas formas de realización, las células no exportan ARNm de DMPK CUGexp desde el núcleo o dicha exportación se reduce. Por consiguiente, en determinadas formas de realización, el ARNm de DMPK CUGexp se acumula en el núcleo. En determinadas formas de realización, hay más copias de ARNm de DMPK CUGexp en el núcleo de una célula que copias de ARNm de DMPK de tipo salvaje, que se exporta normalmente. En tales realizaciones, los compuestos antisentido que reducen la diana en el núcleo reducirán preferentemente el ARNm de DMPK CUGexp mutante en relación con el ARNm de DMPK de tipo salvaje, debido a sus abundancias relativas en el núcleo, incluso si el compuesto antisentido no distingue entre mutante y de tipo salvaje. Dado que los compuestos antisentido dependientes de RNasa H son activos en el núcleo, tales compuestos son particularmente adecuados para tal uso.
[0234] En ciertos casos, se espera que DMPK pre-ARNm de tipo salvaje y CUGexp DMPK pre-ARNm mutante sean procesados en ARNm a una velocidad similar. Por consiguiente, se espera que esté presente aproximadamente la misma cantidad de pre-ARNm de DMPK de tipo salvaje y pre-ARNm de CUGexp DMPK mutante en el núcleo de una célula. Sin embargo, después de continuar, el ARNm de DMPK de tipo salvaje se exporta del núcleo con relativa rapidez, y el ARNm de DMPK CUGexp mutante se exporta lentamente o no se exporta en absoluto. En ciertas formas de realización de este tipo, el ARNm de DMPK CUGexp mutante se acumula en el núcleo en mayores cantidades que el ARNm de DMPK de tipo salvaje. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido al ARNm reducirá preferentemente la expresión del ARNm de CUGexp DMPK mutante en comparación con el ARNm de DMPK de tipo salvaje porque hay más copias del ARNm de CUGexp DMPK mutante en el núcleo de la célula. En ciertos casos, no se espera que los compuestos antisentido dirigidos al pre-ARNm y no al ARNm (p. ej., dirigidos a un intrón) reduzcan preferentemente la DMPK mutante en relación con el tipo salvaje, porque es probable que la abundancia nuclear de los dos pre-ARNm sea similar. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido descritos en el presente documento no están dirigidos a intrones de pre-ARNm de DMPK. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido descritos en el presente documento se dirigen a exones o uniones exón-exón presentes en el ARNm de DMPK. En determinadas formas de realización, se prefiere el uso de un oligonucleótido antisentido para apuntar al ARNm porque un oligonucleótido antisentido que tiene una o más características descritas en el presente documento (i) tiene actividad en el núcleo de una célula y (2) reducirá preferentemente el ARNm de DMPK CUGexp mutante en comparación con al ARNm de DMPK de tipo salvaje.
Ciertos biomarcadores
[0235] La severidad de DM1 en modelos de ratón está determinada, al menos en parte, por el nivel de acumulación de la transcripción CUGexp en el núcleo o focos nucleares. Un marcador fisiológico útil para la gravedad de la DM1 es el desarrollo de carreras de alta frecuencia de potenciales de acción involuntarios (miotonía).
Ciertas indicaciones
[0236] En el presente documento se divulgan procedimientos de tratamiento de un individuo que comprenden la administración de una o más composiciones farmacéuticas como se describe aquí. En ciertos casos, el individuo tiene distrofia miotónica de tipo 1 (DM1).
[0237] Por consiguiente, la dislcosedhereína son métodos para mejorar un síntoma asociado con la distrofia miotónica de tipo 1 en un sujeto que la necesita. También se describe en el presente documento un método para reducir la velocidad de aparición de un síntoma asociado con la distrofia miotónica de tipo 1. También se describe en el presente documento un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la distrofia miotónica de tipo 1. En ciertos casos, los síntomas asociados con la DM1 incluyen rigidez muscular, miotonía, debilidad distal incapacitante, debilidad en los músculos de la cara y la mandíbula, dificultad para tragar, caída de los párpados (ptosis), debilidad de los músculos del cuello, debilidad en los músculos de los brazos y las piernas, persistente dolor muscular, hipersomnia, atrofia muscular, disfagia, insuficiencia respiratoria, latidos cardíacos irregulares, daño del músculo cardíaco, apatía, resistencia a la insulina y cataratas. En los niños, los síntomas también pueden ser retrasos en el desarrollo, problemas de aprendizaje, problemas del lenguaje y del habla y problemas del desarrollo de la personalidad.
[0238] En ciertos casos, los métodos comprenden administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente cantidad efectiva de un compuesto dirigido a un ácido nucleico de DMPK.
[0239] En ciertas intances, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico DMPK resulta en la reducción de la expresión de DMPK en al menos aproximadamente 15%, en al menos aproximadamente 20%, en al menos aproximadamente 25%, en al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o al menos aproximadamente el 99%, o un intervalo definido por dos de estos valores.
[0240] En ciertos casos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a DMPK se usan para la preparación de un medicamento para tratar un paciente que sufre o es susceptible a la distrofia miotónica de tipo 1.
[0241] En ciertos casos, los métodos descritos en este documento incluyen administrar un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene una porción de bases nucleicas contiguas como se describe en el presente documento de una secuencia indicada en las SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33- 874.
Administración
[0242] En ciertos casos, los compuestos y composiciones como se describe en el presente documento se administran parenteralmente.
[0243] En ciertos casos, la administración parenteral es por infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En ciertos casos, los agentes farmacéuticos infundidos se administran con una bomba. En ciertos casos, la administración parenteral se realiza mediante inyección (p. ej., inyección en bolo). La inyección se puede administrar con una jeringa.
[0244] La administración parenteral incluye la administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal, o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o administración intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
[0245] En ciertos casos, la administración es subcutánea, intravenosa, intracerebral, intracerebroventricular, intratecal u otra administración que da como resultado un efecto sistémico del oligonucleótido (la administración sistémica se caracteriza por un efecto sistémico, es decir, un efecto en más de un tejido) o entrega al SNC o al CSF.
[0246] La duración de la acción tal como se mide por la inhibición de la alfa 1 de la actina y la reducción de la miotonía en el modelo de ratón de HSALR de DM1 se prolonga en el tejido muscular incluyendo cuádriceps, gastrocnemio, y el tibial anterior (véanse los Ejemplos, más abajo). Las inyecciones subcutáneas de oligonucleótido antisentido durante 4 semanas dan como resultado la inhibición de actina alfa 1 en al menos un 70% en cuádriceps, gastrocnemio y tibial anterior en ratones HSALR durante al menos 11 semanas (77 días) después de la finalización de la dosificación. Las inyecciones subcutáneas de oligonucleótido antisentido durante 4 semanas dan como resultado la eliminación de miotonía en cuádriceps, gastrocnemio y tibial anterior en ratones HSALR durante al menos 11 semanas (77 días) después de la finalización de la dosificación.
[0247] En ciertos casos, la entrega de un compuesto de composición, como se describe en el presente documento, da como resultado al menos 70% regulación a la baja de un ARNm diana y/o proteína diana durante al menos 77 días. En
ciertos casos, la administración de un compuesto o composición, como se describe en este documento, da como resultado 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% regulación a la baja de un ARNm diana y/o proteína diana durante al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días, al menos 70 días, al menos 75 días, al menos 76 días, al menos 77 días, al menos 78 días, al menos 79 días, al menos 80 días, al menos 85 días, al menos 90 días, al menos 95 días, al menos 100 días, al menos 105 días, al menos 110 días, al menos 115 días, al menos 120 días, al menos 1 año.
[0248] En ciertos casos, un oligonucleótido antisentido se administra por inyección o infusión, una vez cada 77 días. En ciertos casos, un oligonucleótido antisentido se administra mediante inyección o infusión una vez al mes, cada dos meses, cada tres meses, cada 6 meses, dos veces al año o una vez al año.
Ciertas terapias de combinación
[0249] En ciertos casos, un primer agente que comprende un oligonucleótido modificado descrito en este documento se coadministra con uno o más agentes secundarios. En ciertos casos, dichos segundos agentes están diseñados para tratar la misma distrofia miotónica de tipo 1 que el primer agente descrito en este documento. En ciertos casos, dichos segundos agentes están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente a la del primer agente descrito en el presente documento. En ciertos casos, dichos segundos agentes están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento. En ciertos casos, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para tratar un efecto no deseado del primer agente. En ciertos casos, los segundos agentes se administran conjuntamente con el primer agente para producir un efecto de combinación. En ciertos casos, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto sinérgico.
[0250] En ciertos casos, un primer agente y uno o más segundos agentes se administran al mismo tiempo. En ciertos casos, el primer agente y uno o más segundos agentes se administran en momentos diferentes. En ciertos casos, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan juntos en una única formulación farmacéutica. En ciertos casos, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan por separado.
Ciertos compuestos comparadores
[0251] En ciertos casos, los compuestos descritos en el presente documento benefician de una o más propiedades mejoradas in vitro y/o in vivo relativas a un compuesto comparador apropiado.
[0252] En ciertas formas de realización, ISIS 445569, un gápmer 5-10-5 MOE, que tiene una secuencia de (de 5' a 3') CGGAGCGGTTGTGAACTGGC (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 24), en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato, cada citosina es una 5-metilcitosina, y cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 comprende un resto 2'-O-metoxietil, que se describió previamente en el documento WO 2012/012443, es un compuesto comparador.
[0253] ISIS 445569 es un compuesto comparador representativo apropiado porque ISIS 445569 demuestra reducción estadísticamente significativa de DMPK humano in vitro como se mide usando una pluralidad de conjuntos de sonda de cebador (véase por ejemplo, Ejemplo 1 y Ejemplo 2 del documento WO 2012/012443). Además, ISIS 445569 demuestra una inhibición dependiente de la dosis estadísticamente significativa de DMPK humana in vitro tanto en células de músculo esquelético humano como en fibroblastos de DM1 (ver, por ejemplo, el Ejemplo 4 y el Ejemplo 5 de WO 2012/012443 y el Ejemplo 28 de WO 2012/012467). ISIS 445569 también reduce la expresión del transcrito de DMPK humana en ratones transgénicos (Ejemplos 23 y 24 de WO 2012/012443 y Ejemplos 29 y 30 de WO 2012/012467). ISIS 445569 fue un compuesto antisentido de DMPK humana preferido en los documentos W o 2012/012443 y WO 2012/012467.
Ciertos compuestos
[0254] En ciertas formas de realización, los compuestos descritos en este documento se benefician de una actividad mejorada y/o una tolerabilidad mejorada con respecto a los compuestos comparadores apropiados, tales como ISIS 445569. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, ISIS 598769, ISIS 598768 y/o ISIS 486178 tienen más actividad y/o tolerabilidad que los compuestos comparadores apropiados, como ISIS 445569.
[0255] En ciertas formas de realización, los compuestos descritos en este documento son más potentes que los compuestos comparadores apropiados, como ISIS 445569. Por ejemplo, como se proporciona en el Ejemplo 10 (descrito en este documento), ISIS 598769 logró un CI50 de 1,9 pM, ISIS 598768 logró un CI50 de 1,2 pM e ISIS 486178 logró un CI50 de 0,7 pM en una curva de dosis-respuesta de 6 puntos (61,7 nM, 185,2 nM, 555,6 nM, 1666,7 nM, 5000,0 nM y 15000,0 nM) en cultivos en células HepG2 cuando se transfectaron usando electroporación, mientras que ISIS 445569 logró un CI50 de 2,3 pM. Por lo tanto, ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 son más potentes que el compuesto comparador, ISIS 445569.
[0256] En ciertas formas de realización, los compuestos descritos en el presente documento tienen una actividad mayor de compuestos comparadores apropiados, tales como ISIS 445569, en el logro de la inhibición dependiente de la dosis
de DMPK a través de múltiples diferentes tejidos musculares. En otro ejemplo, como se proporciona en el Ejemplo 16 (descrito en este documento), ISIS 598768 e ISIS 598769 lograron una mayor inhibición dependiente de la dosis que el compuesto comparador ISIS 445569 en varios tejidos musculares diferentes cuando se administraron por vía subcutánea a ratones transgénicos DMSXL dos veces por semana durante 4 semanas con 25 mg/kg/semana, 50 mg/kg/semana o 100 mg/kg/semana. En algunos tejidos musculares, por ejemplo, en el tibial anterior, tanto ISIS 598768 como ISIS 598769 lograron una mayor inhibición de DMPK a 25, 50 y 100 mg/kg/semana que ISIS 445569 lograda a 200 mg/kg/semana. En el cuádriceps y el gastrocnemio, tanto ISIS 598768 como ISIS 598769 lograron una inhibición de DMPFigual o mayor a 50 mg/kg/semana que ISIS 445569 lograda a 100 o 200 mg/kg/semana. Por lo tanto, ISIS 598768 e ISIS 598769 tienen mayor actividad que ISIS 445569 para lograr la inhibición de DMPK dependiente de la dosis en múltiples tejidos musculares diferentes.
[0257] En ciertas formas de realización, los compuestos descritos en este documento son más tolerables que compuestos comparadores apropiados, tales como ISIS 445569, cuando se administran a ratones CD-1. En otro ejemplo, como se proporciona en el Ejemplo 17 (descrito en el presente documento), ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 exhibieron marcadores de tolerabilidad más favorables que ISIS 445569 cuando se administraron a ratones CD-1. ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 se administraron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas a 50 mg/kg/semana. ISIS 445569 se administró por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas a 100 mg/kg/semana. Después del tratamiento, los niveles de ALT, AST y BUN fueron más bajos en los ratones tratados con ISIS 486178 e ISIS 598768 que en los ratones tratados con ISIS 445569. Después del tratamiento, los niveles de ALT y AST fueron más bajos en los ratones tratados con ISIS 598769 que en los ratones tratados con ISIS 445569. Por lo tanto, ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 son más tolerables que el compuesto comparador, ISIS 445569 en ratones CD-1.
[0258] En ciertas formas de realización, los compuestos descritos en este documento son más tolerables que compuestos comparadores apropiados, tales como ISIS 445569, cuando se administran a ratas Sprague-Dawley. En otro ejemplo, como se proporciona en el Ejemplo 18 (descrito en el presente documento), ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 exhibieron marcadores de tolerabilidad más favorables que ISIS 445569 cuando se administraron a ratas Sprague-Dawley. ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 se administraron por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas a 50 mg/kg/semana. ISIS 445569 se administró por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas a 100 mg/kg/semana. Después del tratamiento, los niveles de ALT y AST fueron más bajos en los ratones tratados con ISIS 486178, ISIS 598769 e ISIS 598768 que en los ratones tratados con ISIS 445569. Por lo tanto, ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 son más tolerables que el compuesto de comparación, ISIS 445569 en ratas Sprague-Dawley.
[0259] En ciertas formas de realización, los compuestos descritos en la presente memoria exhiben marcadores de tolerabilidad más favorables en monos cinomolgos que los compuestos de comparación adecuados, tales como ISIS 445569. En otro ejemplo, según se dispone en el Ejemplo 19 (que se describe en este documento), ISIS 598769, ISIS 598768, y ISIS 486178 exhibió marcadores de tolerabilidad más favorables en monos cinomolgos, incluida la evaluación de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) y creatina quinasa (CK). En determinadas formas de realización, los niveles de ALT y AST se utilizan como indicadores de hepatotoxicidad. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, los niveles elevados de ALT y AST indican traumatismo en las células hepáticas. En determinadas formas de realización, los niveles elevados de CK se asocian con daño a las células en el tejido muscular. En determinadas formas de realización, los niveles elevados de LDH están asociados con el daño del tejido celular.
[0260] En ciertas formas de realización, los compuestos descritos en este documento son más tolerables que compuestos comparadores apropiados, tales como ISIS 445569, cuando se administran a los monos cinomolgos. Como se proporciona en el Ejemplo 19, grupos de monos cinomolgos se trataron con 40 mg/kg/semana de ISIS 598769, ISIS 598768, ISIS 486178 e ISIS 445569. El tratamiento con ISIS 445569 dio como resultado niveles elevados de ALT y AST a los 93 días de iniciado el tratamiento. El tratamiento con ISIS 598768 e ISIS 486178 resultó en niveles más bajos de ALT y AST a los 58 y 93 días de tratamiento en comparación con ISIS 445569. El tratamiento con ISIS 598769 resultó en niveles más bajos de AST a los 58 y 93 días de tratamiento y niveles más bajos de ALT a 93 días de tratamiento en comparación con ISIS 445569. Además, los niveles de ALT y AST de los monos que recibieron dosis de ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 fueron consistentes con los niveles de ALT y AST de los monos que recibieron solución salina. El tratamiento con ISIS 445569 dio como resultado niveles elevados de LDH en comparación con los niveles de LDH medidos en animales que recibieron ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 a los 93 días de tratamiento. Además, el tratamiento con ISIS 445569 dio como resultado niveles elevados de CK en comparación con los niveles de CK medidos en animales que recibieron ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 a los 93 días de tratamiento. Por lo tanto, ISIS 598769, ISIS 598768, ISIS 486178 y son más tolerables que el compuesto comparador, ISIS 445569.
[0261] Como demuestran los datos discutidos anteriormente, ISIS 598769, ISIS 598768, e ISIS 486178 poseen una gama más amplia de dosis bien toleradas en donde ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 están activos en comparación con el compuesto comparador, ISIS 445569. Además, la totalidad de los datos presentados en los ejemplos aquí descritos y discutidos anteriormente demuestran que cada uno de ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 poseen una serie de ventajas de seguridad y actividad sobre el compuesto comparador, ISIS 445569. En otras palabras, es probable que ISIS 598769, ISIS 598768 e ISIS 486178 sean fármacos más seguros y activos en humanos que ISIS 445569.
[0262] En ciertas formas de realización, es probable que ISIS 445569 sea un fármaco más seguro y activo en humanos para reducir el ARNm de DMPK de CUGexp y/o tratar afecciones o síntomas asociados con la distrofia miotónica de tipo 1 que los otros compuestos descritos en WO 2012/012443 y/o WO 2012/012467.
[0263] En ciertas formas de realización, ISIS 512497 tiene un mejor perfil de seguridad en primates y ratones CD-1 de ISIS 445569. En ciertas formas de realización, ISIS 512497 consigue una mayor caída de ácido nucleico de DMPK humano en múltiples tejidos musculares cuando se administra en la misma dosis y a dosis más bajas que ISIS 445569.
[0264] En ciertas formas de realización, ISIS 598768 consigue una mayor caída de ácido nucleico de DMPK humano en uno o más tejidos musculares cuando se administra en la misma dosis como ISIS 445569. en ciertas formas de realización, ISIS 598768 tiene una mejor seguridad perfil en primates de ISIS 445569.
[0265] En ciertas formas de realización, ISIS 598769 consigue una mayor caída de ácido nucleico de DMPK humano en uno o más tejidos musculares cuando se administra en la misma dosis que ISIS 445569. en ciertas formas de realización, ISIS 598769 tiene un mejor perfil de seguridad en primates que ISIS 445569.
Divulgación no limitante
[0266] Si bien ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en este documento se han descrito con especificidad de acuerdo con determinadas formas de realización, los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no pretenden limitar los mismos. Aunque la lista de secuencias que acompaña a esta presentación identifica cada secuencia como "ARN" o "ADN" según sea necesario, en realidad, esas secuencias pueden modificarse con cualquier combinación de modificaciones químicas. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que dicha designación como "ARN" o "ADN" para describir oligonucleótidos modificados es, en ciertos casos, arbitraria. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende un nucleósido que comprende un resto de azúcar 2'-OH y una base de timina podría describirse como un a Dn que tiene un azúcar modificado (2'-Oh para el 2'-H natural del ADN) o como un ARN que tiene una base modificada (timina (uracilo metilado) para el uracilo natural de ARN).
[0267] En consecuencia, las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en este documento, incluidas, entre otras, las de la lista de secuencias, están destinadas a abarcar ácidos nucleicos que contienen cualquier combinación de ARN y/o ADN naturales o modificados, incluidos, entre otros, dichos ácidos nucleicos que tienen nucleobases modificadas. A modo de ejemplo adicional y sin limitación, un compuesto oligomérico que tiene la secuencia de nucleobase "ATCGATCG" abarca cualquier compuesto oligomérico que tenga dicha secuencia de nucleobase, ya sea modificado o no modificado, incluidos, entre otros, compuestos que comprenden bases de ARN, tales como los que tienen secuencia "AUCGAUCG" y aquellos que tienen algunas bases de ADN y algunas bases de ARN como "AUCGATCG" y compuestos oligoméricos que tienen otras bases modificadas o de origen natural, como "ATmeCGAUCG", en donde meC indica una base de citosina que comprende un grupo metilo en las 5 posiciones.
Ejemplos
Divulgación no limitante
[0268] Mientras que ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas formas de realización, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos descritos en este documento y no se pretende que limiten los mismos.
Ejemplo 1: Diseño de oligonucleótidos antisentido dirigidos a proteína quinasa de distrofia miotónica humana (hDMPK)
[0269] Una serie de oligonucleótidos antisentido (ASO) fueron diseñados para dirigirse a hDMPK. Los ASO de nuevo diseño se prepararon usando síntesis de oligonucleótidos estándar bien conocida en la técnica y se describen en las Tablas 1 y 2, a continuación. Los subíndices "s" indican enlaces internucleosídicos de fosforotioato; los subíndices "k" indican nucleósidos bicíclicos 6'-(Sj-CH3 (cEt); los subíndices "e" indican nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo (MOE); y los subíndices "d" indican p-D-2'-desoximbonudeósidos. "mC" indica nucleósidos de 5-metilcitosina.
[0270] Los oligonucleótidos antisentido están dirigidos a cualquiera de SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso GenBank NM_001081560,1) y/o SEQ ID NO: 2 (el complemento de N° de Acceso GENBANK NT_011109,15 truncado de nucleótidos 18540696 hasta 18555106). El "sitio de inicio" indica el nucleósido más en 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más en 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen humano.
Tabla 1
Tabla 2
(Continuación)
Ejemplo 2: Inhibición antisentido de DMPK humano en células musculares del esqueleto humano (hSKMc)
[0271] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK humano se ensayaron para determinar su efecto sobre transcrito DMPK ARN in vitro. Se transfectaron células hSKMc cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 10.000 nM. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de transcripción de ARN de DMPK se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como expresión porcentual de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0272] Los oligonucleótidos antisentido de las Tablas 3, 4, 5 y 6 son 5-10-5 gapmer, donde el segmento de hueco comprende diez 2'-desoxinucleósidos y cada segmento de ala comprende cinco nucleósidos de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleósido más en 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen genómico humano. El "sitio de parada diana" indica el nucleósido más en 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia genómica humana. Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 3, 4 o 5 SEQ ID NO: 1 diana (N° de Acceso GENBANK NM_001081560,1). Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 6 se dirigen a SEQ ID NO: 2 (el complemento de N° de Acceso GENBANK NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106).
[0273] Varios de los oligonucleótidos antisentido en las Tablas 2, 3, 4, y 5 demostraron una inhibición significativa de los niveles de DMPK ARNm en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 3
(Continuación)
(Continuación)
Tabla 4
(Continuación)
Tabla 5
(Continuación)
Tabla 6
(Continuación)
(Continuación)
Ejemplo 3: Diseño de oligonucleótidos antisentido dirigidos a proteína quinasa de distrofia miotónica humana (hDMPK)
[0274] Una serie de oligonucleótidos antisentido (ASO) fueron diseñados para dirigirse a hDMPK. Los ASO de nuevo diseño se prepararon usando síntesis de oligonucleótidos estándar bien conocida en la técnica y se describen en la Tabla 7, a continuación. Los subíndices "s" indican enlaces internucleosídicos de fosforotioato; los subíndices "k" indican nucleósidos bicíclicos 6'-(S)-CH3 (cEt); los subíndices "e" indican nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo (MOE); y los subíndices "d" indican p-D-2'-desoximbonudeósidos. "mC" indica nucleósidos de 5-metilcitosina.
[0275] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK humano se ensayaron para determinar su efecto sobre DMPK transcripción de ARN in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4,500 nM. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de transcripción de DMPK ARN se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como expresión porcentual de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0276] El "sitio de inicio diana" indica el nucleósido más en 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen genómico humano. El "sitio de parada diana" indica el nucleósido más en 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia genómica humana. Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 7 se dirigen a SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso GENBANK NM_001081560,1).
[0277] Varios de los oligonucleótidos antisentido demostraron una inhibición significativa de los niveles de DMPK ARNm bajo las condiciones especificadas anteriormente.
Ejemplo 4: Diseño de oligonucleótidos antisentido dirigidos a proteína quinasa de distrofia miotónica humana (hDMPK)
Respuesta a la dosis HepG2
[0278] Una serie de oligonucleótidos antisentido (ASO) fueron diseñados para apuntar hDMPK. Los ASO de nuevo diseño se prepararon usando síntesis de oligonucleótidos estándar bien conocida en la técnica y se describen en la Tabla 8, a continuación. Los subíndices "s" indican enlaces internucleosídicos de fosforotioato; los subíndices "k" indican nucleósidos bicíclicos 6'-(S)-CH3 (cEt); los subíndices "e" indican nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo (MOE); y los subíndices "d" indican p-D-2'-desoximbonudeósidos. "mC" indica nucleósidos de 5-metilcitosina.
[0279] Los oligonucleótidos antisentido están dirigidos a la SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso GenBank NM_001081560,1). El "sitio de inicio" indica el nucleósido más en 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer como secuencia de genes humanos.
Tabla 8
Ejemplo 5: Respuesta a la dosis de HepG2
[0280] Se ensayaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK humana para determinar su efecto sobre el transcrito de DMPK ARN humano in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con concentraciones de 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM y 10000,0 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK ARN mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el conjunto de sondas de cebadores RTS3164 (secuencia directa AGCCTGAGCCGGGAGATG, designada en este documento como SEQ ID NO: 20; secuencia inversa GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT, designada aquí como SEQ ID NO: 21; secuencia de sonda AGGCCATCCGCACGGACAACCX, designada aquí como SEQ ID NO: 22). Los niveles de transcripción de DMPK ARN humana se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla siguiente como porcentaje de expresión de DMPK humana, en relación con las células de control no tratadas (UTC). Las secuencias de oligonucleótidos antisentido ensayadas demostraron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de DMPK humana en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 9
(Continuación)
(Continuación)
Ejemplo 6: Diseño de oligonucleótidos antisentido dirigidos a proteína quinasa de distrofia miotónica humana (hDMPK)
[0281] Una serie de oligonucleótidos antisentido (ASO) fueron diseñados para dirigirse a hDMPK. Los ASO de nuevo diseño se prepararon usando síntesis de oligonucleótidos estándar bien conocida en la técnica y se describen en la Tabla 10, a continuación. Los subíndices "s" indican enlaces internucleosídicos de fosforotioato; los subíndices "k" indican nucleósidos bicíclicos 6'-(S)-CH3 (cEt); los subíndices "e" indican nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo (MOE); y los subíndices "d" indican p-D-2'-desoximbonudeósidos. "mC" indica nucleósidos de 5-metilcitosina.
[0282] Los oligonucleótidos antisentido están dirigidos a la SEQ ID NO: 2 (el complemento de N° de Acceso GENBANK NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106). El "sitio de inicio" indica el nucleósido más en 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer como secuencia de genes humanos.
Tabla 10
Ejemplo 7: Respuesta a la dosis para ASO dirigidos a una transcripción de DMPK ARN humano en células HepG2
[0283] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK humano se ensayaron para determinar su efecto sobre transcripción de DMPK ARN humano in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con concentraciones de 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM y 10000,0 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK ARN mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el conjunto de sondas de cebadores RTS3164 (secuencia directa AGCCTGAGCCGGGAGATG, designada aquí como Se Q ID
NO 20; secuencia inversa GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 21; secuencia de sonda AGGCCATCCGCACGGACAACCX, designada aquí como SEQ ID NO: 22). Los niveles de transcripción de DMPK ARN humana se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como expresión porcentual de DMPK humana, en relación con las células de control no tratadas (UTC) y se muestran en la tabla siguiente. Las secuencias de oligonucleótidos antisentido ensayadas demostraron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de DMPK humana en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 11
(Continuación)
Ejemplo 8: ASOs diseñados para dirigirse a una transcripción de DMPK ARN humano
[0284] Una serie de oligonucleótidos antisentido (ASO) fueron diseñados para dirigirse a hDMPK. Los ASO de nuevo diseño se prepararon usando síntesis de oligonucleótidos estándar bien conocida en la técnica y se describen en la Tabla 12, a continuación. Los subíndices "s" indican enlaces internucleosídicos de fosforotioato; los subíndices "k" indican nucleósidos bicíclicos 6'-(S)-CH3 (cEt); los subíndices "e" indican nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo (MOE); y los subíndices "d" indican p-D-2'-desoximbonudeósidos. "mC" indica uncleósidos de 5-metilcitosina.
[0285] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK humano se ensayaron para determinar su efecto sobre transcripción de DMPK ARN in vitro. Se transfectaron células hSKMC cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 800 nM. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de transcripción de DMPK ARN se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como expresión porcentual de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0286] El "sitio de inicio diana" indica el nucleósido más en 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen genómico humano. El "sitio de parada diana" indica el nucleósido más en 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia genómica humana. Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 12 se dirigen a SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso GENBANK NM_001081560,1).
[0287] Varios de los oligonucleótidos antisentido demostraron una inhibición significativa de los niveles de DMPK ARNm bajo las condiciones especificadas anteriormente.
Ejemplo 9: ASO diseñados para dirigirse a una transcripción de DMPK ARN humano
[0288] Una serie de oligonucleótidos antisentido (ASO) fueron diseñados para dirigirse a hDMPK. Los ASO de nuevo diseño se prepararon usando síntesis de oligonucleótidos estándar bien conocida en la técnica y se describen en la Tabla 13 a 18, a continuación. Los subíndices "s" indican enlaces internucleosídicos de fosforotioato; los subíndices "k" indican nucleósidos bicíclicos 6'-(S)-CH3 (cEt); los subíndices "e" indican nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo (MOE); y los subíndices "d" indican p-D-2'-desoximbonudeósidos. ”mC” indica nucleósidos de 5-metilcitosina.
[0289] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK humano se ensayaron para determinar su efecto sobre transcripción de DMPK ARN in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de transcripción de DMPK ARN se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como el porcentaje de expresión de DMPK, en relación con las células de control no tratadas, con "% de expresión diana" que representa el porcentaje de expresión de DMPK en relación con las células de control no tratadas.
[0290] Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 13 SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso GENBANK NM_001081560,1). Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 14 a 18 se dirigen a la SEQ ID NO: 2 (el complemento de N° de Acceso GenBank NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106). El "sitio de inicio diana" indica el nucleósido más en 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen genómico humano. El "sitio de parada diana" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia genómica humana.
Ejemplo 10: Estudios de respuesta a la dosis con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la miotonicaproteína quinasa de distrofia humana (DMPK) en células HepG2
[0291] Se ensayaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK humano para determinar su efecto sobre la transcripción de DMPK ARN humano in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con concentraciones de 61,7 nM, 185,2 nM, 555,6 nM, 1666,7 nM, 5000,0 nM y 15000,0 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK ARN mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el conjunto de sondas de cebadores RTS3164 (secuencia directa AGCCTGAGCCGGGAGATG, designada aquí como SEQ ID NO: 20; secuencia inversa GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT, designada aquí como SEQ ID NO: 21; secuencia de sonda AGGCCATCCGCACGGACAACCX, designada aquí como SEQ ID NO: 22). Los niveles de transcripción de DMPK ARN humana se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como el porcentaje de expresión de DMPK humana, en relación con las células de control no tratadas (UTC). Por ejemplo, si la UTC es 100 y una dosis de 5000 nM de ISIS N° 445569 produce un % de expresión de DMPK humana de 35, entonces la dosis de 5000 nM de ISIS redujo la expresión de DMPK humana en un 65% en relación con la UTC. La concentración inhibidora semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido se presenta en la tabla siguiente y se calculó representando gráficamente las concentraciones de oligonucleótidos utilizados frente al porcentaje de inhibición de la expresión de DMPK ARNm humano alcanzado en cada concentración, y tomando nota de la concentración de oligonucleótido en el cual se logró una inhibición del 50% de la expresión de ARNm de DMPK humana en comparación con el control. Los resultados se presentan en la Tabla 19.
[0292] Las secuencias de oligonucleótidos antisentido ensayadas demostraron una inhibición dependiente de la dosis de niveles de DMPK ARNm humanos en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 19
(Continuación)
Ejemplo 11: Estudios de respuesta a la dosis con oligonucleótidos antisentido dirigidos a proteína quinasa de distrofia miotónica humana (hDMPK) en los mioblastos de Steinert DM1
[0293] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK humano se ensayaron para determinar su efecto sobre transcripción de DMPK RNA humano in vitro. Se transfectaron células de mioblastos Steinert DM1 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con concentraciones de 61,7 nM, 185,2 nM, 555,6 nM, 1666,7 nM, 5000,0 nM y 15000,0 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK ARN mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sondas de cebadores RTS3164 descrito anteriormente. Los niveles de transcripción de DMPK ARN humano se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje (%) de expresión de DMPK humana, en relación con las células de control no tratadas (UTC). La concentración inhibitoria máxima media (CI50) de cada oligonucleótido se presenta en la tabla siguiente y se calculó mediante el trazado de las concentraciones de oligonucleótidos utilizados frente al porcentaje de inhibición de la expresión de DMPK ARNm humano alcanzado en cada concentración, y tomando nota de la concentración de oligonucleótido en el cual se logró una inhibición del 50% de la expresión de DMPK ARNm humana en comparación con el control. Los resultados se presentan en la Tabla 20.
[0294] Las secuencias de oligonucleótidos antisentido ensayadas demostraron una inhibición dependiente de la dosis de niveles de DMPK ARNm humanos en las condiciones especificadas anteriormente.
Ejemplo 12: Estudios de respuesta a la dosis con oligonucleótidos antisentido dirigidos a proteína quinasa de distrofia miotónica de macaco rhesus (DMPK) en hepatocitos primarios de mono cynomolgus
[0295] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de DMPK de macaco rhesus se ensayaron para determinar su efecto en transcripción DMPK ARN de mono rhesus in vitro. Se transfectaron células de hepatocitos primarios de mono cynomolgus cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con concentraciones de 61,7 nM, 185,2 nM, 555,6 nM, 1666,7 nM, 5000,0 nM y 15000,0 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK ARN mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sondas de cebador RTS3164 descrito anteriormente. Los niveles de transcripción de DMPK ARN de mono Rhesus se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje (%) de expresión de DMPK de mono rhesus, en relación con las células de control no tratadas (UTC). La concentración inhibidora semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido se presenta en la tabla a continuación y se calculó representando gráficamente las concentraciones de oligonucleótidos utilizados frente a la inhibición porcentual de expresión DMPK ARNm de mono rhesus alcanzada en cada concentración, y tomando nota de la concentración de oligonucleótido en la que la inhibición del 50% de la expresión de ARNm de DMPK de mono rhesus se logró en comparación con el control.
[0296] Las secuencias de oligonucleótidos antisentido ensayadas demostraron una inhibición dependiente de la dosis de niveles de DMPK ARNm de rhesus monkey en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 21
(Continuación)
E j e m p l o 1 3 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o
in vivo
d e h D M P K e n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s D M S X L
[ 0 2 9 7 ] Para probar el efecto de la inhibición antisentido para el tratamiento de la distrofia miotónica de tipo 1 (DM1), se requirió un modelo de ratón apropiado. Se generó el modelo de ratón transgénico, DMSXL que porta el gen hDMPK con grandes expansiones de más de 1000 repeticiones CTG (Huguet et al., PLOS Genetics, 2012, 8 (11), e1003034-e1003043). Estos ratones DMSXL expresan el alelo hDMPK mutante y muestran un fenotipo de debilidad muscular similar al observado en pacientes con DM1.
[ 0 2 9 8 ] ISIS 486178 a partir de la Tabla 1 se seleccionó y se ensayó para la inhibición antisentido de transcripción hDMPK in vivo. ISIS 445569 se incluyó en el estudio a modo de comparación.
Tratamiento
[ 0 2 9 9 ] Los ratones DMSXL se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con pienso de ratón Purina normal. Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en el centro de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en PBS y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los ASO se disolvieron en PBS al 0,9% para inyección.
[ 0 3 0 0 ] Los ratones DMSXL recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 445569 a 50 mg/kg o ISIS 486178 a 25 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo de control recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por
semana durante 4 semanas. Cada grupo de tratamiento constaba de 4 animales.
Inhibición de los niveles de hDMPK ARNm
[0301] Veinte cuatro horas después de la dosis final, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos. Se aisló ARNm para análisis de PCR en tiempo real de hDMPK y se normalizó a 18s ARN. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3164 para medir los niveles de ARNm. Los resultados se expresan como el porcentaje medio de niveles de ARNm de hDMPK para cada grupo de tratamiento, en relación con el control de PBS.
[0302] El conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3164 (secuencia directa AGCCTGAGCCGGGAGATG, designada aquí como SEQ ID NO: 20; secuencia inversa GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT, designada aquí como SEQ ID NO: 21; secuencia de sonda AGGCCATCCGCACGGACAACCX, designada aquí como SEQ ID NO: 22).
[0303] Como se presenta en la Tabla 22 a continuación, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido reduce la expresión del transcrito hDMPK. Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 445569 y 486178 dio como resultado una reducción de los niveles de ARNm de hDMPK en ratones DMSXL.
Tabla 22
Ejemplo 14: Efecto del tratamiento ASO en la fuerza muscular en ratones DMSXL dirigidos a hDMPK
Prueba de agarre
[0304] Los ratones fueron evaluados para rendimiento de la fuerza de agarre de tipo salvaje (WT) y extremidad anterior DMSXL usando un dinamómetro de fuerza de agarre comercial, como se describe en la bibliografía ((Huguet et al., PLOS Genetics, 2012, 8(11), e1003034- e1003043).
[0305] Los ratones DMSXL recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 486178 a 25 mg/kg o ISIS 445569 a 50 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo de control de DMSXL recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. La fuerza de la extremidad anterior para cada grupo de tratamiento y el peso corporal se midieron los días 0, 30 y 60 utilizando la prueba de agarre. se determinó midiendo la diferencia de fuerza entre el día 60 y el día 0. los resultados se presentan como la fuerza de la extremidad anterior promedio de cada grupo.
[0306] Como se ilustra en la Tabla 23, a continuación, el tratamiento con hDMPK dirigido a ASO mejoró la fuerza muscular en ratones de DMSXL comparados al control sin tratar. ISIS 486178, un ASO con modificaciones de cEt, demostró una mejora sustancial en la fuerza de la extremidad anterior (+3,4) en comparación con ISIS 445569 con modificaciones de MOE (+0,38).
Tabla 23
Ejemplo 15: Efecto de tratamiento de ASO en la distribución de la fibra muscular en ratones DMSXL dirigidos a hDMPK
[0307] La distribución de la fibra muscular en ratones DMSXL dirigidos a hDMPK en presencia y ausencia de ISIS 445569 y 486178 también se evaluó. Ambos ASO se describieron previamente en la Tabla 1 anterior.
[0308] Los ratones DMSXL recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 486178 a 25 mg/kg o ISIS 445569 a 50 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo de control con DMSXL recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. Cada grupo de tratamiento constaba de 4 animales. Se evaluó la distribución de las fibras musculares y los resultados se presentan en la Tabla 44, a continuación.
[0309] Como se ilustra, el tratamiento con ASO dirigidos a hDMPK disminuyó la distribución de fibra muscular de tipo 2c asociada a DM1 en el tibial anterior (TA) de ratones DMSXL en comparación con el control sin tratar. Los resultados demostraron que el patrón normal de distribución de fibras en los músculos esqueléticos se puede restaurar con el tratamiento con ASO. ISIS 445569 demostró una mejora en la distribución de las fibras musculares en comparación con el control no tratado; sin embargo, ISIS 486178, un ASO con modificaciones de cEt, demostró una distribución de fibras musculares que era más consistente con la distribución de fibras musculares encontrada en los ratones de tipo salvaje.
Tabla 24
Ejemplo 16: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de hDMPK en ratones transgénicos DMSXL [0310] Los ASO de nuevo diseño de la Tabla 1, anteriormente, se evaluaron adicionalmente en un estudio de dosisrespuesta para inhibición antisentido de transcripción de hDMPK in vivo. ISIS 445569 se incluyó en el estudio a modo de comparación.
Tratamiento
[0311] Los ratones DMSXL se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con pienso de ratón normal Purina. Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en el centro de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en PBS y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los ASO se disolvieron en PBS al 0,9% para inyección.
[0312] Los ratones DMSXL recibieron inyecciones subcutáneas de PBS o ASO de la Tabla 1, anteriormente, la orientación hDMPK. El ASO se dosificó dos veces por semana durante 4 semanas a las dosis indicadas en la Tabla 25, a continuación. El grupo de control recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. Cada grupo de tratamiento constaba de 4 animales.
La inhibición de los niveles de hDMPK ARNm
[0313] Cuarenta y ocho horas después de la dosis final, los ratones se sacrificaron y el tejido de los músculos de tibial anterior, músculos cuádriceps (izquierda), músculos gastrocnemio, corazón y diafragma se aisló. El ARNm se aisló para el análisis de PCR en tiempo real de hDMPK y se normalizó a RIBOGREe N®. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3164 para medir los niveles de ARNm. Los resultados resumidos en la Tabla 25, a continuación,
se generaron de forma independiente a partir de varios estudios de dosis-respuesta. Los resultados se presentan como el porcentaje medio de niveles de expresión de hDMPK ARNm para cada grupo de tratamiento, en relación con el control de PBS.
[ 0 3 1 4 ] Tal como se presenta, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido reduce la expresión del transcrito hDMPK de una manera dependiente de la dosis.
T a b l a 2 5
E j e m p l o 1 7 : E s t u d i o d e t o l e r a b i l i d a d d e s e i s s e m a n a s
in vivo
e n r a t o n e s C D - 1
[ 0 3 1 5 ] Los ASO de nuevo diseño de la Tabla 1, anteriormente, fueron evaluados en un estudio de 6 semanas para evaluar plasma químico, pesos de cuerpo/órganos e histología. A grupos de ratones CD-1 se les administraron 100 mg/kg/semana de ISIS 445569 o ISIS 512497. A otros grupos de ratones CD-1 se les administraron 50 mg/kg/semana de ISIS 486178, ISIS 570808, ISIS 594292, ISIS 598768, ISIS 598769, ISIS 569473, ISIS 594300 e ISIS 598777. Después de seis semanas y dos días después de que cada grupo de ratones recibió la última dosis, los ratones se sacrificaron y se recolectaron tejidos para su análisis. Para cada grupo de ratones, se midió el análisis para medir los niveles de alanina transaminasa, los niveles de aspartato aminotransferasa, los niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN), los niveles de albúmina, la bilirrubina total y los niveles de creatina. Además, también se midieron los pesos de los órganos, cuyos resultados se presentan en las tablas siguientes.
T a b l a 2 6
T a b l a 2 7
E j e m p l o 1 8 : E s t u d i o d e t o l e r a b i l i d a d d e s e i s s e m a n a s
in vivo
e n r a t a s S p r a g u e - D a w l e y
[ 0 3 1 6 ] Los ASOs de nuevo diseño de la Tabla 1, anteriormente, fueron evaluados en un estudio de 6 semanas para evaluar química en plasma, los pesos corporales/de órganos e histología. A grupos de ratas Sprague-Dawley se les administraron 100 mpk/semana de ISIS 445569 o ISIS 512497. A otros grupos de grupos de ratas Sprague-Dawley se les administraron 50 mpk/semana de ISIS 486178, ISIS 570808, ISIS 594292, ISIS 598768, ISIS 598769, ISIS 569473, ISIS 594300 e ISIS 598777. Después de seis semanas y dos días después de que cada grupo de ratones recibió la última dosis, los ratones se sacrificaron y se recolectaron tejidos para su análisis. Para cada grupo de ratones, se midió el análisis para medir los niveles de alanina transaminasa, los niveles de aspartato aminotransferasa, los niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN), los niveles de albúmina, la bilirrubina total, los niveles de creatina y los niveles de creatina urinaria. Además, también se midieron los pesos de los órganos, cuyos resultados se presentan en las tablas siguientes.
T a b l a 2 8
(Continuación)
T a b l a 2 9
E j e m p l o 1 9 : E s t u d i o d e t r e c e ( 1 3 ) s e m a n a s
in vivo
e n m o n o s c y n o m o l g u s
[ 0 3 1 7 ] Se administraron grupos de 4 monos cynomolgus macho 40 mg/kg/semana de ISIS 445569, ISIS 512497, ISIS 486178, ISIS 570808, ISIS 594292, ISIS 598768, ISIS 598769, ISIS 569473, ISIS 594300 e ISIS 598777 mediante inyección subcutánea. Trece semanas después de la primera dosis, se sacrificaron los animales y se realizó un análisis de tejido. Se aisló ARNm para análisis de PCR en tiempo real de DMPK de mono rhesus y se normalizó a RIBOGREEN®. Se usó el conjunto de sondas de cebador RTS3164 (descrito anteriormente) para medir los niveles de ARNm y los resultados se muestran en la Tabla 30 a continuación. Además, se aisló más ARNm para el análisis de PCR en tiempo real de DMPK de mono rhesus y se normalizó a RIBOGREEN® usando el conjunto de sondas de cebadores RTS4447 y los resultados se muestran en la Tabla 31 a continuación. RTS4447 (secuencia directa AGc Ct GAGCCGGGAGATG, designada aquí como SEQ ID NO: 20; secuencia inversa GCGTAGTTGACTGGCAAAGTT, designada aquí como SEQ ID NO: 21; secuencia de sonda AGGCCATCCGCATGGCCAACC, designada aquí como SEQ ID NO: 22).
T a b l a 3 0
T a b l a 3 1
E j e m p l o 2 0 : E s t u d i o d e t o l e r a b i l i d a d d e t r e c e ( 1 3 ) s e m a n a s
in vivo
e n m o n o s c y n o m o l g u s
[ 0 3 1 8 ] A los grupos de monos cynomolgus macho se les administró 40 mg/kg de ISIS 445569, ISIS 512497, ISIS 486178, ISIS 570808, ISIS 594292, ISIS 598768, ISIS 598769, ISIS 569473, ISIS 594300 e ISIS 598777 mediante inyección subcutánea los días 1, 3, 5 y 7. Después de la administración el día 7, a cada mono se le administró 40 mg/kg/semana de ISIS 445569, ISIS 512497, ISIS 486178, ISIS 570808, ISIS 594292, ISIS 598768, ISIS 598769, ISIS 569473, ISIS 594300 e ISIS 598777 mediante inyección subcutánea.
[ 0 3 1 9 ] 48 horas después de recibir cada mono una dosis subcutánea en los días 28 y 91, se tomaron muestras de sangre y de orina para el análisis. A algunos de los monos se les extrajo sangre y orina 48 horas después de la dosis administrada el día 56. Se midieron alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) y creatina cinasa (CK) para cada animal en un grupo de tratamiento y los valores medios se presentan en la tabla siguiente. Los valores del día de la muestra con un negativo representan el punto de tiempo antes de que comenzara el tratamiento. Por ejemplo, un valor de día de tratamiento de -7 representa una muestra tomada 7 días antes de la primera dosis. Trece semanas después de la primera dosis, se sacrificaron los animales y se realizó un análisis de tejido.
T a b l a 3 2
Claims (15)
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10-30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende una porción de al menos 8 nucleobases contiguas 100% complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 1343-1368 de SEQ ID NO: 1 y/o nucleobases 8603-8619 de SEQ ID NO: 2, donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 90% complementaria a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 medido en la totalidad del oligonucleótido modificado y en donde el compuesto es capaz de inhibir la expresión de DMPK.
2. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10-30 nucleósidos enlazados en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende una porción de al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NO: 30, 25, 26, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 378, 379, 380, 381, 382, 383 y 384, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 90% complementaria a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 como se ha medido en la totalidad del oligonucleótido modificado y en donde el compuesto es capaz de inhibir la expresión de DMPK.
3. El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido monocatenario.
4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada, en donde opcionalmente la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado, en donde opcionalmente cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato.
6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde al menos un nucleósido comprende un azúcar modificado.
7. El compuesto de la reivindicación 6, en donde al menos dos nucleósidos comprenden un azúcar modificado, en donde opcionalmente cada uno de los azúcares modificados tiene la misma modificación, o al menos uno de los azúcares modificados tiene una modificación diferente.
8. El compuesto de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el azúcar modificado es un azúcar bicíclico, en donde opcionalmente el azúcar bicíclico se selecciona entre cEt, LNA, a-L-LNA, ENA y 2'-tio LNA.
9. El compuesto de la reivindicación 6, en donde el al menos un nucleósido que comprende un azúcar modificado es un nucleósido 2' sustituido, en donde opcionalmente el nucleósido 2' sustituido se selecciona entre: 2'-OCH3, 2'-F y 2'-O-metoxietilo.
10. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde
(a) el oligonucleótido modificado comprende:
i. un segmento de hueco que consiste en desoxinucleósidos enlazados;
ii. un segmento de ala 5' que consta de nucleósidos similares;
iii. un segmento de ala 3' que consta de nucleósidos enlazados;
iv. en donde el segmento de hueco se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado; y/o
(b) el oligonucleótido modificado consta de 16, 17, 18, 19 o 20 nucleósidos enlazados.
11. Un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobase como se establece en SEQ ID NO: 30, en el que el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados y comprende:
a. un segmento de hueco que consta de ocho desoxinucleósidos enlazados;
b. un segmento de ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 5' E-E-K-K; c. un segmento de ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 3' K-K-E-E; d. en el que el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3';
e. en el que cada E representa azúcar 2'-O-metoxietilo y cada K representa un azúcar cEt;
f. en el que cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato; y
g. en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
12. El compuesto de la reivindicación 2, en el que
(a) el compuesto tiene una secuencia de nucleobase como se establece en SEQ ID NO: 25, en donde el
oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados y comprende:
v. un segmento de hueco que consta de diez desoxinucleósidos enlazados;
vi. un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados;
vii. un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados;
viii. en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; ix. en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; x. en donde cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato; y
xi. en donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina; o
(b) el compuesto tiene una secuencia de nucleobase como se establece en SEQ ID NO: 26, en donde el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos enlazados y comprende:
i. un segmento de hueco que consta de ocho desoxinucleósidos enlazados;
ii. un segmento de ala 5' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 5' E-E-K-K;
iii. un segmento de ala 3' que consta de cuatro nucleósidos enlazados y que tiene un motivo de ala 3' K-K-E-E;
iv. en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; v. donde cada E representa azúcar 2'-O-metoxietilo y cada K representa un azúcar cEt; vi. en donde cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato; y
vii. en donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
13. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el compuesto es un compuesto conjugado.
14. Una composición que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
15. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una composición de la reivindicación 14 para su uso en un método de tratamiento de la distrofia miotónica de tipo 1 en un animal.
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