ES2756326T3 - Modulación de la expresión de distrofia miotónica-proteína quinasa (DMPK) - Google Patents

Modulación de la expresión de distrofia miotónica-proteína quinasa (DMPK) Download PDF

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Bruce M Wentworth
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos unidos complementarios a un no de repetición repetida de un ARN DMPK que contiene repetición CUG expandida para usar en un método de tratamiento de un animal que tiene distrofia miotónica tipo 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia de nucleobase que es al menos 90% complementaria a la SEQ ID NO: 1 y/o La SEQ ID NO: 2, medida según la totalidad de dicho oligonucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN DMPK que contiene repetición CUG expandido, activa una ribonucleasa nuclear.

Description

DESCRIPCIÓN
Modulación de la expresión de distrofia miotónica-proteína quinasa (DMPK)
Campo
[0001] Se describen aquí métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión de DMPK ARNm y proteína en un animal. Además, en el presente documento se describen métodos, compuestos y composiciones que comprenden un inhibidor de DMPk para reducir preferentemente el ARN de CMPexp DMPK, reducir la miotonía o reducir la escleopatía en un animal. Tales métodos, compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, prevenir o mejorar la distrofia miotónica tipo 1 (DM1) en un animal.
Antecedentes
[0002] Distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es la forma más común de distrofia muscular en adultos con una estimada frecuencia de 1 en 7.500 (Harper PS., Myotonic Dystrophy. Londres: WB Saunders Company; 2001). DM1 es un trastorno autosómico dominante causado por la expansión de una repetición CTG no codificante en DMPK1. DMPK1 es un gen que codifica una serina/treonina quinasa citosólica (Brook JD, et al., Cell., 1992, 68 (4): 799-808). Las funciones fisiológicas y sustratos de esta quinasa no se han determinado completamente. La repetición CTG expandida se encuentra en la región no traducida (UTR) 3' de DMPK1. Esta mutación conduce al dominio del ARN, un proceso en donde la expresión de ARN que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp) induce disfunción celular (Osborne RJ y Thornton CA., Human Molecular Genetics., 2006, 15 (2): R162-R169).
[0003] El gen DMPK normalmente tiene 5-37 repeticiones CTG en la región no traducida 3'. En la distrofia miotónica tipo I, este número se expande significativamente y está, por ejemplo, en el rango de 50 a más de 3.500 (Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, London, ed,3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol,20: 572, 2007).
[0004] El tracto CUGexp interactúa con las proteínas de unión de ARN incluyendo proteínas de tipo músculo ciego (MBNL), un empalme del factor, y hace que la transcripción mutante sea retenida en focos nucleares. La toxicidad de este ARN proviene del secuestro de proteínas de unión al ARN y la activación de las vías de señalización. Los estudios en modelos animales han demostrado que los fenotipos de DM1 pueden revertirse si se reduce la toxicidad del ARN de CUGexp (Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325 (5938): 336-339; Mulders SA, et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU.., 2009, 106 (33): 13915-13920).
[0005] En DM1, el músculo esquelético es el tejido más gravemente afectado, pero la enfermedad también tiene importantes efectos en el músculo cardíaco y liso, la lente ocular, y el cerebro. Los músculos craneales, de la extremidad distal y del diafragma se ven afectados preferentemente. La destreza manual se ve comprometida temprano, lo que causa varias décadas de discapacidad severa. La mediana de edad al morir es de 55 años, generalmente por insuficiencia respiratoria (de Die-Smulders CE, et al., Brain., 1998, 121 (Pt 8): 1557-1563).
[0006] La tecnología antisentido está emergiendo como un medio eficaz para modular la expresión de ciertos productos génicos y por lo tanto puede resultar ser únicamente útil en un número de, y aplicaciones de investigación de diagnóstico terapéutico para la modulación de DMPK1. Se demostró que la inyección intramuscular de oligonucleótidos completamente modificados dirigidos con la repetición de CAG en ratones bloquea la formación de complejos CUGexp-MBNL1, dispersa los focos nucleares de las transcripciones de CUGexp, mejora el transporte nucleocitoplasmático y la traducción de las transcripciones de CUGexp, libera proteínas MBNL al nucleoplasma, normaliza empalme alternativo de exones dependientes de MBNL y eliminar la miotonía en ratones transgénicos que expresan CUGexp (Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325 (5938): 336-339; WO2008/036406). Los oligonucleótidos antisentido complementarios a la repetición CUG expandida en ARN DMPK también se describen en el documento WO2008/018795.
[0007] En la actualidad no existe un tratamiento que puede modificar el curso de DM1. La carga de la enfermedad, por lo tanto, es significativa. Es, por lo tanto, un objeto en el presente documento proporcionar compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento de DM1.
Sumario de la invención
[0008] La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlaces complementario a una región de no repetición de un ARN DMPK que contiene repetición CUG expandida para usar en un método de tratamiento de un animal que tiene distrofia miotónica tipo 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia de nucleobase que es al menos 90% complementaria a la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 medido sobre la totalidad de dicho oligonucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN DMPK que contiene repetición CUG expandido, activa una ribonucleasa nuclear.
[0009] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, para uso en un método para tratar un animal que tiene distrofia miotónica de tipo 1.
Resumen de la divulgación
[0010] En este documento se describen métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de DMPK y tratar, prevenir, retrasar o mejorar una enfermedad relacionada con DMPK y/o un síntoma de la misma. En ciertos casos, los compuestos y composiciones inhiben DMPK mutante o DMPK CUGexp.
[0011] También se describe en el presente documento un método para reducir la expresión de DMPK en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado como se describe adicionalmente en el presente documento dirigido a DMPK.
[0012] También se describe aquí un método para reducir preferentemente CUGexp DMPK, reduciendo miotonía, o reducir spliceopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, tal como se describe adicionalmente en este documento, dirigido a CUGexp DMPK. Se cree que las transcripciones CUGexp DMPK son particularmente sensibles a la eliminación antisentido a través de ribonucleasas nucleares, debido a su mayor tiempo de residencia en el núcleo, y se cree que esta sensibilidad permite la inhibición antisentido efectiva de las transcripciones CUGexp DMPK en tejidos relevantes como el músculo a pesar de las barreras de biodistribución para la absorción de oligonucleótidos antisentido en los tejidos. Los mecanismos antisentido que no provocan la escisión a través de ribonucleasas nucleares, como los ASO de repetición de CAG descritos en, por ejemplo, Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325 (5938): 336-339 y WO2008/036406, no proporcionan la misma ventaja terapéutica.
[0013] También se describe aquí un método de tratamiento de un animal con la distrofia miotónica tipo 1. En ciertos casos, el método incluye administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado como se describe adicionalmente en este documento dirigido a DMPK. En ciertos casos, el método incluye identificar un animal con distrofia miotónica tipo 1.
[0014] También se describe aquí un método para tratar, prevenir, retrasar, o aliviar los síntomas y los resultados asociados con el desarrollo de DM1 incluyendo rigidez muscular, miotonía, la desactivación de debilidad distal, debilidad en la cara y la mandíbula músculos, dificultad para tragar, caída de la párpados (ptosis), debilidad de los músculos del cuello, debilidad en los músculos de los brazos y las piernas, dolor muscular persistente, hipersomnia, desgaste muscular, disfagia, insuficiencia respiratoria, latidos cardíacos irregulares, daño muscular del corazón, apatía, resistencia a la insulina y cataratas. También se describe en el presente documento un método para tratar, prevenir, retrasar o mejorar los síntomas y resultados asociados con el desarrollo de DM1 en niños, que incluyen retrasos en el desarrollo, problemas de aprendizaje, problemas de lenguaje y habla y problemas de desarrollo de la personalidad.
[0015] También se describe aquí un método de administración de un oligonucleótido antisentido para contrarrestar RNA dominio por la dirección de la escisión de los transcritos de patógenos.
[0016] En ciertas realizaciones, el DMPK tiene una secuencia como se establece en GenBank n° de acceso NM_001081560,1 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank NT_039413,7 truncado de los nucleótidos 16666001 a 16681000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 3). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el número de acceso de GenBank NM_032418,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank AI007148,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el número de acceso de GenBank AI304033,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el número de acceso de GenBank BC024150,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 7). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el número de acceso de GenBank BC056615,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 8). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el N° de acceso de GenBank BC075715,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 793). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank BU519245,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 794). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el número de acceso de GenBank CB247909,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 795). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el N° de acceso de GenBank CX208906,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 796). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank CX732022,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 797). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el N° de acceso de GenBank S60315,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 798). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank S60316,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 799). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank NM_001081562,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 800). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el número de acceso GenBank NM_001100,3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 801).
Descripción detallada
[0017] Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Aquí, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluido", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
[0018] Los encabezados de sección usados en este documento son sólo para fines de organización y no deben interpretarse como limitantes de la materia diana descrita.
Definiciones
[0019] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
[0020] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados: "2'-O-metoxietilo" (también de 2 '-MOe y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo de la posición 2' de un anillo de furanosilo. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
[0021] "Nucleótido 2'-O-metoxietilo" significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado 2'-O-metoxietilo.
[0022] "5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
[0023] "Acerca de" significa dentro de 7% de un valor. Por ejemplo, si se afirma que "el compuesto afectó al menos el 70% de inhibición de DMPK", se implica que los niveles de DMPk se inhiben dentro de un rango de 63% y 77%.
[0024] "Agente farmacéutico activo" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a DMPK es un agente farmacéutico activo.
[0025] "Región diana activa" o "Región diana" significa una región a la que se dirige uno o más compuestos antisentido activos. "Compuestos antisentido activos" se refiere a los compuestos antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico o los niveles de proteína diana.
[0026] "Administrado concomitantemente" se refiere a la co-administración de dos agentes de cualquier manera en donde los efectos farmacológicos de ambos se manifiestan en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una sola composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse por un período de tiempo y no necesitan ser coextensivos.
[0027] "Administración" significa proporcionar un agente a un animal, e incluye, pero no se limita a la administración por un profesional de la medicina y la auto-administración.
[0028] "Agente" significa una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. "Cebador agente" significa un compuesto terapéutico descrito en este documento. Por ejemplo, un Cebador agente puede ser un oligonucleótido antisentido dirigido a DMPK. "Segundo agente" significa un segundo compuesto terapéutico descrito en el presente documento (por ejemplo, un segundo oligonucleótido antisentido dirigido a DMPK) y/o un compuesto terapéutico no DMPK.
[0029] La "mejora" se refiere a una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la materia.
[0030] “Animal" se refiere a un humano o animal no humano, incluyendo, pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo, pero no limitado a, monos y chimpancés.
[0031] "Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un antisentido compuesto a su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína diana codificada por dicho ácido nucleico diana.
[0032] "Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar la hibridación a una diana de ácido nucleico a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNsis, ARNshs, snoARN, ARNmi y repeticiones satelitales.
[0033] "Inhibición antisentido" se refiere a la reducción de los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles diana de ácido nucleico o niveles diana de proteína en ausencia del compuesto antisentido.
[0034] "Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de una sola hebra que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación a una región correspondiente o segmento de un ácido nucleico diana.
[0035] "Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosilo modificado por el puente de dos átomos de anillo de carbono no geminal. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
[0036] El "ácido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en donde la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, formando así un sistema de anillo bicíclico.
[0037] "Estructura de tapa" o "resto de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
[0038] "Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente que otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
[0039] "Compuesto antisentido quimérico" se refiere a un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas.
[0040] "Coadministración" significa la administración de dos o más agentes a un individuo. Los dos o más agentes pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes se puede administrar a través de las mismas o diferentes vías de administración. La coadministración abarca la administración paralela o secuencial.
[0041] "Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un Cebador ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
[0042] "Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
[0043] "CUGexp DMPK" significa ARN DMPK mutante que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp). El gen DMPK de tipo salvaje tiene 5-37 repeticiones CTG en la región no traducida 3'. En un "CUGexp DMPK" (como en un paciente con distrofia miotónica tipo I) este número se expande significativamente y está, por ejemplo, en el rango de 50 a más de 3.500 (Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, Londres, ed.3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol. 20: 572, 2007).
[0044] "Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
[0045] "DMPK" significa cualquier ácido nucleico o proteína de DMPK. DMPK puede ser un DMPK mutante que incluye el ácido nucleico CUGexp d Mp K.
[0046] "Expresión DMPK" significa el nivel de ARNm transcrito a partir del gen que codifica DMPK o el nivel de proteína traducida a partir del ARNm. La expresión de DMPK puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como una transferencia Northern u Western.
[0047] "Ácido nucleico DMPK" significa cualquier codificación de ácido nucleico DMPK. Por ejemplo, un ácido nucleico de DMPK incluye una secuencia de ADN que codifica DMPK, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica DMPK (incluido el ADN genómico que comprende intrones y exones), y una secuencia de ARNm o pre-ARNm que codifica DMPK. "ARNm de DMPK" significa un ARNm que codifica una proteína DMPK.
[0048] "Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionado en una única administración, o en un determinado período de tiempo. Se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, cuando se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertos casos, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período prolongado de tiempo o de forma continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
[0049] "Cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad efectiva puede variar entre los individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
[0050] "totalmente complementario" o "100% complementario" significa cada nucleobase de una secuencia de nucleobase de un Cebador ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria de una segunda secuencia de nucleobase de un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un Cebador ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
[0051] "Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en donde una región interna tiene una pluralidad de nucleósidos que apoyan la escisión de RNasa H entre las regiones externas tiene uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. la región interna puede denominarse "segmento de separación" y las regiones externas pueden denominarse "segmentos de ala".
[0052] "Ampliado por espacio" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de espacio de 12 o más 2'-desoxirribonucleósidos contiguos colocados entre e inmediatamente adyacentes a segmentos de ala 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
[0053] "Hibridación" significa la hibridación de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana.
[0054] "La identificación de un animal con la distrofia miotónica de tipo 1" significa la identificación de un animal que ha sido diagnosticado con una distrofia miotónica, trastorno o afección tipo 1 o identificación de un animal predispuesto a desarrollar una miotónica distrofia, trastorno o afección tipo 1. Por ejemplo, los individuos con antecedentes familiares pueden estar predispuestos a la distrofia miotónica, trastorno o afección tipo 1. Dicha identificación se puede lograr mediante cualquier método, incluida la evaluación del historial médico de un individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar.
[0055] "Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
[0056] "Individual" significa un ser humano o animal no humano seleccionado para el tratamiento o terapia.
[0057] El "enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
[0058] "Nucleósidos unidos" significa nucleósidos adyacentes que están unidos o unidos entre sí por un internucleosídico de ligamiento.
[0059] "Falta de coincidencia" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en que una nucleobase de un Cebador ácido nucleico no es capaz de aparearse con la correspondiente nucleobase de un segundo ácido nucleico o diana.
[0060] El "enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleósido natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).
[0061] La "nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
[0062] "Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, modificado enlace internucleosídico o nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o una nucleobase modificada.
[0063] "Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido modificado.
[0064] "Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural.
[0065] "Motivo' significa que el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
[0066] “Miotonía” significa una relajación anormalmente lenta de una muscular después de la contracción voluntaria o estimulación eléctrica.
[0067] “Ribonucleasa nuclear” significa una ribonucleasa encontrada en el núcleo. ribonucleasas nucleares incluyen, pero no se limitan a, la RNasa H incluyendo RNasa HI y RNasa H2, el Drosha RNasa de doble hebra y otras RNasas de doble hebra.
[0068] "Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
[0069] "Resto de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
[0070] "Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender una combinación de estos elementos en una sola molécula.
[0071] Nucleobase significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
[0072] "Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier modificación de azúcar, ligamiento, o nucleobase.
[0073] "Nucleósidos" se refiere a una base nitrogenada unida a un azúcar.
[0074] "Nucleósidos miméticos" incluye aquellas estructuras utilizadas para sustituir el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente la articulación en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como por ejemplo miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar sin furanosa.
[0075] "Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
[0076] El "nucleótido mimético" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como por ejemplo ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N (H)-(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster).
[0077] "Compuesto oligomérico" o "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas con enlaces que es capaz de hibridarse con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
[0078] "Oligonucleótido" se refiere a un polímero de los nucleósidos ligados cada uno de los cuales pueden ser modificados o sin modificar, independientes uno de otro.
[0079] "Administración parenteral" significa la administración a través de inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
[0080] "Péptido" significa una molécula formada uniendo al menos dos aminoácidos por enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
[0081] "Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes activos y una solución acuosa estéril.
[0082] "Sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido de los padres y no imparten indeseados efectos toxicológicos a los mismos.
[0083] "Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace de fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno no puente con un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato es un enlace internucleósido modificado.
[0084] Por "porción" se entiende un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
[0085] "Reducción preferencial de CMP exp DMPK ARN" se refiere a una reducción preferencial de transcripciones de ARN de un alelo CMPexp DMPK en relación con transcripciones de ARN de un alelo DMPK normal.
[0086] "Prevenir" se refiere a retrasar o prevenir el inicio o desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
[0087] "Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos o condiciones.
[0088] "Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertos casos, los efectos secundarios incluyen reacciones en el lugar de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anormalidades en el sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, el aumento de los niveles de aminotransferasa en suero puede indicar toxicidad hepática o anormalidad de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de la bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anormalidad de la función hepática.
[0089] "Oligonucleótido de cadena sencilla" significa un oligonucleótido que no se hibrida con una cadena complementaria.
[0090] "Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhibe efectos mínimos o nulos en ácidos nucleicos no diana bajo condiciones en las que se desea la unión, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
[0091] "Spliceopatía" significa un cambio en el corte y empalme alternativo de uno o más ARN que conduce a la expresión de los productos de corte y empalme alterados en un tejido particular.
[0092] "Administración subcutánea" se refiere a la administración justo debajo de la piel.
[0093] El "sustituto del azúcar" se superpone con el término ligeramente más amplio "mimético de nucleósido", pero está destinado a indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en el presente documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en donde el grupo azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo.
[0094] "Orientación" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibride específicamente con un ácido nucleico diana e inducir un efecto deseado.
[0095] El "ácido nucleico diana", el "ARN diana" y el "transcrito de ARN diana" se refieren a un ácido nucleico capaz de ser blanco de compuestos antisentido.
[0096] "Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana a la que un compuesto antisentido está dirigido. "Sitio diana 5'“ se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3'“ se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana.
[0097] "Cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
[0098] "Tratar" se refiere a la administración de una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno, o afección.
[0099] "Distrofia miotónica tipo 1" o "DM1" significa un trastorno autosómico dominante causado por la expansión de una repetición CTG no codificante en DMPK. Esta mutación conduce al dominio de ARN, un proceso en donde la expresión de ARN que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp) induce disfunción celular. El tracto CUGexp interactúa con proteínas de unión a ARN y hace que la transcripción mutante se retenga en focos nucleares. La toxicidad de este ARN proviene del secuestro de proteínas de unión al ARN y la activación de las vías de señalización.
[0100] "Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases naturales, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas instancias
[0101] Se describen aquí métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de DMPK.
[0102] También se describe en el presente documento un método para reducir la expresión de DMPK en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a DMPK.
[0103] También se describe en el presente documento un método para reducir preferentemente el ARN CMPexp DMPK, reducir la miotonía o reducir la escleopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a DMPK, en donde el oligonucleótido modificado reduce preferentemente el ARN CMPexp DMPK, reduce la miotonía o reduce la spliceopatía en el animal.
[0104] También se describe en el presente documento un método para administrar un oligonucleótido antisentido para contrarrestar el dominio del ARN dirigiendo la escisión de las transcripciones patógenas.
[0105] También se describe aquí un método para reducir la spliceopatía de Sercal. En ciertos casos, los métodos descritos en este documento dan como resultado la inclusión en el exón 22. En ciertos casos, el empalme correctivo ocurre en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[0106] También se describe en el presente documento un método para reducir la spliceopatía de m-Titin. En ciertos casos, los métodos descritos en este documento dan como resultado la inclusión del exón 5. En ciertos casos, el empalme correctivo ocurre en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[0107] También se describe en el presente documento un método para reducir la spliceopatía de Clcnl. En ciertos casos, los métodos descritos en este documento dan como resultado la inclusión del exón 7a. En ciertos casos, el empalme correctivo ocurre en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[0108] También se describe en el presente documento un método para reducir la spliceopatía de Zasp. En ciertos casos, los métodos descritos aquí dan como resultado la inclusión del exón 11. En ciertos casos, el empalme correctivo ocurre en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[0109] También se describe en el presente documento un método para tratar un animal con distrofia miotónica tipo 1 que comprende: a) identificar dicho animal con distrofia miotónica tipo 1, y b) administrar a dicho animal una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a DMPK. En ciertos casos, la cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto administrado al animal reduce preferentemente el ARN de CUGexp DMPK, reduce la miotonía o reduce la escleopatía en el animal.
[0110] También se describe en el presente documento un método para lograr una reducción preferencial de ARN CMPexp DMPK, que incluye administrar al sujeto sospechoso de tener distrofia miotónica tipo 1 o tener un ARN CUGexp DMPK un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región no repetida de dicho CUGexp DMPK RNA. El oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une a dicho CUGexp DMPK RNA, logra una reducción preferencial del CUGexp DMPK RNA.
[0111] También se describe en el presente documento un método para lograr una reducción preferencial de ARN CMPexp DMPK, que incluye seleccionar un sujeto que tiene distrofia miotónica tipo 1 o que tiene un ARN CUGexp DMPK y administrar a dicho sujeto un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región no repetida de dicho CUGexp DMPK R n A . El oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN CUGexp DMPK, activa una ribonucleasa o ribonucleasa nuclear, logrando así una reducción preferencial del ARN CUGexp DMPK en el núcleo.
[0112] También se describe en el presente documento un método para lograr una reducción preferencial de ARN CMPexp DMPK, que incluye seleccionar un sujeto que tiene distrofia miotónica tipo 1 o que tiene un ARN mutante o CUGexp DMPK y administrar sistemáticamente a dicho sujeto un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región de no repetición de dicho CUGexp DMPK RNA. El oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN mutante o CUGexp DMPK, logra una reducción preferencial del ARN mutante o CUGexp DMPK.
[0113] También se describe en el presente documento un método para reducir la miotonía en un sujeto que lo necesita. El método incluye administrar al sujeto un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región no repetida de un ARN DMPK, en donde el oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN DMPK, activa una ribonucleasa o ribonucleasa nuclear, reduciendo así la miotonía. En ciertos casos, el sujeto tiene o se sospecha que tiene distrofia miotónica tipo 1 o que tiene un ARN DMPK mutante o ARN DMPK CUGexp. En ciertos casos, el ARN DMPK es retenido nuclearmente.
[0114] También se describe en el presente documento un método para reducir la escleopatía en un sujeto que lo necesite. El método incluye administrar al sujeto un oligonucleótido antisentido modificado complementario a una región no repetida de un ARN de DMPK, en donde el oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN de DMPK, activa una ribonucleasa o ribonucleasa nuclear, reduciendo así la spliceopatía. En ciertos casos, el sujeto tiene o se sospecha que tiene distrofia miotónica tipo 1 o que tiene un ARN CUGexp DMPK retenido nuclearmente. En ciertos casos, el ARN DMPK es nuclear retenido. En ciertos casos, la spliceopatía es spliceopatía dependiente de MBNL.
[0115] En ciertos casos, el oligonucleótido antisentido modificado de los métodos es quimérico. En ciertos casos, el oligonucleótido antisentido modificado de los métodos es un gapmer.
[0116] En ciertos casos de los métodos descritos aquí, la administración es subcutánea. En ciertos casos, la administración es intravenosa.
[0117] En ciertos casos, el oligonucleótido antisentido modificado de los métodos se dirige a una secuencia no codificante dentro de la región no repetida de un ARN DMPK. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido se dirige a una región codificante, un intrón, un 5'UTR o un 3'UTR del ARN mutante DMPK.
[0118] En ciertos casos de los métodos descritos aquí, la ribonucleasa nuclear es RNasa HI.
[0119] En ciertos casos de los métodos, el ARN DMPK se reduce en el tejido muscular. En ciertas realizaciones, el Ar N DMPK mutante CUGexp ARN DMPK se reduce preferentemente.
[0120] En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank NM_001081560,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 1). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank NT_01ll09,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank NT_039413,7 truncado de los nucleótidos 16666001 a 16681000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 3). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el número de acceso de GenBank NM_032418,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank AI007148,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el número de acceso de GenBank AI304033,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el número de acceso de GenBank BC024150,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 7). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el número de acceso de GenBank BC056615,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 8). En ciertas realizaciones del documento, el DMPK tiene la secuencia establecida en el número de acceso de GenBank BC075715,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 793). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank BU519245,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 794). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el número de acceso de GenBank CB247909,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 795). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el N° de acceso de GenBank CX208906,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 796). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank CX732022,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 797). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el N° de acceso de GenBank S60315,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 798). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank S60316,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 799). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia como se establece en el N° de acceso de GenBank NM_001081562,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 800). En ciertas realizaciones, el DMPK tiene la secuencia que se establece en el número de acceso GenBank NM_001100,3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 801).
[0121] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 12­ 156, 160-770 y 774-792. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 9, al menos 10, o al menos 11, nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 12-156, 160-770 y 774 -792.
[0122] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 12­ 156, 160-770 y 774-792. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 13, o al menos 14, nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID No: 12-156, 160-770 y 774-792.
[0123] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 15 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 12­ 156, 160-770 y 774-792. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 16, o al menos 17, nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 12-156, 160-770 y 774-792.
[0124] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 18 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 12­ 156, 160-770 y 774-792. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 19 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase mencionada en cualquiera de las SEQ ID NO: 12-156, 160-770 y 774-792.
[0125] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados proporcionados en el presente documento están dirigidos a cualquiera de las siguientes regiones de SEQ ID NO: 1: 1178-1206, 2159-2182, 2174-2196, 2426-2447, 2450-2518, 2679- 2704 y 2697-2725.
[0126] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados proporcionados en el presente documento están dirigidos a cualquiera de las siguientes regiones de SEQ ID NO 1: 178-223, 232-253, 279-299, 366-399, 519-541, 923­ 975, 1073-1105, 1171-1196, 1215-1246, 1263-1324, 1706-1734, 1743-1763, 1932-1979, 1981-2003, 2077-2108 y 2152-2173.
[0127] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados proporcionados aquí están dirigidos a cualquiera de los siguientes regiones de SEQ ID NO: 2: 1251-1303, 1305-1326, 1352-1372, 3762-3795, 4170-4192, 5800-5852, 6124-6149, 6168-6199, 6216-6277, 11979-12007, 12016- 12036, 12993-13042, 13044-13066, 13140-13171 y 13215­ 13236.
[0128] En ciertas realizaciones, el animal es un humano.
[0129] En ciertos casos, los compuestos o composiciones de la invención se designan como un Cebador agente y los métodos descritos aquí comprenden además administrar un segundo agente. En ciertos casos, el Cebador agente y el segundo agente se administran conjuntamente. En ciertos casos, el Cebador agente y el segundo agente se administran conjuntamente de forma secuencial o concomitante.
[0130] En ciertos casos, la administración comprende la administración parenteral.
[0131] En ciertas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido modificado monocatenario. En ciertos casos, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 95% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 3-8 y 793-801, medida en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos un 95% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-2 medida en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertos casos, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 3-8 y 793-801, medida en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-2 medida en la totalidad de dicho oligonucleótido modificado.
[0132] En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico de dicho oligonucleótido modificado es un enlace internucleósido modificado. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleósido de fosforotioato.
[0133] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido de dicho oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, al menos uno modificado de azúcar comprende un 2'-O-metoxietilo o un 4'-(CH2)n-O-2' puente, donde n es 1 o 2.
[0134] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido de dicho oligonucleótido modificado comprende un núcleo modificado 5 obase. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
[0135] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos unidos; b) un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos unidos; y c) un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos unidos. El segmento de separación se coloca entre el segmento del ala 5' y el segmento del ala 3' y cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar modificado.
[0136] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos unidos; b) un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos unidos; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos unidos. El segmento de separación se coloca entre el segmento del ala 5' y el segmento del ala 3', cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, cada enlace internucleósido de dicho oligonucleótido modificado es un enlace de fosforotioato, y cada citosina en dicho oligonucleótido modificado es una 5'-metilcitosina.
[0137] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos unidos.
[0138] También se describe en el presente documento un método para reducir preferentemente el ARN CMPexp DMPK, reducir la miotonía o reducir la escleopatía en un animal que comprende administrar al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene un segmento de separación que consta de diez desoxinucleósidos unidos, un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos unidos y un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos unidos. El segmento de separación se coloca entre el segmento del ala 5' y el segmento del ala 3', cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, cada enlace internucleósido de dicho oligonucleótido modificado es un enlace de fosforotioato, cada citosina en dicho oligonucleótido modificado es una 5'-metilcitosina.
[0139] También se describe en el presente documento el uso de cualquier compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para usar en cualquiera de los métodos terapéuticos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir la distrofia miotónica tipo 1. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para inhibir la expresión de DMPK y tratar, prevenir, retrasar o mejorar una enfermedad relacionada con DMPK y un síntoma del mismo. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para reducir la expresión de DMPK en un animal. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para reducir preferentemente CUGexp DMPK, reducir la miotonía o reducir la escleopatía en un animal. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar un animal con distrofia miotónica de tipo 1. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir, retrasar o mejorar los síntomas y resultados asociados con el desarrollo de DM1, incluyendo rigidez muscular, miotonía, incapacidad de debilidad distal, debilidad en la cara y la mandíbula músculos, dificultad para tragar, caída de los párpados (ptosis), debilidad de los músculos del cuello, debilidad en los músculos de los brazos y las piernas, dolor muscular persistente, hipersomnia, desgaste muscular, disfagia, insuficiencia respiratoria, latidos cardíacos irregulares, daño del músculo cardíaco, apatía, insulina resistencia y cataratas. También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para contrarrestar el dominio del ARN dirigiendo la escisión de las transcripciones patógenas.
[0140] También se describe en el presente documento un kit para tratar, prevenir o mejorar la distrofia miotónica de tipo 1 como se describe en el presente documento en donde el kit comprende: a) un compuesto como se describe en el presente documento; y opcionalmente b) un agente o terapia adicional como se describe en este documento. El kit puede incluir además instrucciones o una etiqueta para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar la distrofia miotónica tipo 1.
[0141] También se describe en el presente documento cualquier compuesto o composición como se describe en el presente documento, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos descritos en el presente documento. Por ejemplo, también se describe en el presente documento un compuesto o composición como se describe en el presente documento para inhibir la expresión de DMPK y tratar, prevenir, retrasar o mejorar una enfermedad relacionada con DMPK y un síntoma de la misma. También se describe en el presente documento un compuesto o composición como se describe en el presente documento para su uso en la reducción de la expresión de DMPK en un animal. También se describe en el presente documento un compuesto o composición como se describe en el presente documento para su uso en la reducción preferencial de CUGexp DMPK, reducción de la miotonía o reducción de la spliceopatía en un animal. También se describe en el presente documento un compuesto o composición como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de un animal con distrofia miotónica tipo 1. También se describe en el presente documento un compuesto o composición como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento, prevención, retraso o mejora de los síntomas y resultados asociados con el desarrollo de DM1, incluyendo rigidez muscular, miotonía, incapacidad de debilidad distal, debilidad en los músculos de la cara y la mandíbula, dificultad para tragar, caída de los párpados (ptosis), debilidad de los músculos del cuello, debilidad en los músculos de los brazos y las piernas, dolor muscular persistente, hipersomnia, desgaste muscular, disfagia, insuficiencia respiratoria, latidos cardíacos irregulares, daño del músculo cardíaco, apatía, resistencia a la insulina y cataratas. También se describe en el presente documento un compuesto o composición como se describe en el presente documento para su uso en contrarrestar el dominio del ARN dirigiendo la escisión de los transcritos patógenos. También se describen en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos que tienen una secuencia de nucleobase que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 12-156, 160-770 y 774-792.
[0142] También se describen otros compuestos que pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento.
[0143] Por ejemplo, también se describen en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 80, 12 a 50, 12 a 30, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20 nucleósidos unidos que tienen una secuencia de nucleobase que comprende 5 al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19, nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NOs: 41, 44, 76, 109, 153, 320, 321, 322, 325, 329, 335, y 657.
[0144] También se describen en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 80, 12 a 50, 12 a 30, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, o 20, nucleósidos enlaces teniendo una nucleobase secuencia que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 15, 73, 77, 79, 83, 85, 130, 602, 648, 655, 674 y 680.
[0145] También se describen en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 80, 12 a 50, 12 a 30, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20, nucleósidos unidos que tienen una secuencia de nucleobase que comprende una porción de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19, o más, nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 664-683, 773-792, 926-945, 927-946, 928­ 947, 931-950, 935-954, 941-960, 2089-2108, 2163-2182, 2490-2509, 2499-2518, 2676-2695, 2685-2704, 2676-2695, 2688-2707, 2697-2716, 2764-2783, y 2770-2789 de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleobase es complementaria a la SEQ ID NO: 1.
[0146] También se describen en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 80, 12 a 50, 12 a 30, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20, nucleósidos unidos que tienen una secuencia de nucleobase que comprende una porción de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19, o más, nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 812-831, 3629-3648, 4447-4466, 4613­ 4632, 5803-5822, 5804-5823, 5805-5824, 5808-5827, 5818-5837, 6794-6813, 12463-12482, 13152-13171 y 13553­ 13572 de SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleobase es complementaria a SEQ ID NO: 2.
[0147] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido monocatenario.
[0148] En ciertos casos, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100%, complementario a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-8 y 793-801.
[0149] En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleósido modificado.
[0150] En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleósido de fosforotioato.
[0151] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido comprende un azúcar modificado.
[0152] En ciertas realizaciones, al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico.
[0153] En ciertas realizaciones, al menos un azúcar modificado comprende un 2'-O-metoxietilo.
[0154] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada.
[0155] En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
[0156] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos unidos;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
[0157] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos unidos;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; y en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.
[0158] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 14 nucleósidos unidos.
[0159] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 16 nucleósidos unidos.
[0160] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos unidos.
Compuestos antisentido
[0161] Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, y ARNsis. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
[0162] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en el 5' a 3' dirección, comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En ciertas realizaciones de este tipo, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
[0163] En ciertos casos, un compuesto antisentido dirigido a DMPK como se describe en el presente documento tiene una longitud de 10 a 30 nucleótidos. En otras palabras, los compuestos antisentido son de 10 a 30 nucleobases unidas. En otros casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 8 a 80, 10 a 80, 12 a 30, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20 nucleobases unidas. En ciertos casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleobases unidas en longitud, o un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En ciertos casos, los compuestos antisentido de cualquiera de estas longitudes contienen al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19, nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de cualquiera de los compuestos antisentido ejemplares descritos en el presente documento (por ejemplo, al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumeradas en cualquiera de las SEQ ID NO: 12-156, 160-770 y 774-792.
[0164] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. El oligonucleótido modificado acortado o truncado puede tener un nucleósido único eliminado del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente desde el extremo 3' (truncamiento 3'). Un oligonucleótido acortado o truncado puede tener dos nucleósidos eliminados del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3'. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden ser dispersos por todo el oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
[0165] Cuando un único nucleósido adicional está presente en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional puede ubicarse en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido. Cuando están presentes dos o más nucleósidos adicionales, los nucleósidos añadidos pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (3' Además), del oligonucleótido. Alternativamente, el nucleósido agregado puede dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene un nucleósido agregado al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo 3'.
[0166] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 7305-7309, 1992), se probó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De manera similar, se logró la escisión específica del objetivo usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 desajustes.
[0167] Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desajustes con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
[0168] Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem, y un oligonucleótido antisentido de 28 y 42 nucleobase compuesto por la secuencia de dos o tres de los tándem oligonucleótidos antisentido, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobase.
Motivos de compuestos antisentido
[0169] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones o motivos, para conferir a las propiedades de compuestos antisentido tales como una mayor actividad inhibitoria, mayor afinidad de unión para un ácido nucleico diana, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
[0170] Compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente al menos una región modificada de modo que confieren un aumento en resistencia a la degradación por nucleasas, aumento de la captación celular, aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana, y/o actividad inhibidora incrementada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un ARN:dúplex de ADN.
[0171] Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos del ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden en algunas realizaciones incluir p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE, y 2'-O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n = 1 o n = 2). Preferiblemente, cada región distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo ala-espacio-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la región del ala 5', “y” representa la longitud de la región del espacio, y "Z" representa la longitud de los 3' región del ala. Como se usa en este documento, un separador descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de separación se coloca inmediatamente adyacente a cada uno de los segmentos del ala 5' y el segmento del ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala 5' y el segmento de separación, o el segmento de separación y el segmento de ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En una realización preferida, y tiene entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gapmers incluyen, entre otros, por ejemplo 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3,4-12-4, 3-14-3, 2-1,3-5, 2-16-2, 1-18-1,3-10-3, 2­ 10-2, 1-10-1,2-8-2,6-8-6, 5-8-5, 1-8 -1 o 2-6-2.
[0172] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido como un motivo "wingmer", que tiene una configuración de hueco de ala o ala de hueco, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se describió anteriormente para la configuración de gapmer. Por lo tanto, las configuraciones de wingmer incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5­ 10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 o 5-13.
[0173] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK poseen un motivo gapmer 5-10-5.
[0174] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico DMPK tiene un motivo ensanchado.
[0175] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido de cualquiera de estos motivos gapmer o wingmer contienen al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de cualquiera de los compuestos antisentido ejemplares descritos en este documento (por ejemplo, al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase enumeradas en cualquiera de las SEQ NO ID: 12-156, 160­ 770 y 774-792.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
[0176] Las secuencias de nucleótidos que codifican DMPK incluyen, sin limitación, las siguientes secuencias que se establecen en el GenBank N° de acceso NM_001081560,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 1), GenBank N° de acceso NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), GenBank N° de acceso NT_039413,7 truncado de los nucleótidos 16666001 a 16681000 (incorporado aquí como S e Q ID NO: 3), GenBank A N° de acceso NM_032418,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4), GenBank N° de acceso AI007148,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5), GenBank N° de acceso AI304033,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6), GenBank N° de acceso BC024150,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 7), GenBank N° de acceso BC056615,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 8), GenBank N° de acceso BC075715,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 793), GenBank N° de acceso BU519245,1 (incorporado aquí como SEQ ID n O : 794), GenBank N° de acceso CB247909,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 795), GenBank N° de acceso CX208906,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 796), GenBank N° de acceso CX732022,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 797), GenBank N° de acceso S60315,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 798), GenBank N° de acceso S60316,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 799), GenBank N° de acceso NM_001081562,1 (incorporado aquí como Se Q ID NO: 800), y GenBank N° de acceso NM_001100,3 (incorporado aquí en SEQ ID n O: 801). Se entiende que la secuencia establecida en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificación a un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tal, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por Número Isis (Isis N°) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.
[0177] En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar un 3' UTR, un 5' UTR, un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región de codificación, una región de inicio de traducción, una región de terminación de traducción u otra región definida de ácido nucleico. Las regiones estructuralmente definidas para DMPK se pueden obtener mediante el número de acceso a partir de bases de datos de secuencias como NCBI. En ciertas realizaciones, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la región diana 5 a un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la región diana.
[0178] La orientación incluye la determinación de al menos un segmento diana al que se hibrida un compuesto antisentido, de modo que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico diana de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
[0179] Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Múltiples segmentos diana dentro de una región diana pueden superponerse. Alternativamente, pueden no solaparse. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos que es, es, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de, aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico inicial que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' enumerados aquí.
[0180] Segmentos diana adecuados pueden encontrarse dentro de una 5' UTR, una región codificante, una 3' UTR, un intrón, un exón, o un unión exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, como el codón de inicio o el codón de detención.
[0181] La determinación de segmentos diana adecuados pueden incluir una comparación de la secuencia de un nucleico diana ácido a otras secuencias de todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridarse de una manera no específica a secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o no diana).
[0182] Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por reducción porcentual de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de DMPK son indicativas de inhibición de la expresión de la proteína DMPK. Las reducciones en los niveles de una proteína DMPK también son indicativas de inhibición de la expresión de ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos, como la reducción de la miotonía o la reducción de la spliceopatía, pueden ser indicativos de la inhibición de la expresión de proteínas y/o ARNm de DMPK.
Hibridación
[0183] En algunos casos, la hibridación ocurre entre un compuesto antisentido descrito en este documento y un ácido nucleico DMPK. El mecanismo más común de hibridación implica la unión de hidrógeno (p. ej., Watson-Crick, Hoogsteen o unión de hidrógeno de Hoogsteen invertida) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
[0184] La hibridación puede ocurrir en diferentes condiciones. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y se determinan por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridar.
[0185] Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica (Sambrooke y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico DMPK.
Complementariedad
[0186] Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse por hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico DMPK).
[0187] Un compuesto antisentido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico DMPK de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, desajuste o estructura de horquilla).
[0188] En ciertos casos, los compuestos antisentido proporcionados en este documento, o una porción especificada de los mismos, son, o son al menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementario a un ácido nucleico DMPK, una región diana, un segmento diana o una porción específica del mismo. En ciertos casos, los compuestos antisentido son al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementario a un DMPK ácido nucleico, una región diana, segmento diana o una porción especificada del mismo, y contiene al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19, nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de cualquiera de los compuestos antisentido ejemplares descritos en este documento (por ejemplo, al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase indicadas en cualquiera de las SEQ ID NO: 12-156, 160-770 y 774-792). El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando métodos de rutina, y se mide sobre la totalidad del compuesto antisentido.
[0189] Por ejemplo, un compuesto antisentido en donde 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana, y por lo tanto se hibridarían específicamente, representan el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes se pueden agrupar o intercalar con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendría 77,8% de complementariedad global con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), Utilizando la configuración predeterminada, que utiliza algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
[0190] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados aquí, o porciones especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico diana, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico DMPK, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en el presente documento, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejar bases precisas con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobase del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del Cebador y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobase puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobase del oligonucleótido de 30 nucleobase es completamente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción correspondiente de 20 nucleobase en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobase del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido completo de 30 nucleobases puede ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
[0191] La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria se encuentra en el segmento del ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
[0192] En ciertos casos, los compuestos antisentido que son, o son de hasta 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico DMPK, o una porción especificada del mismo.
[0193] En ciertos casos, compuestos antisentido que son, o son hasta 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico DMPK, o una porción especificada del mismo.
[0194] Los compuestos antisentido proporcionados en este documento también incluyen los que son complementarios a una porción de una diana de ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios de al menos un 8, al menos un 9, al menos un 10, al menos un 11, al menos un 12, al menos un 13, al menos un 14, al menos un 15, a al menos un 16, al menos un 17, al menos un 18, al menos un 19, al menos un 20, o más porciones de nucleobase de un segmento diana, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores.
Identidad
[0195] Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en el presente documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en el presente documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobase. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en el presente documento, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o dispersas en todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se compara.
[0196] En ciertos casos, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido ejemplares o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos aquí.
Modificaciones
[0197] Un nucleósido es una combinación base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura oligonucleotídica, los grupos fosfato se denominan comúnmente formando los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
[0198] Las modificaciones a los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por la diana de ácido nucleico, mayor estabilidad en presencia de nucleasas o mayor actividad inhibitoria.
[0199] Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
[0200] El enlace internucleósido natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, a menudo se seleccionan sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y aumento de estabilidad en presencia de nucleasas.
[0201] Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleósidos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y no fósforo son bien conocidos.
[0202] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleósido de fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
[0203] Los compuestos antisentido descritos en este documento pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en donde el grupo de azúcar ha sido modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir mayor estabilidad de la nucleasa, mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos grupos sustituyentes 5' y 2', puente de átomos de anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R), o C(R-i) (R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, C1-C12 alquilo o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de químicamente azúcares modificados incluyen 2'-F-5'-nucleósido sustituido con metilo (consulte la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos 5', 2'-bis sustituidos descritos) o la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de EE.UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un BNA (véase la solicitud internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
[0204] Ejemplos de grupos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos de sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 -OCH3 , 2 -OCH2CH3 , 2'-OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3 , OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-ON (Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N (Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N (R1)-(CH2)2-N (Rm) (Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.
[0205] Los ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNA) incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento incluyen uno o más nucleósidos de BNA en los que el puente comprende una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos, véase la Patente de los Estados Unidos 7,399,845, emitida el 15 de julio de 2008); 4'-(CH3) (CH3)-O-2' (y análogos de los mismos ver PCT/US2008/068922 publicada como WO/2009/006478, publicado el 8 de enero 2009); 4'-H2-N(OCH3)-2' (y análogos de los mismos ver PCT/US2008/064591 publicada como W o /2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-H2-ON (CH3)-2' (véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos US2004-0171570, publicaC2 septiembre del 2004); 4'-H2-N(R)-O-2', en donde R es H, C1-C12 alquilo, o un grupo protector (véase la patente US 7,427,672, emitida el 23 de septiembre de 2008); 4’-H2'(H) (CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4’-CH2-C(= CH2)-2' (y análogos de los mismos ver PCT/US2008/066154 publicada como WO 2008/154401, publicado el 8 diciembre de 2008).
[0206] Otros nucleósidos bicíclicos que han sido reportados en la literatura publicada (véase, por ejemplo: Srivastava et al, J.. Am Chem Soc, 2007, 129 (26) 8,362-8,379; Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; BraasCHet al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Patentes de EE.UU. Nos.: 7,399,845; 7,053,207; 7,034,133; 6,794,499; 6,770,748; 6,670,461; 6,525,191; 6,268,490; Publicaciones de Patentes de EE.UU. Nos: US2008-0039618; US2007-0287831; US2004-0171570; Solicitudes de patentes de EE.UU., Números de serie: 12/129,154; 61/099,844; 61/097,787; 61/086,231; 61/056,564; 61/026,998; 61/026,995; 60/989,574; Solicitudes internacionales WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; WO 94/14226; y Solicitudes Internacionales PCT Nos: PCT/US2008/068922; PCT/US2008/066154; y PCT/US2008/064591). Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, p-1-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
[0207] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos comprenden un puente entre los átomos de carbono 4’ y 2' del resto de azúcar pentofuranosilo que incluye, sin limitación, puentes que comprenden 1 o de 1 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra) = C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-; en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1, 2, 3 o 4; cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, heterociclo radical, heterociclo radical sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, C5-C7 radical alicíclico, C5-C7 alicíclico radical sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2 , SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-Ü1); y cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1-C12 sustituido aminoalquilo o una protección de grupo.
[0208] En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-ON(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'-en donde cada R es, independientemente, H, un protector de grupo o C1-C12 alquilo.
[0209] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-(CH2)-O-2', puede estar en la configuración a-L en la configuración p-D. Anteriormente, a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA han sido incorporados en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
[0210] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen aquellos que tienen un puente de 4' a 2' en donde dichos puentes incluyen, sin limitación, a-1-4'-(CH2)-O-2', p-D-4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', 4 -CH2-N(R)-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH2-S-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH2‘H(CH3)-2', y 4'-(CH2)3-2', en donde R es H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
[0211] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000020_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-ON(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es C1-C12 alquilo o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
[0212] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000020_0002
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tiol sustituido.
[0213] En una realización, cada uno de los grupos sustituidos es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJJd, SJc, N3 , OC(=X)Jc, y NJeC(=X) NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc.
[0214] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000021_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
[0215] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000021_0002
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido, C1-C6 alcoxilo, C1-C6 alcoxilo sustituido, acilo, sustituido acilo, C1-C6 aminoalquilo o C1-C6 aminoalquilo sustituido;
[0216] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000021_0003
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxi, C1-C12 alcoxi sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son = C(qg) (qh); qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1-C12 alquilo sustituido.
[0217] La síntesis y preparación de adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo nucleósidos bicíclicos que tienen un puente 4'-CH2-O-2', junto con su oligomerización, y propiedades de reconocimiento del ácido nucleico se han descrito (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). La síntesis de nucleósidos bicíclicos también se ha descrito en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
[0218] También se han preparado análogos de varios nucleósidos bicíclicos que tienen grupos puente de 4' a 2' tales como 4-CH2-O-2' y 4'-CH2-S-2' (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de dúplex de oligodesoxirribonucleótidos que comprenden nucleósidos bicíclicos para usar como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al., WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-BNA, un novedoso análogo de oligonucleótido de alta afinidad restringido conformacionalmente se ha descrito en la técnica (Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente sobre la estabilidad térmica de sus dúplex con hebras complementarias de ARN y ADN.
[0219] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000022_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxilo, C1-C12 alcoxilo sustituido, Oj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y qi y qj o ql y qk juntos son = C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1-C12 alquilo sustituido.
[0220] Se ha descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo alquenílico 4'-CH=CH- CH2-2 ' (Frier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).
[0221] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos que incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2 ') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-H2-O-2') BNA, (C) etileneoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4’-H2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-H2-N(R)-O-2') BNA, (F) metil (metileneoxi) (4'-H(c H3)-O-2') BNA (también denominado como acetato de constreñido o CET), (G) de metileno-tio (4'-CH2-S-2') BnA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil carbocíclico (4’-H2'H(CH3)-2’) BNA, (J) propileno carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA y (K) vinilo BNA como se muestra a continuación.
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
en donde Bx es el resto de base y R es, independientemente, H, un grupo protector, C1-C6 alquilo o C1-C6 alcoxi.
[0222] En ciertas realizaciones, los nucleósidos se modifican mediante la sustitución del anillo de ribosilo con un sustituto de azúcar. Dicha modificación incluye, sin limitación, el reemplazo del anillo de ribosilo con un sistema de anillo sustituto (a veces denominado análogos de ADN) como un anillo de morfolino, un anillo de ciclohexenilo, un anillo de ciclohexilo o un anillo de tetrahidropiranilo como uno que tiene una de las fórmulas:
Figure imgf000023_0002
[0223] En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar se seleccionan con la fórmula:
Figure imgf000023_0003
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto oligomérico o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto u oligonucleótido oligomérico y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3';
q1, q2, q3, q4 , q5 , q6 y q7 son cada uno independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, sustituido C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido; y uno de R1 y R2 es hidrógeno y el otro se selecciona de halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X) J1, OC(=X) NJ1J2 , NJ 3 C(=X) NJ1J2 y CN, en donde X es O, S o NJ 1 y cada J1, J 2 y J 3 es, independientemente, H o alquilo C1-6.
[0224] En ciertas realizaciones, q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada una H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es diferente de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2, q3, q4 , q5 , q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de THP se proporcionan en donde uno de R1 y R2 es F. En algunas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
[0225] Tales sustitutos de azúcar incluyen, pero no se limitan a, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de altritol (ANA) y ácido nucleico de manitol (MnA) (véase Leumann, CJ, Bioorg. y Med. Chem., 2002, 10, 841-854).
[0226] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, entre otros, los descritos en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud PCT publicada de propiedad común WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (6 ), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (30), 9340 -9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24 (5-7), 993-998; 5 Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33 (8 ), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Sección F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61 (6 ), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60 (9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13 (6 ), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 6 8 , 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29 (24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 6 6 , 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001,20 (4-7), 785­ 788; Wang y col., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud PCT publicada, WO 06/047842; y Solicitud PCT publicada WO 01/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la fórmula:
Figure imgf000024_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un conjugado unido grupo, o un grupo 5' o 3' terminal; y q-i, q2, q3 , q4 , q5, q6, q7, qs y q9 son cada uno, independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo, C2-C6 alquinilo sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
[0227] También se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar bicíclicos y tricíclicos en la técnica que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Christian J., Bioorg. Y Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Dichos sistemas de anillo pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
[0228] Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la materia. Algunas patentes representativas de EE.UU. que enseñan la preparación de dichos azúcares modificados incluyen, entre otras, las US: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 y 6,600,032 y la Solicitud internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
[0229] En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobase (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con una diana de ácido nucleico apropiada.
[0230] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK comprenden uno o más nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer.
Nucleobases modificadas
[0231] Las modificaciones o sustituciones de nucleobase (o base) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con nucleobases no modificadas de origen natural o sintéticas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobase, incluidas las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2°C (Sanghvi, YS, Crooke, ST y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
[0232] nucleobases no modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil ('a C'Hs) uracilo y derivados de citosina y otra alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
[0233] Los restos de base heterocíclica también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, que incluyen 2 aminopropiladenina, 5propiniluracilo y 5-propinilocitosina.
[0234] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido ensanchados dirigidos a un ácido nucleico DMPK comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
[0235] Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con una sustancia activa o inerte farmacéuticamente aceptable para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, que incluyen, entre otros, la vía de administración, el alcance de la enfermedad o la dosis a administrar.
[0236] El compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico DMPK se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se administrarán por vía parenteral. Por consiguiente, en un caso, se emplea en los métodos descritos en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico DMPK y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En realizaciones de la invención, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
[0237] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal farmacéuticamente aceptable, ésteres o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
[0238] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinden por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
[0239] Los compuestos antisentido pueden ser unidos covalentemente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, acridina, fluorosceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
[0240] Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Se incluyen en los grupos estabilizadores las estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasa, y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo 5' (5' tapa), o en el extremo 3' (3' tapa), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de tapa son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapas invertidas de desoxi abásicas. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que pueden usarse para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido
[0241] Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos DMPK se pueden probar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para tales análisis están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las células se cultivan de acuerdo con el proveedor. instrucciones utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B, hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células LLC-MK2.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
[0242] Aquí se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
[0243] En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente 60-80% con fluidez en el cultivo.
[0244] Un reactivo comúnmente utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que típicamente varía de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
[0245] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en medio sérico reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE® que generalmente varía de 2 a 12 ug/mL por 100 nM antisentido oligonucleótido.
[0246] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en medio sérico reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de Cytofectin® que generalmente varía de 2 a 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
[0247] Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye electroporación.
[0248] Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células se cosechan típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el cual los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden por métodos conocidos en la técnica y descritos aquí. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos replicados.
[0249] La concentración de oligonucleótido antisentido utilizada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE 2000®, Lipofectina o Citofectina. Los oligonucleótidos antisentido se usan en concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan mediante electroporación.
Aislamiento de ARN
[0250] El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o poli(A) ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de los niveles o expresión diana
[0251] La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico DMPK se puede analizar de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o poli(A) ARNm. Los métodos de aislamiento de a Rn son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es una rutina en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 disponible en el mercado, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de los niveles de ARN diana
[0252] La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede lograr mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
[0253] Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en la misma muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). RT, las reacciones de PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia.
[0254] Las cantidades objetivo del gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tal como ciclofilina A, o cuantificando ARN total usando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CALIFORNIA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, multiplexación, o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, LJ y col., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluoroscencia RIBOGREEN®.
[0255] Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridarse con un ácido nucleico DMPK. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software como CEBADOR EXPRESS® (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteína
[0256] La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de DMPK se puede evaluar midiendo los niveles de proteína de DMPK. Los niveles de proteína de DMPK pueden evaluarse o cuantificarse en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), análisis de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA), análisis cuantitativos de proteínas, análisis de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluoroscencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido
[0257] Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de DMPK y producir cambios fenotípicos. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades, por ejemplo, el modelo de distrofia miotónica de ratón HSA LR (DM1).
[0258] El modelo de ratón HSALR es un modelo establecido para DM1 (Mankodi, A. et al Science 289: 1769, 2000). Los ratones portan un transgen de actina esquelética humana (hACTAI) con 220 repeticiones CTG insertadas en el 3' UTR del gen. La transcripción hACTA1-CUGexp se acumula en los focos nucleares en los músculos esqueléticos y produce una miotonía similar a la del DM1 humano (Mankodi, A. et al. Mol. Cell 10: 35, 2002; Lin, X. et al. Hum. Mol. Mol. Genet. 15: 2087, 2006). Por lo tanto, se espera que la mejora de los síntomas de DM1 en el ratón HSA LR mediante la inhibición antisentido del transgen hACTA1 predeciría la mejora de síntomas similares en pacientes humanos mediante la inhibición antisentido del transcrito DMPK.
[0259] La expresión de ARN exp CUG en ratones causa una remodelación extensa del transcriptoma muscular, gran parte de la cual se reproduce por ablación de MBNL1. Por lo tanto, se espera que la normalización del transcriptoma en ratones HSA LR prediga la normalización del transcriptoma humano en pacientes con DM1 mediante la inhibición antisentido de la transcripción DMPK.
[0260] Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías parenterales de administración. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el ARN del tejido y se miden los cambios en la expresión de ácido nucleico DMPK. También se miden los cambios en los niveles de proteína DMPK.
Empalme
[0261] La distrofia miotónica (DM1) es causada por expansiones repetidas de CTG en la región no traducida 3' del gen DMPK (Brook, JD y col. Cell. 68: 799, 1992). Esta mutación conduce al dominio del ARN, un proceso en donde la expresión de ARN que contiene una repetición CUG expandida (CUGexp) induce disfunción celular (Osborne RJ y Thornton CA., Human Molecular Genetics., 2006, 15 (2): R162-R169). Tales CUGexp se retienen en los focos nucleares de los músculos esqueléticos (Davis, BM y col. Proc. Natl. Acad. Sci. e E.UU. 94: 7388, 1997). La acumulación de CUGexp en los focos nucleares conduce al secuestro de proteínas de unión a poli(CUG), tales como músculo ciego tipo 1 (MBLN1) (Miller, JW et al. EMBO J. 19: 4439, 2000). MBLN1 es un factor de empalme y regula el empalme de genes como Serca1, CIC-1, Titin y Zasp. Por lo tanto, el secuestro de MBLN1 por CUGexp desencadena un empalme alternativo mal regulado de los exones de genes que MBLN1 normalmente controla (Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006). La corrección del empalme alternativo en un animal que muestra dicha desregulación, como, por ejemplo, en un paciente con DM1 y el modelo de ratón HSALR, es un indicador útil de la eficacia de un tratamiento, incluido el tratamiento con un oligonucleótido antisentido.
Ciertos marcadores
[0262] La gravedad de DM1 en modelos de ratón está determinada, al menos en parte, por el nivel de acumulación de transcripción CUG exp en el núcleo o focos nucleares. Un marcador fisiológico útil para la severidad de DM1 es el desarrollo de corridas de alta frecuencia de potenciales de acción involuntaria (miotonía).
Ciertas indicaciones
[0263] Se describen en el presente documento métodos para tratar a un individuo que comprende administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento. En ciertos casos, el individuo tiene distrofia miotónica tipo 1 (DM1).
[0264] En consecuencia, se describen en el presente documento métodos para mejorar un síntoma asociado con la distrofia miotónica tipo 1 en un sujeto que lo necesita. También se describe un método para reducir la tasa de aparición de un síntoma asociado con la distrofia miotónica tipo 1. También se describe un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la distrofia miotónica tipo 1. En ciertas realizaciones, los síntomas asociados con DM1 incluyen rigidez muscular, miotonía, debilidad distal incapacitante, debilidad en los músculos de la cara y la mandíbula, dificultad para tragar, caída de los párpados (ptosis), debilidad de los músculos del cuello, debilidad en los músculos de los brazos y las piernas, persistente dolor muscular, hipersomnia, desgaste muscular, disfagia, insuficiencia respiratoria, latidos cardíacos irregulares, daño muscular cardíaco, apatía, resistencia a la insulina y cataratas. En los niños, los síntomas también pueden ser retrasos en el desarrollo, problemas de aprendizaje, problemas de lenguaje y habla y problemas de desarrollo de la personalidad.
[0265] En ciertos casos, los métodos comprenden administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto dirigido a un ácido nucleico DMPK.
[0266] En ciertas sustancias iónicas, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico DMPK da como resultado la reducción de la expresión de DMPK en al menos aproximadamente 15%, en al menos aproximadamente 20%, en al menos aproximadamente 25%, en al menos aproximadamente 30%, en al menos aproximadamente 35%, en al menos aproximadamente 40%, en al menos aproximadamente 45%, en al menos aproximadamente 50%, en al menos aproximadamente 55%, en al menos aproximadamente 60%, en al menos aproximadamente 65%, en al menos aproximadamente 70%, en al menos aproximadamente 75%, en al menos aproximadamente 80%, en al menos aproximadamente 85%, en al menos aproximadamente 90%, en al menos aproximadamente 95% o en al menos aproximadamente 99%, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
[0267] En ciertos casos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a DMPK se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que sufre o es susceptible a la distrofia miotónica tipo 1.
[0268] En ciertos casos, los métodos descritos en el presente documento incluyen administrar un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobases contiguas como se describe en el presente documento de una secuencia mencionada en las SEQ ID NO: 12-156, 160-770 y 774-792.
Administración
[0269] En ciertos casos, los compuestos y composiciones como se describen en este documento se administran parenteralmente.
[0270] En ciertos casos, la administración parenteral es por infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En ciertos casos, los agentes farmacéuticos infundidos se entregan con una bomba. En ciertos casos, la administración parenteral es por inyección (p. ej., inyección en bolo). La inyección puede administrarse con una jeringa.
[0271] La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
[0272] En ciertos casos, la administración es administración subcutánea, intravenosa, intracerebral, intracerebroventricular, intratecal u otra que da como resultado un efecto sistémico del oligonucleótido (la administración sistémica se caracteriza por un efecto sistémico, es decir, un efecto en más de un tejido) o administración al SNC o al LCR.
[0273] La duración de la acción medida mediante la inhibición de la actina alfa 1 y la reducción de la miotonía en el modelo de ratón HSA LR de DM1 se prolonga en el tejido muscular, incluidos los cuádriceps, el gastrocnemio y el tibial anterior (ver ejemplos, más adelante). Las inyecciones subcutáneas de oligonucleótidos antisentido durante 4 semanas dan como resultado la inhibición de la actina alfa 1 en al menos un 70% en cuádriceps, gastrocnemio y tibial anterior en ratones HSA LR durante al menos 11 semanas (77 días) después de la finalización de la dosificación. Las inyecciones subcutáneas de oligonucleótidos antisentido durante 4 semanas dan como resultado la eliminación de miotonía en cuádriceps, gastrocnemio y tibial anterior en ratones HSA LR durante al menos 11 semanas (77 días) después de la finalización de la dosificación.
[0274] En ciertos casos, el suministro de un compuesto de composición, como se describe en el presente documento, da como resultado al menos un 70% de regulación negativa de un ARNm y/o proteína diana durante al menos 77 días. En ciertos casos, el suministro de un compuesto o composición, como se describe aquí, da como resultado 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% regulación descendente de un ARNm y/o proteína diana durante al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días, al menos 70 días, al menos 75 días, al menos 76 días, al menos 77 días, al menos 78 días, al menos 79 días, al menos 80 días, al menos 85 días, al menos 90 días, al menos 95 días, al menos 100 días, al menos 105 días, al menos 110 días, al menos 115 días, al menos 120 días, al menos 1 año.
[0275] En ciertos casos, un oligonucleótido antisentido se administra mediante inyección o infusión una vez cada 77 días. En ciertos casos, un oligonucleótido antisentido se administra por inyección o infusión una vez al mes, cada dos meses, cada tres meses, cada 6 meses, dos veces al año o una vez al año.
Ciertas terapias de combinación
[0276] En ciertos casos, un Cebador agente que comprende el oligonucleótido modificado de la divulgación se administra conjuntamente con uno o más agentes secundarios. En ciertos casos, dichos segundos agentes están diseñados para tratar la misma distrofia miotónica de tipo 1 que el Cebador agente descrito aquí. En ciertos casos, dichos segundos agentes están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente como el Cebador agente descrito aquí. En ciertos casos, dichos segundos agentes están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento. En ciertos casos, los segundos agentes se administran conjuntamente con el Cebador agente para tratar un efecto no deseado del Cebador agente. En ciertos casos, los segundos agentes se administran conjuntamente con el Cebador agente para producir un efecto combinacional. En ciertos casos, los segundos agentes se administran conjuntamente con el Cebador agente para producir un efecto sinérgico.
[0277] En ciertos casos, se administran un Cebador agente y uno o más segundos agentes al mismo tiempo. En ciertos casos, el Cebador agente y uno o más segundos agentes se administran en diferentes momentos. En ciertos casos, el Cebador agente y uno o más segundos agentes se preparan juntos en una sola formulación farmacéutica. En ciertos casos, el Cebador agente y uno o más segundos agentes se preparan por separado.
EJEMPLOS
Divulgación no limitante
[0278] Si bien ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no pretenden limitarlos
Ejemplo 1: Inhibición antisentido de la quinasa de proteína de la distrofia myotonica humana (DMPK) en células del músculo esquelético humano (hSKMC)
[0279] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK humano se probaron para determinar su efecto sobre el transcrito de ARN DMPK in vitro. Se transfectaron células hSKM cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 100 nM. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de ARN DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real con el conjunto de Cebador de cebador humano RTS3164 (secuencia directa AGCCTGAGCCGGGAGATG, designada aquí como SEQ ID NO: 9; secuencia inversa GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT, designada aquí como SEQ ID NO: 10; secuencia de Cebador AGGCCATCCGCACGGACAACCX, designada aquí como SEQ ID NO: 11). Los niveles de transcripción de ARN DMPK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de hDMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0280] Los oligonucleótidos antisentido en las Tablas 1 y 2 son 5-10-5 gapmers, donde el segmento de separación comprende diez 2'-desoxinucleósidos y cada segmento de ala comprende cinco nucleósidos 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citosina en cada gapmerson 5-metilcitosinas. El 'sitio de inicio de destino' indica el nucleósido más 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido. El 'sitio de detención diana' indica el nucleósido más 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido. Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 1 se refieren a la SEQ ID NO: 1 (GENBANK N° de acceso NM_001081560,1). Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 2 se dirigen a la SEQ ID NO: 2 (el complemento del N° de acceso de GENBANK NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106).
[0281] Varios oligonucleótidos antisentido demostraron una inhibición significativa de los niveles de ARNm de DMPK humano en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 1: Inhibición del transcrito de ARN de DMPK humano en hSKMC por 5-10-5 gapmers dirigidos a la SEQ ID
NO: 1
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(continuación)
Figure imgf000031_0001
(continuación)
Figure imgf000032_0002
Tabla 2: Inhibición de la transcripción de ARN de DMPK humano en hSKMC por 5-10-5 gapmers dirigidos a la SEQ ID NO: 2
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[0282] Los oligonucleótidos antisentido de las Tablas 1 y 2 también se probaron en un ensayo con condiciones similares a las descritas anteriormente, y los niveles de ARNm medidos con la Cebador de cebador humano RTS3162 (secuencia directa CGGGCCGTCCGTGTT, designada aquí como SEQ ID NO: 157; secuencia inversa CTTTGCACTTTGCGAACCAA, designada aquí como SEQ ID NO: 158; secuencia de Cebador CATCCTCCACGCACCCCCACCX, designada aquí como SEQ ID NO: 159). Los resultados se presentan en la Tabla 3. La expresión de ARNm de DMPK también se evaluó mediante RTS3162 que se dirige al gen DMPK cerca del 3'UTR. El uso de una segunda Cebador de cebador se empleó para confirmar que la expresión del gen DMPK completo se había inhibido.
Tabla 3: Inhibición del transcrito de ARN DMPK humano en hSKMC por 5-10-5 gapmers medidos usando el conjunto de Cebador de cebador RTS3162
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Ejemplo 2: Diseño de oligonucleótidos antisentido dirigidos a repeticiones CUG
[0283] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a transcripciones de ARNm que contienen múltiples repeticiones CUG. La química de estos oligonucleótidos, así como su secuencia, se muestra en la Tabla 4. Los símbolos designados para el tipo de azúcar se muestran después de la base en el subíndice y son los siguientes: b = 2'-ON-[2-(dimetilamino)etil] acetamido ribosa; d = 2'-desoxirribosa; e = 2'-O-metoxietil ribosa; f = 2'-alfa-fluoro-2-desoxirribosa; g = 2'-O-2[2-(2-metoxietoxi)etoxi] etil ribosa; h = 3'-fluoro-HNA; k = (S)-Et; 1 = LNA (ácidos nucleicos bloqueados); n = 2'-O-(N-metilacetamida) ribosa; o = 2'-O-dimetilaminooxietil (DMAOE) ribosa; p = PNA; r = propilribosa; y x = núcleo de aminoácidos. Los nombres de heterociclo se definen con símbolos estándar para adenina, citosina, timina y guanina, 'mC' para 5-metilcitosina y 'K' para la cadena lateral de Lisina. Los enlazadores se muestran después del tipo de azúcar en el subíndice y se designan con los siguientes símbolos: g = PNA-glicina llena; a = aminoácido; y s = tioato éster.
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Ejemplo 3: inhibición antisentido dependiente de la dosis de DMPK humana en células del músculo esquelético humano
[0284] Varios de los oligonucleótidos antisentido que exhiben inhibición in vitro de DMPK en hSKMC (ver Ejemplo 1) se probaron a varias dosis. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM y 20.000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de ARNm de DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de Cebador de cebador RTS3164, descrito anteriormente. Los niveles de transcripción de ARNm de DMPK se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 5 como porcentaje de inhibición de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0285] Los oligonucleótidos antisentido probados demostraron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de DMPK en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 5: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de DMPK humana en hSKMC probados con el conjunto de Cebador de cebador RTS3164
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[0286] Los oligonucleótidos antisentido de la Tabla 5 también se probaron con el conjunto de Cebador de cebador RTS3162, se describe en lo anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 6. La expresión de ARNm de DMPK también se evaluó mediante RTS3162 que se dirige al gen DMPK cerca del 3'UTR. El uso de una segunda Cebador de cebador se empleó para confirmar que la expresión del gen DMPK completo se había inhibido.
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Tabla 7: Inh ib ic ión a n tise n tid o d e p e n d ie n te de la d o s is de D M P K h u m an a en hS K M C p robado con el con ju n to de C e b a d o r de c e b a d o r R T S 3164
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Ejemplo 5: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de DMPK humana en células del músculo esquelético humano
[0289] Se diseñaron varios oligonucleótidos antisentido para atacar el ARNm DMPK humano y se analizaron en hSKMC a diversas dosis. Varios otros oligonucleótidos antisentido se diseñaron para atacar el ARNm de actina humana y también se analizaron en hSKMC a varias dosis. Los separadores de nuevo diseño son separadores 2-10­ 2 MOE o 3-10-3 MOE. Los gapmers 2-10-2 MOE tienen 14 nucleósidos de longitud y donde el segmento gap comprende diez 2'-desoxinucleósidos y cada segmento de ala comprende dos nucleósidos 2'-MOE. Los gapmers 3­ 10-3 MOE tienen 16 nucleósidos de longitud y donde el segmento gap comprende diez 2'-desoxinucleósidos y cada segmento de ala comprende tres nucleósidos 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citosina en cada separador son 5-metilcitosinas. El 'sitio de inicio objetivo' indica el nucleósido más 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido. El 'sitio de detención diana indica el nucleósido más 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido. Los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 8 se dirigen a la secuencia genómica DMPK humana, designada aquí como SEQ ID NO: 2 (el complemento de GENBANK Access No. NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106) o la secuencia de actina humana, designada aquí como SEQ ID NO: 801 (GENBANK N° de acceso NM_001100,3).
[0290] Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM y 20.000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de ARNm de DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de Cebador de cebador RTS3162, descrito anteriormente. Los niveles de transcripción de ARNm de DMPK se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 8 como porcentaje de inhibición de DMPK, en relación con las células de control no tratadas. Los oligonucleótidos antisentido también se probaron en condiciones similares con RTS3164. Los resultados se presentan en la Tabla 9.
[0291] Muchos de los oligonucleótidos antisentido probados demostraron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de DMPK en las condiciones especificadas anteriormente.
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Tabla 9: Inh ib ic ión a n tise n tid o d e p e n d ie n te de la dos is de D M P K hum ana en hS K M C p robado con co n ju n to de C e b a d o r de c e b a d o r R T S 3164
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Ejemplo 6: Estudios de respuesta a dosis con oligonucleótidos antisentido dirigidos a distrofia humana miotonicaquinasa de proteína (DMPK) en células de fibroblastos DM1
[0292] La forma mutante del ARNm de DMPK, que alberga las repeticiones CUG grandes, se transcriben completamente y se poliadenilan, pero permanecen atrapadas en el núcleo (Davis et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94, 7388-7393). Estos ARNm mutantes con retención nuclear son una de las características patológicas más importantes de la distrofia miotónica 1 (DM1). Se estudió la inhibición antisentido del ARNm de DMPK mutante en células de fibroblastos DM1.
[0293] El gen DMPK normalmente tiene 5-37 repeticiones CTG en la región no traducida 3'. En la distrofia miotónica tipo I, este número se expande significativamente y puede estar en el rango de 50 a más de 3.500 (Harper, Distrofia miotónica (Saunders, Londres, ed. 3, 2001); Annu Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol. 20: 572, 2007). Las células de fibroblastos DM1 se sembraron en placas a una densidad de 4.500 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo de citofectina con concentraciones de 9,4 nM, 18,8 nM, 37,5 nM, 75,0 nM, 150,0 nM y 300,0 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de ARN DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de Cebador de cebador RTS3164, descrito anteriormente. Los niveles de transcripción de ARN DMPK se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 10 como porcentaje de inhibición de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0294] También se realizó un ensayo con condiciones similares con el conjunto de Cebador de cebador RTS3162, descrito anteriormente, que se dirige al extremo 3' de la transcripción DMPK. Los resultados se presentan en la Tabla 11Como porcentaje de inhibición de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0295] Los oligonucleótidos antisentido probados demostró una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm DMPK bajo las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 10: Inh ib ic ión a n tise n tid o d e p e n d ie n te de la dos is de A R N m de D M P K en cé lu la s de fib ro b la s to s DM1 con
R T S 3164
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Tabla 11: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARNm de DMPK en células de fibroblastos DM1 con
RTS3162
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Ejemplo 7: Inhibición antisentido de DMPK humana en células del músculo esquelético humano (hSKMc)
[0296] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK humano se probaron para determinar su efecto sobre el transcrito de ARN DMPK in vitro. Las hSKMc cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 10.000 nM. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de transcripción de ARN DMPK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0297] Los oligonucleótidos antisentido en las Tablas 12 y 13 son 5-10-5 gapmers, donde el segmento hueco comprende diez 2'-desoxinucleósidos y cada segmento de ala comprende cinco nucleósidos de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P = S). Todos los residuos de cytsoine a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio de destino" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen genómico humano. El "sitio de detención objetivo" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia genómica humana. Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 12 se refieren a la SEQ ID NO: 1 (GENBANK N° de acceso NM_001081560,1). Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 13 se dirigen a la SEQ ID NO: 2 (el complemento del GENBANK N° de acceso NT_011109,15 truncado de los nucleótidos 18540696 a 18555106).
[0298] Varios de los oligonucleótidos antisentido demostraron una inhibición significativa de los niveles de ARNm de DMPK en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 12: Inhibición del transcrito de ARN DMPK humano en hSKMc por 5-10-5 gapmers dirigidos a SEQ ID NO: 1
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Tabla 13: Inhibición de la transcripción de ARN DMPK humano en hSKMc por 5-10-5 gapmers que se dirigen a la
SEQ ID NO: 2
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Ejemplo 8: Inhibición antisentido de DMPK murina en hepatocitos primarios de ratón
[0299] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico DMPK murino se probaron por su efecto sobre el transcrito de ARN DMPK in vitro se transfectaron hepatocitos primarios de ratón cultivados a una densidad de 35.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 8.000 nM. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de transcripción de ARN DMPK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0300] Los oligonucleótidos antisentido en las Tablas 14, 15 y 16 son 5-10-5 gapmers, donde el segmento gap comprende diez 2'-desoxinucleósidos y cada segmento ala comprende cinco nucleósidos 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citosina en cada separador son 5-metilcitosinas. El 'sitio de inicio de destino murino' indica el nucleósido más 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen murino. El "sitio de detención de destino murino" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen murino. Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 12 objetivo SEQ ID NO: 3 (GENBANK N° de acceso NT_039413,7 truncado de los nucleótidos 16666001 a 16681000). Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 13 se refieren a la SEQ ID NO: 4 (GENBANK N° de acceso NM_032418,1). Los oligonucleótidos antisentido de la Tabla 14 ID SEQ ID NO: 5 (GENBANK N° de acceso AI007148,1), SEQ ID NO: 6 (GENBANK N° de acceso AI304033,1), SEQ ID NO: 7 (GENBANK N° de acceso BC024150,1), SEQ ID NO: 8 (GENBANK N° de acceso BC056615,1), SEQ ID NO: 793 (GENBANK N° de acceso BC075715,1), SEQ ID NO: 794 (GENBANK N° de acceso BU519245,1), SEQ ID NO: 795 (GENBANK N° de acceso CB247909,1), SEQ ID N°: 796 (GENBANK N° de acceso CX208906,1), SEQ ID NO: 797 (GENBANK N° de acceso CX732022,1), SEQ ID NO: 798 (GENBANK Access No. S60315,1), o SEQ ID NO: 799 (GENBANK Access No. S60316,1). Además, el antisentido humano oligonucleótido ISIS 451421 focalización SEQ iD NO: 800 (GENBANK N° de acceso NM_001081562,1) fue también incluido en este ensayo y se enumera en la Tabla 14.
[0301] Los oligonucleótidos murinos de las Tablas 14, 15, y 16 también pueden ser reactivos cruzados con secuencias de genes humanos. Los "desajustes" indican el número de nucleobases por las cuales el oligonucleótido murino no coincide con una secuencia del gen humano. Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido murino y la secuencia humana, es más probable que el oligonucleótido murino pueda reaccionar de forma cruzada con la secuencia humana. Los oligonucleótidos murinos en las Tablas 14, 15 y 16 se compararon con la SEQ ID NO: 800 (GENBANK N° de acceso NM_001081562,1). El "sitio de inicio de diana humana" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen humano. El "sitio de detención de la diana humana" indica el nucleósido más 3' al que el gapmer es la secuencia del gen humano diana.
[0302] Varios de los oligonucleótidos antisentido probados demostraron una inhibición significativa de los niveles de ARNm de DMPK en las condiciones especificadas anteriormente. Algunos de los oligonucleótidos antisentido probados son reactivos cruzados con secuencias de genes humanos.
Tabla 14: Inhibición del transcrito de ARN DMPK murino en hepatocitos primarios de ratón por 5-10-5 gapmers dirigidos a la SEQ ID NO: 800
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Ejemplo 9 : Inhibición antisentido dependiente de la dosis de DMPK murina en hepatocitos primarios de ratón
[0303] Varios de los oligonucleótidos antisentido que exhiben inhibición in v itro de DMPK en hepatocitos primarios de ratón (ver Ejemplo 8) se probaron a varias dosis. Las células se colocaron en placas a una densidad de 35.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 1.000 nM, 2.000 nM, 4.000 nM, 8.000 nM y 16.000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción DMPK mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de Cebador de cebador RTS3181 (secuencia directa GACATATGCCAAGATTGTGCACt Ac , designada aquí como SEQ ID NO: 771; secuencia inversa CACGAATGAGGTCCTGAGCTT, designada aquí como SEQ ID No : 772; secuencia de Cebador AACACTTGTCGCTGCCGCTGGCX, designada aquí como SEQ ID NO: 773). Los niveles de transcripción de DMPK se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 17 como porcentaje de inhibición de DMPK, en relación con las células de control no tratadas.
[0304] La mayoría de los oligonucleótidos antisentido probados demostraron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de DMPK en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 17: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de DMPK murina en hepatocitos primarios de ratón
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Ejemplo 10: Inhibición antisentido de la actina esquelética alfa 1 humana en células HepG2
[0305] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de la actina esquelética alfal humana, un gen que puede llevar una repetición CTG expandida capaz de causar síntomas de DM1 cuando se inserta en modelos de ratón, fueron probado por su efecto sobre la transcripción de ARN alfa-actina in v itro . Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 10.000 nM. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de ARN de actina alfa 1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de transcripción de ARN de actina alfa 1 se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de la actina alfa1, en relación con las células de control no tratadas.
[0306] Los oligonucleótidos antisentido de la Tabla 18 son gapmers 5-10-5, en donde el segmento de hueco comprende diez 2'-desoxinucleósidos y cada segmento de ala comprende cinco nucleósidos de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citosina en cada separador son 5-metilcitosinas. El 'sitio de inicio de destino' indica el nucleósido más 5' al que se dirige el oligonucleótido antisentido. El 'sitio de detención objetivo' indica el nucleósido más 3' al que se dirige el oligonucleótido antisentido. Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 18 SEQ iD NO: 801 (GENBANK N° de acceso NM_001100,3).
[0307] Las secuencias de oligonucleótidos antisentido probadas demostraron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de actina alfa 1 en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 18: Inhibición del transcrito de ARN de actina alfa 1 humano en células HepG2 por 5-10-5 gapmers dirigidos a
SEQ ID NO: 801
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Ejemplo 11: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de actina alfa 1 humana en células HepG2
[0308] Varios de los oligonucleótidos antisentido que exhiben inhibición in v itro de actina alfa 1 en células HepG2 (ver Ejemplo 8) se probaron a varias dosis. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 625 nM, 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM y 20.000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de ARN de actina alfa 1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de Cebador de cebador RTS3154 (secuencia directa CCACCGCAAATGCTTCTAGAC, designada aquí como SEQ ID NO: 785; secuencia inversa CCCCCCCATTGAGAAGATTC, designada aquí como SEQ ID NO: 786; secuencia de Cebador CTCCACCTCCAGCACGCGACTTCTX, designada aquí como SEQ ID NO: 787). Los niveles de transcripción de ARN de actina alfa 1 se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 19 como porcentaje de inhibición de alfa 1 actina, en relación con las células de control no tratadas.
[0309] Varios de los oligonucleótidos antisentido demostraron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de actina alfa 1 en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 19: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de la alfa 1 actina humana en células HepG2
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Ejemplo 12: Inhibición antisentido in vivo de la actina alfa 1 humana por administración intramuscular en ratones transgénicos
[0310] Para probar el efecto de la inhibición antisentido para el tratamiento de la distrofia miotónica, se requirió un modelo de ratón apropiada. El modelo de ratón HSA LR es un modelo establecido para DM1 (Mankodi, A. et al. Science. 289: 1769, 2000). Los ratones portan un transgen de actina esquelética humana (hACTA1) con 220 repeticiones CTG insertadas en el 3' UTR del gen. La transcripción hACTATUGexp se acumula en los focos nucleares en los músculos esqueléticos y produce una miotonía similar a la del DM1 humano (Mankodi, A. y col. Mol. Cell 10: 35, 2002; Lin, X. y col. Hum. Mol. Mol. Genet,15: 2087, 2006). Por lo tanto, se esperaba que la mejora de los síntomas de DM1 en el ratón HSA LR mediante la inhibición antisentido del transgén hACTA1 predeciría la mejora de síntomas similares en pacientes humanos mediante la inhibición antisentido del transcrito DMPk .
[0311] Se generaron ratones DM1 HSA (actina esquelética humana) LR (repetición larga) mediante inserción en ratones FVB/N de un transgén con 250 repeticiones CUG en la UTR 3' de actina esquelética humana. El transgen se expresa en los ratones como un ARN de repetición CUG, que se retiene en el núcleo, formando inclusiones nucleares o focos, similar al observado en muestras de tejido humano de pacientes con distrofia miotónica (DM1).
[0312] ISIS 190403 e ISIS 445238, que demostraron una inhibición dependiente de la dosis estadísticamente significativa in vitro (véase el Ejemplo 11), se evaluaron para determinar su capacidad para reducir el transcrito de ARN de actina alfa 1 humana in vivo.
Tratamiento
[0313] Los ratones HSALR se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con pienso de ratón Purina normal. Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se prepararon en PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9% para inyección.
[0314] Los ratones se dividieron en dos grupos de tratamiento. Los dos grupos recibieron inyecciones intramusculares directas de ISIS 190403 o ISIS 445238 a una dosis de 0,8 nM en el músculo tibial anterior en un lado. El músculo tibial anterior contralateral en cada ratón recibió una dosis única de inyección intramuscular de PBS. El músculo inyectado con PBS actuó como control.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[0315] Veinticuatro horas después de la dosis final, se sacrificaron los animales y se aisló el tejido de los músculos tibiales anteriores de ambos lados. El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de la actina alfa 1 y se normalizó a ARN de 18 s. Como se presenta en la Tabla 20, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo la expresión de transcripción de ARN de alfa-actina humana. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del transcrito de actina alfa1, en relación con el control PBS.
[0316] Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 190403 e ISIS 445238 resultó en la inhibición de los niveles de ARN de actina alfa 1 en los ratones.
Tabla 20: Porcentaje de inhibición de la transcripción de ARN de actina alfa 1 humana en ratones HSA LR
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Ejemplo 13: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de la actina alfa 1 humana por administración intramuscular en ratones transgénicos
[0317] ISIS 445236, que demostró una inhibición dependiente de la dosis estadísticamente significativa in vitro (ver Ejemplo 11), se evaluó su capacidad para reducir el ARN de la actina alfa 1 humana transcripción in vivo.
Tratamiento
[0318] Los ratones HSALR se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con pienso de ratón Purina normal. Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se prepararon en PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9% para inyección.
[0319] Los ratones se dividieron en tres grupos de tratamiento. Los grupos recibieron inyecciones intramusculares directas de ISIS 445236 a dosis de 0,2 nM, 0,4 nM o 0,8 nM en el músculo tibial anterior de un lado. El tibial anterior contralateral en cada ratón recibió una dosis única de inyección intramuscular de PBS. El músculo inyectado con PBS actuó como control.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[0320] Veinticuatro horas después de la dosis final, se sacrificaron los animales y se aisló tejido de los músculos tibiales anteriores de ambos lados. El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de la actina alfa 1 y se normalizó a ARN de 18 s. Como se presenta en la Tabla 21, el tratamiento con ISIS 445236 redujo la expresión del transcripto de ARN de actina alfa humana en todas las dosis. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de la transcripción de alfa 1 actina, en relación con el control.
[0321] Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 445236 dio como resultado una inhibición significativa de la alfa 1 de ARNm de actina niveles en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 21: Inhibición de la transcripción de ARN de actina alfa 1 humana por ISIS 445236 en ratones HSA LR
Figure imgf000078_0002
E v a lu a c ió n de la m io to n ía p o r e le c tro m io g ra fía
[0322] La miotonía se refiere al potencial de acción repetitiva que se debe a la relajación retardada de las fibras musculares. Este fenómeno se observa en pacientes con distrofia miotónica, así como en los ratones HSALR. Cuando la aguja EMG se inserta en un músculo miotónico, la actividad eléctrica se prolonga hasta varios segundos después de que la actividad de inserción normalmente debería cesar. La frecuencia de las descargas miotónicas varía de 50 a 100 impulsos por segundo.
[0323] La miotonía se midió mediante electromiografía y se calificó de la siguiente manera: el grado 0 se refiere a que no se produce miotonía por ninguna inserción de aguja (0%); grado 1 se refiere a la miotonia provocada por menos del 50% de inserciones de agujas; el grado 2 se refiere a miotonía provocada por más del 50% de inserciones de agujas; y el grado 3 se refiere a la mtonia provocada por inserciones de agujas al 100%.
[0324] Antes de la electromiografía, los ratones se anestesiaron usando i.p. un cóctel de 100 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilacina y 3 mg/kg de acepromacina. La electromiografía en los cuádriceps izquierdo y derecho, los músculos gastrocnemios izquierdo y derecho, los músculos tibiales anteriores izquierdo y derecho y los músculos paraespinales lumbares se realizó como se describió anteriormente (Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980) usando electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de agujas para cada músculo. Los datos se presentan en la Tabla 22 como el grado promedio de miotonía observado en cuatro ratones de cada grupo y demuestra una reducción significativa de la miotonía en ratones tratados con ISIS 445236.
Tabla 22: Reducción promedio de la miotonía en varios músculos de ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido
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C o rre cc ió n d e l e m p a lm e a lte rn a tivo
[0325] En el modelo de ratón DM1/HSALR, la acumulación del ARN CUG expandido en el núcleo conduce al secuestro de proteínas de unión a poli(CUG), tales como músculo ciego tipo 1 (Mb Ln 1) (Miller, JW et al. EMBO J. 19: 4439, 2000). El factor de empalme MBNL1, que controla el empalme alternativo del gen Serca l, está secuestrado en focos CUG expandidos. Esto desencadena la desregulación de la unión alternativa de este gen. Para evaluar el efecto de la inhibición antisentido de la actina alfa 1 humana en dicho empalme alternativo, se purificó el ARN total del músculo tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps utilizando el Mini Kit de tejido lipídico RNeasy (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La RT-PCR se realizó con el sistema SuperScript III One-Step RT-PCR y Platinum Taq Polymerase (Invitrogen), utilizando cebadores específicos de genes para la síntesis de ADNc y la amplificación por PCR. Los cebadores directos e inversos para S erca -1 se han descrito en Bennett y Swayze (Annu. Rev. Pharmacol.
2010; 50: 259-93). Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa, se tiñeron con tinción con gel de ácido nucleico SybrGreen I (Invitrogen), y se tomaron imágenes usando una caja oscura inteligente Fujifilm LAS-3000.
[0326] Los productos de PCR de empalme S e rca l en el control de PBS demostraron la exclusión del exón 22 como resultado de la desregulación de MBLN1. El tratamiento con ISIS 445236 dio como resultado en el exón 22 inclusión y normalización de corte y empalme alternativo de la S erca l gen en el tibial anterior, gastrocnemio y músculos cuádriceps.
[0327] Por lo tanto, la inhibición antisentido de la actina alfa 1 corrigió la desregulación de empalme de Serca1, lo que indica que el tratamiento con oligonucleótido antisentido redujo la acumulación de CUGexp en los focos nucleares. La acumulación reducida de CUGexp en los focos nucleares corrige el secuestro de MBLN1 permitiendo así que ocurra el empalme normal.
Figure imgf000079_0001
[ 0 3 2 8 ] Se evaluaron ISIS 190403, ISIS 445236 e ISIS 445238 por su capacidad para reducir el transcrito de ARN de actina alfal humana in vivo.
Tratamiento
[ 0 3 2 9 ] Los ratones HSALR se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con pienso de ratón Purina normal. Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se prepararon en PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9% para inyección.
[ 0 3 3 0 ] Los ratones se dividieron en cuatro grupos de tratamiento. Los primeros tres grupos recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 190403, ISIS 445236 o ISIS 445238 a una dosis de 25 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El cuarto grupo recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como el grupo de control con el que se comparó el grupo tratado con oligonucleótidos.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[ 0 3 3 1 ] Veinticuatro horas después de la dosis final, se sacrificaron los animales y se extrajo tejido de los músculos cuádriceps (izquierdo y derecho), músculos gastrocnemios (izquierdo y derecho) y músculos tibiales anteriores (izquierdo y derecho). aislado. El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de la actina alfa 1 y se normalizó a ARN de 18 s. Como se presenta en la Tabla 23, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo la expresión del transcripto de ARN de alfa-actina humana. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de la transcripción de alfa 1 actina, en relación con el control.
[ 0 3 3 2 ] Tanto ISIS 445236 como ISIS 445238 demostraron una inhibición significativa de los niveles de ARNm de alfal actina en las condiciones especificadas anteriormente.
T a b l a 2 3 : Porcentaje de inhibición del transcrito de ARN de actina alfa 1 humano en ratones HSALR
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Hibridación fluoroscente in situ de actina alfa 1 en músculos
[ 0 3 3 3 ] Se fijaron secciones de tejido muscular congelado en paraformaldehído fresco al 3% en solución de PBS durante 15-20 minutos, después de lo cual se enjuagaron dos veces con PBS durante 5 minutos. Los núcleos se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 5 minutos, después de lo cual el tejido se bloqueó con suero de CaBra normal durante 30 minutos. Las secciones se incubaron con un ARN de 2'-O-metilo dirigido a la alfa-actina que está marcada con 5'con Texas Red (Tecnologías Integradas de ADN). Las secciones se tiñeron con DAPI para marcar los núcleos. Las secciones fueron montadas y vistas con un microscopio de fluoroscencia estándar. La adquisición de imágenes se realizó mediante el software Metavue y la desconvolución se logró mediante el software Autoquant.
[ 0 3 3 4 ] Todas las secciones de tejido muscular de ratones tratados con ISIS 445236 e ISIS 445238 mostraron una intensidad fluoroscente reducida de la señal de actina alfa 1 en los focos ribonucleares, lo que indica la inhibición antisentido del ARNm de actina alfal humana y la reducción del ARN en los focos nucleares.
Evaluación de la miotonía por electromiografía
[ 0 3 3 5 ] La miotonía se refiere al potencial de acción repetitiva debido a la relajación retardada de las fibras musculares. Este fenómeno se observa en pacientes con distrofia miotónica, así como en los ratones HSALR. Cuando la aguja EMG se inserta en un músculo miotónico, la actividad eléctrica se prolonga hasta varios segundos después de que la actividad de inserción normalmente debería cesar. La frecuencia de las descargas miotónicas varía de 50 a 100 impulsos por segundo.
[ 0 3 3 6 ] La miotonía se puede medir mediante electromiografía y se clasifica de la siguiente manera: el grado 0 se refiere a que no se produce miotonía por ninguna inserción de aguja (0%); grado 1 se refiere a la miotonia provocada por menos del 50% de inserciones de agujas; el graC2 se refiere a la miotonía provocada por más del 50% de inserciones de agujas; y el grado 3 se refiere a la mtonia provocada por inserciones de agujas al 100%.
[ 0 3 3 7 ] Antes de la electromiografía, los ratones se anestesiaron utilizando i.p. 100 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilacina y 3 mg/kg de acepromacina o 250 mg/kg de 2,2,2-tribromoetanol. La electromiografía en los cuádriceps izquierdo y derecho, los músculos gastrocnemios izquierdo y derecho, los músculos tibiales anteriores izquierdo y derecho y los músculos paraespinales lumbares se realizó como se describió anteriormente (Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980) usando electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de agujas para cada músculo. Los datos se presentan en la Tabla 24 como el grado promedio de miotonía observado en cuatro ratones de cada grupo y demuestra una reducción significativa de la miotonía en ratones tratados con ISIS 445236 e ISIS 445238.
T a b l a 2 4 : Reducción promedio de la miotonía en varios músculos de ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido
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Corrección del empalme alternativo
[ 0 3 3 8 ] El factor de empalme MBNL1, que controla Sercal El empalme, el empalme de m-titina, el empalme del gen del canal de cloruro CIC-1 (C lcnl) y el empalme de Zasp, se secuestra en focos CUG expandidos. El secuestro de MBNL1 desencadena el empalme desregulado en cada uno de estos genes. Para evaluar el efecto de la inhibición antisentido de la actina alfa 1 humana en el empalme, se purificó el ARN total del músculo tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps y se realizó RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 13. Los cebadores directo e inverso para Serca-1, m-Titin, C lcnl y ZASP se han descrito en Bennett y Swayze, Annu. Rev. Pharmacol. 2010; 50: 259-93.
[ 0 3 3 9 ] En ratones HSALR tratados con PBS, el empalme sercal está desregulado como se demuestra por exclusión del exón 22. El tratamiento con cada uno de ISIS 445236 e ISIS 445238 resultó en la inclusión del exón 22 y la normalización del empalme alternativo del gen Sercal en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[ 0 3 4 0 ] En ratones HSALR tratados con PBS, el empalme de m-Titina está desregulado como se demuestra mediante la inclusión del exón 5. El tratamiento con cada uno de ISIS 445236 e ISIS 445238 dio como resultado la omisión del exón 5 y la normalización del empalme alternativo del gen m-Titin en los músculos tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps.
[ 0 3 4 1 ] En ratones HSALR tratados con PBS, el empalme de Clcn1 está desregulado como se demuestra por la inclusión del exón 7a. El tratamiento con cada uno de ISIS 445236 e ISIS 445238 dio lugar a la omisión del exón 7a y la normalización de corte y empalme alternativo de la CLCN1 gen en el tibial anterior, gastrocnemio, y los músculos cuádriceps.
[ 0 3 4 2 ] En ratones HSALR tratados con PBS, el empalme de Zasp está desregulado como se demuestra mediante la inclusión del exón 11. El tratamiento con cada uno de ISIS 445236 e ISIS 445238 dio lugar a la omisión del exón 11 y la normalización de corte y empalme alternativo de la ZASP gen en el tibial anterior, gastrocnemio, y los músculos cuádriceps.
[ 0 3 4 3 ] Por lo tanto, la inhibición antisentido de la alfa-actina corrigió la desregulación de empalme Sercal, m-Titin, Clcn1 y Zasp, lo que indica que el tratamiento con oligonucleótido antisentido redujo la acumulación de CUGexp en los focos nucleares. La reducción de la acumulación de CUGexp en los focos nucleares corrige el secuestro de MBLN1 permitiendo así que se produzca un empalme normal.
E j e m p l o 1 5 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o in vivo d e l a a c t i n a a l f a 1 h u m a n a e n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s
[ 0 3 4 4 ] Inhibición antisentido del transcrito de ARN de actina alfal humana por ISIS 445236 e ISIS 445238 en miotonía en ratones HSALR se evaluó adicionalmente.
Tratamiento
[0345] Los ratones HSALR se dividieron en tres grupos de tratamiento. Los primeros dos grupos recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 445236 o ISIS 445238 a una dosis de 25 mg/kg dos veces por semana durante 2 semanas. El tercer grupo recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como el grupo de control con el que se comparó el grupo tratado con oligonucleótidos.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[0346] Veinticuatro horas después de la dosis final, se sacrificaron los animales y se aisló tejido de los músculos cuádriceps, músculos gastrocnemios y músculos tibiales anteriores. El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de la actina alfa 1 y se normalizó a ARN de 18s. Como se presenta en la Tabla 25, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo la expresión de transcripción de ARN de alfa-actina humana. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del transcrito de actina alfa1, en relación con el control PBS.
[0347] Tanto ISIS 445236 como ISIS 445238 demostraron una inhibición significativa de los niveles de ARNm de alfa 1 actina en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 25: Porcentaje de inhibición del transcrito de ARN de actina alfa 1 humano en ratones HSALR
Figure imgf000081_0002
Evaluación de la miotonía por electromiografía
[0348] La electromiografía en los cuádriceps izquierdo y derecho, los músculos gastrocnemios izquierdo y derecho, los músculos tibial anterior izquierdo y derecho y los músculos paraespinales lumbares se realizó como se describió anteriormente (Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980) mediante el uso de electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de aguja para cada músculo. Los datos se presentan en la Tabla 26 como el grado promedio de miotonía observado en cuatro ratones de cada grupo y demuestra una reducción significativa de la miotonía en ratones tratados con ISIS 445236 e ISIS 445238.
Tabla 26: Reducción promedio de la miotonía en varios músculos de ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000081_0001
Corrección del empalme alternativo
[0349] Para evaluar el efecto de ISIS 190401 en El empalme alternativo de Sercal, el ARN total purificado del músculo gastrocnemio anterior tibial y el músculo cuádriceps se analizaron en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 13.
[0350] En ratones HSALR tratados con PBS, el empalme sercal está desregulado como se demuestra por la exclusión del exón 22, como resultado de la desregulación de MBLN1. El tratamiento con cada uno de ISIS 445236 e ISIS 445238 resultó en la inclusión casi completa y la normalización del empalme alternativo del exón 22 del gen Sercal en los músculos tibial anterior y cuádriceps.
[0351] Por lo tanto, la inhibición antisentido de la actina alfa 1 corrigió la desregulación de empalme sercal, lo que indica que el tratamiento con oligonucleótido antisentido redujo la acumulación de CUGexp en los focos nucleares. La reducción de la acumulación de CUGexp en los focos nucleares corrige el secuestro de MBLN1 permitiendo así que se produzca un empalme normal.
Ejemplo 16: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de actina alfa 1 humana en ratones transgénicos
[0353] Se evaluó la inhibición dependiente de la dosis del transcrito de ARN de actina alfa 1 humana por ISIS 445236 e ISIS 445238 sobre miotonía en ratones HSALR
Tratamiento
[0353] Los ratones HSALR fueron inyectados subcutáneamente con ISIS 445236 o ISIS 445238 a dosis de 2,5 mg/kg, 8,5 mg/kg o 25,0 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo control recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como el grupo de control con el que se comparó el grupo tratado con oligonucleótidos.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[0354] Veinticuatro horas después de la dosis final, se sacrificaron los animales y se aisló tejido de los músculos cuádriceps (Quad), músculos gastrocnemios (Gastroc) y músculos tibiales anteriores (TA). El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de alfa 1 actina y se normalizó a ARN de 18 s. Como se presenta en la Tabla 27, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo la expresión de transcripción de ARN de alfa-actina humana. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del transcrito de actina alfa1, en relación con el control PBS.
[0355] Ambos oligonucleótidos antisentido demostraron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de alfa-actina en los músculos cuádriceps, músculos gastrocnemios y músculos tibiales anteriores en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 27: Inhibición dependiente de la dosis del ARN de actina alfa 1 humano transcripción en ratones HSALR
Figure imgf000082_0002
Evaluación de la miotonía por electromiografía
[0356] La electromiografía en los cuádriceps izquierdo y derecho (Quad), los músculos gastrocnemio izquierdo y derecho (Gastroc), los músculos tibial anterior (TA) izquierdo y derecho y los músculos paraespinales lumbares se realizaron como se describió anteriormente (Kanadia et al. 2003, Science, 302: 1978-1980) mediante el uso de electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de aguja para cada músculo. Los datos se presentan en la Tabla 28 como el grado promedio de miotonía observado en cuatro ratones de cada grupo y demuestra una reducción significativa de la miotonía dependiente de la dosis en ratones tratados con ISIS 445236 e ISIS 445238.
Tabla 28: Reducción promedio de la miotonía en varios músculos de ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido
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Corrección del empalme alternativo
[0357] Para evaluar el efecto de ISIS 190401 en el empalme alternativo de Sercal, ARN total purificado del tibnecro anterior gastrocnemio y músculo cuádriceps analizado en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 13.
[0358] En ratones HSALR tratados con PBS, el empalme sercal está desregulado como lo demuestra la exclusión del e x ó n 22 , c o m o r e s u l t a d o d e la d e s r e g u l a c i ó n d e M B L N 1 . E l t r a t a m i e n t o c o n I S I S 445236 o I S I S 445238 a d o s i s d e 8 , 5 m g / k g o 25 , 0 m g / k g d o s v e c e s p o r s e m a n a ( o 17 , 0 m g / k g / s e m a n a y 50 , 0 m g / k g / s e m a n a ) d i o c o m o r e s u l t a d o la i n c l u s i ó n c o m p l e t a y la n o r m a l i z a c i ó n d e l e m p a l m e a l t e r n a t i v o d e e x ó n 2 2 d e l g e n Sercal e n l o s t r e s t i p o s m u s c u l a r e s .
[ 0359 ] P o r l o t a n t o , la i n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e la a c t i n a a l f a 1 c o r r i g i ó la d e s r e g u l a c i ó n d e e m p a l m e d e S e r c a 1 , l o q u e i n d i c a q u e e l t r a t a m i e n t o c o n o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o r e d u j o la a c u m u l a c i ó n d e C U G e x p e n l o s f o c o s n u c l e a r e s . L a r e d u c c i ó n d e la a c u m u l a c i ó n d e C U G e x p e n l o s f o c o s n u c l e a r e s c o r r i g e e l s e c u e s t r o d e M B L N 1 p e r m i t i e n d o a s í q u e s e p r o d u z c a u n e m p a l m e n o r m a l .
Figure imgf000083_0001
Tratamiento
[ 0361 ] L o s r a t o n e s H S A LR r e c i b i e r o n i n y e c c i o n e s s u b c u t á n e a s d e I S I S 190401 a u n a d o s i s d e 25 m g / k g d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 4 s e m a n a s . U n g r u p o d e c o n t r o l r e c i b i ó i n y e c c i o n e s s u b c u t á n e a s d e P B S d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 2 s e m a n a s . E l g r u p o i n y e c t a d o c o n P B S s i r v i ó c o m o e l g r u p o d e c o n t r o l c o n e l q u e s e c o m p a r ó e l g r u p o t r a t a d o c o n o l i g o n u c l e ó t i d o s .
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[ 0362 ] V e i n t i c u a t r o h o r a s d e s p u é s d e la d o s i s f i n a l , s e s a c r i f i c a r o n l o s a n i m a l e s y s e a i s l ó t e j i d o d e l o s m ú s c u l o s c u á d r i c e p s , m ú s c u l o s g a s t r o c n e m i o s y m ú s c u l o s t i b i a l e s a n t e r i o r e s . E l A R N s e a i s l ó p a r a e l a n á l i s i s p o r P C R e n t i e m p o r e a l d e la a c t i n a a l f a 1 y s e n o r m a l i z ó a A R N d e 18 s . C o m o s e p r e s e n t a e n la T a b l a 29 , e l t r a t a m i e n t o c o n o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o r e d u j o la e x p r e s i ó n d e l t r a n s c r i p t o d e A R N d e a l f a - a c t i n a h u m a n a . L o s r e s u l t a d o s s e e x p r e s a n c o m o p o r c e n t a j e d e i n h i b i c i ó n d e l t r a n s c r i t o d e a c t i n a a l f a 1 , e n r e l a c i ó n c o n e l c o n t r o l P B S .
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Evaluación de miotonía por electromiografía
Figure imgf000083_0003
T a b l a 30 : R e d u c c i ó n p r o m e d i o d e la m i o t o n í a e n v a r i o s m ú s c u l o s d e r a t o n e s H S A LR t r a t a d o s c o n o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o
Figure imgf000083_0004
Corrección del empalme alternativo
[0365] Para evaluar el efecto del ISIS 190401 en el empalme alternativo de Sercal, se analizó el ARN total purificado del tibial anterior gastrocnemio y el músculo cuádriceps en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 13.
[0366] En ratones HSALR tratados con PBS, el empalme sercal está desregulado como lo demuestra la exclusión del exón 22, como un resultado de la desregulación de MBLN1. El tratamiento con ISIS 190401 resultó en la inclusión completa y la normalización del empalme alternativo del exón 22 del gen Sercal en los tres tipos de músculos.
[0367] Por lo tanto, la inhibición antisentido de la actina alfa 1 corrigió la desregulación de empalme de Serca1, lo que indica que el tratamiento con oligonucleótido antisentido redujo la acumulación de CUGexp en los focos nucleares. La acumulación reducida de CUGexp en los focos nucleares corrige el secuestro de MBLN1 permitiendo así que ocurra el empalme normal.
Ejemplo 18: Duración de la acción de la inhibición antisentido por un oligonucleótido dirigido a la actina alfa 1 humana en ratones transgénicos
[0368] Se evaluó la duración de la acción de la inhibición antisentido del transcrito de ARN de actina alfal humana por ISIS 445236 en ratones HSALR
Tratamiento
[0369] Los ratones HSALR recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 445236 a una dosis de 25 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. Un grupo de control recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como el grupo de control con el que se comparó el grupo tratado con oligonucleótidos. Los ratones fueron analizadoS6semanas después de la administración de la última dosis.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[0370] Seis semanas después de la dosis final, se sacrificaron los animales y se aisló tejido de los músculos cuádriceps, músculos gastrocnemios y músculos tibiales anteriores. El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de la actina alfa 1 y se normalizó a ARN de 18 s. Como se presenta en la Tabla 31, el tratamiento con ISIS 445236 redujo la expresión del transcripto de ARN de actina alfa humana, y este efecto se mantuvo al menos durante 6 semanas. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del transcrito de actina alfa1, en relación con el control PBS.
[0371] El tratamiento con ISIS 445236 dio como resultado una inhibición significativa de los niveles de ARNm de alfaactina en el músculo cuádriceps, el músculo gastrocnemio y el músculo tibial anterior en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 31: Inhibición antisentido del transcrito de ARN de actina alfa 1 humano en ratones HSALR
Figure imgf000084_0001
Evaluación de miotonía por electromiografía
[0372] Se realizó electromiografía en cuádriceps izquierdo y derecho, músculos gastrocnemios izquierdo y derecho, tibial izquierdo y derecho, músculos anteriores tibiales y músculos paraespinales lumbares. Como se describió anteriormente (Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980) mediante el uso de electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de aguja para cada músculo. Los datos se presentan en la Tabla 32 como el grado promedio de miotonía observado en cuatro ratones de cada grupo y demuestra una reducción significativa de la miotonía en ratones tratados con ISIS 445236. Por lo tanto, el efecto de la inhibición antisentido de alfa actina por ISIS 445236 se mantuvo al menos durante 6 semanas.
T a b l a 3 2 : Reducción promedio de la miotonía en varios músculos de ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido
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E j e m p l o 1 9 : E f e c t o in vivo d e l a i n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e A R N m c o n r e p e t i c i o n e s C U G m e d i a n t e a d m i n i s t r a c i ó n i n t r a m u s c u l a r e n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s
[ 0 3 7 3 ] Se evaluó el efecto de la inhibición antisentido de transcripciones de ARNm que contienen múltiples repeticiones CUG sobre la miotonía en ratones HSALR Tres oligonucleótidos antisentido dirigidos a las repeticiones c Ug y con longitudes variables se analizaron para determinar su eficacia en la inhibición de la miotonía en los ratones. ISIS 444745 (AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA (SEQ ID NO: 789) es un oligonucleótido 2'-O-metoxietil uniforme, de 25 nucleótidos de longitud y con un esqueleto de fosforotioato. ISIS 444746 (AGCAGCAGCAGCAGCAGCAG (SEQ ID NO: 790-O) es un uniforme -metoxietiloligonucleótido, 20 nucleótidos de longitud y con un esqueleto de fosforotioato. ISIS 444749 (GCAGCAGCAGCAGCA (SEQ ID NO: 791) es un oligonucleótido uniforme 2'-O-metoxietil, 15Nucleótidos de longitud y con un esqueleto de fosforotioato. ISIS 445236 fue incluido en el ensayo como control positivo.
Tratamiento
[ 0 3 7 4 ] Los ratones HSALR se dividieron en tres grupos de tratamiento. Los grupos recibieron inyecciones intramusculares directas de ISIS 444745, ISIS 444746 o ISIS 444749 a una dosis de 0,4 nM en el músculo tibial anterior. el músculo tibial anterior contralateral en cada ratón recibió una dosis única de inyección intramuscular de PBS. El músculo inyectado con PBS actuó como control.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[ 0 3 7 5 ] Veinticuatro horas después de la administración final, los animales fueron sacrificados y se aisló tejido del tibial anterior (izquierdo y derecho). El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de la actina alfa 1 y se normalizó a ARN de 18 s. Como se presenta en la Tabla 33, solo el tratamiento con ISIS 444745 redujo la expresión de transcripción de ARN de actina alfa humana. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del transcrito de actina alfa1, en relación con el control PBS.
T a b l a 3 3 : Porcentaje de inhibición del transcrito de ARN de actina alfa 1 humano en ratones HSALR
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[ 0 3 7 6 ] ISIS 444745 e ISIS 444746 se evaluaron adicionalmente para determinar su capacidad. para reducir el ARNm de la actina alfa 1 humana in vivo.
Tratamiento
[ 0 3 7 7 ] Los ratones HSALR se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con pienso de ratón Purina normal. Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se prepararon en PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9% para inyección.
[ 0 3 7 8 ] Los ratones se dividieron eN6grupos de tratamiento. Tres de los grupos recibieron inyecciones intramusculares directas de ISIS 444745 a dosis de 0,2 nM, 0,5 nM o 1,0 nM en el músculo tibial anterior en un lado. Otros tres grupos dirigen inyecciones intramusculares de ISIS 444746 a dosis de 0,2 nM, 0,5 nM o 1,0 nM en el músculo tibial anterior en un lado. El músculo tibial anterior contralateral en cada ratón recibió una dosis única de inyección intramuscular de PBS. El músculo inyectado con PBS actuó como control para el músculo correspondiente tratado con el oligonucleótido ISIS.
Evaluación de la miotonía por electromiografía
[ 0 3 7 9 ] La electromiografía en los cuádriceps izquierdo y derecho, los músculos gastrocnemios izquierdo y derecho, los músculos tibiales anteriores izquierdo y derecho y los músculos paraespinales lumbares se realizó como se describió anteriormente (Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980) mediante el uso de electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de aguja para cada músculo. Los datos se presentan en la Tabla 34 como el grado promedio de miotonía observado en cuatro ratones de cada grupo y demuestra una reducción significativa de la miotonía en ratones tratados con ISIS 444745 o ISIS 444746. El efecto de la inhibición antisentido de alfa actina por ISIS 444745 y 444746 fue sostenido al menos durante 6 semanas.
T a b l a 3 4 : Reducción dependiente de la dosis de miotonia en músculos de ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido
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E j e m p l o 2 1 : E f e c t o in vivo d e l a i n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e l A R N m c o n r e p e t i c i o n e s C U G p o r a d m i n i s t r a c i ó n s u b c u t á n e a e n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s
[ 0 3 8 0 ] Se evaluó el efecto de la inhibición antisentido de las transcripciones de ARNm que contienen múltiples repeticiones CUG sobre la miotonía en ratones HSALR ISIS 445236 se incluyó en el ensayo como control positivo.
Tratamiento
[ 0 3 8 1 ] Los ratones HSALR se dividieron en cinco grupos de tratamiento. Los primeros tres grupos recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 444745, ISIS 444746 o ISIS 444749 a una dosis de 25 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El cuarto grupo recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. El quinto grupo recibió inyecciones subcutáneas de ISIS 445236 a una dosis de 25 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como el grupo de control al que se comparó el grupo tratado con oligonucleótidos.
Evaluación de la miotonía por electromiografía
[ 0 3 8 2 ] La electromiografía en los cuádriceps izquierdo y derecho, los músculos gastrocnemios izquierdo y derecho, los músculos tibiales anteriores izquierdo y derecho y los músculos paraespinales lumbares se realizó como se describió previamente (Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980) mediante el uso de electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de aguja para cada músculo. Los datos se presentan en la Tabla 35 como el grado promedio de miotonía observado en cuatro ratones de cada grupo.
[ 0 3 8 3 ] El tratamiento con ISIS 445236 condujo a una reducción significativa en la miotonía. El tratamiento con ISIS 444745 e ISIS 444746 también dio como resultado una reducción de la miotonía en algunos de los tejidos analizados.
T a b l a 3 5 : Reducción promedio de la miotonía en varios músculos de ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido
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[ 0 3 8 4 ] la inhibición dependiente de la dosis de transcritos de ARNm que contienen una repetición larga CUG (ratones HSALR) y una repetición CUG corta (ratones HSASR) se evaluó. Los ratones de repetición corta HSA (HSASR) expresan el transgen idéntico que los ratones HSALR, excepto que se insertan 5 repeticiones en lugar de 250 CUG en la 3' UTR. Los ratones HSASR no tienen miotonía, cambios de empalme ni ningún otro fenotipo de miotonía observable. Se usó ISIS 445236 en este ensayo.
Tratamiento
[ 0 3 8 5 ] Los ratones HSALR se dividieron en cuatro grupos de tratamiento. Los primeros tres grupos recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 445236 a dosis de 2,5 mg/kg, 8,5 mg/kg o 25,0 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El cuarto grupo recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como el grupo de control con el que se comparó el grupo tratado con oligonucleótidos. Los ratones HSASR también se dividieron en cuatro grupos y se trataron de manera similar.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[ 0 3 8 6 ] Veinticuatro horas después de la dosis final, se sacrificaron los animales y se extrajo tejido de los músculos cuádriceps (izquierdo y derecho), músculos gastrocnemios (izquierdo y derecho) y músculos tibiales anteriores (izquierdo y derecho) se aisló. El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de la actina alfa 1 y se normalizó a ARN de 18s. Los resultados se presentan en las Tablas 36 y 37 y se expresan como porcentaje de inhibición de la transcripción de actina alfa1, en relación con el control. Se logró una mayor inhibición de la repetición larga retenida nuclearmente en el músculo de los ratones HSALR en comparación con la repetición corta no retenida nuclearmente en el músculo de los ratones HSASR.
T a b l a 3 6 : Porcentaje de inhibición del transcrito de ARN de actina alfa 1 humano en ratones HSALR
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T a b l a 3 7 : Porcentaje de inhibición del transcrito de ARN de actina alfa 1 humano en ratones HSA SR
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E j e m p l o 2 3 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o in vivo d e D M P K h u m a n a e n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s
[ 0 3 8 7 ] Los ratones LC15, Línea A, son ratones transgénicos que contienen la DMPK 3'UTR humana completa (desarrollada por Wheeler et al, Universidad de Rochester). Los ratones son la segunda generación de ratones retrocruzados a un fondo FVB. El transgen se expresa en los ratones como un ARN de repetición CUG, que se retiene en el núcleo, formando inclusiones nucleares o focos, similar al observado en muestras de tejido humano de pacientes con distrofia miotónica (DM1). Hay 350-400 repeticiones CUG en el transgen DMPK. Estos ratones muestran signos
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Tratamiento
[ 0 3 8 8 ] L C 1 5 , l o s r a t o n e s L í n e a A s e m a n t u v i e r o n e n u n 12 h o r a s d e l u z / o s c u r i d a d c i c l o y a l i m e n t a d o s ad libitum d e p i e n s o n o r m a l d e r a t ó n P u r i n a . L o s a n i m a l e s s e a c l i m a t a r o n d u r a n t e a l m e n o s 7 d í a s e n l a s i n s t a l a c i o n e s d e i n v e s t i g a c i ó n a n t e s d e l i n i c i o d e l e x p e r i m e n t o . L o s o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o ( A S O ) s e p r e p a r a r o n e n P B S y s e e s t e r i l i z a r o n p o r f i l t r a c i ó n a t r a v é s d e u n f i l t r o d e 0 , 2 m i c r a s . L o s o l i g o n u c l e ó t i d o s s e d i s o l v i e r o n e n P B S a l 0 , 9 % p a r a i n y e c c i ó n .
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Inhibición del ARN DMPK
[ 0390 ] V e i n t i c u a t r o h o r a s d e s p u é s d e la d o s i s f i n a l , s e s a c r i f i c a r o n l o s a n i m a l e s y s e a i s l ó e l t e j i d o d e l o s m ú s c u l o s c u á d r i c e p s . E l A R N s e a i s l ó p a r a e l a n á l i s i s p o r P C R e n t i e m p o r e a l d e D M P K y s e n o r m a l i z ó a A R N d e 18 s . C o m o s e p r e s e n t a e n la T a b l a 38 , e l t r a t a m i e n t o c o n o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o r e d u j o la e x p r e s i ó n d e l t r a n s c r i t o d e A R N D M P K h u m a n o . L o s r e s u l t a d o s s e e x p r e s a n c o m o p o r c e n t a j e d e i n h i b i c i ó n d e la t r a n s c r i p c i ó n D M P K , e n r e l a c i ó n c o n e l c o n t r o l P B S .
T a b l a 38 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e l t r a n s c r i t o d e A R N D M P K h u m a n o e n r a t o n e s L C 15
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Evaluación de la miotonía por electromiografía
[ 0391 ] L a e l e c t r o m i o g r a f í a e n l o s c u á d r i c e p s i z q u i e r d o y d e r e c h o , l o s m ú s c u l o s g a s t r o c n e m i o s i z q u i e r d o y d e r e c h o , l o s m ú s c u l o s t i b i a l a n t e r i o r i z q u i e r d o y d e r e c h o y l o s m ú s c u l o s p a r a e s p i n a l e s l u m b a r e s s e r e a l i z ó c o m o s e d e s c r i b i ó p r e v i a m e n t e ( K a n a d i a e t a l , 2003 , S c i e n c e , 302 : 1978 - 1980 ) m e d i a n t e e l u s o d e e l e c t r o d o s d e a g u j a c o n c é n t r i c o s d e c a l i b r e 30 y u n m í n i m o d e 10 i n s e r c i o n e s d e a g u j a p a r a c a d a m ú s c u l o . D a d o q u e l o s r a t o n e s L C 15 n o t i e n e n m i o t o n í a , n i e l g r u p o d e c o n t r o l n i l o s g r u p o s d e t r a t a m i e n t o m o s t r a r o n m i o t o n í a e n n i n g ú n m ú s c u l o p r o b a d o .
E j e m p l o 2 4 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o in vivo d e D M P K h u m a n a e n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s
[ 0392 ] L o s r a t o n e s L C 15 , L í n e a D , s o n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s q u e c o n t i e n e n la D M P K 3 'U T R h u m a n a c o m p l e t a ( d e s a r r o l l a d a p o r W h e e l e r e t a l , U n i v e r s i d a d d e R o c h e s t e r ) . L o s r a t o n e s s o n la t e r c e r a g e n e r a c i ó n d e r a t o n e s r e t r o c r u z a d o s a u n f o n d o F V B . E l t r a n s g e n s e e x p r e s a e n lo s r a t o n e s c o m o u n A R N d e r e p e t i c i ó n C U G , q u e s e r e t i e n e e n e l n ú c l e o , f o r m a n d o i n c l u s i o n e s n u c l e a r e s o f o c o s , s i m i l a r a l o b s e r v a d o e n m u e s t r a s d e t e j i d o h u m a n o d e p a c i e n t e s c o n d i s t r o f i a m i o t ó n i c a ( D M 1 ) . H a y 350 - 400 r e p e t i c i o n e s C U G e n e l t r a n s g e n D M P K . E s t o s r a t o n e s m u e s t r a n s i g n o s t e m p r a n o s d e D M 1 y n o m u e s t r a n n i n g u n a m i o t o n í a e n s u s t e j i d o s m u s c u l a r e s .
Figure imgf000088_0003
Tratamiento
[ 0 3 9 4 ] L o s r a t o n e s L C 1 5 , L i n e D s e m a n t u v i e r o n e n u n c i c l o d e l u z / o s c u r i d a d d e 12 h o r a s y s e a l i m e n t a r o n ad libitum con c o m i d a n o r m a l p a r a r a t o n e s P u r i n a . L o s a n i m a l e s s e a c l i m a t a r o n d u r a n t e a l m e n o s 7 d í a s e n l a s i n s t a l a c i o n e s d e i n v e s t i g a c i ó n a n t e s d e l i n i c i o d e l e x p e r i m e n t o . L o s o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o ( A S O ) s e p r e p a r a r o n e n P B S y s e e s t e r i l i z a r o n p o r f i l t r a c i ó n a t r a v é s d e u n f i l t r o d e 0 , 2 m i c r a s . L o s o l i g o n u c l e ó t i d o s s e d i s o l v i e r o n e n P B S a l 0 , 9 % p a r a i n y e c c i ó n .
[ 0395 ] L o s r a t o n e s s e d i v i d i e r o n e n s e i s g r u p o s d e t r a t a m i e n t o . L o s p r i m e r o s t r e s g r u p o s r e c i b i e r o n i n y e c c i o n e s subcutáneas de ISIS 445569, ISIS 444404 o ISIS 444436 a una dosis de 25,00 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El cuarto grupo recibió inyecciones subcutáneas de ISIS 473810 a una dosis de 12,50 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El quinto grupo recibió inyecciones subcutáneas de ISIS 473810 a una dosis de 6,25 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. El sexto grupo recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como el grupo de control con el que se comparó el grupo tratado con oligonucleótidos.
Inhibición del ARN DMPK
[0396] Veinticuatro horas después de la dosis final, los animales fueron sacrificados y se aisló el tejido de los músculos cuádriceps. El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de DMPK y se normalizó a a Rn de 18s. Como se presenta en la Tabla 39, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo la expresión del transcrito de ARN DMPK humano. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de la transcripción DMPK, en relación con el control PBS.
[0397] Los resultados indican que el tratamiento con los oligonucleótidos antisentido dio como resultado la inhibición de DMPK ARNm en los ratones.
Tabla 39: Inhibición antisentido del transcrito de ARN DMPK humano en ratones LC15
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Evaluación de la miotonía por electromiografía
[ 0 3 9 8 ] La electromiografía en los cuádriceps izquierdo y derecho, los músculos gastrocnemios izquierdo y derecho, los músculos tibiales anteriores izquierdo y derecho y los músculos paraespinales lumbares se realizó como se describió anteriormente (Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980) mediante el uso de electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de aguja para cada músculo. Dado que los ratones LC15 no tienen miotonía, ni el grupo de control ni los grupos de tratamiento mostraron miotonía en ningún músculo probado.
E j e m p l o 2 5 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o in vivo d e D M P K h u m a n a e n e l m o d e l o d e r a t ó n t r a n s g é n i c o S X L
[ 0 3 9 9 ] Utilizando ASOs 444401 y 299471 dirigidos a hDMPK en el músculo sóleo se midió en ratones SXL. El ratón SXL es transgénico para todo el gen DMPK y el promotor y contiene una secuencia de repetición de 1000 CUG en el 3'UTR del gen DMPK. Los ratones recibieron una dosis de 50 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas (n = 3 ratones por grupo, excepto n = 2 para los controles inyectados con solución salina). Los resultados de los ensayos Taqman demostraron que el tratamiento con ISISI 444401 o ISIS 299471 redujo significativamente los niveles de ARNm de mut-hDMPK pero tuvo un efecto insignificante sobre los niveles de ARNm de Dmpk de ratón endógeno.
[ 0 4 0 0 ] Por lo tanto, ISIS 444401 e ISIS 299471 se dirigen selectivamente a la transcripción de ARNm DMPK humano.
E j e m p l o 26 : D u r a c i ó n d e l a a c c i ó n d e l a i n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o p o r u n o l i g o n u c l e ó t i d o d i r i g i d o a l a a c t i n a a l f a 1 h u m a n a e n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s
[ 0 4 0 1 ] Se evaluó la duración de la acción de la inhibición antisentido del transcrito de ARN de actina alfal humana por ISIS 190401 en ratones HSALR.
Tratamiento
[ 0 4 0 2 ] Los ratones HSALR recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 190401 a una dosis de 25 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. Un grupo de control recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como el grupo de control con el que se comparó el grupo tratado con oligonucleótidos. Los ratones fueron analizados 15 semanas después de la administración de la última dosis.
Inhibición del ARN de actina alfa 1
[ 0 4 0 3 ] Quince semanas después de la dosis final, se sacrificaron los animales y se aisló tejido de los músculos cuádriceps, músculos gastrocnemios y músculos tibiales anteriores. El ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real de la actina alfa 1 y se normalizó a ARN de 18 s. Como se presenta en la Tabla 40, el tratamiento con ISIS 190401 redujo la expresión del transcripto de ARN de actina alfa humana, y este efecto se mantuvo al menos durante 15 semanas. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del transcrito de actina alfa1, en relación con el control PBS.
[0404] El tratamiento con ISIS 190401 dio como resultado una inhibición significativa de los niveles de ARNm de alfal actina en las condiciones especificadas anteriormente.
Tabla 40: Inhibición antisentido del transcrito de ARN de actina alfa 1 humano en ratones HSALR
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Evaluación de la miotonía por electromiografía
[0405] La electromiografía en los cuádriceps izquierdo y derecho, los músculos gastrocnemios izquierdo y derecho, los músculos tibial anterior izquierdo y derecho y los músculos paraespinales lumbares se realizó como se describió previamente (Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980) mediante el uso de electrodos de aguja concéntricos de calibre 30 y un mínimo de 10 inserciones de aguja para cada músculo. Los datos se presentan en la Tabla 41 como el grado de miotonía promedio observado en cuatro ratones de cada grupo y demuestra una reducción significativa de la miotonía en ratones tratados con ISIS 190401. Por lo tanto, el efecto de la inhibición antisentido de alfa actina por ISIS 190401 se mantuvo al menos durante 15 semanas.
Tabla 41: Reducción promedio de la miotonía en varios músculos de ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido
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Corrección del empalme alternativo
[0406] Para evaluar el efecto de ISIS 190401 sobre el empalme alternativo de Sercal, ARN total purificado del tibnecro anterior gastrocnemio y músculo cuádriceps analizado en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 13.
[0407] En ratones HSALR tratados con PBS, el empalme sercal está desregulado como se demuestra por exclusión del exón 22. El tratamiento con ISIS 190401 resultó en la inclusión completa y la normalización del empalme alternativo del exón 22 del gen Sercal en los tres tipos de músculos, que se mantuvo incluso después de 15 semanas.
[0408] Por lo tanto, la inhibición antisentido de la actina alfa 1 corrigió la desregulación de empalme de Sercal, lo que indica que el tratamiento con oligonucleótido antisentido redujo la acumulación de CUGexp en los focos nucleares. La acumulación reducida de CUGexp en los focos nucleares corrige el secuestro de MBLN1 permitiendo así que ocurra el empalme normal.
Ejemplo 27: Análisis de micromatrices del efecto transcriptómico de la inhibición antisentido de la actina humana
[0409] La expresión de ARNm de actina con repeticiones CUG expandidas provoca una remodelación extensa del transcriptoma muscular. Para evaluar los efectos transcriptómicos generales de ISIS 190401 e ISIS 445236, se utilizaron análisis de micromatrices en ratones HSALR.
Tratamiento
[0410] Los ratones HSALR recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 190401 o ISIS 445236 a una dosis de 25 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas. Un grupo de control recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se comparó el grupo tratado con oligonucleótido.
Análisis de transcriptoma por micromatriz
[0411] Se aisló ARN del músculo cuádriceps de ratones de tipo salvaje o HSALR. La integridad del ARN se verificó utilizando un bioanalizador Agilent (número de integridad del ARN>7,5). El ARN se procesó en ARN complementario (ARNc) y se hibridó en microperlas utilizando los kits MouseRef-8 v2,0 Expression BeadChip (Illumina, San Diego), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los datos de imagen se cuantificaron utilizando el software BeadStudio (Illumina). Las intensidades de señal fueron cuantiles normalizadas. Se utilizaron compensaciones específicas de fila para evitar cualquier valor de menos de 2 antes de la normalización. Los datos de todos los conjuntos de sondas con 6 o más nucleótidos de repeticiones CUG, UGC o GCU se suprimieron para eliminar la posibilidad de que las repeticiones expandidas en la mezcla de hibridación (Repeticiones CAG en ARNc que se originan a partir de repeticiones CUG en el ARNm) pudieran hibridarse con secuencias repetidas en las sondas para eliminar los genes cuya expresión no se cuantificó fácilmente en las matrices, se suprimieron las sondas que mostraban un valor de p para la probabilidad de detección de <0,1 en todas las muestras. Las comparaciones entre grupos se resumieron y ordenaron por rango mediante cambios de pliegue del nivel de expresión medio y las pruebas t. El paquete de software R(Butler et al. Diabetes. 2002; 51: 1028-34) se utilizó para realizar análisis de componentes principales (Levin et al. En Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications, ST Crooke, Ed. (CRC Press, Boca Raton, 2008), pp 183-215; Geary et al. Drug Metab. Dispos,2003; 31: 1419-28) en muestras de microarrays de tipo salvaje, tratados con oligonucleótidos ISIS y tratados con PBS. Los componentes principales permitieron la captura de la mayoría de la variación de expresión en cada muestra dentro de 3 dimensiones. Se trazaron los primeros tres componentes principales de cada muestra.
[0412] El análisis del componente principal de ratones de tipo salvaje y HSALR no tratados demostró la segregación de HSALR lejos de los ratones de tipo salvaje, en grupos ampliamente separados. En contraste, los ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido se agruparon más estrechamente con los ratones de tipo salvaje, lo que sugiere una tendencia general a la normalización del transcriptoma. Las comparaciones de ratones transgénicos HSALR con ratones de tipo salvaje identificaron 93 transcripciones cuyos niveles de expresión se alteraron más de dos veces (P <0,0001), como se presenta en la Tabla 42 a continuación. El grado de desregulación para estas transcripciones se redujo o normalizó para los oligonucleótidos antisentido (el 88% de las transcripciones desreguladas respondieron a ISIS 445236, p <0,05 para ISIS 445236 frente al control de PBS, mientras que el 90% respondió a ISIS 190401).
[0413] Para considerar las transcripciones que tienen una caída fuera del objetivo, se identificaron todas las transcripciones cuya expresión se redujo en ratones HSALR tratados con oligonucleótidos antisentido (>reducción de dos veces por cualquiera de los oligonucleótidos, p < 0,0001, n = 41 transcripciones). Todas las transcripciones que fueron reguladas negativamente por estos criterios demostraron una regulación positiva en ratones HSALR. La única excepción, el colágeno 6 alfa2, es poco probable que resulte de la escisión fuera del objetivo porque estaba regulada por los dos oligonucleótidos antisentido con secuencias no superpuestas.
[0414] Estos resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido durante 4 semanas dio como resultado una mejora general del transcriptoma muscular sin ninguna evidencia de efectos fuera de la diana.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos unidos complementarios a un no de repetición repetida de un ARN DMPK que contiene repetición CUG expandida para usar en un método de tratamiento de un animal que tiene distrofia miotónica tipo 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia de nucleobase que es al menos 90% complementaria a la SEQ ID NO: 1 y/o La SEQ ID NO: 2, medida según la totalidad de dicho oligonucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado, cuando se une al ARN DMPK que contiene repetición CUG expandido, activa una ribonucleasa nuclear.
2. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el animal es un humano.
3. El compuesto para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el compuesto reduce la miotonía en cualquiera de los músculos cuádriceps, el músculo gastrocnemio o el músculo tibial anterior.
4. El compuesto para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
5. El compuesto para usar de acuerdo a la reivindicación 4, en donde el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido monocatenario, en donde opcionalmente el oligonucleótido modificado monocatenario es un separador.
6. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado, en donde opcionalmente cada enlace internucleósido del oligonucleótido modificado es un enlace internucleósido modificado.
7. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleósido de fosforotioato.
8. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato y al menos un enlace internucleósido del oligonucleótido modificado es un enlace internucleósido fosfodiéster.
9. El compuesto para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado, en donde opcionalmente al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico.
10. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el azúcar bicíclico comprende un puente químico entre las posiciones 4' y 2' del azúcar, en donde el puente químico se selecciona entre: 4'-(CH2)-O-2'; 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'; 4’-CH(CHa)-O-2', 4'-CH(CH2OCHa)-O-2', 4'-(CH3) (CH3)-O-2', 4'-H2-N(OCH3)-2', 4'-CH2-O-N(CH3)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, C 1 -C 12 alquilo, o un grupo protector, 4'-CH2‘(H)(CH3)-2', 4'-y CH 2 -C(= CH2)-2'.
11. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.
12. El compuesto para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-11, en donde al menos un nucleósido de dicho oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada, en donde opcionalmente la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
13. El compuesto para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde el compuesto es un compuesto antisentido conjugado.
14. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso en un método de tratamiento de un animal que tiene distrofia miotónica de tipo 1.
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