ES2659845B1

ES2659845B1 - Modulación de microRNAs contra la distrofia miotónica tipo 1 y antagonistas de microRNAs para ello

Info

Publication number: ES2659845B1
Application number: ES201631216A
Authority: ES
Inventors: Allepuz Rubén D Artero; Troisi María Beatriz Llamusi; Herreros Estefanía Cerro; Costa Juan M Fernandez
Original assignee: Universitat de Valencia
Current assignee: Universitat de Valencia
Priority date: 2016-09-19
Filing date: 2016-09-19
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2036-09-19
Also published as: CA3037288A1; WO2018050930A1; US20220133774A1; IL265461B1; AU2017328728B2; EP4269587A2; JP6919098B2; JP2019531092A; EP3516059A1; AU2021257890A1; IL265461B2; US11202794B2; ES2659845A1; CA3037288C; AU2017328728A1; US20190231809A1; IL265461A

Description

DESCRIPCION

Modulation de microRNAs contra la distrofia miotonica tipo 1 y antagonistas de microRNAs para ello

Campo tecnico

La invention se refiere al uso de pequenas moleculas que comprenden unidades de ribonucleotidos o analogos de los mismos para su aplicacion terapeutica contra enfermedades. Mas concretamente, la invencion se refiere al uso de antagonistas de microRNAs, como los antagomiRs, para el tratamiento de la distrofia miotonica tipo 1.

Antecedentes de la invencion

La distrofia miotonica tipo 1 (DM1) es un trastorno neuromuscular incurable que constituye una seria preocupacion cllnica pues al hecho de ser la distrofia muscular mas comun de inicio adulto se une que es altamente discapacitante. Cllnicamente, la DM1 se considera un trastorno multisistemico que afecta principalmente al musculo esqueletico y liso, al sistema nervioso y al corazon y se caracteriza por una reduction de la masa muscular (distrofia muscular), lo que puede conducir a insuficiencia respiratoria y muerte, cataratas posteriores subcapsulares iridiscentes, defectos en la conduction del impulso cardiaco, cambios endocrinos, miotonla (dificultad para relajar el musculo despues de una contraction voluntaria), disfunciones del Sistema Nervioso Central que incluyen deficit de atencion, patrones de personalidad caracterlsticos, alteraciones del sueno y slndrome disejecutivo. Este cuadro cllnico se completa con una edad de aparicion altamente variable, que va desde formas congenitas (desde el nacimiento) a DM1 infantil, de inicio en la etapa adulta de la vida y en la tercera edad. La forma mas comun de la enfermedad, la de inicio en la adolescencia o segunda decada de vida, reduce la esperanza de vida de los pacientes a 48-55 anos (Harper, 2001; Gagnon et al., 2007). La DM1 se clasifica como una enfermedad rara ya que su prevalencia en la poblacion se estima inferior a 1 cada 2000 personas.

A nivel genetico, se conoce que la DM1 es una enfermedad hereditaria autosomica dominante y esta causada por la presencia de expansiones de cientos de repeticiones del motivo CTG*CAG en la region 3' no traducida (3' UTR) del gen de la protelna quinasa de la distrofia miotonica (DMPK: dystrophia myotonica-protein kinase) (para una revision reciente, vease por ejemplo Thornton, 2014). El gen DMPK humano (HGNC: 2933, Entrez Gene: 1760, Ensembl: ENSG00000104936, OMIM: 605377 , UniProtKB: Q09013) normal alberga 5-37 copias del motivo de trinucleotidos, pero una mutation dinamica puede aumentar este numero a mas de 5000 copias de la repetition. La gravedad de la enfermedad se correlaciona aproximadamente con el numero de repeticiones, es decir, el tamano de la expansion.

Existe tambien la llamada distrofia miotonica de tipo 2 (DM2), menos frecuente, que se debe a mutaciones en un gen diferente, el gen CNBP, presente en el cromosoma 23 humano. En la DM2 aparece tambien disfuncion muscular, pero involucra sobre todo a los musculos de la ralz de las extremidades (hombros, nalgas, muslos...), mientras que en la DM1 estan implicados sobre todo los musculos de la portion distal de las extremidades. Al contrario que en DM1, la DM2 no parece afectar a la esperanza de vida y se suele manifestar con slntomas mas moderados.

La expresion de alelos expandidos en DM1 da como resultado la retention nuclear de mRNA de DMPK mutante y la reduction de los niveles de protelna DMPK (Davis et al., 1997). Los transcritos mutantes secuestran los factores de corte y empalme (proceso al que se aludira en adelante por el termino ingles splicing) que son similares a la protelna de Drosophila Muscleblind (MBNL, abreviatura en ingles de Muscleblind-like), lo que da lugar al splicing alternativo anormal de multitud de otros transcritos y la expresion de formas fetales de las correspondientes protelnas en adultos que padecen DM1 (Lin et al., 2006; Du et al., 2010). De hecho, tanto la protelna Muscleblind de Drosophila (UniProtKB O16011, CG33197) como sus homologos MBNL1-3 de vertebrados, son conocidos como reguladores del splicing. Los transcritos de los genes MBNL1 y MBNL2, por su parte, estan sometidos ellos mismos a splicing alternativo, generando numerosas isoformas proteicas (Pascual et al, 2006). MBNL1 se expresa fuertemente en tejido muscular esqueletico y cardiaco y durante la diferenciacion de los mioblastos. Su expresion es menor en otros tejidos tales como cerebro, placenta, pulmones, hlgado, rinon y pancreas. MBNL2 tiene una expresion solapante en gran medida y se detecta en corazon, cerebro, placenta, pulmones, hlgado, musculo esqueletico, rinones y pancreas. MBNL3, por su parte, se expresa en placenta y celulas satelite. Para information mas detallada sobre todo ello, puede consultarse la revision Fernandez-Costa et al. (Fernandez-Costa et al., 2011).

Por lo tanto, se cree que la espliceopatla es el principal factor que subyace en la patogenesis de la DM1. Sin embargo, distintos mecanismos alternativos tales como cambios adicionales en la expresion genica, transcritos antisentido, la eficacia de la traduccion, la desregulacion de la poliadenilacion alternativa y la desregulacion de miRNAs pueden contribuir a la patogenesis de la DM1 (Batra et al., 2014; Yadava et al., 2016; Kalsotra et al., 2014).

Se han probado varios enfoques terapeuticos en modelos animales de DM1. Entre ellos, los resultados mas interesantes derivan del bloqueo de la interaction entre MBNLs y el RNA toxico utilizando moleculas pequenas, peptidos, morfolinos u oligonucleotidos antisentido, y espaciomeros (“gapmers”) para degradar los transcritos DMPK mutantes (revisado por Klein et al., 2015).

Una alternativa menos explorada en DM1 es la modulation terapeutica de la expresion de los genes MBNL1 y MBNL2 (HGNC: 6923, Entrez Gene: 4154, Ensembl: ENSG00000152601, OMIM: 606516, UniProtKB: Q9NR56, al que se identificaba previamente en HGNC con el slmbolo MBNL). Aunque la expresion de las expansiones CUG desencadena diferentes alteraciones moleculares, las evidencias actuales apuntan al secuestro de las protelnas MBNLs como la principal causa de los slntomas de la enfermedad. El modelo de raton con el gen Mbnll inactivado (raton knockout, abreviado KO, para Mbnl1) muestra miotonla, splicing incorrecto de transcritos musculares y cataratas, que son todos ellos slntomas caracterlsticos de la enfermedad de DM1 (Kanadia et al., 2003). Mas recientemente, se han descrito en ratones de dos meses de edad mutantes en Mbnl1 las caracterlsticas mas relevantes de la disfuncion cardiaca (hipertrofia, fibrosis intersticial y alteraciones del splicing), lo que sugiere un papel de la reduction de la Mbnl1 en los problemas cardiacos de DM1 (Dixon et al., 2015). Ademas, los polimorfismos geneticos en el promotor del gen MBNL1 humano han sido asociados con la gravedad de la enfermedad (Huin et al., 2013).

Sin embargo, los ratones KO para Mbnl1 no muestran todo el conjunto de slntomas de la DM1. Por lo tanto, se ha planteado la hipotesis de que Mbnl2 podrla compensar la perdida de funcion de Mbnl1 en estos ratones. De hecho, los ratones KO para Mbnl1 con expresion reducida de Mbnl2 (Mbnl1-/-; Mbnl2+/-), son viables, pero desarrollan la mayor parte de los defectos cardinales de la enfermedad, incluida la reduccion de la esperanza de vida, bloqueo cardlaco, miotonla grave, fibras atroficas y debilidad progresiva de los musculos esqueleticos. En apoyo de la hipotesis de compensation puede mencionarse que los niveles de Mbnl2 estan incrementados en ratones KO para Mbnl1-/- y Mbnl2 puede regular exones que normalmente son regulados por Mbnl1 (Lee et al., 2013).

Varias observaciones sugieren que la sobreexpresion de MBNL1 puede tener potencial para el tratamiento de la patologla de la DM1. En primer lugar, la sobreexpresion de MBNL1 es bien tolerada en el musculo esqueletico de ratones transgenicos, causando solo cambios relativamente menores en el splicing, pero sin afectar a la longevidad (Chamberlain et al., 2012). En segundo lugar, la administration de la protelna Mbnll recombinante a un modelo de DM1 de raton HSALR, rescata la miotonla y las alteraciones del splicing caracterlsticas de la DM1 (Kanadia et al., 2006).

Dada la gravedad de los slntomas de la DM1, que pueden conducir a la muerte prematura del paciente, y la ausencia en la actualidad de tratamientos eficaces para la misma, es de interes explorar estrategias terapeuticas alternativas.

Asl, serla interesante comprobar si la sobreexpresion de MBNL1, sola o en combination con la modulation de MBNL2, podrla tambien tener aplicacion terapeutica en seres humanos aquejados de DM1. Sin embargo, dado que el diseno y la autorizacion de la aplicacion de vectores de expresion seguros para su administracion a seres humanos es compleja, serla interesante encontrar una manera de conseguir aumentar los niveles de la protelna MBNL1 o MBNL2 en seres humanos, en los mismos tejidos donde normalmente se transcriben, mediante algun metodo alternativo a la expresion de dicha protelna desde un vector artificial. Serla preferible, ademas, que dicho incremento de nivel se produjera, al menos, en uno o mas de los tejidos y organos relevantes donde aparecen slntomas especlficamente significativos de la enfermedad: musculo esqueletico y liso, corazon y sistema nervioso.

La presente invention proporciona una solution a ese problema.

Sumario de la invencion

La presente invencion se basa en compensar las insuficientes cantidades de protelnas MBNL (Muscleblind-like) que estan disponibles para interaccionar con sus dianas naturales en los pacientes con distrofia miotonica 1 (DM1), debido a que dicha protelna, entre otros mecanismos que pueden afectar a su expresion, distribution subcelular y actividad in vivo, queda secuestrada en foci ribonucleares de los que forman parte los transcritos mutantes del gen DMPK. Mediante la compensation de las cantidades de las protelnas MBNL, se intenta provocar una mejorla en los slntomas de dicha enfermedad. Y para ello, los presentes inventores proponen conseguir una regulation al alza de los niveles de dichas protelnas, provocada por un aumento de la expresion de las mismas, mediante el bloqueo de la action de microRNAs (miRNAs) que intervienen negativamente en la regulacion de su traduction y estabilidad, preferiblemente mediante oligorribonucleotidos, analogos de los mismos o, en general, moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica, capaces de bloquear especlficamente la accion de determinados miRNAs represores de los genes MBNL1 y/o MBNL2.

Asl, en un primer aspecto la presente invention se refiere a una molecula de naturaleza oligorribonucleotidica y/o un analogo de oligorribonucleotido que es un antagonista de un microRNA que regula a la baja la expresion del gen humano MBNL1 y/o MBNL2, o a una mezcla de dos o mas de dichas moleculas. Dicha molecula se considerara una molecula de naturaleza oligorribonucleotidica o analogo de oligorribonucleotido de la invencion. Preferiblemente, la molecula es un antagonista de un microRNA que se expresa al menos en uno o mas organos seleccionados del grupo de cerebro, cerebelo, hipocampo, musculo esqueletico y corazon, o en una o mas celulas de un cultivo primario de uno de dichos organos o de una llnea celular establecida derivada de uno de dichos organos (incluidas las celulas madre pluripotentes inducidas, conocidas por sus siglas en ingles iPSCs:induced pluripotent stem cells) o celulas madre de uno de dichos organos. Se prefiere que la molecula sea complementaria y comprenda un fragmento de secuencia de unidades de ribonucleotidos, o de analogos de ribonucleotidos, en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es complementaria al menos en un 50% (o al menos en un 55%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5%, o un 100%) a la secuencia de las bases nitrogenadas de la molecula endogena (el microRNA o el RNA mensajero) a la que debe unirse. Preferiblemente, la molecula es un antagonista del microRNA-218-5p humano o del microRNA-23b-3p humano. Compatiblemente con cualquiera de las preferencias anteriores, se prefiere que el antagonista sea un antagomiR, un blockmiR, un antimiR o una esponja de microRNA, con especial preferencia por que la molecula sea un antagomiR y, dentro de ellos, un antagomiR en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es complementaria es identica al menos en un 80% a la secuencia de las bases nitrogenadas del microRNA al que debe unirse. Especialmente en el caso de que la molecula sea un antagomiR, un antimiR o una esponja de microRNA, se prefiere que la molecula sea complementaria a la secuencia del microRNA-218-5p o la del microRNA-23b-3p humano o que comprenda un fragmento de secuencia de unidades de ribonucleotidos, o de analogos de ribonucleotidos, en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es identica al menos en un 80% (o al menos en 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5%, o un 100%) a la secuencia de las bases nitrogenadas del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:1 o de SEQ ID NO:2. Especialmente cuando la molecula en un antagomiR, se prefiere que dicha molecula sea complementaria a la secuencia del microRNA-218-5p humano o la del microRNA-23b-3p humano o que comprenda un fragmento de secuencia de unidades de ribonucleotidos, o de analogos de ribonucleotidos, en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es complementaria al menos en un 50% (o al menos en un 55%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5%, o un 100%) a la del microRNA-218-5p humano o la del microRNA-23b-3p humano, con especial preferencia por que sea complementaria al menos en un 80%. Muy preferiblemente, la molecula es un analogo de oligorribonucleotido de tipo antagomiR en el que al menos una de las unidades es un analogo de ribonucleotido que presenta una o mas modificaciones qulmicas en el resto de la ribosa, en el enlace fosfato o en ambos, la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o analogos de ribonucleotidos es identica a la secuencia de bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:1 o del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:2 y que, optativamente, presenta en el extremo 5’ y/o en el extremo 3’ uno o mas restos adicionales que no son restos de adenorribonucleotidos o ribonucleotidos. Con la mayor preferencia, la molecula es el antagomiR-218 (SEQ ID NO:10) o el antagomiR-23b (SEQ ID NO:11). En otra posible realization, especialmente interesante en el caso de antimiRs, la molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o el analogo de oligorribonucleotido comprende un fragmento que es complementario en un 100% a la region semilla del microRNA del que es antagonista. Otra posible realizacion, especialmente interesante en el caso de blockmiRs, es una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o el analogo de oligorribonucleotido que comprende un fragmento compuesto por una sucesion de unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es complementaria al menos en un 80% a la secuencia de las bases nitrogenadas de la region reconocida por el microRNA del que es antagonista en un mRNA diana (es decir, regulado a la baja por ese microRNA).

En un segundo aspecto, la presente invention se refiere a una composition que comprende al menos una de las moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica o un analogo de oligorribonucleotido de la presente invencion, una mezcla de las mismas, o un vector de expresion que comprende la secuencia codificante de al menos una de dichas moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica. En una posible realizacion, la composicion adicionalmente comprende un vehlculo y/o uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. En otra posible realizacion preferida, compatible con la anterior, la composicion comprende el analogo de oligorribonucleotido tipo antagomiR representado por SEQ ID NO:10 (antagomiR-218-5p) o el analogo de oligorribonucleotido tipo antagomiR representado por SEQ ID NO:11 (antagomiR-23b-3p) o una mezcla de los mismos. Es tambien una posible realizacion, compatible con todas las anteriores y especialmente preferida cuando estan presentes en la composition el antagomiR-23b-3p y/o el antagomiR-218-5p, que la molecula de naturaleza oligorribonucleotldica o analogo de oligorribonucleotido este en una concentration de 50 nM a 200 nM, ambas incluidas.

En un aspecto mas, la invention se refiere al uso de una de las moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica o un analogo de oligorribonucleotido de la invencion, una mezcla de dos o mas de ellas, o una composicion que comprende al menos una de dichas moleculas, para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de la distrofia miotonica tipo 1. Por tanto, esta comprendido dentro del alcance de la invencion y puede considerarse un aspecto de la misma, una de las moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica o un analogo de oligorribonucleotido de la invencion, una mezcla de dos o mas de ellas, o una composicion para uso en el tratamiento de la distrofia miotonica tipo 1. Preferiblemente, en este aspecto de la invencion referido al uso para la fabricacion de un medicamento y, por tanto, relacionado con el uso en el tratamiento de la distrofia miotonica tipo 1, es una posible realizacion aquella en que la molecula es o la composicion comprende un antagonista del microRNA-218-5p humano, un inhibidor del microRNA-23b-5p humano, una mezcla de los mismos o una composicion que los comprende. En una posible realizacion, el tratamiento es un tratamiento paliativo de uno o mas slntomas de la distrofia miotonica tipo 1. Dentro de la anterior, una posible preferencia es que el tratamiento sea un tratamiento paliativo de una o mas de las alteraciones musculares que forman parte de los slntomas de la distrofia miotonica tipo 1.

Breve description de las figuras

Fig. 1. El silenciamiento especlfico de tejido de dme-miR-277 y dme-miR-304 provoca la sobreexpresion de RNA y protelnas muscleblind en el musculo de Drosophila. (A): Niveles de expresion de muscleblind relativo a un control endogeno obtenidos por amplification por qRT-PCR a partir de moscas que expresan las construcciones de esponjas de miRNAs para dme-miR-92a, dme-miR-100, dme-miR-124, dme-miR-277 y dme-miR-304 en el musculo: los niveles de expresion de muscleblind fueron fuertemente regulados al alza en las moscas que expresaban las esponjas de microRNAs miR-277SP y miR-304SP con respecto a moscas que expresan una construction UAS-scrambledSP (B): Analisis de los niveles de isoformas de muscleblind por qRT-PCR, donde se aprecia que el silenciamiento de dme-miR-277 en el musculo causo una regulation al alza de la isoforma mblB, mientras que los niveles de expresion de las isoformas mblC y mblD se redujeron en las moscas que expresaban miR-277SP; por el contrario, los niveles de mblC y mblD se incrementaron y los de la isoforma mblB se redujeron en las moscas que expresaban miR-304SP. (C) Detection de la protelna Muscleblind por Western blot, donde se detecto la sobreexpresion de la protelna Muscleblind en las moscas que expresaban miR-304SP. Todos los transgenes indicados fueron dirigidos al musculo utilizando Mhc-Gal4. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 (prueba de la t de Student).

Fig. 2. El silenciamiento de dme-miR-277 y dme-miR-304 potencia la expresion de muscleblind y rescata eventos de splicing incorrecto en un contexto de DM1. (A) Grafico de barras que muestra los niveles de expresion de muscleblind segun los datos obtenidos por qRT-PCR en moscas i(CTG)480 que expresaban las construcciones esponja indicadas bajo el grafico: se muestra que el mRNA de muscleblind se regulo al alza de manera significativa en las moscas modelo que expresaban miR-277SP y miR-304SP en comparacion con las moscas que no expresan las expansiones (control, Mhc-Gal4/+) o las moscas modelo que expresaban los scrambled-SP (scramble-SP en la figura). (B) Analisis de transferencia Western en muestras de las mismas moscas, que mostro la sobreexpresion de Muscleblind C solo en las moscas modelo que expresaban miR-304SP. (C-F) Imagenes confocales de secciones longitudinales de los IFM (musculos indirectos de vuelo) de moscas que expresaban o no esponjas de miRNAs segun se muestra en la esquina inferior derecha, que muestran la localization de la senal de anti-Muscleblind (verde en el original, gris claro en escala de grises), con contratincion de los nucleos con DAPI (senal azul en el original, gris mas apagado en escala de grises): se aprecia senal de Muscleblind en las bandas sarcomericas de las moscas control (c); por el contrario, Muscleblind se encontro en los agregados nucleares de los IFM en los que se expresaban expansiones CTG (d); la expresion de miR-277SP en las moscas modelo libero Muscleblind de los agregados y restauro su distribution en las bandas del sarcomero (e); la expresion de miR-304SP dio lugar a una sobreexpresion dispersa de Muscleblind tanto en los nucleos como en el citoplasma. (G) Resultados obtenidos tras RT-PCR para evaluar la inclusion del exon 16' (+e16') de Fhos o su exclusion (-e16') en moscas con diferentes genotipos y expresion de esponjas de microRNAs, segun se indica sobre las fotograflas; se muestran tambien los resultados correspondientes a los transcritos de Rp49 detectados como control endogeno. (H) Cuantificacion del porcentaje de inclusion del exon 16' de Fhos a partir de los resultados mostrados en el panel G, que confirmo una mejora del splicing erroneo de Fhos en las moscas modelo que expresaban miR-304SP. (I, L) Graficos de barras que muestra los resultados, obtenidos por qRT-PCR, de expresion del exon 13 de Serca (Serca e13) y el exon 2 del gen CyP6W1 (CyP6W1 e2) en relation con Rp49, que confirmaron un rescate significativo del splicing de Serca en moscas modelo que expresaban miR-304SP y de la expresion relativa de CyP6W1 en estas moscas. (J) Resultados obtenidos tras RT-PCR para evaluar la inclusion de los exones 3-5 del gen TnT (+e3-5), que no difirio en los genotipos estudiados. (K) Cuantificacion del porcentaje de inclusion de los exones 3 a 5 de Tnt a partir de los resultados mostrados en el panel J. Los transgenes de todos los genotipos indicados fueron dirigidos al musculo utilizando Mhc-Gal4. Barra de escala = 2 micrometros. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 (prueba de la t de Student).

Fig. 3. El silenciamiento de dme-miR-277 y dme-miR-304 rescata la atrofia muscular y la presencia de foci ribonucleares en las moscas modelo. (a-c, e-g): Secciones dorsoventrales de torax embebido en resina, de moscas con los genotipos indicados bajo las fotograflas: se aprecia como, en comparacion con las moscas control (a), la expresion de miR-277SP dio como resultado una reduction significativa del area del musculo (b), mientras que la expresion de miR-304SP no tuvo efecto en este fenotipo (c); en las moscas modelo de DM1, el area del musculo se redujo hasta un 40% de lo normal (e); sin embargo, en las moscas modelo que expresaban uno cualquiera de entre miR-277SP o miR-304SP, el area muscular aumento hasta un 60% de lo normal (f, g). (d, h): Cuantificacion del porcentaje medio del area muscular segun el genotipo indicado bajo las barras; los graficos muestran las medias ± E.E.M. Se analizaron seis individuos por genotipo y se cuantificaron seis fotograflas de cada uno. En todas las imagenes la parte dorsal esta hacia arriba. (i-k) Hibridacion in situ de cortes transversales de musculatura de moscas con los genotipos indicados bajo las fotograflas: se aprecia como, en comparacion con las moscas control donde se observa una clara presencia de foci (i) la expresion de miR-277SP y miR-304SP dio como resultado una reduccion significativa de estos, siendo practicamente inapreciable en este ultimo caso (j y k). Todos los genotipos indicados fueron dirigidos al musculo utilizando Mhc-Gal4. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 (prueba de la t de Student).

Fig.4. La inhibition de dme-miR-277 o dme-miR-304 mejora la locomotion y la supervivencia de las moscas modelo de DM1. (a, e) Altura media de aterrizaje de moscas con los genotipos relevantes indicados bajo el grafico. En los individuos control (a), el silenciamiento de dme-miR-277 disminuyo la altura de aterrizaje mientras que el silenciamiento de dme-miR-304 no afecto al vuelo. En las moscas modelo de DM1 (e), la expresion de miR-277SP o miR-304SP rescato la disminucion de la capacidad de vuelo observada. (b, f) Histogramas de la velocidad de ascension por superficies expresada como la velocidad media ± E.E.M. en mm/s. En las moscas control (b), el silenciamiento de cualquiera de entre dme-miR-277 o dme-miR-304 no tuvo efecto sobre la velocidad de ascension. Sin embargo, en las moscas modelo de DM1 (f), que tienen una velocidad de ascension muy reducida, la expresion de miR-277SP o miR-304SP rescato significativamente este fenotipo. (c, g) Curvas de supervivencia y (d,h) supervivencia media, que muestran que la expresion de miR-277SP o miR-304SP no tuvieron efecto sobre las moscas control, pero mejoraron la supervivencia de las moscas modelo de DM1. Se analizaron entre 140 y 160 individuos de cada genotipo. Todos los transgenes indicados fueron dirigidos al musculo con Mhc-Gal4. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 (prueba de la t de Student).

Fig. 5. Validation de resultados del screening primario de miRNAs represores de MBNL1 o MBNL2. (a-b) Representation logarltmica en base 2 (log2) del nivel de expresion relativo de MBNL1 (a) y MBNL2 (b) en celulas HeLa transfectadas con plasmidos derivados de pCMV-MIR que expresan diferentes miRNAs humanos (miR-7, miR-23b, miR-146b, miR-218, miR-372), siendo el valor de referencia para ambos genes el detectado en celulas HeLa transfectadas con el plasmido pCMV-MIR vaclo (VTC en la figura) y el gen endogeno utilizado para normalizar GAPDH. Como control de la transfection el vector expresaba la protelna GFP. * p<0,05 **, p<0,01,***p<0,001. (c-d) Representacion del nivel de expresion relativo a nivel de protelna de MBNL1 (panel c) y MBNL2 (panel d) en celulas HeLa transfectadas con los plasmidos de los ensayos mostrados en (a) y (b), utilizando igualmente como valor de referencia para ambos genes el detectado en celulas HeLa transfectadas con el plasmido pCMV-MIR vaclo (VTC en la figura) y utilizando como control endogeno p-actina. **p<0,01, ***p<0,001 (prueba de la t de Student).

Fig. 6. Confirmation experimental de las secuencias diana reconocidas por los miRNAs candidatos en 3’ UTRs mediante ensayos de Luciferasa. (A) Representacion esquematica, a escala, de los sitios de union predichos por los programas miRanda y Targetscan de los microRNAs indicados sobre los 3'UTRs de MBNL1. Aunque dicho gen sufre splicing alternativo, ninguna de las isoformas conocidas afecta a la presencia en el transcrito de las dianas mostradas. (B) Representacion grafica de la actividad de los diferentes microRNAs sobre sensores luc:3'-UTR MBNL1 expresada en unidades relativas de luciferasa de Gaussia, normalizadas respecto al control interno SEAP (Gluc/SEAP). (C) Para comprobar que la union de miR-23b es directa, se muestran los datos del sensor 3'UTR de este miRNA candidato con la secuencia diana predicha mutada (MUT) y tambien su version con la diana complementaria perfecta (PM), as! como los datos obtenidos cuando la diana natural (WT) esta presente en el sensor 3’UTR. La actividad de miR-23b sobre los sensores 3'UTR natural, mutado y PM se expresa en unidades relativas de luciferasa de Gaussia, normalizadas respecto al control interno SEAP (Gluc/SEAP). *p<0,05 **, p<0,01, ***p<0,001. (D) Representacion esquematica, a escala, de los sitios de union predichos por los programas miRanda y Targetscan de los microRNAs indicados sobre las 3'UTRs de MBNL2. Como en el caso de MBNL1, aunque dicho gen sufre splicing alternativo, ninguna de las isoformas conocidas afecta a la presencia en el transcrito de las dianas mostradas. (E) Representation grafica de la actividad de los diferentes microRNAs sobre sensores luc:3'UTR de MBNL2 expresada en unidades relativas de luciferasa de Gaussia, normalizadas respecto al control interno SEAP (Gluc/SEAP). (F,G): Representacion grafica de la actividad de los microRNAs mirR-23b (F), miR-218 (G) que resultaron positivos en el ensayo anterior. Como en el caso de MBNL1, se muestran los datos obtenidos con las versiones del sensor 3'UTR disenadas para cada miRNA candidato con la secuencia diana predicha mutada (mut) y tambien su version con diana complementaria perfecta (PM), asl como los datos obtenidos cuando la diana natural (WT) esta presente en el sensor 3’UTR. La actividad de los diferentes microRNAs sobre los 3'UTR natural, mutado y PM se expresan en unidades relativas de luciferasa de Gaussia, normalizadas respecto al control interno SEAP (Gluc/SEAP). *p<0,05 **, p<0,01, ***p<0,001 (prueba de la t de Student).

Fig. 7. Representacion grafica del nivel de expresion relativo de los diferentes microRNAs (miR-23b, miR-146b, miR-218, miR-372) mediante qPCR. Como controles endogenos para la normalization de la expresion se utilizaron los genes U1 y U6. (A) Expresion de los microRNAs en los diferentes tejidos de raton (cepa FVB); (B) expresion de microRNAs en fibroblastos de individuos controles y de pacientes con DM1; (C) expresion de microRNAs en biopsias musculares de individuos control y pacientes con DM1. * p<0,05, **p<0,01 (prueba de la t de Student).

Fig. 8. Ensayos de toxicidad con antagomiRs de los microRNAs 218 y 23b en mioblastos normales Representacion grafica del porcentaje de inhibition de la supervivencia celular a las 60 h, obtenida en mioblastos control provocada por la toxicidad asociada a ensayo de dosis respuesta con cantidades crecientes de los antagomiRs, respecto al logaritmo en base 10 de la concentration nanomolar del compuesto. Las cantidades probadas en mioblastos control se indican sobre las correspondientes curvas.

Fig. 9. Ensayos de respuesta a dosis de los antagomiRs de los microRNAs 218 y 23b: representacion grafica del nivel de expresion de MBNL1 (a, b) o MBNL2 (c, d) en mioblastos control sanos, DM1 y tratados con los antagomiR-23b y antagomiR-218 (50 pM, 100 pM, 200 pM). Como controles endogenos para la normalizacion de la expresion se utilizaron los genes GAPDH y ACTB. En los paneles de la izquierda se ve la expresion de MBNL1 (a) o MBNL2 (c) a las 48 horas post-transfeccion y transdiferenciacion con los antagomiRs, mientras que en los paneles de la derecha se ve la expresion de MBNL1 (b) o MBNL2 (d) a las 96 horas post-transfeccion y transdiferenciacion con los antagomiRs. *p<0,05 ,**p<0,01,***p<0,001 (prueba de la t de Student).

Fig. 10. Ensayos de respuesta a dosis de los antagomiRs de los microRNAs 218 y 23b: evaluation del splicing alternativo de los genes cTNT, DMD, SERCA1, BIN, IR y GAPDH mediante RT-PCR semicuantitativa en muestras de mioblastos de controles sanos (CNT) y de pacientes con DM1 sin tratar (DM1), o tratados con los antagomiR-23b y antagomiR-218 a las concentraciones indicadas (50 nM, 100 nM, 200 nM). Se muestran los resultados obtenidos tras 48 h (paneles A, C, D, E, F, G) o 96 h (paneles B, H, I, J, K, L) de transdiferenciacion. Los paneles A y B muestran fotograflas de los correspondientes fragmentos de los geles de las electroforesis realizadas tras la RT-PCR; en la parte derecha de los ensayos correspondientes a cada gen se indica el exon para el cual se comprobo su inclusion (leyenda encabezada por un signo

o exclusion (leyendas encabezadas por un signo “-“). Los paneles C, D, E, F, G (ensayo a 48 h) y H, I, J, K, L (ensayo a 96 h) muestran graficos de barras con los porcentajes de exclusion (parte en gris claro) o inclusion (parte superior, en gris mas oscuro) de cada uno de esos exones para los controles CNT y DM1 y las concentraciones de cada antagomiR indicadas bajo las barras.

Description detallada de la invention

Como se ha comentado previamente, la presente invencion se basa en conocimientos que indican que en pacientes con DM1 la actividad de las protelnas de la familia MBNL es limitante, lo cual se origina, al menos en parte, porque los mRNA transcritos de alelos mutantes del gen DMPK, que presentan cientos de repeticiones CUG adicionales en la region UTR de 3’, se acumulan en foci en los que quedan secuestradas protelnas Muscleblind-like (MBNL), apartandolas de sus dianas funcionales. Por ello, los presentes inventores proponen que la regulation al alza de los niveles de las protelnas endogenas MBNL supone un enfoque terapeutico contra la DM1, que ayudarla a paliar sus slntomas.

La base de la presente invencion es la identification de miRNAs que actuan negativamente sobre la expresion de las protelnas MBNL y el bloqueo o inhibition de los mismos, para disminuir o impedir su efecto negativo sobre los niveles de las protelnas MBNL, dando lugar con ello a un incremento de dichos niveles.

El papel fundamental de los miRNA en la regulacion de la expresion genica ha sido bien establecido. Los microRNAs (comunmente abreviados como miRNAs) son RNAs endogenos no codificantes, de una longitud aproximada de 22 nucleotidos, que actuan post-transcripcionalmente y ejercen sus efectos reguladores principalmente mediante la union a la region 3 'UTR del mRNA diana, lo que da como resultado la desadenilacion del mRNA y, con ello, provocan la disminucion o la supresion de la traduccion o, raramente, la escision del mRNA. Este ultimo efecto, la escision del mRNA, puede darse cuando existe una complementariedad completa entre un mRNA y un miRNA que se une al mismo, lo cual permite que actue un miembro de la familia de protelnas llamadas argonautas, concretamente Ago2, que es capaz de escindir el mRNA y conducir a su degradation directa. Para la union de un microRNA al correspondiente RNA mensajero, es fundamental la presencia en dicho mRNA de la llamada "region semilla” (“seed region’), que es un fragmento de unos 6-8 nucleotidos (habitualmente 7), que forma parte de la zona del mRNA a la que se une el microRNA y que tiene una complementariedad perfecta con una parte del microRNA, habitualmente los nucleotidos 2 a 8 o 9 del mismo, a la que se suele llamar igualmente region semilla. Aunque la complementariedad entre el microRNA y su correspondiente mRNA no sea perfecta en toda la zona de apareamiento, si lo es en la region semilla; con ella, el microRNA podra ser funcional en la regulation de la expresion del gen al que corresponda el mRNA que la contenga.

Asl, los presentes inventores proponen una aproximacion terapeutica para la mejora de la DM1 que consiste en la modulation de las protelnas MBNL endogenas provocando el secuestro de uno o mas de los miRNAs que actuan negativamente sobre su expresion, dando con ello lugar a una regulacion al alza y, como consecuencia, a un aumento de los niveles de las protelnas MBNL endogenas. Por tanto, se trata de provocar la modulacion de la protelna endogena mediante el silenciamiento o la disminucion de la actividad represora de miRNAs especlficos implicados en la regulacion de su expresion. Particularmente, en el presente caso, se tiene preferencia por miRNAs que se expresen en musculo, por ser uno de los principales organos afectados por la enfermedad.

De acuerdo con lo anterior, y tal como se utiliza en la presente memoria, se denomina inhibidores, silenciadores o bloqueadores de un miRNA a los compuestos que son capaces de producir una disminucion de la actividad endogena de dicho miRNA. Por ser habitual en la literatura relacionada con estrategias analogas hablar de “antagonismo” (vease, p.ej., el artlculo de Landford et al., 2010, sobre silenciamiento del miR-122), estos tres terminos se han englobado bajo la denomination “antagonista” de un miRNA. Puesto que la presente invention se centra en disminuir la actividad de miRNAs represores de la expresion de ciertos genes, es dicha capacidad represora la que se vera disminuida por la presencia de sus inhibidores, silenciadores o bloqueantes: sus antagonistas. Si bien, estrictamente hablando, el termino “silenciamiento” podrla interpretarse como la anulacion absoluta de dicha actividad, dado que la diferencia entre que se produzca dicha anulacion o una disminucion no absoluta de la actividad represora puede depender de la concentration de compuesto utilizada, los cuatro terminos (inhibidores, silenciadores, bloqueantes o antagonistas) se utilizan como sinonimos en la presente memoria, siendo suficiente que un compuesto de lugar a una disminucion de la actividad represora de un miRNA para que sea considerado un inhibidor, silenciador, bloqueante o, en suma, un antagonista del mismo. Analogamente, el efecto producido por un inhibidor, silenciador o bloqueante es denominado inhibition, silenciamiento o bloqueo del miRNA en distintas partes de la memoria, entendiendose que cualquiera de esos tres terminos conllevan y significan un antagonismo de la action del mismo. En algunos puntos especlficos, particularmente cuando se hace referencia a ensayos en los que se han utilizado esponjas de miRNAs, se utiliza tambien la palabra “agotamiento” para aludir al efecto que se produce cuando dichas esponjas estan presentes, pues puede considerarse que el numero de sitios de union en dichas esponjas da lugar a que queden unidas a ellas la mayor parte o la practica totalidad de las moleculas de miRNA que tienen secuencias complementarias a ellas, “agotandose” las moleculas de ese miRNA disponibles para interaccionar con otras moleculas o compuestos en la celula donde las esponjas esten presentes.

En la presente invention, se tiene preferencia por antagonistas especlficos de dichos miRNAs, que sean tambien, a su vez, oligorribonucleotidos o moleculas derivadas de los mismos que incorporen, entre otras, alguna de las modificaciones qulmicas habituales con las que se modifican las moleculas de oligorribonucleotidos para hacerlas mas resistentes a la degradacion o biodisponibles, tales como la modificacion de parte o todos los nucleotidos con grupos 2’-metoxi (2’-O-metil: 2’-OMe), 2’-Ometoxietil (2’-MOE), y/o fosforotioatos. Tal como se utiliza en la presente memoria, se denomina oligorribonucleotidos a las moleculas que resultan de la union de un maximo de 50 unidades de los monomeros que dan lugar a la molecula conocida de forma abreviada como RNA, monomeros que estan compuestos por un grupo fosfato, las bases nitrogenadas adenina (A), citosina (C), guanina (G) o uracilo (U), y la pentosa conocida como ribosa. Por lo habitual de su uso, se consideran tambien incluidas dentro de dicha definicion las moleculas entre cuyas unidades se encuentra el nucleotido inosina.

Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica” incluye tanto a los oligorribonucleotidos propiamente dichos, tal como se han definido mas arriba, como tambien a los “analogos de oligorribonucleotidos”. Se consideran “analogos de oligorribonucleotidos” las moleculas derivadas de los mismos que incorporen alguna modification qulmica en al menos una de las unidades de ribonucleotidos que los componen, ya sea en el grupo fosfato, la pentosa o una de las bases nitrogenadas; se incluyen tambien las modificaciones consistentes en la adicion de grupos de naturaleza no nucleotldica en los extremos 5’ y/o 3’. Por extension, a efectos de la presente invention y tal como se utilizan en la presente memoria, los terminos “molecula de naturaleza oligorribonucleotldica” y “analogo de oligorribonucleotido” incluyen tambien a las esponjas de miRNAs o miRNAs esponja, pues puede considerarse que el principal constituyente de los mismos son repeticiones de oligonucleotidos colocadas en tandem, con la particularidad de que cada uno de dichos oligonucleotidos son en si mismos o contienen un sitio de union de un microRNA de interes.

Con respecto a las posibles modificaciones qulmicas incluidas en los analogos de oligorribonucleotidos, el termino se aplicara especialmente cuando se trate de una o mas de las modificaciones habituales conocidas por los expertos en la materia de la biologla molecular, tanto en el campo de la investigation basica como, en la particular, en la busqueda de aplicaciones terapeuticas de dichas moleculas. Puede encontrarse information sobre este tipo de modificaciones en revisiones como la de Kole et al. (Kole et al., 2012). En particular, para los propositos de la invencion, son de especial interes (y se consideran incluidas dentro de las modificaciones que dan lugar a moleculas incluidas dentro del alcance de la invencion) aquellas modificaciones, validas para oligorribonucleotidos o acidos ribonucleicos de mayor longitud, que dan lugar a analogos de RNAs con resistencia incrementada a la hidrolisis, y que generalmente son modificaciones en la ribosa, tales como las que resultan en: RNAs 2’-O-metil-sustituidos (las modificaciones 2’-metoxi); RNAs 2’-O-metoxietil-sustituidos; LNAs (“locked nucleic acids”: acido nucleico bloqueado, en el que el residuo de la ribosa esta modificado con un puente extra que conecta el oxlgeno de 2’ y el carbono de 4’ y bloquea a la ribosa en la conformation 3’-endo); BNAs (“bridged nucleic acid”: acido nucleico con puentes); PMOs (acidos nucleicos donde la ribosa ha sido sustituida por un grupo morfolino), o PNAs (“peptide nucleic acid”: acido nucleico peptldico, donde el grupo ribosa-fosfato se sustituye por un residuo de aminoacido, de forma que el analogo de nucleotido tiene por esqueleto una estructura de unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptldicos). Ultimamente se estan utilizando tambien nucleotidos con un tipo adicional de qulmica: los CRN (“Conformationally Restricted Nucleotides”), en los que el residuo de ribosa se encuentra bloqueado en una conformacion rlgida mediante un resto qulmico que actua como conector, modificacion que se esta usando principalmente para obtener antagomiRs con nuevas propiedades (ver, por ejemplo, la informacion proporcionada en la pagina web: http://www.marinabio.com/pipeline/nucleic-acid-drugs/). Son tambien comunes, y se consideran igualmente incluidas dentro de las posibles modificaciones que dan lugar a analogos de oligorribonucleotidos de la invencion, las modificaciones que dan lugar a enlaces fosforotioato, que son modificaciones que afectan a grupos fosfato que forman parte del “esqueleto” de la cadena de nucleotidos, dando lugar a la introduction de un atomo de azufre en sustitucion de un atomo de oxlgeno del grupo fosfato que no esta actuando como puente entre nucleotidos; estas modificaciones hacen que las uniones entre nucleotidos sean resistentes a la degradation por nucleasas, por lo que es habitual que se introduzcan entre los ultimos 3-5 nucleotidos en los extremos 5’ o 3’ de oligonucleotidos para inhibir su degradacion por exonucleasas, aumentando su estabilidad. Es habitual representar los analogos de ribonucleotidos fosforotioados anteponiendo a la abreviatura de la base una r y colocando detras un asterisco (p.ej., rA*), mientras que las bases 2’-O-metiladas y unidas a fosforotioato pueden encontrarse representadas con una letra m delante de su abreviatura y un asterisco detras (p.ej., mA*). Por su frecuencia de uso dentro del grupo de los antimiRs, se incluye tambien entre las modificaciones qulmicas que dan lugar a analogos de oligorribonucleotidos de la invencion la metilacion en 5’ de la base nitrogenada citosina (C), lo que parece incrementar la estabilidad de los duplex que se forman con la diana.

Son posibles y conocidas tambien otras distintas modificaciones qulmicas, que quedan comprendidas igualmente dentro de las modificaciones posibles que dan lugar a analogos de oligorribonucleotidos. Como puede deducirse de la definition de “moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica” y la de “analogos de oligorribonucleotidos”, quedan comprendidas tambien dentro de la definicion de analogos de oligorribonucleotidos las moleculas que puedan considerarse de caracter hlbrido, en las que unas unidades presentan modificaciones y otras no, asl como los hlbridos entre analogos de acidos nucleicos y peptidos o, incluso, las moleculas hlbridas en las que algunas de las unidades nucleotldicas son ribonucleotidos (o analogos de los mismos) y otras son desoxirribonucleotidos (nucleotidos donde el azucar es desoxirribosa), asl como los analogos de estos ultimos, es decir, los hlbridos RNA-DNA y los analogos de ellos.

Para los propositos de la presente invencion, se consideran incluidos dentro de las moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica o los analogos de oligorribonucleotidos los inhibidores, bloqueantes o antagonistas de miRNAs de los tipos conocidos como antagomiRs, blockmiRs, antimiRs y las esponjas de miRNAs.

Asl, por ejemplo, en el Ejemplo 1 de la presente memoria se utilizan moleculas que corresponden a este grupo de compuestos y que estan formados por varias unidades de ribonucleotidos, las esponjas de miRNAs o miRNAs esponja (en ingles, microRNA sponges), que son transcritos expresados desde promotores fuertes que contienen multiples sitios de union a un microRNA de interes, colocados en tandem. Los miRNAs esponja habitualmente estan disenados de manera que inhiben miRNAs con un fragmento heptamerico u octamerico complementario (region semilla), de forma que una unica construction esponja puede utilizarse para bloquear toda una familia de miRNAs que compartan el mismo motivo, aunque tambien pueden contener toda la secuencia diana para un miRNA especlfico. El termino “construccion esponja” se utiliza a veces indistintamente para hacer alusion a los vectores a partir de los cuales se expresan los miRNAs esponja y a las moleculas de RNA expresadas a partir de los mismos. Por cuestiones de claridad, en la presente memoria, se ha procurado reservar el termino “construccion esponja” para el vector a partir del cual se expresa el miRNA esponja como tal o bien para el fragmento especlfico del vector que codifica el miRNA esponja expresado, pero se habla del efecto de dichas construcciones cuando se alude a los efectos encontrados cuando se ha producido la expresion de los correspondientes miRNAs esponja en las celulas o tejidos en ensayo.

Dado que las esponjas de miRNAs no son totalmente especlficas, sino que pueden bloquear, silenciar o inhibir varios miRNAs que compartan un mismo motivo, para evitar en lo posible efectos no deseados y que se vean afectados genes que no tienen ninguna implication en la DM1, en la presente invention se tiene preferencia por inhibidores especlficos de los grupos de los llamados blockmiRs, los antimiRs o los antagomiRs, especialmente por estos ultimos. En los tres casos se trata de oligonucleotidos con modificaciones qulmicas que impiden que una serie de moleculas se unan a un lugar concreto de una molecula de mRNA, aunque hay algunas diferencias entre ellos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los blockmiRs son pequenos RNAs de qulmica especial disenados contra la secuencia que un miRNA concreto detecta en un RNA mensajero (mRNA) concreto, por lo que, en un principio, cada uno de ellos solo deberla desreprimir el efecto de ese miRNA sobre ese transcrito, siendo esperable un efecto muy especlfico. Por tanto, se disenan de forma que tengan una secuencia que sea complementaria a la de un fragmento de la secuencia de un mRNA que sirve como sitio de union para un miRNA, de tal forma que se suelen unir en el extremo 3’ de la region no traducida (UTR) de un mRNA, es decir, en la zona en la que se suelen unir los miRNAs endogenos.

Los antagomiRs, en cambio, se utilizan en general para silenciar miRNAs endogenos. Por tanto, se denomina antagomiRs a pequenos RNAs sinteticos, qulmicamente modificados con respecto al correspondiente oligomero de RNA compuesto solo por unidades de ribonucleotidos, y que son complementarios a un miRNA diana. Por tanto, pueden considerarse analogos de oligonucleotidos que se unen especlficamente a miRNAs concretos y, por ello, actuan como inhibidores/bloqueantes de miRNAs. Como un miRNA puede tener muchos transcritos diana, el uso de antagomiRs puede dar lugar en ocasiones a efectos colaterales indeseables, por quedar afectados mRNAs que no se deseaba modular. Habitualmente, los antagomiRs incluyen modificaciones qulmicas en sus unidades, en comparacion con los ribonucleotidos, tales como grupos 2-O-metilo, fosforotioatos y restos de colesterol conjugados; tambien es habitual que incluyan al menos una modification que o bien de lugar a algun tipo de impedimento para la actuation de la protelna Ago2 o bien a un apareamiento imperfecto entre el antagomiR y el miRNA diana, evitando con ello que se produzca la escision mediada por Ago2. Tal como recogen Wang et al. en su revision sobre implicaciones de microRNAs en enfermedades hepaticas (Wang et al., 2012), se ha informado de que los antagomiRs inhiben su miRNA diana, de manera dependiente de dosis, en diferentes tejidos de ratones cuando se administran por via intravenosa como moleculas desnudas. Entre otros efectos, se conoce que un antagomiR del miR-221 fue capaz de bloquear el crecimiento de xenoinjertos de tumores de HCC en ratones y prolongar su supervivencia. La via cutanea tambien es una via habitual de administration de antagomiRs.

Por su parte, los antimiRs, habitualmente son complementarios a solo una parte del miRNA maduro que es su diana, la llamada region semilla, pero se unen a el con gran afinidad, debido a que presentan modificaciones que incrementan en gran medida la union con su diana, tales como las propias de los LNAs antes descritas o, en ocasiones tambien, como ya se ha comentado, la metilacion en 5’ de la base nitrogenada citosina (C), lo que tambien parece incrementar la estabilidad de los duplex que se forman con la diana. Rottiers et al. observaron no solo la inhibition efectiva de familias de miRNAs utilizando antimiRs dirigidos a la region semilla de dichos miRNAs, de solo 8 unidades de analogos de nucleotidos con modificaciones tipo LNA, sino tambien la eficacia y seguridad de estos tratamientos a largo plazo en primates no humanos. Tal como recogen tambien Wang et al., en la referencia antes citada (Wang et al., 2012), estas pequenas moleculas presentan una potente actividad en todo un rango de tejidos de raton, rata, mono y chimpance tras su administracion sistemica como moleculas desnudas, a dosis considerablemente menores que las de otros inhibidores. El antimiR SPC3649, por ejemplo (Landford et al., 2010) se ha utilizado en estudios cllnicos en fase 2a para pacientes con infection cronica del virus de la hepatitis C (ClinicalTrials.gov No. NCT01200420).

Como puede deducirse de las definiciones anteriores, el diseno de inhibidores / antagonistas de microRNAs parte habitualmente de una secuencia basica de ribonucleotidos corta, que puede ser la secuencia complementaria al microRNA a inhibir (es lo habitual en antagomiRs y antimiRs, asl como tambien en esponjas de microRNAs) o bien la secuencia del propio microRNA o una secuencia complementaria a una zona del mRNA al que se une el microRNA (caso de los blockmiRs). Tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende que dos cadenas de moleculas de naturaleza nucleotldica son complementarias en un 100% (o, como se expresa de forma mas abreviada en la presente memoria, que sus secuencias son complementarias) cuando la secuencia de nucleotidos o analogos de nucleotidos de una de ellas, lelda en sentido 5’-3’, es la secuencia de los nucleotidos o analogos de nucleotidos que presentan las bases nitrogenadas con las que se aparean las bases nitrogenadas de los nucleotidos o analogos de nucleotidos de la otra secuencia, lelda en sentido 3’-5’. Es decir, la secuencia 5’-UAGC-3’ serla complementaria a las secuencias 3’-AUCG-5’ (en el caso de ser las unidades ribonucleotidos o analogos de ribonucleotidos) y 3’-ATCG-5’ (en el caso de ser las unidades dexosirribonucleotidos o analogos de dexosirribonucleotidos), que serlan, respectivamente, las secuencias 5’-GCUA-3’ y 5’-GCTA-3’ en sentido 5’-3’. En algunos casos, particularmente en el diseno de antimiRs, es importante que la molecula antagonista comprenda un fragmento que es identico a la secuencia complementaria a la de la region semilla del microRNA al que quiere antagonizar, al menos en lo que se refiere a la complementariedad de las bases nitrogenadas. Y es que a menudo, especialmente en el caso de los antagomiRs y los antimiRs, se incorporan modificaciones a las correspondientes unidades de ribonucleotidos, que afectan principalmente al residuo de la ribosa y/o al fosfato, modificaciones que son diflciles de indicar en las representaciones habituales de secuencias de nucleotidos, donde el nucleotido presente en una determinada posicion se identifica por la abreviatura de la base nitrogenada que forma parte del mismo. Por ello, en la presente invention, se encuentran comparaciones de moleculas de antagonistas de microRNAs que hacen referencia al porcentaje de identidad entre las secuencias de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o analogos de ribonucleotidos presentes en dichas unidades, pues es lo que puede indicar si dos moleculas o fragmentos de secuencia estan disenadas partiendo de la misma secuencia de ribonucleotidos basica de partida, aunque se le hayan podido incorporar a los ribonucleotidos distintas modificaciones qulmicas en cada caso.

Para disenar las moleculas antagonistas, es importante tener en cuenta que exista suficiente complementariedad con las moleculas endogenas a las que deban unirse para que realmente se produzca el efecto de inhibition / antagonismo / silenciamiento deseado. En ese sentido, pueden tenerse en cuenta ejemplos de que la complementariedad “tlpica” entre un miRNA y su diana puede ser del 50% (ver, por ejemplo, la referencia http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/detail.php?mirtid=MIRT000125#target), por lo que es recomendable que la molecula de naturaleza oligorribonucleotldica de la invencion comprenda un fragmento de secuencia de unidades de ribonucleotidos, o de analogos de ribonucleotidos, en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es identica al menos en un 50% (o al menos en un 55%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5%, o un 100%), a la secuencia complementaria a la del fragmento de la molecula endogena con la que se tenga que aparear, es decir, a la secuencia del microRNA endogeno con el que se deba unir (en el caso de antagomiRs y de la secuencia repetitiva de las esponjas de miRNAs) o la secuencia del fragmento del mRNA mensajero (en el caso de blockmiRs). En el caso de antagomiRs, cuya longitud suele ser aproximadamente igual a la de los miRNAs cuya accion tienen que antagonizar, se prefiere especialmente que la secuencia de las bases nitrogenadas de sus unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos sea identica al menos en un 80% (o al menos en un 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5%, o un 100%), a la secuencia complementaria a la del microRNA endogeno al que tienen que antagonizar; este es el criterio que se ha seguido para el diseno de antagomiRs contra los microRNAs humanos miR-218-5p y miR-23b-3p. En el caso de los antimiRs, lo mas importante es que comprendan un fragmento en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de los nucleotidos o analogos de nucleotidos sea complementaria (preferiblemente, complementaria al 100%) a la secuencia de las bases nitrogenadas de los nucleotidos de la region semilla del miRNA maduro que es su diana, por lo que la complementariedad en el resto de los nucleotidos o analogos de nucleotidos que esten presente en el antimiR, de haberlos, es menos importante.

El alineamiento de secuencias para su comparacion se puede llevar a cabo con los algoritmos de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); o Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); mediante el metodo de busqueda de similitudes de Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988); o mediante las aplicaciones informaticas basadas en dichos algoritmos y metodologlas, incluidas pero sin limitarse a: CLUSTAL, en el programa PC/Gene de Intelligenetics (Mountain View, California, EE.UU.).; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group (GCG), Wisconsin EE.UU.) En particular, los programas de la familia BLAST, que estan basados en el algoritomo de Altschul et al. (Altschul et al., 1990), son de acceso publico (por ejemplo, a traves de la pagina del Centro Nacional para la Information Biotecnologica de EE.UU. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pueden utilizarse para realizar busquedas y calculos de identidad, y en especial, para los propositos de la invention, BLASTN, dedicado a nucleotidos.

Como puede verse en los ensayos que se describen y divulgan en los Ejemplos de la presente memoria, los presentes inventores han partido de la realization de una prueba de concepto en un modelo de DM1 de Drosophila melanogaster, en el que se sobreexpresan repeticiones de trinucleotidos CUG en el musculo. Este modelo se utilizo para explorar el potencial terapeutico del silenciamiento de microRNAs especlficos (miRNAs) impulsando con ello la expresion de muscleblind. Los ensayos realizados con dicho modelo, descritos en el Ejemplo 1, demuestran que es posible la regulation al alza de las protelnas muscleblind endogenas de Drosophila mediante el secuestro de miRNAs que modulan negativamente su expresion, concretamente mediante el uso de construcciones “esponja”. Para ello, se partio de un juego de miRNA identificados como potenciales reguladores de muscleblind, encontrando que solo el silenciamiento especlfico de dos de los miRNAs del juego inicial, dme-miR-277 o dme-miR-304, dio lugar al efecto directo deseado: un aumento de los niveles tanto de la protelna muscleblind como del correspondiente mRNA. Esta regulacion al alza tuvo como resultado la reversion de varios eventos de splicing erroneos y, con ello, el rescate de varios fenotipos parecidos a los slntomas de la DM1, como la reduction de la atrofia muscular. Las moscas en las que se llevo a cabo el ensayo mostraron una mejora de la funcion muscular en los ensayos de vuelo y de ascenso por superficies y un incremento de la esperanza de vida.

Analogamente, la presente memoria describe la identification, en celulas HeLa, de potenciales miRNAs que podrlan regular negativamente MBNL en seres humanos (MBNL1 y/o MBNL2), la selection de aquellos que efectivamente pareclan tener efectos reguladores, la comprobacion en modelos animales, concretamente de raton, de su expresion en tejidos de interes generalmente afectados en casos de DM1, el diseno de inhibidores (concretamente antagomiRs) para unos miRNAs concretos, comprobacion de la efectividad de los mismos para aumentar la expresion de MBNL1 y/o MBNL2 en mioblastos humanos y verification de que se corresponde con el rescate de varios eventos de splicing alternativo tlpicamente alterados en mioblastos de pacientes aquejados de DM1. Estos ensayos, unidos a la prueba de concepto anterior realizada en Drosophila, demuestran la eficacia de la estrategia disenada.

La prueba de concepto realizada en Drosophila, descrita en el Ejemplo 1, es tambien significativa porque mostro algunos hechos notables, a tener en cuenta para el diseno de inhibidores, bloqueadores o silenciadores espedficos de miRNAs, en particular para su aplicacion en el tratamiento de la DM1 en mamiferos, especialmente en humanos. En particular, merecen comentarse los siguientes:

- Como se ha comentado, aunque se partio de un juego de miRNA identificados como potenciales reguladores de muscleblind a partir de datos anteriores de los presentes inventores y de analisis bioinformaticos, solo el silenciamiento de dos ellos, dme-miR-277 (SEQ ID NO:29) y dme-miR-304 (SEQ ID NO:30), dio lugar a la regulacion al alza de la expresion del gen de Drosophila muscleblind, tanto a nivel de mRNA como de las propias protemas. Por tanto, la simple identificacion de motivos estructurales que puedan hacer indicar que un miRNA pueda tener un efecto en la regulacion de la expresion de MBNL1 y/o MBNL2 no garantiza que sea un miRNA con efecto negativo en su expresion ni que el diseno de un inhibidor espedfico del mismo pueda dar lugar a los efectos deseados sobre la elevacion de los niveles de una y/u otra protema, en especial cuando lo que se desea es que dicho incremento de los niveles de las protemas se produzca en los tejidos adecuados y se vea acompanado por una mejora en los smtomas de la DM1.

- Tambien es interesante comentar que el analisis cuantitativo confirmo que cada construccion esponja daba lugar a la elevacion de los niveles de diferentes isoformas de muscleblind. Curiosamente, ambas construcciones esponja, miR-277SP y miR-304SP (las construcciones esponjas disenadas, espedficamente, para silenciar dme-miR-277 y dme-miR-304), fueron capaces de regular negativamente la expresion de las isoformas mblB y mblC, respectivamente, en lugar de aumentar la expresion, lo que sugiere algun tipo de regulacion interisoforma, tal como se ha demostrado previamente para las protemas MBNL (Kino et al., 2015; Terenzi et al., 2010). Este hecho indujo a los presentes inventores a plantearse la identificacion en celulas humanas de miRNAs que fueran o bien inhibidores de MBNL1 o de MBNL2 o de ambas, para controlar posibles efectos reguladores o compensatorios entre ambas protemas o entre los miRNAs que regulan su expresion.

- Los ensayos de inmunodeteccion de la protema en el tejido muscular de moscas que expresaban una de las construcciones esponja, miR-304SP y miR-277SP, demostraron la sobreexpresion de Muscleblind en ambos casos, aunque en diferentes localizaciones subcelulares: miR-277SP provoco un incremento preferentemente en bandas sarcomericas y miR-304SP en los nucleos. Merece mencionarse que en ninguno de los dos casos se detecto la retention de Muscleblind en foci ribonucleares los cuales no se detectan en secciones de IFMs de torax de mosca mediante una sonda disenada para detectar las expansiones (sonda "CAG”). Finalmente, consistentemente con los conocimientos previos que indican que la isoforma MblC se localiza en el nucleo y con regulation preferencial de la expresion de MblC por parte de miR-304SP, pudo confirmase que la expresion de miR-304SP permitio rescatar un numero de eventos de splicing erroneos dependientes de Muscleblind. Tomandolos en conjunto, estos datos confirman que la regulacion al alza de muscleblind conseguida mediante el silenciamiento de miRNAs reguladores especlficos es suficiente para rescatar las caracterlsticas moleculares crlticas alteradas en modelos de DM1 en moscas.

En el Ejemplo 1 se describe tambien el efecto positivo de la expresion de las construcciones esponja miR-277SP y miR-304SP sobre la recuperation de la atrofia muscular, que es un fenotipo caracterlstico de DM1.

Expresando las construcciones esponja con el conductor (“driver’) Mhc-Gal4, tambien se probaron los efectos de la sobreexpresion de Muscleblind a largo plazo. En las moscas control, se observo que la expresion de miR-304SP, provoco un aumento de 6 veces en la expresion relativa de muscleblind y no tuvo efecto sobre el area del musculo, la supervivencia o la funcion del aparato locomotor. Sin embargo, la expresion de miR-277SP, que produjo una regulacion al alza de 15 veces de muscleblind, causo una reduction significativa en el area de musculo, que se correlaciona con una disminucion de la altura de aterrizaje. En un fondo que expresa CTG, sin embargo, la expresion de cualquiera de las construcciones esponja provoco efectos beneficiosos, lo que sugiere que la sobreexpresion limitada de transcritos de dianas naturales adicionales de los miRNAs bloqueados es insignificante en comparacion con los efectos positivos de estimular la expresion de muscleblind. Esto es importante, porque podrlan producirse efectos deletereos de miR-277SP por la sobreexpresion de varias de sus dianas, ademas de muscleblind, dado que dme-miR-277 es uno de los miRNAs con la mas alta expresion en el musculo. Estudios previos han confirmado que la sobreexpresion a largo plazo de MBNL1 en modelos de raton es bien tolerada cuando se limita al musculo esqueletico. La sobreexpresion de MBNL1, incrementada en el intervalo de 10 a 17 veces, no causo ninguna histopatologla detectable o anomallas funcionales (Chamberlain & Raum, 2012). Estos resultados se interpretaron como un respaldo a la estrategia de intentar inhibir / silenciar / disminuir / antagonizar la actividad de miRNAs especlficos implicados en la regulation negativa de las protelnas MBNL1 y/o MBNL2 en mamlferos, particularmente humanos, como un medio para paliar los slntomas de DM1, sin producir efectos secundarios indeseables en otras funciones del individuo que esta necesitado de recibir el tratamiento.

Asl, estos resultados indicaron que el bloqueo de miRNAs represores de MBNL en humanos u otros mamlferos podrla igualmente reducir los slntomas de DM1, proporcionando una prueba de concepto del potencial terapeutico de la regulation al alza de Muscleblind mediante bloqueadores de miRNAs especlficos en pacientes con DM1. Asl, el estudio con el modelo de Drosophila de la DM1 divulgado en la presente memoria sienta las bases para la evaluation de los bloqueadores de miRNAs que reprimen la expresion de muscleblind (o, mas bien, de las protelnas homologas en mamlferos como los seres humanos) como diana terapeutica valida y eficaz para el tratamiento de la DM1.

Con esta base, los presentes inventores abordaron un estudio de identification de posibles miRNA represores de las protelnas humanas MBNL1 y/o MBNL2, para comprobar despues si podia utilizarse una estrategia analoga de inhibir/bloquear uno o varios de dichos miRNAs para aumentar los niveles de las protelnas MBNL1 y/o MBNL2 y, con ello, conseguir rescatar fenotipos caracterlsticos de DM1, como prueba de que la inhibition de dichos miRNAs podia servir para el tratamiento de slntomas caracterlsticos de dicha enfermedad.

Tal como se describe en el Ejemplo 2, se realizo un cribado (“screening’) inicial, para identificar potenciales represores de uno de dichos genes o de ambos, que identifico un total de 23 microRNAs candidatos, entre los cuales se hizo una preselection a partir de programas bioinformaticos, seleccionando aquellos para los que se hablan predicho dianas de union en las regiones 3’ UTR de uno o de los dos genes. Sin embargo, los ensayos de validation realizados indicaron que solo algunos de los microRNAs preseleccionados, efectivamente daban lugar a una disminucion de los niveles de la correspondiente protelna (MBNL1 o MBNL2) producto de los genes que en principio eran regulados por dicho miRNA, incluso aunque se confirmo por aplicaciones bioinformaticas complementarias la presencia de dianas de union para el correspondiente microRNA en la region 3’ no traducida (3’ UTR). La disminucion de los niveles de protelna producidos, en los casos en los que realmente existio, tampoco fue del mismo nivel para todos los microRNAs, siendo mas pronunciado en algunos casos, destacando los de los microRNAs miR-23b-3p (al que se alude en forma abreviada en la memoria como miR-23b) y miR-218-5p (al que se alude en forma abreviada en la memoria como miR-218). Esto muestra, como ya apuntaban los ensayos previos realizados en el modelo de Drosophila, que la identification de hipoteticas dianas de union en la 3’UTR del RNA mensajero de un gen o de otros motivos que puedan indicar una supuesta interaction no garantiza ni hace esperable que un microRNA realmente sea un modulador de un gen, preferiblemente directo, ni que el bloqueo o inhibition de dicho microRNA realmente de lugar a la modulation deseada que, en este caso, era un aumento de los niveles de la protelna MBNL1 y/o de la protelna MBNL2.

Ademas, se comprobo si los miRNAs preseleccionados se expresaban en los organos mas afectados por los slntomas caracterlsticos de la enfermedad, como son organos del Sistema Nervioso Central tales como el cerebro, el cerebelo o el hipocampo, as! como el musculo esqueletico y el corazon. Los ensayos realizados con diferentes tejidos de raton mostraron que la expresion de los microRNAs endogenos de dicho animal miR-23b y miR-218 en distintos tejidos relacionados con los organos citados (cerebro anterior, cerebelo, hipocampo, corazon, cuadriceps y gastronomio) fueron muy superiores a las de los restantes microRNAs preseleccionados, especialmente en el caso del miR-23b, que fue muy superior en todos los tejidos. Estos datos indican que la inhibition de los mismos microRNAs podrla servir para tratar casos de distrofia miotonica 1 en otros mamlferos.

Tambien se realizaron determinaciones de expresion genica a partir de biopsias musculares de seres humanos, observandose que los niveles de miR-218 y miR-23b estaban claramente incrementados en los pacientes de DM1 con respecto a los controles no aquejados por la enfermedad. Tambien se observo un incremento del miR-218 en los fibroblastos obtenidos de pacientes con DM1 respecto a los controles. Estos datos son interesantes pues, tomados en conjunto con los ensayos de eficacia realizados con antagomiRs en el Ejemplo 3, indican que los cultivos de llneas establecidas o los cultivos primarios de celulas obtenidas de tejidos de interes de pacientes, como pueden ser los miocitos de musculo esqueletico, pueden ser de utilidad para realizar ensayos y comprobar la eficacia de posibles bloqueantes o inhibidores de distintos miRNAs y observar si ciertas alteraciones moleculares caracterlsticas de la enfermedad muestran una mejora o resultan paliadas mediante los inhibidores en ensayo, como una indicacion de un efecto paliativo de slntomas de la enfermedad. Y eso es importante para facilitar los estudios, pues los modelos de raton existentes no reproducen todos los slntomas de la enfermedad humana, sino principalmente los slntomas relacionados con la disfuncion muscular.

Estos ensayos, junto con los ensayos de comprobacion de la interaccion directa de los microRNAs miR-218 y miR-23b con los correspondientes mRNAs mensajeros (vease el ensayo con la luciferasa de Gaussia), dieron lugar a que se eligieran estos microRNAs como los microRNAs de preferencia a inhibir / antagonizar, para los cuales desarrollar inhibidores / antagonistas.

Los microRNAs miR-218-5p y miR-23b-3p, al contrario que otros microRNAs inicialmente ensayados, tienen en comun que cumplen las caracterlsticas que se buscaba que deblan cumplir los microRNAs candidatos a desarrollar inhibidores contra ellos con el objetivo de paliar slntomas caracterlsticos de la DM1, como son:

- Ambos parecen ser microRNAs represores de al menos uno de los genes sobre los que se deseaba actuar, los genes homologos en seres humanos del gen muscleblind de Drosophila, MBNL1 o MBNL2, represores que, segun los ensayos del Ejemplo 2, tienen una accion directa sobre los correspondientes RNAs mensajeros, lo que disminuye el riesgo de que sus potenciales inhibidores afecten otras rutas o vean disminuido su efecto mediante la regulacion endogena de pasos intermedios necesarios hasta que se produjera su accion sobre los genes deseados.

- Ambos muestran expresion en tejidos de organos relacionados con slntomas caracterlsticos de la enfermedad, como las alteraciones musculares, tanto las relacionadas con la movilidad como las cardiacas, o las alteraciones neurologicas. En particular, ambos muestran un incremento claro en sus niveles en muestras de biopsias musculares de pacientes con DM1, por lo que los ensayos de bloqueo o inhibition de esos microRNAs en celulas y la observation de sus efectos sobre alteraciones moleculares relacionadas con la enfermedad, tales como las alteraciones del splicing alternativo, pueden ser indicativas de la efectividad de su bloqueo o inhibicion para paliar slntomas de la enfermedad.

A pesar de estas coincidencias, que muestra que la election preferencial de estos microRNAs para proceder a su bloqueo o inhibicion responde a un mismo concepto inventivo, debe destacarse la diferencia significativa entre ellos de que el miR-218 es solo represor de MBNL2, mientras que miR-23b es represor tanto de MBNL1 como de MBNL2. Ademas, miR-218 esta significativamente aumentado en biopsias musculares de pacientes (miR-23b muestra una tendencia al alza, aunque no significativa en los datos experimentales disponibles) de modo que su bloqueo no solo anticipa la desrepresion de MBNL2, que ya se sabe que es una diana terapeutica, sino que mitigara los efectos aguas abajo que la sobreexpresion de miR-218 pudiera estar provocando sobre otros transcritos musculares, constituyendo por tanto una diana terapeutica en si misma.

Ademas, aunque los ensayos presentados en la presente memoria confirman la expresion de ambos microRNAs en tejidos de interes relacionados con slntomas de la enfermedad, la busqueda de los tejidos de expresion en la base de datos miRGator, version 3.0 (v3.0) (http://mirgator.kobic.re.kr) revela algunas diferencias entre ambos microRNAs, presentando el miR-23b un abanico de tejidos mas amplio. En concreto, segun miRGator v3.0, miR-218 se expresa en: tejido adiposo, cerebro, sistema nervioso central, rinon, corazon, hlgado y sistema biliar, pulmon, faringe, nasofaringe, nariz, placenta, bazo, celulas madre, testlculo, utero; miR-23b, por su parte, se expresa en: sistema nervioso central, tracto gastrointestinal, tejido adiposo, mama, vejiga, corazon, queratinocitos, rinon, hlgado y sistema biliar, pulmon, celulas linfoides, nariz, faringe, placenta, prostata, piel, bazo, celulas madre, testlculo, glandula tiroides y utero. Asl, puede considerarse una posible realizacion de la invention una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido que es un antagonista de un microRNA que regula a la baja la expresion del gen humano MBNL1 y/o MBNL2, o a una mezcla de dos o mas de dichas moleculas y que se expresa al menos en uno o mas organos seleccionados del grupo de cerebro, cerebelo, hipocampo u otro organo del sistema nervioso central, musculo esqueletico, corazon, tejido adiposo, rinon, hlgado y sistema biliar, pulmon, faringe, nasofaringe, nariz, placenta, bazo, testlculo, utero, tracto gastrointestinal, mama, vejiga, prostata, piel, queratinocitos y celulas linfoides o en una o mas celulas de un cultivo primario de uno de dichos organos o de una llnea celular establecida derivada de uno de dichos organos (incluidas las celulas madre pluripotentes inducidas, conocidas por sus siglas en ingles iPSCs:induced pluripotent stem cells) o celulas madre de uno de dichos organos. La election del microRNA concreto a antagonizar, particularmente, la eleccion concretamente entre el microRNA-218-5p humano o del microRNA-23b-3p humano, determinara tambien el abanico de tejidos donde puede ejercerse el efecto antagonico. Por otro lado, la administration del antagonista mediante un posible vector de expresion del mismo puede permitir dirigir la expresion a un tejido o grupo de tejidos concretos en funcion del tropismo del propio vector de base y/o mediante la eleccion de elementos de control que den lugar a la expresion de la secuencia codificante ligada a los mismos solo en tejidos concretos. Ademas, algunas formas de dosificacion concretas pueden favorecer un mayor acceso a unos u otros organos. Asl, puede considerarse tambien que una posible realizacion, combinable con cualquiera otra, del aspecto de la presente invencion mas directamente referido a la aplicacion terapeutica de la misma, podrla enunciarse como: uso de una de las moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica o un analogo de oligorribonucleotido de la invencion, una mezcla de dos o mas de ellas, o una composition que comprende al menos una de dichas moleculas, para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de la distrofia miotonica tipo 1 mediante la inhibition o el antagonismo de la action de un microRNA que regula a la baja la expresion del gen humano MBNL1 y/o MBNL2 en al menos uno o mas organos seleccionados del grupo de cerebro, cerebelo, hipocampo u otro organo del sistema nervioso central, musculo esqueletico, corazon, tejido adiposo, rinon, hlgado y sistema biliar, pulmon, faringe, nasofaringe, nariz, placenta, bazo, testlculo, utero, tracto gastrointestinal, mama, vejiga, prostata, piel, queratinocitos y celulas linfoides o celulas madre de uno o mas de dichos organos. Dado que se tiene especial preferencia por la inhibition o action antagonica sobre el microRNA-218-5p humano, tambien se tiene porque el organo u organos se seleccionen del grupo de cerebro, cerebelo, hipocampo u otro organo del sistema nervioso central, musculo esqueletico, corazon, tejido adiposo, rinon, hlgado y sistema biliar, pulmon, faringe, nasofaringe, nariz, placenta, bazo, testlculo y utero o celulas madre de uno de dichos organos, mientras la election del miR-23b-3p permite extender las posibilidades de election, segun el conocimiento actual, al menos a tracto gastrointestinal, mama, vejiga, prostata, piel, queratinocitos y celulas linfoides o celulas madre de uno o mas de dichos organos, o combinaciones de los mismos, segun se desee o se vea conveniente.

Los microRNAs humanos miR-218-5p (miR-218) y miR-23b-3p (miR-23b) difieren tambien en la secuencia de ribonucleotidos que los componen, as! como en su region semilla, lo cual se debe tener en cuenta para el diseno de inhibidores / silenciadores / antagonistas especlficos de cada uno de ellos. Se muestran a continuation las secuencias de sus versiones maduras, donde aparece en negrita la region semilla de cada uno de ellos, y el codigo de acceso a las mismas (MIMAT) en la base de datos de miRbase (www.mirbse.org):

miR-128-5p (MIMAT000275): 5’- UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’ (SEQ ID NO:3) miR-23b-3p (MIMAT0000418): 5’-AUCACAUUGCCAGGGAUUACC-3’ (SEQ ID NO:4)

Aunque los ensayos realizados en el modelo de Drosophila demostraron la viabilidad de la inhibition de la action de microRNAs represores mediante esponjas de microRNAs, y los ensayos de union de los microRNAs miR-218 y miR-23b a las 3’ UTR indicaron que el desarrollo de blockmiRs es tambien una estrategia posible para el bloqueo/inhibicion de la action de los microRNAs miR-218 o miR23b, los presentes inventores prefirieron optar por los antagomiRs, debido a que, como se explico antes, las modificaciones qulmicas que generalmente se realizan sobre ellos dan lugar a un aumento de la estabilidad que es interesante para su posible administration directa a seres humanos, as! como porque tambien la adicion de restos lipofllicos o de naturaleza lipldica que a menudo se incorporan en alguno de sus extremos suele facilitar su entrada en las celulas. Es por ello que los antagomiRs han sido los inhibidores de preferencia con la que se continuaron los ensayos, entre las posibles opciones para el desarrollo o identification de una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido que es un inhibidor de un microRNA que regula a la baja la expresion del gen humano MBNL1 y/o MBNL2, para su uso en el tratamiento de la distrofia miotonica 1, y en especial entre los inhibidores del microRNA-218-5p humano o del microRNA-23b-3p humano.

Como puede verse en el Ejemplo 3, los antagomiRs especlficos desarrollados, denominados antagomiR-218 y antagomiR-23b, presentan determinadas modificaciones qulmicas habituales en este tipo de analogos de oligorribonucleotidos, como las modificaciones 2’-O-metilo (2’-metoxi) en todos los restos de ribosa, la sustitucion de algunos enlaces fosfato entre las unidades monomericas analogas de nucleotidos por fosforotioato o la incorporation de restos de colesterol en un extremo de la molecula, concretamente en el extremo 3’, aunque, como se detallo mas arriba, son posibles otras distintas modificaciones, que darlan tambien moleculas compatibles con la presente invencion.

Los antagomiRs-23b y 218 demostraron ser capaces de penetrar en las celulas en los experimentos de transfection realizados. Los ensayos de toxicidad demostraron que las concentraciones que daban una senal apreciable de detection de dichos antagomiRs en celulas eran inferiores a la concentration inhibitoria que mata el 10% de las celulas (IC10) lo que apoya su seguridad y sus posibilidades de ser candidatos a moleculas para su uso para el tratamiento de la distrofia miotonica 1, ademas de permitir continuar con los ensayos.

Los ensayos de dosis respuesta realizados en mioblastos de pacientes de DM1 con uno u otro antagomiR, a diferentes dosis, mostraron que dichos antagomiRs son capaces de revertir el splicing aberrante de algunos genes que caracterlsticamente tienen ese proceso alterado en pacientes de DM1, lo que apoya su uso para la preparation de un medicamento para el tratamiento de la distrofia miotonica 1, en particular para paliar slntomas de la enfermedad, especialmente slntomas que se corresponden con la disfuncion muscular. No hubo coincidencia absoluta entre los eventos revertidos por uno u otro antagomiR, ni sobre las concentraciones preferenciales, por lo que la combination de ambos podrla ser interesante en algunos casos, aunque en otros podrla mostrarse preferencia por el antagomiR-218.

Dada la estabilidad de los antagomiRs, es posible plantearse su administracion a seres humanos directamente, por ejemplo por via subcutanea o sistemica, preferiblemente por via intravenosa, por ejemplo disueltos o en suspension en un vehlculo farmaceuticamente aceptable, tal como agua o alguna solucion acuosa como, por ejemplo, suero salino o tampon fosfato. La composition en la que se administren puede contener excipientes farmaceuticamente aceptables.

Estan tambien comprendidas dentro del alcance de la presente invention, las composiciones que comprendan uno de estos antagomiRs o sus mezclas, asl como cualquier otro antagomiR dirigido contra el microRNA-218-5p humano o el microRNA-23b-3p humano o mezclas de ellos, o en general cualquier molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o analogo de oligorribonucleotido que sea un inhibidor de uno de dichos microRNAs o de otro microRNA que regula a la baja la expresion del gen humano MBNL1 y/o MBNL2, incluidas las composiciones que comprendan tambien un vehlculo y/o excipientes farmaceuticamente aceptables. Ademas, dada la relation directa entre los vectores de expresion que expresen esponjas de miRNAs o, incluso, precursores de los microRNAs maduros que finalmente tienen efecto represor, se considera que esta tambien comprendida dentro del alcance de la presente invencion una composicion que comprenda un vector de expresion de una de dichas moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica, en particular los vectores que comprende la secuencia codificante de una esponja de microRNA que comprende multiples sitios colocados en tandem complementarios al microRNA-218-5p humano o al microRNA-23b-3p humano o una mezcla de multiples sitios de union colocados en tandem complementarios a cada uno de ellos.

Para su aplicacion cllnica, las composiciones de la presente invencion, que se consideraran entonces composiciones farmaceuticas de la presente invencion, se pueden preparar en una forma adecuada para la aplicacion deseada. Tal como se recoge en publicaciones tambien relacionadas con la aplicacion cllnica de inhibidores / antagonistas de microRNAs, como la solicitud internacional WO2012148373A1, generalmente esto implicara la preparation de composiciones que esten esencialmente libres de pirogenos, asl como de otras impurezas que podrlan ser perjudiciales para los seres humanos o animales. Dicha solicitud internacional WO2012148373A1 tiene por objeto compuestos analogos a los de la presente invencion y aplicaciones terapeuticas de los mismos, por lo que la informacion sobre formas de preparacion y presentacion de composiciones farmaceuticas, posibles vehlculos de administration adecuados, o formas y vlas de administration pueden considerarse aplicables a la presente invencion y puede tomarse como referencia para las composiciones de la presente invencion. Parte de dicha information se reproduce mas abajo.

En una posible realization, la composition farmaceutica comprende una dosis eficaz de un inhibidor o antagonista del microRNA-218-5p humano o del microRNA-23b-3p humano o una mezcla de los mismos. Por ejemplo, la composition farmaceutica puede comprender un inhibidor/antagonista del microRNA-218-5p humano o del microRNA-23b-3p humano, o mezclas de los mismos. Preferiblemente, el inhibidor/antagonista del microRNA-218-5p humano presente es el inhibidor de tipo antagomiR utilizado en los ejemplos de la presente invention (representado por SEQ ID NO:10) y el inhibidor/antagonista del microRNA-23b-3p humano presente es el inhibidor de tipo antagomiR representado por SEQ ID NO:11. Mas preferiblemente, el inhibidor(es)/antagonista(s) presentes estara presente a una concentration que permita la administration de una dosis terapeuticamente efectiva.

Una "dosis efectiva" o “dosis terapeuticamente efectiva” es una cantidad suficiente para efectuar un resultado cllnico beneficioso o deseado. Una dosis efectiva de un inhibidor/antagonista de un microRNA, de acuerdo con los resultados previos obtenidos con moleculas dirigidas contra otros microRNAs, puede ser de aproximadamente 1 mg / kg a aproximadamente 100 mg / kg, aproximadamente 2,5 mg / kg a aproximadamente 50 mg / kg, o aproximadamente 5 mg / kg a aproximadamente 25 mg / kg. La determination precisa de lo que se considerarla una dosis eficaz puede basarse en factores individuales para cada paciente, incluyendo su tamano, edad, y la naturaleza del inhibidor o antagonista (por ejemplo, si es una construction de expresion, un analogo de oligorribonucleotido tipo antagomiR o antimiR...). Por lo tanto, las dosificaciones se pueden determinar facilmente por los expertos normales en la tecnica a partir de esta description y el conocimiento en la tecnica. Puede ser necesario o conveniente administrar dosis multiples al sujeto durante un periodo de tratamiento particular, administrando dosis diarias, semanales, mensuales, cada dos meses, cada tres meses o cada seis meses. En ciertas realizaciones, el sujeto recibe una dosis inicial en un primer momento que es mayor que una o mas dosis posteriores o de mantenimiento.

Los sistemas de dispersion coloidal, tales como complejos de macromoleculas, nanocapsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en llpidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas, se pueden usar como vehlculos de administration de los inhibidores/antagonistas de la presente invencion, con los cuales se forma la composicion farmaceutica de la invencion. Las emulsiones grasas comercialmente disponibles que son adecuadas para la entrega de moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica a un sujeto incluyen Intralipid®, Liposyn®, Liposyn® II, Liposyn® III, Nutrilipid, y otras emulsiones de llpidos similares. Un sistema coloidal preferido para uso como vehlculo de administration in vivo es un liposoma (es decir, una veslcula de membrana artificial). La preparation y uso de tales sistemas son bien conocidos en la tecnica. Las formulaciones ejemplares tambien se describen en US 5,981, 505; Estados Unidos 6.217.900; Estados Unidos 6.383.512; Estados Unidos 5.783.565; Estados Unidos 7.202.227; Estados Unidos 6.379.965; US 6, 127,170; Estados Unidos 5.837.533; Estados Unidos 6.747.014; y WO03 / 093449, que se incorporan aqul por referencia en su totalidad.

Otra posibilidad, como ya se ha comentado, es preparar las composiciones farmaceuticas de la invention utilizando sales y tampones apropiados para hacer que los vehlculos de administracion sean estables y ayudar en la captation por las celulas diana. Las composiciones de la presente invencion pueden ser composiciones acuosas que comprenden una cantidad eficaz del vehlculo de administracion y que comprenden o bien las moleculas de naturaleza oligonucleotldica de la invencion, de forma independiente o formando liposomas u otros complejos, o bien vectores de expresion de las mismas, disueltos o dispersos en un vehlculo farmaceuticamente aceptable o medio acuoso. Las expresiones "farmaceuticamente aceptable" o "farmacologicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alergicas o de otro tipo, cuando se administran a un animal o un ser humano. Tal como se usa en la presente memoria, "vehlculo farmaceuticamente aceptable" incluye disolventes, tampones, soluciones, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares aceptables para su uso en productos farmaceuticos de formulation, tales como productos farmaceuticos adecuados para la administracion a seres humanos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los ingredientes activos de la presente invencion, se contempla su uso en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Tambien se pueden incorporar en las composiciones ingredientes activos suplementarios, siempre que no inactiven las moleculas de la presente invencion o sus vectores de expresion.

Las composiciones activas de la presente invencion pueden administrarse por cualquiera de las vlas comunes, siempre que el tejido diana este disponible a traves de esa ruta. Esto incluye las vlas oral, nasal, o bucal y tambien, preferiblemente, la administracion puede ser por via intradermica, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Como se ha comentado previamente, es habitual que las composiciones que comprenden antagomiRs o antimiRs se formulen para la administration intravenosa o subcutanea. A modo de ilustracion, las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacologicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles llquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen generalmente un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas esteriles o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Generalmente, estas preparaciones son esteriles y fluidas en la medida que exista una facil inyectabilidad. Las preparaciones deben ser estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe conservarse frente a la action contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Los disolventes apropiados o medios de dispersion pueden contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol llquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos puede ser provocada por varios antibacterianos y agentes antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando los compuestos activos en una cantidad apropiada en un disolvente junto con cualesquiera otros ingredientes (por ejemplo, como se especifica anteriormente) como se desee, seguido de esterilizacion por filtration. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehlculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes deseados, por ejemplo, como se especifica anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparation incluyen secado al vaclo y liofilizacion tecnicas que producen un polvo del ingrediente(s) activo(s) mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solucion del mismo previamente esterilizada por filtracion.

Las composiciones de la presente invention generalmente se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protelna) derivadas de acidos inorganicos (acidos por ejemplo, clorhldrico o fosforico), o de acidos organicos (por ejemplo, acetico, oxalico, tartarico, mandelico), y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres de la protelna tambien se pueden derivar de bases inorganicas (por ejemplo, de sodio, potasio, amonio, calcio, o hidroxidos ferricos) o de bases organicas (por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, histidina, procalna y similares).

En cualquier caso, se recomienda que la preparation de las composiciones de la presente invencion siga practicas que garanticen una calidad minima para su uso en humanos, tal como las recogidas en la Gula de Buenas Practicas de Fabrication de Ingredientes Farmaceuticos Activos del Grupo de Trabajo Q7 de la Conferencia Internacional sobre la Armonizacion de Requisitos Tecnicos para el Registro de Agentes Farmaceuticos para Uso Humano ("ICH Q7 Guideline. Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredientes”, disponible en Internet en la direction: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q7/Step4/ Q7_Guideline.pdf, junto con su complemento de Preguntas y Respuestas, de 10 de junio de 2015, disponible en la direccion de Internet: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q7/ICH_ Q7-IWG_QA_v5_0_14Apr2015_FINAL_for_publication_17June2015.pdf).

Preferiblemente, se tendran tambien en cuenta otras directrices de calidad de la misma procedencia, a las que se puede acceder a traves de la pagina http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html, tales como la Q8, relativa al Desarrollo Farmaceutico, o la Q10, sobre el Sistema de Calidad Farmaceutico.

Tras la formulation, las soluciones se administran preferiblemente en una forma compatible con la formulacion de dosificacion y en tal cantidad que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones pueden ser facilmente administradas en una variedad de formas de dosificacion tales como soluciones inyectables, capsulas de liberacion de farmaco y similares. Para la administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion generalmente se tampona adecuadamente y el diluyente llquido primero debe hacerse isotonico por ejemplo, con solucion salina o glucosa suficiente. Tales soluciones acuosas se pueden utilizar, por ejemplo, para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. Preferiblemente, se emplean medios acuosos esteriles, como es conocido por los expertos en la tecnica, seleccionados particularmente a la luz de la presente description. A modo de ilustracion, una sola dosis se puede disolver en 1 ml de solution isotonica de NaCl y anadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusion propuesto, (ver por ejemplo, "Remington Pharmaceutical Sciences" 15a edition, paginas 1035- 1038 y 1570 a 1580). Necesariamente ocurriran algunas variaciones en la dosificacion dependiendo de la condition del sujeto que esta siendo tratado. La persona responsable de la administration, en cualquier caso, determinara la dosis apropiada para el sujeto individual. Por otra parte, para la administracion humana, las preparaciones deben cumplir los estandares biologicos de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza tal como lo requiere, por ejemplo, las Directrices de Calidad del ICH antes citadas o a normativa de la FDA.

La invention se ilustrara ahora con mas detalle con ayuda de los Ejemplos y Figuras que se muestran a continuacion.

Ejemplos

Los ensayos descritos en los Ejemplos que se presentan a continuation fueron llevados a cabo con los siguientes materiales y metodologlas:

- Stocks de Drosophila

La llnea de moscas MHC-Gal4 de la especie Drosophila melanogaster expresa el factor de transcripcion Gal4 de levaduras con el patron de expresion del gen de la cadena pesada de la miosina de Drosophila; por tanto, se expresa en toda la musculatura del insecto, incluyendo la musculatura somatica o esqueletica, la visceral o lisa, los musculos de la faringe y el vaso dorsal o corazon, entre otros. Se pueden adquirir a partir de repositorios centralizados (http://flystocks.bio.indiana.edu/) pagando una cuota para contribuir a su mantenimiento. Las llneas con esponjas de miRNAs (UAS-miR-SP) para los miRNAs de Drosophila dme-miR-92a, dme-miR-100, dme-miR-124, dme-miR-277, dme-miR-304 y contra una secuencia al azar como control negativo (conocidos por el termino ingles scrambled-SP, el control) se obtuvieron del Dr. T. Fulga (Fulga et al., 2015). Brevemente, las construcciones de miR-SP fueron disenadas con un casete de silenciamiento de 20 secuencias repetitivas complementarias a los miRNAs separadas por secuencias enlazadoras variables de cuatro nucleotidos (miR-92SP: SEQ ID NO:62; miR-100SP: SEQ ID NO:63; miR-124SP: SEQ ID NO:64; miR-277SP: SEQ ID NO:65; miR-304SP: SEQ ID NO:66). La llnea recombinante MHC-Gal4 UAS-i(CTG)480 fue generada segun han descrito Llamusi et al. (L lam usi et al., 2013). La co ns tru c tio n y ca racte rls ticas de las llneas de m oscas UAS-mblC y UAS-IR-mbl se ha descrito previam ente (G arc ia-C asado et al., 2002; Llam usi et al., 2013, respectivam ente): UAS-m blC es un transgen que expresa la iso form a m blC (descrita en el num ero de acceso N M _176210) de m uscleblind bajo el contro l del s is tem a G al4/UAS, m ientras que UAS-IR-mbl es un transgen que expresa una cons tru c tio n in terferente para s ilencia r todos los transcritos generados por splicing alternativo a partir del gen m uscleblind y que en test previos se ha v isto que es capaz de reducir la expresion de mbl hasta, al menos, el 50% de sus va lores norm ales. Todos los cruces se rea lizaron a 25 °C con a lim e n ta tio n es tandar para moscas.

-Extraccion de RNA, RT-PCR y qRT-PCR

Para cada replica bio logica, se extra jo el RNA tota l de 10 m achos adultos u tilizando Trizol (S igm a). Un m icrogram o de RNA se d ig irio con DNasa I (Invitrogen) y se re tro transcrib io u tiizando S uperS crip t II (Invitrogen) u tilizando hexanucleotidos a leatorios segun las recom endaciones del fabricante. Se utilizaron 20 ng de cDNA en una re a c tio n PCR estandar con Go taq po lim erasa (Prom ega) y los cebadores especlficos para ana liza r el splicing del exon 16 ' del gen Fhos y de los exones 3-5 del gen Tnt. C om o control endogeno se utilizo Rp49 utilizando 0,2 ng de cDNA. La qR T-PC R se llevo a cabo a partir de 2 ng cDNA m olde con SYBR G reen PCR M aster M ix (Applied B iosystem s) y cebadores especlficos (SEQ ID NO:31 a SEQ ID NO:50: ve r Tabla 1). Para el gen de referencia, Rp49, la qR T-PC R se llevo a cabo a partir de 0,2 ng de cDNA. El ciclo te rm ico se llevo a cabo en sis tem a Step One Plus Real Time PCR (Applied B iosystem s) segun cond ic iones estandar. En cada experim ento se llevaron a cabo tres rep licas b io log icas y tres rep licas tecnicas. Los datos de la expresion re la tiva respecto al gen endogeno y el grupo contro l se obtuvieron por el m etodo de 2"AACt. Los pares de m uestras se com pararon m ediante la prueba de la t de dos colas (a = 0,05), ap licando la co rre c tio n de W elch cuando fue necesario.

Tabla 1: RT-qPCR de expresion en Drosophila m elanogaster

-Western Blot

Para la e x tra c tio n de p ro te lna total, se hom ogeneizaron 20 to rax de hem bra en tam pon RIPA (NaCl 150 mM, 1,0% de IGEPAL, 0,5% de desoxico la to de sodio, 0,1% SDS, Tris-HCl 50 mM pH 8,0) mas cocte les de inh ib idores de pro teasas y de fosfa tasas (Roche Applied Science). Las pro te lnas to ta les se cuantificaron con el kit de ensayo de pro te lnas BCA (P ierce) usando a lbum ina de suero bovino com o estandar. 20 pg de las m uestras se desnatura lizaron durante 5 m in a 100°C, se reso lv ieron en geles de S D S-PAG E al 12% y se transfirie ron a m em branas de d ifluoruro de poliv in ilideno (PVDF). Las m em branas se b loquearon con leche en polvo desnatada al 5% en PBS-T (Na2HPO 48 mM, NaCl 150 mM, KH2PO 4 2 mM, KCl 3 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) y se realizo inmunodeteccion sobre las mismas siguiendo los procedimientos estandar. Para la detection de la protelna Mbl de Drosophila, el anticuerpo anti-Mbl (Houseley et al, 2005) se preabsorbio frente a embriones de tipo silvestre en estadio temprano (0-6 h tras puesta) para eliminar la union no especlfica de anticuerpos. Las membranas se incubaron con el anticuerpo primario pre-absorbido (durante toda la noche, 1:1000) seguido del anticuerpo secundario anti-IgG de oveja conjugado con peroxidasa de rabano (HRP) (1 h, 1:5000, Sigma-Aldrich). El control de carga se realizo con un anticuerpo anti-tubulina (incubation durante toda la noche, 1:5000, Sigma-Aldrich) seguido de incubation con un anticuerpo secundario anti-IgG de raton conjugado con HRP (1 h, 1:3000, Sigma-Aldrich). Las bandas se detectaron utilizando el sustrato para Western Blotting ECL (Pierce). Las imagenes fueron tomadas con un ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).

-Analisis histologico

La deteccion por inmunofluorescencia de Muscleblind en el musculo de las moscas y el analisis del area muscular en los torax de Drosophila se realizaron como se ha descrito previamente (Llamusi et al., 2013). Para la inmunodeteccion de Mbl se utilizaron criosecciones de torax de mosca que fueron incubadas 30 min con solution de bloqueo y toda la noche a 4°C con anticuerpo anti-Mbl a una dilution 1:500. Al dla siguiente se lavo el exceso de anticuerpo con PBS-T y se incubo 45 min con anticuerpo secundario contra IG de oveja conjugado con biotina a una dilucion 1:200. Tras lavar el anticuerpo secundario, se incubo con solucion ABC (VECTASTAIN ABC kit) 30 min, se lavo exceso de reactivo y se incubo 45 min con estreptavidina conjugada con el fluoroforo final a 1:1000. Las preparaciones se montaron en medio de montaje con DAPI.

El area muscular se determino a partir de secciones de torax embebidos en la resina epoxi. Brevemente, colocamos los torax en un tubo con 200 pl de la solucion 1 (% paraformaldehldo 4 %, % glutaraldehldo 8 %, % Na2HPO40,2 M y % NaH2PO40,2 M) en hielo. A continuation, se anadieron 200 pl de la solucion 2 (mezcla 1:1 solucion 1 y tetraoxido de osmio) y se incubo 30 min en hielo. A continuacion, se sustituyo la mezcla por 200 pl de la solucion 2 y se incubo en hielo durante 1-2 h. Tras la fijacion, se deshidrataron las muestras mediante pases de 5 min en etanol al 30%, 50% y 70% en hielo, y al 90% y 100% (2X) a temperatura ambiente. A continuacion, se llevaron a cabo dos pases de 10 min en oxido de propileno. Por ultimo, las muestras se dejaron toda la noche en una mezcla 1:1 de oxido de propileno y resina epoxi. Al dla siguiente, el llquido se sustituyo por resina epoxi pura, y esta se dejo penetrar en las muestras durante al menos 4 h. Pasado este tiempo, las moscas fueron colocadas y orientadas en moldes con resina y se dejaron polimerizar toda la noche en un horno Pasteur a 70 °C. Las muestras fueron cortadas con una cuchilla de diamante en secciones transversales de 1,5 pm en un ultramicrotomo. Las secciones se colocaron en portas gelatinizados con una gota de medio de montaje DPX y se cubrieron con un cubreobjetos para su posterior observation al microscopio optico.

-Deteccion de foci

Los torax de las moscas a analizar se fijaron durante una noche en paraformaldehldo al 4% en PBS a 4°C, posteriormente se mantuvieron en una solution de sacarosa 30% en PBS durante 2 dlas. Transcurridos los 2 dlas, los torax fueron embebidos en OCT y congelados en nitrogeno llquido y mantenidos a -80°C hasta su procesado, momento en el que se obtuvieron secciones transversales de 15 pm con el criomicrotomo Leica CM 1510S. Los portaobjetos con los cortes de torax se lavaron tres veces con PBS 1X (5 min) y se les anadio el tampon de acetilacion. Tras 10 min con este, se lavaron tres veces (5 min) con PBS 1X y se prehibridaron durante 30 min con solucion de hibridacion (10 ml formamida desionizada, 12 pl de 5M NaCl, 400 pl de 1M Tris-HCl pH=8, 20 pl 0,5M EDTA pH=8, 2 g Dextrano sulfato, 400 pl solucion Denhart’s 50X, 1 ml de esperma de arenque (10 mg/m), H2O hasta un volumen final de 20 ml. La sonda marcada (Cy3-5’CAGCAGCAGCAGCAGCAGCA3’-Cy3: SEQ ID NO:61, Sigma) tras calentarla a 65°C durante 5 min se anadio a los portaobjetos disuelta en tampon de hibridacion (1/100) y se dejo hibridar a 37°C durante la noche en una camara humeda y oscura. Al dla siguiente se lavo con SSC2X manteniendo las preparaciones a 32°C (2 x 15 min) y 3 x 5 min lavados con PBS. Finalmente se montaron los portaobjetos con Vectastain y se tomaron fotograflas utilizando un microscopio confocal FLUOVIEW FV1000 con el objetivo de 40X.

-Analisis de la tasa de supervivencia en Drosophila

Se recogieron un total de 120 moscas recien nacidas con los genotipos adecuados y se mantuvieron a 29°C. Las moscas se transfirieron a medios nutritivos frescos nuevos cada dos dlas y el numero de muertes se contabilizo a diario. Las curvas de supervivencia se obtuvieron utilizando el metodo de Kaplan-Meier y el analisis estadlstico se realizo con una prueba de rango logarltmico (log-rank test, de Mantel-Cox) (a = 0,05) utilizando el software GraphPad Prism5.

-Ensayos funcionales

Los ensayos de vuelo se realizaron en el dla 5 de acuerdo con lo descrito por Babcok et al. (Babcock et al., 2014) utilizando 100 moscas macho por grupo. El ensayo consiste en lanzar un grupo de moscas, a traves de un embudo, a un cilindro de aproximadamente un metro de altura y 15 cm de diametro. Dicho cilindro esta recubierto por una lamina de plastico impregnada con un pegamento de modo que las moscas bien vuelan y se mantienen en el aire en la parte alta del cilindro, y quedan pegadas alll, o bien caen a la parte baja del mismo y quedan pegadas si vuelan deficientemente. La altura de aterrizaje se comparo entre los grupos utilizando la prueba de la t de dos colas (a = 0,05). Para evaluar la velocidad de ascension grupos de diez machos de 5 dlas de edad se transfirieron a pipetas desechables (de 1,5 cm de diametro y 25 cm de altura) despues de un perlodo de 24 h sin anestesia. Se registro con una camara la altura alcanzada por cada mosca desde la parte inferior del vial en un perlodo de 10 s. Para cada genotipo se probaron dos grupos de 30 moscas. Para la comparacion de pares de muestras se utilizo la prueba de la t de dos colas (a = 0,05), aplicando la correction de Welch cuando fue necesario.

-Screening basado en librerlas de microRNAs mimeticos (SureFIND Transcriptome PCR Array, Qiagen)

En este estudio se utilizo el kit "Cancer miRNA SureFind Transcriptome PCR Array' (Qiagen) para identificar posibles miRNAs reguladores de MBNL1 y 2. El ensayo de qPCR multiplex se llevo a cabo mediante uso de sondas Taqman comerciales (QuantiFast Probe PCR Kits, Qiagen) para cuantificar la expresion de MBNL1 y 2 (genes de interes, marcados con el marcador fluorescente FAM: fluorescelna, de ThermoFisher) y GAPDH (como gen endogeno, marcado con el fluoroforo conocido como MAX o Fluoro-Max, tambien de ThermoFisher). Los cambios en la expresion de MBNL1 y 2 como resultado del tratamiento con cada microRNA mimetico especlfico fueron calculados respecto al control negativo mimetico (un microRNA no existente en la naturaleza) y normalizados respecto a GAPDH. Los cambios observados fueron representados en forma de log2 y sometidos a analisis estadlstico AACt (MAD) para la selection de los miRNAs candidatos positivos.

-Ensayo de Validacion

Celulas HeLa se cultivaron a 37°C en medio de cultivo DMEM con 1000 mg/L glucosa (Sigma-Aldrich), complementado con 10% suero fetal bovino y 1% penicilina/ estreptomicina (Sigma-Aldrich). Las celulas fueron sembradas a una densidad de 4 x 105 celulas/pocillo en un volumen de 2 ml de medio en placa de 6 pocillos. Despues de 16 horas y con las celulas al 80% de confluencia, estas fueron transfectadas con el vector usando X-tremeGENE HP Reagent (Roche) de acuerdo a las indicaciones del fabricante para su uso en celulas HeLa.

Se transfectaron celulas HeLa con 2 pg de cada una de las versiones del vector para expresion de microRNAs: un vector derivado del plasmido comercial pCMV-MIR (OriGene) que contenla, en cada caso, o bien la secuencia codificante del precursor individual de uno de los 5 microRNAs (hsa-miR-7, secuencia del inserto: SEQ ID NO:5, hsa-miR-23b SEQ ID NO:6, hsa-miR-146b: SEQ ID NO:7; hsa-miR-218: SEQ ID NO:8 y hsa-miR-372: SEQ ID NO:9) operativamente unida a y, por tanto, bajo el control del promotor CMV del vector original, o bien su version vacla, sin secuencia precursora de microRNA.

El RNA procedente de estas celulas fue extraldo a las 48 horas post-transfeccion con los plasmidos, utilizando Trizol (Sigma). Un microgramo de RNA se digirio con DNasa I (Invitrogen) y se retrotranscribio con SuperScript II (Invitrogen) utilizando hexameros al azar. La concentration de cada muestra de RNA se determino con el espectrofotometro NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). La cuantificacion de la expresion de MBNL1 y 2 a nivel de transcrito mediante qPCR se llevo a cabo a partir de 10 ng de cDNA con sondas Taqman comerciales (QuantiFast Probe PCR Kits, Qiagen), siguiendo las indicaciones del fabricante al igual que el apartado anterior.

La protelna total utilizada en los ensayos de Western blot, fue extralda a las 72 horas post-transfeccion mediante el uso de tampon RIPA (150 mM NaCl, 1,0% IGEPAL, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0), mas inhibidores de proteasa y fosfatasas (Roche Applied Science). Las muestras fueron cuantificadas mediante el kit de ensayo de protelnas BCA (Pierce). 20 ng de las muestras fueron desnaturalizadas durante 5 min a 100°C y utilizados para cargar los geles SDS-PAGE (12% acrilamida), donde se separaron las protelnas, mediante el sistema Mini-protean Electrophoresis System (Bio-Rad). La inmovilizacion de las protelnas en membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare) se realizo por electrotransferencia en el sistema Trans-blot SD semi-dry transfer cell (Bio-Rad). La transferencia se realizo a voltaje constante (15 V) durante una hora. Tras la electroforesis las membranas se equilibraron en PBST y se bloquearon durante 1 h en solution de bloqueo (leche desnatada 5% en PBST). Posteriormente dichas membranas se incubaron con el anticuerpo primario anti-MBNL1 y anti-MBNL2 (toda la noche, 1:1000, Abcam), tras lavar con PBST 3 veces, se anadio el anticuerpo secundario indicado anti-raton-HRP y anti-conejo-HRP respectivamente (1 h, 1:5000, Sigma-Aldrich). Como control de carga se utilizo anti-p-actina (durante toda la noche, 1: 5000, Sigma-Aldrich), seguido de los pertinentes lavados y del anticuerpo secundario, que en este caso fue anti-raton-HRP (1 h, 1: 5000, Sigma-Aldrich). La detection quimioluminiscente se realizo utilizando el ECL Western Blotting Substrate (Pierce). Las imagenes se obtuvieron utilizando el sistema de documentation ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Australia Pty Ltd, Rydalmere, NSW, Australia).

-Ensayo de validation de la actividad de miRNAs candidatos sobre la region 3’ UTR (kit luciferasa dual)

Celulas HeLa se cultivaron a 37° C en medio de cultivo DMEM con 1000 mg/L glucosa (Sigma-Aldrich), complementado con 10% suero fetal bovino y 1% penicilina / estreptomicina (P/S; Sigma-Aldrich). Las celulas fueron sembradas a una densidad de 1x 105 celulas/pocillo en un volumen de 0,5 ml de medio en placa de 24 pocillos. Despues de 16 horas y con las celulas al 80% de confluencia, estas fueron co-transfectadas con los microRNAs ya mencionados con anterioridad expresandose a partir del correspondiente derivado del vector pCMV-MIR (OriGene), junto con el vector pEZX-MT05 que portaba la region 3'UTR de ambos genes MBNL1 y 2 (GeneCopoeia) usando X-tremeGENE HP reagent (Roche) de acuerdo a las indicaciones del fabricante para su uso en celulas HeLa. Las secuencias de la parte correspondiente a la 3’ UTR, de los correspondientes fragmentos insertados en cada caso en el vector pEZX-MT05 se indican en SEQ ID NO:51 (region 3’ UTR del gen MBNL1: numero de producto HmiT011084-MT05) y SEQ ID NO:54 (region 3’ UTR del gen MBNL2: numero de producto HmiT000192-MT05).

Para todos los miRNAs que resultaron positivos para el primer estudio de actividad, se probaron tres tipos de construcciones: las construcciones de tipo salvaje (WT) que portan el 3'UTR de MBNL1 y 2 ya probadas con anterioridad, y dos construcciones nuevas: las construcciones mutadas (MUT) que se disenaron con una deletion (la de la secuencia complementaria a la region semilla, o “seed region”: 6, 7 u 8 nucleotidos normalmente) en la diana predicha del microRNA, con la finalidad de impedir la union del microRNA al 3' UTR y las construcciones con diana complementaria perfecta (PM). Todas estas construcciones fueron sintetizadas por la companla GeneCopoeia, siguiendo las ordenes de los presentes inventores. Las partes correspondientes a las 3’ UTR modificadas, se indican en SEQ ID NO:52 (constructo con deletion en la zona de union a miR-23b a la 3’UTR de MBNL1: MUT-miR-23b), SEQ ID NO:53 (constructo con complementariedad perfecta en la zona de union a miR-23b a la 3’UTR de MBNL1: PM-miR-23b), SEQ ID NO:55 (constructo con deletion en la zona de union a miR-23b a la 3’UTR de MBNL2: MUT-miR-23b), SEQ ID NO:56 (constructo con complementariedad perfecta en la zona de union a miR-23b a la 3’UTR de MBNL2: PM-miR-23b), SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59 (constructo con deletion en las zonas de union primera, segunda o tercera, respectivamente, de miR-218 a la 3’UTR de MBNL2: MUT1-miR-218, MUT2-miR-218, MUT3-miR-218) y SEQ ID NO:60 (constructo con complementariedad perfecta en las 3 zonas de union de miR-218 a la 3’UTR de MBNL2: PM-miR-218) .

En todas estas construcciones que portan el 3'UTR (WT, MUT, PM) para ambos genes, este esta situado aguas abajo de un gen reportero que expresa la luciferasa de Gaussia (Gluc) que es secretada al medio. Ambas secuencias, la correspondiente a la luciferasa y la correspondiente a la region 3’ UTR, son transcritas conjuntamente bajo el promotor SV40 de expresion en celulas de mamlfero, dando lugar a un mRNA quimerico. Ademas este vector (pEZX-MT05) cuenta con otro reportero que tambien es secretado al medio y de expresion constitutiva, la fosfatasa alcalina (SEAP), que se expresa bajo el control del promotor CMV y que sirve como control interno para la normalization de las lecturas obtenidas para la luciferasa de Gaussia.

La lectura de estos experimentos se realizo utilizando Secrete-Pair™ Gaussia Luciferase Dual Luminescence Assay Kits (GeneCopoeia), siguiendo las instrucciones marcadas por el fabricante, en formato de placa blanca de 96 pocillos que se introdujeron en el lector de placas (Infinite 200 PRO Microplate Reader, Tecan). De cada una de las construcciones estudiadas se hicieron tres replicas tecnicas en cada uno de los tres experimentos independientes.

-Expresion de miRNAs candidatos en los tejidos relevantes

La extraction de RNA total enriquecido con RNAs pequenos, procedente de tejidos de raton (prosencefalo, cerebelo, hipocampo, corazon, gastrocnemio y cuadriceps), biopsias musculares humanas y cultivos de fibroblastos humanos, se realizo usando el kit miRNeasy de Qiagen. A partir de 10 ng de RNA total se retrotranscribio la fraction de miRNAs con el kit Universal cDNA synthesis II de Exiqon. Para la qRT-PCR se realizaron diluciones 1/80 del cDNA, del cual se utilizaron 4 ml por replica tecnica. La amplification por qRT-PCR de los miRNAs se realizo con cebadores comerciales especlficos para cada miRNA (EXIQON) y el SyBR Green mastermix Universal RT. Las diferencias de expresion se calcularon mediante el metodo del 2-AACt.

-Prueba de transfeccion con antagomiRs

Se cultivaron fibroblastos controles sanos haciendolos crecer en Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM 4500 mg/l, Gibco) suplementado con 1% P/S y 10% de suero fetal bovino inactivado, en botellas de cultivo celular.

Las celulas para este ensayo fueron sembradas a una densidad de 105 cels/ml en placas de 96 pocillos (10000 celulas por pocillo). Transcurridas unas 16 horas despues de la siembra de las celulas y con estas al 80% de confluencia, se procedio a la transfeccion de dichas celulas con los antagomiRs cuya slntesis se encargo a Creative Biogene (secuencia nucleotldica base del antagomiR-23b-3p: GGUAAUCCCUGGCAAUGUGAU (SEQ ID NO:2), y del antagomiR-218-5p: ACAUGGUUAGAUCAAGCACAA (SEQ ID NO:1) usando X-tremeGENE HP reagent (Roche) de acuerdo a las indicaciones del fabricante para su uso en fibroblastos, instrucciones sobre las que se realizaron pequenas modificaciones, pues se utilizo un volumen menor de reactivo de transfeccion (0,5 pl y 1 pl) del que recomienda el fabricante, ya que los antagomiRs portan una qulmica especial incorporando colesterol en su estructura, lo que les permite atravesar mejor las membranas celulares y as! favorecer la entrada de este, no siendo necesaria tanta cantidad de reactivo de transfeccion lo que mejora su viabilidad.

En concreto, los antagomiRs utilizados en la presente solicitud (antagomiR-218-5p: SEQ ID NO:10, y antagomiR23b-3p: SEQ ID NO:11), tal como se refleja en la correspondiente pagina web de Creative Biogen sobre slntesis de agomirs y antagomiRs (http://www.creative-biogene.com/Services/MicroRNA-Agomir-Antagomir-Synthesis-Service.html) difieren de las secuencias oligonucleotldicas basicas representadas por SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 en que presentan las siguientes modificaciones qulmicas: 2 grupos fosforotioatos en el extremo 5’, 4 grupos fosforotioato en el extremo 3’, 4 grupos colesterol en el extremo 3’ y modificaciones 2’-metoxi en la ribosas de todas las posiciones nucleotldicas, es decir, a lo largo de toda la secuencia oligonucleotldica. Las secuencias oligonucleotldicas basicas de cada uno de ellos, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente, son las complementarias a las de los miRNAs que se desean bloquear, es decir, las del miR-23b-3p, 5’- AUCACAUUGCCAGGGAUUACC -3’ (SEQ ID NO:12), y miR-218, 5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’ (SEQ ID NO:13).

Los experimentos de transfeccion se llevaron a cabo en fibroblastos provenientes de pacientes. En concreto, en los presentes ensayos se utilizaron fibroblastos de piel en los que se les ha transducido con vectores lentivirales una construccion que permite la expresion inducible, por doxiciclina, de MyoD (lo que permite transdiferenciarlos en mioblastos), y que son celulas inmortalizadas por expresion de hTERT. Proceden del laboratorio del Dr. Denis Furling, del Institute of Myology (http://www.institutmyologie.org/en/)

Ambos antagomiRs fueron transfectados en dichos fibroblastos de pacientes, utilizando cantidades crecientes de estos: 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM. Como control solo se puso reactivo de transfeccion pero no antagomiR. Se dejo el medio de transfeccion junto con las celulas durante 4 horas y, transcurrido este tiempo, se cambio el medio por medio DMEM nuevamente. A las 48 horas post-transfeccion se tomaron imagenes de las celulas en el m icroscop io con luz v is ib le para observar la p resencia y m orfo log la de las celulas, y con fluorescencia para observar la d is trib u tio n y p resencia del antagom iR ya que este, esta m arcado con el m arcador fluorescente Cy3 (rojo).

-Ensayo de toxicidad en cultivo celular

Se cu ltivaron fib rob lastos contro les sanos haciendolos c recer en Dulbecco 's M odified Eagle M edium -h igh g lucose (DM EM 4500 mg/l, G ibco) sup lem entado con 1% P/S y 10% de suero feta l bovino inactivado, en bote llas de cultivo celular. Dado su crecim iento adherente, para pasar estas ce lu las se lavaban con PBS y se trips in izaban 2 min a 37oC, y a co n tin u a tio n se le anad la m edio fresco para inh ib ir la a c tio n de la tripsina.

Las ce lu las para este ensayo fueron sem bradas a una densidad de 105 ce ls/m l en placas de 96 pocillos (10000 ce lu las por pocillo). La placa fue sem brada sigu iendo la p lantilla que se representa en la Tab la 2, en la que los num eros de las co lum nas pueden encontrarse en la u ltim a fila: en el caso de la co lum na 1, no se s iem bran celulas, pues esta co lum na sera el b lanco del analis is de co lorim etrla . Las filas A a D (concentraciones subrayadas) corresponden al antagom iR de m iRNA 23b-3p, m ientras que las filas E a H corresponden al antagom iR del m iR N A-218 (concentrac iones en negrita):

Tabla 2: P lantilla de s iem bra para el ensayo de toxic idad en cultivo ce lu lar

Ambos antagomiRs fueron transfectados en fibroblastos de pacientes, utilizando cantidades crecientes de estos: 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM y 1000 nM (1 pM), y como control solo se puso reactivo de transfeccion pero no antagomiR. Se dejo el medio de transfeccion junto con las celulas durante 4 horas y transcurrido este tiempo se cambio por medio de transdiferenciacion. Para transdiferenciar los fibroblastos a mioblastos se indujo la expresion de MyoD. Para ello, se reemplazo el medio completo por medio de diferenciacion muscular (MDM) que consistla en DMEM suplementado con 1% P/S, 2% suero de caballo (Gibco), 0,1 mg/ml de apotransferrina, 0,01 mg/ml de insulina y 0,02 mg/ml de doxiciclina (Sigma) durante 60 h.

Transcurridas estas 60 horas, se reemplazo el medio de transdiferenciacion por 100 pl de medio nuevo en todos los pocillos de la placa incluida la columna 1, y se anadio 20 pl de la solucion MTS/PMS (Kit CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) a cada pocillo y se incubo 2 horas a 37 °C. Transcurrido el tiempo de incubacion se leyo el ensayo colorimetrico en el lector de placas Infinite 200 PRO Microplate Reader, Tecan, siguiendo las instruction del fabricante. Los datos obtenidos con el lector fueron procesados y analizados con la finalidad de obtener la IC10 (concentration inhibitoria del 10% de las celulas) e IC50 (concentracion inhibitoria del 50% de las celulas) que nos permiten saber con que cantidad de antagomiR debemos trabajar para que no resulte toxico en el modelo celular.

-Ensayos de PCR cuantitativa y splicing

Fibroblastos de pacientes DM1 y controles sanos se cultivaron en Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM 4500 mg/l, Gibco) suplementado con 1% P/S y 10% de suero fetal bovino inactivado, en botellas de cultivo celular. Las celulas se sembraron en placas de Petri de 60 mm, a una densidad de 125000 celula/placa, poniendo 10 ml de celulas en cada pocillo. Transcurridas unas 16 horas despues de la siembra de las celulas y con estas al 80% de confluencia, se procedio a la transfeccion de las celulas con los antagomiRs sintetizados por encargo de los solicitates por Creative Biogene (antagomiR-23b-3p y antagomiR-218) usando X-tremeGENE HP reagent (Roche) de acuerdo a las indicaciones del fabricante para su uso en celulas fibroblastos, salvo porque solo se anadieron 5 pl de reactivo de transfeccion.

Ambos antagomiRs fueron transfectados en fibroblastos de pacientes, utilizando cantidades crecientes: 50 nM, 100 nM y 200 nM. Como control solo se puso reactivo de transfeccion pero no antagomiR tanto en celulas control sanas, como en fibroblastos de paciente. Se dejo el m edio de transfeccion jun to con las ce lu las durante 4 horas y transcurrido este tiem po se cam bio por m edio de transd ife renciac ion (DM EM sup lem entado con 1% P/S, 2% suero de caballo (G ibco), 0,1 m g/m l de apotransferrina, 0,01 mg/m l de insu lina y 0,02 m g/m l de doxic ic lina (S igm a)). Los fib rob lastos fueron transd ife renciados a m ioblastos durante dos tiem pos: 48 horas y 96 horas.

El RNA procedente de estas ce lu las fue extra ldo a las 48 y 96 horas post-transfeccion con los antagom iRs, utilizando Trizol (S igm a). Un m icrogram o de RNA se d ig irio con DNasel (Invitrogen) y se re tro transcrib io con S uperS crip t II (Invitrogen) utilizando hexam eros al azar. La conce n tra tio n de cada m uestra de RNA se determ ino con el espectro fo tom etro NanoD rop-1000 (Therm o Scientific, W altham , MA).

La cuantificacion de la expresion de MBNL1 y 2 a nivel de transcrito m ediante qPC R se llevo a cabo a partir de 10 ng de cDNA con sondas Taqm an com ercia les (Q uantiFast Probe PCR Kits, Q iagen), para cuan tifica r la expresion de MBNL1 y 2 (genes de interes, m arcados con el m arcador fluorescente FAM: fluoresce lna, de Therm oFisher); G APDH y A C TB (com o genes endogenos, m arcados con el fluoro fo ro conocido com o M AX o F luoro-M ax y TA M R A respectivam ente , estas tam bien de Therm oFisher).

Para la a m p lifica tion de los transcritos m ediante RT-PCR se utilizo la polim erasa G oTaq® DNA Polym erase (Prom ega). Para ello se utilizo cDNA obtenido com o m olde del paso ante rio r s igu iendo las cond ic iones del fabricante. Los productos de PCR se separaron en gel de agarosa al 2,5% . Los cebadores utilizados para el analis is de cada evento de s p lic in g estud iado, el patron esperado en m iob lastos de paciente DM1, el exon estud iado y las cond ic iones utilizadas se encuentran en la s igu iente tabla:

Tabla 3: Condic iones de am plificac ion de transcritos m ediante RT-PCR en el ensayo del sp lic in g

- E jem plo 1. Prueba de concepto en m odelos de DM1 de Drosophila melanogaster^.

1.1. El s ilenciam iento de dme-miR-277 o dme-miR-304 provoca sobreexpresion de muscleblind en el m usculo de Drosophila

El secuestro de M uscleblind en foci de RNA y la poste rio r perdida de la funcion de la pro te lna es uno de los principales facto res desencadenantes de la pato log la m o lecu lar de la DM1. Con el fin de iden tifica r m iR NAs que reprim en muscleblind^, los inventores se leccionaron m iR NAs cand idatos y procedieron al b loqueo de su activ idad u tilizando esponjas especlficos de m iRNA.

In ic ia lm ente se leccionaron dme-miR-92a, dme-miR-100 y miR-dme-124 basandose en datos previos generados por el g rupo de los presentes inventores y su re lacion orto log ica con m iR NAs hum anos; para ob tener esos datos se hablan utilizado, entre otras herram ientas, el a lgoritm o m iRanda, desarro llado en el C entro de B io log la C om putaciona l del M em oria l S loan-K ette ring C ancer C enter (version del 2010 descargable, entre otros, desde la pagina de descargas m icroR NA.org: h ttp ://w w w .m icro rna .o rg /m icro rna /ge tD ow n loads.do ; m anual d ispon ib le en la d ireccion: h ttp ://cb io .m skcc.org /m icrorna_data /m anual.h tm l). Para am plia r la busqueda de m iRNAs candidatos, se utilizo TargetScan, un softw are en llnea proporcionado por el W h itehead Institute para la prediccion de d ianas de m iR NAs (w w w .ta rge tscan .o rg ), para buscar sitios de reconocim ien to de m iR NAs en la region 3' UTR de muscleblind y se identificaron, entre otros, sitios para dos m iRNAs: dme-m iR-277 y dm e-m iR-304. La Tabla 4 m uestra los sitios de reconocim ien to de varios m iR NAs predichos segun d iferentes a lgoritm os en la region 3 ’UTR de muscleblind , as l com o el num ero de acceso tan to de sus secuencias precursoras con bucles en horquilla (codigos encabezados por la abrevia tura MI) com o de los m iR NAs m aduros (codigos encabezados por la abrevia tu ra M IM AT) en la base de datos de m iR Base (w w w .m irbase .o rg ).

Tabla 4.- Num ero de sitios de reconocim ien to de varios m iR NAs predichos segun d iferentes a lgoritm os en la region 3 ’UTR de m uscleblind

Para validar miRNAs que regulan Muscleblind, se dirigio la expresion de las construcciones esponja (Fulga et al., 2015), UAS-miR-XSP, a los musculos de Drosophila mediante la llnea Mhc-Gal4, abreviaturas de los elementos “promotor del gen de la cadena pesada de la miosina” (myosin heavy chain) y region codificante del gen Gal4 correspondiente a la protelna activadora de la transcripcion de levaduras Gal4, de la cual se conoce que actua como activador de la transcripcion en distintos organismos, incluida Drosophila. En este sistema, los elementos UAS (upstream activation sequence: secuencia de activacion aguas arriba) actuan como potenciadores de la transcripcion, pues la protelna GAL4 se une especlficamente a ellos para activar la transcripcion de genes, mientras que el hecho de que la region codificante del gen Gal4 se encuentre operativamente unida al promotor endogeno del gen Mhc dirige la expresion de las esponjas de miRNAs al musculo. Los niveles de transcripcion de muscleblind se analizaron por qRT-PCR, utilizando cebadores especlficos para amplificar una region del exon 2 de muscleblind, que es compartida por todas las isoformas de transcripcion conocidas hasta la fecha. Como control, se utilizo una llnea con una secuencia al azar (UAS-scrambled-SP).

No se detecto ningun aumento significativo en el nivel de expresion de muscleblind en las moscas que expresan el miR-92aSP, miR-100SP o miR-124SP bajo el control de MHC-Gal4. En contraste, los niveles de transcritos muscleblind aumentaron significativamente en las moscas que expresaban el miR-277SP o miR-304SP en el musculo, en comparacion con los controles de Scrambled-SP (Fig. 1a). Los niveles de RNA muscleblind fueron 14 veces mas altos cuando el miRNA bloqueado fue dme-miR-227, mientras que el silenciamiento de dme-miR-304 dio como resultado un aumento de 6 veces. Por lo tanto, estos resultados demuestran que el silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304 provoca la sobreexpresion de muscleblind.

1.2. dme-miR-277 y dme-miR-304 regulan diferentes isoformas de Muscleblind

El gen muscleblind de Drosophila melanogaster es un gen grande, que abarca mas de 110 kb, que da lugar a varios transcritos diferentes mediante splicing alternativo (Begeman et al., 1997; Irion et al., 2012). La evidencia experimental sugiere que las isoformas de muscleblind no son funcionalmente redundantes (Vicente et al., 2007). Para determinar que isoformas de muscleblind estan reguladas por dme-miR-277 o dme-miR-304, se utilizo el algoritmo MiRanda (Enright et al., 2003) para identificar sitios de reconocimiento de dme-miR-277 y dme-miR-304 en la region 3'UTRs de las isoformas de muscleblind (Tabla 4). Es importante destacar que MiRanda realiza la busqueda en los transcritos de mblA, mblB, mblC y mblD, siguiendo la denomination utilizada por Begemann et al. 1997 en la referenda antes mencionada, pero no incluye las isoformas identificadas recientemente, mblH, mblH', mblJ y mblK (Irion et al., 2012).

Se encontro un sitio de reconocimiento potencial de dme-miR-277 en la isoforma mblA y dos en mblB y mblD. Los analisis de qRT-PCR determinaron que el nivel de mblB aumento significativamente cuando se bloqueo/agoto dme-miR-277. Los niveles de expresion de mblD se redujeron en las moscas Mhc-Gal4 miR-277SP y no se detectaron diferencias significativas en lo que respecta a mblA cuando se comparo con las moscas control que expresaban los Scrambled-SP (Fig. 1b). Curiosamente, los niveles de expresion de mblC, una isoforma para la que no se hablan predicho sitios de reconocimiento para dme-miR-277, se redujeron significativamente en las moscas Mhc-Gal4 miR-277SP.

Para dme-miR-304, se encontro un sitio de reconocimiento en la region 3’UTR de mblC y mblD, y se detecto una regulation al alza significativa de las dos isoformas en moscas Mhc-Gal4 miR-304SP (Fig. 1b). En particular, el bloqueo/agotamiento de dme-miR-304 en el musculo provoco un fuerte aumento en los niveles de mblC, la isoforma mas expresada en moscas adultas (Vicente et al., 2007).

El hecho de que el silenciamiento de dme-miR-277 y dme-miR-304 originen cambios en los niveles de expresion especlficos de cada isoforma de muscleblind sugiere una regulacion directa de los transcritos de muscleblind mediante estos miRNAs.

Teniendo en cuenta que un miRNA puede actuar tlpicamente a nivel de estabilidad del mRNA o del bloqueo de su traduction, se decidio analizar los niveles de la protelna Muscleblind para validar a los miRNAs reguladores candidatos. Con este objetivo, se utilizo un anticuerpo anti-Mbl para detectar la regulacion al alza de las protelnas MblA, MblB y MblC. Los analisis de transferencia Western revelaron un aumento en los niveles de la protelna Muscleblind solo en las moscas Mhc-Gal4 miR-304SP (Fig. 1c). Consistentemente con las determinaciones por qRT-PCR, la banda detectada en la transferencia Western correspondla a la protelna MblC. Debe mencionarse que el anticuerpo utilizado solo ha funcionado previamente en experimentos de sobreexpresion (Houseley et al., 2005; Vicente-Crespo et al., 2008).

A fin de analizar el efecto del silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304, se tineron secciones longitudinales de los musculos indirectos de vuelo (los IFMs) para ver la distribution de Muscleblind: la senal anti-Mbl se detecto en verde, mientras que los nucleos apareclan contratenidos en azul con DAPI. El grupo de los presentes inventores habla demostrado previamente que la protelna endogena Muscleblind se localiza principalmente en las bandas sarcomericas Z y H del musculo (Llamusi et al., 2013). En consonancia con ello, las imagenes confocales obtenidas de dichas secciones permitieron detectar protelnas Muscleblind preferentemente en las bandas de los sarcomeros musculares en las moscas control que expresaban la construction de los Scrambled-SP, obteniendose una baja senal en algunos nucleos de dichas celulas. Curiosamente, la reduction en la funcion de dme-miR-277 y dme-miR-304 tuvo diferentes efectos sobre la distribution de las protelnas: mientras el silenciamiento de dme-miR-277 aumento la senal de la protelna Muscleblind citoplasmica, particularmente en las bandas sarcomericas, en las moscas Mhc-Gal4 miR-304SP se detecto una fuerte localization nuclear.

Tomados conjuntamente, estos resultados demuestran que las isoformas endogenas de Muscleblind pueden ser reguladas al alza mediante el bloqueo de la actividad inhibidora de dme-miR-277 y dme-miR-304.

1.3. La disminucion de funcion de dme-miR-277 o dme-miR-304 favorece la expresion de Muscleblind en un modelo de DM1 en Drosophila

Los modelos previos de DM1 en Drosophila tenlan foci ribonucleares en las celulas musculares que contenlan protelnas Muscleblind (Garcia-Lopez et al., 2008; Picchio et al., 2013). Para probar el efecto de silenciamiento especlfico de los miRNA represores de muscleblind en un modelo de DM1 de Drosophila, se estudio la expresion de Muscleblind en moscas que expresan 480 repeticiones CTG interrumpidas (“i(CTG)480”) con el promotor de la cadena pesada de la miosina como conductor determinante especlfico de la expresion en musculo con la expresion simultanea de construcciones esponja (Mhc-Gal4 UAS-i(CTG)480 UAS-miR-XSP).

Los analisis de los niveles de transcritos mbl por qRT-PCR mostraron que el silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304 dio lugar a una expresion aumentada de muscleblind en las moscas modelo de DM1 (Fig. 2a). Es importante destacar que la regulation positiva de muscleblind fue mas fuerte en moscas modelo de DM1 que en las moscas que solo expresaban construcciones esponja (comparense las Fig. 1a y Fig. 2a). Los niveles de los transcritos de muscleblind fueron 19 veces mas elevados en las moscas que expresaban tanto i(CTG)480 como miR-277SP y 7 veces mas elevados en las moscas Mhc-Gal4 UAS-i(CTG)480 UAS-miR-304SP en comparacion con los controles. Por otra parte, en consonancia con el analisis de protelnas realizado en presencia de distintas construcciones esponja (Fig. 1c), el silenciamiento de dme-miR- 304 provoco un incremento de los niveles de la protelna MblC en las moscas modelo de DM1 (Fig. 2b).

Para estudiar el efecto del silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304 en la localization subcelular de Muscleblind en moscas modelo de DM1, se analizo la distribution de protelnas Muscleblind mediante inmunodeteccion en IFMs (Fig. 2c-f). Tanto la expresion de miR-277SP (Fig. 2e) como la de miR-304SP (Fig. 2f) en moscas modelo de DM1 libero a Muscleblind de los foci ribonucleares y aumento el nivel de protelnas, tanto en los nucleos y como en el citoplasma. En el caso de las moscas modelo que expresaban el miR-277SP, la distribucion de Muscleblind en las bandas sarcomericas del musculo, que es caracterlstica de las moscas control que no expresan las repeticiones, fue rescatada por completo. Del mismo modo, la expresion de miR-304SP condujo a un aumento detectable de Muscleblind dispersa en nucleos y citoplasma. Por lo tanto, el silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304 regula al alza los niveles de Muscleblind y rescata su distribucion subcelular en musculos de moscas modelo de DM1.

1.4. El silenciamiento de dme-miR-304 rescata alteraciones en el splicing y en los niveles globales de expresion de genes en un modelo de DM1 en Drosophila

La espliceopatla es el principal hito bioqulmico de la DM1 y el unico que ha sido vinculado directamente con los slntomas. Para probar si el aumento de Muscleblind, provocado por el silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304, era suficiente para rescatar las alteraciones en el splicing en las moscas modelo de DM1, se estudiaron eventos de splicing caracterlsticamente alterados. Dichos eventos fueron:

- la exclusion del exon 16' del gen Fhos en moscas modelo de DM1, que los presentes inventores han identificado, comprobando que esta regulado por Muscleblind;

- la inclusion del exon 13 del gen Serca, lo cual es un evento de splicing regulado por Muscleblind.

Tambien se comprobo que sucedla con otra funcion molecular descrita para mbl: la regulation de los niveles globales de expresion de genes. Concretamente, se amplifico el exon 2 del gen CyP6W1, para comprobar los niveles de expresion de dicho gen, para el cual se ha descrito aumento en su expresion en moscas modelo de DM1 (Picchio et al., 2013).

En las moscas modelo de DM1, se confirmo un aumento de 2 veces de la inclusion del exon 16' de Fhos y una reduction de 2,4 veces de los transcritos de Serca con el exon 13, asl como un aumento de 3 veces de los transcritos de CyP6W1, en comparacion con las moscas control que no expresan las repeticiones.

La expresion de miR-304SP en estas moscas consiguio un rescate completo del exon 16' de Fhos y de la expresion normal del gen CyP6W1 y un incremento significativo del 20% de los transcritos de Serca que incluyen el exon 13 (Fig. 2g-i, l). Es destacable que el silenciamiento de dme-miR-304 en el musculo provoco un fuerte aumento en los niveles de mblC (Fig. 2b), una isoforma que previamente se ha demostrado que actua como regulador del splicing (Vicente et al., 2007). Por el contrario, la expresion de miR-277SP, que rescato la expresion Muscleblind en el citoplasma, y redujo los niveles de expresion de mblC, no modifico estos eventos de splicing. Como control, se confirmo que el patron de splicing de los exones 3-5 de Tnt, que no esta alterado en moscas adultas modelo de DM1 (Garcia-Lopez et al., 2008), no resulto modificado ni por la expresion de las construcciones esponja ni por las alteraciones en la expresion de muscleblind (Fig. 2j, Fig. 2k).

Estos resultados muestran que el nivel de desrepresion de muscleblind conseguido mediante esponjas de miRNAs es suficiente para desencadenar, potencialmente, rescates moleculares significativos.

1.5. El silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304 rescata la atrofia muscular y la funcion motora en un modelo de DM1 en Drosophila

Para evaluar la relevancia funcional del aumento de Muscleblind alcanzado por la expresion de las construcciones esponja especlficas, se estudio el efecto del silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304 sobre la atrofia muscular, cuya alteracion es uno de los rasgos que caracterizan a los individuos con DM1. Para el estudio de la atrofia muscular primero se midio el area del musculo en secciones dorsoventrales de los IFMs en las moscas control que expresaban o bien miR-277SP o bien miR-304SP en el musculo (Fig. 3a-d). La disminucion de la funcion de dme-miR-277 indujo una reduccion del 15% en el area de IFM, en comparacion con las moscas que expresaban Scrambled-SP como control. Es importante destacar que la expresion de miR-304SP no tuvo ningun efecto sobre este parametro.

El grupo investigador de los presentes inventores habla informado anteriormente de la existencia de atrofia muscular en moscas que expresan i(CTG)480 en la musculatura. En estas moscas modelo de DM1, se encontro que el silenciamiento especlfico de tejido de dme-miR-277 o dme-miR-304 fue suficiente para rescatar el porcentaje de area muscular de forma significativa (Fig. 3e-h). En comparacion con las moscas control que no expresaban las repeticiones CUG, el area media de los IFMs en las moscas modelo que expresaban el scrambled-SP se redujo significativamente al 40%. La expresion simultanea de las repeticiones CUG y uno cualquiera de entre miR-277SP o miR-304SP dio lugar a un aumento del 20% del area del musculo en estas moscas. Ademas, los ensayos de hibridacion in situ de cortes transversales de musculatura de moscas (Fig. 3ik) mostraron como la expresion de miR-277SP (Fig. 3j) y miR-304SP (Fig. 3k) dio como resultado una reduction significativa de un parametro histopatologico tlpico de la enfermedad, los foci ribonucleares del modelo de DM1 en mosca (Fig. 3i), que eran practicamente inapreciables tras la expresion miR-304SP. Estos datos confirman que la regulation al alza de diferentes isoformas de muscleblind fue suficiente para rescatar la atrofia muscular y la formation de foci ribonucleares en Drosophila.

Para evaluar la correlation entre el area muscular y la actividad locomotora se analizo la capacidad de ascenso y vuelo de moscas de diferentes genotipos. La expresion de miR-277SP en el musculo dio como resultado una reduccion de la altura media de aterrizaje de alrededor del 10% en comparacion con las moscas control que expresaban el scrambled-SP, lo que indica que la reduccion de area del musculo que se encuentra en estas moscas tiene una correlacion funcional (Fig. 4a). Sin embargo, la atrofia muscular fue aparentemente especlfica de los IFMs, ya que la velocidad de ascenso por superficies se mantuvo sin cambios en estas moscas (Fig. 4b). Por el contrario, el silenciamiento de dme-miR-304 en el musculo no afecto a la actividad de locomotion de las moscas (Fig. 4a, b). En las moscas modelo de DM1, en comparacion con las moscas control que no expresaban las repeticiones, la expresion simultanea de las repeticiones CUG y la construction scrambled-SP dio como resultado una reduccion drastica de la altura media de aterrizaje y de la velocidad de ascenso por superficies (Fig 4e, f). Sin embargo, la expresion de uno cualquiera de entre miR-277SP o miR-304SP en las moscas modelo dio como resultado el rescate de todos estos parametros a niveles similares (Fig 4e, f). Por lo tanto, estos resultados demostraron que el silenciamiento especlfico de miRNAs que regulan muscleblind puede rescatar la atrofia muscular y el fenotipo funcional caracterlstico de DM1.

1.6. El agotamiento funcional de dme-miR-277 o dme-miR-304 extiende la tasa de supervivencia de las moscas modelo de DM1

La reduccion de la funcion muscular, particularmente del sistema respiratorio, es la causa principal de muerte en DM1. El grupo de los presentes inventores habla informado anteriormente de que las moscas que expresan i(CTG)480 en la musculatura tienen una tasa y un promedio de supervivencia reducida en comparacion con las moscas control (Garcia-Lopez et al., 2008). Para estudiar si el silenciamiento de dme-miR-277 o dmemiR-304 rescatan la tasa de supervivencia de las moscas modelo de DM1, se llevaron a cabo analisis de las curvas de supervivencia en moscas de diferentes genotipos. Es importante destacar que las curvas de supervivencia de las moscas que expresaban miR-277SP o miR-304SP en el musculo no fueron diferentes a las de las tratadas como scrambled-SP, lo que indica que el silenciamiento de dme-miR-277 o dme-miR-304 no altero la tasa de supervivencia (Fig. 4c, d). La tasa de supervivencia de las moscas modelo de DM1 que expresaban los scrambled-SP se redujo significativamente en comparacion con las moscas control que no expresaban las repeticiones CTG (Fig. 4 g, h). La expresion de miR-277SP o miR-304SP en las moscas modelo incremento la tasa de supervivencia y supervivencia media. El silenciamiento de dme-miR-277 aumento la supervivencia media en ocho dlas, mientras que se detecto un incremento de seis dlas para las moscas modelo de DM1 que expresan miR-304SP (Fig. 4 g, h). Por lo tanto, la regulation positiva de muscleblind provocada por la disminucion de la funcion de dmemiR-277 o dme-miR-304 mejora la supervivencia de las moscas modelo de DM1.

Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el silenciamiento de miRNAs especlficos en Drosophila provoca un aumento de los niveles de muscleblind que es suficiente para rescatar varias caracterlsticas moleculares y fisiologicas, incluyendo un aumento de la supervivencia. Por tanto, suponen un apoyo para plantearse recurrir a la represion de miRNAs de los homologos de Muscleblind como una estrategia potencial para el tratamiento de la DM1 en seres humanos y otros mamlferos.

Por ello, los presentes inventores pasaron a identificar miRNAs represores de MBNL1 y/o 2 y, de entre ellos, buscar aquellos que se expresaran en tejidos donde se manifiestan slntomas de DM1 y cuyo bloqueo sea eficaz para rescatar caracterlsticas moleculares de DM1 y, con ello, mejorar slntomas de la enfermedad.

- Ejemplo 2: Identification, validation y caracterizacion de miRNAs represores de MBNL1 y/o MBNL2

2.1. Cribado (screening) de identificacion de miRNAs que regulan negativamente MBNL1 o MBNL2

Se comenzo realizando un screening inicial basado en librerlas de miRNAs mimeticos, empleando el kit comercial SureFIND Transcriptome PCR array, de Qiagen, tal como se ha descrito en la section metodologica previa. Dicho estudio permitio la identificacion inicial, en celulas HeLa, de 18 miRNAs como potenciales represores de MBNL1 y 9 microRNAs potenciales represores de MBNL2 en celulas HeLa, por mostrar una represion de la expresion de los citados genes un mlnimo de 4 veces respecto al control, GAPDH. Cuatro de dichos miRNA pareclan inicialmente capaces de inhibir la expresion de ambos.

2.2. Confirmation de la action represora

Puesto que se trataba de un gran numero de microRNAs a validar, se acoto el numero de microRNAs con los que continuar los ensayos a un total de 6, basando la election en el numero de predicciones bioinformaticas recogidas en las bases de datos mirDIP (https://omictools.com/mirdip-tool) y miRecords (https://omictools.com/mirecords-tool), las cuales recogen la information de un total de 9 programas de prediction proporcionando information de la existencia de las dianas de un microRNA concreto en los transcritos de un gen dado, lo que sugiere que exista una regulation.

Para realizar los ensayos de confirmacion de los resultados iniciales comprobando la posible modulation por regulacion directa, se seleccionaron inicialmente varios miRs, entre los que se inclulan tanto potenciales reguladores de ambos genes, como represores especlficos de MBNL1 o MBNL2. miR-146b y miR-23b como potenciales reguladores tanto de MBNL1 como MBNL2; y miR-218 y miR-372 como represores especlficos de MBNL2.

Los resultados anteriores, se confirmaron para algunos miRNAs, mediante la transfection en celulas HeLa de plasmidos de expresion derivados de pCMV-MIR (Origene) que expresaban precursores de los miRNAs seleccionados, junto con el plasmido pCMV-MIR vaclo y miR-7 como controles negativos, este ultimo por no haber sido identificado como inhibidor de MBNL1 o MBNL2 en el screening inicial. Se procedio entonces a la cuantificacion de la expresion de MBNL1 o MBNL2 a nivel de mRNA y protelna, tal como se describe en la parte dedicada a los "Ensayos de validation” en la section metodologica previa. En la Fig. 5 se muestran los resultados obtenidos para miR-146b y miR-23b (inicialmente identificados como potenciales reguladores tanto de MBNL1 como MBNL2), as! como para miR-218 y miR-372 (inicialmente identificados como represores especlficos de MBNL2).

Efectivamente, se observo tanto en el caso de MBNL1 (Fig. 5a) como en el caso de MBNL2 (Fig. 5b), que los microRNAs seleccionados ejerclan un efecto represor sobre el mensajero de los genes para los que inicialmente se habla detectado un efecto represor aunque el efecto represor provocado por miR-146b era menos acusado.

En cuanto a la cuantificacion de protelnas, se observo una disminucion a nivel de protelna MBNL1 en caso de miR-23b (Fig. 5c), a las 72 horas post-transfeccion, mientras que en el caso de MBNL2 (Fig. 5d), esta disminucion a nivel de protelna ocurrla tanto con el microRNA miR-23b como con miR-218. La disminucion provocada por miR-372 era mucho menor que con los dos microRNAs anteriores.

Por tanto, los datos obtenidos confirmaron que miR-23b regula a la baja, a nivel de protelna, tanto MBNL1 como MBNL2, mientras que miR-218 reprime MBNL2.

2.3. Identification de las secuencias diana de miRNAs y demostracion de la relevancia funcional de la potencial interaction miRNA-mRNA

A continuation se procedio a identificar las secuencias concretas a las que los miRNAs tienen que unirse para ejercer su action represora. Esto es necesario para disenar inhibidores del tipo de los "blockmiRs” y para confirmar la union directa del miRNA a su diana, descartando que la regulation sea indirecta.

Para ello, se realizo una prediction bioinfomatica de las dianas de los miRNAs preseleccionados tras el screening, utilizando las aplicaciones miRanda y TargetScan ya utilizadas en los ensayos realizados en Drosophila. Las Figs. 6A y 6F muestran una representacion esquematica, a escala, de los sitios de union predichos por los programas anteriormente citados sobre las regiones 3’UTR de MBNL1 y MBNL2, respectivamente. En ambos caso, ninguna de las isoformas de dichos genes, resultantes de splicing alternativo, afecta a la presencia en el correspondiente transcrito de las dianas predichas.

Para demostrar la relevancia funcional de una interaccion potencial miRNA-mRNA, se recurrio a la utilization de sensores que demostraran que, en efecto, los microRNAs preseleccionados se unen a sus dianas predichas en las 3'UTR de ambos genes. Esto se demostro experimentalmente generando una construction en la que los extremos 3'UTR de MBNL1 o MBNL2 se fusionan a una secuencia codificante de luciferasa como gen reportero, de modo que la eventual regulacion represora resultante de sobreexpresar el miRNA se observa como reduction en la cantidad de luciferasa detectada. En concreto, se recurrio a la metodologla detallada en la section "Ensayo de union al 3’UTR (kit luciferasa dual)”.

Tal como se explica en esa misma seccion metodologica, en este ensayo, una menor senal de la luciferasa de Gaussia (Gluc) indica union del microRNA a la 3'UTR, pues la union de este a la 3'UTR impide la traduction del reportero y, por ende una disminucion de la Gluc liberada al medio (vease los esquemas ofrecidos en la pagina especlfica de GeneCopoeia, http://www.genecopoeia.com/product/mirna-targets/).

De las lecturas observadas 48 horas tras la co-transfeccion tanto del plasmido a partir del cual se expresa el microRNA en ensayo como del vector pEZX-MT05 (que porta la region 3’UTR de ambos genes, MBNL1 y MBNL2, aguas debajo de la secuencia codificante de la luciferasa de Gaussia), se observo que todos los microRNAs en ensayo, a exception del miR-146b y del control negativo, miR-7, ejercen un efecto represor sobre el reportero, de lo que se infiere su union especlfica de secuencia al 3'UTR de su gen diana (veanse las Figs 6B y 6E).

Una vez realizado el experimento anterior, se paso a comprobar que la union observada era directa, lo que indica una regulation directa del microRNA sobre la 3'UTR. Para ello, se disenaron versiones adicionales de la construction con el sensor 3'UTR para cada miRNA candidato, donde la secuencia diana predicha estaba mutada (mut) por deletion, y tambien otra version donde dicha diana predicha en la 3’UTR se habla mutado dando lugar a una diana complementaria perfecta (PM) del correspondiente miRNA, diana perfecta a la que microRNAs se unen de forma completa y con la mayor eficiencia. Como se explica en la section metodologica antes citada, la union de los diferentes microRNAs a las 3'UTR mutadas y con dianas PM se expreso en unidades relativas de luciferasa de Gaussia, normalizadas respecto al control interno de la fosfatasa alcalina SEAP (Gluc/SEAP). Estos ensayos de mutagenesis de dianas se realizaron para miR-23b en MBNL1 (Figs. 6C) y para miR-218 y miR-23b en MBNL2 (Figs. 6F y 6G).

En el caso de MBNL1, la union directa del microRNA miR-23b se aprecia a partir de la Fig.6B, pues al transfectar celulas HeLa con las versiones mutadas (mut) de las construcciones reporteras MBNL1 y miR-23b (Fig 6C), dicho miRNA dejo de reprimir, observandose un aumento en la luciferasa similar a lo que ocurre con el control, donde es transfectada la construccion sensora con el vector vaclo pCMV-MIR. Tambien se transfectaron junto a los microRNAs las construcciones con la version perfecta (PM) de la diana de union, lo que permite saber cuan efectiva es la union de un microRNA a la 3'UTR natural (WT: wild type) del gen en cuestion respecto a union perfecta que vemos con el PM. Estos ensayos son muy utiles pues son una base importante en el diseno de los blockmiRs. En todos los casos, se observo una disminucion de la senal de la luciferasa superior a la observada con la diana natural.

En el caso de MBNL2, se demostro que hay una union directa de los microRNAs miR-23b y miR-218, pues al transfectar celulas HeLa con las construcciones con las versiones mutadas (mut) de las dianas junto con los diferentes microRNAs miR-23b (Fig 6F), y miR-218 (Fig 6G), se perdia la represion del reportero, observandose de nuevo un aumento en la luciferasa similar a lo que ocurre con el control, donde fue tranfectada la construction sensora con el vector vado pCMV-MIR. De nuevo se transfectaron tambien junto a los microRNAs las construcciones con la version perfecta (PM) de la diana de union. En los dos casos, se observo una disminucion de la senal de la luciferasa superior a la observada con la diana natural.

2.4. Expresion de miRNAs candidatos en tejidos relevantes

Ademas de la comprobacion de la capacidad represora, es importante confirmar si los miRNAs sobre los que se desea actuar se expresan en tejidos relevantes para la enfermedad (corazon, musculo y cerebro, entre otros), para que la actuation sobre los mismos pueda tener un efecto paliativo de smtomas de la enfermedad asociados a dichos tejidos. Por tanto, esto es importante, porque si se identifica un represor, pero no se expresa en los tejidos relevantes, bloquearlo no tendra ningun efecto.

Se procedio a comprobar la expresion de los miRNAs candidatos en biopsias musculares humanas de individuos sanos y pacientes de DM1, en cultivos de fibroblastos humanos procedentes tambien o de individuos sanos o de pacientes de DM1 y en tejidos de raton (prosencefalo, cerebelo, hipocampo, corazon, gastrocnemio y cuadriceps), segun se describe en la section metodologica "Expresion de miRNAs candidatos en los tejidos relevantes”.

Los resultados obtenidos en raton (Fig. 7A) fueron coherentes con los datos previos de expresion de los que dispotian los presentes inventores, bien procedentes de bases de datos publicas o datos propios, que indicaban que determinados miRNAs se expresan en tejidos relevantes para la enfermedad (corazon, musculo, cerebro). Son especialmente relevantes los resultados obtenidos con miR-23b y miR-218, especialmente con el primero, donde la expresion relativa en todos los tejidos era muy superior a la del microRNA miR-146b y, particularmente, a la de miR-372, con el que no se detecto expresion.

En consonancia con ello, los resultados obtenidos en biopsias musculares de individuos humanos (Fig. 7C) muestran un aumento significativo de la expresion de miR-218 y una tendencia clara, aunque no significativa con los datos del experimento realizado, para miR-23b en las muestras de pacientes con DM1, muy superior a la observada para el miR-146. Incluso en los ensayos realizados con fibroblastos humanos (Fig. 7B), la expresion relativa del miR-218 es muy superior en el caso de los fibroblastos procedentes de pacientes con DM1 con respecto a los fibroblastos de individuos control no aquejados de la enfermedad.

- Ejemplo 3. Efectos de la transfeccion de antagomiRs de los miR-218 y miR-23b

Tomando en conjunto los ensayos de confirmation de potencial represor de la expresion de mRNAs y protelnas, los de confirmacion de action directa sobre los mRNAs de MBNL1 y/o MBNL2 y los datos de expresion en diferentes tejidos, se decidio concentrarse en disenar bloqueadores o inhibidores del miR-23b y miR-218, que eran los dos microRNAs con mas expresion en estos tejidos implicados en la patologla.

Se opto por los inhibidores de naturaleza oligorribonucleotldica del tipo antagomiRs que, como se explico previamente, son analogos de RNAs con una qulmica particular que hacen mas estable su union al miRNA, los hace menos susceptibles a la degradation y aumenta su capacidad para atravesar membranas celulares (es habitual, como sucede en el presente caso, que incluyan colesterol).

El proveedor de los antagomiRs concretos con los que se realizaron los siguientes ensayos ha sido: http://www.creative-biogene.com/Services/MicroRNA-Agomir-Antagomir-Synthesis-Service.html. Tal como se ha descrito previamente, los antagomiRs a los que se denomina en la presente memoria, de forma abreviada, antagomiR-218 (antagomiR-218-5p: SEQ ID NO:10) y antagomiR-23b (antagomiR-23b-3p: SEQ ID NO:11), que difieren de las secuencias basicas SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 (complementarias, respectivamente, de los microRNAs humanos miR-218-5p y miR-23b-5p) en las modificaciones detalladas en el listado de secuencias y la section metodologica "Prueba de transfeccion con antagomiRs”.

3.1. Ensayos de transfeccion de los antagomiRs

Tal como se describe en dicha seccion, se comenzo realizando un ensayo de transfeccion de fibroblastos de pacientes con DM1 con concentraciones crecientes (10 nM, 50 nM, 100 nM) de cada uno de los antagomiRs, marcados con el fluoroforo Cy3, (que emite una senal roja) y dos concentraciones diferentes del reactivo de transfeccion XtremGene (0,5 pl y 1 pl).

Este experimento de prueba de transfeccion de los fibroblastos, se realizo con la finalidad de determinar la concentration umbral a la que es detectable el antagomiR dentro de las celulas, asl como la cantidad de reactivo de transfeccion a utilizar, tratando de usar la minima cantidad posible, pues dicho reactivo es altamente toxico para fibroblastos humanos.

Debido a la presencia de Cy3 en su estructura, cuando el antagom iR entra en las ce lu las estas se ven de co lo r rojo al m icroscop io de fluorescencia, lo que indica p resencia del antagom iR .

A la co nce n tra tio n de 10 nM apenas se detecto senal roja, lo que indico que la presencia de cualqu iera de los antagom iR s era escasa en las celu las, siendo necesarias concentrac iones de 50 nM o superiores para que las senales fueran intensas. Por eso, son las que se usaron en los posterio res ensayos rea lizados con los antagom iRs.

3.2. Ensayos de toxic idad

Una prim era aproxim acion fue rea liza r un ensayo de toxic idad ce lu la r dosis-respuesta para estab lecer a que um bral de concentrac ion de antagom iR estos em pezaban a ser toxicos para su traba jo en celulas, pues siem pre que se traba ja con com puestos en un m odelo ce lu lar es conven iente traba ja r a una concentrac ion in ferio r a la IC10.

Se obtuvieron los perfiles de toxic idad de am bos antagom iR s en m ioblastos hum anos sanos a las 60 h de su adicion al m edio (Fig. 8a), tal com o se describe en la se c tio n "Ensayo de toxic idad en cultivo ce lu lar” . El ensayo co lorim etrico rea lizado perm itio una cuantificac ion rapida y sensib le de la p ro life ra tio n y viab ilidad celular, ante la adicion de concentrac iones crecientes del antagom iR . Con los datos obten idos se ca lcu laron la IC10 (que m uestra la concentrac ion a la que el 10% de las ce lu las han m uerto por la toxic idad asociada al com puesto) y la IC50 (que es la concentrac ion a la que el 50 % de las ce lu las han m uerto debido a la toxicidad). Los va lores obten idos fueron:

Se ca lcu lo tam bien el va lo r del fac to r Z, pues un fac to r Z positivo indica que el ensayo de toxic idad se esta rea lizando de form a adecuada. En este caso fue: 0,46.

Una vez rea lizado el estud io se decid io p rosegu ir con tres concentrac iones (50 nM, 100 nM y 200 nM) con las que rea liza r los s igu ientes ensayos, pues se tra ta de concentrac iones por debajo de la IC10.

3.3. Ensayos de respuesta a dosis de los antagom iR s en ce lu las de pacientes con DM1

Con las concentrac iones arriba m encionadas, se rea lizaron ensayos de tra n s fe c tio n de fib rob lastos transd ife renciados a m ioblastos de pacientes con DM1, con el antagom iR -23 o el antagom iR -218, tal com o se describe en la seccion m etodo log ica de "Ensayos de s p lic in g ” y se com enzo rea lizando ensayos de cuantificacion del RNA de MBNL1 y MBNL2. C om o puede verse en la Fig. 9, se observo que tan to el antagom iR m iR -23b com o el antagom iR m iR -218 aum entaron la expresion de MBNL1 y M BNL2 a nivel de m RNA m ediante qPCR y que este aum ento responde a la dosis del antagom iR (m ediante transfeccion). Esto se hizo a 48 y 96 h.

Tam bien se com probo si pod ia consegu irse el rescate de a lgunos sucesos de sp lic in g alternativo tlp icam en te a lterados en DM1, en m ioblastos de pacientes, en presencia del antagom iR 23b o el antagom iR 218, s igu iendo la m etodo log la descrita en la seccion "Ensayos de s p lic in g ” . Estos experim entos se h icieron a 48 h (Figs. 10A, C, D, E, F, G) y 96 h (Figs. 10 B, H, I, J, K, L) tras la transfeccion del antagom iR.

C om o puede verse en d ichas figuras, el tra tam ien to de ce lu las DM1 con antagom iR s m ejoro la inclusion del exon 11 de BIN1 con am bos antagom iRs, a todas las concentrac iones y a los dos tiem pos tras las transfeccion.

El tra tam ien to con los antagom iR s aum enta el porcenta je de inclusion del exon 79 de DMD tal y com o se ve re fle jado en el gel (banda superior), con am bos antagom iR s y a todas las concentrac iones en el ensayo rea lizado a 48 h. En cam bio, en el ensayo rea lizado a 96 h, no se observo n ingun cam bio en el s p lic in g aberrante de DMD.

En el ensayo rea lizado a las 48 h, no se observo n ingun cam bio con los antagom iR s a n inguna conce n tra tio n sobre el sp lic ing aberrante de SERCA1, m ientras que en el ensayo de 96 h el tra tam ien to con am bos antagom iR s y a todas las concentrac iones da lugar a un aum ento del porcenta je de inclusion del exon 22 de SER CA1; este aum ento fue notab lem ente mas vis ib le con el antagom iR -23b.

El ensayo a las 48 h desde la transfeccion no dio lugar a n ingun cam bio sobre el sp lic in g aberrante de IR. La inclusion del exon 11 de IR solo m ejoro de una form a parecida a lo que se ve en el caso de m iob lastos sanos a la concentrac ion m enor del antagom iR -23b (50 nM) a las 96 h y a la concentrac ion mas alta del antagom iR -218 (200 nM).

No se observo n ingun cam bio con los antagom iR s a n inguna concentrac ion sobre el s p lic in g aberrante de cTNT.

Referencias Bibliograficas

Altschul, S.F. et al. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)

Babcock, D. T. & Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J Vis Exp , e51223, doi:10.3791/51223 (2014)

Batra, R. et al. Loss of MBNL leads to disruption of developmental^ regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease. Mol Cell 56, 311-322, doi:10.1016/j.molcel.2014.08.027 (2014)

Begemann, G. et al. muscleblind, a gene required for photoreceptor differentiation in Drosophila, encodes novel nuclear Cys3His-type zinc-finger-containing proteins. Development 124, 4321-4331 (1997)

Chamberlain, C. M. & Ranum, L. P. Mouse model of muscleblind-like 1 overexpression:

skeletal muscle effects and therapeutic promise. Hum Mol Genet 21, 4645-4654, doi:10.1093/hmg/dds306 (2012)

Davis, B. M., McCurrach, M. E., Taneja, K. L., Singer, R. H. & Housman, D. E. Expansion of a CUG trinucleotide repeat in the 3' untranslated region of myotonic dystrophy protein kinase transcripts results in nuclear retention of transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 7388-7393 (1997)

Dixon, D.M. et al. Loss of muscleblind-like 1 results in cardiac pathology and persistence of embryonic splice isoforms. Sci Rep 5, 9042, doi:10.1038/srep09042 (2015).

Du, H. et al. Aberrant alternative splicing and extracellular matrix gene expression in mouse models of myotonic dystrophy. Nat Struct Mol Biol 17, 187-193, doi:10.1038/nsmb.1720 (2010)

Enright, A. J. et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biol 5, R1, doi:10.1186/gb-2003-5-l-rl (2003)

Fernandez-Costa, J. M. et al. Alternative splicing regulation by Muscleblind proteins: from development to disease. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 86(4), 947-58, (2011).

Fulga, T. A. et al. A transgenic resource for conditional competitive inhibition of conserved Drosophila microRNAs. Nat Commun 6, 7279, doi:10.1038/ncomms8279 (2015)

Gagno n, C. et al. Towards an integrative approach to the management of myotonic dystrophy type 1. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry 78, 800-806 (2007) Garcia-Casado, M. Z., Artero, R. D., Paricio, N., Terol, J. & Perez-Alonso, M. Generation of GAL4-responsive muscleblind constructs. Genesis 34, 111-114, doi: 10.1002/gene.10147 (2002)

Garcia-Lopez, A. et al. Genetic and chemical modifiers of a CUG toxicity model in Drosophila. PLoS One 3, e1595, doi:10.1371/journal.pone.0001595 (2008)

Harper, P. Myotonic dystrophy. (Saunders, 2001)

Houseley, J. M. et al. Myotonic dystrophy associated expanded CUG repeat muscleblind positive ribonuclear foci are not toxic to Drosophila. Hum Mol Genet 14, 873-883, doi: 10.1093/hmg/ddi080 (2005)

Huin, V. et al. MBNL1 gene variants as modifiers of disease severity in myotonic dystrophy type 1. J Neurol 260, 998-1003, doi:10.1007/s00415-012-6740-y (2013)

Irion, U. Drosophila m uscleblind codes fo r proteins w ith one and two tandem zinc finger motifs. PLoS One 7, e34248, doi:10.1371/journal.pone.0034248 (2012)

Kalsotra, A., et al.. The Mef2 transcription network is d isrupted in m yotonic dystrophy heart tissue, dram atically altering m iRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6(2): 336-345. (2014). doi: 10.1016/j.celrep.2013.12.025. Epub 2014 Jan 9

Kanadia, R. N. et al. A m uscleblind knockout model fo r m yotonic dystrophy. Science 302, 1978-1980, doi: 10.1126/science.1088583 (2003)

Kanadia, R.N. et al. Reversal o f RNA m issplicing and m yotonia afte r muscleblind overexpression in a mouse poly(CUG) model fo r m yotonic dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 11748-11753, doi:10.1073/pnas.0604970103 (2006)

Kino, Y. et al. Nuclear localization o f MBNL1: splic ing-m ediated autoregulation and repression o f repeat-derived aberrant proteins. Hum Mol Genet 24, 740-756, doi: 10.1093/hm g/ddu492 (2015)

Klein, A.F., et al.. Therapeutic Approaches fo r Dom inant M uscle D iseases: H ighlight on M yotonic Dystrophy. Curr. G ene Ther. 15(4), 329-337 (2015).

Kole, R., et al.. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews 11, 125-140 (2012)

Landford, R. E., et al. Therapeutic silencing o f m icroRNA-122 in prim ates w ith chronic hepatitis C virus infection. Science 327(5962): 198-201 (2010). Doi:10.1126/science.1178178

Lee, K. Y. et al. Com pound loss o f m uscleblind-like function in m yotonic dystrophy. EMBO Mol Med 5, 1887-1900, doi:10.1002/em m m .201303275 (2013)

Lin, X. et al. Failure o f M BNL1-dependent post-natal splicing transitions in m yotonic dystrophy. Hum Mol Genet 15, 2087-2097, doi:10.1093/hm g/ddl132 (2006) Llamusi, B. et al. Muscleblind, BSF and TBPH are m islocalized in the m uscle sarcom ere of a Drosophila m yotonic dystrophy model. Dis Model Mech 6, 184-196, doi: 10.1242/dm m .009563 (2013)

Needleman, S.B., W unsch, C.D. A general method applicable to the search fo r sim ilarities in the am ino acid sequence o f two proteins., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970) Pascual, M., et al., The M uscleblind fam ily o f proteins: an em erging class o f regulators of developm enta lly program m ed alternative splicing. D ifferentiation 4(2-3):65-80 (2006). Pearson, W .R., Lipman, D.J. Improved tools fo r biological sequence com parison. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448 (1988)

Picchio, L., Plantie, E., Renaud, Y., Poovthum kadavil, P. & Jagla, K. Novel Drosophila model o f m yotonic dystrophy type 1: phenotypic characterization and genom e-w ide view o f a ltered gene expression. Hum Mol Genet 22, 2795-2810, doi:10.1093/hm g/ddt127 (2013)

Rottiers, V. et al. Pharm acological inhibition o f a m icroRNA fam ily in non-hum an primates by a seed-targeting 8-m er antim iR. Sci Transl Med. 5(212), 212ra162, doi: 10.1126/scitranslm ed.3006840 (2013)

Smith, T.F., W aterm an, M.S. Com parison o f b iosequences. Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Terenzi, F. & Ladd, A. N. Conserved developmental alternative splicing of muscleblind-like (MBNL) transcripts regulates MBNL localization and activity. RNA Biol 7, 43-55 (2010)

Thornton, C. A. Myotonic dystrophy. Neurol Clin 32, 705-719, viii, doi:10.1016/j.ncl.2014.04.011 (2014)

Vicente, M., et al. Muscleblind isoforms are functionally distinct and regulate alpha-actinin splicing. Differentiation 75, 427-440, doi:10,1111/j.1432-0436.2006.00156.x (2007)

Vicente-Crespo, M. et al. Drosophila muscleblind is involved in troponin T alternative splicing and apoptosis. PLoS One 3, e1613, doi:10.1371/journal.pone.0001613 (2008) Wang, X.W., et al. MicroRNAs in liver disease. Gastroenterology 142(7), 1431-1443 (2012) Yanava, R. S., et al. TWEAK Regulates Muscle Functions in a Mouse Model of RNA Toxicity. PLoS One. 22;11(2):e0150192. doi: 10.1371/journal.pone.0150192 (2016). eCollection 2016.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotidica y/o un analogo de oligorribonucleotido que es un antagonista de un microRNA que regula a la baja la expresion del gen humano MBNL1 y/o MBNL2, o a una mezcla de dos o mas de dichas moleculas.

2. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotidica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun la reivindicacion 1, que es un antagonista de un microRNA que se expresa al menos en uno o mas organos seleccionados del grupo de cerebro, cerebelo, hipocampo, musculo esqueletico y corazon, o en una o mas celulas de un cultivo primario de uno de dichos organos o de una llnea celular establecida derivada de uno de dichos organos o celulas madre suyas.

3. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotidica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende un fragmento de secuencia de unidades de ribonucleotidos, o de analogos de ribonucleotidos, en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es complementaria al menos en un 50% a la secuencia de las bases nitrogenadas del fragmento de la molecula endogena (el microRNA o el RNA mensajero) al que ha de unirse.

4. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotidica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun la reivindicacion 3, que comprende un fragmento de secuencia de unidades de ribonucleotidos, o de analogos de ribonucleotidos, en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es complementaria al menos en un 55%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5%, o un 100%, a la secuencia de las bases nitrogenadas del fragmento de la molecula endogena al que ha de unirse.

5. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotidica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un antagonista del microRNA-218-5p humano o del microRNA-23b-3p humano.

6. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotidica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun la reivindicacion 5, que comprende un fragmento compuesto por una sucesion de unidades de ribonucleotidos, o de analogos de ribonucleotidos, en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es identica al menos en un porcentaje seleccionado del grupo de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 100%, a la secuencia de las bases nitrogenadas del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:1 o del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:2.

7. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un antagomiR, un blockmiR, un antimiR o una esponja de microRNA.

8. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun la reivindicacion 7, que es un analogo de oligorribonucleotido de tipo antagomiR cuya secuencia es complementaria a la secuencia del microRNA-218-5p humano o del microRNA-23b-3p humano, o que comprende un fragmento de unidades de ribonucleotidos, o de analogos de ribonucleotidos, en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es identica al menos en un 80% a la secuencia de las bases nitrogenadas del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:1 o del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:2.

9. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun la reivindicacion 8, que es un analogo de oligorribonucleotido de tipo antagomiR en el que

a. al menos una de las unidades monomericas que lo componen es un analogo de ribonucleotido que presenta una o mas modificaciones qulmicas en el resto de la ribosa, en el enlace fosfato o en ambos, b. la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades monomericas de ribonucleotidos o analogos de ribonucleotidos es identica a la secuencia de bases nitrogenadas de las unidades monomericas de ribonucleotidos del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:1 o del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:2, y que,

c. optativamente, presenta en el extremo 5’ y/o en el extremo 3’ uno o mas restos adicionales que no son restos de desoxirribonucleotido o ribonucleotidos.

10. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun la reivindicacion 8, que es un analogo de oligorribonucleotido de tipo antagomiR en el que

a. todas las unidades monomericas analogas de ribonucleotidos comprendidas en su estructura presentan modificaciones 2’-O-metil (2’-metoxi) en el resto de la ribosa,

b. las dos primeras unidades monomericas analogas de ribonucleotidos de su extremo 5’ y las cuatro ultimas unidades monomericas analogas de ribonucleotidos de su extremo 3’ estan unidas al siguiente resto componente de la molecula por grupos fosforotioato en lugar de grupos fosfato,

c. presenta 4 restos de colesterol en el extremo 3’, unidas a la ultima unidad monomerica analoga de ribonucleotido de dicho extremo 3’, d. la secuencia de las bases nitrogenadas de sus unidades monomericas analogas de ribonucleotidos es identica a la secuencia de bases nitrogenadas de las unidades monomericas de ribonucleotidos del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:1 (antagomiR-218-5p) o del oligorribonucleotido de SEQ ID NO:2 (antagomiR-23b-3p),

11. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun la reivindicacion 9 o 10, que es un analogo de oligorribonucleotido tipo antagomiR representado por SEQ ID NO:10 (antagomiR-218-5p) o el analogo de oligorribonucleotido tipo antagomiR representado por SEQ ID NO:11 (antagomiR-23b-3p).

12. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende un fragmento complementario a la region semilla del microRNA del que es antagonista o que comprende un fragmento compuesto por una sucesion de unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es complementaria en un 100% a la secuencia de las bases nitrogenadas de la region semilla del microRNA del que es antagonista.

13. Una molecula de naturaleza oligorribonucleotldica y/o un analogo de oligorribonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un blockmiR que comprende un fragmento compuesto por una sucesion de unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos en el que la secuencia de las bases nitrogenadas de las unidades de ribonucleotidos o de analogos de ribonucleotidos es complementaria al menos en un 80% a la secuencia de las bases nitrogenadas de la region de un RNA mensajero diana reconocida por el microRNA del que el blockmiR es antagonista.

14. Una composition que comprende al menos una de las moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica o un analogo de oligorribonucleotido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, una mezcla de dos o mas de ellas, o un vector de expresion que comprende la secuencia codificante de al menos una de dichas moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica.

15. Una composicion segun la reivindicacion 14, que adicionalmente comprende un vehlculo y/o uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.

16. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15 , que comprende el analogo de oligorribonucleotido tipo antagomiR representado por SEQ ID NO:10 (antagomiR-218-5p) o el analogo de oligorribonucleotido tipo antagomiR representado por SEQ ID NO:11 (antagomiR-23b-3p) o una mezcla de los mismos.

17. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, que comprende un vector de expresion que comprende la secuencia codificante de una esponja de microRNA que comprende multiples sitios colocados en tandem complementarios al microRNA-218-5p humano o al microRNA-23b-3p humano o una mezcla de mutiples sitios de union colocados en tandem complementarios a cada uno de ellos.

18. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en la que la molecula de naturaleza oligorribonucleotldica o analogo de oligorribonucleotido esta en una concentration de 50 nM a 200 nM, ambas incluidas

19. Uso de una de las moleculas de naturaleza oligorribonucleotldica o un analogo de oligorribonucleotido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, una mezcla de dos o mas de ellas, o una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de la distrofia miotonica tipo 1.

20. El uso segun la reivindicacion 19, en el que el tratamiento es un tratamiento paliativo de uno o mas slntomas de la distrofia miotonica tipo 1.

21. El uso segun la re iv ind icacion 20, en el que el tra tam ien to es un tra tam ien to paliativo de una o mas de las a lteraciones m uscu lares que form an parte de los s ln tom as de la d istro fia m io ton ica tipo 1.

22. El uso segun una cualqu iera de las re iv ind icaciones 19 a 21, en el que la m olecula de natura leza o ligorribonucleo tld ica o ana logo de o ligorribonucleotido es un inh ib idor del m icroR N A -218-5p hum ano o del m icroR N A -23b-3p hum ano.

23. El uso segun la re iv ind icacion 22, en el que la m olecula de natura leza o ligorribonucleotld ica o ana logo de o ligorribonucleotido es el inh ib idor del m icroR N A-218-5p tipo antagom iR representado por SEQ ID NO :10 o el inh ib idor del m icroR N A-23b-3p hum ano tipo antagom iR representado por SEQ ID NO:11.