KR20130106811A - 근육긴장성 이영양증-단백질 키나제(dmpk) 발현의 조절 방법 - Google Patents

근육긴장성 이영양증-단백질 키나제(dmpk) 발현의 조절 방법 Download PDF

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아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드
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Abstract

동물에서 DMPK mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 방법, 화합물 및 조성물이 본원에 제공된다. 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키기 위한 방법, 화합물 및 조성물이 또한 본원에 제공된다. 이러한 방법, 화합물 및 조성물은 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 이의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키는데 유용하다.

Description

근육긴장성 이영양증-단백질 키나제(DMPK) 발현의 조절 방법{MODULATION OF DYSTROPHIA MYOTONICA-PROTEIN KINASE (DMPK) EXPRESSION}
서열목록
본 출원은 전자 포맷의 서열목록과 함께 출원된다. 서열목록은 약 216Mb 크기의 2011년 7월 19일에 생성된 BIOL0134USL2SEQ.txt를 제목으로 하는 파일로 제공된다. 서열목록의 전자 포맷의 정보는 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
분야
동물에서 DMPK mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 방법, 화합물 및 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로(preferentially) 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시(spliceopathy)를 감소시키기 위한 방법, 화합물, 및 DMPK 억제제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 방법, 화합물 및 조성물은, 예를 들어, 동물에서 타입 1 근육긴장성 이영양증(DM1)을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키는데 유용하다.
근육긴장성 이영양증 타입 1(DM1)은 7,500명 중 1명의 추정 빈도로 성인에 존재하는 가장 흔한 형태의 근육 이영양증이다(Harper PS., Myotonic Dystrophy. London: W.B. Saunders Company; 2001). DM1은 DMPK1에서의 비-코딩 CTG 반복부의 확장에 의해 야기되는 보통염색체 우성 질환이다. DMPK1은 세포질 세린/트레오닌 키나제를 엔코딩하는 유전자이다(Brook JD, et al., Cell, 1992, 68(4):799-808). 상기 키나제의 생리학적 기능 및 기질은 완전히 결정되지 않았다. 확장된 CTG 반복부는 DMPK1의 3' 비번역 영역(UTR)에 위치된다. 이러한 돌연변이는 확장된 CUG 반복부(CUGexp)를 함유하는 RNA의 발현이 세포 기능이상을 유도하는 과정인 RNA 우세를 발생시킨다(Osborne RJ and Thornton CA., Human Molecular Genetics., 2006, 15(2): R162-R169).
DMPK 유전자는 보통 3' 비번역 영역 내에 5-37개의 CTG 반복부를 갖는다. 근육긴장성 이영양증 타입 I에서, 이러한 수는 현저히 확장되고, 이는, 예를 들어, 50개 내지 3,500개 초과의 범위이다(Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, London, ed.3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol. 20: 572, 2007).
CUGexp 트랙(tract)은 스플라이싱 인자인 muscleblind-유사(MBNL) 단백질을 포함하는 RNA 결합 단백질과 상호작용하고, 돌연변이 전사물이 핵 초점(nuclear foci) 내에 유지되도록 한다. 이러한 RNA의 독성은 RNA 결합 단백질의 격리 및 신호전달 경로의 활성화로부터 발생한다. 동물 모델에서의 연구에서 CUGexp RNA의 독성이 감소되는 경우에 DM1의 표현형이 역전될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325(5938):336-339; Mulders SA, et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2009, 106(33):13915-13920).
DM1에서, 골격근은 가장 심각하게 영향을 받는 조직이나, 상기 질병은 또한 심장 및 평활근, 안구 렌즈 및 뇌에 중요한 영향을 미친다. 두개, 말단지(distal limb) 및 횡경막 근육이 우선적으로 영향을 받는다. 수동민첩성(Manual dexterity)은 초기에 손상되고, 이는 수십년간의 심한 장애를 야기시킨다. 사망시의 정중 연령은 55세이고, 이러한 사망은 보통 호흡부전으로부터 유래된다(de Die-Smulders CE, et al., Brain., 1998, 121(Pt 8): 1557-1563).
안티센스 기술은 특정 유전자 생성물의 발현을 조절하기 위한 효과적인 수단으로 최근 만들어졌으며, 따라서 이는 DMPK1의 조절을 위한 다수의 치료, 진단 및 연구 적용에 독특하게 유용한 것을 알 수 있다. CAG-반복부를 표적으로 하는 완전히 변형된 올리고뉴클레오타이드의 근내 주사는 마우스에서 CUGexp-MBNL1 복합체의 형성을 차단하고, CUGexp 전사물의 핵 초점을 분산시키고, CUGexp 전사물의 핵세포질 수송(nucleocytoplasmic transport) 및 번역을 향상시키고, 핵질로 MBNL 단백질을 방출시키고, MBNL-의존성 엑손의 대안적 스플라이싱을 정상화시키고, CUGexp-발현 트랜스제닉 마우스에서 근육긴장증을 제거하는 것으로 밝혀졌다(Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325(5938):336-339; WO2008/036406).
현재, DM1의 과정을 조절할 수 있는 치료가 없다. 따라서, 질병의 부담이 현저하다. 따라서, DM1을 치료하기 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공하는 것이 본원의 목적이다.
DMPK의 발현을 억제하고, DMPK 관련 질병 및/또는 이의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키는 방법, 화합물 및 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 화합물 및 조성물은 돌연변이 DMPK 또는 CUGexp DMPK를 억제한다.
특정 구체예는 DMPK를 표적으로 하는 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물의 DMPK 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 구체예는 CUGexp DMPK를 표적으로 하는 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물에서 CUGexp DMPK를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 방법을 제공한다. CUGexp DMPK 전사물은 이의 핵에서의 보다 긴 체류 시간으로 인해 핵 리보누클레아제를 통한 안티센스 넉다운(knockdown)에 특히 민감한 것으로 생각되며, 이러한 민감성은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 조직 흡수에 대한 생체분포 장벽에도 불구하고 근육과 같은 관련 조직에서 CUGexp DMPK 전사물의 효과적인 안티센스 억제를 가능케 하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 문헌[Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325(5938):336-339] 및 WO2008/036406호에 기재된 CAG-반복부 ASO와 같은 핵 리보누클레아제를 통한 절단을 유도하지 않는 안티센스 메커니즘은 동일한 치료 장점을 제공하지 않는다.
특정 구체예는 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 DMPK를 표적으로 하는 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 확인하는 것을 포함한다.
특정 구체예는 근육 경직, 근육긴장증, 불능화 원위 약화(disabling distal weakness), 안면 및 턱 근육의 약화, 연하(swallowing)의 어려움, 눈꺼풀의 힘없음(안검하수증), 목 근육의 약화, 팔 및 다리 근육의 약화, 지속적인 근육 동통, 과다수면, 근육 소모, 연하곤란, 호흡기능부전, 불규칙한 심박동, 심장 근육 손상, 무감동, 인슐린 내성, 및 백내장을 포함하는 DM1의 발달과 관련된 증상 및 결과를 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예는 발달 지연, 학습 장애, 언어 및 말 문제, 및 인격 발달 문제를 포함하는 아동에서의 DM1의 발달과 관련된 증상 및 결과를 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키는 방법을 제공한다.
특정 구체예는 병원성 전사물의 절단을 유도함으로써 RNA 우세를 중화시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호(GenBank Accession No.) NM_001081560.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 1로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 뉴클레오타이드 18540696으로부터 18555106까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_011109.15에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 2로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 뉴클레오타이드 16666001로부터 16681000까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_039413.7에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 3으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 NM_032418.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 4로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 AI007148.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 5로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 AI304033.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 6으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 BC024150.1로 본원에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 7로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 BC056615.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 8로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 BC075715.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 793으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 BU519245.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 794로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 CB247909.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 795로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 CX208906.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 796으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 CX732022.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 797로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 S60315.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 798로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 S60316.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 799로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 NM_001081562.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 800으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 NM_001100.3에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 801로 본원에 포함됨)을 갖는다.
상기 일반적 기재 및 하기의 상세한 설명 둘 모두는 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며, 청구되는 바와 같은 본 발명을 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본원에서, 단수의 사용은 특별히 달리 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 본원에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 다른 형태, 예를 들어, "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한되지 않는다. 또한, "성분" 또는 "구성요소"와 같은 용어는 특별히 달리 언급되지 않는 한 하나의 유닛을 포함하는 성분 및 구성요소 및 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 성분 및 구성요소 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 섹션 제목은 단지 구성 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다. 특허, 특허 출원, 문헌, 서적 및 논문을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 출원에 본 출원에 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 본원에 논의된 이러한 문서의 일부뿐만 아니라 이의 전체내용에 있어서 참조로서 특별히 본원에 포함된다.
정의
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달리 표시하지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미를 갖는다:
"2'-O-메톡시에틸"(또한, 2'-MOE 및 2'-O(CH2)2-OCH3)은 푸라노실 고리의 2' 위치의 O-메톡시-에틸 변형을 의미한다. 2'-O-메톡시에틸 변형된 당은 변형된 당이다.
"2'-O-메톡시에틸 뉴클레오타이드"는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미한다.
"5-메틸사이토신"은 위치 5에 부착된 메틸기로 변형된 사이토신을 의미한다. 5-메틸사이토신은 변형된 핵염기이다.
"약"은 값의 ±7% 내를 의미한다. 예를 들어, "화합물이 DMPK의 적어도 70% 억제에 영향을 줬다"라고 언급되는 경우, 이는 DMPK 수준이 63% 및 77%의 범위 내에서 억제되는 것을 의미한다.
"활성 약학적 작용제"는 개체에 투여되는 경우에 치료적 이점을 제공하는 약학적 조성물 내의 물질 또는 물질들을 의미한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, DMPK를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 활성 약학적 작용제이다.
"활성 표적 영역" 또는 "표적 영역"은 하나 이상의 활성 안티센스 화합물이 표적으로 하는 영역을 의미한다. "활성 안티센스 화합물"은 표적 핵산 수준 또는 단백질 수준을 감소시키는 안티센스 화합물을 의미한다.
"동시 투여된"은 2개의 작용제의 약리학적 효과가 동시에 환자에서 나타나는 임의의 방식의 2개의 작용제의 공동 투여를 의미한다. 동시 투여는 둘 모두의 작용제가 단일한 약학적 조성물, 동일한 투여 형태 또는 동일한 투여 경로로 투여되는 것을 필요로 하지 않는다. 둘 모두의 작용제의 효과는 동시에 둘 모두의 작용제 효과 자체가 나타나는 것을 필요로 하지 않는다. 상기 효과는 단지 일정 기간 동안 중첩되는 것을 필요로 하며, 공존하는 것을 필요로 하지 않는다.
"투여하는"은 동물에게 작용제를 제공하는 것을 의미하며, 이는 의학 전문가에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"작용제"는 동물에게 투여되는 경우에 치료적 이점을 제공할 수 있는 활성 물질을 의미한다. "첫번째 작용제"는 본 발명의 치료 화합물을 의미한다. 예를 들어, 첫번째 작용제는 DMPK를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. "두번째 작용제"는 본 발명의 두번째 치료 화합물(예를 들어, DMPK를 표적으로 하는 두번째 안티센스 올리고뉴클레오타이드) 및/또는 비-DMPK 치료 화합물을 의미한다.
"개선"은 관련 질병, 장애 또는 질환의 적어도 하나의 지표, 징후 또는 증상의 감소를 의미한다. 지표의 중증도는 당업자에게 공지된 주관적 또는 객관적 척도에 의해 결정될 수 있다.
"동물"은 인간, 또는 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-인간 동물, 및 원숭이 및 침팬지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-인간 영장류를 의미한다.
"안티센스 활성"은 안티센스 화합물의 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 하이브리드화에 기인하는 임의의 검출가능하거나 측정가능한 활성을 의미한다. 특정 구체예에서, 안티센스 활성은 표적 핵산 또는 상기 표적 핵산에 의해 엔코딩되는 단백질의 양 또는 발현에서의 감소이다.
"안티센스 화합물"은 수소 결합을 통한 표적 핵산으로의 하이브리드화를 경험할 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다. 안티센스 화합물의 예는 단일 가닥 및 이중 가닥의 화합물, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, snoRNA, miRNA 및 위성 반복부(satellite repeat)를 포함한다.
"안티센스 억제"는 안티센스 화합물의 부재하에서의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준에 비한 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물의 존재하에서의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준의 감소를 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적 핵산의 상응하는 영역 또는 세그먼트에 대한 하이브리드화를 가능케 하는 핵염기 서열을 갖는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"바이사이클릭 당"은 2개의 비-이중(non-geminal) 탄소 고리 원자의 브릿지 형성에 의해 변형된 푸라노실 고리를 의미한다. 바이사이클릭 당은 변형된 당이다.
"바이사이클릭 핵산" 또는 "BNA"는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 푸라노스 부분이 푸라노스 고리 상의 2개의 탄소 원자를 연결시키는 브릿지를 포함함으로써 바이사이클릭 고리 시스템을 형성하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 의미한다.
"캡 구조" 또는 "말단 캡 모이어티"는 안티센스 화합물의 어느 한 말단에 통합된 화학적 변형을 의미한다.
"화학적으로 별개의 영역"은 동일한 안티센스 화합물의 또 다른 영역과 어떤 점에서든지 화학적으로 상이한 안티센스 화합물의 영역을 의미한다. 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오타이드를 갖는 영역은 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖지 않는 뉴클레오타이드를 갖는 영역과 화학적으로 별개이다.
"키메라 안티센스 화합물"은 적어도 2개의 화학적으로 별개의 영역을 갖는 안티센스 화합물을 의미한다.
"공동 투여"는 개체로의 2개 이상의 작용제의 투여를 의미한다. 2개 이상의 작용제는 단일한 약학적 조성물로 존재할 수 있거나, 별개의 약학적 조성물로 존재할 수 있다. 2개 이상의 작용제 각각은 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 공동 투여는 병행 또는 순차적 투여를 포함한다.
"상보성"은 첫번째 핵산 및 두번째 핵산의 핵염기 사이에서 쌍을 형성하는 능력을 의미한다.
"연속적 핵염기"는 서로 바로 인접한 핵염기를 의미한다.
"CUGexp DMPK"는 확장된 CUG 반복부(CUGexp)를 함유하는 돌연변이 DMPK RNA를 의미한다. 야생형 DMPK 유전자는 3' 비번역 영역에 5-37개의 CTG 반복부를 갖는다. "CUGexp DMPK"에서(예를 들어, 근육긴장성 이영양증 타입 I 환자에서), 이러한 수는 현저히 확장되고, 이는, 예를 들어, 50개 내지 3,500개 초과의 범위이다(Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, London, ed.3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol. 20: 572, 2007).
"희석제"는 약리학적 활성이 결핍되어 있으나, 약학적으로 필요하거나 요망되는 조성물 내의 성분을 의미한다. 예를 들어, 주사되는 조성물 내의 성분은 액체, 예를 들어, 염수 용액일 수 있다.
"DMPK"는 DMPK의 임의의 핵산 또는 단백질을 의미한다. DMPK는 CUGexp DMPK 핵산을 포함하는 돌연변이 DMPK일 수 있다.
"DMPK 발현"은 DMPK를 엔코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준 또는 mRNA로부터 번역된 단백질의 수준을 의미한다. DMPK 발현은 노던(Northern) 또는 웨스턴 블롯(Western blot)과 같은 당 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
"DMPK 핵산"은 DMPK를 엔코딩하는 임의의 핵산을 의미한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, DMPK 핵산은 DMPK를 엔코딩하는 DNA 서열, DMPK를 엔코딩하는 DNA(인트론 및 엑손을 포함하는 유전체 DNA를 포함함)로부터 전사된 RNA 서열, 및 DMPK를 엔코딩하는 mRNA 또는 프리-mRNA 서열을 포함한다. "DMPK mRNA"는 DMPK 단백질을 엔코딩하는 mRNA를 의미한다.
"용량"은 단일 투여 또는 특정한 기간으로 제공되는 약학적 작용제의 특정량을 의미한다. 특정 구체예에서, 용량은 1, 2 또는 이 이상의 횟수의 볼루스, 정제 또는 주사로 투여될 수 있다. 예를 들어, 피하 투여가 요망되는 특정 구체예에서, 요망되는 용량은 단일 주사에 의해 용이하게 제공되지 않는 부피를 필요로 하며, 따라서 요망되는 용량을 달성하기 위해 2회 이상의 주사가 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 약학적 작용제는 연장된 기간에 걸쳐 또는 지속적으로 주입에 의해 투여된다. 용량은 시간, 일, 주 또는 월 당 약학적 작용제의 양으로 언급될 수 있다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 작용제를 필요로 하는 개체에서 요망되는 생리학적 결과를 실현하기에 충분한 활성 약학적 작용제의 양을 의미한다. 유효량은 치료되는 개체의 건강 및 신체 상태, 치료되는 개체의 분류집단, 조성물의 제형, 개체의 의학적 상태의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 개체마다 다양할 수 있다.
"완전히 상보적" 또는 "100% 상보적"은 첫번째 핵산의 핵염기 서열의 각각의 핵염기가 두번째 핵산의 두번째 핵염기 서열 내에 상보적인 핵염기를 갖는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 첫번째 핵산은 안티센스 화합물이고, 표적 핵산은 두번째 핵산이다.
"갭머"는 RNase H 절단을 지지하는 다수의 뉴클레오사이드를 갖는 내부 영역이 하나 이상의 뉴클레오사이드를 갖는 외부 영역 사이에 위치되는 키메라 안티센스 화합물을 의미하며, 상기 내부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드는 외부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드들과 화학적으로 별개이다. 내부 영역은 "갭 세그먼트"로 언급될 수 있고, 외부 영역은 "윙 세그먼트"로 언급될 수 있다.
"갭-확장된"은 1 내지 6개의 뉴클레오사이드를 갖는 5' 및 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 이에 바로 인접한 12개 이상의 연속적 2'-데옥시리보뉴클레오사이드의 갭 세그먼트를 갖는 키메라 안티센스 화합물을 의미한다.
"하이브리드화"는 상보적 핵산 분자의 어닐링(annealing)을 의미한다. 특정 구체예에서, 상보적 핵산 분자는 안티센스 화합물 및 표적 핵산을 포함한다.
"타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 확인"은 1 근육긴장성 이영양증 장애 또는 질환을 갖는 것으로 진단된 동물을 확인하거나, 타입 1 근육긴장성 이영양증 장애 또는 질환이 발달하기 쉬운 동물을 확인하는 것을 의미한다. 예를 들어, 가족력을 갖는 개체는 타입 1 근육긴장성 이영양증 장애 또는 질환이 발달하기 쉬울 수 있다. 이러한 확인은 개체의 의학력(medical history) 및 표준 임상 시험 또는 평가를 평가하는 것을 포함하는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
"바로 인접한"은 성분 사이에 바로 인접하여 개재 성분이 존재하지 않는 것을 의미한다.
"개체"는 치료 또는 요법을 위해 선별된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"뉴클레오사이드간 결합"은 뉴클레오사이드 사이의 화학적 결합을 의미한다.
"결합된 뉴클레오사이드"는 뉴클레오사이드간 결합에 의해 함께 결합되거나 연결되는 인접한 뉴클레오사이드를 의미한다.
"미스매치" 또는 "비-상보적 핵염기"는 첫번째 핵산의 핵염기가 두번째 또는 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 쌍을 형성할 수 없는 경우를 의미한다.
"변형된 뉴클레오사이드간 결합"은 자연 발생 뉴클레오사이드간 결합(즉, 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 결합)으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 의미한다.
"변형된 핵염기"는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티미딘 또는 유라실이 아닌 임의의 핵염기를 의미한다. "변형되지 않은 핵염기"는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 사이토신(C) 및 유라실(U)을 의미한다.
"변형된 뉴클레오타이드"는 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오사이드간 결합 또는 변형된 핵염기를 독립적으로 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. "변형된 뉴클레오사이드"는 변형된 당 모이어티 또는 변형된 핵염기를 독립적으로 갖는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"변형된 올리고뉴클레오타이드"는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"변형된 당"은 자연 당으로부터의 치환 또는 변형을 의미한다.
"모티프"는 안티센스 화합물 내의 화학적으로 별개의 영역의 패턴을 의미한다.
"근육긴장증"은 수의 수축 또는 전기 자극 후의 근육의 비정상적인 느린 이완을 의미한다.
"핵 리보누클레아제"는 핵에서 발견된 리보누클레아제를 의미한다. 핵 리보누클레아제는 RNase H1 및 RNase H2를 포함하는 RNase H, 이중 가닥의 RNase drosha 및 다른 이중 가닥의 RNase를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"자연 발생 뉴클레오사이드간 결합"은 3'으로부터 5'으로의 포스포다이에스터 결합을 의미한다.
"자연 당 모이어티"는 DNA (2'-H) 또는 RNA (2'-OH)에서 발견되는 당을 의미한다.
"핵산"은 모노머 뉴클레오타이드로 구성되는 분자를 의미한다. 핵산은 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 단일 가닥의 핵산, 이중 가닥의 핵산, 작은 간섭 리보핵산(small interfering ribonucleic acid, siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)를 포함한다. 핵산은 또한 단일 분자 내에 상기 성분의 조합을 포함할 수 있다.
"핵염기"는 또 다른 핵산의 염기와 쌍을 이룰 수 있는 헤테로사이클릭 모이어티를 의미한다.
"핵염기 서열"은 임의의 당, 결합 또는 핵염기 변형과 독립적인 연속적 핵염기의 순서를 의미한다.
"뉴클레오사이드"는 당에 결합된 핵염기를 의미한다.
"뉴클레오사이드 모방체(mimetic)"는, 예를 들어, 모르폴리노, 사이클로헥세닐, 사이클로헥실, 테트라하이드로피라닐, 바이사이클로 또는 트라이사이클로 당 모방체, 예를 들어, 비 푸라노스 당 유닛을 갖는 뉴클레오사이드 모방체와 같은 올리고머 화합물의 하나 이상의 위치에 당 또는 당 및 염기, 및 반드시 그러한 것은 아니지만 결합을 대체하는데 사용되는 구조를 포함한다.
"뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유적으로 결합된 포스페이트 기를 갖는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"뉴클레오타이드 모방체"는, 예를 들어, 펩티드 핵산 또는 모르폴리노(모르폴리노는 -N(H)-C(=O)-O- 또는 다른 비-포스포다이에스터 결합에 의해 연결됨)와 같은 올리고머 화합물의 하나 이상의 위치의 뉴클레오사이드 및 결합을 대체하기 위해 사용되는 구조를 포함한다.
"올리고머 화합물" 또는 "올리고머"는 핵산 분자의 적어도 한 영역에 하이브리드화될 수 있는 결합된 모노머 서브유닛의 중합체를 의미한다.
"올리고뉴클레오타이드"는 각각이 서로 독립적으로 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 결합된 뉴클레오사이드의 중합체를 의미한다.
"비경구 투여"는 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여는 피하 투여, 정맥내 투여, 근내 투여, 동맥내 투여, 복막내 투여, 또는 두개내 투여, 예를 들어, 수막강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다. 투여는 연속, 또는 만성, 또는 단기, 또는 간헐적 투여일 수 있다.
"펩티드"는 아미노 결합에 의해 적어도 2개의 아미노산을 결합시킴으로써 형성된 분자를 의미한다. 펩티드는 폴리펩티드 및 단백질을 의미한다.
"약학적 조성물"은 개체로의 투여에 적합한 물질의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 하나 이상의 활성제 및 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용되는 염"은 안티센스 화합물의 생리학적 및 약학적으로 허용되는 염, 즉, 모(parent) 올리고뉴클레오타이드의 요망되는 생물학적 활성을 보유하고, 모 올리고뉴클레오타이드에 요망되지 않는 독물학적 효과를 제공하지 않는 염을 의미한다.
"포스포로티오에이트 결합"은 포스포다이에스터 결합이 브릿지를 형성하지 않는 산소 원자 중 하나를 황 원자로 대체함으로써 변형된, 뉴클레오사이드 사이의 결합을 의미한다. 포스포로티오에이트 결합은 변형된 뉴클레오사이드간 결합이다.
"부분"은 핵산의 연속적(즉, 결합된) 핵염기의 규정된 수를 의미한다. 특정 구체예에서, 부분은 표적 핵산의 연속적 핵염기의 규정된 수이다. 특정 구체예에서, 부분은 안티센스 화합물의 연속적 핵염기의 규정된 수이다.
"CUG exp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키는"은 정상 DMPK 대립유전자로부터의 RNA 전사물에 비한 CUGexp DMPK 대립유전자로부터의 RNA 전사물의 선택적 감소를 의미한다.
"예방하다"는 수분 내지 무기한의 기간 동안 질병, 장애 또는 질환의 발생 또는 발달을 지연시키거나 미리 방해하는 것을 의미한다. 예방은 또한 질병, 장애 또는 질환이 발달 위험을 감소시키는 것을 의미한다.
"프로드러그"는 내인성 효소 또는 다른 화합물 또는 상태의 작용에 의해 체내 또는 세포 내에서 활성 형태로 전환되는 비활성 형태로 제조되는 치료제를 의미한다.
"부작용"은 요망되는 효과가 아닌 치료에 기인하는 생리학적 반응을 의미한다. 특정 구체예에서, 부작용은 주사 부위 반응, 간 기능 시험 이상, 신장 기능 이상, 간 독성, 신장 독성, 중추신경계 이상, 근육병증 및 권태감을 포함한다. 예를 들어, 혈청에서의 증가된 아미노전이효소 수준은 간 독성 또는 간 기능 이상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 증가된 빌리루빈은 간 독성 또는 간 기능 이상을 나타낼 수 있다.
"단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드"는 상보적 가닥에 하이브리드화되지 않은 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"특이적으로 하이브리드화가능한"은 특이적 결합이 요망되는 조건, 즉, 생체내 검정 및 치료적 치료의 경우에 생리학적 조건하에서 요망되는 효과를 유도하기에 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 표적 핵산 사이에 충분한 정도의 상보성을 갖지만, 비-표적 핵산에 대해서는 최소의 효과를 나타내거나 효과를 나타내지 않는 안티센스 화합물을 의미한다.
"스플라이스오패시"는 특정 조직 내의 변경된 스플라이스 생성물의 발현을 발생시키는 하나 이상의 RNA의 대안적 스플라이싱에서의 변화를 의미한다.
"피하 투여"는 피부 바로 아래의 투여를 의미한다.
"당 대용물(surrogate)"은 약간 더 광범위한 용어 "뉴클레오사이드 모방체"와 중복되지만, 이는 당 단위(푸라노스 고리)만의 대체를 나타내고자 하는 것이다. 본원에 제공된 테트라하이드로피라닐 고리는 푸라노스 당 기가 테트라하이드로피라닐 고리 시스템으로 대체된 당 대용물의 예를 예시한다.
"표적으로 하는" 또는 "표적화된"은 표적 핵산에 특이적으로 하이브리드화되고, 요망되는 효과를 유도하는 안티센스 화합물의 설계 및 선별 과정을 의미한다.
"표적 핵산", "표적 RNA" 및 "표적 RNA 전사물" 모두는 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 핵산을 의미한다.
"표적 세그먼트"는 안티센스 화합물이 표적으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오타이드의 서열을 의미한다. "5' 표적 부위"는 표적 세그먼트의 가장 5'의 뉴클레오타이드를 의미한다. "3' 표적 부위"는 표적 세그먼트의 가장 3'의 뉴클레오타이드를 의미한다.
"치료적 유효량"은 개체에 치료적 이점을 제공하는 작용제의 양을 의미한다.
"치료하다"는 질병, 장애 또는 질환의 변경 또는 개선을 성취하기 위해 약학적 조성물을 투여하는 것을 의미한다.
"타입 1 근육긴장성 이영양증" 또는 "DM1"은 DMPK에서 비-코딩 CTG 반복부의 확장에 의해 야기되는 보통염색체 우성 장애를 의미한다. 이러한 돌연변이는 확장된 CUG 반복부(CUGexp)를 함유하는 RNA의 발현이 세포 기능이상을 유도하는 과정인 RNA 우세를 발생시킨다. CUGexp 트랙은 RNA 결합 단백질과 상호작용하고, 돌연변이 전사물이 핵 초점(nuclear foci) 내에 유지되도록 한다. 이러한 RNA의 독성은 RNA 결합 단백질의 격리 및 신호전달 경로의 활성화로부터 발생한다.
"변형되지 않은 뉴클레오타이드"는 자연 발생 핵염기, 당 모이어티, 및 뉴클레오사이드간 결합으로 구성되는 뉴클레오타이드를 의미한다. 특정 구체예에서, 변형되지 않은 뉴클레오타이드는 RNA 뉴클레오타이드(즉, β-D-리보뉴클레오사이드) 또는 DNA 뉴클레오타이드(즉, β-D-데옥시리보뉴클레오사이드)이다.
특정 구체예
특정 구체예는 DMPK 발현을 억제하기 위한 방법, 화합물 및 조성물을 제공한다.
특정 구체예는 DMPK를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물의 DMPK 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 구체예는 DMPK를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시킨다.
특정 구체예는 병원성 전사물의 절단을 유도함으로써 RNA 우세를 중화시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 방법을 제공한다.
특정 구체예는 Serca1의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 엑손 22 봉입(inclusion)을 야기시킨다. 특정 구체예에서, 교정 스플라이싱은 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근에서 발생한다.
특정 구체예는 m- Titin의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 엑손 5 봉입을 야기시킨다. 특정 구체예에서, 교정 스플라이싱은 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근에서 발생한다.
특정 구체예는 Clcn1의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 엑손 7a 봉입을 야기시킨다. 특정 구체예에서, 교정 스플라이싱은 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근에서 발생한다.
특정 구체예는 Zasp의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 엑손 11 봉입을 야기시킨다. 특정 구체예에서, 교정 스플라이싱은 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근에서 발생한다.
특정 구체예는, a) 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 선별하는 단계, 및 b) DMPK를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 동물에게 투여되는 치료적 유효량의 화합물은 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시킨다.
특정 구체예는 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 CUGexp DMPK RNA를 갖는 것으로 의심되는 피검체에 상기 CUGexp DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함하는 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성하는 방법을 제공한다. 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 CUGexp DMPK RNA에 결합하는 경우 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성한다.
특정 구체예는 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 CUGexp DMPK RNA를 갖는 피검체를 선별하는 단계, 및 상기 CUGexp DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 피검체에 투여하는 단계를 포함하는 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성하는 방법을 제공한다. 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 CUGexp DMPK RNA에 결합하는 경우 리보누클레아제 또는 핵 리보누클레아제를 활성화시킴으로써 핵 내의 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성한다.
특정 구체예는 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 돌연변이 또는 CUGexp DMPK RNA를 갖는 피검체를 선별하는 단계, 및 상기 CUGexp DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 피검체에 전신 투여하는 단계를 포함하는 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성하는 방법을 제공한다. 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 돌연변이 또는 CUGexp DMPK RNA에 결합하는 경우 돌연변이 또는 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성한다.
특정 구체예는 근육긴장증을 감소시킬 필요가 있는 피검체의 근육긴장증을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 피검체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DMPK RNA에 결합하는 경우 리보누클레아제 또는 핵 리보누클레아제를 활성화시킴으로써 근육긴장증을 감소시킨다. 특정 구체예에서, 피검체는 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 돌연변이 DMPK RNA 또는 CUGexp DMPK RNA를 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심된다. 특정 구체예에서, DMPK RNA는 핵 유지된다.
특정 구체예는 스플라이스오패시를 감소시킬 필요가 있는 피검체의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 피검체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DMPK RNA에 결합하는 경우 리보누클레아제 또는 핵 리보누클레아제를 활성화시킴으로써 스플라이스오패시를 감소시킨다. 특정 구체예에서, 피검체는 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 핵 유지된 CUGexp DMPK RNA를 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심된다. 특정 구체예에서, DMPK RNA는 핵 유지된다. 특정 구체예에서, 스플라이스오패시는 MBNL 의존성 스플라이스오패시이다.
특정 구체예에서, 상기 방법의 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 특정 구체예에서, 상기 방법의 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 갭머이다.
본원에 제공된 방법의 특정 구체예에서, 투여는 피하 투여이다. 특정 구체예에서, 투여는 정맥내 투여이다.
특정 구체예에서, 상기 방법의 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DMPK RNA의 비-반복부 영역 내의 비-코딩 서열을 표적으로 한다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이 DMPK RNA의 코딩 영역, 인트론, 5'UTR 또는 3'UTR을 표적으로 한다.
본원에 제공된 방법의 특정 구체예에서, 핵 리보누클레아제는 RNase H1이다.
상기 방법의 특정 구체예에서, DMPK RNA는 근육 조직에서 감소된다. 특정 구체예에서, 돌연변이 DMPK RNA CUGexp DMPK RNA가 선택적으로 감소된다.
특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 NM_001081560.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 1로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 뉴클레오타이드 18540696으로부터 18555106까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_011109.15에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 2로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 뉴클레오타이드 16666001로부터 16681000까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_039413.7에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 3으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 NM_032418.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 4로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 AI007148.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 5로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 AI304033.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 6으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 BC024150.1로 본원에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 7로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 BC056615.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 8로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 BC075715.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 793으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 BU519245.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 794로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 CB247909.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 795로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 CX208906.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 796으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 CX732022.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 797로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 S60315.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 798로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 S60316.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 799로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 NM_001081562.1에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 800으로 본원에 포함됨)을 갖는다. 특정 구체예에서, DMPK는 유전자은행 등록번호 NM_001100.3에 나열된 바와 같은 서열(서열번호 801로 본원에 포함됨)을 갖는다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 9개, 적어도 10개 또는 적어도 11개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 13개 또는 적어도 14개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 15개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 16개 또는 적어도 17개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 18개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 19개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1:1178-1206, 2159-2182, 2174-2196, 2426-2447, 2450-2518, 2679-2704 및 2697-2725의 영역 중 어느 하나를 표적으로 한다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1:178-223, 232-253, 279-299, 366-399, 519-541, 923-975, 1073-1105, 1171-1196, 1215-1246, 1263-1324, 1706-1734, 1743-1763, 1932-1979, 1981-2003, 2077-2108 및 2152-2173의 영역 중 어느 하나를 표적으로 한다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2:1251-1303, 1305-1326, 1352-1372, 3762-3795, 4170-4192, 5800-5852, 6124-6149, 6168-6199, 6216-6277, 11979-12007, 12016-12036, 12993- 13042, 13044-13066, 13140-13171 및 13215-13236의 영역 중 어느 하나를 표적으로 한다.
특정 구체예에서, 동물은 인간이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 첫번째 작용제로 지정되고, 본 발명의 방법은 두번째 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 첫번째 작용제 및 두번째 작용제는 공동 투여된다. 특정 구체예에서, 첫번째 작용제 및 두번째 작용제는 순차적으로 또는 동시에 공동 투여된다.
특정 구체예에서, 투여는 비경구 투여를 포함한다.
특정 구체예에서, 화합물은 단일 가닥의 변형된 올리고뉴클레오타이드이다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정 시 서열번호 1-8 및 793-801 중 어느 하나에 적어도 95% 상보적이다. 특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정 시 서열번호 1-8 및 793-801 중 어느 하나에 100% 상보적이다.
특정 구체예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합은 변형된 뉴클레오사이드간 결합이다. 특정 구체예에서, 각각의 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합이다.
특정 구체예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 뉴클레오사이드는 변형된 당을 포함한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 변형된 당은 바이사이클릭 당이다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸, 또는 n이 1 또는 2인 4'-(CH2)n-O-2' 브릿지를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 뉴클레오사이드는 변형된 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신이다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 a) 결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; b) 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 c) 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함한다. 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 변형된 당을 포함한다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 a) 10개의 결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; b) 5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 c) 5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함한다. 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드 중 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성된다.
특정 구체예는 10개의 결합된 데옥시뉴클레오사이드, 5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되는 갭 세그먼트를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 방법을 제공한다. 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드 중 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
특정 구체예는 본원에 기재된 치료 방법 중 임의의 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 임의의 화합물의 용도를 제공한다. 예를 들어, 특정 구체예는 타입 1 근육긴장성 이영양증을 치료하거나, 개선시키거나, 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다. 특정 구체예는 DMPK의 발현을 억제하고, DMPK 관련 질병 및/또는 이의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다. 특정 구체예는 동물에서 DMPK 발현을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다. 특정 구체예는 동물에서 CUGexp DMPK를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다. 특정 구체예는 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다. 특정 구체예는 근육 경직, 근육긴장증, 불능화 원위 약화(disabling distal weakness), 안면 및 턱 근육의 약화, 연하(swallowing)의 어려움, 눈꺼풀의 힘없음(안검하수증), 목 근육의 약화, 팔 및 다리 근육의 약화, 지속적인 근육 동통, 과다수면, 근육 소모, 연하곤란, 호흡기능부전, 불규칙한 심박동, 심장 근육 손상, 무감동, 인슐린 내성 및 백내장을 포함하는 DM1의 발달과 관련된 증상 및 결과를 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다. 특정 구체예는 병원성 전사물의 분해를 유도함으로써 RNA 우세를 중화시키는 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
특정 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 타입 1 근육긴장성 이영양증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 a) 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 및 임의로 b) 본원에 기재된 바와 같은 추가 작용제 또는 요법을 포함한다. 키트는 타입 1 근육긴장성 이영양증을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위한 키트를 사용하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구체예는 본원에 기재된 치료 방법 중 임의의 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 화합물 또는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 특정 구체예는 DMPK의 발현을 억제하고, DMPK 관련 질병 및/또는 이의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 제공한다. 특정 구체예는 동물에서의 DMPK 발현을 감소시키는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 제공한다. 특정 구체예는 동물에서 CUGexp DMPK를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 제공한다. 특정 구체예는 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 제공한다. 특정 구체예는 근육 경직, 근육긴장증, 불능화 원위 약화, 안면 및 턱 근육의 약화, 연하의 어려움, 눈꺼풀의 힘없음(안검하수증), 목 근육의 약화, 팔 및 다리 근육의 약화, 지속적인 근육 동통, 과다수면, 근육 소모, 연하곤란, 호흡기능부전, 불규칙한 심박동, 심장 근육 손상, 무감동, 인슐린 내성, 및 백내장을 포함하는 DM1의 발달과 관련된 증상 및 결과를 치료하거나, 예방하거나, 지연시키거나, 개선시키는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 제공한다. 특정 구체예는 병원성 전사물의 절단을 유도함으로써 RNA 우세를 중화시키는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 제공한다. 특정 구체예는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 다른 화합물이 또한 제공된다.
예를 들어, 특정 구체예는 서열번호 41, 44, 76, 109, 153, 320, 321, 322, 325, 329, 335 및 657의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 10 내지 80, 12 내지 50, 12 내지 30, 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 또는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 15, 73, 77, 79, 83, 85, 130, 602, 648, 655, 674 및 680의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 10 내지 80, 12 내지 50, 12 내지 30, 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 또는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 구체예는 서열번호 1의 핵염기 664-683, 773-792, 926-945, 927-946, 928-947, 931-950, 935-954, 941-960, 2089-2108, 2163-2182, 2490-2509, 2499-2518, 2676-2695, 2685-2704, 2676-2695, 2688-2707, 2697-2716, 2764-2783 및 2770-2789의 동일 길이 부분과 상보적인 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19개 또는 이 초과의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 10 내지 80, 12 내지 50, 12 내지 30, 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 또는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 핵염기 서열은 서열번호 1에 상보적이다.
특정 구체예는 서열번호 2의 핵염기 812-831, 3629-3648, 4447-4466, 4613-4632, 5803-5822, 5804-5823, 5805-5824, 5808-5827, 5818-5837, 6794-6813, 12463-12482, 13152-13171 및 13553-13572의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19개 또는 이 초과의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 10 내지 80, 12 내지 50, 12 내지 30, 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 또는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 핵염기 서열은 서열번호 2에 상보적이다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드이다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호 1-8 및 793-801 중 임의의 것에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적이다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합은 변형된 뉴클레오사이드간 결합이다.
특정 구체예에서, 각각의 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합이다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드는 변형된 당을 포함한다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 변형된 당은 바이사이클릭 당이다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸을 포함한다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드는 변형된 핵염기를 포함한다.
특정 구체예에서, 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신이다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는
결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 변형된 당을 포함한다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는
10개의 결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 14개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성된다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성된다.
특정 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성된다.
안티센스 화합물
올리고머 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드 유사체, 올리고뉴클레오타이드 모방체(mimetics), 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 올리고머 화합물은 표적 핵산에 대해 "안티센스"일 수 있고, 이는 수소 결합을 통해 표적 핵산에 대한 하이브리드화를 경험할 수 있는 것을 의미한다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 5'에서 3' 방향으로 기재하는 경우 표적화되는 표적 핵산의 표적 세그먼트의 역 상보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 상기 특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'에서 3' 방향으로 기재하는 경우 표적화되는 표적 핵산의 표적 세그먼트의 역 상보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 DMPK를 표적으로 하는 안티센스 화합물은 10 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 즉, 안티센스 화합물은 일부 구체예에서 10 내지 30개의 결합된 핵염기이다. 다른 구체예에서, 안티센스 화합물은 8 내지 80, 10 내지 80, 12 내지 30, 12 내지 50, 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 또는 20개의 결합된 핵염기로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 결합된 핵염기 길이, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 규정되는 범위로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 길이 중 임의의 길이의 안티센스 화합물은 본원에 기재된 예시적 안티센스 화합물 중 임의의 안티센스 화합물의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19개의 연속적 핵염기(예를 들어, 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기)를 함유한다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 단축되거나 트렁케이션된 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 단축되거나 트렁케이션된 변형된 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단(5' 트렁케이션), 또는 대안적으로 3' 말단(3' 트렁케이션)으로부터 결실된 단일 뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 단축되거나 트렁케이션된 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 결실된 2개의 뉴클레오사이드를 가질 수 있거나, 대안적으로 3' 말단으로부터 결실된 2개의 서브유닛을 가질 수 있다. 대안적으로, 결실된 뉴클레오사이드는, 예를 들어, 5'으로부터 결실된 하나의 뉴클레오사이드 및 3' 말단으로부터 결실된 하나의 뉴클레오사이드를 갖는 안티센스 화합물 중의 변형된 올리고뉴클레오타이드 전체에 걸쳐 분산될 수 있다.
단일한 첨가 뉴클레오사이드가 연장된 올리고뉴클레오타이드에 존재하는 경우, 첨가 뉴클레오사이드는 올리고뉴클레오타이드의 5' 또는 3' 말단에 위치될 수 있다. 2개 이상의 첨가 뉴클레오사이드가 존재하는 경우, 첨가된 뉴클레오사이드는, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단(5' 첨가), 또는 대안적으로 3' 말단(3' 첨가)에 첨가된 2개의 뉴클레오사이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드 중에서 서로 인접하여 존재할 수 있다. 대안적으로, 첨가된 뉴클레오사이드는, 예를 들어, 5' 말단에 첨가된 하나의 뉴클레오사이드 및 3' 말단에 첨가된 하나의 서브유닛을 갖는 올리고뉴클레오타이드 중에서 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산될 수 있다.
활성을 제거하지 않고 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 같은 안티센스 화합물의 길이를 증가시키거나 감소시키고/시키거나 매스매치 염기를 도입시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 문헌[Woolfet al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)]에서, 13-25개 핵염기 길이의 일련의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 난모세포 주입 모델에서 표적 RNA의 절단을 유도하는 능력에 대해 시험되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 말단 근처에 8 또는 11개의 미스매치 염기를 갖는 25개 핵염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 미스매치를 함유하지 않은 안티센스 올리고뉴클레오타이드보다 정도는 덜하지만 표적 mRNA의 특이적 절단을 유도할 수 있었다. 유사하게, 표적 특이적 절단이 1 또는 3개의 미스매치를 갖는 것을 포함하는 13개의 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 달성되었다.
문헌[Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001)]에서 시험관내 및 생체내에서 bcl-2 및 bcl-xL 둘 모두의 발현을 감소시키는, bcl-2 mRNA에 대해 100% 상보성을 갖고 bcl-xL mRNA에 대해 3개의 미스매치를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 능력이 입증되었다. 또한, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 효능 있는 항-종양 활성을 나타내었다.
문헌[Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988)]에서 토끼 망상적혈구 검정에서 인간 DHFR의 번역을 억제하는 능력에 대해 일련의 탠덤(tandem)의 14개의 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 2 또는 3개의 탠덤 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열로 구성되는 28 및 42개의 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 각각 시험되었다. 3개의 14개의 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 각각은 단독으로 28 또는 42개의 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오타이드보다 약한(modest) 수준에도 불구하고 번역을 억제할 수 있었다.
안티센스 화합물 모티프
특정 구체예에서, DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 억제 활성 향상, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성, 또는 생체내 누클레아제에 의한 분해에 대한 내성과 같은 특성을 안티센스 화합물에 부여하는, 패턴 또는 모티프로 배열된 화학적으로 변형된 서브유닛을 갖는다.
키메라 안티센스 화합물은 통상적으로 누클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성 및/또는 증가된 억제 활성을 부여하기 위해 변형된 적어도 하나의 영역을 함유한다. 키메라 안티센스 화합물의 두번째 영역은 RNA:DNA 듀플렉스(duplex)의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도누클레아제 RNase H에 대한 기질로 임의로 작용할 수 있다.
갭머 모티프를 갖는 안티센스 화합물이 키메라 안티센스 화합물로 간주된다. 갭머에서, RNaseH 절단을 지지하는 다수의 뉴클레오타이드를 갖는 내부 영역은 내부 영역의 뉴클레오사이드와 화학적으로 다른 다수의 뉴클레오타이드를 갖는 외부 영역 사이에 위치된다. 갭머 모티프를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우, 갭 세그먼트는 일반적으로 엔도누클레아제 절단에 대한 기질로 작용하는 한편, 윙 세그먼트는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 갭머의 영역은 각각의 별개의 영역을 포함하는 당 모이어티(moiety)의 유형에 의해 구별된다. 갭머의 영역을 구별하는데 사용되는 당 모이어티의 유형은 일부 구체예에서 β-D-리보뉴클레오사이드, β-D-데옥시리보뉴클레오사이드, 2'-변형된 뉴클레오사이드(이러한 2'-변형된 뉴클레오사이드는 2'-MOE, 특히 2'-O-CH3를 포함할 수 있음), 및 바이사이클릭 당 변형된 뉴클레오사이드(이러한 바이사이클릭 당 변형된 뉴클레오사이드는 4'-(CH2)n-O-2' 브릿지를 갖는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 n=1 또는 n=2임)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 별개의 영역은 균일한 당 모이어티를 포함한다. 윙-갭-윙 모티프는 종종 "X-Y-Z"로 기재되며, 여기서 "X"는 5' 윙 영역의 길이이고, "Y"는 갭 영역의 길이이고, "Z"는 3' 윙 영역의 길이이다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "X-Y-Z"로 기재되는 갭머는, 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트 및 3' 윙 세그먼트 각각에 바로 인접하여 위치되도록 하는 형태를 갖는다. 따라서, 5' 윙 세그먼트와 갭 세그먼트 사이, 또는 갭 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 개재되는 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다. 본원에 기재된 안티센스 화합물 중 임의의 안티센스 화합물은 갭머 모티프를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, X 및 Z는 동일하고, 다른 구체예에서, 이들은 상이하다. 한 바람직한 구체예에서, Y는 8 내지 15개의 뉴클레오타이드이다. X, Y 또는 Z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30개 또는 이 초과의 뉴클레오타이드 중 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 따라서, 갭머는, 예를 들어, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6, 5-8-5, 1-8-1 또는 2-6-2를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, "윙머(wingmer)" 모티프로서의 안티센스 화합물은 윙-갭 또는 갭-윙 형태, 즉, 갭머 형태에 대해 상기 기재된 바와 같은 X-Y 또는 Y-Z 형태를 갖는다. 따라서, 윙머 형태는, 예를 들어, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 또는 5-13을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 5-10-5 갭머 모티프를 갖는다.
특정 구체예에서, DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 갭-확장된 모티프를 갖는다.
특정 구체예에서, 상기 갭머 또는 윙머 모티프 중 임의의 것의 안티센스 화합물은 본원에 기재된 예시적 안티센스 화합물 중 임의의 것의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19개의 연속적 핵염기(예를 들어, 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 8개의 연속적 핵염기)를 함유한다.
표적 핵산, 표적 영역 및 뉴클레오타이드 서열
DMPK를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 비제한적인 예로, 유전자은행 등록번호 NM_001081560.1(서열번호 1로 본원에 포함됨), 뉴클레오타이드 18540696으로부터 18555106까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_011109.15(서열번호 2로 본원에 포함됨, 뉴클레오타이드 16666001로부터 16681000까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_039413.7(서열번호 3으로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 NM_032418.1(서열번호 4로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 AI007148.1(서열번호 5로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 AI304033.1(서열번호 6으로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 BC024150.1(서열번호 7로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 BC056615.1(서열번호 8로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 BC075715.1(서열번호 793으로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 BU519245.1(서열번호 794로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 CB247909.1(서열번호 795로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 CX208906.1(서열번호 796으로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 CX732022.1(서열번호 797로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 S60315.1(서열번호 798로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 S60316.1(서열번호 799로 본원에 포함됨), 유전자은행 등록번호 NM_001081562.1(서열번호 800로 본원에 포함됨) 및 유전자은행 등록번호 NM_001100.3(서열번호 801로 본원에 포함됨)에 나열된 바와 같은 서열을 포함한다. 본원에 포함된 실시예의 각각의 서열번호에 나열된 서열은 당 모이어티, 뉴클레오사이드간 결합, 또는 핵염기에 대한 임의의 변형과 독립적인 것이 이해된다. 이와 같이, 서열번호에 의해 규정되는 안티센스 화합물은 독립적으로 당 모이어티, 뉴클레오사이드간 결합, 또는 핵염기에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 아이시스 번호(Isis Number)(Isis No)에 의해 기재된 안티센스 화합물은 핵염기 서열 및 모티프의 조합을 나타낸다.
특정 구체예에서, 표적 영역은 표적 핵산의 구조적으로 규정된 영역이다. 예를 들어, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손/인트론 접합부, 코딩 영역, 번역 개시 영역, 번역 종료 영역 또는 다른 규정된 핵산 영역을 포함할 수 있다. DMPK에 대해 구조적으로 규정된 영역은 NCBI와 같은 서열 데이터베이스로부터의 등록 번호에 의해 수득될 수 있고, 이러한 정보는 참조로서 본원에 포함된다. 특정 구체예에서, 표적 영역은 표적 영역 내의 하나의 표적 세그먼트의 5' 표적 부위로부터 표적 영역 내의 또 다른 표적 세그먼트의 3' 표적 부위까지의 서열을 포함할 수 있다.
표적화는 안티센스 화합물이 하이브리드화되어 요망되는 효과가 발생하는 적어도 하나의 표적 세그먼트의 결정을 포함한다. 특정 구체예에서, 요망되는 효과는 mRNA 표적 핵산 수준의 감소이다. 특정 구체예에서, 요망되는 효과는 표적 핵산에 의해 엔코딩되는 단백질 수준의 감소 또는 표적 핵산과 관련된 표현형 변화이다.
표적 영역은 하나 이상의 표적 세그먼트를 함유할 수 있다. 표적 영역 내의 다수의 표적 세그먼트는 중첩될 수 있다. 대안적으로, 다수의 표적 세그먼트는 중첩되지 않을 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 영역 내의 표적 세그먼트는 약 300개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 특정 구체예에서, 표적 영역 내의 표적 세그먼트는 표적 핵산 상의 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 값의 임의의 2개의 값에 의해 규정된 범위인 다수의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 특정 구체예에서, 표적 영역 내의 표적 세그먼트는 표적 핵산 상의 5개 이하 또는 약 5개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 특정 구체예에서, 표적 세그먼트는 연속적이다. 본원에 나열된 5' 표적 부위 또는 3' 표적 부위 중 임의의 것인 시작 핵산을 갖는 범위에 의해 규정되는 표적 영역이 고려된다.
적합한 표적 세그먼트는 5' UTR, 코딩 영역, 3' UTR, 인트론, 엑손 또는 엑손/인트론 접합부 내에서 발견될 수 있다. 시작 코돈 또는 정지 코돈을 함유하는 표적 세그먼트가 또한 적합한 표적 세그먼트이다. 적합한 표적 세그먼트는 특별히 특정한 구조적으로 규정된 영역, 예를 들어, 시작 코돈 또는 정지 코돈을 배제할 수 있다.
적합한 표적 세그먼트의 결정은 유전체 전체에 걸친 다른 서열에 대한 표적 핵산의 서열의 비교를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 핵산 사이에서 유사한 영역을 확인하기 위해 BLAST 알고리즘이 사용될 수 있다. 이러한 비교는 선별된 표적 핵산이 아닌 서열(즉, 비-표적 또는 표적외(off-target) 서열)에 비특이적 방식으로 하이브리드화될 수 있는 안티센스 화합물 서열의 선별을 방지할 수 있다.
활성 표적 영역 내의 안티센스 화합물의 활성에서의 변화(예를 들어, 표적 핵산 수준의 감소 퍼센트에 의해 규정됨)가 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, DMPK mRNA 수준에서의 감소는 DMPK 단백질 발현의 억제를 나타낸다. DMPK 단백질 수준의 감소는 또한 표적 mRNA 발현의 억제를 나타낸다. 추가로, 표현형 변화, 예를 들어, 근육긴장증 감소 또는 스플라이스오패시 감소는 DMPK mRNA 및/또는 단백질 발현의 억제로 나타날 수 있다.
하이브리드화
일부 구체예에서, 하이브리드화는 본원에 개시된 안티센스 화합물과 DMPK 핵산 사이에서 발생한다. 하이브리드화의 가장 통상적인 메커니즘은 핵산 분자의 상보적 핵염기 사이의 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역(reversed) 후그스틴 수소 결합)을 포함한다.
하이브리드화는 다양한 조건하에서 발생할 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 하이브리드화되는 핵산 분자의 특성 및 조성에 의해 결정된다.
서열이 표적 핵산에 특이적으로 하이브리드화되는지의 여부를 결정하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다(Sambrooke and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., 2001). 특정 구체예에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 DMPK 핵산과 특별히 하이브리드화 가능하다.
상보성
안티센스 화합물 및 표적 핵산은 안티센스 화합물의 충분한 수의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 수소 반응하여 요망되는 결과(예를 들어, 표적 핵산, 예를 들어, DMPK 핵산의 안티센스 억제)가 발생할 수 있는 경우에 서로 상보적이다.
안티센스 화합물은 개재 또는 인접 세그먼트가 하이브리드화 사건과 관련되지 않도록 하면서(예를 들어, 루프 구조, 미스매치 또는 헤어핀 구조) DMPK 핵산의 하나 이상의 세그먼트 상에 하이브리드화 될 수 있다
특정 구체예에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물 또는 이의 특정된 부분은 DMPK 핵산, 표적 영역, 표적 세그먼트, 또는 이의 특정된 부분에 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 DMPK 핵산, 표적 영역, 표적 세그먼트, 또는 이의 특정된 부분에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이고, 이는 본원에 기재된 예시적 안티센스 화합물 중 임의의 안티센스 화합물의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19개의 연속적 핵염기(예를 들어, 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 핵염기 서열 중 적어도 8개의 연속적 핵염기)를 함유한다. 표적 핵산을 갖는 안티센스 화합물의 상보성 퍼센트는 통상적인 방법을 이용하여 결정될 수 있고, 이는 안티센스 화합물의 전체에 걸쳐 측정된다.
예를 들어, 안티센스 화합물의 20개의 핵염기 중 18개가 표적 영역에 상보적이고, 따라서 특이적으로 하이브리드화되는 안티센스 화합물은 90 퍼센트 상보성을 나타낸다. 이러한 예에서, 나머지 비상보적인 핵염기는 상보적 핵염기에 대해 밀집되거나 산재되어 있을 수 있고, 서로 또는 상보적 핵염기에 대해 연속적일 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전한 상보성의 2 영역의 측면에 존재하는 4개(네개)의 비상보적 핵염기를 갖는 18개의 핵염기 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산과 전체적으로 77.8%의 상보성을 가지며, 따라서 본 발명의 범위에 속한다. 안티센스 화합물과 표적 핵산의 영역의 상보성 퍼센트는 당 분야에 공지된 BLAST 프로그램(기본 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). 상동성, 서열 동일성 또는 상보성 퍼센트는, 예를 들어, 스미스 및 워터맨(Smith and Waterman)의 알고리즘(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489)을 이용하는 디폴트 설정을 이용하는 Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물 또는 이의 특정된 부분은 표적 핵산 또는 이의 특정된 부분에 완전히 상보적(즉, 100% 상보적)이다. 예를 들어, 안티센스 화합물은 DMPK 핵산, 또는 표적 영역, 또는 표적 세그먼트 또는 이의 표적 서열에 완전히 상보적일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "완전히 상보적"은 안티센스 화합물의 각각의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 정확한 염기쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 20개의 핵염기 안티센스 화합물은, 안티센스 화합물과 완전히 상보적인 표적 핵산의 상응하는 20개의 핵염기 부분이 존재하는 한 400개의 핵염기 길이인 표적 서열에 완전히 상보적이다. 완전한 상보성은 또한 첫번째 및/또는 두번째 핵산의 특정된 부분과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 30개의 핵염기 안티센스 화합물의 20개의 핵염기 부분은 400개의 핵염기 길이인 표적 서열에 대해 "완전히 상보적"일 수 있다. 30개의 핵염기 올리고뉴클레오타이드 중 20개의 핵염기 부분은, 표적 서열이 각각의 핵염기가 안티센스 화합물의 20개의 핵염기 부분에 상보적인 상응하는 20개의 핵염기 부분을 갖는 경우에, 표적 서열에 완전히 상보적이다. 동시에, 전체 30개의 핵염기 안티센스 화합물은, 안티센스 화합물의 나머지 10개의 핵염기가 또한 표적 서열에 상보적인지의 여부에 따라 표적 서열에 완전히 상보적일 수 있다.
비-상보적 핵염기의 위치는 안티센스 화합물의 5' 말단 또는 3' 말단에 존재할 수 있다. 대안적으로, 비-상보적 핵염기 또는 핵염기들은 안티센스 화합물의 내부 위치에 존재할 수 있다. 2개 이상의 비-상보적 핵염기가 존재하는 경우, 이들은 연속적(즉, 연결된 상태)이거나 비-연속적으로 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 비-상보적 핵염기는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 윙 세그먼트에 위치된다.
특정 구체예에서, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 핵염기 길이이거나, 그 이하의 핵염기 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예를 들어, DMPK 핵산, 또는 이의 특정된 부분에 비해 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 비-상보적 핵염기(들)를 포함한다.
특정 구체예에서, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 핵염기 길이이거나, 그 이하의 핵염기 길이인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예를 들어, DMPK 핵산, 또는 이의 특정된 부분에 비해 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 비-상보적 핵염기(들)를 포함한다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은 또한 표적 핵산의 부분에 상보적인 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "부분"은 표적 핵산의 영역 또는 세그먼트 내의 연속적(즉, 연결된) 핵염기의 규정된 수를 의미한다. "부분"은 또한 안티센스 화합물의 연속적 핵염기의 규정된 수를 의미한다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 적어도 8개의 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 적어도 10개의 핵염기 부분에 상보적이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 적어도 15개의 핵염기 부분에 상보적이다. 표적 세그먼트의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20개 또는 이 초과의 핵염기 부분, 또는 상기 값의 임의의 2개의 값에 의해 규정된 범위에 상보적인 안티센스 화합물이 또한 고려된다.
동일성
본원에 제공된 안티센스 화합물은 또한 특정 뉴클레오타이드 서열, 서열번호, 또는 특정 Isis 번호에 의해 표시되는 화합물, 또는 이의 부분에 대한 규정된 동일성 퍼센트를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 안티센스 화합물은 이러한 안티센스 화합물이 동일한 핵염기쌍 형성 능력을 갖는 경우 본원에 개시된 서열과 동일하다. 예를 들어, 개시된 DNA 서열 내에 티미딘 대신 유라실을 함유하는 RNA는 유라실 및 티미딘이 아데닌과 쌍을 형성하므로 DNA 서열과 동일한 것으로 간주된다. 본원에 기재된 안티센스 화합물의 단축된 형태 및 연장된 형태 뿐만 아니라 본원에 제공된 안티센스 화합물과 비교하여 동일하지 않은 염기를 갖는 화합물이 또한 고려된다. 동일하지 않은 염기는 서로 인접하여 존재할 수 있거나, 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산되어 있을 수 있다. 안티센스 화합물의 동일성 퍼센트는 비교되는 서열에 비해 동일한 염기쌍 형성을 갖는 염기의 수에 따라 계산된다.
특정 구체예에서, 안티센스 화합물 또는 이의 부분은 본원에 개시된 예시적 안티센스 화합물 또는 서열번호, 또는 이의 부분 중 하나 이상과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
변형
뉴클레오사이드는 염기-당 조합물이다. 뉴클레오사이드의 핵염기(염기로도 공지됨) 부분은 보통 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유적으로 결합된 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오사이드에 대해, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 결합될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 서로 인접한 뉴클레오사이드의 공유 결합을 통해 형성되어, 선형의 중합 올리고뉴클레오타이드가 형성된다. 올리고뉴클레오타이드 구조 내에서, 포스페이트 기는 보통 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드간 결합을 형성하는 것으로 언급된다.
안티센스 화합물에 대한 변형은 뉴클레오사이드간 결합, 당 모이어티 또는 핵염기에 대한 치환 또는 변화를 포함한다. 요망되는 특성, 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 향상된 친화성, 누클레아제의 존재하에서의 증가된 안정성, 또는 증가된 억제 활성으로 인해 변형된 안티센스 화합물이 종종 자연 형태보다 선호된다.
화학적으로 변형된 뉴클레오사이드는 또한 표적 핵산에 대한 단축되거나 트렁케이션된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합 친화성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 결과로서, 상기 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드를 갖는 보다 짧은 안티센스 화합물을 이용하여 동등한 결과가 종종 수득될 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 간 결합
RNA 및 DNA의 자연 발생 뉴클레오사이드간 결합은 3'으로부터 5'으로의 포스포다이에스터 결합이다. 요망되는 특성, 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 향상된 친화성, 및 누클레아제의 존재하에서의 증가된 안정성으로 인해 하나 이상의 변형된, 즉, 비-자연 발생의 뉴클레오사이드간 결합을 갖는 안티센스 화합물이 종종 자연 발생 뉴클레오사이드간 결합을 갖는 안티센스 화합물보다 더 선별된다.
변형된 뉴클레오사이드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 인 원자를 보유하는 뉴클레오사이드간 결합뿐만 아니라 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오사이드간 결합을 포함한다. 대표적인 인 함유 뉴클레오사이드간 결합은 포스포다이에스터, 포스포트라이에스터, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인-함유 결합 및 인을 함유하지 않는 결합의 제조 방법은 널리 공지되어 있다.
특정 구체예에서, DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드간 결합을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 특정 구체예에서, 안티센스 화합물의 각각의 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합이다.
변형된 당 모이어티
본 발명의 안티센스 화합물은 임의로 당 기가 변형된 하나 이상의 뉴클레오사이드를 함유할 수 있다. 이러한 당 변형된 뉴클레오사이드는 향상된 누클레아제 안정성, 증가된 결합 친화성, 또는 안티센스 화합물에 있어서 일부 다른 유리한 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 뉴클레오사이드는 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리의 예는, 비제한적인 예로, 치환된 기(5' 및 2' 치환기를 포함함)의 첨가, 바이사이클릭 핵산(BNA)을 형성하는 비-이중(non-geminal) 고리 원자의 브릿징(bridging), 리보실 고리 산소 원자의 S, N(R) 또는 C(R1)(R2)(R, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 보호기임)로의 치환, 및 이의 조합을 포함한다. 화학적으로 변형된 당의 예는 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오사이드(다른 개시된 5',2'-비스 치환된 뉴클레오사이드에 대해서는 2008년 8월 21일에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2008/101157호 참조) 또는 2'-위치에서의 추가 치환과 함께 리보실 고리 산소 원자의 S로의 치환(2005년 6월 16일에 공개된 미국 특허 출원 US2005-0130923호 참조) 또는 대안적으로 BNA의 5'-치환(2007년 11월 22일에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2007/134181호 참조, 여기서 LNA는, 예를 들어, 5'-메틸 또는 5'-비닐기로 치환됨)을 포함한다.
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오사이드의 예는, 비제한적인 예로, 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 뉴클레오사이드를 포함한다. 2' 위치에서의 치환은 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) 및 O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각각의 R1, Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬이다.
바이사이클릭 핵산(BNA)의 예는, 비제한적인 예로, 4'와 2' 리보실 고리 원자 사이에 브릿지를 포함하는 뉴클레오사이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 브릿지가 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(및 이의 유사체, 2008년 7월 15일에 발행된 미국 특허 제7,399,845호 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(및 이의 유사체, 2009년 1월 8일에 WO/2009/006478호로 공개된 PCT/US2008/068922호 참조); 4'-CH2-N(OCH3)-2'(및 이의 유사체, 2008년 12월 11일에 WO/2008/150729호로 공개된 PCT/US2008/064591호 참조); 4'-CH2-O-N(CH3)-2'(2004년 9월 2일에 공개된 공개 미국 특허 출원 US2004-0171570호 참조); R이 H, C1-C12 알킬 또는 보호기인 4'-CH2-N(R)-O-2'(2008년 9월 23일에 발행된 미국 특허 제7,427,672호 참조); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(Chattopadhyaya et al ., J. Org . Chem ., 2009, 74, 118-134 참조); 및 4'-CH2-C(=CH2)-2'(및 이의 유사체, 2008년 12월 8일에 WO 2008/154401호로 공개된 PCT/US2008/066154호 참조)의 식 중 하나를 포함하는 하나 이상의 BNA 뉴클레오사이드를 포함한다.
추가 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 공개된 문헌에 보고되어 있다(예를 들어, Srivastava et al., J. Am . Chem . Soc, 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden et al ., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr . Opinion Invens . Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al ., Chem . Biol, 2001, 8, 1-7; Orum et al ., Curr . Opinion Mol . Ther ., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem . Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg . Med . Chem . Lett ., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem ., 1998, 63, 10035-10039; 미국 특허 제7,399,845호; 제7,053,207호; 제7,034,133호; 제6,794,499호; 제6,770,748호; 제6,670,461호; 제6,525,191호; 제6,268,490호; 미국 특허 공개 번호: US2008-0039618호; US2007-0287831호; US2004-0171570호; 미국 특허 출원 제12/129,154호; 제61/099,844호; 제61/097,787호; 제61/086,231호; 제61/056,564호; 제61/026,998호; 제61/026,995호; 제60/989,574호; 국제 출원 WO 2007/134181호; WO 2005/021570호; WO 2004/106356호; WO 94/14226호; 및 PCT 국제 출원 번호: PCT/US2008/068922호; PCT/US2008/066154호; 및 PCT/US2008/064591호 참조). 상기 바이사이클릭 뉴클레오사이드 각각은, 예를 들어, α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학 당 형태를 갖도록 제조될 수 있다(WO 99/14226호로 1999년 3월 25일에 공개된 PCT 국제 출원 PCT/DK98/00393호 참조).
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- 및 -N(Ra)-로부터 독립적으로 선택된 1 또는 1 내지 4개의 결합된 기를 포함하는 브릿지를 비제한적인 예로 포함하는 펜토푸라노실 당 모이어티의 4'와 2' 탄소 원자 사이의 브릿지를 포함하며, 상기 식에서, x는 0, 1 또는 2이고, n은 1, 2, 3 또는 4이고; 각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 알리사이클릭 라디칼, 치환된 C5-C7 알리사이클릭 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐(S(=O)2-J1) 또는 설폭실(S(=O)-J1)이고, 각각의 J1 및 J2는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
특정 구체예에서, 바이사이클릭 당 모이어티의 브릿지는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- 또는 -C(RaRb)-O-N(R)-이다. 특정 구체예에서, 브릿지는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' 및 4'-CH2-N(R)-O-2-이고, 상기 식에서 각각의 R은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 이성질체 형태에 의해 추가로 규정된다. 예를 들어, 4'-(CH2)-O-2' 브릿지를 포함하는 뉴클레오사이드는 α-L 형태 또는 β-D 형태로 존재할 수 있다. 이전에, α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA가 안티센스 활성을 나타낸 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 통합되었었다(Frieden et al ., Nucleic Acids Research , 2003, 21, 6365-6372).
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 4'으로부터 2'으로의 브릿지를 갖는 것을 포함하며, 여기서 상기 브릿지는, 비제한적인 예로, α-L-4'-(CH2)-O-2', β-D-4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH2-S-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH2-CH(CH3)-2' 및 4'-(CH2)3-2'을 포함하며, 여기서 R은 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00001
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
-Qa-Qb-Qc-는 -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- 또는 -N(Rc)-O-CH2이고;
Rc는 C1-C12 알킬 또는 아미노 보호기이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매질에 대한 공유적 부착이다.
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00002
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매질에 대한 공유적 부착이고;
Za는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티올이다.
일 구체예에서, 치환된 기 각각은 독립적으로 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc 및 NJeC(=X)NJcJd로부터 선택된 치환기로 치환된 모노 또는 폴리이고, 여기서 각각의 Jc, Jd 및 Je는 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고, X는 O 또는 NJc이다.
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00003
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매질에 대한 공유적 부착이고;
Zb는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 치환된 아실 (C(=O)-)이다.
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00004
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매질에 대한 공유적 부착이고;
Rd는 C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
각각의 qa, qb, qc 및 qd는 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕실, 치환된 C1-C6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-C6 아미노알킬 또는 치환된 C1-C6 아미노알킬이다.
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00005
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매질에 대한 공유적 부착이고;
qa, qb, qe 및 qf는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이거나;
qe 및 qf는 함께 =C(qg)(qh)이고;
qg 및 qh는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
올리고머화, 및 핵산 인지 특성과 함께 4'-CH2-O-2' 브릿지를 갖는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 5-메틸-사이토신, 티민 및 유라실 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 합성 및 제조가 기재되어 있다(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 합성이 또한 WO 98/39352호 및 WO 99/14226호에 기재되어 있다.
4'-CH2-O-2' 및 4'-CH2-S-2'와 같은 4'으로부터 2'으로의 브릿지 형성 기를 갖는 다양한 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 유사체가 또한 제조되었다(Kumar et al ., Bioorg. Med . Chem . Lett, 1998, 8, 2219-2222). 핵산 중합효소에 대한 기질로 사용하기 위한 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 듀플렉스의 제조가 또한 기재되었다(Wengel et al., WO 99/14226). 더욱이, 신규한 형태적으로 제한된 고-친화성의 올리고뉴클레오타이드 유사체인 2'-아미노-BNA의 합성이 또한 당 분야에서 기재되었다(Singh et al., J Org . Chem ., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-BNA가 제조되었고, 상보적 RNA 및 DNA 가닥과의 듀플렉스의 열 안정성이 이전에 보고되었다.
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00006
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지체 매질에 대한 공유적 부착이고;
각각의 qi, qj, qk 및 ql은 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕실, 치환된 C1-C12 알콕실, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이고;
qi 및 qj 또는 ql 및 qk는 함께 =C(qg)(qh)이고, 여기서 qg 및 qh는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
4'-(CH2)3-2' 브릿지 및 알케닐 유사체 브릿지 4'-CH=CH-CH2-2'를 갖는 하나의 카보사이클릭 바이사이클릭 뉴클레오사이드가 기재되었다(Frier et al ., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 및 Albaek et al ., J. Org . Chem ., 2006, 71, 7731-7740). 올리고머화 및 생화학적 연구와 함께 카보사이클릭 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 합성 및 제조가 또한 기재되었다(Srivastava et al ., J. Am . Chem . Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
특정 구체예에서, 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 하기 도시되는 바와 같은 (A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (B) β-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA (구속 에틸(constrained ethyl) 또는 cEt로도 언급됨), (G) 메틸렌-티오 (4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노 (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 카보사이클릭 (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) 프로필렌 카보사이클릭 (4'-(CH2)3-2') BNA 및 (K) 비닐 BNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
Figure pct00007
상기 식에서, Bx는 염기 모이어티이고, R은 독립적으로 H, 보호기, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕시이다.
특정 구체예에서, 뉴클레오사이드는 리보실 고리의 당 대용물(surrogate)로의 치환에 의해 변형된다. 이러한 변형은 리보실 고리의 대용물 고리 시스템(때때로 DNA 유사체로 언급됨), 예를 들어, 모르폴리노 고리, 사이클로헥세닐 고리, 사이클로헥실 고리 또는 테트라하이드로피라닐 고리, 예를 들어, 하기 화학식 중 하나를 갖는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00008
특정 구체예에서, 하기 화학식을 갖는 당 대용물이 선택된다:
Figure pct00009
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 올리고머 화합물에 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 연결시키는 뉴클레오사이드간 결합기이거나, T3 및 T4 중 하나는 올리고머 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드에 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 연결시키는 뉴클레오사이드간 결합기이고, T3 및 T4 중 나머지는 H, 하이드록실 보호기, 결합된 컨쥬게이트 기 또는 5' 또는 3'-말단 기이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R1 및 R2 중 하나는 수소이고, 나머지는 할로겐, 치환되거나 비치환된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 선택되고, 여기서 X는 O, S 또는 NJ1이고, 각각의 J1, J2 및 J3는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
특정 구체예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 H이다. 특정 구체예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 H가 아니다. 특정 구체예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 메틸이다. 특정 구체예에서, THP 뉴클레오사이드가 제공되고, 여기서 R1 및 R2 중 하나는 F이다. 특정 구체예에서, R1은 플루오로이고, R2는 H이고; R1은 메톡시이고, R2는 H이고, R1은 메톡시에톡시이고, R2는 H이다.
이러한 당 대용물은 헥시톨 핵산(HNA), 알트리톨 핵산(ANA) 및 만니톨 핵산(MNA)으로 당 분야에서 언급되는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(Leumann, C. J., Bioorg . & Med . Chem ., 2002, 10, 841-854 참조).
특정 구체예에서, 안티센스 화합물은 자연 발생 뉴클레오사이드 중 펜토푸라노실 잔기 대신에 6-원 사이클로헥세닐을 갖는 뉴클레오사이드인 하나 이상의 변형된 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드를 포함한다. 변형된 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드는 당 분야에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, 통상적으로 소유된 2010년 4월 10일에 공개된 PCT 출원 WO 2010/036696호, Robeyns et al ., J. Am. Chem . Soc, 2008, 130(6), 1979-1984; Horvath et al ., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al ., J. Am . Chem . Soc, 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al ., Nucleosides , Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al ., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al ., J. Org . Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al ., J. Org . Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al ., Nucleosides , Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al ., J. Am . Chem ., 2000, 122, 8595-8602; 공개된 PCT 출원, WO 06/047842호; 및 공개된 PCT 출원 WO 01/049687호를 참조하라; 상기 문헌 각각은 전체내용이 본원에 참조로서 포함됨). 특정한 변형된 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00010
상기 식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 안티센스 화합물에 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드 유사체를 연결시키는 뉴클레오사이드간 결합기이거나, T3 및 T4 중 하나는 안티센스 화합물에 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 연결시키는 뉴클레오사이드간 결합기이고, T3 및 T4 중 나머지는 H, 하이드록실 보호기, 결합된 컨쥬게이트 기 또는 5' 또는 3'-말단 기이고; q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8 및 q9 각각은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 다른 당 치환기이다.
안티센스 화합물로의 통합을 위해 뉴클레오사이드를 변형시키는데 사용될 수 있는 많은 다른 바이사이클릭 및 트라이사이클릭 당 대용물 고리 시스템이 또한 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 종설: Leumann, Christian J., Bioorg . & Med . Chem., 2002, 10, 841-854 참조). 이러한 고리 시스템은 활성을 향상시키기 위해 다양한 추가 치환을 겪을 수 있다.
변형된 당의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 변형된 당의 제조를 교시하는 일부 대표적 미국 특허는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,670,633호; 제5,700,920호; 제5,792,847호 및 제6,600,032호, 및 2005년 6월 2일에 출원되고, 2005년 12월 22일에 WO 2005/121371호로 공개된 국제 출원 PCT/US2005/019219호를 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 상기 특허 각각은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드에서, 핵염기 모이어티(자연, 변형 또는 이의 조합물)가 적절한 핵산 표적과의 하이브리드화를 위해 유지된다.
특정 구체예에서, DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 변형된 당 모이어티를 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 당 모이어티는 2'-MOE이다. 특정 구체예에서, 2'-MOE 변형된 뉴클레오타이드는 갭머 모티프 내에 배열된다.
변형된 핵염기
핵염기(또는 염기) 변형 또는 치환은 자연 발생 또는 합성의 변형되지 않은 핵염기와 구조적으로 구별가능하나, 기능적으로는 상호 교환된다. 자연 및 변형된 핵염기 둘 모두는 수소 결합에 관여할 수 있다. 이러한 핵염기 변형은 안티센스 화합물에 누클레아제 안정성, 결합 친화성 또는 일부 다른 유리한 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 변형된 핵염기는 합성 및 자연 핵염기, 예를 들어, 5-메틸사이토신(5-me-C)을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환을 포함하는 특정 핵염기 치환이 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 예를 들어, 5-메틸사이토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6-1.2℃까지 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
추가의 변형되지 않은 핵염기는 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오유라실, 2-티오타이민 및 2-티오사이토신, 5-할로유라실 및 사이토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 유라실 및 사이토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 유라실, 사이토신 및 타이민, 5-유라실(슈도유라실), 4-티오유라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 유라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
헤테로사이클릭 염기 모이어티는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 안티센스 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용한 핵염기는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어, 2 아미노프로필아데닌, 5-프로피닐유라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함한다.
특정 구체예에서, DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, DMPK 핵산을 표적으로 하는 갭-확장된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신이다. 특정 구체예에서, 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
약학적 조성물을 제형화시키기 위한 조성물 및 방법
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약학적 조성물 또는 제형의 제조를 위해 약학적으로 허용되는 활성 또는 비활성 물질과 혼합될 수 있다. 약학적 조성물의 제형화를 위한 조성 및 방법은 투여 경로, 질병의 정도 또는 투여되는 용량을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 기준에 좌우된다.
DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물이 안티센스 화합물과 적합한 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 조합시킴으로써 약학적 조성물에서 이용될 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제는 포스페이트-완충 염수(PBS)를 포함한다. PBS는 비경구로 전달되는 조성물에서 사용하기에 적합한 희석제이다. 따라서, 일 구체예에서, 본원에 기재된 방법에서 DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 사용된다. 특정 구체예에서, 약학적으로 허용되는 희석제는 PBS이다. 특정 구체예에서, 인티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 인간을 포함하는 동물에게 투여시 생물학적으로 활성인 대사물 또는 이의 잔여물을 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 약학적으로 허용되는 염, 에스터 또는 상기 에스터의 염, 또는 임의의 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 개시는 또한 안티센스 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 프로드러그, 상기 프로드러그의 약학적으로 허용되는 염, 및 다른 생물학적 동등물(bioequivalent)에 관한 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 염은 소듐 및 포타슘 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
프로드러그는 체내에서 내인성 누클레아제에 의해 절단되어 활성 안티센스 화합물을 형성시키는 안티센스 화합물의 한 말단 또는 양 말단에 추가 뉴클레오사이드의 통합을 포함할 수 있다.
컨쥬게이션된 안티센스 화합물
안티센스 화합물은 발생되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 컨쥬게이트에 공유적으로 결합될 수 있다. 통상적인 컨쥬게이트 기는 콜레스테롤 모이어티 및 지질 모이어티를 포함한다. 추가 컨쥬게이트 기는 탄수화물, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료를 포함한다.
안티센스 화합물은 또한, 예를 들어, 누클레아제 안정성과 같은 특성을 향상시키기 위해 안티센스 화합물의 한 말단 또는 양 말단에 일반적으로 부착되는 하나 이상의 안정화 기를 갖도록 변형될 수 있다. 캡 구조가 안정화 기에 포함된다. 이러한 말단 변형은 말단 핵산을 갖는 안티센스 화합물을 엑소누클레아제 분해로부터 보호하고, 이는 또한 세포 내에서의 전달 및/또는 국소화를 도울 수 있다. 캡은 5'-말단(5'-캡) 또는 3'-말단(3'-캡)에 존재할 수 있거나, 양 말단에 존재할 수 있다. 캡 구조는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, 역위된 데옥시 어베이직(abasic) 캡을 포함한다. 추가로, 누클레아제 안정성을 제공하기 위해 안티센스 화합물의 한 말단 또는 양 말단을 캡핑시키는데 사용될 수 있는 3' 및 5'-안정화 기는 2003년 1월 16일에 공개된 WO 03/004602호에 개시된 것을 포함한다.
세포 배양 및 안티센스 화합물 처리
DMPK 핵산의 수준, 활성 또는 발현에 대한 안티센스 화합물의 효과는 다양한 세포 유형에서 시험관내 시험될 수 있다. 상기 분석에 사용되는 세포 유형은 시판 업체(예를 들어, American Type Culture Collection, 버지니아주의 머내서스시에 소재; Zen-Bio, Inc., 노스캐롤라이나주의 리서치 트라이앵글 파크에 소재; Clonetics Corporation, 매릴랜드주의 워커스빌시에 소재)로부터 이용가능하고, 세포는 상업적으로 이용가능한 시약(예를 들어, Invitrogen Life Technologies, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 이용하여 업체의 설명서에 따라 배양된다. 예시적 세포 유형은 HepG2 세포, Hep3B 세포, 일차 간세포, A549 세포, GM04281 섬유모세포 및 LLC-MK2 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 시험관내 시험
다른 안티센스 화합물을 이용한 치료를 위해 적절히 변형될 수 있는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 세포의 처리를 위한 방법이 본원에 기재된다.
일반적으로, 세포가 배양 중에 약 60 내지 80% 컨플루언스(confluence)에 도달하는 경우에 세포는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된다.
배양된 세포로 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 도입시키는데 통상적으로 사용되는 한 시약은 양이온성 지질 트랜스펙션 시약 LIPOFECTIN(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 100nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 당 통상적으로 2 내지 12 ug/mL 범위인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 요망되는 최종 농도 및 LIPOFECTIN(등록상표) 농도를 달성하기 위해 OPTI-MEM(등록상표) 1 중 LIPOFECTIN(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)과 혼합된다.
배양된 세포로 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 도입시키기 위해 사용되는 또 다른 시약은 LIPOFECTAMINE 2000(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 OPTI-MEM(등록상표) 1 감소 혈청 배지 중 LIPOFECTAMINE 2000(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)과 혼합되어 100nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 당 통상적으로 2 내지 12 ug/mL 범위의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 요망되는 농도 및 LIPOFECTAMINE(등록상표) 농도가 달성된다.
배양된 세포로 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 도입시키는데 사용되는 또 다른 시약은 Cytofectin(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 OPTI-MEM(등록상표) 1 감소 혈청 배지 중 Cytofectin(등록상표)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)과 혼합되어 100nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 당 통상적으로 2 내지 12 ug/mL 범위의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 요망되는 농도 및 Cytofectin(등록상표) 농도가 달성된다.
배양된 세포로 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 도입시키는데 사용되는 또 다른 기술은 전기천공을 포함한다.
세포는 통상적인 방법에 의해 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된다. 세포는 통상적으로 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 16-24시간 후에 수거되고, 이때 표적 핵산의 RNA 또는 단백질 수준이 당 분야에 공지되고 본원에 기재된 방법에 의해 측정된다. 일반적으로, 처리가 다수의 반복으로 수행되는 경우, 데이터는 반복 처리의 평균으로 제시된다.
사용된 안틴센스 올리고뉴클레오타이드의 농도는 세포주마다 다양하였다. 특정 세포주에 대한 최적의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 결정하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 LIPOFECTAMINE2000(등록상표), Lipofectin 또는 Cytofectin으로 트랜스펙션되는 경우 1nM 내지 300nM 범위의 농도로 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전기천공을 이용하여 트랜스펙션되는 경우 625 내지 20,000nM 범위의 높은 농도로 사용된다.
RNA 분리
RNA 분석은 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에서 수행될 수 있다. RNA 분리의 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. RNA는 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어, 제조업체의 권장된 프로토콜에 따라 TRIZOL(등록상표) 시약(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 이용하여 제조된다.
표적 수준 또는 발현의 억제의 분석
DMPK 핵산의 수준 또는 발현의 억제는 당 분야에 공지된 다양한 방식으로 검정될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 수준은, 예를 들어, 노던 블롯(Northern blot) 분석, 경쟁 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 정량 실시간 PCR에 의해 정량될 수 있다. RNA 분석은 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에서 수행될 수 있다. RNA 분리의 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 노던 블롯 분석은 또한 당 분야에서 통상적이다. 정량 실시간 PCR은 PE-어플라이드 바이오시스템즈(PE-Applied Biosystems, 캘리포니아주의 포스터 시티에 소재)에서 이용가능한 시판되고, 제조업체의 설명서에 따라 사용되는 ABI PRISM(등록상표) 7600, 7700 또는 7900 서열 검출 시스템을 이용하여 편리하게 달성될 수 있다.
표적 RNA 수준의 정량 실시간 PCR 분석
표적 RNA 수준의 정량은 제조업체의 설명서에 따라 ABI PRISM(등록상표) 7600, 7700 또는 7900 서열 검출 시스템(PE-Applied Biosystems, 캘리포니아주의 포스터 시티에 소재)을 이용하여 정량 실시간 PCR에 의해 달성될 수 있다. 정량 실시간 PCR의 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
실시간 PCR 전에, 분리된 RNA는 실시간 PCR 증폭을 위한 기질로 이후에 사용되는 상보적 DNA(cDNA)를 생성시키는 역전사효소(RT) 반응에 적용된다. RT 및 실시간 PCR 반응은 동일 샘플 웰에서 연속적으로 수행된다. RT 및 실시간 PCR 시약은 Invitrogen(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 수득된다. RT, 실시간 PCR 반응은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 수행된다.
실시간 PCR에 의해 수득되는 유전자(또는 RNA) 표적 양은 발현이 일정한 유전자, 예를 들어, 사이클로필린 A(cyclophilin A)의 발현 수준을 이용하거나, RIBOGREEN(등록상표)(Invitrogen, Inc. 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 이용하여 전체 RNA를 정량함으로써 표준화된다. 사이클로필린 A 발현은 실시간 PCR에 의해 정량되고, 이는 표적과 동시에, 또는 다중으로, 또는 독립적으로 수행된다. 전체 RNA는 RIBOGREEN(등록상표) RNA 정량 시약(Invitrogen, Inc. 오리건주의 유진시에 소재)을 이용하여 정량된다. RIBOGREEN(등록상표)에 의한 RNA 정량의 방법은 문헌[Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)]에 교시되어 있다. CYTOFLUOR(등록상표) 4000 기계(PE Applied Biosystems)는 RIBOGREEN(등록상표) 형광을 측정하는데 사용된다.
프로브 및 프라이머는 DMPK 핵산에 하이브리드화되도록 설계된다. 실시간 PCR 프로브 및 프라이머를 설계하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 PRIMER EXPRESS(등록상표) 소프트웨어(Applied Biosystems, 캘리포니아주의 포스터 시티에 소재)와 같은 소프트웨어의 사용을 포함할 수 있다.
단백질 수준의 분석
DMPK 핵산의 안티센스 억제는 DMPK 단백질 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. DMPK의 단백질 수준은 당 분야에 널리 공지된 다양한 방식, 예를 들어, 면역침전, 웨스턴 블롯(Western blot) 분석(면역블로팅), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 정량적 단백질 검정, 단백질 활성 검정(예를 들어, 카스파제 활성 검정), 면역조직화학, 면역세포화학 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 평가되거나 정량될 수 있다. 표적에 특이적인 항체는 항체의 MSRS 카탈로그(Aerie Corporation, 미시건주의 버밍엄시에 소재)와 같은 다양한 소스로부터 확인되고 수득될 수 있거나, 이는 당 분야에 널리 공지된 통상적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 생성 방법을 통해 제조될 수 있다.
안티센스 화합물의 생체내 시험
안티센스 화합물, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DMPK의 발현을 억제하고, 표현형 변화를 생성시키는 능력을 평가하기 위해 동물에서 시험된다. 시험은 정상 동물, 또는 실험 질병 모델, 예를 들어, 근육긴장성 이영양증(DM1)의 HSALR 마우스 모델에서 수행될 수 있다.
HSALR 마우스 모델은 DM1에 대해 확립된 모델이다(Mankodi, A. et al. Science. 289: 1769, 2000). 마우스는 유전자의 3' UTR에 삽입된 220개의 CTG 반복부를 갖는 인간 골격 액틴(hACTA1) 트랜스진을 갖는다. hACTA1-CUGexp 전사물은 골격근 내의 핵 초점(nuclear foci)으로 축적되고, 이는 인간 DM1의 근육긴장증과 유사한 근육긴장증을 발생시킨다(Mankodi, A. et al. Mol. Cell 10: 35, 2002; Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006). 그러므로, hACTA1 트랜스진의 안티센스 억제에 의한 HSALR 마우스에서의 DM1 증상의 개선은 DMPK 전사물의 안티센스 억제에 의한 인간 환자에서의 유사한 증상의 개선을 예측하는 것이 예상된다.
마우스에서의 CUGexp RNA의 발현은 근육 전사체의 광범위한 리모델링을 야기시키고, 이 중 많은 것은 MBNL1의 제거에 의해 재생된다. 그러므로, HSALR 마우스에서의 전사체의 정상화는 DMPK 전사물의 안티센스 억제에 의한 DM1 환자에서의 인간 전사체의 정상화를 예측하는 것이 예상된다.
동물로의 투여를 위해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약학적으로 허용되는 희석제, 예를 들어, 포스페이트-완충 염수 중에서 제형화된다. 투여는 비경구 투여 경로를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 일정 기간의 처리 후, RNA가 조직으로부터 분리되고, DMPK 핵산 발현에서의 변화가 측정된다. DMPK 단백질 수준에서의 변화가 또한 측정된다.
스플라이싱
근육긴장성 이영양증(DM1)은 DMPK 유전자의 3' 비번역되는 영역 내의 CTG 반복부 확장에 의해 야기된다(Brook, J.D. et al. Cell. 68: 799, 1992). 이러한 돌연변이는 확장된 CUG 반복부(CUGexp)를 함유하는 RNA의 발현이 세포 기능이상을 유도하는 과정인 RNA 우세를 발생시킨다(Osborne RJ and Thornton CA., Human Molecular Genetics ., 2006, 15(2): R162-R169). 이러한 CUGexp는 골격근의 핵 초점으로 유지된다(Davis, B.M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:7388, 1997). 핵 초첨 내의 CUGexp의 축적은 폴리(CUG)-결합 단백질, 예를 들어, Muscleblind-유사 1(MBLN1)의 격리를 발생시킨다(Miller, J. W. et al. EMBO J. 19: 4439, 2000). MBLN1은 스플라이싱 인자이고, 이는 Serca1, CIC-1, Titin 및 Zasp와 같은 유전자의 스플라이싱을 조절한다. 따라서, CUGexp에 의한 MBLN1의 격리는 MBLN1이 보통 조절하는 유전자의 엑손의 오조절된 대안적 스플라이싱을 촉발시킨다(Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006). DM1 환자 및 HSALR 마우스 모델에서와 같은 상기 이상조절을 나타내는 동물에서의 대안적 스플라이싱의 교정은 안티센스 올리고구클레오티드를 이용한 처리를 포함하는 처리의 효능에 대한 유용한 지표이다.
특정 바이오마커
마우스 모델에서의 DM1 중증도는 핵 또는 핵 초점의 CUGexp 전사물 축적의 수준에 의해 적어도 부분적으로 결정된다. DM1 중증도에 대한 유용한 생리학적 마커는 불수의 활동 전위의 고-빈도 수행의 발달(근육긴장증)이다.
특정 지표
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 개체는 타입 1 근육긴장성 이영양증(DM1)을 갖는다.
따라서, 타입 1 근육긴장성 이영양증과 관련된 증상을 개선시킬 필요가 있는 피검체의 타입 1 근육긴장성 이영양증과 관련된 증상을 개선시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 타입 1 근육긴장성 이영양증과 관련된 증상의 발생 속도를 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 타입 1 근육긴장성 이영양증과 관련된 증상의 중증도를 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, DM1과 관련된 증상은 근육 경직, 근육긴장증, 불능화 원위 약화(disabling distal weakness), 안면 및 턱 근육의 약화, 연하(swallowing)의 어려움, 눈꺼풀의 힘없음(안검하수증), 목 근육의 약화, 팔 및 다리 근육의 약화, 지속적인 근육 동통, 과다수면, 근육 소모, 연하곤란, 호흡기능부전, 불규칙한 심박동, 심장 근육 손상, 무감동, 인슐린 내성, 및 백내장을 포함한다. 아동에서, 증상은 또한 발달 지연, 학습 장애, 언어 및 말 문제, 및 인격 발달 문제일 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 DMPK 핵산을 표적으로 하는 치료적 유효량의 화합물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여는 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%, 또는 상기 값 중 임의의 2개의 값에 의해 규정된 범위까지 DMPK 발현의 감소를 발생시킨다.
특정 구체예에서, DMPK를 표적으로 하는 안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물이 타입 1 근육긴장성 이영양증에 걸려 있거나 이에 민감한 환자를 치료하기 위한 약제의 제조를 위해 사용된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792에 열거된 서열의 본원에 기재된 바와 같은 연속적 핵염기 부분을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
투여
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 조성물은 비경구로 투여된다.
특정 구체예에서, 비경구 투여는 주입에 의한 것이다. 주입은 만성 또는 연속 또는 단기 또는 간헐적 주입일 수 있다. 특정 구체예에서, 주입된 약학적 작용제는 펌프를 이용하여 전달된다. 특정 구체예에서, 비경구 투여는 주사(예를 들어, 볼루스 주사)에 의한 것이다. 주사는 주사기를 이용하여 전달될 수 있다.
비경구 투여는 피하 투여, 정맥내 투여, 근내 투여, 동맥내 투여, 복막내 투여 또는 두개내 투여, 예를 들어, 수막강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다. 투여는 연속, 또는 만성, 또는 단기, 또는 간헐적 투여일 수 있다.
특정 구체예에서, 투여는 피하, 정맥내, 뇌내, 뇌실내, 수막강내 또는 올리고뉴클레오타이드의 전신 효과를 발생시키는 또 다른 투여(전신 투여는 전신 효과, 즉, 하나 이상의 조직에서의 효과를 특징으로 함) 또는 CNS 또는 CSF로의 전달이다.
DM1의 HSALR 마우스 모델에서의 알파 1 액틴의 억제 및 근육긴장증의 감소에 의해 측정되는 바와 같은 작용의 지속기간은 대퇴사두근, 장딴지근 및 앞정강근(하기 실시예 참조)을 포함하는 근육 조직에서 연장된다. 4주 동안의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 피하 주사는 투여 종료 후에 적어도 11주(77일) 동안 HSALR 마우스의 대퇴사두근, 장딴지근 및 앞정강근에서 적어도 70%까지 알파 1 액틴의 억제를 발생시킨다. 4주 동안의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 피하 주사는 투여 종료 후에 적어도 11주(77일) 동안 HSALR 마우스의 대퇴사두근, 장딴지근 및 앞정강근에서 근육긴장증의 제거를 발생시킨다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물의 전달은 적어도 77일 동안 표적 mRNA 및/또는 표적 단백질의 적어도 70% 하향조절을 발생시킨다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물의 전달은 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 55일, 적어도 60일, 적어도 65일, 적어도 70일, 적어도 75일, 적어도 76일, 적어도 77일, 적어도 78일, 적어도 79일, 적어도 80일, 적어도 85일, 적어도 90일, 적어도 95일, 적어도 100일, 적어도 105일, 적어도 110일, 적어도 115일, 적어도 120일, 적어도 1년 동안 표적 mRNA 및/또는 표적 단백질의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 하향조절을 발생시킨다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 77일 동안 매일 1회의 주사 또는 주입에 의해 전달된다. 특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 매월 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회, 1년에 2회 또는 1년에 1회 주사 또는 주입에 의해 전달된다.
특정 병용 요법
특정 구체예에서, 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 첫번째 작용제는 하나 이상의 두번째 작용제와 공동 투여된다. 특정 구체예에서, 이러한 두번째 작용제는 본원에 기재된 첫번째 작용제와 동일한 타입 1 근육긴장성 이영양증을 치료하도록 설계된다. 특정 구체예에서, 이러한 두번째 작용제는 본원에 기재된 첫번째 작용제와 상이한 질병, 장애 또는 질환을 치료하도록 설계된다. 특정 구체예에서, 이러한 두번째 작용제는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 약학적 조성물의 요망되지 않는 부작용을 치료하도록 설계된다. 특정 구체예에서, 두번째 작용제는 첫번째 작용제의 요망되지 않는 결과를 치료하기 위해 첫번째 작용제와 공동 투여된다. 특정 구체예에서, 두번째 작용제는 조합 효과를 발생시키기 위해 첫번째 작용제와 공동 투여된다. 특정 구체예에서, 두번째 작용제는 상승작용 효과를 생성시키기 위해 첫번째 작용제와 공동 투여된다.
특정 구체예에서, 첫번째 작용제 및 하나 이상의 두번째 작용제는 동시에 투여된다. 특정 구체예에서, 첫번째 작용제 및 하나 이상의 두번째 작용제는 상이한 시간에 투여된다. 특정 구체예에서, 첫번째 작용제 및 하나 이상의 두번째 작용제는 단일한 약학적 제형으로 함께 제조된다. 특정 구체예에서, 첫번째 작용제 및 하나 이상의 두번째 작용제는 별개로 제조된다.
실시예
비제한적 개시 및 참조로서의 포함
본원에 기재된 특정 화합물, 조성물 및 방법은 특정 구체예에 따라 특이적으로 기재되었으나, 하기 실시예는 단지 본원에 기재된 화합물을 예시하기 위해 제공되며, 이를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 출원에 언급된 참조 각각은 이의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
실시예 1: 인간 골격근 세포(hSKMC)에서의 인간 근긴장성 이영양증 단백질 키나제(DMPK)의 안티센스 억제
인간 DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 시험관내 DMPK RNA 전사물에 대한 이의 효과에 대해 시험하였다. 웰 당 20,000개 세포의 밀도의 배양된 hSKM 세포를 전기천공을 이용하여 100nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 24시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, DMPK RNA 전사물 수준을 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3164(정방향 서열 AGCCTGAGCCGGGAGATG, 서열번호 9로 본원에 표시됨; 역방향 서열 GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT, 서열번호 10으로 본원에 표시됨; 프로브 서열 AGGCCATCCGCACGGACAACCX, 서열번호 11로 본원에 표시됨)를 이용한 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DMPK RNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 hDMPK의 억제 퍼센트로 제시된다.
표 1 및 표 2의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-10-5 갭머이고, 여기서 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함하고, 각각의 윙 세그먼트는 5개의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 각각의 갭머 전체에 걸친 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트(P=S) 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸친 모든 사이토신 잔기는 5-메틸사이토신이다. '표적 시작 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. '표적 정지 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. 표 1에 나열된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(유전자은행 등록번호 NM_001081560.1)을 표적으로 한다. 표 2에 나열된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2(뉴클레오타이드 18540696으로부터 18555106까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_011109.15의 상보체)를 표적으로 한다.
여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 특정된 조건하에서 인간 DMPK mRNA 수준의 유의한 억제를 나타내었다.
표 1: 서열번호 1을 표적으로 하는 5-10-5 갭머에 의한 hSKMC에서의 인간 DMPK RNA 전사물의 억제
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
표 2: 서열번호 2를 표적으로 하는 5-10-5 갭머에 의한 hSKMC에서의 인간 DMPK RNA 전사물의 억제
Figure pct00015
표 1 및 표 2로부터의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 또한 상기 기재된 것과 유사한 조건을 갖는 검정으로 시험하였고, mRNA 수준을 인간 프라이머 프로브RTS3162(정방향 서열 CGGGCCGTCCGTGTT, 서열번호 157로 본원에 표시됨; 역방향 서열 CTTTGCACTTTGCGAACCAA, 서열번호 158로 본원에 표시됨; 프로브 서열 CATCCTCCACGCACCCCCACCX, 서열번호 159로 본원에 표시됨)로 측정하였다. 결과는 표 3에 제시된다. DMPK mRNA 발현을 또한 3'UTR 근처의 DMPK 유전자를 표적으로 하는 RTS3162에 의해 평가하였다. 전체 DMPK 유전자의 발현이 억제된 것을 확인하기 위해 두번째 프라이머 프로브의 사용을 이용하였다.
표 3: 프라이머 프로브 세트 RTS3162를 이용하여 측정된 5-10-5 갭머에 의한 hSKMC에서의 인간 DMPK RNA 전사물의 억제
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
실시예 2: CUG 반복부를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 설계
다수의 CUG 반복부를 함유하는 mRNA 전사물을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라 이의 서열의 화학은 표 4에 제시되어 있다. 당 유형에 대해 지정된 기호는 아래첨자의 염기 뒤에 제시되고, 이는 다음과 같다: b = 2'-O-N-[2-(디메틸아미노)에틸]아세트아미도 리보스; d = 2'-데옥시리보스; e = 2'-O-메톡시에틸 리보스; f = 2'-알파-플루오로-2'-데옥시리보스; g = 2'-O-2[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸 리보스; h = 3'-플루오로-HNA; k = (S)-cEt; l = LNA(잠금 핵산); n = 2'-O-(N-메틸아세트아미드) 리보스; o = 2'-O-디메틸아미노옥시에틸(DMAOE) 리보스; p = PNA; r = 프로필리보스; 및 x = 아미노산 코어. 헤테로사이클명은 아데닌, 사이토신, 티민 및 구아닌에 대해 표준 기호, 5-메틸사이토신에 대해 'mC', 및 리신 측쇄에 대해 'K'로 정의된다. 링커는 아래첨자의 당 유형 뒤에 제시되고, 이는 다음과 같은 기호로 지정된다: g = PNA-글리신 전체; a = 아미노산; 및 s = 티오에이트 에스터.
표 4: CUG 반복부를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 설계
Figure pct00020
실시예 3: 인간 골격근 세포에서의 인간 DMPK의 용량 의존성 안티센스 억제
hSKMC에서 DMPK의 시험관내 억제를 나타내는 여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드(실시예 1 참조)를 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 20,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하고, 전기천공을 이용하여 1,250nM, 2,500nM, 5,000nM, 10,000nM 및 20,000nM 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, DMPK mRNA 전사물 수준을 상기 기재된 프라이머 프로브 세트 RTS3164를 이용한 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DMPK mRNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 대해 표준화시켰다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 DMPK의 억제 퍼센트로서 표 5에 제시된다.
시험된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 특정된 조건하에서 DMPK mRNA 수준의 용량 의존적 억제를 나타내었다.
표 5: 프라이머 프로브 세트 RTS3164로 시험된 hSKMC에서의 인간 DMPK의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00021
Figure pct00022
표 5로부터의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 또한 상기 기재된 프라이머 프로브 세트 RTS3162로 시험하였다. 결과는 표 6에 제시된다. DMPK mRNA 발현을 또한 3'UTR 근처의 DMPK 유전자를 표적으로 하는 RTS3162에 의해 평가하였다. 전체 DMPK 유전자의 발현이 억제된 것을 확인하기 위해 두번째 프라이머 프로브의 사용을 이용하였다.
표 6: 프라이머 프로브 세트 RTS3164로 시험된 hSKMC에서의 인간 DMPK의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 4: 인간 골격근 세포에서의 인간 DMPK의 용량 의존적 안티센스 억제
hSKMC에서 DMPK의 시험관내 억제를 나타내는 여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드(실시예 3 참조)를 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 20,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하고, 전기천공을 이용하여 1,250nM, 2,500nM, 5,000nM, 10,000nM 및 20,000nM 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, DMPK mRNA 전사물 수준을 상기 기재된 프라이머 프로브 세트 RTS3164를 이용한 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DMPK mRNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 대해 표준화시켰다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 DMPK의 억제 퍼센트로서 표 7에 제시된다.
시험된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 대부분은 상기 특정된 조건하에서 DMPK mRNA 수준의 용량 의존적 억제를 나타내었다.
표 7: 프라이머 프로브 세트 RTS3164로 시험된 hSKMC에서의 인간 DMPK의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 5: 인간 골격근 세포에서의 인간 DMPK의 용량 의존적 안티센스 억제
인간 DMPK mRNA를 표적으로 하는 여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하고, 다양한 용량으로 hSKMC에서 시험하였다. 인간 액틴 mRNA를 표적으로 하는 여러 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하고, 또한 다양한 용량으로 hSKMC에서 시험하였다. 새로이 설계된 갭머는 2-10-2 MOE 또는 3-10-3 MOE 갭머이다. 2-10-2 MOE 갭머는 14개의 뉴클레오사이드 길이이고, 여기서 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함하고, 각각의 윙 세그먼트는 2개의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 3-10-3 MOE 갭머는 16개의 뉴클레오사이드 길이이고, 여기서 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함하고, 각각의 윙 세그먼트는 3개의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 각각의 갭머 전체에 걸친 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트(P=S) 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸친 모든 사이토신 잔기는 5-메틸사이토신이다. '표적 시작 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. '표적 정지 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. 표 8에 나열된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2로 본원에 표시된 인간 DMPK 유전체 서열(뉴클레오타이드 18540696으로부터 18555106까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_011109.15의 상보체) 또는 서열번호 801로 본원에 표시된 인간 액틴 서열(유전자은행 등록번호 NM_001100.3)을 표적으로 한다.
세포를 웰 당 20,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하고, 전기천공을 이용하여 1,250nM, 2,500nM, 5,000nM, 10,000nM 및 20,000nM 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, DMPK mRNA 전사물 수준을 상기 기재된 프라이머 프로브 세트 RTS3162를 이용한 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DMPK mRNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 대해 표준화시켰다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 DMPK의 억제 퍼센트로서 표 8에 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 또한 RTS3164와 유사한 조건하에서 시험하였다. 결과는 표 9에 제시된다.
시험된 많은 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 특정된 조건하에서 DMPK mRNA 수준의 용량 의존적 억제를 나타내었다.
표 8: 프라이머 프로브 세트 RTS3162로 시험된 hSKMC에서의 인간 DMPK 및 인간 액틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00027
표 9: 프라이머 프로브 세트 RTS3164로 시험된 hSKMC에서의 인간 DMPK의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00028
실시예 6: DM1 섬유모세포 세포에서의 인간 근육긴장성 이영양증 -단백질 키나제( DMPK)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 용량 반응 연구
큰 CUG 반복부를 갖는 DMPK mRNA의 돌연변이 형태는 완전히 전사되고 아데닐중합체형성되나, 핵 내에 포획된 채로 남아 있는다(Davis et al, 1997, Proc. Natl. Acad . Sci . U.S.A. 94, 7388-7393). 이러한 돌연변이의 핵-유지된 mRNA는 근육긴장성 이영양증 1(DM1)의 가장 중요한 병리학적 특징 중 하나이다. DM1 섬유모세포 세포에서의 돌연변이 DMPK mRNA의 안티센스 억제를 연구하였다.
DMPK 유전자는 보통 3' 비번역 영역 내에 5-37개의 CTG 반복부를 갖는다. 근육긴장성 이영양증 타입 I에서, 이러한 수는 현저히 확장되고, 이는 50개 내지 3,500개 초과의 범위일 수 있다(Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, London, ed.3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol. 20: 572, 2007). DM1 섬유모세포 세포를 웰 당 4,500개의 세포의 밀도로 플레이팅하고, Cytofectin 시약을 이용하여 9.4nM, 18.8nM, 37.5nM, 75.0nM, 150.0nM 및 300.0nM 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, DMPK RNA 전사물 수준을 상기 기재된 프라이머 프로브 세트 RTS3164를 이용한 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DMPK RNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 대해 표준화시켰다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 DMPK의 억제 퍼센트로서 표 10에 제시된다.
유사한 조건을 갖는 검정을 또한 DMPK 전사물의 3'-말단을 표적으로 하는 상기 기재된 프라이머 프로브 세트 RTS3162로 수행하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 DMPK의 억제 퍼센트로 표 11에 제시된다.
시험된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 특정된 조건하에서 DMPK mRNA 수준의 용량 의존적 억제를 나타내었다.
표 10: RTS3164를 이용한 DM1 섬유모세포 세포에서의 DMPK mRNA의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00029
표 11: RTS3162를 이용한 DM1 섬유모세포 세포에서의 DMPK mRNA의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00030
실시예 7: 인간 골격근 세포( hSKMc )에서의 인간 DMPK 의 안티센스 억제
인간 DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 시험관내에서 DMPK RNA 전사물에 대한 이의 효과에 대해 시험하였다. 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 hSKMc를 전기천공을 이용하여 10,000nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 24시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, DMPK 전사물 수준을 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DMPK RNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 DMPK의 억제 퍼센트로 제시된다.
표 12 및 표 13의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-10-5 갭머이며, 여기서 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함하고, 각각의 윙 세그먼트는 5개의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 각각의 갭머 전체에 걸친 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트(P=S) 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸친 모든 사이토신 잔기는 5-메틸사이토신이다. '표적 시작 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 인간 유전체 유전자 서열 내에서 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. '표적 정지 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 인간 유전체 서열 내에서 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. 표 12에 나열된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(유전자은행 등록번호 NM_001081560.1)을 표적으로 한다. 표 13에 나열된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2(뉴클레오타이드 18540696으로부터 18555106까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_011109.15의 상보체)를 표적으로 한다.
여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 특정된 조건하에서 DMPK mRNA 수준의 유의한 억제를 나타내었다.
표 12: 서열번호 1을 표적으로 하는 5-10-5 갭머에 의한 hSKMc에서의 인간 DMPK RNA 전사물의 억제
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
표 13: 서열번호 2를 표적으로 하는 5-10-5 갭머에 의한 hSKMc에서의 인간 DMPK RNA 전사물의 억제
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
실시예 8: 마우스 일차 간세포에서의 뮤린 DMPK의 안티센스 억제
뮤린 DMPK 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 시험관내에서 DMPK RNA 전사물에 대한 이의 효과에 대해 시험하였다. 웰 당 35,000개 세포의 밀도의 배양된 마우스 일차 간세포를 전기천공을 이용하여 8,000nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 24시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, DMPK 전사물 수준을 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DMPK RNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 DMPK의 억제 퍼센트로 제시된다.
표 14, 표 15 및 표 16의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-10-5 갭머이고, 여기서 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함하고, 각각의 윙 세그먼트는 5개의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 각각의 갭머 전체에 걸친 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트(P=S) 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸친 모든 사이토신 잔기는 5-메틸사이토신이다. '뮤린 표적 시작 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 뮤린 유전자 서열 내에서 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. '뮤린 표적 정지 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 뮤린 유전자 서열 내에서 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. 표 12에 나열된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 3(뉴클레오타이드 16666001로부터 16681000까지 트렁케이션된 유전자은행 등록번호 NT_039413.7)을 표적으로 한다. 표 13에 나열된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4(유전자은행 등록번호 NM_032418.1)를 표적으로 한다. 표 14의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 5(유전자은행 등록번호 AI007148.1), 서열번호 6(유전자은행 등록번호 AI304033.1), 서열번호 7(유전자은행 등록번호 BC024150.1), 서열번호 8(유전자은행 등록번호 BC056615.1), 서열번호 793(유전자은행 등록번호 BC075715.1), 서열번호 794(유전자은행 등록번호 BU519245.1), 서열번호 795(유전자은행 등록번호 CB247909.1), 서열번호 796(유전자은행 등록번호 CX208906.1), 서열번호 797(유전자은행 등록번호 CX732022.1), 서열번호 798(유전자은행 등록번호 S60315.1) 또는 서열번호 799(유전자은행 등록번호 S60316.1)를 표적으로 한다. 또한, 서열번호 800(유전자은행 등록번호 NM_001081562.1)을 표적으로 하는 인간 안티센스 올리고뉴클레오타이드 ISIS 451421이 또한 상기 검정에 포함되었고, 이는 표 14에 나열되어 있다.
표 14, 표 15 및 표 16의 뮤린 올리고뉴클레오타이드는 또한 인간 유전자 서열과 교차 반응될 수 있다. '미스매치'는 뮤린 올리고뉴클레오타이드가 인간 유전자 서열과 미스매치되는 핵염기의 수를 나타낸다. 뮤린 올리고뉴클레오타이드와 인간 서열 사이에 상보성이 클수록, 뮤린 올리고누클레티드가 인간 서열과 교차 반응할 수 있는 가능성이 더 크다. 표 14, 표 15 및 표 16의 뮤린 올리고뉴클레오타이드를 서열번호 800(유전자은행 등록번호 NM_001081562.1)과 비교하였다. "인간 표적 시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열 내에서 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. "인간 표적 정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열 내에서 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오사이드를 나타낸다.
시험된 여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 특정된 조건하에서 DMPK mRNA 수준의 유의한 억제를 나타내었다. 시험된 특정 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 유전자 서열과 교차 반응성이다.
표 14: 서열번호 800을 표적으로 하는 5-10-5 갭머에 의한 마우스 일차 간세포에서의 뮤린 DMPK RNA 전사물의 억제
Figure pct00060
Figure pct00061
표 15: 서열번호 800을 표적으로 하는 5-10-5 갭머에 의한 마우스 일차 간세포에서의 뮤린 DMPK RNA 전사물의 억제
Figure pct00062
표 16: 서열번호 5-8 및 793-799를 표적으로 하는 5-10-5 갭머에 의한 마우스 일차 간세포에서의 뮤린 DMPK RNA 전사물의 억제
Figure pct00063
실시예 9: 마우스 일차 간세포에서의 뮤린 DMPK의 용량 의존적 안티센스 억제
마우스 일차 간세포에서의 DMPK의 시험관내 억제를 나타내는 여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드(실시예 8 참조)를 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 35,000개 세포의 밀도로 플레이팅시키고, 전기천공을 이용하여 1,000nM, 2,000nM, 4,000nM, 8,000nM 및 16,000nM 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, DMPK 전사물 수준을 프라이머 프로브 세트 RTS3181(정방향 서열 GACATATGCCAAGATTGTGCACTAC, 서열번호 771로 본원에 표시됨; 역방향 서열 CACGAATGAGGTCCTGAGCTT, 서열번호 772로 본원에 표시됨; 프로브 서열 AACACTTGTCGCTGCCGCTGGCX, 서열번호 773으로 본원에 표시됨)를 이용한 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DMPK 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 대해 표준화시켰다. 결과는 미처리된 대조군 세포에 비한 DMPK의 억제 퍼센트로 표 17에 제시된다.
시험된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 대부분은 상기 특정된 조건하에서 DMPK mRNA 수준의 용량 의존적 억제를 나타내었다.
표 17: 마우스 일차 간세포에서의 뮤린 DMPK의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00064
실시예 10: HepG2 세포에서의 인간 알파1 골격 액틴의 안티센스 억제
마우스 모델에 삽입되는 경우 DM1의 증상을 야기시킬 수 있는 확장된 CTG 반복부를 가질 수 있는 유전자인 인간 알파1 골격 액틴 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 시험관내에서 알파1 액틴 RNA 전사물에 대한 이의 효과에 대해 시험하였다. 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 HepG2 세포를 전기천공을 이용하여 10,000nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 24시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, 알파1 액틴 RNA 전사물 수준을 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 알파1 액틴 RNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 조정하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 알파1 액틴의 억제 퍼센트로 제시된다.
표 18의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-10-5 갭머이고, 여기서 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함하고, 각각의 윙 세그먼트는 5개의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 각각의 갭머 전체에 걸친 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트(P=S) 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸친 모든 사이토신 잔기는 5-메틸사이토신이다. '표적 시작 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. '표적 정지 부위'는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오사이드를 나타낸다. 표 18에 나열된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 801(유전자은행 등록번호 NM_001100.3)을 표적으로 한다.
시험된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 상기 특정된 조건하에서의 알파1 액틴 mRNA 수준의 용량 의존적 억제를 나타내었다.
표 18: 서열번호 801을 표적으로 하는 5-10-5 갭머에 의한 HepG2 세포에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 억제
Figure pct00065
실시예 11: HepG2 세포에서의 인간 알파1 액틴의 용량 의존적 안티센스 억제
HepG2 세포에서의 알파1 액틴의 시험관내 억제를 나타내는 여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드(실시예 8 참조)를 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅시키고, 전기천공을 이용하여 625nM, 1,250nM, 2,500nM, 5,000nM, 10,000nM 및 20,000nM 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션시켰다. 약 16시간 후, RNA를 세포로부터 분리시키고, 알파1 액틴 RNA 전사물 수준을 프라이머 프로브 세트 RTS3154(정방향 CCACCGCAAATGCTTCTAGAC, 서열번호 785로 본원에 표시됨; 역방향 CCCCCCCATTGAGAAGATTC, 서열번호 786으로 본원에 표시됨; 프로브 서열 CTCCACCTCCAGCACGCGACTTCTX, 서열번호 787로 본원에 표시됨)를 이용하여 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 알파1 액틴 RNA 전사물 수준을 RIBOGREEN(등록상표)에 의해 측정되는 바와 같은 전체 RNA 함량에 따라 표준화시켰다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포에 비한 알파1 액틴의 억제 퍼센트로 표 19에 제시된다.
여러 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 특정된 조건하에서 알파1 액틴 mRNA 수준의 용량 의존적 억제를 나타내었다.
표 19: HepG2 세포에서의 인간 알파1 액틴의 용량 의존적 안티센스 억제
Figure pct00066
실시예 12: 트랜스제닉 마우스에서의 근내 투여에 의한 인간 알파1 액틴의 생체내 안티센스 억제
근육긴장성 이영양증의 치료를 위한 안티센스 억제의 효과를 시험하기 위해, 적절한 마우스 모델을 필요로 하였다. HSALR 마우스 모델은 DM1에 대해 확립된 모델이다(Mankodi, A. et al. Science. 289: 1769, 2000). 상기 마우스는 유전자의 3' UTR에 삽입된 220개의 CTG 반복부를 갖는 인간 골격 액틴(hACTA1) 트랜스진을 갖는다. hACTA1-CUGexp 전사물은 골격근 내의 핵 초점으로 축적되고, 이는 인간 DM1의 근육긴장증과 유사한 근육긴장증을 발생시킨다(Mankodi, A. et al. Mol. Cell 10: 35, 2002; Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006). 그러므로, hACTA1 트랜스진의 안티센스 억제에 의한 HSALR 마우스에서의 DM1 증상의 개선이 DMPK 전사물의 안티센스 억제에 의한 인간 환자에서의 유사한 증상의 개선을 예측하는 것이 예상되었다.
HSA(인간 골격 액틴)LR (긴 반복부) DM1 마우스를 인간 골격 액틴의 3' UTR 내의 250개의 CUG 반복부를 갖는 트랜스진의 FVB/N 마우스 내의 삽입에 의해 생성시켰다. 트랜스진은 핵 내에 유지되는 CUG 반복부 RNA로서 마우스에서 발현되어, 근육긴장성 이영양증(DM1)을 갖는 환자의 인간 조직 샘플에서 관찰되는 것과 유사한 핵내 봉입(nuclear inclusion) 또는 초점을 형성시킨다.
시험관내에서 통계적으로 유의한 용량 의존적 억제를 나타낸 ISIS 190403 및 ISIS 445238(실시예 11 참조)을 생체내에서 인간 알파1 액틴 RNA 전사물을 감소시키는 능력에 대해 평가하였다.
처리
HSALR 마우스를 12시간의 명/암 주기로 유지시키고, 일반적인 퓨리나(Purina) 마우스 먹이를 무제한적으로 공급하였다. 동물을 실험 개시 전에 연구 시설에서 적어도 7일 동안 새 환경에 순응시켰다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 PBS에서 제조하였고, 0.2 마이크론 필터를 통한 여과에 의해 멸균시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 주사를 위해 0.9% PBS에 용해시켰다.
마우스를 2개의 처리군으로 나누었다. 2개의 군에 한 측면의 앞정강근 근육에 0.8nM의 용량으로 ISIS 190403 또는 ISIS 445238을 직접적 근내 주사로 투여하였다. 각각의 마우스의 반대쪽 앞정강근 근육에 PBS를 단일 용량의 근내 주사로 투여하였다. PBS 주사된 근육은 대조군으로 작용하였다.
알파1 액틴 RNA의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 양 측면의 앞정강근 근육으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 20에 제시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 PBS 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
상기 결과는 ISIS 190403 및 ISIS 445238을 이용한 처리가 마우스에서 알파1 액틴 RNA 수준의 억제를 발생시킨 것을 나타낸다.
표 20: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 억제 퍼센트
Figure pct00067
실시예 13: 트랜스제닉 마우스에서의 근내 투여에 의한 인간 알파1 액틴의 용량 의존적 안티센스 억제
시험관내에서 통계적으로 유의한 용량 의존적 억제를 나타낸 ISIS 445236(실시예 11 참조)을 생체내에서 인간 알파1 액틴 RNA 전사물을 감소시키는 이의 능력에 대해 평가하였다.
처리
HSALR 마우스를 12시간의 명/암 주기로 유지시키고, 일반적인 퓨리나(Purina) 마우스 먹이를 무제한적으로 공급하였다. 동물을 실험 개시 전에 연구 시설에서 적어도 7일 동안 새 환경에 순응시켰다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 PBS에서 제조하였고, 0.2 마이크론 필터를 통한 여과에 의해 멸균시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 주사를 위해 0.9% PBS에 용해시켰다.
마우스를 3개의 처리군으로 나누었다. 상기 군에 한 측면의 앞정강근 근육에 0.2nM, 0.4nM 또는 0.8nM의 용량으로 ISIS 445236을 직접적 근내 주사로 투여하였다. 각각의 마우스의 반대쪽 앞정강근 근육에 PBS를 단일 용량의 근내 주사로 투여하였다. PBS 주사된 근육은 대조군으로 작용하였다.
알파1 액틴 RNA의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 양 측면의 앞정강근 근육으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 21에 제시된 바와 같이, ISIS 445236을 이용한 처리는 모든 투여량에서 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
상기 결과는 ISIS 445236을 이용한 처리가 상기 특정된 조건하에서 알파1 액틴 mRNA 수준의 유의한 억제를 발생시킨 것을 나타낸다.
표 21: HSALR 마우스에서의 ISIS 445236에 의한 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 억제
Figure pct00068
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
근육긴장증은 근섬유의 지연된 이완으로 인한 반복 활동 전위를 의미한다. 이러한 현상은 근육긴장성 이영양증의 환자뿐만 아니라 HSALR 마우스에서 관찰된다. EMG 바늘이 근육긴장증 근육에 삽입되는 경우, 전기 활동은 삽입 활동이 보통 정지된 후 수초까지 연장된다. 근육긴장증성 방전의 주파수는 초당 50 내지 100 임펄스 범위이다.
근육긴장증을 근전도검사를 통해 측정하고, 다음과 같은 방식으로 등급화시켰다: 등급 0은 어떠한 바늘 삽입에 의해 근육긴장증이 유도되지 않은 것을 나타내고(0%); 등급 1은 50% 미만의 바늘 삽입에 의해 근육긴장증이 유도된 것을 나타내고; 등급 2는 50% 이상의 바늘 삽입에 의해 근육긴장증이 유도된 것을 나타내고; 등급 3은 100% 바늘 삽입에 의해 근육긴장증이 유도된 것을 나타낸다.
근전도검사 전, 마우스를 100 ㎎/㎏ 케타민, 10 ㎎/㎏ 크실라진, 및 3 ㎎/㎏ 아세프로마진의 칵테일을 복막내 이용하여 마취시켰다. 좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 22에 제시되고, 이는 ISIS 445236으로 처리된 마우스에서의 근육긴장증의 유의한 감소를 나타내었다.
표 22: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 다양한 근육에서의 근육긴장증의 평균 감소
Figure pct00069
대안적 스플라이싱의 교정
DM1/HSALR 마우스 모델에서, 핵 내의 확장된 CUG RNA의 축적은 Muscleblind-유사 1(MBLN1)과 같은 폴리(CUG)-결합 단백질의 격리를 발생시킨다(Miller, J.W. et al. EMBO J. 19: 4439, 2000). Serca1 유전자의 대안적 스플라이싱을 조절하는 스플라이싱 인자 MBNL1은 확장된 CUG 초점 내에 격리된다. 이는 상기 유전자의 대안적 스플라이싱의 이상조절을 촉발시킨다. 상기 대안적 스플라이싱에 대한 인간 알파1 액틴의 안티센스 억제의 효과를 평가하기 위해, 전체 RNA를 제조업체의 설명서에 따라 RNeasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근 근육으로부터 정제하였다. RT-PCR을 cDNA 합성 및 PCR 증폭을 위한 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 Superscript III One-Step RT-PCR System 및 Platinum Taq Polymerase(Invitrogen)로 수행하였다. Serca-1에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 문헌[Bennett and Swayze (Annu. Rev. Pharmacol. 2010; 50: 259-93)]에 기재되어 있다. PCR 생성물을 아가로스 겔 상에서 분리시키고, SybrGreen I Nucleic Acid Gel Stain(Invitrogen)으로 염색시키고, Fujifilm LAS-3000 Intelligent Dark Box를 이용하여 이미지화시켰다.
PBS 대조군에서의 Serca1 스플라이싱의 PCR 생성물은 MBLN1의 이상조절의 결과로서 엑손 22 배제를 나타내었다. ISIS 445236을 이용한 처리는 엑손 22 봉입 및 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근 근육에서의 Serca1 유전자의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰다.
따라서, 알파1 액틴의 안티센스 억제는 Serca1 스플라이싱 이상조절을 교정하였고, 이는 안티센스 올리고누클레오티를 이용한 처리가 핵 초점 내의 CUGexp의 축적을 감소시킨 것을 나타낸다. 핵 초점 내의 CUGexp의 감소된 축적은 MBLN1 격리를 교정함으로써, 정상적인 스플라이싱이 발생하도록 한다.
실시예 14: 트랜스제닉 마우스에서의 피하 투여에 의한 인간 알파1 액틴의 생체내 안티센스 억제
ISIS 190403, ISIS 445236 및 ISIS 445238을 생체내에서 인간 알파1 액틴 RNA 전사물을 감소시키는 이의 능력에 대해 평가하였다.
처리
HSALR 마우스를 12시간의 명/암 주기로 유지시키고, 일반적인 퓨리나(Purina) 마우스 먹이를 무제한적으로 공급하였다. 동물을 실험 개시 전에 연구 시설에서 적어도 7일 동안 새 환경에 순응시켰다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 PBS에서 제조하였고, 0.2 마이크론 필터를 통한 여과에 의해 멸균시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 주사를 위해 0.9% PBS에 용해시켰다.
마우스를 4개의 처리군으로 나누었다. 처음 3개의 군에 4주 동안 주 당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 190403, ISIS 445236 또는 ISIS 445238을 피하 주사로 투여하였다. 네번째 군에 4주 동안 1주일에 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다.
알파1 액틴 RNA의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육(좌측 및 우측), 장딴지근 근육(좌측 및 우측) 및 앞정강근 근육(좌측 및 우측)으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 23에 제시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
ISIS 445236 및 ISIS 445238 둘 모두는 상기 특정된 조건하에서 알파1 액틴 mRNA 수준의 유의한 억제를 나타내었다.
표 23: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 억제 퍼센트
Figure pct00070
근육에서의 알파1 액틴의 형광 인 시츄 하이브리드화(Fluorescence in situ hybridization)
동결된 근육 조직 섹션을 15-20분 동안 신선한 PBS 중 3% 파라포름알데하이드 용액에 고정시킨 후, 이를 5분 동안 PBS로 2회 헹구었다. 핵을 5분 동안 0.5% Triton X-100으로 투과화시킨 후, 조직을 30분 동안 정상 염소 혈청으로 차단시켰다. 섹션을 Texas Red(Integrated DNA Technologies)로 5'-표지된 알파1 액틴을 표적으로 하는 2'-O-메틸 RNA와 함께 인큐베이션시켰다. 섹션을 핵을 표지하기 위해 DAPI로 대조 염색시켰다. 섹션을 표준 형광현미경에 올려놓고 관찰하였다. Metavue 소프트웨어에 의해 이미지를 획득하였고, Autoquant 소프트웨어에 의해 디컨볼루션(deconvolution)을 달성하였다.
ISIS 445236 및 ISIS 445238로 처리된 마우스로부터의 모든 근육 조직 섹션은 리보핵 초점에서 알파1 액틴 신호의 감소된 형광 강도를 나타내었고, 이는 인간 알파1 액틴 mRNA의 안티센스 억제 및 핵 초점에서의 RNA의 감소를 나타낸다.
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
근육긴장증은 근섬유의 지연된 이완으로 인한 반복 활동 전위를 의미한다. 이러한 현상은 근육긴장성 이영양증의 환자뿐만 아니라 HSALR 마우스에서 관찰된다. EMG 바늘이 근육긴장증 근육에 삽입되는 경우, 전기 활동은 삽입 활동이 보통 정지된 후 수초까지 연장된다. 근육긴장증성 방전의 주파수는 초당 50 내지 100 임펄스 범위이다.
근육긴장증을 근전도검사를 통해 측정하고, 다음과 같은 방식으로 등급화시켰다: 등급 0은 어떠한 바늘 삽입에 의해 근육긴장증이 유도되지 않은 것을 나타내고(0%); 등급 1은 50% 미만의 바늘 삽입에 의해 근육긴장증이 유도된 것을 나타내고; 등급 2는 50% 이상의 바늘 삽입에 의해 근육긴장증이 유도된 것을 나타내고; 등급 3은 100% 바늘 삽입에 의해 근육긴장증이 유도된 것을 나타낸다.
근전도검사 전, 마우스를 100 ㎎/㎏ 케타민, 10 ㎎/㎏ 크실라진 및 3 ㎎/㎏ 아세프로마진 또는 250 ㎎/㎏ 2,2,2-트라이브로모에탄올을 복막내 이용하여 마취시켰다. 좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 24에 제시되고, 이는 ISIS 445236 및 ISIS 445238로 처리된 마우스에서의 근육긴장증의 유의한 감소를 나타내었다.
표 24: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 다양한 근육에서의 근육긴장증의 평균 감소
Figure pct00071
대안적 스플라이싱의 교정
Serca1 스플라이싱, m-Titin 스플라이싱, CIC-1 클로라이드 채널 유전자(Clcn1) 스플라이싱 및 Zasp 스플라이싱을 조절하는 스플라이싱 인자 MBNL1은 확장된 CUG 초점 내에 격리된다. MBNL1 격리는 상기 유전자 각각에서 이상조절된 스플라이싱을 촉발시킨다. 스플라이싱에 대한 인간 알파1 액틴의 안티센스 억제의 효과를 평가하기 위해, 전체 RNA를 실시예 13에 기재된 바와 같이 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근 근육으로부터 정제시키고, RT-PCR을 수행하였다. Serca-1, m-Titin, Clcn1 및 ZASP에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 문헌[Bennett and Swayze, Annu. Rev. Pharmacol. 2010; 50: 259-93]에 기재되어 있다.
PBS 처리된 HSALR 마우스에서, Serca1 스플라이싱은 엑손 22 배제에 의해 입증되는 바와 같이 이상조절된다. ISIS 445236 및 ISIS 445238 각각을 이용한 처리는 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근 근육에서 엑손 22 봉입 및 Serca1 유전자의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰다.
PBS 처리된 HSALR 마우스에서, m-Titin 스플라이싱은 엑손 5 봉입에 의해 입증되는 바와 같이 이상조절된다. ISIS 445236 및 ISIS 445238 각각을 이용한 처리는 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근 근육에서 엑손 5의 스키핑(skipping) 및 m-Titin 유전자의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰다.
PBS 처리된 HSALR 마우스에서, Clcn1 스플라이싱은 엑손 7a 봉입에 의해 입증되는 바와 같이 이상조절된다. ISIS 445236 및 ISIS 445238 각각을 이용한 처리는 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근 근육에서 엑손 7a의 스키핑(skipping) 및 Clcn1 유전자의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰다.
PBS 처리된 HSALR 마우스에서, Zasp 스플라이싱은 엑손 11 봉입에 의해 입증되는 바와 같이 이상조절된다. ISIS 445236 및 ISIS 445238 각각을 이용한 처리는 앞정강근, 장딴지근 및 대퇴사두근 근육에서 엑손 11의 스키핑(skipping) 및 Zasp 유전자의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰다.
따라서, 알파1 액틴의 안티센스 억제는 Serca1, m-Titin, Clcn1 및 Zasp 스플라이싱 이상조절을 교정하였고, 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리가 핵 초점에서 CUGexp의 축적을 감소시킨 것을 나타낸다. 핵 초점 내의 CUGexp의 감소된 축적은 MBLN1 격리를 교정함으로써, 정상적인 스플라이싱이 발생하도록 한다.
실시예 15: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 알파1 액틴의 생체내 안티센스 억제
HSALR 마우스에서의 근육긴장증에 대한 ISIS 445236 및 ISIS 445238에 의한 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 안티센스 억제를 추가로 평가하였다.
처리
HSALR 마우스를 3개의 처리군으로 나누었다. 처음 2개의 군에 2주 동안 주 당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 445236 또는 ISIS 445238을 피하 주사로 투여하였다. 세번째 군에 2주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다.
알파1 액틴 RNA의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육, 장딴지근 근육 및 앞정강근 근육으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 25에 제시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 PBS 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
ISIS 445236 및 ISIS 445238 둘 모두는 상기 특정된 조건하에서 알파1 액틴 mRNA 수준의 유의한 억제를 나타내었다.
표 25: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 억제 퍼센트
Figure pct00072
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 26에 제시되고, 이는 ISIS 445236 및 ISIS 445238로 처리된 마우스에서의 근육긴장증의 유의한 감소를 나타내었다.
표 26: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 다양한 근육에서의 근육긴장증의 평균 감소
Figure pct00073
대안적 스플라이싱의 교정
Serca1의 대안적 스플라이싱에 대한 ISIS 190401의 효과를 평가하기 위해, 앞정강근 장딴지근 및 대퇴사두근 근육으로부터 정제된 전체 RNA를 실시예 13에 기재된 것과 유사한 절차로 분석하였다.
PBS 처리된 HSALR 마우스에서, Serca1 스플라이싱은 MBLN1 이상조절의 결과로서 엑손 22 배제에 의해 입증되는 바와 같이 이상조절된다. ISIS 445236 및 ISIS 445238 각각을 이용한 처리는 앞정강근 및 대퇴사두근 근육에서 거의 완전한 포함 및 Serca1 유전자의 엑손 22의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰다.
따라서, 알파1 액틴의 안티센스 억제는 Serca1 스플라이싱 이상조절을 교정하였고, 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리가 핵 초점에서 CUGexp의 축적을 감소시킨 것을 나타낸다. 핵 초점 내의 CUGexp의 감소된 축적은 MBLN1 격리를 교정함으로써, 정상적인 스플라이싱이 발생하도록 한다.
실시예 16: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 알파1 액틴의 용량 의존적 안티센스 억제
HSALR 마우스에서의 근육긴장증에 대한 ISIS 445236 및 ISIS 445238에 의한 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 용량 의존적 억제를 평가하였다.
처리
HSALR 마우스에 4주 동안 주 당 2회로 2.5 ㎎/㎏, 8.5 ㎎/㎏ 또는 25.0 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 445236 또는 ISIS 445238을 피하 주사하였다. 대조군에 4주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다.
알파1 액틴 RNA의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육(Quad), 장딴지근 근육(Gastroc) 및 앞정강근 근육(TA)으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 27에 제시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 PBS 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
둘 모두의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 특정된 조건하에서 대퇴사두근 근육, 장딴지근 근육 및 앞정강근 근육에서 알파1 액틴 mRNA 수준의 용량 의존적 억제를 나타내었다.
표 27: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 용량 의존적 억제
Figure pct00074
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근(Quad), 좌측 및 우측 장딴지근 근육(Gastroc), 좌측 및 우측 앞정강근(TA) 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 28에 제시되고, 이는 ISIS 445236 및 ISIS 445238로 처리된 마우스에서의 근육긴장증의 유의한 용량 의존적 감소를 나타내었다.
표 28: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 다양한 근육에서의 근육긴장증의 평균 감소
Figure pct00075
대안적 스플라이싱의 교정
Serca1의 대안적 스플라이싱에 대한 ISIS 190401의 효과를 평가하기 위해, 앞정강근 장딴지근 및 대퇴사두근 근육으로부터 정제된 전체 RNA를 실시예 13에 기재된 것과 유사한 절차로 분석하였다.
PBS 처리된 HSALR 마우스에서, Serca1 스플라이싱은 MBLN1 이상조절의 결과로서 엑손 22 배제에 의해 입증되는 바와 같이 이상조절된다. 1주일에 2회 8.5 ㎎/㎏ 또는 25.0 ㎎/㎏의 용량(또는 17.0 ㎎/㎏/주 및 50.0 ㎎/㎏/주)의 ISIS 445236 또는 ISIS 445238을 이용한 처리는 모든 3개의 근육 유형에서 완전한 봉입 및 Serca1 유전자의 엑손 22의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰다.
따라서, 알파1 액틴의 안티센스 억제는 Serca1 스플라이싱 이상조절을 교정하였고, 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리가 핵 초점에서 CUGexp의 축적을 감소시킨 것을 나타낸다. 핵 초점 내의 CUGexp의 감소된 축적은 MBLN1 격리를 교정함으로써, 정상적인 스플라이싱이 발생하도록 한다.
실시예 17: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 알파1 액틴의 HSA 코딩 영역을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
HSALR 마우스에서의 근육긴장증에 대한 ISIS 190401(5'-GCGGTCAGCGATCCCAGGGT-3'(서열번호 788), 서열번호 1의 표적 시작 부위 1028)에 의한 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 안티센스 억제를 평가하였다.
처리
HSALR 마우스에 4주 동안 주 당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 190401을 피하 주사로 투여하였다. 대조군에 2주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다.
알파1 액틴 RNA의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육, 장딴지근 근육 및 앞정강근 근육으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 29에 제시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 PBS 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
ISIS 190401을 이용한 처리는 상기 특정된 조건하에서 대퇴사두근 근육, 장딴지근 근육 및 앞정강근 근육에서 알파1 액틴 mRNA 수준의 유의한 억제를 발생시켰다.
표 29: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 안티센스 억제
Figure pct00076
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 30에 제시되고, 이는 ISIS 190401로 처리된 마우스에서의 근육긴장증의 유의한 감소를 나타내었다.
표 30: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 다양한 근육에서의 근육긴장증의 평균 감소
Figure pct00077
대안적 스플라이싱의 교정
Serca1의 대안적 스플라이싱에 대한 ISIS 190401의 효과를 평가하기 위해, 앞정강근 장딴지근 및 대퇴사두근 근육으로부터 정제된 전체 RNA를 실시예 13에 기재된 것과 유사한 절차로 분석하였다.
PBS 처리된 HSALR 마우스에서, Serca1 스플라이싱은 MBLN1 이상조절의 결과로서 엑손 22 배제에 의해 입증되는 바와 같이 이상조절된다. ISIS 190401을 이용한 처리는 모든 3개의 근육 유형에서 완전한 봉입 및 Serca1 유전자의 엑손 22의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰다.
따라서, 알파1 액틴의 안티센스 억제는 Serca1 스플라이싱 이상조절을 교정하였고, 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리가 핵 초점에서 CUGexp의 축적을 감소시킨 것을 나타낸다. 핵 초점 내의 CUGexp의 감소된 축적은 MBLN1 격 리를 교정함으로써, 정상적인 스플라이싱이 발생하도록 한다.
실시예 18: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 알파1 액틴을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 안티센스 억제의 작용 기간
HSALR 마우스에서의 ISIS 445236에 의한 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 안티센스 억제의 작용 기간을 평가하였다.
처리
HSALR 마우스에 4주 동안 주 당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 445236을 피하 주사로 투여하였다. 대조군에 2주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다. 마우스를 마지막 용량의 투여 후 6주 동안 분석하였다.
알파1 액틴 RNA의 억제
최종 투여 6주 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육, 장딴지근 근육 및 앞정강근 근육으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 31에 제시된 바와 같이, ISIS 445236을 이용한 처리는 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰고, 이러한 효과는 적어도 6주 동안 지속되었다. 결과는 PBS 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
ISIS 445236을 이용한 처리는 상기 특정된 조건하에서 대퇴사두근 근육, 장딴지근 근육 및 앞정강근 근육에서 알파1 액틴 mRNA 수준의 유의한 억제를 발생시켰다.
표 31: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 안티센스 억제
Figure pct00078
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 32에 제시되고, 이는 ISIS 445236으로 처리된 마우스에서의 근육긴장증의 유의한 감소를 나타내었다. 따라서, ISIS 445236에 의한 알파 액틴의 안티센스 억제의 효과는 적어도 6주 동안 지속되었다.
표 32: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 다양한 근육에서의 근육긴장증의 평균 감소
Figure pct00079
실시예 19: 트랜스제닉 마우스에서의 근내 투여에 의한 CUG 반복부를 갖는 mRNA의 안티센스 억제의 생체내 효과
HSALR 마우스에서의 근육긴장증에 대한 다수의 CUG 반복부를 함유하는 mRNA 전사물의 안티센스 억제의 효과를 평가하였다. CUG 반복부를 표적으로 하며, 다양한 길이를 갖는 3개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 마우스에서 근육긴장증을 억제하는데 있어서의 이의 효과를 검정하였다. ISIS 444745(AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA(서열번호 789)는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 25개 뉴클레오타이드 길이의 균일한 2'-O-메톡시에틸 올리고뉴클레오타이드이다. ISIS 444746(AGCAGCAGCAGCAGCAGCAG(서열번호 790)는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 20개 뉴클레오타이드 길이의 균일한 2'-O-메톡시에틸 올리고뉴클레오타이드이다. ISIS 444749(GCAGCAGCAGCAGCA(서열번호 791)는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 15개 뉴클레오타이드 길이의 균일한 2'-O-메톡시에틸 올리고뉴클레오타이드이다. ISIS 445236을 양성 대조군으로 검정에 포함시켰다.
처리
HSALR 마우스를 3개의 처리군으로 나누었다. 상기 군에 앞정강근 근육으로 0.4nM의 용량으로 ISIS 444745, ISIS 444746 또는 ISIS 444749을 직접적 근내 주사로 투여하였다. 각각의 마우스의 반대쪽 앞정강근 근육에 PBS를 단일 용량의 근내 주사로 투여하였다. PBS 주사된 근육은 대조군으로 작용하였다.
알파1 액틴 RNA의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 앞정강근(좌측 및 우측)으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 33에 제시된 바와 같이, ISIS 444745를 이용한 처리만이 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 PBS 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
표 33: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 억제 퍼센트
Figure pct00080
실시예 20: 트랜스제닉 마우스에서의 근내 투여에 의한 CUG 반복부를 갖는 mRNA의 생체내 용량 의존적 억제
ISIS 444745 및 ISIS 444746을 생체내에서 인간 알파1 액틴 mRNA를 감소시키는 이의 능력에 대해 추가로 평가하였다.
처리
HSALR 마우스를 12시간의 명/암 주기로 유지시키고, 일반적인 퓨리나(Purina) 마우스 먹이를 무제한적으로 공급하였다. 동물을 실험 개시 전에 연구 시설에서 적어도 7일 동안 새 환경에 순응시켰다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 PBS에서 제조하였고, 0.2 마이크론 필터를 통한 여과에 의해 멸균시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 주사를 위해 0.9% PBS에 용해시켰다.
마우스를 6개의 처리군으로 나누었다. 3개의 군에 한 측면의 앞정강근 근육에 0.2nM, 0.5nM 또는 1.0nM의 용량으로 ISIS 444745를 직접적 근내 주사로 투여하였다. 또 다른 3개의 군에 한 측면의 앞정강근 근육에 0.2nM, 0.5nM 또는 1.0nM의 용량으로 ISIS 444746을 직접적 근내 주사로 투여하였다. 각각의 마우스의 반대쪽 앞정강근 근육에 PBS를 단일 용량의 근내 주사로 투여하였다. PBS 주사된 근육은 ISIS 올리고뉴클레오타이드로 처리된 상응하는 근육에 대한 대조군으로 작용하였다.
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 34에 제시되고, 이는 ISIS 444745 또는 ISIS 444746으로 처리된 마우스에서의 근육긴장증의 유의한 감소를 나타내었다. ISIS 444745 및 444746에 의한 알파 액틴의 안티센스 억제의 효과는 적어도 6주 동안 지속되었다.
표 34: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 근육에서의 근육긴장증의 용량 의존적 감소
Figure pct00081
실시예 21: 트랜스제닉 마우스에서의 피하 투여에 의한 CUG 반복부를 갖는 mRNA의 안티센스 억제의 생체내 효과
HSALR 마우스에서의 근육긴장증에 대한 다수의 CUG 반복부를 함유하는 mRNA 전사물의 안티센스 억제의 효과를 평가하였다. ISIS 445236을 양성 대조군으로 검정에 포함시켰다.
처리
HSALR 마우스를 5개의 처리군으로 나누었다. 처음 3개의 군에 4주 동안 주 당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 444745, ISIS 444746 또는 ISIS 444749를 피하 주사로 투여하였다. 네번째 군에 4주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. 다섯번째 군에 4주 동안 주 당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 445236을 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다.
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 35에 제시된다.
ISIS 445236을 이용한 처리는 근육긴장증에서 유의한 감소를 발생시켰다. ISIS 444745 및 ISIS 444746을 이용한 처리는 또한 시험된 조직 일부에서 감소된 근육긴장증을 발생시켰다.
표 35: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 다양한 근육에서의 근육긴장증의 평균 감소
Figure pct00082
실시예 22: 트랜스제닉 마우스에서의 피하 투여에 의한 긴 CUG 반복부 mRNA(HSA LR 마우스) 및 짧은 CUG 반복부(HSA SR 마우스)의 용량 의존적 억제
긴 CUG 반복부(HSALR 마우스) 및 짧은 CUG 반복부(HSASR 마우스)를 함유하는 mRNA 전사물의 용량 의존적 억제를 평가하였다. HSA-짧은 반복부(HSASR) 마우스는, 250개 대신 5개의 CUG 반복물이 3' UTR에 삽입된 것을 제외하고는 HSALR 마우스와 동일한 트랜스진을 발현한다. HSASR 마우스는 근육긴장증, 스플라이싱 변화, 또는 임의의 다른 관찰가능한 근육긴장증 표현형을 갖지 않는다. 본 검정에 ISIS 445236을 이용하였다.
처리
HSALR 마우스를 4개의 처리군으로 나누었다. 처음 3개의 군에 4주 동안 주 당 2회로 2.5 ㎎/㎏, 8.5 ㎎/㎏ 또는 25.0 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 445236을 피하 주사로 투여하였다. 네번째 군에 4주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다. HSASR 마우스를 또한 4개의 군으로 나누고, 유사하게 처리하였다.
알파1 액틴 RNA 의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육(좌측 및 우측), 장딴지근 근육(좌측 및 우측) 및 앞정강근 근육(좌측 및 우측)으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 결과는 표 36 및 표 37에 제시되며, 이는 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다. HSASR 마우스의 근육에서의 비-핵 유지된 짧은 반복부에 비해 HSALR 마우스의 근육에서 핵 유지된 긴 반복부의 보다 큰 억제가 달성되었다.
표 36: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 억제 퍼센트
Figure pct00083
표 37: HSASR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 억제 퍼센트
Figure pct00084
실시예 23: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 DMPK 의 생체내 안티센스 억제
LC15 마우스 계통 A는 전체 인간 DMPK 3'UTR을 함유하는 트랜스제닉 마우스이다(휠러 등(Wheeler et al, University of Rochester)에 의해 개발됨). 상기 마우스는 FVB 백그라운드로 역교배된 마우스의 두번째 세대이다. 상기 트랜스진은 핵에 유지되는 CUG 반복부 RNA로서 마우스에서 발현되어, 근육긴장성 이영양증(DM1)을 갖는 환자의 인간 조직 샘플에서 관찰되는 것과 유사한 핵내 봉입체 또는 초점을 형성한다. DMPK 트랜스진에는 350-400개의 CUG 반복부가 존재한다. 이러한 마우스는 DM1의 초기 징후를 나타내고, 근육 조직 내에서 어떠한 근육긴장증도 나타내지 않는다.
시험관내에서 통계적으로 유의한 용량 의존적 억제를 나타낸 ISIS 445569, ISIS 444404, ISIS 444436 및 ISIS 473810(실시예 5 참조)을 생체내에서 인간 DMPK RNA 전사물을 감소시키는 능력에 대해 평가하였다.
처리
LC15 계통 A 마우스를 12시간의 명/암 주기로 유지시키고, 일반적인 퓨리나(Purina) 마우스 먹이를 무제한적으로 공급하였다. 동물을 실험 개시 전에 연구 시설에서 적어도 7일 동안 새 환경에 순응시켰다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 PBS에서 제조하였고, 0.2 마이크론 필터를 통한 여과에 의해 멸균시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 주사를 위해 0.9% PBS에 용해시켰다.
마우스를 5개의 처리군으로 나누었다. 처음 3개의 군에 4주 동안 주 당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 445569, ISIS 444404 또는 ISIS 444436을 피하 주사로 투여하였다. 네번째 군에 4주 동안 주 당 2회로 12.5 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 473810을 피하 주사로 투여하였다. 다섯번째 군에 4주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다.
DMPK RNA 의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육으로부터 조직을 분리시켰다. DMPK의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 38에 제시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 인간 DMPK RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 PBS 대조군에 비한 DMPK 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
표 38: LC15 마우스에서의 인간 DMPK RNA 전사물의 안티센스 억제
Figure pct00085
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. LC15 마우스는 근육긴장증을 갖지 않으므로, 대조군 및 처리군은 시험된 임의의 근육에서 어떠한 근육긴장증도 나타내지 않았다.
실시예 24: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 DMPK 의 생체내 안티센스 억제
LC15 마우스 계통 D는 전체 인간 DMPK 3'UTR을 함유하는 트랜스제닉 마우스이다(휠러 등(Wheeler et al, University of Rochester)에 의해 개발됨). 상기 마우스는 FVB 백그라운드로 역교배된 마우스의 세번째 세대이다. 상기 트랜스진은 핵에 유지되는 CUG 반복부 RNA로서 마우스에서 발현되어, 근육긴장성 이영양증(DM1)을 갖는 환자의 인간 조직 샘플에서 관찰되는 것과 유사한 핵내 봉입 또는 초점을 형성한다. DMPK 트랜스진에는 350-400개의 CUG 반복부가 존재한다. 이러한 마우스는 DM1의 초기 징후를 나타내고, 근육 조직 내에서 어떠한 근육긴장증도 나타내지 않는다.
ISIS 445569, ISIS 444404, ISIS 444436 및 ISIS 473810을 생체내에서 인간 DMPK RNA 전사물을 감소시키는 이의 능력에 대해 추가로 평가하였다.
처리
LC15 계통 D 마우스를 12시간의 명/암 주기로 유지시키고, 일반적인 퓨리나(Purina) 마우스 먹이를 무제한적으로 공급하였다. 동물을 실험 개시 전에 연구 시설에서 적어도 7일 동안 새 환경에 순응시켰다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 PBS에서 제조하였고, 0.2 마이크론 필터를 통한 여과에 의해 멸균시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 주사를 위해 0.9% PBS에 용해시켰다.
마우스를 6개의 처리군으로 나누었다. 처음 3개의 군에 4주 동안 주 당 2회로 25.00 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 445569, ISIS 444404 또는 ISIS 444436을 피하 주사로 투여하였다. 네번째 군에 4주 동안 주 당 2회로 12.50 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 473810을 피하 주사로 투여하였다. 다섯번째 군에 4주 동안 주 당 2회로 6.25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 473810을 피하 주사로 투여하였다. 여섯번째 군에 4주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다.
DMPK RNA 의 억제
최종 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육으로부터 조직을 분리시켰다. DMPK의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 39에 제시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리는 인간 DMPK RNA 전사물 발현을 감소시켰다. 결과는 PBS 대조군에 비한 DMPK 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
상기 결과는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리가 마우스에서 DMPK mRNA의 억제를 발생시킨 것을 나타낸다.
표 39: LC15 마우스에서의 인간 DMPK RNA 전사물의 안티센스 억제
Figure pct00086
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. LC15 마우스는 근육긴장증을 갖지 않으므로, 대조군 및 처리군은 시험된 임의의 근육에서 어떠한 근육긴장증도 나타내지 않았다.
실시예 25: SXL 트랜스제닉 마우스 모델에서의 인간 DMPK 의 생체내 안티센스 억제
hDMPK-표적화 ASO를 이용하여, 가자미근에서의 444401 및 299471 표적 넉다운을 SXL 마우스에서 측정하였다. SXL 마우스는 전체 DMPK 유전자 및 프로모터에 대해 트랜스제닉이고, DMPK 유전자의 3'UTR에 1000개의 CUG 반복부 서열을 함유한다. 마우스에 4주 동안 주 당 2회로 50㎎/㎏을 투여하였다(n= 군 당 3마리의 마우스, n= 염수 주사된 대조군에 대한 2마리는 예외). Taqman 검정의 결과는 ISISI 444401 또는 ISIS 299471을 이용한 처리가 mut-hDMPK mRNA 수준을 유의하게 감소시켰으나, 내인성 마우스 Dmpk mRNA 수준에는 사소하게 영향을 미친 것을 나타내었다.
따라서, ISIS 444401 및 ISIS 299471은 인간 DMPK mRNA 전사물을 선별적으로 표적화한다.
실시예 26: 트랜스제닉 마우스에서의 인간 알파1 액틴을 표적으로 하는 올리 고뉴클레오타이드에 의한 안티센스 억제의 작용 기간
HSALR 마우스에서의 ISIS 190401에 의한 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 안티센스 억제의 작용 기간을 평가하였다.
처리
HSALR 마우스에 4주 동안 주 당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 190401을 피하 주사로 투여하였다. 대조군에 4주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다. 마우스를 마지막 용량의 투여 후에 15주 동안 분석하였다.
알파1 액틴 RNA 의 억제
최종 투여 15주 후, 동물을 희생시키고, 대퇴사두근 근육, 장딴지근 근육 및 앞정강근 근육으로부터 조직을 분리시켰다. 알파1 액틴의 실시간 PCR 분석을 위해 RNA를 분리시키고, 18s RNA에 대해 표준화시켰다. 표 40에 제시된 바와 같이, ISIS 190401을 이용한 처리는 인간 알파1 액틴 RNA 전사물 발현을 감소시켰고, 이러한 효과는 적어도 15주 동안 지속되었다. 결과는 PBS 대조군에 비한 알파1 액틴 전사물의 억제 퍼센트로 표현된다.
ISIS 190401을 이용한 처리는 상기 특정된 조건하에서 알파1 액틴 mRNA 수준의 유의한 억제를 발생시켰다.
표 40: HSALR 마우스에서의 인간 알파1 액틴 RNA 전사물의 안티센스 억제
Figure pct00087
근전도검사에 의한 근육긴장증의 평가
좌측 및 우측 대퇴사두근, 좌측 및 우측 장딴지근 근육, 좌측 및 우측 앞정강근 근육 및 요추 척추옆 근육에 대한 근전도검사를 30 게이지 동심 바늘 전극 및 각각의 근육에 대한 최소 10회의 바늘 삽입을 이용하여 이전에 기재(Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980)된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각의 군의 4마리의 마우스에서 관찰된 평균 근육긴장증 등급으로서 표 41에 제시되고, 이는 ISIS 190401로 처리된 마우스에서의 근육긴장증의 유의한 감소를 나타내었다. 따라서, ISIS 190401에 의한 알파 액틴의 안티센스 억제의 효과는 적어도 15주 동안 지속되었다.
표 41: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스의 다양한 근육에서의 근육긴장증의 평균 감소
Figure pct00088
대안적 스플라이싱의 교정
Serca1의 대안적 스플라이싱에 대한 ISIS 190401의 효과를 평가하기 위해, 앞정강근 장딴지근 및 대퇴사두근 근육으로부터 정제된 전체 RNA를 실시예 13에 기재된 것과 유사한 절차로 분석하였다.
PBS 처리된 HSALR 마우스에서, Serca1 스플라이싱은 엑손 22 배제에 의해 입증되는 바와 같이 이상조절된다. ISIS 190401을 이용한 처리는 모든 3개의 근육 유형에서 완전한 봉입 및 Serca1 유전자의 엑손 22의 대안적 스플라이싱의 정상화를 발생시켰고, 이는 15주 후에도 지속되었다.
따라서, 알파1 액틴의 안티센스 억제는 Serca1 스플라이싱 이상조절을 교정하였고, 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리가 핵 초점에서 CUGexp의 축적을 감소시킨 것을 나타낸다. 핵 초점 내의 CUGexp의 감소된 축적은 MBLN1 격리를 교정함으로써, 정상적인 스플라이싱이 발생하도록 한다.
실시예 27: 인간 액틴의 안티센스 억제의 전사체적 효과( transcriptomic effect)의 마이크로어레이 분석
확장된 CUG 반복부를 갖는 액틴 mRNA의 발현은 근육 전사체의 광범위한 리모델링을 야기시킨다. ISIS 190401 및 ISIS 445236의 전체 전사체적 효과를 평가하기 위해, 마이크로어레이 분석을 HSALR 마우스에서 이용하였다.
처리
HSALR 마우스에 4주 동안 주당 2회로 25 ㎎/㎏의 용량으로 ISIS 190401 또는 ISIS 445236을 피하 주사로 투여하였다. 대조군에 4주 동안 주 당 2회로 PBS를 피하 주사로 투여하였다. PBS 주사된 군은 올리고뉴클레오타이드 처리군과 비교되는 대조군으로 작용하였다.
마이크로어레이에 의한 전사체 분석
야생형 또는 HSALR 마우스의 대퇴사두근 근육으로부터 RNA를 분리시켰다. Agilent Bioanalyzer를 이용하여 RNA 온전성을 확인하였다(RNA 온전성 수 > 7.5). RNA를 상보성 RNA(cRNA)로 처리하고, 제조업체의 권고에 따라 MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChip Kits(Illumina, San Diego)를 이용하여 마이크로비드 상에 하이브리드화시켰다. 이미지 데이터를 BeadStudio 소프트웨어(Illumina)를 이용하여 정량하였다. 신호 강도를 분위수 표준화시켰다. 표준화 전에 2 미만의 임의의 값을 피하기 위해 열-특이적 오프셋(Row-specific offset)을 이용하였다. 하이브리드화 혼합물 내의 확장된 반복부(mRNA 내의 CUG 반복부로부터 유래되는 cRNA 내의 CAG 반복부)가 프로브 내의 반복부 서열과 교차 하이브리드화될 수 있는 가능성을 배제시키기 위해 CUG, UGC 또는 GCU 반복부의 6개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 모든 프로브 세트로부터의 데이터를 삭제하였다. 발현이 어레이에서 용이하게 정량되지 않는 유전자를 배제시키기 위해, 0.1 미만의 검출 확률에 대한 P 값을 나타내는 프로브를 모든 샘플에서 삭제하였다. 군 사이의 비교를 요약하고, 평균 발현 수준 및 t 시험의 변화 배수에 의해 순위를 매겼다. 야생형 샘플, ISIS 올리고뉴클레오타이드-처리 샘플 및 PBS-처리 마이크로어레이 샘플에 대한 주요 구성요소 분석(Levin et al. In Antisense Drug Technology : Principles , Strategies , and Applications, S.T. Crooke, Ed. (CRC Press, Boca Raton, 2008), pp 183-215; Geary et al . Drug Metab . Dispos. 2003; 31: 1419-28)을 수행하기 위해 소프트웨어 패키지 R(Butler et al . Diabetes. 2002; 51: 1028-34)을 이용하였다. 주요 구성요소는 3차원 내의 각각의 샘플의 발현 변화의 대부분의 포획을 가능케 한다. 각각의 샘플의 처음 3개의 주요 구성요소를 작도하였다.
미처리된 야생형 및 HSALR 마우스의 주요 구성요소 분석은 광범위하게 군집을 이룬 집단의 야생형 마우스로부터 떨어진 HSALR의 격리를 나타내었다. 대조적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스는 야생형 마우스에 보다 근접하게 군집을 이루었고, 이는 전반적인 전사체 정상화의 경향을 암시한다. HSALR 트랜스제닉 마우스와 야생형 마우스의 비교로 하기 표 42에 제시되는 바와 같이 발현 수준이 2배 이상 변경(P < 0.0001)된 93개의 전사물을 확인하였다. 상기 전사물에 대한 이상조절의 정도는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 감소되거나 정상화되었다(ISIS 445236에 반응된 88%의 이상조절된 전사물, ISIS 445236에 대해 P < 0.05, 대 ISIS 190401에 대해 90%가 반응된 PBS 대조군).
표적외(off-target) 넉다운을 갖는 전사물을 고려하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 HSALR 마우스에서 발현이 감소된 모든 전사물을 확인하였다(어느 하나의 올리고뉴클레오타이드에 의한 2배를 초과하는 감소, P < 0.0001, n = 41 전사물). 상기 기준에 의해 하향 조절된 모든 전사물은 HSALR 마우스에서 상향조절을 나타내었다. 유일한 예외인 콜라겐 6 알파2는 표적외 절단으로부터 발생할 가능성이 없는데, 이는 상기 콜라겐 6 알파2가 비중첩 서열을 갖는 2개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 하향조절되었기 때문이다.
이러한 결과는 4주 동안의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 처리가 표적외 효과에 대한 어떠한 증거 없이 근육 전사체의 전반적 개선을 발생시킨 것을 나타낸다.
표 42: HSALR 트랜스제닉 마우스와 야생형 마우스의 확인된 93개의 전사물의 비교
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
SEQUENCE LISTING <110> C. Frank Bennett Susan M. Freier Robert A. MacLeod Sanjay K. Pandey Charles A. Thornton Thurman Wheeler Seng H. Cheng Andrew Leger Bruce M. Wentworth <120> MODULATION OF DYSTROPHIA MYOTONICA-PROTEIN KINASE (DMPK) EXPRESSION <130> BIOL0134WO <140> PCT/US2011/044555 <141> 2011-07-19 <150> 61/365,775 <151> 2010-07-19 <150> 61/365,762 <151> 2010-07-19 <150> 61/478,021 <151> 2011-04-21 <160> 837 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2877 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aggggggctg gaccaagggg tggggagaag gggaggaggc ctcggccggc cgcagagaga 60 agtggccaga gaggcccagg ggacagccag ggacaggcag acatgcagcc agggctccag 120 ggcctggaca ggggctgcca ggccctgtga caggaggacc ccgagccccc ggcccgggga 180 ggggccatgg tgctgcctgt ccaacatgtc agccgaggtg cggctgaggc ggctccagca 240 gctggtgttg gacccgggct tcctggggct ggagcccctg ctcgaccttc tcctgggcgt 300 ccaccaggag ctgggcgcct ccgaactggc ccaggacaag tacgtggccg acttcttgca 360 gtgggcggag cccatcgtgg tgaggcttaa ggaggtccga ctgcagaggg acgacttcga 420 gattctgaag gtgatcggac gcggggcgtt cagcgaggta gcggtagtga agatgaagca 480 gacgggccag gtgtatgcca tgaagatcat gaacaagtgg gacatgctga agaggggcga 540 ggtgtcgtgc ttccgtgagg agagggacgt gttggtgaat ggggaccggc ggtggatcac 600 gcagctgcac ttcgccttcc aggatgagaa ctacctgtac ctggtcatgg agtattacgt 660 gggcggggac ctgctgacac tgctgagcaa gtttggggag cggattccgg ccgagatggc 720 gcgcttctac ctggcggaga ttgtcatggc catagactcg gtgcaccggc ttggctacgt 780 gcacagggac atcaaacccg acaacatcct gctggaccgc tgtggccaca tccgcctggc 840 cgacttcggc tcttgcctca agctgcgggc agatggaacg gtgcggtcgc tggtggctgt 900 gggcacccca gactacctgt cccccgagat cctgcaggct gtgggcggtg ggcctgggac 960 aggcagctac gggcccgagt gtgactggtg ggcgctgggt gtattcgcct atgaaatgtt 1020 ctatgggcag acgcccttct acgcggattc cacggcggag acctatggca agatcgtcca 1080 ctacaaggag cacctctctc tgccgctggt ggacgaaggg gtccctgagg aggctcgaga 1140 cttcattcag cggttgctgt gtcccccgga gacacggctg ggccggggtg gagcaggcga 1200 cttccggaca catcccttct tctttggcct cgactgggat ggtctccggg acagcgtgcc 1260 cccctttaca ccggatttcg aaggtgccac cgacacatgc aacttcgact tggtggagga 1320 cgggctcact gccatggaga cactgtcgga cattcgggaa ggtgcgccgc taggggtcca 1380 cctgcctttt gtgggctact cctactcctg 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gccgaccttg ctttactcag ccccgacgtg gatgggcaaa ctgctcagct catccgattt 2460 cactttttca ctctcccagc catcagttac aagccataag catgagcccc ctatttccag 2520 ggacatccca ttcccatagt gatggatcag caagacctct gccagcacac acggagtctt 2580 tggcttcgga cagcctcact cctgggggtt gctgcaactc cttccccgtg tacacgtctg 2640 cactctaaca acggagccac agctgcactc ccccctcccc caaagcagtg tgggtattta 2700 ttgatcttgt tatctgactc actgacagac tccgggaccc acgttttaga tgcattgaga 2760 ctcgacattc ctcggtattt attgtctgtc cccacctacg acctccactc ccgacccttg 2820 cgaataaaat acttctggtc tgccctaaaa aaaaaaaaaa aa 2862 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 agcctgagcc gggagatg 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gcgtagttga ctggcgaagt t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 11 aggccatccg cacggacaac c 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 ctggctgcat gtctgcctgt 20 <210> 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gatccccgcc gagatggctc gcttctacct 180 ggccgagatt gtcatggcca tagactccgt gcaccggctg ggctacgtgc acagggacat 240 caaaccagat aacattctgc tggaccgatg tgggcacatt cgcctggcag acttcggctc 300 ctgcctcaaa ctgcagcctg atggaatggt gaggtcgctg gtggctgtgg gcaccccgga 360 ctacctgtct cctgagattc tgcaggccgt tggtggaggg cctggggcag gcagctacgg 420 gccagagtgt gactggtggg cactgggcgt gttcgcctat gagatgttct atgggcagac 480 ccccttctac gcggactcca cagccgagac atatgccaag attgtgcact acagggaaca 540 cttgtcgctg ccgctggcag acacagttgt ccccgaggaa gctcaggacc tcattcgtgg 600 gctgctgtgt cctgctgaga taaggctagg tcgaggtggg gcaggtgatt tccagaaaca 660 tcctttcttc tttggccttg attgggaggg tctccgagac agtgtacccc cctttacacc 720 agacttcgag ggtgccacgg acacatgcaa tttcgatgtg gtggaggacc ggctcactgc 780 catggagacg ctgtcagaca tgcaggaaga catgcccctt ggggtgcgcc tgcccttcgt 840 gggctactcc tactgctgca tggccttcag agctgaagag gccgacctag tggctgtccc 900 tgcccctgtg gctgaggcag agaccacggt aacgctgcag cagctccagg aagccctgga 960 agaagaggtt ctcacccggc agagcctgag ccgcgagctg gaggccatcc ggaccgccaa 1020 ccagaacttc tccagccaac tacaggaggc cgaggtccga aaccgagacc tggaggcgca 1080 tgttcggcag ctacaggaac ggatggagat gctgcaggcc ccaggagccg cagccatcac 1140 gggggtcccc agtccccggg ccacggatcc accttcccat atggcccccc ggccgtggct 1200 gtgggccagt gcccgctggt ggggccaggc cccatgcacc gccgtcacct gctgctccct 1260 gccaggatcc ctaggcctgg cctatccgag gcgcgttgcc tgctcctgtt cgccgctgct 1320 ctggctgctg ccgccacact gggctgcact gggttggtgg cctataccgg cggtctcacc 1380 ccagtctggt gtttcccggg agccaccttc gccccctgaa ccctaagact ccaagccatc 1440 tttcatttag gcctcctagg aagatcgagc gaccagggag cgacccaaag cgtctctgtg 1500 cccatcgccc cccccccccc ccccaccgct ccgctccaca cttctgtgag cctgggtccc 1560 cacccagctc cgctcctgtg atccaggcct gccacctggc ggccggggag ggaggaacag 1620 ggctcgtgcc cagcacccct ggttcctgca gagctggtag ccaccgctgc tgcagcagct 1680 gggcattcgc cgaccttgct ttactcagcc ctgacgtgga tgggctaact gctcagctca 1740 tccgatttca ctttttcact ctcccagcca tcagttacaa gccataagca tgagccccct 1800 atttccaggg acatcccatt cccatagtga tggatcagca agacctctgc cagcacacac 1860 ggagtctttg gcttcggaca gcctcactcc tgggggttgc tgcaactcct tccccgtgta 1920 cacgtctgca ctctaacaac ggagccacag ctgcactccc ccctccccca aagcagtgtg 1980 ggtatttatt gatcttgtta tctgactcac tgacagactc cgggacccac gttttagatg 2040 cattgagact cgacattcct cggtatttat tgtctgtccc cacctacgac ctccactccc 2100 gacccttgcg aataaaatac ttctggtctg cccta 2135 <210> 800 <211> 2873 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 800 aggggggctg gaccaagggg tggggagaag gggaggaggc ctcggccggc cgcagagaga 60 agtggccaga gaggcccagg ggacagccag ggacaggcag acatgcagcc agggctccag 120 ggcctggaca ggggctgcca ggccctgtga caggaggacc ccgagccccc ggcccgggga 180 ggggccatgg tgctgcctgt ccaacatgtc agccgaggtg cggctgaggc ggctccagca 240 gctggtgttg gacccgggct tcctggggct ggagcccctg ctcgaccttc tcctgggcgt 300 ccaccaggag ctgggcgcct ccgaactggc ccaggacaag tacgtggccg acttcttgca 360 gtgggcggag cccatcgtgg tgaggcttaa ggaggtccga ctgcagaggg acgacttcga 420 gattctgaag gtgatcggac gcggggcgtt cagcgaggta gcggtagtga agatgaagca 480 gacgggccag gtgtatgcca tgaagatcat gaacaagtgg gacatgctga agaggggcga 540 ggtgtcgtgc ttccgtgagg agagggacgt gttggtgaat ggggaccggc ggtggatcac 600 gcagctgcac ttcgccttcc aggatgagaa ctacctgtac ctggtcatgg agtattacgt 660 gggcggggac ctgctgacac tgctgagcaa gtttggggag cggattccgg ccgagatggc 720 gcgcttctac ctggcggaga ttgtcatggc catagactcg gtgcaccggc ttggctacgt 780 gcacagggac atcaaacccg acaacatcct gctggaccgc tgtggccaca tccgcctggc 840 cgacttcggc tcttgcctca agctgcgggc agatggaacg gtgcggtcgc tggtggctgt 900 gggcacccca gactacctgt cccccgagat cctgcaggct gtgggcggtg ggcctgggac 960 aggcagctac gggcccgagt gtgactggtg ggcgctgggt gtattcgcct atgaaatgtt 1020 ctatgggcag acgcccttct acgcggattc cacggcggag acctatggca agatcgtcca 1080 ctacaaggag cacctctctc tgccgctggt ggacgaaggg gtccctgagg aggctcgaga 1140 cttcattcag cggttgctgt gtcccccgga gacacggctg ggccggggtg gagcaggcga 1200 cttccggaca catcccttct tctttggcct cgactgggat ggtctccggg acagcgtgcc 1260 cccctttaca ccggatttcg aaggtgccac cgacacatgc aacttcgact tggtggagga 1320 cgggctcact gccatggaga cactgtcgga cattcgggaa ggtgcgccgc taggggtcca 1380 cctgcctttt gtgggctact cctactcctg catggccctc agggacagtg aggtcccagg 1440 ccccacaccc atggaactgg aggccgagca gctgcttgag ccacacgtgc aagcgcccag 1500 cctggagccc tcggtgtccc cacaggatga aacagctgaa gtggcagttc cagcggctgt 1560 ccctgcggca gaggctgagg ccgaggtgac gctgcgggag ctccaggaag ccctggagga 1620 ggaggtgctc acccggcaga gcctgagccg ggagatggag gccatccgca cggacaacca 1680 gaacttcgcc agtcaactac gcgaggcaga ggctcggaac cgggacctag aggcacacgt 1740 ccggcagttg caggagcgga tggagttgct gcaggcagag ggagccacag ctgtcacggg 1800 ggtccccagt ccccgggcca cggatccacc ttcccatatg gccccccggc cgtggctgtg 1860 ggccagtgcc cgctggtggg gccaggcccc atgcaccgcc gccacctgct gctccctgcc 1920 agggtcccta ggcctggcct atcggaggcg ctttccctgc tcctgttcgc cgttgttctg 1980 tctcgtgccg ccgccctggg ctgcattggg ttggtggccc acgccggcca actcaccgca 2040 gtctggcgcc gcccaggagc cgcccgcgct ccctgaaccc tagaactgtc ttcgactccg 2100 gggccccgtt ggaagactga gtgcccgggg cacggcacag aagccgcgcc caccgcctgc 2160 cagttcacaa ccgctccgag cgtgggtctc cgcccagctc cagtcctgtg atccgggccc 2220 gccccctagc ggccggggag ggaggggccg ggtccgcggc cggcgaacgg ggctcgaagg 2280 gtccttgtag ccgggaatgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 2340 gctgctgctg ctgctgctgg ggggatcaca gaccatttct ttctttcggc caggctgagg 2400 ccctgacgtg gatgggcaaa ctgcaggcct gggaaggcag caagccgggc cgtccgtgtt 2460 ccatcctcca cgcaccccca cctatcgttg gttcgcaaag tgcaaagctt tcttgtgcat 2520 gacgccctgc tctggggagc gtctggcgcg atctctgcct gcttactcgg gaaatttgct 2580 tttgccaaac ccgctttttc ggggatcccg cgcccccctc ctcacttgcg ctgctctcgg 2640 agccccagcc ggctccgccc gcttcggcgg tttggatatt tattgacctc gtcctccgac 2700 tcgctgacag gctacaggac ccccaacaac cccaatccac gttttggatg cactgagacc 2760 ccgacattcc tcggtattta ttgtctgtcc ccacctagga cccccacccc cgaccctcgc 2820 gaataaaagg ccctccatct gcccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2873 <210> 801 <211> 1509 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 801 ccaccgcagc ggacagcgcc aagtgaagcc tcgcttcccc tccgcggcga ccagggcccg 60 agccgagagt agcagttgta gctacccgcc cagaaactag acacaatgtg cgacgaagac 120 gagaccaccg ccctcgtgtg cgacaatggc tccggcctgg tgaaagccgg cttcgccggg 180 gatgacgccc ctagggccgt gttcccgtcc atcgtgggcc gcccccgaca ccagggcgtc 240 atggtcggta tgggtcagaa agattcctac gtgggcgacg aggctcagag caagagaggt 300 atcctgaccc tgaagtaccc tatcgagcac ggcatcatca ccaactggga tgacatggag 360 aagatctggc accacacctt ctacaacgag cttcgcgtgg ctcccgagga gcaccccacc 420 ctgctcaccg aggcccccct caatcccaag gccaaccgcg agaagatgac ccagatcatg 480 tttgagacct tcaacgtgcc cgccatgtac gtggccatcc aggccgtgct gtccctctac 540 gcctccggca ggaccaccgg catcgtgctg gactccggcg acggcgtcac ccacaacgtg 600 cccatttatg agggctacgc gctgccgcac gccatcatgc gcctggacct ggcgggccgc 660 gatctcaccg actacctgat gaagatcctc actgagcgtg gctactcctt cgtgaccaca 720 gctgagcgcg agatcgtgcg cgacatcaag gagaagctgt gctacgtggc cctggacttc 780 gagaacgaga tggcgacggc cgcctcctcc tcctccctgg aaaagagcta cgagctgcca 840 gacgggcagg tcatcaccat cggcaacgag cgcttccgct gcccggagac gctcttccag 900 ccctccttca tcggtatgga gtcggcgggc attcacgaga ccacctacaa cagcatcatg 960 aagtgtgaca tcgacatcag gaaggacctg tatgccaaca acgtcatgtc ggggggcacc 1020 acgatgtacc ctgggatcgc tgaccgcatg cagaaagaga tcaccgcgct ggcacccagc 1080 accatgaaga tcaagatcat cgccccgccg gagcgcaaat actcggtgtg gatcggcggc 1140 tccatcctgg cctcgctgtc caccttccag cagatgtgga tcaccaagca ggagtacgac 1200 gaggccggcc cttccatcgt ccaccgcaaa tgcttctaga cacactccac ctccagcacg 1260 cgacttctca ggacgacgaa tcttctcaat gggggggcgg ctgagctcca gccaccccgc 1320 agtcactttc tttgtaacaa cttccgttgc tgccatcgta aactgacaca gtgtttataa 1380 cgtgtacata cattaactta ttacctcatt ttgttatttt tcgaaacaaa gccctgtgga 1440 agaaaatgga aaacttgaag aagcattaaa gtcattctgt taagctgcgt aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaa 1509 <210> 802 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 802 gcagcagcag cagcagcag 19 <210> 803 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 803 gcagcagcag cagcagcag 19 <210> 804 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 804 agcagcagca gcagcagcag 20 <210> 805 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 805 gcagcagcag cagcagca 18 <210> 806 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 806 agcagcagca gcagcagca 19 <210> 807 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 807 agcagcagca gcagca 16 <210> 808 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 808 ctcccgacaa gctcca 16 <210> 809 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 809 tcccgacaag ctcc 14 <210> 810 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 810 gcttgcacgt gtggct 16 <210> 811 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 811 cttgcacgtg tggc 14 <210> 812 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 812 ggttgtgaac tggcag 16 <210> 813 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 813 gttgtgaact ggca 14 <210> 814 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 814 gagcggttgt gaactg 16 <210> 815 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 815 agcggttgtg aact 14 <210> 816 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 816 gctgccttcc caggcc 16 <210> 817 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 817 ctgccttccc aggc 14 <210> 818 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 818 gcactttgcg aaccaa 16 <210> 819 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 819 cactttgcga acca 14 <210> 820 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 820 gaaagctttg cacttt 16 <210> 821 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 821 aaagctttgc actt 14 <210> 822 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 822 cggaggacga ggtcaa 16 <210> 823 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 823 ggaggacgag gtca 14 <210> 824 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 824 agcctgtcag cgagtc 16 <210> 825 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 825 gcctgtcagc gagt 14 <210> 826 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 826 tcctgtagcc tgtcag 16 <210> 827 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 827 cctgtagcct gtca 14 <210> 828 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 828 gaagcgaggc ttcact 16 <210> 829 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 829 aagcgaggct tcac 14 <210> 830 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 830 acctgcccgt ctggca 16 <210> 831 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 831 cctgcccgtc tggc 14 <210> 832 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 832 ggtcagcgat cccagg 16 <210> 833 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 833 gtcagcgatc ccag 14 <210> 834 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 834 attttcttcc acaggg 16 <210> 835 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 835 ttttcttcca cagg 14 <210> 836 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 836 gaatgacttt aatgct 16 <210> 837 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 837 aatgacttta atgc 14

Claims (124)

  1. CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소(preferential reduction)를 달성하는 방법으로서,
    a. 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 CUGexp DMPK RNA를 갖는 피검체를 선별하는 단계; 및
    b. 상기 CUGexp DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 피검체에 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 상기 CUGexp DMPK RNA에 결합하는 경우 리보누클레아제를 활성화시킴으로써 상기 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성하는 것인 방법.
  2. CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성하는 방법으로서,
    a. 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 CUGexp DMPK RNA를 갖는 피검체를 선별하는 단계; 및
    b. 상기 CUGexp DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 피검체에 전신 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 상기 CUGexp DMPK RNA에 결합하는 경우 상기 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성하는 것인 방법.
  3. CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성하는 방법으로서,
    타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 CUGexp DMPK RNA를 갖는 것으로 의심되는 피검체에 상기 CUGexp DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 상기 CUGexp DMPK RNA에 결합하는 경우 상기 CUGexp DMPK RNA의 선택적 감소를 달성하는 것인 방법.
  4. 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 핵 유지된 CUGexp DMPK RNA를 갖는 것으로 의심되는 피검체의 근육긴장증을 감소시키는 방법으로서,
    상기 DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 피검체에 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 상기 DMPK RNA에 결합하는 경우 리보누클레아제를 활성화시킴으로써 근육긴장증을 감소시키는 것인 방법.
  5. 타입 1 근육긴장성 이영양증 또는 핵 유지된 CUGexp DMPK RNA를 갖는 것으로 의심되는 피검체의 스플라이스오패시(spliceopathy)를 감소시키는 방법으로서,
    돌연변이 DMPK RNA의 비-반복부 영역에 상보적인 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 피검체에 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 상기 돌연변이 DMPK RNA에 결합하는 경우 리보누클레아제를 활성화시킴으로써 스플라이스오패시를 감소시키는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 스플라이스오패시는 MBNL 의존성 스플라이스오패시인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 키메라 올리고뉴클레오타이드인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 갭머(gapmer)인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 피하 투여인 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 투여인 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 갭머 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이 DMPK RNA의 비-반복부 영역 내의 비-코딩 서열을 표적으로 하는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 갭머 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이 DMPK RNA의 코딩 영역, 인트론, 5'UTR 또는 3'UTR을 표적으로 하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리보누클레아제는 RNase H1인 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적 감소가 근육 조직 내에서 발생하는 것인 방법.
  15. 동물의 DMPK 발현을 감소시키는 방법으로서,
    DMPK를 표적으로 하는 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드 길이의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하되, DMPK의 발현이 동물에서 감소되는 것인 방법.
  16. 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 방법으로서,
    DMPK를 표적으로 하는 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드 길이의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하되, 변형된 올리고뉴클레오타이드가 동물의 DMPK 발현을 감소시킴으로써 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 것인 방법.
  17. 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 치료하는 방법으로서,
    a. 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 확인하는 단계; 및
    b. DMPK를 표적으로 하는 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드 길이의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물이 치료되는 것인 방법.
  18. DMPK 발현을 감소시키는 방법으로서, 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정 시 서열번호 1-8 또는 793-801에 적어도 90% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하되, DMPK의 발현이 감소되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, DMPK 발현을 감소시키는 것이 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 것인 방법.
  20. 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 방법으로서, 테트라트리코펩티드 반복부 도메인 39B의 발현을 감소시키는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하되, 변형된 올리고뉴클레오타이드가 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정 시 서열번호 1-8 또는 793-801에 적어도 90% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되고, 상기 CUGexp DMPK RNA의 감소가 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 것인 방법.
  21. 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 치료하는 방법으로서,
    c. 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물을 확인하는 단계; 및
    d. 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정 시 서열번호 1-8 또는 793-801에 적어도 90% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 치료적 유효량의 화합물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 타입 1 근육긴장성 이영양증을 지닌 동물이 치료되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 동물에게 투여되는 치료적 유효량의 화합물이 동물에서 CUGexp DMPK RNA를 선택적으로 감소시키거나, 근육긴장증을 감소시키거나, 스플라이스오패시를 감소시키는 것인 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 것인 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 인간인 것인 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 첫번째 작용제이고, 두번째 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 첫번째 작용제와 상기 두번째 작용제는 공동 투여되는 것인 방법.
  27. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 비경구 투여를 포함하는 것인 방법.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 단일-가닥의 변형된 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 것인 방법.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정 시 서열번호 1-8 또는 793-801 중 어느 하나와 적어도 95% 상보적인 것인 방법.
  30. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정 시 서열번호 1-8 또는 793-801 중 어느 하나와 100% 상보적인 것인 방법.
  31. 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합은 변형된 뉴클레오사이드간 결합인 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 각각의 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합인 것인 방법.
  33. 제15항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 뉴클레오사이드는 변형된 당을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당이 바이사이클릭 당인 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당이 2'-O-메톡시에틸, 또는 n이 1 또는 2인 4'-(CH2)n-O-2' 브릿지를 포함하는 것인 방법.
  36. 제15항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 뉴클레오사이드는 변형된 핵염기를 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신인 것인 방법.
  38. 제15항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는,
    a. 결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
    b. 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
    c. 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
    상기 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 변형된 당을 포함하는 것인 방법.
  39. 제15항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되고,
    a. 10개의 결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
    b. 5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
    c. 5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
    상기 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 사이토신이 5'-메틸사이토신인 것인 방법.
  40. 제15항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 것인 방법.
  41. 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792에 열거된 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드인 것인 화합물.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호 1-8 또는 793-801에 100% 상보적인 것인 화합물.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합은 변형된 뉴클레오사이드간 결합인 것인 화합물.
  45. 제44항에 있어서, 각각의 뉴클레오사이드간 결합이 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합인 것인 화합물.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드가 변형된 당을 포함하는 것인 화합물.
  47. 제46항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당이 바이사이클릭 당인 것인 화합물.
  48. 제46항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당이 2'-O-메톡시에틸을 포함하는 것인 화합물.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드가 변형된 핵염기를 포함하는 것인 화합물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신인 것인 화합물.
  51. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는,
    결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
    결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
    결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
    상기 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 변형된 당을 포함하는 것인 화합물.
  52. 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되고,
    10개의 결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
    5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트;
    5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
    상기 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되며, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드간 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것인 화합물.
  53. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 것인 화합물.
  54. 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792 중 어느 하나에 열거된 서열로부터 선별된 핵염기 서열의 적어도 8개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드인 것인 조성물.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 것인 조성물.
  57. 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되고, 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792에 열거된 핵염기 서열 중에서 선별된 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  58. 제57항에 있어서, 단일 가닥의 변형된 올리고뉴클레오타이드로 구성되는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호 1-8 또는 793-801에 100% 상보적인 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합이 변형된 뉴클레오사이드간 결합인 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  61. 제60항에 있어서, 각각의 뉴클레오사이드간 결합이 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합인 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드가 변형된 당을 포함하는 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  63. 제62항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당이 바이사이클릭 당인 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  64. 제62항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당이 2'-O-메톡시에틸을 포함하는 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드가 변형된 핵염기를 포함하는 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  66. 제65항에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신인 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  67. 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는
    결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
    결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
    결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고,
    상기 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되며, 각각의 윙 세그먼트의 68개의 각각의 뉴클레오사이드가 변형된 당을 포함하는 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  68. 제57항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는
    10개의 결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
    5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
    5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고,
    상기 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트와 3'윙 세그먼트 사이에 위치되며, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신이며, 각각의 뉴클레오사이드간 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  69. 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 것인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  70. 서열번호 1의 핵염기 1178-1206, 2159-2182, 2174-2196, 2426-2447, 2450-2518, 2679-2704 또는 2697-2725의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열이 서열번호 1에 상보적인 것인 화합물.
  71. 핵염기 178-223, 232-253, 279-299, 366-399, 519-541, 923-975, 1073-1105, 1171-1196, 1215-1246, 1263-1324, 1706-1734, 1743-1763, 1932-1979, 1981-2003, 2077-2108 또는 2152-2173의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열이 서열번호 1에 상보적인 것인 화합물.
  72. 핵염기 1251-1303, 1305-1326, 1352-1372, 3762-3795, 4170-4192, 5800-5852, 6124-6149, 6168-6199, 6216-6277, 11979-12007, 12016-12036, 12993-13042, 13044-13066, 13140-13171 또는 13215-13236의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열이 서열번호 2에 상보적인 것인 화합물.
  73. Serca1의 스플라이스오패시를 감소시킬 필요가 있는 동물에서 Serca1의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법으로서, DMPK를 표적으로 하는 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 Serca1 엑손 22 봉입(inclusion)을 야기시켜서, Serca1의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법.
  74. m-Titin의 스플라이스오패시를 감소시킬 필요가 있는 동물에서 m-Titin의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법으로서, DMPK를 표적으로 하는 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 m-Titin 엑손 5 봉입을 야기시켜서, m- Titin의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법.
  75. Clcn1의 스플라이스오패시를 감소시킬 필요가 있는 동물의 Clcn1의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법으로서, DMPK를 표적으로 하는 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 Clcn1 엑손 7a 봉입을 야기시켜서, Clcn1의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법.
  76. Zasp의 스플라이스오패시를 감소시킬 필요가 있는 동물의 Zasp의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법으로서, DMPK를 표적으로 하는 10 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 Zasp 엑손 11 봉입을 야기시켜서, Zasp의 스플라이스오패시를 감소시키는 방법.
  77. 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
  78. 서열번호 41, 44, 76, 109, 153, 320, 321, 322, 325, 329, 335 및 657의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
  79. 서열번호 15, 73, 77, 79, 83, 85, 130, 602, 648, 655, 674 및 680의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
  80. 서열번호 1의 핵염기 664-683, 773-792, 926-945, 927-946, 928-947, 931-950, 935-954, 941-960, 2089-2108, 2163-2182, 2490-2509, 2499-2518, 2676-2695, 2685-2704, 2676-2695, 2688-2707, 2697-2716, 2764-2783 및 2770-2789의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 핵염기 서열이 서열번호 1에 상보적인 것인 화합물.
  81. 서열번호 2의 핵염기 812-831, 3629-3648, 4447-4466, 4613-4632, 5803-5822, 5804-5823, 5805-5824, 5808-5827, 5818-5837, 6794-6813, 12463-12482, 13152-13171 및 13553-13572의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 핵염기 서열이 서열번호 2에 상보적인 것인 화합물.
  82. 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드인 것인 화합물.
  83. 제77항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호 1-8 또는 793-801에 100% 상보적인 것인 화합물.
  84. 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합이 변형된 뉴클레오사이드간 결합인 것인 화합물.
  85. 제84항에 있어서, 각각의 뉴클레오사이드간 결합이 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합인 것인 화합물.
  86. 제77항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드가 변형된 당을 포함하는 것인 화합물.
  87. 제86항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당이 바이사이클릭 당인 것인 화합물.
  88. 제86항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당이 2'-O-메톡시에틸을 포함하는 것인 화합물.
  89. 제77항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드가 변형된 핵염기를 포함하는 것인 화합물.
  90. 제89항에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신인 것인 화합물.
  91. 제77항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는
    결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
    결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
    결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고,
    상기 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되며, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 변형된 당을 포함하는 것인 화합물.
  92. 제77항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는
    10개의 결합된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
    5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
    5개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고,
    상기 갭 세그먼트가 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치되며, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드간 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것인 화합물.
  93. 제77항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 14개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 것인 화합물.
  94. 제77항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 것인 화합물.
  95. 제77항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 것인 화합물.
  96. 제41항 내지 제53항, 제57항 내지 제72항 및 제77항 내지 제95항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
  97. 제41항 내지 제53항, 제57항 내지 제72항 및 제77항 내지 제95항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제54항 내지 제56항 및 제96항 중 어느 한 항에 따른 조성물을, DM1의 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서의 DM1의 치료 방법.
  98. 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, DM1의 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서의 DM1의 치료 방법.
  99. 서열번호 41, 44, 76, 109, 153, 320, 321, 322, 325, 329, 335 및 657의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, DM1의 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서의 DM1의 치료 방법.
  100. 서열번호 15, 73, 77, 79, 83, 85, 130, 602, 648, 655, 674 및 680의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 DM1을 치료할 필요가 있는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서의 DM1의 치료 방법.
  101. 서열번호 1의 핵염기 664-683, 773-792, 926-945, 927-946, 928-947, 931-950, 935-954, 941-960, 2089-2108, 2163-2182, 2490-2509, 2499-2518, 2676-2695, 2685-2704, 2676-2695, 2688-2707, 2697-2716, 2764-2783 및 2770-2789의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, DM1의 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵염기 서열은 서열번호 1에 상보적인 것인, 상기 동물에서의 DM1의 치료 방법.
  102. 서열번호 2의 핵염기 812-831, 3629-3648, 4447-4466, 4613-4632, 5803-5822, 5804-5823, 5805-5824, 5808-5827, 5818-5837, 6794-6813, 12463-12482, 13152-13171 및 13553-13572의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, DM1의 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵염기 서열은 서열번호 2에 상보적인 것인, 상기 동물에서의 DM1의 치료 방법.
  103. 제98항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 DMPK mRNA 수준을 감소시키는 것인, DM1의 치료 방법.
  104. 제98항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 DMPK 단백질 발현을 감소시키는 것인, DM1의 치료 방법.
  105. 제98항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 CUGexp DMPK를 감소시키는 것인, DM1의 치료 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 CUGexp DMPK를 선택적으로 감소시키는 것인, DM1의 치료 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 CUGexp의 선택적 감소는 근육 조직 내에서 발생하는 것인, DM1의 치료 방법.
  108. 동물의 근육긴장증을 감소시키는 방법으로서, 제41항 내지 제53항, 제57항 내지 제72항 및 제77항 내지 제95항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제54항 내지 제56항 및 제96항 중 어느 한 항에 따른 조성물을, 근육긴장증의 감소를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육긴장증의 감소 방법.
  109. 동물의 근육긴장증을 감소시키는 방법으로서, 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, 근육긴장증의 감소를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육긴장증의 감소 방법.
  110. 동물의 근육긴장증을 감소시키는 방법으로서, 서열번호 41, 44, 76, 109, 153, 320, 321, 322, 325, 329, 335 및 657의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, 근육긴장증의 감소를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육긴장증의 감소 방법.
  111. 동물의 근육긴장증을 감소시키는 방법으로서, 서열번호 15, 73, 77, 79, 83, 85, 130, 602, 648, 655, 674 및 680의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, 근육긴장증의 감소를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육긴장증의 감소 방법.
  112. 동물의 근육긴장증을 감소시키는 방법으로서, 서열번호 1의 핵염기 664-683, 773-792, 926-945, 927-946, 928-947, 931-950, 935-954, 941-960, 2089-2108, 2163-2182, 2490-2509, 2499-2518, 2676-2695, 2685-2704, 2676-2695, 2688-2707, 2697-2716, 2764-2783 및 2770-2789의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, 근육긴장증의 감소를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵염기 서열은 서열번호 1에 상보적인 것인, 근육긴장증의 감소 방법.
  113. 동물의 근육긴장증을 감소시키는 방법으로서, 서열번호 2의 핵염기 812-831, 3629-3648, 4447-4466, 4613-4632, 5803-5822, 5804-5823, 5805-5824, 5808-5827, 5818-5837, 6794-6813, 12463-12482, 13152-13171 및 13553-13572의 동일 길이 부분에 상보적인 적어도 12개의 연속적 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, 근육긴장증의 감소를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵염기 서열은 서열번호 2에 상보적인 것인, 근육긴장증의 감소 방법.
  114. 동물의 MBLN 의존성 스플라이스오패시를 감소시키는 방법으로서, 제41항 내지 제53항, 제57항 내지 제72항 및 제77항 내지 제95항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제54항 내지 제56항 및 제96항 중 어느 한 항에 따른 조성물을, MBLN 의존성 스플라이스오패시의 감소를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, MBLN 의존성 스플라이스오패시의 감소 방법.
  115. 동물의 MBLN 의존성 스플라이스오패시를 감소시키는 방법으로서, 서열번호 12-156, 160-770 및 774-792의 핵염기 서열 중 임의의 핵염기 서열의 적어도 12개의 연속적 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 12 내지 30개의 결합된 뉴클레오사이드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을, MBLN 의존성 스플라이스오패시의 감소를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, MBLN 의존성 스플라이스오패시의 감소 방법.
  116. 제115항에 있어서, Serca1, m-Titin, Clcn1 및 Zasp 중 임의의 것의 스플라이싱이 교정되는 것인, MBLN 의존성 스플라이스오패시의 감소 방법.
  117. 제98항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 전신 투여인 것인 방법.
  118. 제98항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 비경구 투여인 것인 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 전신 투여는 피하 투여, 정맥내 투여, 뇌실내 투여 및 수막강내 투여 중 임의의 것인 방법.
  120. 제98항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 근내 투여가 아닌 것인 방법.
  121. 제98항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 인간인 것인 방법.
  122. 동물의 DM1을 치료하는데 사용하기 위한, 제41항 내지 제53항, 제57항 내지 제72항 및 제77항 내지 제95항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  123. 동물의 근육긴장증을 감소시키는데 사용하기 위한, 제41항 내지 제53항, 제57항 내지 제72항 및 제77항 내지 제95항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  124. 동물의 MBLN 의존성 스플라이스오패시를 감소시키는데 사용하기 위한, 제41항 내지 제53항, 제57항 내지 제72항 및 제77항 내지 제95항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
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