CN105331720A - 检测dm致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒 - Google Patents

检测dm致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒 Download PDF

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CN105331720A
CN105331720A CN201510850015.1A CN201510850015A CN105331720A CN 105331720 A CN105331720 A CN 105331720A CN 201510850015 A CN201510850015 A CN 201510850015A CN 105331720 A CN105331720 A CN 105331720A
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本申请公开了一种检测DM致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒，所述检测方法包括：样本处理，DNA提取，PCR扩增，PCR产物电泳，PCR产物纯化，测序。所述引物序列如：SEQ？ID？NO:1，SEQ？ID？NO:2，SEQ？ID？NO:3和SEQ？ID？NO:4所示，所述试剂盒包括有上述引物。本发明的优点是：解决了现有技术中进行DM致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。

Description

检测DM致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒
技术领域
本发明属分子生物学技术领域，涉及检测DM致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒。
背景技术
DM(myotonicdystrophy)基因位于19号染色体长臂(19q13.3)，基因组跨度为14kb，含15个外显子，编码582个氨基酸残基组成萎缩性肌强直蛋白激酶(dystrophiamyotonicaproteinkinase，DMPK)。现有研究成果提示，DM基因发生突变时将导致一组以肌无力、肌强直和肌萎缩为特点的多系统受累的常染色体显性遗传病，发病率为1/8000。
现有的检测DM的致病基因技术主要是基于单个突变位点的PCR和测序方法及单基因芯片方法，显著缺点主要在于仅仅能检测单个突变位点，不能对多个突变位点进行同时检测，也不能对分布于多个外显子的位点进行同时检测。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种检测DM致病基因突变的方法，其解决了现有技术中进行DM致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种检测DM致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加220μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水20μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
5)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
6)延伸的条件，60℃4min；
7)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μl反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
1)每管加入100μl100％酒精，或每管加入1μl125mMEDTA到管底，或每管加入1μl3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
6)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在DM基因突变位点两端设计两对特异性引物；
所述引物是DMPK和ZNF-9；
所述引物DMPK的sense为：
5'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'，
所述引物DMPK的antisense为：
5'GCACTTTGCGAACCAACG3'，
所述引物ZNF-9的sense为：
5'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG3'，
所述引物ZNF-9的antisense为：
5'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
本发明的另一目的在于提供一种检测DM致病基因突变的引物，其特征在于，所述引物序列包括：
SEQIDNO:15'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'
SEQIDNO:25'GCACTTTGCGAACCAACG3'
SEQIDNO:35'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG3'
SEQIDNO:45'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'。
本发明的还一目的在于提供包含所述引物的试剂盒。
本发明的有益效果为：
能对多个突变位点进行同时检测，也能对分布于多个外显子的位点进行同时检测，简单、快速、准确、有效的对强直性肌营养不良两种突变类型进行检测和临床诊断，利用多种特异性引物同时对患者可能存在的多个突变位点进行检测，使用该方法能保证95％以上的疾病检出率。解决了现有技术中进行DM致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加220μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水20μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
实施例2
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加220μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水20μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
8)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
9)延伸的条件，60℃4min；
10)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10ul反应体系，96孔板，酒精法；
1)每管加入100μl100％酒精，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
7)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在DM基因突变位点两端设计两对特异性引物；
所述引物是DMPK和ZNF-9；
所述引物DMPK的sense为：
5'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'，
所述引物DMPK的antisense为：
5'GCACTTTGCGAACCAACG3'，
所述引物ZNF-9的sense为：
5'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG3'，
所述引物ZNF-9的antisense为：
5'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
所述引物DMPK的扩增产物序列是：
AAGGGTCCTTGTAGCCGGGAATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGGGGATCACAGACCATTTCTTTCTTTCGGCCAGGCTGAGGCCCTGACGTGGATGGG
所述引物ZNF-9的扩增产物序列是
CTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGCCTGCCTGCCTGCCTGCCTGCCTGCCTGCCTGGCTGCCTGTCTGCCTGTCTGCCTGCCTGCCTGCCTGCCTGCCTGCCTGTCTGTCTCACTTTGTCCCCTAGGCTGGAGTGCAGTGGTA
实施例3
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加220μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水20μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
11)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
12)延伸的条件，60℃4min；
13)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μl反应体系，96孔板，EDTA法；
1)每管加入1μl125mMEDTA到管底，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
8)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在DM基因突变位点两端设计两对特异性引物；
所述引物是DMPK和ZNF-9；
所述引物DMPK的sense为：
5'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'，
所述引物DMPK的antisense为：
5'GCACTTTGCGAACCAACG3'，
所述引物ZNF-9的sense为：
5'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG3'，
所述引物ZNF-9的antisense为：
5'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
实施例4
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加220μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水20μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
14)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
15)延伸的条件，60℃4min；
16)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10ul反应体系，96孔板，NaAc法；
1)每管加入1μl3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
9)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在DM基因突变位点两端设计两对特异性引物；
所述引物是DMPK和ZNF-9；
所述引物DMPK的sense为：
5'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'，
所述引物DMPK的antisense为：
5'GCACTTTGCGAACCAACG3'，
所述引物ZNF-9的sense为：
5'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG3'，
所述引物ZNF-9的antisense为：
5'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
优选地，PCR缓冲液中各物质的浓度分别为10-40mMTriscl，50-200mM氯化钾(KCL)，0-5.0mM二硫苏糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2.0％(V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40，0-2.0％(V/V)吐温20(Tween20)，30-70％(v/v)甘油(glycerol)，稳定剂(stabilizer)：pH7.0-10.0(20℃)。优选浓度为20mMTriscl、100mMKCL、1mMDTT、0.1mMEDTA、0.5％(V/V)NonidetP-40、0.5％(V/V)Tween20、50％glycerol(v/v)，稳定剂，终pH值为9.0。DNA模板为用常规方法从患者抗凝全血中提取获得的DNA。
优选地，引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。
优选地，引物设计遵循原则：第一，引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。第二，产物不能形成二级结构。第三，引物长度一般在15～30碱基之间。第四，G+C含量在40％～60％之间。第五，碱基要随机分布。第六，引物自身不能有连续4个碱基的互补。第七，引物之间不能有连续4个碱基的互补。第八，引物5′端可以修饰。第九，引物3′端不可修饰。第十，引物3′端要避开密码子的第3位。引物合成采用的方法为亚磷酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
优选地，试剂盒包括：1)序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物；2)PCR反应体系；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
优选地，所述引物的浓度为10μmol/L。
优选地，所述试剂盒由PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液，模板DNA，PrimerU，PrimerL，灭菌蒸馏水组成，各组份反应时终浓度为：
优选地，所述PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液包括Tris.cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁，-20℃下pH值在8.0-9.0之间。
应用实施例1
取抗凝全血30例，样品由首都医科大学宣武医院提供，提取DNA作为模板。使用仪器：ABIVeritiDxPCR仪器分析，用DMPK和ZNF-9引物对检测，PCR扩增。将扩增产物使用ABI3500DX进行测序分析，将测序结果与NCBIBLAST进行比对分析，结果显示，与报道的目的基因序列完全一致。
本发明利用多种特异性引物同时对患者可能存在的多个突变位点进行检测，使用该方法能保证95％以上的疾病检出率。
本发明可以做到简单、快速、准确、有效的对强直性肌营养不良两种突变类型进行检测和临床诊断。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测DM致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加220μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水20μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
2)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
3)延伸的条件，60℃4min；
4)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10ul反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
1)每管加入100μl100％酒精，或每管加入1μl125mMEDTA到管底，或每管加入1ul3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
6)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在DM基因突变位点两端设计两对特异性引物；
所述引物是DMPK和ZNF-9；
所述引物DMPK的sense为：
5'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'，
所述引物DMPK的antisense为：
5'GCACTTTGCGAACCAACG3'，
所述引物ZNF-9的sense为：
5'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG3'，
所述引物ZNF-9的antisense为：
5'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
3.一种检测DM致病基因突变的引物，其特征在于，所述引物序列包括：
引物是DMPK：
SEQIDNO:15'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'
SEQIDNO:25'GCACTTTGCGAACCAACG3'；退火温度为62℃
引物是ZNF-9
SEQIDNO:35'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG3'
SEQIDNO:45'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'；退火温度为62℃。
4.根据权利要求3所述的检测DM致病基因突变的引物，其特征在于，
所述引物DMPK的扩增产物序列是：
AAGGGTCCTTGTAGCCGGGAATGCTGCTGCTGCTGCTGCT
GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGGGGATCACAGA
CCATTTCTTTCTTTCGGCCAGGCTGAGGCCCTGACGTGGATGGG
所述引物ZNF-9的扩增产物序列是
CTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGCCTGCCTGCCTGCCTGCCT
GCCTGCCTGCCTGGCTGCCTGTCTGCCTGTCTGCCTGCCTGCCTGCCTGC
CTGCCTGCCTGTCTGTCTCACTTTGTCCCCTAGGCTGGAGTGCAGTGGTA。
5.一种检测DM致病基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要求3所述的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1)序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物；2)PCR反应体系；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为10μmol/L。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液，模板DNA，PrimerU，PrimerL，灭菌蒸馏水组成，各组份反应时终浓度为：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液包括Tris.cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁，-20℃下pH值在8.0-9.0之间。
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Title
马明义等: "强直性肌营养不良症的基因诊断", 《山西医药杂志》 *

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