CN101899518A - 检测苯丙酮尿症pah基因7个热点突变位点的试剂盒及其pcr扩增方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法，其特点是经耐3’→5’核酸外切酶酶切修饰的突变检测引物在高保真DNA聚合酶参与的PCR反应中，其产物特异性非常高，可直接观察凝胶电泳的产物条带的有无来判断PAH基因相应突变位点的基因型。本发明操作简单，经济，无需测序，一般分子生物学实验室就可操作；本发明建立的方法和荧光定量PCR技术结合，可实现生物样本临床检测的自动化以及高通量，大大提高检测准确性和效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法，该检测结果可用于临床辅助诊断苯丙酮尿症，属于生物医学领域中的临床检测技术。
背景技术
苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)由阿斯布乔恩·佛伦(Asbjorn·Folling)于1934年首次发现，他用经典的有机化学分析方法发现患者尿液里含有大量的苯丙酮酸，苯丙酮尿症因此得名。PKU是一种由于氨基酸代谢缺陷而引起的一种常染色体隐性遗传病，发病率约为1/10000，杂合体频率约为1/50，是我国法定的新生儿期进行普查的两种疾病之一(另外一种是甲状腺功能低下)。
本病患儿出生时临床表现正常，但如果未经过法定的筛查及低苯丙氨酸饮食治疗的话，患儿一两个月后便开始出现异常症状。如皮肤、毛发和膜的色素减退，皮肤色白，头发呈褐色，约1/3婴儿出现湿疹，也有出现干燥和粗糙的皮肤异常；易流涎和出汗，汗液有特殊的霉臭或鼠样气味；约1/4的患儿出现痉挛性癫痫，加上轻癫痫发生率可达50％以上；大部分患儿表现行为焦躁，肌张力和运动过度，膝、股部屈曲，走路无节制；绝大部分患儿严重智力低下，头小畸形。
其发病机理在于人体必需的氨基酸苯丙氨酸被吸收后，一部分被利用合成蛋白质，一部分则通过酪氨酸途径降解，此过程需要苯丙氨酸羟化酶及其辅酶四氢生物蝶啶BH4的作用。当此二者中任何一种缺乏时，降解反应便不能进行。经典型苯丙酮尿症是指由于编码苯丙氨酸羟化酶(PAH)的PAH基因发生突变，导致苯丙氨酸羟化酶缺陷，而不能使苯丙氨酸转化为酪氨酸，苯丙氨酸在血液中堆积，并在转氨酶的作用下形成苯丙酮酸、苯乳酸、苯乙酸等旁路代谢产物；这些产物一部分随尿液排出，使尿呈特殊的霉烂臭味，而更多的产物则积聚在血液和脑脊液中，这对正在迅速发育的婴儿神经系统造成不同程度的毒害，引起不可逆的大脑损伤和严重的智力发育障碍。
临床上，在婴儿出生经母乳喂养3天后，通过足跟采血并检测新生儿血液中苯丙氨酸的浓度以达到PKU筛查的目的。一旦确诊，目前唯一的治疗方法是保持低苯丙氨酸的摄入量，具体措施是患者长期食用人工合成的含低苯丙氨酸的奶粉及其他食品。然而，这类食品不易获得而且价格昂贵，长期食用给患者的家庭带来沉重的经济负担。因此，对高危胎儿进行产前诊断，防止患儿的出生才是有效的解决方法。
人类PAH基因定位于12号染色体长臂，即：12q22-12q24.2，全长约90kb，其中包含13个外显子的长度在57-892bp之间，全长2.3kb，其阅读框架为1353bp共编码451个氨基酸。通过对PAH基因正常及突变序列的分析，绝大部分PAH缺乏或活性降低的病因在于PAH基因的点突变，而不是由于PAH基因的全部或部分缺失。突变或导致相应的氨基酸置换，而使PAH的理化性质改变，形成不稳定的酶蛋白或影响PAH酶的催化活性或者产生终止密码使PAH的合成提前终止，最终导致PAH缺乏；而剪接位点突变导致剪接异常，表达出错误的mRNA，进而翻译成异常的肽链，最终影响PAH酶的活性。
由于PCR技术以及DNA测序等分子生物学技术的广泛应用，导致经典型苯丙酮尿症的一系列PAH基因突变位点已经被发现。在PAH基因突变数据库已登记的320余种PAH突变中，近3/4的已知突变位于外显子5至外显子12之间，外显子7中的突变约占1/4。在国内，据研究和分析表明PKU基因突变已达25种，3/4的导致中国人经典型PKU的基因突变已经被查清，他们分别属于近20种不同的突变类型，而常见的有7种，具体见下表：
表1.中国人群PAH基因的7个热点突变位点
表1所列的7种突变类型的总数可达中国人PKU病例的70％左右。虽然建立利用内含子3内的STR(短串联重复序列)遗传标记进行连锁分析，判断高危胎儿携带的基因型来开展产前诊断的工作已有报道，但由于其技术本身的局限性，目前直接检测PAH基因中的点突变仍然是对PKU进行基因诊断和产前诊断的主要途径。目前，世界上有许多科研机构和生物科技公司正致力于基因突变检测的研究，已开发了许多有效的检测方法，如PCR-SSCP、TGGE、DGGE、SNaPshot、HRMA、分子信标、DNA直接测序等，然而这些方法的缺点是耗时多、花费大、效率较低，难以广泛推广应用。
“分子开关”技术是通过对高保真DNA聚合酶的保真性进行研究后，发现高保真DNA聚合酶对错配碱基的识别，不仅仅局限于新生DNA分子或引物3’末端，而且也能识别3’末端上游一至数个碱基距离的错配。根据高保真聚合酶的这一特征，可以认为，高保真聚合酶对DNA合成时的错配碱基存在一个“识别→逸漏→反复识别”的过程，当引物与模板完全配对时，则在聚合中心直接进行聚合反应；当引物与模板不完全配对时，则送到酶解中心进行校正，其中一部分引物被校正后，即时送回聚合中心，继续聚合反应，而另一部分引物由于不能被即时校正，引发聚合反应的非成熟性终止。这种配对引物被延伸，不配对引物不延伸的有或无的二元化效果，较好地满足了点突变分析时对特定位点进行非此即彼的二元化辨认。故提出将耐外切酶消化的硫化磷酸修饰的碱基特异性引物与具3’→5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶相结合，而构成了受单碱基差异调控的纳米级复合突变敏感性“分子开关”。
该突变敏感性“分子开关”已经成功应用于单基因遗传病--神经性耳聋GJB3中C→T突变点的检测；对性染色体以及线粒体上的SNP位点的检测取得成功，说明“分子开关”突变检测技术是一种简便经济实用的突变检测方法。本专利运用突变敏感性“分子开关”突变检测技术，建立了苯丙酮尿症PAH基因的7个热点突变位点的检测方法，以期应用于苯丙酮尿症的产前诊断，达到优生优育的目的。
发明内容
本发明提供一种检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法，目的是建立引起中国人群苯丙酮尿症的PAH基因的7个热点突变的检测方法，该检测结果用于判断高危胎儿是否携带PAH基因突变。
为达到上述目的，本发明采用的第一种技术方案是：一种检测苯丙酮尿症PAH基因七个热点突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括检测R111X、IVS-4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个热点突变位点的七组引物中的至少一组；
第一组：所述检测R111X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R111X M：
5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCAA-3’；
正常模板配对引物R111X N：
5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCGA-3’；
共同上游或下游引物R111X C：
5’-TGCCCCACCTCCTGCCACTT-3’；
其中，所述突变模板配对引物R111X M和正常模板配对引物R111X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第二组：所述检测IVS-4-1热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物IVS-4-1 M：
5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAAC-3’；
正常模板配对引物IVS-4-1 N：
5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAGC-3’；
共同上游或下游引物IVS-4-1 C：
5’-TTCCATCCTCAACTGGATGA-3’；
其中，所述突变模板配对引物IVS-4-1 M和正常模板配对引物IVS-4-1 N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第三组：所述检测Y204C热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物Y204C M：
5’-GTATAAAACCCATGCTTGCTGA-3’；
正常模板配对引物Y204C N：
5’-GTATAAAACCCATGCTTGCTAA-3’；
共同上游或下游引物Y204C C：
5’-CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG-3’；
其中，所述突变模板配对引物Y204C M和正常模板配对引物Y204C N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第四组：所述检测R243Q热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R243Q M：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCCAT-3’；
正常模板配对引物R243Q N：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCCGT-3’；
共同上游或下游引物R243Q C：5’-TGTGGACCAGCCAGCAATGAAC-CCAAACCTCATTCTTGCAGCAGG-3’；
其中，所述突变模板配对引物R243Q M和正常模板配对引物R243Q N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第五组：所述检测W326X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物W326X M：
5’-CTTTCCATTCCAGATTTACTAC-3’；
正常模板配对引物W326X N：
5’-CTTTCCATTCCAGATTTACTGC-3’；
共同上游或下游引物W326XC：
5’-GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA-3’；
其中，所述突变模板配对引物W326X M和正常模板配对引物W326X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第六组：所述检测Y356X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物Y356X M：
5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCATA-3’；
正常模板配对引物Y356X N：
5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCAGA-3’；
共同上游或下游引物Y356X C：
5’-CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG-3’；
其中，所述突变模板配对引物Y356X M和正常模板配对引物Y356X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第七组：所述检测R413P热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R413P M：
5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCCG-3’；
正常模板配对引物R413P N：
5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCGG-3’；
共同上游或下游引物R413P C：
5’-AACATGGCAGTGACAGACCAAGT-3’；
其中，所述突变模板配对引物R413P M和正常模板配对引物R413P N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。
为达到上述目的，本发明采用的第一种技术方案是：一种采用权利要求1所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因七个热点突变位点的PCR扩增方法，
(1)针对不同突变位点的检测，PCR扩增采用权利要求书1所列的七组引物中的至少一组；
(2)PCR扩增由预变性和30-40次扩增温度循环组成，循环条件为
预变性：温度为94℃～98℃；
变性：温度为94℃～98℃；
退火：温度为55℃～65℃；
延伸：温度为68℃～72℃。
1、上述技术方案中：所述引物(primer)是PCR(聚合酶链式反应)技术中重要的组成部分，它是一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点。
2、上述方案中，在运用PCR扩增方法时，将以上所列针对不同突变位点的一组引物中，突变模板配对引物与共同上游或下游引物为一对，正常模板配对引物与共同上游或下游引物为另外一对，这两对引物分别与该组引物对应检测位点基因型未知的DNA模板、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性高保真Pfu DNA聚合酶、10％DMSO、去离子水混合构成2个单独的反应体系；分别对2个单独的反应体系进行PCR扩增。
本发明工作原理是：PCR扩增的基本原理是：模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互补链聚合反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列退火复性、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。一般反应过程是：1、将反应体系加热至90～98℃，模板双链DNA变性成为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板；2、降温至37～60℃，使两种引物分别与模板DNA链的互补序列退火复性；3、升温至70～75℃，在耐热性DNA聚合酶催化下，四种脱氧核糖核酸按与模板碱基配对原则沿引物5’→3’方向延伸，合成模板DNA链的互补链。重复以上过程，就可以出现待扩增的特异性DNA片段。由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍，因此PCR经过n次循环后，理论上，待扩增的特异性DNA片段可达到2n个拷贝数。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1、本发明采用特殊设计并经修饰的引物，其PCR产物特异性非常高。利用该基因检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物条带的有无来判断苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的基因型。
2、本发明操作简单，经济，无需测序，一般分子生物学实验室或检验室就可操作。
3、本发明建立了的检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的PCR方法可以和荧光定量PCR技术结合，可实现生物样本临床检测的自动化以及高通量，大大提高检测准确性和效率。
附图说明
附图1为本发明采用PCR扩增方法检测PAH基因R111X(CGA→TGA)位点得到的凝胶电泳图(两个样本)。
附图2为采用Sanger直接测序法检测PAH基因R111X(CGA→TGA)位点的测序图(附图1的样本一)。
附图3为采用Sanger直接测序法检测PAH基因R111X(CGA→TGA)位点的测序图(附图1的样本二)。
附图4为本发明采用PCR扩增方法检测PAH基因IVS-4-1(AG→AA)位点得到的凝胶电泳图(两个样本)。
附图5为采用Sanger直接测序法检测PAH基因IVS-4-1(AG→AA)位点的测序图(附图4的样本一)。
附图6为采用Sanger直接测序法检测PAH基因IVS-4-1(AG→AA)位点的测序图(附图4的样本二)。
附图7为本发明采用PCR扩增方法检测PAH基因Y204C(TAT→TGT)位点得到的凝胶电泳图(两个样本)。
附图8为采用Sanger直接测序法检测PAH基因Y204C(TAT→TGT)位点的测序图(附图7的样本一)。
附图9为采用Sanger直接测序法检测PAH基因Y204C(TAT→TGT)位点的测序图(附图7的样本二)。
附图10为本发明采用PCR扩增方法检测PAH基因R243Q(CGA→CAA)位点得到的凝胶电泳图(两个样本)。
附图11为采用Sanger直接测序法检测PAH基因R243Q(CGA→CAA)位点的测序图(附图10的样本一)。
附图12为采用Sanger直接测序法检测PAH基因R243Q(CGA→CAA)位点的测序图(附图10的样本二)。
附图13为本发明采用PCR扩增方法检测PAH基因W326X(TGG→TAG)位点得到的凝胶电泳图(一个样本)。
附图14为采用Sanger直接测序法检测PAH基因W326X(TGG→TAG)位点的测序图。
附图15为本发明采用PCR扩增方法检测PAH基因Y356X(TAC→TAA)位点得到的凝胶电泳图(两个样本)。
附图16为采用Sanger直接测序法检测PAH基因Y356X(TAC→TAA)位点的测序图(附图15的样本一)。
附图17为采用Sanger直接测序法检测PAH基因Y356X(TAC→TAA)位点的测序图(附图15的样本二)。
附图18为本发明采用PCR扩增方法检测PAH基因R413P(CGC→CCC)位点得到的凝胶电泳图(两个样本)。
附图19为采用Sanger直接测序法检测PAH基因R413P(CGC→CCC)位点的测序图(附图18的样本一)。
附图20为采用Sanger直接测序法检测PAH基因R413P(CGC→CCC)位点的测序图(附图18的样本二)。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种检测苯丙酮尿症PAH基因七个热点突变位点的试剂盒，所述试剂盒：由10×PCR Buffer、dNTP (各2.5mM)、MgSO4(25mM)、七组引物(各10mM)以及Pfu DNA聚合酶(5U/μl)组成。
所述七组引物是指检测R111X、IVS-4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个热点突变位点的七组引物；
第一组：所述检测R111X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R111X M：
5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTC*AA-3’；
正常模板配对引物R111X N：
5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTC*GA-3’；
共同上游或下游引物R111X C：
5’-TGCCCCACCTCCTGCCACTT-3’；
其中，所述突变模板配对引物R111X M和正常模板配对引物R111X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰(标有“*”处)；
第二组：所述检测IVS-4-1热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物IVS-4-1 M：
5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTA*AC-3’；
正常模板配对引物IVS-4-1 N：
5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTA*GC-3’；
共同上游或下游引物IVS-4-1 C：
5’-TTCCATCCTCAACTGGATGA-3’；
其中，所述突变模板配对引物IVS-4-1 M和正常模板配对引物IVS-4-1 N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰(标有“*”处)；
第三组：所述检测Y204C热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物Y204C M：
5’-GTATAAAACCCATGCTTGCT*GA-3’；
正常模板配对引物Y204C N：
5’-GTATAAAACCCATGCTTGCT*AA-3’；
共同上游或下游引物Y204C C：
5’-CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG-3’；
其中，所述突变模板配对引物Y204C M和正常模板配对引物Y204C N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰(标有“*”处)；
第四组：所述检测R243Q热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R243Q M：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCC*AT-3’；
正常模板配对引物R243Q N：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCC*GT-3’；
共同上游或下游引物R243Q C：5’-TGTGGACCAGCCAGCAATGAAC-CCAAACCTCATTCTTGCAGCAGG-3’；
其中，所述突变模板配对引物R243Q M和正常模板配对引物R243Q N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰(标有“*”处)；
第五组：所述检测W326X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物W326X M：
5’-CTTTCCATTCCAGATTTACT*AC -3’；
正常模板配对引物W326X N：
5’-CTTTCCATTCCAGATTTACT*GC -3’；
共同上游或下游引物W326X C：
5’-GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA-3’；
其中，所述突变模板配对引物W326X M和正常模板配对引物W326X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰(标有“*”处)；
第六组：所述检测Y356X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物Y356X M：
5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCA*TA-3’；
正常模板配对引物Y356X N：
5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCA*GA-3’；
共同上游或下游引物Y356X C：
5’-CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG-3’；
其中，所述突变模板配对引物Y356X M和正常模板配对引物Y356X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰(标有“*”处)；
第七组：所述检测R413P热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R413P M：
5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTC*CG-3’；
正常模板配对引物R413P N：
5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTC*GG-3’；
共同上游或下游引物R413P C：
5’-AACATGGCAGTGACAGACCAAGT-3’；
其中，所述突变模板配对引物R413P M和正常模板配对引物R413P N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰(标有“*”处)。
实施例二：一种采用实施例一所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因热点突变位点的PCR扩增方法，包括下列步骤：
第一步：准备DNA
(1)、从两个人体中抽取血液得到两个血液样本。
(2)、从两个血液样本中获取DNA，即血液样本中白细胞基因组DNA样品准备。
试剂准备：
抗凝剂：每100ml抗凝剂含0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖。
红细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCl，pH 7.6；
5mmol/L MgCl2；
10mmol/L NaCl；
白细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCl，pH 7.6；
10mmol/L EDTA(pH 8.0)
50mmol/L NaCl
10mg/ml蛋白酶K(Protease K)：10mg Protease K溶于1ml ddH2O(双蒸水)，分装，于-20℃保存。使用时，在4℃融化。
从两个血样中获取DNA过程：
①、取3ml新鲜血液加0.5ml抗凝剂，混匀，1500rpm离心10min，小心吸取红细胞与血清之间呈一层乳白色的白细胞到一个新的15ml离心管。
②、加10ml红细胞裂解液，轻轻混匀，放置10min，并经常对溶液进行混匀以充分裂解红细胞。
③、1500rpm离心10min，弃上清，沉淀为白细胞。
④、加白细胞裂解液3ml，加50μl 10％SDS和50μl的10mg/ml蛋白酶K，50℃温育过夜。
⑤、加等体积苯酚∶氯仿(1∶1)，轻柔混匀15次，5000rpm离心10min，取上层水溶液。
⑥、加60μl 5mol/L NaCl，轻轻混匀。再加2/3体积异丙醇，轻轻混匀5min，可见白色絮状沉淀即基因组DNA。
⑦、8000g离心10min，弃上清。
⑧、加体积浓度为70％的乙醇10ml，轻轻旋转离心管，使管壁都充分接触到乙醇。
⑨、8000g离心5min，弃上清，室温风干明显的乙醇液滴，不要使白色沉淀干透，否则基因组DNA难溶于水。
⑩、加无菌去离子水500μl，置于摇床，室温轻轻摇2h。之后，4℃过夜，使其充分溶解。
第二步：对DNA进行扩增
利用PCR扩增方法，以第一步获取的基因组DNA为模板，采用以下一组(两对)引物(5’→3’)进行扩增：
①、突变模板配对引物对：
突变模板配对引物R111X M：ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTC*AA
共同上游或下游引物R111X C：TGCCCCACCTCCTGCCACTT
②、正常模板配对引物对：
正常模板配对引物R111X N：ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTC*GA
同上游或下游引物R111X C：TGCCCCACCTCCTGCCACTT
注：标有“*”号处的磷酸二酯键经磷硫酰修饰。
具体操作为：
①、将上述两对引物分别与获取的两个血液样本的DNA、4种碱基、MgSO4溶液、PCR反应缓冲液、耐热性Pfu DNA聚合酶、去离子水按一定比例混合构成四个单独的反应体系，具体见下表：
| ddH2O | To 20μl |
| 10×PCR Buffer | 2μl |
| dNTP(各2.5mM) | 1.6μl |
| MgSO4(25mM) | 1.2μl |
| 一对引物(各10mM) | 各0.4μl |
| Pfu DNA聚合酶(5U/μl) | 0.2μl |
| 基因组DNA(约50ng/μl) | 0.5μl |
②、对上述反应体系进行PCR循环。PCR循环条件见下表：
第三步：苯丙酮尿症PAH基因R111X(CGA→TGA)突变位点的PCR扩增方法检测结果分析
采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳，得到的凝胶电泳图如附图1所示，根据凝胶电泳对应产物电泳条带的有无来判断PAH基因R111X(CGA→TGA)突变位点的基因型。具体判断方法如下：
(1)当突变模板配对引物与共同上游或下游引物组成的一对引物对未知的DNA模板进行PCR扩增，如果观察到目的电泳条带则表明该未知DNA模板在相应的检测位点含有突变型基因。
(2)当正常模板配对引物与共同上游或下游引物组成的一对引物对未知的DNA模板进行PCR扩增，如果观察到目的电泳条带则表明该未知DNA模板在相应的检测位点含有正常型基因。
(3)当上述两对引物都对未知DNA模板进行扩增并通过电泳观察到目的条带，则表明该检测位点为杂合型；如果上述两对引物只有其中一对引物的电泳结果观察到目的产物条带，而另外一对引物没有观察到目的产物条带，则表明该检测位点为有目的条带的一对引物对应的纯合子，即纯合突变或者纯合正常。
从附图1中可以看出，1号血液样本在含有突变模板配对引物对和正常模板配对引物对的两个体系中扩增均得到目的产物条带(第1、3泳道)，则1号样本的R111X(CGA→TGA)位点为杂合突变(该样本的DNA测序图如附图2所示)。2号血液样本在含有突变模板配对引物对的体系中扩增没有得到目的产物条带(第2泳道)，而只在含有正常模板配对引物对的体系中扩增得到目的产物条带(第4泳道)，则2号样本的R111X(CGA→TGA)位点为纯合正常(该样本的DNA测序图如附图3所示)。
实施例三：一种实施例一所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因热点突变位点的PCR扩增方法
实验条件及判断方法均与实施例二相同，血样样本也为两个(与实施例二均不同)。
采用以下一组(两对)引物检测IVS-4-1(AG→AA)突变位点，每对引物对应的产物片段大小为176bp，其核苷酸序列为(5’→3’)：
①、突变模板配对引物对：
突变模板配对引物IVS-4-1M：CAGGTGTCTCTTTTCTCCTA*AC
共同上游或下游引物IVS-4-1C：TTCCATCCTCAACTGGATGA
②、正常模板配对引物对：
正常模板配对引物IVS-4-1N：CAGGTGTCTCTTTTCTCCTA*GC
共同上游或下游引物IVS-4-1C：TTCCATCCTCAACTGGATGA
注：标有“*”号处的磷酸二酯键经磷硫酰修饰。
得到的凝胶电泳图如附图4所示，从图中可以看出，1号血液样本在含有突变模板配对引物对和正常模板配对引物对的两个体系中扩增均得到目的产物条带(第1、3泳道)，则1号血液样本的IVS-4-1(AG→AA)位点为杂合突变(该样本的DNA测序图如附图5所示)。2号血液样本在含有突变模板配对引物对的体系中扩增没有得到目的产物条带(第2泳道)，而只在含有正常模板配对引物对的体系中扩增得到目的产物条带(第4泳道)，则2号样本的IVS-4-1(AG→AA)位点为纯合正常(该样本的DNA测序图如附图6所示)。
实施例四：一种实施例一所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因热点突变位点的PCR扩增方法
实验条件及判断方法均与实施例二相同，血样样本也为两个(与前述实施例均不同)。
采用以下一组(两对)引物检测Y204C(TAT→TGT)突变位点，每对引物对应的产物片段大小为134bp，其核苷酸序列为(5’→3’)：
①、突变模板配对引物对：
突变模板配对引物Y204C M：GTATAAAACCCATGCTTGCT*GA
共同上游或下游引物Y204C C：CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG
②、正常模板配对引物对：
正常模板配对引物Y204C N：GTATAAAACCCATGCTTGCT*AA
共同上游或下游引物Y204C C：CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG
注：标有“*”号处的磷酸二酯键经磷硫酰修饰。
得到的凝胶电泳图如附图7所示，从图中可以看出，1号血液样本在含有突变模板配对引物对和正常模板配对引物对的两个体系中扩增均得到目的产物条带(第1、3泳道)，则1号样本的Y204C(TAT→TGT)位点为杂合突变(该样本的DNA测序图如附图8所示)。2号样本在含有突变模板配对引物对的体系中扩增没有得到目的产物条带(第2泳道)，而只在含有正常模板配对引物对的体系中扩增得到目的产物条带(第4泳道)，则2号样本的Y204C(TAT→TGT)位点为纯合正常(该样本的DNA测序图如附图9所示)。
实施例五：一种实施例一所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因热点突变位点的PCR扩增方法
实验条件及判断方法均与实施例二相同，血样样本也为两个(与前述实施例均不同)。
采用以下一组(两对)引物检测R243Q(CGA→CAA)突变位点，每对引物对应的产物片段大小为234bp，其核苷酸序列为(5’→3’)：
①、突变模板配对引物对：
突变模板配对引物R243Q M：GCACTGGTTTCCGCCTCC*AT
共同上游或下游引物R243Q C：TGTGGACCAGCCAGCAATGAA-CCCAAACCTCATTCTTGCAGCAGG
②、正常模板配对引物对：
正常模板配对引物R243Q N：GCACTGGTTTCCGCCTCC*GT
共同上游或下游引物R243Q C：TGTGGACCAGCCAGCAATGAA-CCCAAACCTCATTCTTGCAGCAGG
注：标有“*”号处的磷酸二酯键经磷硫酰修饰。
得到的凝胶电泳图如附图10所示，从图中可以看出，1号血液样本在含有突变模板配对引物对和正常模板配对引物对的两个体系中扩增均得到目的产物条带(第1、3泳道)，则1号样本的R243Q(CGA→CAA)位点为杂合突变(该样本的DNA测序图如附图11所示)。2号样本在含有突变模板配对引物对的体系中扩增没有得到目的产物条带(第2泳道)，而只在含有正常模板配对引物对的体系中扩增得到目的产物条带(第4泳道)，则2号样本的R243Q(CGA→CAA)位点为纯合正常(该样本的DNA测序图如附图12所示)。
实施例六：一种实施例一所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因热点突变位点的PCR扩增方法
实验条件及判断方法均与实施例二相同，血样样本为一个(与前述实施例均不同)。
采用以下一组(两对)引物检测W326X(TGG→TAG)突变位点，每对引物对应的产物片段大小为121bp，其核苷酸序列为(5’→3’)：
①、突变模板配对引物对：
突变模板配对引物W326X M：CTTTCCATTCCAGATTTACT*AC
共同上游或下游引物W326X C：GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA
②、正常模板配对引物对：
正常模板配对引物W326X N：CTTTCCATTCCAGATTTACT*GC
共同上游或下游引物W326X C：GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA
注：标有“*”号处的磷酸二酯键经磷硫酰修饰。
得到的凝胶电泳图如附图13所示，从图中可以看出，血液样本在含有突变模板配对引物对的体系中扩增没有得到目的产物条带(右侧泳道)，而只在含有正常模板配对引物对的体系中扩增得到目的产物条带(左侧泳道)，该血液样本的W326X(TGG→TAG)位点为纯合正常(该样本的DNA测序图如附图14所示)。
实施例七：一种实施例一所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因热点突变位点的PCR扩增方法
实验条件及判断方法均与实施例二相同，血样样本也为两个(与前述实施例均不同)。
采用以下一组(两对)引物检测Y356X(TAC→TAA)突变位点，每对引物对应的产物片段大小为145bp，其核苷酸序列为(5’→3’)：
①、突变模板配对引物对：
突变模板配对引物Y356X M：AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCA*TA
共同上游或下游引物Y356X C：CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG
②、正常模板配对引物对：
正常模板配对引物Y356X N：AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCA*GA
共同上游或下游引物Y356X C：CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG
注：标有“*”号处的磷酸二酯键经磷硫酰修饰。
得到的凝胶电泳图如附图15所示，从图中可以看出，1号血液样本在含有突变模板配对引物对和正常模板配对引物对的两个体系中扩增均得到目的产物条带(第1、3泳道)，则1号样本的Y356X(TAC→TAA)位点为杂合突变(该样本的DNA测序图如附图16所示)。2号血液样本在含有突变模板配对引物对的体系中扩增没有得到目的产物条带(第2泳道)，而只在含有正常模板配对引物对的体系中扩增得到目的产物条带(第4泳道)，则2号样本的Y356X(TAC→TAA)位点为纯合正常(该样本的DNA测序图如附图17所示)。
实施例八：一种实施例一所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因热点突变位点的PCR扩增方法
实验条件及判断方法均与实施例二相同，血样样本为一个(与前述实施例均不同)。
采用以下一组(两对)引物检测R413P(CGC→CCC)突变位点，每对引物对应的产物片段大小为371bp，其核苷酸序列为(5’→3’)：
①、突变模板配对引物对：
突变模板配对引物R413P M：TACCTCGGCCCTTCTCAGTTC*CG
共同上游或下游引物R413P C：AACATGGCAGTGACAGACCAAGT
②、正常模板配对引物对：
正常模板配对引物R413P N：TACCTCGGCCCTTCTCAGTTC*GG
共同上游或下游引物R413P C：AACATGGCAGTGACAGACCAAGT
注：标有“*”号处的磷酸二酯键经磷硫酰修饰。
得到的凝胶电泳图如附图18所示，从图中可以看出，1号血液样本在含有突变模板配对引物对和正常模板配对引物对的两个体系中扩增均得到目的产物条带(第1、3泳道)，则1号样本的R413P(CGC→CCC)位点为杂合突变(该样本的DNA测序图如附图19所示)。2号样本在含有突变模板配对引物对的体系中扩增没有得到目的产物条带(第2泳道)，而只在含有正常模板配对引物对的体系中扩增得到目的产物条带(第4泳道)，则2号样本的R413P(CGC→CCC)位点为纯合正常(该样本的DNA测序图如附图20所示)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种检测苯丙酮尿症PAH基因七个热点突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测R111X、IVS-4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个热点突变位点的七组引物中的至少一组；
第一组：所述检测R111X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R111X M：
5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCAA-3’；
正常模板配对引物R111X N：
5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCGA-3’；
共同上游或下游引物R111X C：
5’-TGCCCCACCTCCTGCCACTT-3’；
其中，所述突变模板配对引物R111X M和正常模板配对引物R111X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第二组：所述检测IVS-4-1热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物IVS-4-1 M：
5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAAC-3’；
正常模板配对引物IVS-4-1 N：
5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAGC-3’；
共同上游或下游引物IVS-4-1 C：
5’-TTCCATCCTCAACTGGATGA-3’；
其中，所述突变模板配对引物IVS-4-1 M和正常模板配对引物IVS-4-1 N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第三组：所述检测Y204C热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物Y204C M：
5’-GTATAAAACCCATGCTTGCTGA-3’；
正常模板配对引物Y204C N：
5’-GTATAAAACCCATGCTTGCTAA-3’；
共同上游或下游引物Y204C C：
5’-CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG-3’；
其中，所述突变模板配对引物Y204C M和正常模板配对引物Y204C N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第四组：所述检测R243Q热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R243Q M：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCCAT-3’；
正常模板配对引物R243Q N：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCCGT-3’；
共同上游或下游引物R243Q C：5’-TGTGGACCAGCCAGCAATGAACC-CAAACCTCATTCTTGCAGCAGG-3’；
其中，所述突变模板配对引物R243Q M和正常模板配对引物R243Q N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第五组：所述检测W326X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物W326X M：
5’-CTTTCCATTCCAGATTTACTAC-3’；
正常模板配对引物W326X N：
5’-CTTTCCATTCCAGATTTACTGC-3’；
共同上游或下游引物W326X C：
5’-GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA-3’；
其中，所述突变模板配对引物W326X M和正常模板配对引物W326X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第六组：所述检测Y356X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物Y356X M：
5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCATA-3’；
正常模板配对引物Y356X N：
5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCAGA-3’；
共同上游或下游引物Y356X C：
5’-CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG-3’；
其中，所述突变模板配对引物Y356X M和正常模板配对引物Y356X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；
第七组：所述检测R413P热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：
突变模板配对引物R413P M：
5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCCG-3’；
正常模板配对引物R413P N：
5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCGG-3’；
共同上游或下游引物R413P C：
5’-AACATGGCAGTGACAGACCAAGT-3’；
其中，所述突变模板配对引物R413P M和正常模板配对引物R413P N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。
2.一种采用权利要求1所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因七个热点突变位点的PCR扩增方法，其特征在于：
(1)针对不同突变位点的检测，PCR扩增采用权利要求书1所列的七组引物中的至少一组；
(2)PCR扩增由预变性和30-40次扩增温度循环组成，循环条件为
预变性：温度为94℃～98℃；
变性：温度为94℃～98℃；
退火：温度为55℃～65℃；
延伸：温度为68℃～72℃。
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Effective date of registration: 20140422 Address after: 215558, No. 8, Jin Du Road, Southeast Economic Development Zone, Jiangsu, Changshou City Patentee after: Suzhou Kuangyuan Molecular Biotechnology Co., Ltd. Address before: 215123 Department of pharmacology, Department of medicine, Soochow University, 199 AI en Road, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Patentee before: Soochow University Patentee before: Suzhou Kuangyuan Molecular Biotechnology Co., Ltd. |