CN111286533B - Pah基因多重pcr引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种多重PCR引物，该多重PCR引物包括表1中所示引物对中的至少两对。利用根据本发明实施例的多重PCR引物可实现3‑5个细胞的全基因组扩增和序列分析，扩增效率高、特异性强，适用于获得少量细胞(如低至3‑5个细胞)的PAH基因区域序列和突变信息，进而可应用于PAH基因区域突变位点的功能研究等科学研究，或用于单细胞的移植前PAH基因突变信息的诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及多重PCR引物及应用，更具体地，本发明涉及多重PCR引物、多重PCR引物在获得和/或检测PAH基因序列中的用途、试剂盒、试剂盒在获得和/或检测PAH基因序列中的用途、多重PCR的方法、PAH基因检测的方法以及评估待测样品患苯丙酮尿症风险的方法。
背景技术
苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种常染色体隐性遗传性疾病，因肝脏苯丙氨酸羟化酶缺乏或者四氢生物蝶呤合成酶、二氢生物喋呤还原酶缺陷而导致苯丙氨酸代谢障碍。PKU患儿出生后若不能得到及时诊治，会出现高苯丙酸血症。高苯丙氨酸血症及中间代谢产物对中枢神经系统的毒性作用，可致严重的智能发育障碍。
经典型PKU由苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase,PAH)基因突变所致，突变后的PAH活性降低或丧失，苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)在肝脏中代谢紊乱所致。
PAH基因位于12号染色体长臂上，基因全长79.28kb，有13个外显子mRNA 2681bp，编码451个氨基酸所组成的多肽，已发现的突变数超过600种，中国人突变数超过100种。
PAH的遗传方式为常染色体隐性遗传，即两条染色体上的PAH基因均存在缺陷时才会导致PKU。一条染色体上的PAH基因正常，而另一条染色体上的PAH基因存在缺陷不会致病，此时称之为PKU携带者。若男女双方均为PKU携带者，生育PKU患儿的风险为25％。
全球新生儿PKU平均发病率的大约是25000分之一，我国目前筛查结果显示其PKU平均发病在15000分之一左右。尤其我国华北地区是PKU的高发区，发病率在1：6000左右。尽管苯丙酮尿症的发病率并不高，但是它的危害却非常大，它不仅影响下一代智力的发育，也给许多家庭和社会带来不幸。
采用试管婴儿技术能有效帮助夫妻均携带PAH致病基因的父母解决下一代出现PKU的难题。试管婴儿技术是将卵子与精子取出后置于特定的培养液内培养、受精，受精卵在恒温孵箱中发育为胚胎后移植回母体子宫，最终发育成胎儿。挑选健康胚胎移植是成功预防的关键。胚胎植入前遗传学诊断是指胚胎植入着床之前进行基因突变异常的检测，挑选无PKU的胚胎植入子宫，以期获得正常的后代。
目前，常用的基因诊断方法有变性凝胶梯度电泳(PCR-DGGE),单链构象多态性(PCR-SSCP),限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)以及DNA测序技术，短串联重复序列等，但这些方法灵敏度低，只适合于采用新生儿外周血作为检测对象，不适合针对单细胞的移植前诊断。
因此急需开发一种检测试管婴儿技术中胚胎PKU突变检测的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种多重PCR引物。根据本发明的实施例，所述多重PCR引物包括表1中所示引物对中的至少两对。
表1：
根据本发明实施例的多重PCR引物在目标染色体上序列唯一，位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度，213对引物可混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中同时进行213重反应，实现PAH基因区域的特异性扩增和富集。利用根据本发明实施例的多重PCR引物可实现3-5个细胞的全基因组扩增和序列分析，扩增效率高、特异性强，适用于获得少量细胞(如低至3-5个细胞)的PAH基因区域序列和突变信息，进而可应用于PAH基因区域突变位点的功能研究等科学研究，或用于单细胞的移植前PAH基因突变信息的诊断。
根据本发明的实施例，上述多重PCR引物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述多重PCR引物用于扩增PAH基因的至少一个外显子区域。
根据本发明的实施例，所述多重PCR引物用于扩增PAH基因的上下游3Mb范围内紧密连锁多态性位点。进而可获得更多的PAH基因的遗传信息的多态位点。
根据本发明的实施利，所述引物的5’端包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。进而可以满足基于高通量测序技术，一次地对大量样品进行分析。
在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的多重PCR引物在获得和/或检测PAH基因序列中的用途。根据本发明实施例的多重PCR引物可实现3-5个细胞的全基因组PAH基因区域的特异性扩增和序列分析，扩增效率高、特异性强，适用于获得和/或检测少量细胞(如低至3-5个细胞)的PAH基因区域序列和突变信息，尤其适用于单细胞的移植前PAH基因突变信息的诊断。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述的多重PCR引物。根据本发明实施例的试剂盒，包括前面所述的多重PCR引物，因此可实现3-5个细胞的全基因组PAH基因区域的特异性扩增和序列分析，具有了扩增效率高、特异性强的优势，适用于获得和/或检测少量细胞(如低至3-5个细胞)的PAH基因区域序列和突变信息，尤其适用于单细胞的移植前PAH基因突变信息的诊断。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的试剂盒在获得和/或检测PAH基因序列中的用途。根据本发明实施例的试剂盒适用于获得和/或检测少量细胞(如低至3-5个细胞)的PAH基因区域序列和突变信息，尤其适用于单细胞的移植前PAH基因突变信息的诊断。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种多重PCR的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括利用前面所述的多重PCR引物进行所述多重PCR。根据本发明实施例的多重PCR引物在目标染色体上序列唯一，位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度，213对引物可混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中同时进行213个多重PCR反应，高效实现PAH基因区域的特异性扩增和富集。利用根据本发明实施例的多重PCR方法可实现低至3-5个细胞的全基因组PAH基因区域序列的特异性扩增，扩增效率高、特异性强。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种PAH基因检测的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用前面的所述的方法对待测样品中的至少一部分核酸进行扩增，获得扩增产物；(2)分析所述扩增产物，以获得PAH基因基因检测结果。根据本发明实施例的PAH基因检测方法可实现对待测样品PAH基因的高效、高通量、低成本、高灵敏度的检测。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸为DNA和/或RNA。
根据本发明的实施例，所述核酸为RNA，步骤(1)包括：(1-1)利用所述多重PCR引物中的上游或下游引物将所述RNA反转录为cDNA；以及(1-2)利用所述多重PCR引物中相应的下游或上游引物对所述cDNA进行扩增，获得扩增产物。
根据本发明的实施例，步骤(2)包括：(2-1)对所述扩增产物进行测序；以及(2-2)将测序结果分别与PAH基因野生型序列比对，以确定PAH基因的突变位点。根据本发明的具体实施例，所述PAH基因野生型序列信息来源于人类hg19参考基因组。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种评估待测样品患苯丙酮尿症风险的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的方法对待测样本进行PAH基因检测，获得检测结果1，所述待测样本来源于囊胚滋养层细胞；利用前面所述的方法对待测样本的父母本全血样本进行PAH基因检测，获得检测结果2；以及将检测结果1和检测结果2进行比对，依据比对结果，判断待测样品的单倍体型及致病位点携带情况；依据待测样品的单倍体型及致病位点携带情况，评估患苯丙酮尿症风险。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的具体实施例，本发明提出了一种基于高通量测序技术检测PKU的方法。
该方法包括以下步骤：
1)体外培养的囊胚滋养层细胞经MDA全基因组扩增后得到基因组DNA。
2)磁珠纯化MDA全基因组扩增产物。
3)提取夫妻双方全血DNA。
4)多重PCR扩增单体型目标区域。
5)纯化PCR产物，并测序。
6)将测定的胚胎和夫妻双方的DNA序列(应选择突变位点上、下游的多态位点，在父母样本中进行连锁分析，从中选择能够提供遗传信息的位点建立单体型图)进行比对，判断胚胎的单倍体型及致病位点携带情况。
根据本发明实施例的上述方法具有下列优势：
1)通用性：本发明的引物组可实现对PAH基因外显子以及PAH基因的上下游3Mb范围内紧密连锁多态性位点的213个SNP(SNP位点如表1中“针对位点”所列)进行分析，SNP位点全面，可用于不同配偶的胚胎移植前诊断。
3)多位点SNP测序：基于第二代测序技术，本发明可以对PAH基因附近的多个SNP进行分析，不需依赖已知的探针和设计探针。
4)高通量：基于高通量测序技术，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析。
5)成本低：随着测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，本发明对PAH的单体型分析的成本也在不断下降。
6)高灵敏度：可用于至少3-5个细胞的分析。因此适合于试管婴儿技术中胚胎移植前的检测。
需要说明的是，如无特别说明，在本发明说明书和权利要求书中，读段(reads)是指测序获得的序列片段；单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性；单体型(Haplotype)是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合,又称单倍体型或单元型。
根据本发明的实施例，基因组DNA的获取是当胚胎发育至囊胚期，取出外围滋养层细胞3-5个，运用全基因组扩增方法对细胞中基因组DNA进行富集。
根据本发明的实施例，目标区域DNA分子富集采用的是多重PCR扩增的方法。具体地，将DNA分子富集为比较集中的一定大小的片段。在本发明的一个实施方案中，DNA片段大小在125-275bp的大小。
在本发明中针对人类PAH基因，分别设计213对序列特异性引物。这些引物的特点为：(1)在目标染色体上序列唯一。(2)位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度。(3)213对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行213重反应。发明人发现，213对引物混合到两个PCR反应管中进行反应，可以克服某些引物在一个PCR管中不能特异性扩增的缺陷，同时放在两个PCR反应管中，扩增效率显著提高。
在本发明中，所采用的测序方法可以为高通量测序方法。DNA片段长度分布在125bp-275bp之间。在本发明的一个实施方案中。测序平台为Illumina，得到DNA长度分布在125bp-275bp之间的DNA序列分子。
在本发明中，测序深度可以是300～3000X，即每条特异PCR扩增产物被测序300～3000次，例如在本发明的一个实施方案中，测序深度为1000，即该条特异PCR扩增产物被测序1000次。
本发明中，当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的标签序列(barcode)，以用于在测序过程中进行样品的区分，从而实现同时对多个样品进行测序。
本发明中，基因组参考序列可以来自公共数据库。例如，人类基因组序列可以是NCBI或者ucsc数据库中的人类基因组参考序列。
本发明中，序列比对可以通过任何一种序列比对程序，例如本领域技术人员可获得的BWA(Burrow-Wheeler-Aligner)进行比对，将读段与参考基因组序列比对，得到读段在参考基因组上的位置。
本发明的一个实施方案中具体方法包括以下步骤：
按照MDA全基因组扩增法(Qiagen试剂盒)提取细胞DNA后，按照Illumina标准建库流程进行建库。在这个过程中，胚胎MDA全基因组扩增通过目标区域多重PCR扩增为集中在125-275bp左右的DNA分子，两端加上测序所用接头，每个样品被加上不同的标签序列(barcode)，从而在一次测序得到的数据中可以使多个样品的数据区分开。
比对及统计：利用trimmomatic软件对Illumina测序仪产生的原始数据去除接头序列，用BWA软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。
本发明用于对适用人群进行苯丙酮尿症胚胎移植前诊断，有利于提供遗传咨询和提供临床决策依据。本发明适用人群可以是苯丙酮尿症携带者和患者。
上述适用人群举例仅用于本发明，而不应为限定本说明的范围。
实施例1 4例胚胎苯丙酮尿症胚胎移植前诊断
1.建库和测序
在一个家系中母亲生出1例苯丙酮尿症患儿，经基因检测患儿为PAH c.1197A>T和PAH c.1174T>A复合杂合，母亲为PAH c.1197A>T携带者，父亲为PAH c.1174T>A携带者。按照全基因组扩增方法，获取该家系4例胚胎样本3～5个细胞DNA，按照Illumina标准建库流程进行建库，用miseq进行测序。
2.比对与统计
利用trimmomatic软件对Illumina测序仪产生的原始数据去除接头序列，用BWA软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。
3.结果
根据苯丙酮尿症症家系单体型结果(见下表2)可以推断：H1胚胎为父源携带者、H2胚胎为母源携带者、H3胚胎为父源携带者、H4胚胎为母源携带者。
表2：家系单体型结果
注：注：H1、H2、H3、H4为该家系胚胎。F0和F1为父亲PAH基因上、下游3M区域的两条单体型链，F0是致病链，F1是正常链。M0和M1为母亲PAH基因上、下游3M区域的两条单体型链，M0是致病链，M1是正常链。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (12)
1.一种多重PCR引物，其特征在于，包括表1中所示引物对，
2.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物用于扩增PAH基因的至少一个外显子区域。
3.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物用于扩增PAH基因的上下游3Mb范围内紧密连锁多态性位点。
4.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述引物的5’端包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
5.权利要求1～4任一项所述的多重PCR引物在获得和/或检测PAH基因序列中的用途。
6.一种试剂盒，其包括权利要求1～4任一所述的多重PCR引物。
7.权利要求6的所述的试剂盒在获得和/或检测PAH基因序列中的用途，其中，获得和/或检测PAH基因序列用于非诊断目的。
8.一种多重PCR的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一所述的多重PCR引物进行所述多重PCR。
9.一种PAH基因检测的方法，其特征在于，包括：
(1)利用权利要求8的所述的方法对待测样品中的至少一部分核酸进行扩增，获得扩增产物；
(2)分析所述扩增产物，以获得PAH基因基因检测结果，
其中，所述方法用于非诊断目的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸为DNA和/或RNA。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸为RNA，步骤(1)包括：
(1-1)利用所述多重PCR引物中的上游或下游引物将所述RNA反转录为cDNA；以及
(1-2)利用所述多重PCR引物中相应的下游或上游引物对所述cDNA进行扩增，获得扩增产物。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：
(2-1)对所述扩增产物进行测序；以及
(2-2)将测序结果分别与PAH基因野生型序列比对，以确定PAH基因的突变位点。
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