CN101245392B - 一种预测出血性脑卒中易感性的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预测出血性脑卒中易感性的方法，属于医学生物技术和基因诊断领域。一种预测出血性脑卒中易感性的方法，通过提取宿主细胞基因组DNA，测定受试者的ANGPT1基因多态性3379位点(rs2507800)的基因型，预测受试者对出血性脑卒中的易感性：ANGPT1基因型为AA纯合子时，受试者的易感性最高；增加出血性脑卒中的风险为1.96倍。本发明中ANGPT1基因的单核苷酸多态性(SNP)具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列位点，是与出血性脑卒中发病相关的高风险位点之一。本发明的优点是：首次阐明了ANGPT1基因多态性位点与出血性脑卒中的相关性，提供了一种预测出血性脑卒中易感性的方法，该方法可用于出血性脑卒中的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

Description

一种预测出血性脑卒中易感性的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种预测出血性脑卒中易感性的方法及试剂盒，更具体地说是通过测定人促血管生成素-1(angiopoietin 1；ANGPT1)多态性位点3379A/T预测受试者对于出血性脑卒中的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于医学生物技术和基因诊断领域。

背景技术

我国在世界上是脑卒中的大国。2003年全球每年死亡5702万人，约1％的死亡率。由于心脑血管病死亡1673万，约占所有死亡的1/3；心脑血管疾病中，550万死于脑卒中，亦约占1/3；而其中420万在发展中国家，其中约一半(200万)是在中国。中国初发脑卒中的发病率已接近发达国家水平(中国：115.61-219/100000/年；发达国家：130-410/100000/年)。来自世界卫生组织(WHO-MONICA，1994～2003年)的最新统计结果表明，目前心脑血管病占我国总死亡原因的40.7％，并呈逐年上升趋势。中国残存脑中风患者700万，冠心病200万，每年新的与复发的脑中风300万，心脏病50万。60岁以上，每5个中有一个患冠心病或脑中风。每6个患者中有一个以“猝死”为“首发，唯一也是最终”的临床表现；每3个心梗中有一个无症状或不典型。心脑血管病也给社会和家庭带来了沉重的经济负担(我国心脑血管病每年耗费至少约3000亿元人民币)。

中国人与西方人群脑卒中的病理类型构成有明显不同。西方以缺血性脑卒中为主(约占脑卒中的80％)，出血性脑卒中少见；而中国人出血性脑卒中与缺血性脑卒中的发病平分秋色。出血性脑卒中，又称为脑中风或脑血管意外，是一组以脑部出血及出血性损伤症状为主要临床表现的疾病，具有发病急，病死率高等特点，同时也是致残率最高的疾病，75％的卒中病后患者有不同程度的残疾。能够找到出血性脑卒中疾病的早期预测标记，具有非常明显的意义。出血性脑卒中的发生是基因遗传倾向和一系列环境危险因素长期作用的结果所导致的，正常血管内的维护修复能够对抗环境危险因素所造成的血管损伤。

目前进行出血性脑卒中的遗传病因研究中，采用单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism)作为基因组标志的关联分析方法是有效的。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需＞1％，SNP是双等位基因标记。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNP在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高，平均每1kb就有1个；代表性强，位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNP在人群中为双等位基因标记，可简单以“+/-或1/0”直接分型，成为很好的遗传标志。

作为本研究的候选基因，促血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANGPT1)是1996年发现的特异作用于血管内皮细胞的生长因子，是受体类酪氨酸激酶Tie-2的特异性配体，与血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)在血管生成过程中有协同作用，促进血管重塑、成熟，维持血管的完整性和调节血管功能，同时还可维持成熟血管中内皮细胞的静息状态和血管的完整。ANGPT1/Tie2还有阻止内皮细胞凋亡，促进血管损伤修复的功能。由于促血管生成素-1在血管内皮细胞的生长和发育过程中具有重要的调节作用，其对于血管生理具有不可忽视的影响。在已知的几个位于ANGPT1基因上的SNP位点中，处于ANGPT1mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)的3379A/T由于处于microRNA204/211的结合区域而受到我们的关注。

MicroRNA是近年来新发现的一类21-25nt长的单链小分子RNA。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。MicroRNA可以与编码基因的mRNA 3’-UTR相结合，形成不完全的碱基配对，抑制mRNA的表达或是促进mRNA的降解。MicroRNA广泛地参与了生长发育的全过程，包括干细胞分化、血细胞形成、心脏和骨骼肌发育、神经发生、胰岛素分泌、胆固醇代谢和免疫应答反应等。同时MicroRNA也涉及一系列的疾病的病理生理过程，包括癌症和心脑血管疾病等。目前普遍认为，大概有30％的人类基因受到MicroRNA的调控。

在MicroRNA与编码基因的mRNA 3’-UTR结合的过程中，MicroRNA5’端的6～7个碱基对于结合的特异性起着决定性的作用，因此被称为“种子序列(seed sequence)”。因此与种子序列相对应的mRNA序列也就显得尤为重要，在这个序列内发生的碱基变化将直接影响MicroRNA与编码基因mRNA的结合，进而影响MicroRNA对基因的调控，而3379A/T正是处于这个区域内。通过实验，我们首次证实，3379A/T确实可以影响microRNA204/211与编码基因mRNA的结合。

由于传统的PCR-酶切分析SNP的方法存在时间长、可重复性差、灵敏度低、准确率低等问题。本发明中，我们使用了新的LDR-PCR测序分型技术对SNP3379A/T进行分析。

发明内容

本发明要解决的首要技术问题是提供一种准确预测出血性脑卒中易感性的方法。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种预测出血性脑卒中易感性的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种预测出血性脑卒中易感性的方法，该方法通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的ANGPT1基因3379位点(rs2507800)的基因型，预测受试者对出血性脑卒中的易感性。

一种分离核酸，是序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。本发明证实，ANGPT1的3379位点基因型为AA纯合子时，受试者的易感性最高；增加出血性脑卒中的风险为1.96倍。

一组预测出血性脑卒中易感性的引物和探针序列(寡核苷酸序列)，能特异性地扩增出含ANGPT1基因的3379位点的扩增产物，具有序列表SEQ ID NO.2-SEQ IDNO.6所示的碱基序列；其中序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列分别为F引物序列和R引物序列；序列表SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.6所示的碱基序列是LDR探针混合物。以上寡核苷酸序列在一次检测中同时使用。

一种预测出血性脑卒中易感性的试剂盒，由以下试剂组成：

20ul 10×HotStar PCR缓冲液，40ul 10mM dNTP混合液，20μl 100mM MgSO₄溶液，20ul 5unit/ul HotStar DNA聚合酶，各2ul 50pmol/ul F和R引物，0.5ul 40unit/ul Taq DNA连接酶，10ul 10×Taq DNA连接酶反应缓冲液，10ul 12.5pmol/ul/each LDR探针混合物，4ml超纯水；F和R引物是序列表SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示的碱基序列；LDR探针混合物是序列表SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20℃。

所述的LDR探针序列SEQ ID No.4的5’端磷酸化，3’端标记荧光染料FAM。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。

本发明具有以下优点：本发明首次阐明了ANGPT1基因多态性位点与出血性脑卒中的相关性，提供了一种预测出血性脑卒中易感性的方法，该方法可用于出血性脑卒中的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。本发明所采用的LDR法是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。这种方法操作简便、结果稳定、灵敏度和准确率高。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为SNP检测结果：3种测序图谱中，图1-1对应SNP3379的AT基因型；图1-2对应SNP3379的AA基因型；图1-3对应SNP3379的TT基因型。

具体实施方式

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下。

需要时，用高压锅(120℃，20分钟)灭菌

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

SDS：十二烷基硫酸钠

TE：10mM Tris-HCl(pH7.5)；1mM EDTA(pH8.0)

10×PCR缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.3)；500mM KCl；15mMMgCl₂

dNTP：脱氧核苷三磷酸

实施例1：检测出血性脑卒中相关风险的试剂盒

一.试剂盒成分

检测出血性脑卒中相关风险的试剂盒，包含有可扩增出ANGPT1基因SNP3379位点的引物对，及其LDR-PCR相应试剂，成分和含量如下，于-20℃保存：

                   表1：PCR扩增试剂(10人份)：

10×HotStar PCR缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM MgCl₂，100μg/ml BSA。

10mM dNTP混合液：dATP，dCTP，dTTP，dGTP各2.5mM。

F引物序列和R引物序列分别为序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

                      表2：LDR检测试剂(10人份)

LDR探针混合物是序列表SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.6所示的碱基，其中SEQ IDNO.4的5’端磷酸化，3’端标记荧光染料FAM。

二.使用方法

1.通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段

(1)PCR系统(20uL体系)

                     表3：PCR系统(20uL体系)

F引物：5’-TGGCAACTAGCAGTCAGAATTT-3’(SEQ ID No.2)

R引物：5’-TGGAATATGCAACATTGTCCTT-3’(SEQ ID No.3)

(2)PCR反应参数：

PCR仪：PERKIN ELMER Gene Amp PCR system 9600；MJ PTC-200 Gradientcycler。

(3)PCR产物检测：

用3％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在LDR反应中加入的量。

PCR产物的序列为序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

2.通过LDR反应测定ANGPT1基因SNP+3379多态性

(1)LDR系统(10uL体系)：

                    表4：LDR系统(10uL体系)：

探针混合物如下：

5’-P-ATATATACAAAAAGAAAATTAATCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’(SEQ IDNO.4)该序列5’端磷酸化，3’端标记荧光染料FAM。

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCAAAACTATTATATGTAAGGGAG-3’.(SEQ ID NO.5)

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCAAAACTATTATATGTAAGGGAA-3’(SEQ ID NO.6)

(2)LDR反应参数：

测序仪：ABI PRISM 377 DNA Sequencer，ABI PRISM 3100 DNA Sequencer。

三.试验结果

测序结果如图1所示，当测序图中出现双峰时，可以确认SNP3379基因型为AT；当测序图为单峰，且峰尖值为102时，可以确认SNP3379基因型为AA；当测序图为单峰，且峰尖值为102时，可以确认SNP3379基因型为TT。

实施例2：收集和基因组DNA的提取

样本由中国医学科学院阜外心血管病医院中德实验室承担的973课题收集的的病例。共计收集出血性脑卒中患者489例，平均年龄58.0±9.7岁，其中男性占63.2％，对照1843例，平均年龄59.3±8.5岁，其中男性占57.6％。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。

根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA：

在抗凝剂EDTA存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至30ng/ul，置-20℃冰箱保存。

实施例3：ANGPT1基因SNP与出血性脑卒中的相关性研究

一.SNP的识别确定

采用实施例1所述的检测试剂盒，运用LDR-PCR测序分型技术对ANGPT1基因的SNP3379位点进行检测。

二.统计方法：利用SPSS13.0软件进行分析，检验Hardy-Weinberg平衡检测，数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P＜0.05认为统计学的差异显著。采用单因素Logistic回归分析计算出血性脑卒中的患病风险OR值及其95％可信区间(CI)。

三.结果

1.病例和对照的基本临床资料：

                       表5：病例和对照的基本临床资料

可见，病例组与对照组间在年龄构成、血压、血脂水平、血糖等方面均有显著差异(P＜0.01)。在体重指数，性别组成上，对照组和病例组之间差异不显著。

2.SNP 3379A/T位点多态性与出血性脑卒中密切相关

       表6：SNP 3379A/T位点多态性与出血性脑卒中相关性

AA基因型在出血性脑卒中患者中的分布与对照组有显著差异(P＜0.01)。在未考虑出血性脑卒中传统危险因子的情况下，以T等位基因作对照，A等位基因可使出血性脑卒中的危险性显著增加(OR 1.96，CI 1.48～2.59)。

3.多因素Logistic回归分析基因多态性与其它危险因素和脑卒中的关联性

Logistic多元回归分析了出血性脑卒中患者年龄、性别、总胆固醇、甘油三脂、体重指数、吸烟、糖尿病史、高血压和ANGPT1基因3379AA基因型对出血性脑卒中的相对危险度。

表7：多因素Logistic回归分析基因多态性与其它危险因素和脑卒中的关联性

在传统的出血性脑卒中危险因素中，高血压会导致出血性脑卒中危险度增高。在校正了传统的出血性脑卒中危险因素以后，与TT基因型相比较后，AA基因型的携带者患脑出血的相对危险度高达2.365(CI 1.508～3.710)。

可见，ANGPT1的3379基因多态性显著与出血性脑卒中的易感性相关。

本发明具有实用性的例证：

1)本发明的ANG基因多态性的检测方法可用于分析ANGPT1基因上的SNP3379位点的多态性，应用在对出血性脑卒中的辅助性诊断和对个体是否有多大的出血性脑卒中患病风险进行评估。以利于开展出血性脑卒中的早期干预和治疗。

2)利用本发明阐述冠出血性脑卒中心病基因的多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节ANGPT1表达的活性分子，促进ANG新药开发。

3)本发明建立的检测ANGPT1基因多态性的核酸序列和出血性脑卒中相关位点，可高灵敏度、特异性地应用于出血性脑卒中基因诊断用的试剂盒。

如上所述，得出结论，ANGPT1基因的多态性与出血性脑卒中具显著相关性。因此，根据本发明，测定多态性可用于进行基因诊断。

本发明叙述了ANGPT1基因出血性脑卒中相关的新突变点，并提供了一种测定ANGPT1基因多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定ANGPT1基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定出血性脑卒中相关基因多态性的基因诊断方法。

                             序列表

Claims (3)

1.一组预测出血性脑卒中易感性的引物，能特异性地扩增出含ANGPT1基因的3379位点的扩增产物，引物序列为序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的序列。

2.一种预测出血性脑卒中易感性的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

20ul 10×HotStar PCR缓冲液，40ul 10mM dNTP混合液，20μl 100mMMgSO₄溶液，20ul 5unit/ul HotStar DNA聚合酶，各2ul 50pmol/ul F和R引物，0.5ul 40unit/ul Taq DNA连接酶，10ul 10×Taq DNA连接酶反应缓冲液，10ul 12.5pmol/ul/each LDR探针混合物，4ml超纯水；F和R引物序列为序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列；LDR探针混合物的碱基序列为序列表SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20℃。

3.根据权利要求2所述的一种预测出血性脑卒中易感性的试剂盒，其特征在于：所述的序列为SEQ ID No.4的LDR探针的5’端磷酸化，3’端标记荧光染料FAM。

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