CN108893532A - 一种用于sma遗传病筛查的基因检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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CN108893532A CN201810804520.6A CN201810804520A CN108893532A CN 108893532 A CN108893532 A CN 108893532A CN 201810804520 A CN201810804520 A CN 201810804520A CN 108893532 A CN108893532 A CN 108893532A
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Abstract

本发明涉及一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括用于SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针，具体为扩增SMN1 Exon7的特异性引物对SEQ ID NO:1‑2、SMN1 Exon7特异性探针SEQ ID NO:3、扩增SMN1 Exon8的特异性引物对SEQ ID NO:4‑5、SMN1 Exon8特异性探针SEQ ID NO：6、SMN1 Exon7的内参ALB特异性引物对SEQ ID NO:7‑8、SMN1 Exon7的内参ALB特异性探针SEQ ID NO:9、SMN1 Exon8的内参ALB特异性引物对SEQ ID NO：7和SEQ ID NO:10、SMN1 Exon8的内参ALB特异性探针SEQ ID NO：9。本发明的技术方案通过设计特异性高的引物及荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明应用于新生儿SMA遗传病谱筛时具有操作简单、检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点。

Description

一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及遗传病基因筛查技术领域，尤其涉及一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒及检测方法。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(SMA)是一组脊髓前角细胞变性、导致对称性肌无力和肌萎缩为特征的常染色体隐性遗传的神经肌肉病，为一种常见的运动神经元疾病，主要表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱等病理性特征，目前尚无有效治疗手段，是两岁以下婴幼儿的头号遗传杀手。脊髓性肌萎缩症不存在种族、性别和年龄差异，携带率约为1/40-1/50，发病率约为1/6000-1/10000。
正常情况下，人类机体会正常表达SMN蛋白和NAIP蛋白，而维护脊髓前角细胞功能。当SMN蛋白和NAIP蛋白表达下降甚至消失后，将导致脊髓前角细胞变性，从而使个体身体躯干和四肢近端骨骼肌进行性肌无力、肌萎缩，即脊髓性肌萎缩症(SMA)。SMA的病因是由于SMA相关基因(主要包含SMN基因和NAIP基因)缺失或突变，导致SMN蛋白和NAIP蛋白表达下降甚至消失而发病，因此通过检测SMN基因和NAIP基因缺失或突变状况，是SMA的主要确诊方法。
运动神经元存活基因1(SMN1)被认为SMA的主要治病基因，位于5号染色体长臂1区编码SMN蛋白，同时被克隆的还有该病的修饰基因SMN2，这两个基因以串联排列在染色体上，在染色体上的位置，SMN1靠近端粒一侧，SMN2位于着丝粒一侧。SMN基因长度为27kb，含有9个外显子(1、2a、2b、3-8)，其转录子长1.7kb，编码含294个氨基酸的SMN蛋白，分子量为38kD。SMN1和SMN2基因之间只有5个核苷酸位点的差异(其中内含子6、外显子7、外显子8各一个，内含子7两个)，通过外显子7、8中非多态性单核苷酸能够将这两个基因区别出来。由于外显子7的中部有一个富含AG的外显子剪接增强子，该剪接增强子在mRNA形成过程中发挥重要作用，SMN2外显子7第6个碱基C→T导致转录大部分跳跃，形成功能不全的选择性剪接产物，且多不稳定。SMN1编码全长SMN蛋白产物，生成完整且稳定的功能蛋白。携带者的2条5号染色体上SMN1基因至少有1个拷贝不存在外显子7和外显子8的缺失(即1拷贝为正常的SMN1基因)；而脊肌萎缩症患者的2条5号染色体上均没有正常的SMN1基因(即0拷贝为正常的SMN1基因)。SMN1的突变包括7号和/或8号外显子缺失以及点突变等类型，其中95％以上为7号和/或8号外显子缺失，其余是SMN1外显子7杂合缺失、带有点突变或小缺失。
目前常用于检测SMN1基因7号和/或8号外显子缺失的方法主要有PCR-RFLP或一代测序、双侧双重AS-PCR、荧光定量PCR、MLPA和PCR-DHPLC。其中RFLP无法区分杂合子；AS-PCR需要凝胶电泳，过程复杂且易造成污染；MLPA虽然为金标准，但过程仍过于繁琐；而荧光定量PCR方法过程简单，闭管操作污染少，且能进行模板定量，成本更低，是众多方法中性价比更高的技术。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提出了一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒及检测方法。本发明的基于荧光定量PCR方法用于新生儿SMA遗传病谱筛准确性高、特异性强、快速、简便、性价比高。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的在于提出了一种SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针，包括扩增SMN1Exon7的特异性引物对、SMN1Exon7特异性探针、扩增SMN1Exon8的特异性引物对、SMN1Exon8特异性探针、SMN1Exon7的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针、SMN1Exon8的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon8的内参ALB特异性探针；所述扩增SMN1Exon7的特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述SMN1Exon7特异性探针序列如SEQ ID NO:3所示，所述扩增SMN1Exon8的特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述SMN1Exon8特异性探针序列如SEQ ID NO:6；所述SMN1Exon7的内参ALB特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，所述SMN1Exon7的内参ALB特异性探针序列如SEQID NO:9所示，所述SMN1Exon8的内参ALB特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQID NO:7和SEQ ID NO:10所示，所述SMN1Exon8的内参ALB特异性探针序列如SEQ ID NO:9所示。
进一步地，所述SMN1Exon7特异性探针、SMN1Exon8特异性探针、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针和SMN1Exon8的内参ALB特异性探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
本发明的第二个目的在于提出一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR缓冲液、权利要求1-2任一项所述的SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针、DNA聚合酶。
进一步地，所述PCR缓冲液由Tris-KCl(pH8.0)、MgCl2(250mM)和dNTP(10mM)组成。
进一步地，所述DNA聚合酶为热启动Taq酶，每个反应用量为0.2-2U。
进一步地，所述试剂盒还包括小牛血清白蛋白BSA，所述小牛血清白蛋白BSA在反应液中终浓度为0.05-1mg/ml。
本发明的第三个目的在于提出一种上述试剂盒筛查SMA遗传病的方法，包括如下步骤：
(1)配制两组PCR反应液，包括反应液Ⅰ和反应液Ⅱ；所述反应液Ⅰ用于检测SMN1第7号外显子缺失，包括PCR缓冲液、扩增SMN1Exon7的特异性引物对、SMN1Exon7特异性探针、SMN1Exon7的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针、DNA聚合酶；所述反应液Ⅱ用于检测SMN1第8号外显子缺失，包括PCR缓冲液、扩增SMN1Exon8的特异性引物对、SMN1Exon8特异性探针、SMN1Exon8的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon8的内参ALB特异性探针、DNA聚合酶；
(2)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；
(3)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成2-20ng/μl；
(4)采用步骤(1)中的两组PCR反应液对所述步骤(3)中得到的模板DNA分别进行PCR扩增，得到两组PCR扩增产物；
(5)对步骤(4)中得到的两组PCR扩增产物进行分析，判断待检测的样本基因组DNA中的SMA遗传病SMN1第7号外显子、SMN1第8号外显子是否缺失。
进一步地，所述反应液Ⅰ包括如下含量的各组分：
所述扩增引物、探针混合液包括SMN1Exon7的特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7特异性探针(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的内参ALB特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的内参ALB特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针(50μM)0.4μL。
进一步地，所述反应液Ⅱ包括如下含量的各组分：
所述扩增引物、探针混合液包括SMN1Exon8的特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8特异性探针(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的内参ALB特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的内参ALB特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的内参ALB特异性探针(50μM)0.4μL。
进一步地，所述步骤(4)中PCR扩增反应条件为：52℃30min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃捕捉荧光信号。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的技术方案通过设计特异性高的引物及荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明应用于新生儿SMA遗传病谱筛时具有操作简单、检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点。
(2)本发明的SMA遗传病相关基因缺失检测试剂盒在突变检测反应液中均添加了内参引物及内参探针，通过内参的扩增能有效避免假阴性出现，最终确保试剂盒检测结果准确无误。
附图说明
图1为实施例2中20145样本EX7扩增曲线。
图2为实施例2中20491样本EX7扩增曲线。
图3为实施例2中20654样本EX7扩增曲线。
图4为实施例2中NTC EX7扩增曲线。
图5为实施例2中20145样本EX8扩增曲线。
图6为实施例2中20491样本EX8扩增曲线。
图7为实施例2中20654样本EX8扩增曲线。
图8为实施例2中NTC EX8扩增曲线。
具体实施方式
展示以下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)。
实施例1：
本发明首先提出了一种SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针，包括扩增SMN1Exon7的特异性引物对、SMN1Exon7特异性探针、扩增SMN1Exon8的特异性引物对、SMN1Exon8特异性探针、SMN1Exon7的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针、SMN1Exon8的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon8的内参ALB特异性探针；其中扩增SMN1Exon7的特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，SMN1Exon7特异性探针序列如SEQ ID NO:3所示，扩增SMN1Exon8的特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，SMN1Exon8特异性探针序列如SEQID NO:6；SMN1Exon7的内参ALB特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，SMN1Exon7的内参ALB特异性探针序列如SEQ ID NO:9所示，SMN1Exon8的内参ALB特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示，SMN1Exon8的内参ALB特异性探针序列如SEQ ID NO:9所示。需要进一步说明的是，SMN1Exon7特异性探针、SMN1Exon8特异性探针、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针和SMN1Exon8的内参ALB特异性探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本实施例中特异性探针如下所示：
SMN1 Exon7特异性探针SEQ ID NO：3
5`-FAM-agacaaaatcaaaaagaaggaaggtgctca-BHQ1-3`
SMN1 Exon8特异性探针SEQ ID NO：6
5`-FAM-cagcacggtggtgaggcagttgag-BHQ1-3`
SMN1 Exon7的内参ALB特异性探针和SMN1Exon8的内参ALB特异性探针SEQ ID NO：9：
5`-VIC-cacagaatccttggtgaacaggcga-BHQ1-3`
基于本实施例中的SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针，本实施例提出一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR缓冲液、上述的SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针、DNA聚合酶。其中PCR缓冲液由Tris-KCl(pH8.0)、MgCl2(250mM)和dNTP(10mM)组成，DNA聚合酶为热启动Taq酶，每个反应用量为0.2-2U，优选为每个反应用量1U。在试剂盒中还可以添加小牛血清白蛋白BSA，用于扩增体系抗抑制及保护Taq酶作用，小牛血清白蛋白BSA在反应液中终浓度为0.05-1mg/ml，优选地，小牛血清白蛋白BSA在反应液中终浓度为0.1mg/ml。
具体地，试剂盒包括反应液Ⅰ和反应液Ⅱ。其中反应液Ⅰ用于检测SMN1第7号外显子缺失，包括PCR缓冲液、扩增SMN1Exon7的特异性引物对、SMN1Exon7特异性探针、SMN1Exon7的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针、DNA聚合酶；所述反应液Ⅱ用于检测SMN1第8号外显子缺失，包括PCR缓冲液、扩增SMN1Exon8的特异性引物对、SMN1Exon8特异性探针、SMN1Exon8的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon8的内参ALB特异性探针、DNA聚合酶。
采用上述试剂盒来筛查SMA遗传病的方法，包括如下步骤：
(1)配制两组PCR反应液，包括反应液Ⅰ和反应液Ⅱ；所述反应液Ⅰ用于检测SMN1第7号外显子缺失，包括PCR缓冲液、扩增SMN1Exon7的特异性引物对、SMN1Exon7特异性探针、SMN1Exon7的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针、DNA聚合酶；所述反应液Ⅱ用于检测SMN1第8号外显子缺失，包括PCR缓冲液、扩增SMN1Exon8的特异性引物对、SMN1Exon8特异性探针、SMN1Exon8的内参ALB特异性引物对、SMN1Exon8的内参ALB特异性探针、DNA聚合酶；
具体的，反应液Ⅰ总体积为12.5μL(2×Mix)，扩增体系的组分、浓度或
含量如下：
所述扩增引物、探针混合液包括SMN1Exon7的特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7特异性探针(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的内参ALB特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的内参ALB特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的内参ALB特异性探针(50μM)0.4μL。
反应液Ⅱ总体积为12.5μL(2×Mix)，扩增体系的组分、浓度或含量如下：
所述扩增引物、探针混合液包括SMN1Exon8的特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8特异性探针(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的内参ALB特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的内参ALB特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的内参ALB特异性探针(50μM)0.4μL。
(2)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；
将待测样本进行DNA提取纯化，待测样本可以为血液、组织或口腔细胞等，提取试剂盒推荐天根或Qiagen血液或组织DNA提取试剂盒，按照其提取试剂盒说明书提取DNA。用nanodrop2000对步骤1提取的DNA进行浓度及纯度测定，260/280在1.7-2.1之间。
(3)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成2-20ng/μl，优选为将DNA样本稀释成5ng/μl备用。
(4)采用步骤(1)中的两组PCR反应液对所述步骤(3)中得到的模板DNA分别进行PCR扩增，得到两组PCR扩增产物。具体操作如下：首先从-20℃冰箱拿出已制备好的2×预混Mix，分别为检测SMN1第7号外显子缺失的SMN1-Exon7检测液(2×Mix)和检测SMN1第8号外显子缺失的SMN1-Exon8检测液(2×Mix)，将上述2种检测液放室温溶解，等待完全溶解后轻微颠倒混匀离心，按终浓度1×分别分装至PCR管，不足部分加入双蒸水，并留出2μl体积作模板体积，反应体积25μl；然后向分装的Mix中加入2μl步骤(3)中已稀释备用的样本DNA。荧光检测通道选择FAM，VIC/HEX检测通道，PCR扩增反应条件为：52℃30min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃同时收集两种荧光信号。
(5)对步骤(4)中得到的两组PCR扩增产物进行分析，判断待检测的样本基因组DNA中的SMA遗传病SMN1第7号外显子、SMN1第8号外显子是否缺失。
SMN1-Exon7和Exon8检测结果判读标准：
同时满足①NTC无扩增Ct值或无S形曲线、②内参Ct值≤36、③-0.5≤Cttarget-Ct内参<0.8，则靶标无缺失即为野生型；
同时满足①NTC无扩增Ct值或无S形曲线、②内参Ct值≤36、③0.8≤Cttarget-Ct内参≤1.6，则靶标为缺失携带者；
当靶标无扩增曲线而内参为正常S型扩增曲线时，则靶标为纯合缺失。
实施例2：采用实施例的试剂盒及方法筛查临床血液样本
1、选取临床上已知结果的3个临床血液样本，样本号分别为样本20145、样本20491、样本20654。
2、采用天根血液DNA提取试剂盒分别提取上述3个临床样本DNA。
3、运用nanodrop2000测定上述3个样本DNA浓度及纯度，结果如表1所示：
表1
样本号 基因型 浓度(ng/μl) 260/280
20145 正常 181.7 2.07
20491 携带者 195 2.07
20654 缺失 195.7 2.00
4、将步骤3中已知浓度的DNA样本用TE稀释成5ng/μL备用
表2
样本号 样本浓度(ng/μl) 样本体积(μl) TE体积(μl) 终浓度(ng/μl)
20145 181.7 5 176.7 5
20491 195 5 190 5
20654 195.7 5 190.7 5
5、从-20℃冰箱拿出已制备好的两种检测液预混Mix(2×)，放室温溶解，等待完全溶解后轻微颠倒混匀离心，分别配制8个反应Mix(4个孔每孔分装23μl反应液ⅠMix，另4个孔每孔分装23μl反应液ⅡMix)，然后3个反应液ⅠMix分别对应加入2μl 3个不同样本的5ng/μl的DNA模板，3个反应液ⅡMix也分别对应加入2μl 3个不同样本的5ng/μl的DNA模板，最后一个反应液ⅠMix和最后一个反应液ⅡMix分别加2μlddH2O。反应体系配制如下：
表3
6、将步骤5的反应液上机进行PCR扩增，热循环条件为52℃30min，95℃10min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃同时收集2种荧光信号。
7、扩增结果分析
PCR扩增结果如图1-图8所示，根据实施例1中的SMN1-Exon7和Exon8检测结果判读标准，由扩增曲线导出Ct值结果如下表：
表4
Sample CtExon7 Ct内参 CtExon7-Ct内参 基因型判定
20145 27.803 27.815 -0.012 野生型
20491 28.730 27.624 1.106 缺失携带者
20654 - 27.205 - 纯合缺失
表5
Sample CtExon8 Ct内参 CtExon8-Ct内参 基因型判定
20145 26.452 26.461 -0.009 野生型
20491 26.952 25.931 1.021 缺失携带者
20654 - 25.283 - 纯合缺失
通过该荧光定量PCR检测试剂盒检测SMN1基因Exon7或(和)Exon8缺失及结果判定标准得出的基因型和待测样本已知结果一致。
序列表
<110> 良培基因生物科技（武汉）有限公司
<120> 一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒及检测方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttcctttat tttccttaca gggttac 27
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attcactttc ataatgctgg cagac 25
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agacaaaatc aaaaagaagg aaggtgctca 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaccatc tgtaaaagac ggg 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttctcaca gctcataaaa ttacc 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtatgtttc atcgacttcc ag 22

Claims (10)

1.一种SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针，其特征在于，包括扩增SMN1 Exon7的特异性引物对、SMN1 Exon7特异性探针、扩增SMN1 Exon8的特异性引物对、SMN1 Exon8特异性探针、SMN1 Exon7的内参ALB特异性引物对、SMN1 Exon7的内参ALB特异性探针、SMN1 Exon8的内参ALB特异性引物对、SMN1 Exon8的内参ALB特异性探针；所述扩增SMN1 Exon7的特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述SMN1 Exon7特异性探针序列如SEQ ID NO:3所示，所述扩增SMN1 Exon8的特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述SMN1 Exon8特异性探针序列如SEQID NO:6；所述SMN1 Exon7的内参ALB特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示，所述SMN1 Exon7的内参ALB特异性探针序列如SEQ ID NO:9所示，所述SMN1 Exon8的内参ALB特异性引物对的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO:7和SEQID NO:10所示，所述SMN1 Exon8的内参ALB特异性探针序列如SEQ ID NO:9所示。
2.根据权利要求1所述的一种SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针，其特征在于，所述SMN1 Exon7特异性探针、SMN1 Exon8特异性探针、SMN1 Exon7的内参ALB特异性探针和SMN1 Exon8的内参ALB特异性探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
3.一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR缓冲液、权利要求1-2任一项所述的SMA遗传病荧光定量检测的引物和探针、DNA聚合酶。
4.根据权利要求3所述的一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由Tris-KCl(pH8.0)、MgCl2(250mM)和dNTP(10mM)组成。
5.根据权利要求3所述的一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为热启动Taq酶，每个反应用量为0.2-2U。
6.根据权利要求3所述的一种用于SMA遗传病筛查的基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括小牛血清白蛋白BSA，所述小牛血清白蛋白BSA在反应液中终浓度为0.05-1mg/ml。
7.一种使用权利要求3-6任一项所述试剂盒筛查SMA遗传病的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制两组PCR反应液，包括反应液Ⅰ和反应液Ⅱ；所述反应液Ⅰ用于检测SMN1第7号外显子缺失，包括PCR缓冲液、扩增SMN1 Exon7的特异性引物对、SMN1 Exon7特异性探针、SMN1Exon7的内参ALB特异性引物对、SMN1 Exon7的内参ALB特异性探针、DNA聚合酶；所述反应液Ⅱ用于检测SMN1第8号外显子缺失，包括PCR缓冲液、扩增SMN1 Exon8的特异性引物对、SMN1Exon8特异性探针、SMN1 Exon8的内参ALB特异性引物对、SMN1 Exon8的内参ALB特异性探针、DNA聚合酶；
(2)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；
(3)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成2-20ng/μl；
(4)采用步骤(1)中的两组PCR反应液对所述步骤(3)中得到的模板DNA分别进行PCR扩增，得到两组PCR扩增产物；
(5)对步骤(4)中得到的两组PCR扩增产物进行分析，判断待检测的样本基因组DNA中的SMA遗传病SMN1第7号外显子、SMN1第8号外显子是否缺失。
8.根据权利要求7所述的一种筛查SMA遗传病的方法，其特征在于，所述反应液Ⅰ包括如下含量的各组分：
所述扩增引物、探针混合液包括SMN1 Exon7的特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon7的特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1 Exon7特异性探针(50μM)0.1μL、SMN1 Exon7的内参ALB特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1 Exon7的内参ALB特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1 Exon7的内参ALB特异性探针(50μM)0.4μL。
9.根据权利要求7所述的一种筛查SMA遗传病的方法，其特征在于，所述反应液Ⅱ包括如下含量的各组分：
所述扩增引物、探针混合液包括SMN1 Exon8的特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1Exon8的特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1 Exon8特异性探针(50μM)0.1μL、SMN1 Exon8的内参ALB特异性上游引物(50μM)0.1μL、SMN1 Exon8的内参ALB特异性下游引物(50μM)0.1μL、SMN1 Exon8的内参ALB特异性探针(50μM)0.4μL。
10.根据权利要求7所述的一种筛查SMA遗传病的方法，其特征在于，所述步骤(4)中PCR扩增反应条件为：52℃30min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃捕捉荧光信号。
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