CN111172254B - 一种smn1基因突变的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种smn1基因突变的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种SMN1基因突变的检测方法及试剂盒，该方案是对当前临床上仅针对SMN1基因缺失型基因检测技术的补充。可有效筛查出携带有方案中涉及点突变位点的SMA患者和SMA点突变携带者。且本发明方案所应用的核酸飞行质谱平台通量高、可实现自动化检测，便于在临床展开大规模人群筛查，对于进一步实现SMA预防有很高的临床应用价值。

Description

一种SMN1基因突变的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明具体涉及生物技术领域，具体涉及一种SMN1基因突变的检测方法及试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy，SMA)是婴幼儿致死的主要遗传疾病之一，是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，表现为脊髓运动神经元变性，骨骼肌萎缩和全身无力。脊髓性肌萎缩症在中的发病率为1/6000-1/10000，全球不同人群携带者频率为1/40-1/50。脊髓性肌萎缩症的致病基因定位于染色体5q13区域的运动神经元生存基因1(survival motor neuron，SMN1)，SMN1基因的拷贝数检测是脊髓性肌萎缩症临床诊断的关键手段。95％的脊髓性肌萎缩患者是SMN1基因纯合缺失或杂合缺失伴点突变，无法生成功能性的SMN蛋白，致脊髓运动神经元退行性病变，称为5qSMA。这其中，90～95％的患者为SMN1基因纯合缺失，另有5％～10％左右的患者为SMN1杂合缺失伴点突变型即复合杂合型。故研究人员根据SMA患者中存在SMN1基因缺失这一机制，应用多种技术如多重连接依赖探针扩增(MLPA)、荧光定量PCR(qPCR)、高分辨率熔解曲线(HRM)等对SMN1基因拷贝数进行定量或半定量分析，以达成对SMN1基因纯合缺失的SMA患者和SMN1基因杂合缺失的SMA携带者的诊断和筛查。
然而针对SMN1致病性点突变的检测研究相对较少，目前对于SMN1致病性点突变的研究报道均基于已确诊的复合杂合型SMA患者。通过对先证者SMN1基因的扩增并测序来检测致病性点突变。方法简述如下：先证者的父母其中一方携带SMN1基因缺失拷贝，另一方携带有先证者(患者)中所检测到的SMN1基因致病性点突变。故对于该家庭来说，父母双方一方为SMN1基因杂合缺失类型的SMA携带者，另一方为SMN1基因致病性点突变类型的SMA携带者，仍有1/4的概率生育SMA患儿。仅针对SMN1基因缺失的检测将造成SMN1基因致病性点突变的SMA携带者漏检，对于该类家庭来说，不能有效的为其提供生育的遗传学指导。然而通过测序的检测SMN1基因点突变耗时繁琐，并不适合于临床大规模的携带者筛查。因此，我们需要一种能适用于临床大规模SMA携带者筛查的SMN1基因点突变检测方案，这对于SMA携带者筛查和SMA预防有着重大意义。迄今已有数百种SMN1基因致病性点突变被报道，不同人种中常见的点突变位点存在较大差异，如中国人群中以c.22dupA最为多见，而白种人群中以c.815A>G和c.821C>T最为常见。
基于飞行质谱技术(MALDI-TOF mass spectrometry,MS)的核酸飞行质谱平台可以对20-40个突变位点进行多重检测，具有自动化、高灵敏度、高特异性的特点。本应用发明基于核酸飞行质谱平台开发了一种单管完成19种常见SMN1基因点突变的检测方案。核酸飞行质谱平台现已实现自动化，故本发明便于在临床推广应用，适用于大规模的人群筛查。
在专利CN110468192A中通过应用核酸飞行质谱平台建立了脊髓性肌萎缩症基因检测方案，单管完成SMN1基因6个点突变检测和SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2基因拷贝数定量。其中点突变检测结果直接依据单碱基延伸反应所生成的延伸产物分子量判断基因型。拷贝数定量则需通过获得各目的基因的峰面积值，对各目的基因的峰面积值进行拷贝数的校正计算。具体通过用无拷贝数变异的内参基因进行校正，再根据参照样本和待检样本该比值以及结合参比样本目标基因拷贝数进行计算，对待检样本拷贝数进行推算。但该方案中仅包含6个SMN1点突变位点(c.5C>T、c.22dupA、c.275G>C、c.683T>A、c.819_820insT、c.830A>G)，但SMN1常见点突变位点众多，根据现有文献报道在国内外人群中发现频率相对较高的点突变在20-30个左右，已发现的SMN1点突变有数百个，仅针对这6个位点设计检测对于SMA点突变患者的检出和SMA点突变携带者的检出仍有极大局限性。
在专利CN109136366A中通过应用等位基因特性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)对目的位点进行扩增，其后通过毛细管电泳技术对目的位点野生型和突变型进行分型。对于每个检测位点设计三条引物，对两种分型分别设计一条不同长度的特异引物，以及一条荧光标记的上游或下游引物。每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增。完成PCR扩增和毛细管电泳检测后，通过特定荧光标记、特定长度的扩增产物即可判定样本特定位点是否存在特定基因型。该检测方案可通过单管多重PCR扩增反应达成对22个SMN1基因致病性突变位点的检测。但由于野生、突变型引物比较接近，不易区分；存在不同位点间的片段区分度不大；受毛细电泳管检测区间的长度限制，检测突变位点有限的缺点
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，为SMA点突变患者的诊断和SMA点突变携带者在临床上的大规模筛查提供高通量、准确的检测方案，本发明提供了一种SMN1基因突变的检测方法及试剂盒，该方案是对纯合缺失型SMA患者检测方案的补充，通过核酸飞行质谱这一自动化平台在临床上实现对约98％SMA患者(纯合缺失型SMA患者和携带有方案中涉及点突变的复合杂合型SMA患者)诊断、SMA常见点突变携带者筛查的提供易行高效的方案支持。
本发明采用的技术解决方案是：一种SMN1基因突变的检测方法,包括以下步骤：
基于已报道的文献和LOVD database汇总了中国人群和外国人群中SMN1基因点突变的热点突变，对公开数据库中所能检索到的SMA相关SMN1基因第1外显子、SMN1基因第3外显子、SMN1基因第5外显子、SMN1基因第6外显子、SMN1基因第7外显子上19个常见致病性点突变，设计PCR引物，通过PCR引物混合液采用多重PCR扩增在单管反应中对这些突变所在的外显子特定区域进行扩增，其后应用虾碱性磷酸酶去除扩增反应后体系中残余的dNTPs，最后加入上述设计的目的基因位点的延伸引物的延伸引物混合液，进行单碱基延伸反应。
所述的PCR引物混合液包括针对SMN1第1外显子的上游引物SMN1_E1_F、下游引物SMN1_E1_R；针对SMN1第3外显子的上游引物SMN1_E3_F、下游引物SMN1_E3_FR；针对SMN1第5外显子的的上游引物SMN1_E5_F、下游引物SMN1_E5_R；针对SMN1第6外显子的上游引物SMN1_E6_F、下游引物SMN1_E6_R；针对SMN1第7内含子及第7外显子的上游引物SMN1_E7_F、下游引物SMN1_E7_R。
所述的针对SMN1第1外显子的上游引物SMN1_E1_F和下游引物SMN1_E1_R的序列分别为(5’-3’)：
SMN1_E1_F：ACGTTGGATGTCACTCTTAAGAAGGGACGGG；
SMN1_E1_R：ACGTTGGATGCTAATAGGGAGACTGCACTGG。
所述的针对SMN1第3外显子的上游引物SMN1_E3_F和下游引物SMN1_E3_R的序列分别为(5’-3’)：
SMN1_E3_F：ACGTTGGATGGTTCTGCCATTTGGTCAGAAG；
SMN1_E3_R：ACGTTGGATGGGGAAAGTAGATCGGACAGAT。
所述的针对SMN1第5外显子的上游引物SMN1_E5_F和下游引物SMN1_E5_R的序列分别为(5’-3’)：
SMN1_E5_F：ACGTTGGATGACTGGTGGTCCAGAAGGAAATG；
SMN1_E5_R：ACGTTGGATGCAGGTCTAAAATTCAATGGCCC。
所述的针对SMN1第6外显子的上游引物SMN1_E6_F和下游引物SMN1_E6_R的序列分别为(5’-3’)：
SMN1_E6_F：ACGTTGGATGGATGCTGAGTGATTACTTACC；
SMN1_E6_R：ACGTTGGATGTCTGTCTCCAGATAATTCCCC。
所述的针对SMN1第7外显子的上游引物SMN1_E7_F和下游引物SMN1_E7_R的序列分别为(5’-3’)：
SMN1_E7_F：ACGTTGGATGCTATATATAGCTATCTATGTC；
SMN1_E7_R：ACGTTGGATGTAATGCTGGCAGACTTACTCC。
所述的延伸引物混合液中各延伸引物的序列如下(5’-3’)：
C5G&C5T_U：TTCCGCCGCTGCTCATC；
22dupA_U：GACGCCGCCACCACT；
G40T_U：GTGGAATCCTCCTGCT；
C43T_U：TTGGCGTCCCGGAG；
56delT_U：ACTTGGCCGCGCCGGAACAGC；
A326G_U：GAGGTCAGAAGACGGTTGCATTT；
G400A&400_402del2_U：TCGGACAGATTTTGCTCCT；
T683A_U：CACCACCACCCCACTT；
C689T_U：ATTACCACCCCACTTACTAT；
744del1_U：CAGATAATTCCCCCACCACCTCC；
768_778dup_U：ATGATGCTGATGCTTTG；
811_814dup4_U：CATGGTACATGAGTGGCT；
A815G_U：AGCATATAATAGCCAGTATGA；
C821T_U：GATTACTTACCATATAATAGCCA；
835-5G_U：TTTGTCTGAAACCCTGT；
G835-1A_U：GGTTTTTGATTTTGTCTGAAACC；
G863T_U：GTTTAAGGAATGTGAGCAC。
所述的SMN1基因突变的检测方法的具体操作方法如下：
(1)获取待测样本：提取人类基因组DNA，在PCR反应中加入10-100ng DNA进行扩增；
(2)阴性参考样本准备：构建稳定细胞系，细胞系中对于所检测的位点均为野生型序列，并从该细胞系中提取DNA作为阴性对照，PCR反应中每个反应加入10-100ng DNA进行扩增；
阳性参考样本准本：人工构建点突变质粒标准品；
(3)样本检测：配置多重PCR反应体系(5μL)，将待测样本及阴性和阳性参考样本依序加入反应孔位，加样体积均为2μL，执行PCR反应程序，进行PCR反应；
(4)向步骤3中所得的5μL PCR产物依序加入2μL SAP反应液，执行SAP反应程序，进行SAP反应；
(5)向步骤4中所得的7μL SAP反应产物依序加入2μL延伸反应液，执行延伸反应程序，进行延伸反应；
(6)将步骤5中获得的延伸反应产物通过核酸飞行质谱平台点样分析获取数据；
一种用检测于SMN1基因突变的试剂盒，所述的试剂盒包含权利要求1-9中所述的所有针对SMN1基因点突变的设计的PCR引物和目的基因位点的延伸引物。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种SMN1基因突变的检测方法及试剂盒，该方案是对当前临床上仅针对SMN1基因缺失型基因检测技术的补充。可有效筛查出携带有方案中涉及点突变位点的SMA患者和SMA点突变携带者。且本发明方案所应用的核酸飞行质谱平台通量高、可实现自动化检测，便于在临床展开大规模人群筛查，对于进一步实现SMA预防有很高的临床应用价值。
附图说明
图1实施例核酸飞行质谱平台点样分析获取数据图。
如图一所示为应用本方案对部分人工构建质粒的质谱检测结果：(1)在野生型质粒的检测结果中可见单一的相应野生型的延伸产物峰(WT)；(2)在突变型质粒的检测结果中可见单一的相应突变型的延伸产物峰(MUT)；(3)在野生型质粒与突变型质粒混合(模拟杂合点突变携带者)的检测结果中可见相应野生型和突变型的延伸产物峰。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明基于已报道的文献和LOVD database汇总了中国人群和外国人群中SMN1基因点突变的热点突变，并基于此设计了SMN1常见点突变的核酸飞行质谱检测方案。
本发明在一个试剂盒内包含SMN1第1外显子、SMN1第3外显子、SMN1第5外显子、SMN1第6外显子、SMN1第7外显子上19个常见致病性点突变的检测。通过多重PCR扩增在单管反应中对这些突变所在的外显子特定区域进行扩增(multi-plex PCR反应)。其后应用虾碱性磷酸酶去除扩增反应后体系中残余的dNTPs(SAP反应)。最后加入上述设计的目的基因位点的延伸引物，进行单碱基延伸反应(延伸反应)。
点突变检测PCR引物混合液：
包含以下引物(浓度均为2μM)：针对SMN1第1外显子的上游引物SMN1_E1_F、下游引物SMN1_E1_R；针对SMN1第3外显子的上游引物SMN1_E3_F、下游引物SMN1_E3_FR；针对SMN1第5外显子的的上游引物SMN1_E5_F、下游引物SMN1_E5_R；针对SMN1第6外显子的上游引物SMN1_E6_F、下游引物SMN1_E6_R；针对SMN1第7内含子及第7外显子的上游引物SMN1_E7_F、下游引物SMN1_E7_R。
各引物序列如下(5’-3’)：
SMN1_E1_F：ACGTTGGATGTCACTCTTAAGAAGGGACGGG
SMN1_E1_R：ACGTTGGATGCTAATAGGGAGACTGCACTGG
SMN1_E3_F：ACGTTGGATGGTTCTGCCATTTGGTCAGAAG
SMN1_E3_R：ACGTTGGATGGGGAAAGTAGATCGGACAGAT
SMN1_E5_F：ACGTTGGATGACTGGTGGTCCAGAAGGAAATG
SMN1_E5_R：ACGTTGGATGCAGGTCTAAAATTCAATGGCCC
SMN1_E6_F：ACGTTGGATGGATGCTGAGTGATTACTTACC
SMN1_E6_R：ACGTTGGATGTCTGTCTCCAGATAATTCCCC
SMN1_E7_F：ACGTTGGATGCTATATATAGCTATCTATGTC
SMN1_E7_R：ACGTTGGATGTAATGCTGGCAGACTTACTCC
点突变检测延伸引物混合液：
包含针对上述19个位点所设计的延伸引物，具体配置如下表：
各延伸引物序列如下(5’-3’)：
C5G&C5T_U：TTCCGCCGCTGCTCATC
22dupA_U：GACGCCGCCACCACT
G40T_U：GTGGAATCCTCCTGCT
C43T_U：TTGGCGTCCCGGAG
56delT_U：ACTTGGCCGCGCCGGAACAGC
A326G_U：GAGGTCAGAAGACGGTTGCATTT
G400A&400_402del2_U：TCGGACAGATTTTGCTCCT
T683A_U：CACCACCACCCCACTT
C689T_U：ATTACCACCCCACTTACTAT
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G835-1A_U：GGTTTTTGATTTTGTCTGAAACC
G863T_U：GTTTAAGGAATGTGAGCAC
检测时的具体操作方法如下：
获取待测样本：提取人类基因组DNA，在PCR反应中加入10-100ng DNA进行扩增；
阴性参考样本准备：构建稳定细胞系，细胞系中对于所检测的位点均为野生型序列，并从该细胞系中提取DNA作为阴性对照，PCR反应中每个反应加入10-100ng DNA进行扩增。
阳性参考样本准本：人工构建点突变质粒标准品
1.多重PCR反应体系配置，总反应体积5μL，如下表：
样本检测：将待测样本及参考样本依序加入反应孔位，加样体积均为2μL(10-100ng)。PCR反应程序设置如下表：
2.SAP反应体系配置如下表：
向步骤1中所得的5μL PCR产物依序加入2μL SAP反应液。SAP反应程序设置如下表：
3.延伸反应体系配置如下表：
向步骤2中最后所得的7μL SAP后产物依序加入2μL延伸反应液。延伸反应程序设置如下表：
4.将步骤3中获得的延伸反应产物通过核酸飞行质谱平台点样分析获取数据。
5.结果分析：通过分析步骤4种所获得数据，判定待测样本是否携带有检测目录中所包含的致病性点突变。若含有上述致病性点突变，则进一步结合拷贝数变异检测结果分析判定其是复合杂合型突变患者或致病性点突变携带者。
实施例1
以人工构建的点突变质粒测试点突变检测方案，人工构建了前述19种点突变的19个点突变质粒，现对其中部分点突变质粒进行验证。
1.样本准备：稀释野生型质粒、突变型质粒样本至8000copies/μl模拟人基因组DNA，分别作为反应一、反应二的反应模板；将突变型质粒与野生型质粒混合模拟点突变携带者样本，将此作为反应三的反应模板。
2.多重PCR反应体系配置，总反应体积10μL，如下表：
样本检测：将待测样本及参考样本依序加入反应孔位，加样体积均为2μL。
PCR反应程序设置如下表：
3.SAP反应体系配置如下表：
向步骤2中最后所得的5μL PCR产物依序加入2μL SAP反应液。
SAP反应程序设置如下表：
4.延伸反应体系配置如下表：
延伸反应程序设置如下表：
5.将步骤4中获得的延伸反应产物通过核酸飞行质谱平台点样分析获取数据，结果如图1所示。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 浙江中创生物医药有限公司
<120> 一种SMN1基因突变的检测方法及试剂盒
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagataattc ccccaccacc tcc 23
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgatgctga tgctttg 17
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
catggtacat gagtggct 18
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agcatataat agccagtatg a 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gattacttac catataatag cca 23
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tttgtctgaa accctgt 17
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggtttttgat tttgtctgaa acc 23
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtttaaggaa tgtgagcac 19

Claims (2)

1.一种用检测于SMN1基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含针对SMN1基因点突变中SMA相关SMN1基因第1外显子、SMN1基因第3外显子、SMN1基因第5外显子、SMN1基因第6外显子、SMN1基因第7外显子上19个常见致病性点突变设计的PCR引物及PCR引物混合液和目的基因位点的延伸引物及延伸引物混合液，所述的PCR引物混合液包括针对SMN1第1外显子的上游引物SMN1_E1_F、下游引物SMN1_E1_R；针对SMN1第3外显子的上游引物SMN1_E3_F、下游引物SMN1_E3_FR；针对SMN1第5外显子的的上游引物SMN1_E5_F、下游引物SMN1_E5_R；针对SMN1第6外显子的上游引物SMN1_E6_F、下游引物SMN1_E6_R；针对SMN1第7内含子及第7外显子的上游引物SMN1_E7_F、下游引物SMN1_E7_R；
所述的针对SMN1第1外显子的上游引物SMN1_E1_F和下游引物SMN1_E1_R的序列分别为：
SMN1_E1_F：ACGTTGGATGTCACTCTTAAGAAGGGACGGG；
SMN1_E1_R：ACGTTGGATGCTAATAGGGAGACTGCACTGG；
所述的针对SMN1第3外显子的上游引物SMN1_E3_F和下游引物SMN1_E3_R的序列分别为：
SMN1_E3_F：ACGTTGGATGGTTCTGCCATTTGGTCAGAAG；
SMN1_E3_R：ACGTTGGATGGGGAAAGTAGATCGGACAGAT；
所述的针对SMN1第5外显子的上游引物SMN1_E5_F和下游引物SMN1_E5_R的序列分别为：
SMN1_E5_F：ACGTTGGATGACTGGTGGTCCAGAAGGAAATG；
SMN1_E5_R：ACGTTGGATGCAGGTCTAAAATTCAATGGCCC；
所述的针对SMN1第6外显子的上游引物SMN1_E6_F和下游引物SMN1_E6_R的序列分别为：
SMN1_E6_F：ACGTTGGATGGATGCTGAGTGATTACTTACC；
SMN1_E6_R：ACGTTGGATGTCTGTCTCCAGATAATTCCCC；
所述的针对SMN1第7外显子的上游引物SMN1_E7_F和下游引物SMN1_E7_R的序列分别为：
SMN1_E7_F：ACGTTGGATGCTATATATAGCTATCTATGTC；
SMN1_E7_R：ACGTTGGATGTAATGCTGGCAGACTTACTCC；
所述的延伸引物混合液中各延伸引物的序列如下：
C5G&C5T_U：TTCCGCCGCTGCTCATC；
22dupA_U：GACGCCGCCACCACT；
G40T_U：GTGGAATCCTCCTGCT；
C43T_U：TTGGCGTCCCGGAG；
56delT_U：ACTTGGCCGCGCCGGAACAGC；
A326G_U：GAGGTCAGAAGACGGTTGCATTT；
G400A&400_402del2_U：TCGGACAGATTTTGCTCCT；
T683A_U：CACCACCACCCCACTT；
C689T _U：ATTACCACCCCACTTACTAT；
744del1_U：CAGATAATTCCCCCACCACCTCC；
768_778dup_U：ATGATGCTGATGCTTTG；
811_814dup4_U：CATGGTACATGAGTGGCT；
A815G_U：AGCATATAATAGCCAGTATGA；
C821T_U：GATTACTTACCATATAATAGCCA；
835-5G_U：TTTGTCTGAAACCCTGT；
G835-1A_U：GGTTTTTGATTTTGTCTGAAACC；
G863T_U：GTTTAAGGAATGTGAGCAC。
2.一种非诊断目的的采用权利要求1所述的试剂盒针对SMN1基因突变的检测方法，其特征在于，所述的SMN1基因突变的检测方法的具体操作方法如下：
（1）获取待测样本：提取人类基因组DNA，通过nanodrop定量即可，后续PCR反应中每个反应加入10-20ng DNA进行扩增；
（2）阴性对照样本准备：构建稳定细胞系，无设计中包含的任意点突变，并从该细胞系中提取DNA作为阴性对照，DNA定量，后续PCR反应中每个反应加入10-20ng DNA进行扩增；
阳性对照样本准本：人工构建点突变质粒标准品；
（3）样本检测：配置多重PCR反应体系5µL，将待测样本及参考样本依序加入反应孔位，加样体积均为2µL，执行PCR反应程序，进行PCR反应；
（4）向步骤3中所得的5µL PCR产物依序加入2µL SAP反应液，执行SAP反应程序，进行SAP反应；
（5）向步骤4中所得的7µL SAP反应产物依序加入2µL 延伸反应液，执行延伸反应程序，进行延伸反应；
（6）将步骤5中所得的延伸反应产物通过核酸飞行质谱平台点样分析获取数据。
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