CN101880731A

CN101880731A - 肝炎病毒变异的多重检测

Info

Publication number: CN101880731A
Application number: CN201010173216.XA
Authority: CN
Inventors: 丁春明; 栾菊; 周伯平; 袁静; 陈心春; 张红梅
Original assignee: Third Peoples Hospital of Shenzhen; Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Third Peoples Hospital of Shenzhen; Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2009-05-06
Filing date: 2010-05-06
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2030-05-06
Also published as: US8435764B2; CN101880731B; US20100286291A1

Abstract

公开了检测病毒变异的方法以及基于病毒变异的检测来治疗个体的病毒感染的方法。另外，提供了用于检测病毒变异的试剂盒。

Description

肝炎病毒变异的多重检测

技术领域

本发明一般地涉及检测病毒变异的方法和试剂盒。

背景技术

肝炎是最常由病毒感染引起的肝的炎症。有5种主要的肝炎病毒，称为甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病毒。

甲型肝炎和戊型肝炎通常由摄入受污染的食物或水引起。乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎通常由与被感染体液(例如，来自输血或使用被污染器具的侵入性医疗程序)的胃肠外接触而引起。乙型肝炎还通过性接触传播。

在全世界范围内，估计有4亿人慢性感染乙型肝炎病毒(HBV)。慢性乙型肝炎(CHB)感染是肝硬化和肝细胞癌(HCC)最常见的原因，并且每年估计有500,000至900,000例死亡。连续的HBV复制提高了进展成肝硬化和HCC的风险(28-31)。

乙型肝炎病毒(HBV)基因组的变异可以自发地发生或在抗病毒疗法的选择性压力下发生。这些变异中的一些赋予了抗药性，从而导致治疗失败，这可以进一步导致肝炎再激活和肝代偿失调(32)。

发明概述

一方面提供检测肝炎病毒(HV)变异的方法，该方法包括a)提供来自患有HV感染的个体的HV的DNA分子作为模板，其中该DNA分子包含HV变异位点；b)沿该模板延伸多重延伸引物以获得含有所述变异位点的核苷酸的延伸产物；以及c)通过质谱术(MS)分析该延伸产物以检测HV变异。

另一方面提供治疗个体的肝炎病毒(HV)感染的方法，该方法包括a)根据本文公开的检测方法检测个体的HV变异，其中该HV变异与抗药性有关；b)基于所述检测评价个体的抗药性；以及c)基于该评价治疗所述个体。

又一方面提供通过质谱术分析检测肝炎病毒(HV)变异的试剂盒，该试剂盒包括本文公开的多重延伸引物。

附图简述

图1是多重延伸测定1的代表性质谱。整个原始质谱示于图1a。峰的强度是任意单位。图1b放大一个测定(nt 367)。“引物”表示未被延伸的引物。T和C分别表示突变体序列(T)和野生型序列(C)的延伸产物。

图2表示每一变异的检出率(call rate)和每一样品的检出率。图2a中显示了每组的每一变异的检出率(TN表示未治疗(treatment naive)，DR表示抗药性)。大部分的变异具有较高的检出率(88.3％的变异实现了高于90％的检出率)。图2b中显示了每一样品的检出率(通过其X轴的病毒载量显示)。抗药性样品更可能具有较低的检出率。检出率小于90％的全部样品都是抗药性样品。

图3是延伸反应的热谱(thermal profile)。将具有两个循环环(cyclingloops)的200-短-循环程序用于延伸反应。5-循环环位于40-循环环中。

图4A-E描述PCR引物与不同HBV基因型的比对。设计了4条引物，251F和1004R用于逆转录酶，1593F和1950R用于前核心(precore)和核心启动子。

图5是示例性的质谱。图5a)MS检测到野生型和突变体序列两者，而测序只检测到一种序列；图5b)测序检测到野生型和突变体序列两者，而MS只检测到一种序列。

图6A-B示出延伸引物的实例。MW表示分子量，UEP表示未被延伸的引物，EP表示被延伸的引物。

具体实施方式

本发明的实施，除另有所指，将使用分子生物学、病毒学、细胞生物学、微生物学和生物化学领域的技术人员所熟知的常规方法。这类方法在文献中详细说明。在本文中引用的出版物、专利和专利申请均通过引用其整体并入本文。

为了解释本说明书，将应用下述定义，并且在任何合适的情况下，以单数使用的术语还包括复数，反之亦然。在下文所列的任何定义与包括通过引用的方式并入本文的任何文件在内的任何其它文件中的该词语的使用相冲突的情况下，除非明确地意在相反的含义(例如，为理解原用该术语的文件)，该词语将使用下文所列的定义以解释本说明书及相关的权利要求。

在本文中，术语“变异”指病毒的遗传变异。

在本文中，术语“变异位点”旨在表示存在变异的核苷酸位点。

在本文中，术语“DNA”旨在表示脱氧核苷酸的任何聚合物。

在本文中，术语“互补”或“互补性”用于借助碱基配对规则关联的核苷酸/多核苷酸。对于多核苷酸，“互补”可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸碱基根据碱基配对规则匹配；或者，在多核苷酸之间可以有“完整”或“完全”的互补性。

本文公开的一方面涉及检测肝炎病毒(HV)变异的方法，该方法包括下述步骤：a)提供来自患有HV感染的个体的HV的DNA分子作为模板，其中该DNA分子包含HV变异位点；b)沿该模板延伸多重延伸引物以获得含有所述变异位点的核苷酸的延伸产物；以及c)通过质谱术(MS)分析该延伸产物以检测HV变异。

示例性的HV是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒。优选地，HV是HBV。

与人SNP相比，HV变异以高得多的密度发生在HV基因组中。HV可以以准种存在，以致某些HV变异可以只以较小比例存在，而杂合SNP以1∶1的比率存在。

HV变异包括但不限于与HV的毒力、病毒逃逸和/或抗药性有关的变异。在某些实施方案中，HV变异是与HV的抗药性有关的变异，包括已记录其在抗药性中的功能性作用的HV变异和/或在衍生自经历抗HV疗法的患者血清样品中已检测到的HV变异。在特定实施方案中(其中HV是HBV)，与抗药性有关的变异示例性地列于表1。

表1.突变总结

本文公开的HV的DNA分子包括但不限于，HV的编码序列、非编码序列、及其片段。在某些实施方案中，DNA分子是HBV逆转录酶基因、HBV基本核心/前核心启动子、或其片段。

可以提供一种或多种不同的DNA分子，其中每一DNA分子包含至少一个目的HV变异位点。在特定实施方案中，HV变异位点是如表l所列的HBV变异位点。

可以从患有HV感染的个体的样品提供DNA分子。该个体可以是未治疗的个体或者是抗药性的个体。示例性样品包括但不限于，个体的肝细胞、肝组织样本、血清、血浆和血液。在某些实施方案中，可以从多于一个的个体的样品提供DNA分子。

在一实施方案中，可以从如本文公开的样品提取和/或扩增DNA分子。

可以利用可商购的DNA制备试剂盒、特别地用于动物的DNA提取试剂盒，根据制造商的操作步骤，来进行DNA分子的提取。

在某些实施方案中，如本文所公开的，从个体的样品提取HV RNA，然后反转录成DNA分子。可以利用可商购的试剂盒来进行RNA提取和反转录反应。

在某些实施方案中，在延伸多重延伸引物前，可以通过PCR、RT-PCR或其它方法，利用扩增引物从提取的DNA或RNA扩增DNA分子。PCR、RT-PCR或其它方法可以利用可商购的试剂盒，根据制造商的操作步骤来进行。给定待扩增的特定DNA分子和特定扩增引物后，PCR、RT-PCR或其它方法的热谱或其优化可以由技术人员确定或进行。

扩增引物可以根据待扩增的DNA分子来设计。在优选的实施方案中，扩增引物可以通过比对来自不同HV基因型的基因组序列来设计。在另一优选的实施方案中，可以向扩增引物的5’-端添加序列标签来增加其分子量以避免质谱中的任何干扰。在又一优选的实施方案中，DNA分子的5’-部分和3’-部分对应于HV的高度保守的基因组区域，其中每个部分代表扩增引物。

扩增引物的长度可以是10个至50个核苷酸，优选长度为15至35个核苷酸。

在某些实施方案中，当HV变异位点存在于多于一种DNA分子中时，扩增可以是多重扩增。所述多重可以是2重至50重、特别地2重至30重。扩增引物可以是为不同DNA分子设计的多重扩增引物。在优选的实施方案中，多重扩增引物被设计为避免引物交叉杂交。在特定实施方案中，多重扩增引物是与SEQ ID NOs：1-4中所示的那些引物具有70％、80％、85％、优选地90％、更优选地95％、甚至更优选地100％同一性的引物。

在特定实施方案中，通过2重PCR，利用如SEQ ID NOs：1-4中所示的引物来扩增DNA分子。PCR反应(25μL)可以含有5μL HBV DNA、200nM的每一引物(SEQ ID NOs：1-2)、100nM的每一引物(SEQ ID NOs：3-4)、1×缓冲液(含有1.5mM Mg²⁺)、1.0mM额外的Mg²⁺、200μM dNTP(每种)、以及0.5单位的Hotstar Taq聚合酶(Qiagen)。可以以95℃，15min起始PCR；然后进行45个循环的95℃变性40sec，57℃退火30sec和72℃延伸1.5min；并且最后在72℃延伸3min。

可以在进一步处理后提供DNA分子。处理可以是去磷酸化。在某些实施方案中，可以用包括但不限于虾碱性磷酸酶(SAP)的去磷酸化试剂处理扩增的DNA分子。

在某些实施方案中，如本文所公开的多重延伸可以优选地是单核苷酸延伸。将多重延伸用于延伸多重引物以包含HV的多于一个变异位点的核苷酸。延伸的方向可以是从延伸引物的5’至3’。多重可以是2重至72重、特别是2重至36重。延伸可以利用可商购的引物延伸试剂盒来进行。特别地，引物延伸试剂盒是包括于用于引物延伸iPLEX^TM反应的MassARRAY iPLEX^TM(Sequenom，Inc，San Diego，CA)的试剂盒。延伸的热谱或其优化可以由技术人员确定或进行。

在某些实施方案中，使用如图3所示的MassARRAY iPLEX^TM的标准热谱。延伸反应混合物可以含有7μL PCR-SAP产物、0.2μL 10×iPLEX增强缓冲液(buffer plus)、包含修饰的ddNTPs的0.2μL iPLEX终止混合物、0.94μL延伸引物混合物、0.041μL iPLEX热测序酶(thermosequenase)。

为多于一个的HV变异设计多重延伸引物。每一多重延伸引物可以基于其靶HV变异位点来设计。特别地，多重延伸引物可以被设计为可与HV变异位点的核苷酸的紧邻3’下游杂交。更特别地，多重延伸引物可以与HV变异位点的核苷酸的紧邻3’下游互补。甚至更特别地，多重延伸引物的3’端可以与连接至HV变异位点的核苷酸的3’的那一核苷酸互补。

在某些实施方案中，多重延伸引物可以是针对相同靶变异位点的简并引物的混合物，其中另一或另外多个HV变异位点与靶变异位点的核苷酸的3’端相邻。

在优选的实施方案中，可以向多重延伸引物的5’端添加序列标签来增加其分子量以避免质谱中的任何干扰。

多重延伸引物的长度可以是10个至50个核苷酸，特别地长度为15个至35个核苷酸，更特别地长度为15个至28个核苷酸。

可以调节多重延伸引物的浓度以补偿由不同多重延伸引物的序列和分子量的差异所导致的MS中信号强度的差异。可以基于所产生的实际质谱数据来进行调节。

在一实施方案中，延伸是12重的，其使用的多重延伸引物与SEQ IDNOs：5-16中所示的那些引物具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、优选地98％、更优选地99％、甚至更优选地100％的同一性。

在另一实施方案中，延伸是17重的，其使用的多重延伸引物与SEQID NOs：17-33中所示的那些引物具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、优选地98％、更优选地99％、甚至更优选地100％的同一性。

在又一实施方案中，延伸是17重的，其使用的多重延伸引物与SEQID NOs：34-50中所示的那些引物具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、优选地98％、更优选地99％、甚至更优选地100％的同一性。

在再一实施方案中，延伸是14重的，其使用的多重延伸引物与SEQID NOs：51-64中所示的那些引物具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、优选地98％、更优选地99％、甚至更优选地100％的同一性。

本文所公开的延伸产物，即被延伸的多重延伸引物，可以通过MS来分析，从而鉴定同样包含在该延伸产物中的HV变异位点的核苷酸。MS分析可以通过可商购的MS设备，根据制造商的操作步骤来进行。数据分析可以利用可商购的MS数据分析软件来进行。

在某些实施方案中，MS可以是基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱术(MALDI-TOF MS)。

MS分析可以包括延伸产物处理步骤，例如在将样品进样至MS设备前的脱盐作用。

另一方面涉及治疗个体的肝炎病毒(HV)感染的方法，该方法包括下述步骤：a)根据本文所公开的检测方法检测个体的HV变异，其中该HV变异与抗药性有关；b)基于所述检测评价个体的抗药性；以及c)基于该评价治疗所述个体。

又一方面涉及通过质谱术分析检测肝炎病毒(HV)变异的试剂盒，该试剂盒包括本文所公开的多重延伸引物。

在一实施方案中，多重延伸引物是与SEQ ID NOs：5-16中所示的那些引物具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、优选地98％、更优选地99％、甚至更优选地100％同一性的引物。

在另一实施方案中，多重延伸引物是与SEQ ID NOs：17-33中所示的那些引物具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、优选地98％、更优选地99％、甚至更优选地100％同一性的引物。

在又一实施方案中，多重延伸引物是与SEQ ID NOs：34-50中所示的那些引物具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、优选地98％、更优选地99％、甚至更优选地100％同一性的引物。

在再一实施方案中，多重延伸引物是与SEQ ID NOs：51-64中所示的那些引物具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、优选地98％、更优选地99％、甚至更优选地100％同一性的引物。

试剂盒还可以包括本文所公开的扩增引物。

在特定实施方案中，扩增引物是与SEQ ID NOs：1-4中所示的那些引物具有70％、80％、85％、优选地90％、更优选地95％、甚至更优选地100％同一性的引物。

试剂盒又可以包括用于引物延伸的试剂。

试剂盒再可以包括用于引物延伸的试剂、用于去磷酸化的试剂和/或用于PCR的试剂。在特定实施方案中，试剂盒再可以包括如MassARRAYiPLEX^TM所包括的试剂。

实施例

实施例1.HBV变异选择

我们进行了文献检索，并且包括了与抗药性直接有关的所有已知HBV突变。包括了前核心(G1896A和C1858T)和基本核心启动子(A1762T和G1764A)中的变异。还包括了经常在抗病毒治疗中观察到、但并不确定地涉及抗药性的变异，并且希望，当将来分析大量样品时，对于其中的一些，可以观察到它们与抗病毒治疗相联系的统计学显著性。突变的总结列于表1。

实施例2.样品收集

获得知情同意书后，本研究募集了总共168名患有HBV感染的患者。在这168名患者中，88名患者没有接受任何抗病毒治疗(未治疗的)，80名患者经历过病毒学突破(virological breakthrough)，其中HBV DNA由最低水平增加大于1log且至大于100,000个拷贝/ml。对每名患者收集1.5mL血清样品。

利用QIAamp DNA血液小量试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(Qiagen)，根据“从血液或体液纯化DNA(离心操作步骤)”，从血清提取HBV DNA。将800μL血清用于DNA提取(50μL洗脱体积)。利用荧光PCR试剂盒(PG Biotech，Shenzhen，China)，确定每个样品的病毒载量(12)。

88名未治疗患者和80名抗药性患者的HBV DNA分别为10^3.07拷贝/mL至10^8.80拷贝/mL(中值：10^7.38拷贝/mL)和10^3.42拷贝/mL至10^8.21拷贝/mL(中值：10^5.39拷贝/mL)。未治疗的样品中的病毒载量显著高于抗药性样品(p＜0.05，t-检验)。

此外，基于来自32名未治疗患者的样品的毛细管测序，23名(71.9％)患者是基因型B HBV，而9名(28.1％)患者是基因型C HBV。还测序了来自33个抗药性样品的HBV DNA。23名(69.7％)患者被基因型B HBV感染，而10名(30.3％)患者被基因型C HBV感染。

实施例3.HBV变异检测

借助MALDI-TOF MS的HBV变异检测包括4个主要步骤。靶HBV变异列于表1。延伸引物和延伸产物的序列和分子量提供于图6A-B。全部引物由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成。除非另外指明，全部其它试剂购自Sequenom(California，USA)。

步骤1：扩增目的HBV区的2重PCR

选择了逆转录酶和基本核心启动子/前核心区域，因为这两个区域含有功能上重要的变异以及经常在经历抗病毒疗法的患者中观察到的变异。我们设计了扩增全部靶变异的2重PCR测定。

通过比对来自不同HBV基因型的基因组序列来设计PCR引物(图4A-E)。PCR引物对分别是5’-gttggatgGACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3’(251F-标签)(SEQ ID NO：1)和5’-ggatgCCCACAATTCKTTGACATACTTTCC-3’(1004R-标签)(SEQ ID NO：2)，以及5’-acgttggatgACCTCTGCACGTYRCATGGA-3’(1593F-标签)(SEQ ID NO：3)和5’-ggatgGAGAGTAACTCCACAGTAGCTCCAA-3’(1950R-标签)(SEQID NO：4)。非大写字母是增加PCR引物分子量以致其不会干扰质谱的序列标签。

逆转录酶和基本核心启动子/前核心区域通过利用上文的PCR引物对的2重PCR来扩增，从而产生长度为754bp和358bp的两种扩增产物。

25μL PCR反应含有5μL HBV DNA、200nM的每种引物(251F-标签和1004R-标签)、100nM的每种引物(1593F-标签和1950R-标签)、1×缓冲液(含有1.5mM Mg²⁺)、1.0mM额外的Mg²⁺、200μM dNTP(每种)以及0.5单位的Hotstar Taq聚合酶(Qiagen)。

以95℃，15min起始PCR；然后进行45个循环的95℃变性40sec，57℃退火30sec和72℃延伸1.5min；并且最后在72℃延伸3min。

在进一步的PCR优化中，当输入的DNA拷贝数大于每PCR 94个拷贝时，该2重PCR测定一致地扩增HBV DNA。当病毒载量大于1170拷贝/mL血清时，这允许我们分析全部血清样品。

步骤2：虾碱性磷酸酶(SAP)处理

为了除去PCR反应中剩余的dNTPs，将包含1.53μL H₂O、0.17μLSAP 10×缓冲液和0.5单位SAP酶的2-μL SAP溶液与5μL PCR产物混合。反应在37℃下进行40min，然后在85℃下进行5min的失活。

步骤3：多重引物延伸反应

MassARRAY测定设计(Sequenom)可以实现高达36的多重水平。然而，我们决定设计明显较低的多重水平下的测定，从而可以在将来升级时容易地加入新的变异。因此，在4个单独的引物延伸反应中分析60个靶HBV变异(测定1为12重，测定2为17重，测定3为17重，测定4为14重)。

60个变异需要60条延伸引物(图6A-B)。

9-μL的延伸反应含有7μL的扩增-去磷酸化产物、0.2μL 10×iPLEX增强缓冲液、包含修饰的ddNTPs的0.2μL iPLEX终止混合物、0.94μL延伸引物混合物、0.041μL iPLEX热测序酶。iPLEX反应的标准热谱列于图3。

进一步调节延伸引物的浓度以补偿由不同延伸引物的序列和分子量的差异所导致的质谱中信号强度的差异。可以基于所产生的实际质谱数据来进行调节。每条引物的浓度列于图6A-B。

步骤4：MS分析

通过添加16μL ddH₂O和6mg SpectroCLEAN树脂，将延伸产物脱盐，用于MS分析。在360g下离心5min后，利用点样仪(Nanodispenser)，将约15nL反应溶液分散至384样品格式的SpectroCHIP上。通过BrukerCompact MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics，Billerica，MA，USA)进行SpectroCHIP的数据获取，并且利用TyperAnalyzer应用(4.0版)(TyperAnalyzer Application，version 4.0)(Sequenom，Inc.)进行数据分析。

多重测定1的代表性质谱示于图1。

在优化PCR和引物延伸反应时，分析了88个未治疗血清样品和80个抗药性血清样品，其灵敏度接近每毫升血清1,000个HBV拷贝。

在本研究中，在两种语境中定义检出率：每样品检出率，其是全部变异中每一单独样品的成功检出百分比；和每变异检出率，其是全部样品中每一变异的成功检出百分比。未指明时，检出率指全部样品中全部变异的成功检出百分比。

为了评价HBV变异检测的表现，我们首先查看每一变异的检出率(定义为测试每一变异的所选样品中成功检出的百分比)。32个变异(53.3％)实现了大于98％的检出率。53个变异(88.3％)实现了大于90％的检出率。60个变异中的56个(93.3％)实现了大于80％的检出率。全部样品中全部变异的总检出率为95.3％。

两个患者组(未治疗和抗药性)中的60个变异中每一个的检出率示于图2a。未治疗和抗药性样品中全部变异的总检出率分别是97.0％和93.4％。另外，抗药性患者中14个变异的检出率明显低于未治疗患者。

还分析了每样品检出率(定义为每一样品中测试的全部60个变异的成功检出百分比)。在图2b中，将两个患者组中的每一样品的检出率(其病毒载量示于X轴)作图。对于未治疗样品，在大范围的浓度内保持高的每样品检出率(大于90％)，但许多抗药性样品具有低于最优的检出率(7个具有80％至90％的检出率，4个具有小于80％的检出率)。

60个变异中4个的检出率低于80％，这是4.7％的总未检出率的主要原因。这四个变异都不具有已知的功能。另外，有不利于抗药性样品的表现偏好，因为检出率低于90％的全部11个样品都是抗药性样品。

实施例4.毛细管测序验证

随机地选择总共70个样品(35个未治疗样品和35个抗药性样品)进行测序以验证MS结果。将用于SAP处理的相同PCR产物(参见实施例3)用于直接测序，该测序利用BigDye终止循环测序试剂盒(3.0版)(BigDyeTerminator Cycle Sequencing Kit，Version 3.0)(Applied Biosystems)和ABI3100基因分析仪(ABI 3100Genetic analyzer)(Applied Biosystems)。

测序引物是5’-gttggatgGACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3’(PCR引物)(SEQ ID NO：65)，5’-ggatgGAGAGTAACTCCACAGTAGCTCCAA-3’(PCR引物)(SEQ ID NO：66)，5’-GYGCCATTTGTTCAGTGGTTCG-3’(SEQ ID NO：67)以及5’-AAACATAGAGGTTCCTTGAGCAGG-3’(SEQID NO：68)。

对于逆转录酶区域，成功地测序了27个未治疗样品和33个抗药性样品。对于前核心启动子和基本核心启动子区域，成功地测序了29个未治疗样品和33个抗药性样品。总测序成功率为87％，不过通过MS成功地分析了全部样品。

除了某些样品中某些变异的某些失败检出以外，MS和直接测序均获得了总共3,380个变异检出。总体上，3,340个变异检出(98.8％)在MS与测序之间是完全一致的，不管是否只存在野生型序列或突变体序列，或者两种序列都存在。对于23个变异检出(0.7％)，MS检测到野生型和突变体两者，而测序只检测到野生型或突变体。一个代表性实例示于图5a。对于这些检出，由于较少变异(minor variation)的较低频率(小于20％)，测序有可能错过了较少序列(minor sequence)(野生型或突变体)。通过进一步的克隆和测序验证了这些情况中的一些。

对于12个变异检出(0.4％)，测序检测到野生型和突变体两者，而MS只检测到野生型或突变体。这些MS检出的大部分具有较低的信号质量，这很可能使得不能检测较少变异(图5b)。

对于0.1％的检出(3,380个检出中的5个)，直接测序和MS完全不一致。进一步的克隆和测序证实直接测序是正确的。

在直接测序与MS之间获得了高度一致的数据，3,380个检出中只有5个变异检出完全不一致。更常见地，MS检测到野生型序列和突变的存在，而直接测序则并非如此。应当指出，实际上，来自直接测序的全部杂合检出通过仔细的人工检查完成，而实际上来自MS的全部检出(纯合或杂合)通过软件自动地完成。另外，测序反应在13％的扩增子中失败了，而MS成功地分析了该13％的扩增子。

尽管为了清楚和理解本发明而提供了前述描述和实施方案，但是对本领域技术人员显而易见的是，通过阅读本公开，可以做出形式和细节上的各种改变而不偏离本发明的范围。例如，上文所述的全部技术和元素可以以各种组合使用。

参考文献

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序列表

<110>香港中文大学

深圳市第三人民医院

<120>肝炎病毒变异的多重检测

<130>10C10315US

<150>US 61/175,827

<151>2009-05-06

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<170>PatentIn version 3.3

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Claims

1.检测肝炎病毒(HV)变异的方法，包括a)提供来自患有HV感染的个体的HV的DNA分子作为模板，其中所述DNA分子包含HV变异位点；b)沿所述模板延伸多重延伸引物以获得含有所述变异位点的核苷酸的延伸产物；以及c)通过质谱术(MS)分析所述延伸产物以检测所述HV变异。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述HV是乙型肝炎病毒(HBV)。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中通过进行使用SEQ ID NOs：1-4所示引物的2重PCR来提供所述DNA分子。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述模板在虾碱性磷酸酶(SAP)处理后提供。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过进行使用SEQID NOs：5-16所示引物的12重iPLEX反应，通过进行使用SEQ ID NOs：17-33所示引物的17重iPLEX反应，通过进行使用SEQ ID NOs：34-50所示引物的17重iPLEX反应，或通过进行使用SEQ ID NOs：51-64所示引物的14重iPLEX反应来延伸所述多重延伸引物。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述MS是基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱术(MALDI-TOF MS)。

7.通过质谱术分析检测肝炎病毒(HV)变异的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述方法中所用的多重延伸引物。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述HV是乙型肝炎病毒(HBV)。

9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其中所述多重延伸引物是SEQID NOs：5-16，SEQ ID NOs：17-33，SEQ ID NOs：34-50或SEQ ID NOs：51-64所示的引物。

10.如权利要求7-9中任一项所述的试剂盒，其还包括扩增引物。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述扩增引物是SEQ ID NOs：1-4所示的引物。

12.如权利要求7所述的试剂盒，其还包括用于PCR的试剂、用于引物延伸的试剂、用于去磷酸化的试剂和/或MassARRAY iPLEX^TM所包括的试剂。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述用于去磷酸化的试剂是虾碱性磷酸酶(SAP)。