CN111154914A - 一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的引物；本发明根据所选择的待检测的乙肝肝炎病毒耐药位点临床标本，设计延伸引物，建立了以HBV聚合酶基因区为鉴定对象的快速HBV耐药位点鉴定平台。本发明能在一个反应体系中对不同基因的6个位点同时检测，较测序、荧光定量PCR等技术成本更低，结果准确，操作更简便；同时，实现了快速有效的检测乙肝肝炎耐药位点的信息，可为临床医师合理用药提供参考，降低不良耐药反应的发生率。

Description

一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及多重PCR扩增技术和飞行时间质谱基因分型系统(MassArray)。且更具体而言，本发明涉及一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒及其使用方法。
背景技术
近年来，随着分子生物学理论和技术的发展，乙肝肝炎病毒耐药相关机制及用药相关的分子基础大部分已被阐明，建立了快速检测乙肝肝炎耐药位点的方法，为快速检测乙肝肝炎耐药试验开辟了一条新的途径。
但目前的分子检测方法主要以限制性片段长度多态性分析、PCR测序、基因芯片为主，普遍存在低通量、低分辨率、高背景信号、高成本等缺陷。目前临床常见的HBV耐药位点的检测试剂盒大多为单一检测YMDD区的荧光定量PCR试剂，这类试剂无法同时检测多个耐药位点的突变；也可以先PCR再进行Sanger测序，可以进行HBV耐药位点突变的检测，最近几年不断改进的测序系统(如ABI公司377等)能满足较大通量的检测HBV耐药突变，但该方法并不能得出各突变位点发生变异的具体频率的精确数据，这将会影响临床医师CHB治疗方案的制定和改进；而基因芯片检测HBV耐药位点的突变也不能得到耐药突变的准确频率，另外该方法成本太高，不适宜进行临床推广。
MassArray分子量阵列技术是世界上领先的基因突变分析技术。MassArray结合了简单、可靠的引物延伸反应和先进的MALDI-TOF质谱技术，可以快速经济地进行基因型分析，达到目前市场上最高的准确率和性价比。基于MassArray分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术可以便捷的设计多达40种的基因型检测。实验设计灵活，价格低廉。迄今为止国内外未见应用MassArray分子量阵列技术同时检测乙肝病毒多耐药位点和准确突变频率的产品和报道。
发明内容
本发明的目的在于克服低通量、低分辨率、高背景信号、高成本等现有技术之不足，提供一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒。
本发明的目的是通过下述方案来实现的：
本发明提供一种用于快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的引物；
另一方面，本发明提供一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒，所述试剂盒至少包括上述引物组；
优选地，所述试剂盒还包括水、iPLEX缓冲液、iPLEX ddNTP混合物、iPLEX酶；
优选地，所述的引物组用于质谱延伸反应；
优选地，所述试剂盒还包括用于扩增的引物组，所述扩增的引物组包括如SEQ IDNO.22～SEQ ID NO.63所示的引物；
优选地，所述试剂盒还包括水、10x PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物、热启动Taq酶；
本发明还提供一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)以提取的DNA为模板，通过扩增引物组PCR扩增，获得靶序列扩增产物；
2)SAP酶处理，除去步骤1)获得的扩增产物中未反应的dNTP；
3)以2)中获得的扩增产物为模板，使用质谱延伸引物组延伸得到延伸产物；
4)采用树脂纯化步骤3)中获得的延伸产物；
5)将纯化后的产物在Agena Bioscience MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测，所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件进行分析，得到分型结果；
优选地，所述步骤1)中PCR扩增反应条件为：94℃，2分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环，最终72℃延伸5分钟；
优选地，所述步骤2)中酶处理的条件为：先37℃温育40分钟，再85℃温育5分钟；
优选地，所述步骤3)中延伸反应条件为：94℃，30秒，94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环，最终72℃延伸3分钟；
本发明还提供一种上述的引物组、试剂盒在快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点中的用途。
本发明根据所选择的待检测的乙肝肝炎病毒耐药位点临床标本，设计延伸引物，所述延伸引物的长度为17-28个碱基，并且其3'端位于用药相关突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为用药相关突变位点。其中，延伸引物的野生型延伸产物与突变型延伸产物之间的分子量差异不小于9Da(Da＝道尔顿)，且各个耐药相关突变位点的延伸产物间的分子量差异不小于30Da。按照引物之间、引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体、引物自身不形成发夹结构以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量在4500—8500Da之间。
同时设计出特异性针对每种个体化用药相关基因的扩增引物，扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的至少15个碱基，在5'端具有10个碱基(acgttggatg)的标签序列，以区分扩增引物与延伸引物。
本发明的有益效果：
1、快速有效的检测乙肝肝炎耐药位点的信息，检测结果结合临床指标，可为临床医师合理用药提供参考，降低不良耐药反应的发生率。
2、本发明能在一个反应体系中对不同基因的6个位点同时检测，较测序、荧光定量PCR等技术成本更低，结果准确，操作更简便，同时，对于患者而言，节省了检测费用。
附图说明
图1 rtA181T/S_420质谱分型结果图
图2 rtA181V_421质谱分型结果图
图3 rtA194T_459质谱分型结果图
图4 rtF166L_375质谱分型结果图
图5 rtI169T_385质谱分型结果图
图6 rtI233V_576质谱分型结果图
图7 rtL80I/V_117质谱分型结果图
图8 rtL180M_417质谱分型结果图
图9 rtL229F_566质谱分型结果图
图10 rtL229V/M_564质谱分型结果图
图11 rtL229W_565质谱分型结果图
图12 rtM204I_491质谱分型结果图
图13 rtM204V_489质谱分型结果图
图14 rtM250V_627质谱分型结果图
图15 rtN236T_586质谱分型结果图
图16 rtS202I_484质谱分型结果图
图17 rtT128N_262质谱分型结果图
图18 rtT184S_430质谱分型结果图
图19 rtV173L_396质谱分型结果图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。引物序列由上海生工合成，PCR扩增试剂、SAP酶、Extension反应液均购自Agena Bioscience公司，PCR扩增仪为AB公司9700型号，质谱分析仪为Agena Bioscience公司MassARRAY Compact Analyzer。
实施例一引物的设计
(1)PCR扩增引物：
根据所选择的待检测的乙肝肝炎病毒耐药位点临床标本，设计出特异性针对每种个体化用药相关基因的扩增引物，扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的至少15个碱基，在5'端具有10个碱基(acgttggatg)的标签序列，以区分扩增引物与延伸引物。具体引物如下表所示：
表1 PCR扩增引物
Figure BDA0002300781680000061
Figure BDA0002300781680000071
(2)质谱延伸引物：
设计延伸引物，所述延伸引物的长度为17-28个碱基，并且其3'端位于用药相关突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为用药相关突变位点。其中，延伸引物的野生型延伸产物与突变型延伸产物之间的分子量差异不小于9Da(Da＝道尔顿)，且各个耐药相关突变位点的延伸产物间的分子量差异不小于30Da。按照引物之间、引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体、引物自身不形成发夹结构以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量在4500—8500Da之间。具体引物如下表所示：
表2质谱延伸引物
WELL TERM SNP_ID UEP_SEQ
WW1 iPLEX rtL180M_417 GCCTCAGTCCGTTTCTC
WW1 iPLEX rtS202I_484 CCACTGTTTGGCTTTCA
WW1 iPLEX rtT128N_262 CGTGCAGGTCTTGCATG
WW1 iPLEX rtL80I/V_117 GCAGACACATCCAGCGATA
WW1 iPLEX rtM250V_627 ACTTCCAATTACATATCCCA
WW1 iPLEX rtV173L_396 ggtAAACGGACTGAGGCCCA
WW1 iPLEX rtL180M_417 CCTCAGTCCGTTTCTC
WW1 iPLEX rtV173L_396 gTTCGCAAGATTCCTATGGGA
WW2 iPLEX rtA181V_421 CAGTCCGTTTCTCCTGG
WW2 iPLEX rtM204I_491 TGTTTGGCTTTCAGTTATAT
WW2 iPLEX rtL229W_565 ACCTCTATTACCAATTTTCTTT
WW3 iPLEX rtA181T/S_420 TCAGTCCGTTTCTCCTG
WW3 iPLEX rtM204V_489 CTGTTTGGCTTTCAGTTAT
WW3 iPLEX rtN236T_586 ACGTTTGGTTTTATTAGGG
WW4 iPLEX rtI169T_385 GGCCCACTCCCATAGGA
WW4 iPLEX rtA194T_459 TGTTCAGTGGTTCGTAGG
WW4 iPLEX rtI233V_576 GGTTTTATTAGGGTTCAAATGTA
WW5 iPLEX rtF166L_375 CCATAGGAATCTTGCGAA
WW5 iPLEX rtL229V/M_564 TTACCTCTATTACCAATTTTCTT
WW6 iPLEX rtT184S_430 ACTGAACAAATGGCACTA
WW6 iPLEX rtL229F_566 ACCTCTATTACCAATTTTCTTTT
实施例二PCR扩增
(1)以乙肝肝炎临床标本中提取的DNA为模板，使用实施例一中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表3。其中，所有试剂购买自AgenaBioscience公司。
表3 PCR扩增反应体系
Figure BDA0002300781680000091
PCR反应条件为94℃，2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸5分钟。在本实施例中，使用提取的DNA作为PCR扩增的DNA模板。同时，将无菌双蒸水作为阴性对照。将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试，以验证检测的有效性。
实施例三SAP酶处理
通过SAP酶处理，除去获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。SAP酶反应体系见表4。所有试剂购买自Agena Bioscience公司。
表4 SAP酶反应体系
Figure BDA0002300781680000092
Figure BDA0002300781680000101
SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
实施例四延伸反应
以获得的扩增产物为模板，使用质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表5。所有试剂购买自AgenaBioscience公司。
表5延伸反应体系
试剂 体积/反应
水 0.619μl
iPLEX缓冲液 0.200μl
iPLEX ddNTP混合物 0.200μl
表3中的延伸引物混合物 *0.940μl
iPLEX酶 0.041μl
步骤(3)中获得的产物 7.00μl
总体积 9.00μl
其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即，根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。
延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
实施例五树脂纯化及质谱分析
采用树脂(购买自Agena Bioscience公司)纯化步骤(3)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂，16.00μl水，垂直摇匀一小时。经过本步反应后，树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周。所得的纯化产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。
将纯化后的产物在Agena Bioscience MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测。所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件(由Agena Bioscience公司提供)进行分析，得到分型结果。
结果与分析
图1-图19为本发明质谱分型结果图，从结果图看出本发明的试剂盒均能检测出乙肝肝炎病毒耐药位点；本发明建立了以质谱为平台，以HBV聚合酶基因区为鉴定对象的快速HBV耐药位点鉴定平台，快速有效的检测乙肝肝炎耐药位点的信息；同时能在一个反应体系中对不同基因的6个位点同时检测，较测序、荧光定量PCR等技术成本更低，结果准确，操作更简便，同时，对于患者而言，节省了检测费用。具体检测耐药位点分布如下：
表6检测耐药位点分布
Figure BDA0002300781680000111
Figure BDA0002300781680000121
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种用于快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的引物组，其特征在于，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的引物。
2.一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括如权利要求1所述的引物组。
3.如权利要求2所述的一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括水、iPLEX缓冲液、iPLEX ddNTP混合物、iPLEX酶。
4.如权利要求2所述的一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒，其特征在于，所述的引物组用于质谱延伸反应。
5.如权利要求2所述的一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于扩增的引物组，所述扩增的引物组包括如SEQ ID NO.22～SEQ IDNO.63所示的引物。
6.如权利要求5所述的一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括水、10x PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物、热启动Taq酶。
7.一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以提取的DNA为模板，通过扩增引物组PCR扩增，获得靶序列扩增产物；
2)SAP酶处理，除去步骤1)获得的扩增产物中未反应的dNTP；
3)以2)中获得的扩增产物为模板，使用质谱延伸引物组延伸得到延伸产物；
4)采用树脂纯化步骤3)中获得的延伸产物；
5)将纯化后的产物在Agena Bioscience MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测，所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件进行分析，得到分型结果。
8.如权利要求7所述的一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增反应条件为：94℃，2分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环，最终72℃延伸5分钟。
9.如权利要求7所述的一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤2)中酶处理的条件为：先37℃温育40分钟，再85℃温育5分钟。
10.如权利要求7所述的一种快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤3)中延伸反应条件为：94℃，30秒，94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环，最终72℃延伸3分钟。
11.如权利要求1-10任一项所述的引物组、试剂盒在快速检测乙肝肝炎病毒耐药位点中的用途。
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