CN111893216A - 核酸质谱检测dna/rna的产品及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于核酸质谱的、可同时检测DNA/RNA的多重一步PCR试剂，所述一步PCR试剂是One‑Step RT‑PCR Kit，其中该试剂中的酶为双酶体系，该双酶体系包括选自鼠白血病病毒来源的消除了RNaseH活性的M‑MLV反转录酶，以及特定的且有效减少由引物错配引起的非特异扩增的热稳定Taq DNA聚合酶。本发明还提供了保护所述一步PCR试剂的检测产品和检测用途。本发明能达到现有核酸质谱多重DNA检测的效果，同时RNA反转录和PCR合并为一步进行同步扩增，减少了操作步骤，降低了试剂成本。

Description

核酸质谱检测DNA/RNA的产品及检测方法
技术领域
本发明属于生物诊断技术领域，具体是涉及一种核酸质谱检测DNA/RNA的产品及检测方法。
背景技术
基质辅助激光解吸电离源(MALDI)检测法具有快速、准确、灵敏度高、耗样量少、化学专一性高(可直接分析复杂生物样品或反应混合物)等优势,因此广泛应用于蛋白质和多肽领域的研究,在生物分析领域占有越来越重要的地位。
核酸质谱检测技术以其单反应检测靶点数较多，单次检测样本通量大，检测准确，成本低廉等优势在分子诊断领域中占有一席之地。该技术在DNA核酸检测方面有着广泛的应用，如SNP分型检测，基因突变，病原体检测，DNA甲基化，基因拷贝数变异等方面。在本发明人使用质谱平台进行新型冠状病毒(RNA病毒)检测之前，尚没有质谱平台应用于RNA检测的报道，更谈不上多重RNA检测，更谈不上使用质谱平台同时检测多重DNA/RNA。这主要是因为RNA相对DNA含量过低，容易因反复冻融降解，环境中RNase的存在对RNA的检测干扰影响也较大，对操作人员的技术水平要求较高，且RNA需要反转录为cDNA,才能进一步作为模板进行PCR扩增和后续实验，增加了操作步骤，就进一步增加了污染风险。
随着一步PCR技术的深入研究，RNA反转录为cDNA和以cDNA为模板进行PCR扩增合并为一步进行，并迅速应用于荧光定量平台，但主要是进行1-4重的RNA检测，未进行过多重RNA检测，更未进行过多重DNA/RNA共同检测。原因一可能是受限于荧光定量通道数量，二可能是做多重的一步PCR试剂研发困难。三可能是没有合适的做多重检测的应用平台。
核酸质谱检测平台是非常合适的多重核酸检测平台，一步PCR技术结合核酸质谱平台，使得多重RNA检测成为一种可能。一步PCR技术进行多重RNA检测，除了合适的多重检测平台之外，最关键的是找到能适用于该平台的多重一步PCR试剂，从而达到RNA反转和多重PCR扩增高效进行。目前尚没有合适的可供核酸质谱平台使用的多重一步PCR试剂，故本发明人投入了较大的时间和精力用于试剂筛选，并最终成功筛选出一种适用于核酸质谱平台的可同时检测DNA/RNA的多重一步PCR试剂，在不降低检测灵敏度的同时，可实现多重DNA-/RNA同时检测。
发明内容
本发明的第一原理在于：考虑到物种核酸性质主要有DNA和RNA两种，如果能同时检测两种性质的核酸，且能够突破单重检测的限制，将会大大降低检测成本，提高检测效率。为此，创造性提出将不能用于核酸质谱扩增的常规一步PCR扩增试剂，经过筛选和优化后，得到适用于核酸质谱同时检测DNA/RNA的一步PCR扩增试剂。
本发明的第二原理在于：将筛选得到适用于核酸质谱的可同时检测DNA/RNA的多重一步PCR扩增试剂，直接制成或与SAP试剂及单碱基延伸试剂配套制成质谱检测DNA/RNA的产品，该产品能达到现有核酸质谱多重DNA检测的效果，同时RNA反转录和PCR扩增同步，减少了操作步骤，且因为两步合并一步，降低了试剂成本。
本发明的第三原理在于：在以上研究的基础上，研制同时检测多重DNA/RNA的核酸质谱检测方法及其检测系统，所述方法及系统相对于现有的核酸质谱检测方法及系统，具有同时检测多重DNA/RNA的创新型优点。
本发明的第四原理在于：为了减少核酸质谱的检测时间，创造性提出免核酸提取(含纯化步骤)DNA/RNA的一步PCR检测方法用于核酸质谱检测。
因此，本发明第一目的是提供一种能适用于核酸质谱的、且可同时检测DNA/RNA的多重一步PCR试剂One-Step RT-PCR Kit，其中所述一步PCR试剂One-Step RT-PCR Kit中的酶包括双酶体系(即RNA反转录和PCR扩增反应为反转录酶和DNA聚合酶分别催化)。
在一个实施方案中，所述双酶体系选自鼠白血病病毒来源的消除了RNaseH活性的M-MLV反转录酶，以及特定的且有效减少由引物错配引起的非特异扩增的热稳定Taq DNA聚合酶。
在一个具体实施方案中，与所述双酶体系匹配使用的PCR的反应试剂包括缓冲液、dNTPs，其中所述缓冲液包括Mg2+、PCR稳定剂和增强剂。在更具体的实施方案中，所述增强剂包括200mM Tris-HCl(pH 8.4),500mM KCl。
在一个具体实施方案中，所述dNTP包括相同摩尔浓度比的dATP、dCTP、dGTP、dTTP。在更具体的实施方案中，所述dNTP包括：200uM dATP、200uM dCTP、200uM dGTP、200uMdTTP。
本发明第二目的是提供一种多重一步PCR试剂用于核酸质谱检测DNA/RNA的用途，其中所述多重一步PCR试剂包括One-Step RT-PCR Kit，其中所述一步PCR试剂One-StepRT-PCR Kit中的酶包括双酶体系(即RNA反转录和PCR扩增反应为反转录酶和DNA聚合酶分别催化)和单酶体系(即RNA反转录和PCR扩增反应为同一种酶催化)。
本发明第三目的是提供一种DNA/RNA核酸质谱检测产品，包括上述多重一步PCR试剂和用于单碱基延伸反应的试剂、用于质谱的基质试剂，其中所述一步PCR试剂One-StepRT-PCR Kit中的酶包括双酶体系(即RNA反转录和PCR扩增反应为反转录酶和DNA聚合酶分别催化)和单酶体系(即RNA反转录和PCR扩增反应为同一种酶催化)。
在一个实施方案中，所述双酶体系选自鼠白血病病毒来源的消除了RNaseH活性的M-MLV反转录酶，以及特定的且有效减少由引物错配引起的非特异扩增的热稳定Taq DNA聚合酶。
在一个具体实施方案中，与所述双酶体系匹配使用的PCR的反应试剂包括缓冲液、dNTPs，其中所述缓冲液包括Mg2+、PCR稳定剂和增强剂。在更具体的实施方案中，所述增强剂包括200mM Tris-HCl(pH 8.4),500mM KCl。
在一个具体实施方案中，所述dNTP包括相同摩尔浓度比的dATP、dCTP、dGTP、dTTP。在更具体的实施方案中，所述dNTP包括：200uM dATP、200uM dCTP、200uM dGTP、200uMdTTP。
在一个实施方案中，所述检测产品是用于检测呼吸道病原体的检测产品，其包括用于反转和PCR扩增的一步PCR的反应试剂和用于单碱基延伸反应的试剂、用于质谱的基质试剂，其中所述一步PCR反应试剂包括上述任一所述的一步PCR反应试剂。
在上述任一实施方案中，所述检测产品还包括用于纯化PCR扩增产物的试剂。
在上述任一实施方案中，所述核酸是从样品中提取纯化的核酸，或免提取纯化的核酸，从而将样品与反应试剂混合后直接进行PCR扩增。在一个具体实施方案中，所述核酸是DNA或RNA。在更具体的实施方案，当核酸是DNA/RNA或RNA时，PCR反应试剂是上述任一所述的PCR反应试剂。
在上述任一所述的实施方案中，所述检测产品还包括：特异性PCR引物、用于PCR产物纯化的试剂。在一个优选实施方案中，所述检测产品还包括用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。
在一个具体实施方案中，该检测产品还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片等试剂。
在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
在上述任一所述的实施方案中，所述检测产品包括独立使用的检测试剂、检测基质和/或检测芯片、分析软件，以及包含所述检测试剂、检测基质和/或检测芯片、分析软件的检测试剂盒。
本发明第四目的是提供一种多重DNA/RNA核酸质谱检测方法，包括：
(1)准备待测样本；
(2)一步PCR反应：将样本进行一步PCR反应，得到含扩增目标区域的PCR产物；
(3)PCR产物纯化：对步骤(2)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(4)单碱基延伸：使用特异延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(3)得到的纯化后PCR产物进行单碱基延伸；
(5)延伸产物纯化：对步骤(4)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(6)质谱仪检测：将步骤(5)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测，得到不同SNP位点延伸产物的核酸谱图；
(7)将得到的不同SNP位点延伸产物的核酸谱图，经过质谱仪配套软件比对标准图谱和分析后，确认SNP位点的碱基，从而判定该样本的基因型。
在一个实施方案中，当待测样本是提取纯化的DNA/RNA时，步骤(1)直接将待测样本加入一步PCR反应试剂中。
在另一实施方案中，当待测样本是咽拭子病毒保存液、鼻拭子病毒保存液等样品时，步骤(1)将待测样本加入商品化的样品处理剂中，进行样品预处理，无需纯化。
在一个具体实施方案中，当待测样本是咽拭子病毒保存液、鼻拭子病毒保存液等样品时，步骤(1)将待测样本使用闪电核酸释放剂(北京宝盈同汇生物技术有限公司，商品货号:BT0066)进行预处理，利用细胞内外盐离子浓度差可导致细胞膜胀破的原理来裂解细胞，释放核酸，且无需纯化。在一个更具体的实施方案中，按照以下步骤使用闪电核酸释放剂(北京宝盈同汇生物技术有限公司，商品货号:BT0066)进行血样预处理：每20μL样本，加入5μL闪电核酸释放剂至一新的200μL Eppendorf管，漩涡混合均匀后，将Eppendorf管置于金属浴或热盖PCR仪上95℃加热10min。取出Eppendorf管平衡至室温，12000rpm离心2min，吸取Eppendorf管内上清液至一干净的离心管内，待检。PCR扩增时，每25μL反应体系，加入1μL处理物上清液即可。
在上述任一实施方案中，其中步骤(2)PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列。在一个具体实施方案中，其中保护碱基序列为5-15个碱基。在一个优选实施方案中，其中保护碱基序列选自：ACGTTGGATG。
在上述任一实施方案中，其中步骤(3)的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，其中当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。
在上述任一实施方案中，其中步骤(4)的延伸引物的5'端可以增加作为接头的碱基序列。
本发明第五个发明目的是提供上述多重一步PCR试剂或检测产品用于检测DNA/RNA的用途，其中所述用途是非疾病检测用途。
在一个实施方案中，所述用途是用于确定来自动植物、人、水源、食品、公共场所、居住或办公环境是否携带某些病原体(包括细菌、病毒、立克次氏体、真菌、结核分枝杆菌等，死菌或活菌等)，以便确定卫生防疫的检测结果。
在一个实施方案中，所述用途是确定人的血液、痰液、口咽拭子、鼻拭子等样本中携带病原体的虚拟SNP位点的基因分型，以便提供给药方案的参考意见。
在另一具体实施方案中，所述确定病原体的虚拟SNP位点是确定患者感染结核分枝杆菌或非结核分支杆菌，以便筛选有效的药物。
在一个实施方案中，其中所述用途是确定个体的SNP位点是确定患者的药物靶点，以便筛选有效的药物；或所述用途是确定个体之间的亲缘关系，包括但不限于亲子鉴定、司法身份鉴定或法医学鉴定。
技术效果
1、本发明节省了RNA反转录的时间，并通过常规试剂摸索，确定合适的一步PCR试剂，显著降低了试剂成本。
2、敏感：本发明综合了一步PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过一步PCR技术一步扩增RNA，放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，具有相当高的检测灵敏度。
3、简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染。
4、快速：速度快、通量高，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。
5、本发明以人呼吸道8种病原体进行检测，相比于需要单独反转RNA的传统方法，检测结果快速、准确且稳定。
6、本发明以人呼吸道8种病原体进行检测，从中筛选得到可同时检测DNA/RNA的最优的一步PCR反应试剂盒反应体系，检测结果快速、准确且稳定。
7、本发明所涉及的核酸质谱技术具有极强的分辨率和灵敏度，最高分辨率达到9Da，且通过计算机程序判读，人为干扰因素低。相比于传统PCR扩增后凝胶电泳检测，其各自扩增成分的电泳凝胶条带如果区分度过低，将导致结果难以分辨。
8、本发明填补了通过一步PCR试剂同时检测DNA/RNA的核酸质谱检测技术的检测空白，具有自主知识产权，对于发展我国核酸检测领域具有重要的促进和支撑作用。
原理与定义
本发明的核酸质谱检测原理在于：使用特异性PCR引物，对待测DNA/RNA模板进行反转录和PCR扩增，得到大分子的基因片段或含待检虚拟SNP位点的PCR产物。对于待检的虚拟SNP，还需要将PCR产物经过纯化处理后，进行单碱基延伸，在延伸引物后延伸一个核苷酸，该核苷酸与模板互补配对(如模板为核苷酸A，将在对应的延伸引物上延伸T)；在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸；在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在脱盐纯化后，点至含基质的靶片上，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与其分子量呈负相关，即分子量越大，飞行时间越慢，到达检测器的时间越晚。
传统核酸质谱检测技术，主要是利用质谱平台检测DNA，而没有检测过RNA，更没有同时检测过DNA/RNA。核酸质谱检测的是单碱基延伸产物，该产物是以PCR扩增产物为模板获得，PCR扩增产物则以单链或双链DNA为模板获得，双链DNA可通过核酸提取直接获得，单链DNA则主要是RNA反转录获得。即理论上RNA反转为单链的cDNA后，也可以通过PCR扩增和单碱基延伸反应进行核酸质谱检测。本发明对RNA的多重核酸质谱检测进行了探索和实验验证，填补了质谱平台检测RNA的空白。
本次筛选到的一步PCR试剂所包含的酶是双酶体系，其中，鼠白血病病毒来源M-MLV反转录酶是经基因突变筛选出的可耐高温的反转录酶，适用于高温反转录，有利于消除RNA高级结构，具有高稳定性和强大的反转录合成能力，与各种PCR扩增酶具有较好的兼容性。热稳定Taq DNA聚合酶可有效减少由引物错配引起的非特异扩增。此双酶体系与能提高反应特异性的独特的缓冲体系相配合，对低浓度模板扩增亦有较高的灵敏度和特异性。
术语“保护碱基”，指在PCR引物的5’端额外增加的碱基。保护碱基的序列使得PCR引物的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5’端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。
术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5’-P末端转换成5’-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。
术语“外切酶Exo I消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间的3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后剩余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会再检测窗口中出现，因此在使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3’连接形成延伸产物，即引物延伸了一个碱基。ddNTP与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3’位置缺少了一个羟基，不能与后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅可连接一个ddNTP，故而称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后方可终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中只加入ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此，单碱基延伸反应产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。
术语“延伸效率”，指的是单碱基延伸引物转化为单碱基延伸产物的效率，可通过计算单碱基延伸产物SNR/(单碱基延伸引物SNR+单碱基延伸产物SNR)的比值获得。
术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddCTP，ddATP，ddGTP，ddTTP的分子量分布是247.2、271.2、287.2、327.1Da，其中ddTTP为修饰后的分子量。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸时，将形成分子量差异。可以通过质谱检测，分辨出这种差异(质谱检测核酸的最小灵敏度约为9Da)。例如，某SNP位点若为G/A多态，对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量为6153Da)，当该SNP位点是G基因型时，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量为6400.2Da的延伸产物；当该SNP位点处为A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量为6480.1Da的延伸产物，两种产物间存在80.1Da的分子量差异。即对该SNP位点而言，使用此6153Da的延伸引物，G基因型将对应6400.2Da的质谱峰，A基因型将对应6480.1Da的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对6153Da、6400.2Da、6480.1Da三处进行观察：若6153Da处出现质谱峰，则表明有部分或全部延伸引物未与ddNTP结合；不论6153Da处是否有质谱峰，若6400.2Da与6480.1Da处仅出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，并与质谱峰的位置对应，如前所述，6400.2Da的质谱峰对应G基因型，6480.1Da的质谱峰对应A基因型；若6400.2Da与6480.1Da两处均出现质谱峰，则该SNP位点的基因型为杂合型；若6400.2Da与6480.1Da两处均未出现质谱峰，则实验失败。
术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。为避免不同延伸引物与产物间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对较宽的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多种物质的同时检测。
术语“SNP”基因型，表示物种基因组中单核苷酸多态性的类型。其中，在实际检查中，作为对照的用于检测的基因型既可来自于对于物种的基因组中，也可来自克隆入质粒的载体工具，而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定易得而受到实际使用者的欢迎。
术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片(如基因芯片、液体芯片等)、检测载体、检测配套的分析测试软件，以及检测试剂盒等。
术语“One-Step RT-PCR Kit”是由中科亚美医学科技(北京)有限公司研发的多重一步PCR试剂，产品网址和货号：https://www.instrument.com.cn/list/CM1160348/Q4939907.html，JHM0004。
附图说明
图1-图30：实施例2中对待测DNA/RNA进行核酸质谱检测的各组阴性对照、阳性对照和待测样品的质谱结果图。
图31-图42：实施例3中优化一步PCR试剂反应体系对各组阴性对照、阳性对照和待测样品的质谱优化结果图。
图43-图48：实施例4中免核酸提取的一步PCR反应对各组阴性对照、阳性对照和待测样品的质谱结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：一步PCR试剂的筛选
按下表进行比较不同来源的测试试剂。
Figure BDA0002626768450000071
实施例2：对待测DNA/RNA进行核酸质谱检测
本实施例使用10种一步PCR试剂，以及检测8种呼吸道病原体的多重引物体系，检测相同待测样品(2.0×103copies/mL乙流B/Victory、1.8×103copies/mL甲流H1N1(2009)、1.2×103copies/mL甲流H3N2共3种病原体的RNA混合物)。通过比对不同试剂的检测结果，筛选出最优的一步PCR试剂。设置阴性对照为水，阳性对照为检测8种呼吸道病原体的各靶标的质粒混合物。筛选最优一步PCR试剂的质量标准：水中未检出任何靶标；3种病原体的RNA混合物中4个检测靶标均检出；质粒混合物检出数量最多；谱图中3000-10000Da范围内无杂峰或<2根杂峰。
其中，所述8种呼吸道病原体的信息如下表：
Figure BDA0002626768450000072
Figure BDA0002626768450000081
所述8种呼吸道病原体的引物序列如下表：
Figure BDA0002626768450000082
Figure BDA0002626768450000091
其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如下表所示。
Figure BDA0002626768450000092
在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag(acgttggatg)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-acgttggatgccctgtgggttttacactta-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。
使用ABI 9700型PCR仪进行检验。操作按照说明书进行，具体方法如下：
1.一步PCR扩增
1.1在PCR配液区，按照待检样品数准备200μL PCR反应管，并在管上标记样本编号；
1.2从试剂盒中取出10种一步PCR试剂，ddH2O，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底；
1.3根据样本数目，按各试剂对应说明书的25ul体系的比例配制试剂，各置于一个离心管中混匀，分装至200ul PCR反应管；
1.4按各试剂对应说明书，在PCR扩增区内向每管混合物中加入6μL待测样品，使每份PCR反应体系总体积为25μL。其中，阴性对照为超纯水，阳性对照为质粒混合物；
1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按各试剂对应说明书中推荐的程序进行PCR扩增反应。
2.SAP酶消化
PCR反应结束后，依次取5μL PCR产物至新管，每管加入SAP酶混合物2μL，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。
温度(℃) 时间(min) 循环数
37 30 1
65 5 1
3.单碱基延伸
3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混合物，置于一个离心管中混匀。
组分名称 单反应体积(μL)
延伸引物混合液 1
延伸酶混合物 1
合计 2
3.2在PCR扩增区，按每管PCR产物加入2μL延伸混合物进行分装；
3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。
Figure BDA0002626768450000101
4.纯化
在PCR扩增区向每管延伸产物中加入41μL纯水，15mg树脂，颠倒混匀30min。
5.点样
使用微量移液器，吸取0.5μL纯化产物，点样至含基质靶片上。
6.结果分析
使用发明人研制的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。
7、检测质量标准
Figure BDA0002626768450000102
杂峰：非本反应体系中可能出现的峰均为杂峰；峰型：无分叉，偏锋，跟峰等情况视为峰型较好。
8.检测结果
将实施例1中所述测试组1-10组的单碱基延伸产物均点样至同样一张芯片上，进行核酸质谱检测，质谱检测结果如下表所示：
Figure BDA0002626768450000111
(1)阴性对照：10种一步PCR试剂检测阴性对照均正常未检出任何病原体靶标；
(2)阳性对照：试剂1、4、8、9、10可检出11个靶标；试剂3、5、7可检出10个靶标；试剂6可检出9个靶标；试剂2可检出6个靶标。
(3)待测样品：试剂4四个靶标均未检出；试剂5、7检出1个靶标；试剂2、3、6检出2个靶标；试剂1、8、9检出3个靶标，试剂10四个靶标均检出。
综合分析以上结果得出，(1)在10种一步PCR试剂检测待测样品时，H3未检出9次，FluB未检出5次，H1未检出4次，即因为试剂的灵敏度差异或者检测靶标可能存在的特殊结构或者引物的灵敏度等原因，使得H3、FluB、H1三个靶标较难检出，但试剂10能够将此3种靶标均检出，提示试剂10相比其他试剂具有高灵敏度，检测RNA的性能最优。(2)试剂4检测阳性对照，11个靶标均检出，但检测待测的RNA样品时，4个靶标均未检出，可能是反转录未成功所致。提示双酶体系的一步PCR试剂，反转录酶和DNA聚合酶的比例是比较重要的。(3)本次试剂筛选，一步PCR扩增时，虽然模板加样量保持一致，总反应体积也保持一致，但不同的试剂推荐的反应程序不尽相同，可能检测结果会受到所选择的反应程序的影响。(4)核酸质谱检测DNA/RNA,一步PCR扩增反应是第一步，再结合SAP和单碱基延伸反应，才能得到质谱检测所需产物，如果试剂之间存在干扰，也会影响检测灵敏度，故筛选适合核酸质谱平台的一步PCR试剂是非常必要的。
实施例三：优化一步PCR试剂反应体系
本实施例设置3个测试组，1个对照组，通过优化一步PCR试剂中buffer和酶的比例来达到更优的检测效果。以实施例一和二筛选出的一步PCR试剂10作为检测试剂，以3种病原体的RNA混合物作为待测样品(该样品同实施例二)，以13种呼吸道病原体的多重引物混合物作为引物体系，进行核酸质谱检测，通过比对测试组与对照组的检测结果，筛选出最优的一步PCR试剂反应体系。设置阴性对照为水，阳性对照为检测13种呼吸道病原体的各靶标的质粒混合物。最优一步PCR试剂反应体系的质量标准：水中未检出任何靶标；3种病原体的RNA混合物中4个检测靶标均检出；质粒混合物检出靶标数量最多；谱图中3000-10000Da范围内无杂峰或<2根杂峰。
其中，所述13种呼吸道病原体的信息如下表：
位点编号 病原体 检测靶标 核酸性质
13HXD-1 SARS-COV-2 靶标1 RNA
13HXD-2 SARS-COV-2 靶标2 RNA
13HXD-3 FluA 靶标3 RNA
13HXD-4 FluA-H1N1(2009) 靶标4 RNA
13HXD-5 FluA-H3N2 靶标5 RNA
13HXD-6 FluB 靶标6 RNA
13HXD-7 HuRNA 靶标7 RNA
13HXD-8 HcoV-229E 靶标8 RNA
13HXD-9 HcoV-OC43 靶标9 RNA
13HXD-10 HcoV-NL63 靶标10 RNA
13HXD-11 HcoV-HKU1 靶标11 RNA
13HXD-12 HcoV-SARS 靶标12 RNA
13HXD-13 HcoV-MERS 靶标13 RNA
13HXD-14 HcoV-MERS 靶标14 RNA
13HXD-15 FluA-H5N1 靶标15 RNA
13HXD-16 FluA-H7N9 靶标16 RNA
所述13种呼吸道病原体的引物序列如下表：
Figure BDA0002626768450000121
Figure BDA0002626768450000131
Figure BDA0002626768450000141
其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如下表所示。
Figure BDA0002626768450000142
在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'端加入10bp的tag(acgttggatg)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-acgttggatgccctgtgggttttacactta-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。
本实施例中的对照组的反应体系与说明书推荐的一致，3个测试组分别对一步PCR试剂中的酶和buffer的比例进行了调整。测试组1将酶增至说明书中的1.5倍用量，buffer用量不变；测试组2酶用量不变，将buffer增至说明书中的1.5倍用量；测试组3将酶增至说明书中的1.5倍用量，buffer增至说明书中的1.5倍用量。对照组和3个测试组使用的反应体积和模板加样量均保持一致，反应程序保持一致，SAP和单碱基延伸反应的反应体系和程序保持一致。
使用ABI 9700型PCR仪进行检验。操作按照说明书进行，具体方法如下：
1.PCR扩增
1.1在PCR配液区，按照待检样品数准备200μL PCR反应管，并在管上标记样本编号。
1.2从试剂盒中取出一步PCR试剂10，ddH2O，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底。
1.3根据样本数目，按下表的比例取出buffer和酶，置于一个1.5mL离心管中混匀，按每PCR反应管加入相应体积混合物进行分装。
Figure BDA0002626768450000151
1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入相应体积待测样品，使每份PCR反应体系总体积达到相应体积。其中，阴性对照为超纯水，阳性对照为检测13种呼吸道病原体的各靶标的质粒混合物。
1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。
Figure BDA0002626768450000152
2.SAP酶消化
PCR反应结束后，依次取5μL PCR产物至新管，每管加入SAP酶混合物2μL，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。
温度(℃) 时间(min) 循环数
37 30 1
65 5 1
3.单碱基延伸
3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混合物，置于一个离心管中混匀。
Figure BDA0002626768450000153
Figure BDA0002626768450000161
3.2在PCR扩增区，按每管PCR产物加入2μL延伸混合物进行分装；
3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。
Figure BDA0002626768450000162
4.纯化
在PCR扩增区向每管延伸产物中加入41μL纯水，15mg树脂，颠倒混匀30min。
5.点样
使用微量移液器，吸取0.5μL纯化产物，点样至含基质靶片上。
6.检测及结果判读
使用发明人研制的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。
7、检测质量标准
Figure BDA0002626768450000163
杂峰：非本反应体系中可能出现的峰均为杂峰；峰型：无分叉，偏锋，跟峰等情况视为峰型较好。
8.检测结果
将实施例三中所述3个测试组、1个对照组各3个单碱基延伸产物均点样至同样一张芯片上，进行核酸质谱检测。质谱检测结果显示：
Figure BDA0002626768450000164
(1)阴性对照：3个测试组、1个对照组中阴性对照均正常未检出任何病原体靶标；
(2)阳性对照：3个测试组、1个对照组中阳性对照所有靶标均正确检出，但H1、H5位点延伸效率有所差异，测试组1、测试组2、测试组3、对照组中H1位点的延伸效率分别为：65％、81％、92％、96％，H5位点的延伸效率分别为：98％、41％、98％、99％，即3个测试组相比对照组，H1位点的延伸效率均得到明显提高，测试组1相比对照组，H5位点的延伸效率明显降低；
(3)待测样品：4个检测靶标的延伸效率如下表：
FluA FluB H3 H1
对照组 99％ 94％ 58％ 77％
测试组1 100％ 96％ 24％ 72％
测试组2 98％ 100％ 86％ 71％
测试组3 99％ 99％ 84％ 74％
从上表得出，测试组1相比对照组，H3的延伸效率明显降低，测试组2相比对照组，H3的延伸效率明显提高。
综合分析以上结果得出，(1)无论反应体系中buffer和酶的比例如何变化，阴性对照都正常未检出，提示该试剂的特异性较好，适用于多重DNA/RNA核酸质谱检测。(2)相比对照组，测试组1会导致个别位点的延伸效率降低：测试组1检测阳性对照，H5延伸效率相比其他组降低，测试组1检测待测样品，H3延伸效率相比其他组降低。分析测试组1中buffer用量增加，则反应体系中所包含的阳离子、dNTP等的浓度增加，甚至反应的PH环境也因此改变，这些参数的改变，可能导致酶的最适反应条件发生变化，从而导致个别位点的延伸效率降低，这提示了buffer在一步PCR试剂中占有重要地位；(3)相比对照组，测试组2、3可导致个别位点延伸效率明显提高：测试组2、3检测阳性对照，H1延伸效率相比其他组提高，测试组2、3检测待测样品，H3延伸效率相比其他组提高。提示当反应灵敏度不足时，可考虑适当增加酶的用量。
实施例四：免核酸提取的一步PCR反应
本实施例设置1个对照组，1个测试组，用于比较经核酸提取纯化进行一步PCR扩增和免核酸提取直接进行一步PCR扩增检测DNA/RNA的效果。以实施例一和二筛选出的一步PCR试剂10作为检测试剂，以上海市临床检验中心新冠室间质评样本2014作为待测样品，以新冠病毒(SARS-COV-2)核酸检测的3重引物混合物作为引物体系，进行核酸质谱检测。通过比对测试组与对照组的检测结果，确定实施例一和二筛选出的一步PCR试剂10是否适合免核酸提取的DNA/RNA样本的检测。设置阴性对照为水，阳性对照为新冠病毒核酸检测的各靶标的质粒混合物。测试组的检测效果应不差于对照组的检测效果。
其中，所述新冠病毒核酸检测的位点信息如下表：
位点编号 病原体 检测靶标 核酸性质
SARS-COV-2-1 SARS-COV-2 靶标1 RNA
SARS-COV-2-2 SARS-COV-2 靶标2 RNA
SARS-COV-2-3 HuRNA 靶标3 RNA
所述13种呼吸道病原体的引物序列如下表：
Figure BDA0002626768450000171
Figure BDA0002626768450000181
其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如下表所示。
Figure BDA0002626768450000182
在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'端加入10bp的tag(acgttggatg)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-acgttggatgccctgtgggttttacactta-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。
本实施例设置1个对照组，使用样本为经过提取纯化的核酸，测试组使用样本为使用商品化试剂盒快速处理的样本，对照组和测试组均使用筛选出的一步PCR试剂10，反应体积和模板加样量均保持一致，反应程序保持一致，SAP和单碱基延伸反应的反应体系和程序保持一致。
使用ABI 9700型PCR仪进行检验。操作按照说明书进行，具体方法如下：
1.PCR扩增
1.1在PCR配液区，按照待检样品数准备200μL PCR反应管，并在管上标记样本编号。
1.2从试剂盒中取出一步PCR试剂10，ddH2O，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底。
1.3根据样本数目，按下表的比例取出buffer和酶，置于一个1.5mL离心管中混匀，按每PCR反应管加入相应体积混合物进行分装。
实验组 水(ul) buffer(ul) 酶(ul) 引物(ul) 模板(ul) 合计(ul)
对照组 4.5 5 1 2.5 12 25
测试组 15.5 5 1 2.5 1 25
1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入相应体积待测样品，使每份PCR反应体系总体积达到相应体积。其中，阴性对照为超纯水，阳性对照为新冠病毒核酸检测的各靶标的质粒混合物。
1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。
Figure BDA0002626768450000183
Figure BDA0002626768450000191
2.SAP酶消化
PCR反应结束后，依次取5μL PCR产物至新管，每管加入SAP酶混合物2μL，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。
温度(℃) 时间(min) 循环数
37 30 1
65 5 1
3.单碱基延伸
3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混合物，置于一个离心管中混匀。
组分名称 单反应体积(μL)
延伸引物混合液 1
延伸酶混合物 1
合计 2
3.2在PCR扩增区，按每管PCR产物加入2μL延伸混合物进行分装；
3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。
Figure BDA0002626768450000192
4.纯化
在PCR扩增区向每管延伸产物中加入41μL纯水，15mg树脂，颠倒混匀30min。
5.点样
使用微量移液器，吸取0.5μL纯化产物，点样至含基质靶片上。
6.检测及结果判读
使用发明人研制的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。
7、检测质量标准
Figure BDA0002626768450000193
Figure BDA0002626768450000201
杂峰：非本反应体系中可能出现的峰均为杂峰；峰型：无分叉，偏锋，跟峰等情况视为峰型较好
8.检测结果
将实施例四中所述测试组、对照组各3个单碱基延伸产物均点样至同样一张芯片上，进行核酸质谱检测。质谱检测结果显示：
Figure BDA0002626768450000202
(1)阴性对照：测试组、对照组中阴性对照均正常未检出任何病原体靶标；
(2)阳性对照：测试组、对照组中阳性对照所有靶标均正确检出；
(3)待测样品：测试组、对照组中待测样品所有靶标均正确检出，延伸效率均为100％；
(4)测试组与对照组中均无明显杂峰，基线平稳，检测效果无明显差异。
综合分析以上结果得出，实施例一和二筛选出的一步PCR试剂10可用于免核酸提取的样本检测，从而可以降低试剂成本，减少样本用量，减少操作步骤。
序列表
<110> 北京毅新博创生物科技有限公司
<120> 核酸质谱检测DNA/RNA的产品及检测方法
<160> 61
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
acgttggatg ccctgtgggt tttacactta 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
acgttggatg aaaacgattg tgcatcagc 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
acgttggatg ggaacttctc ctgctagaat 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
acgttggatg cagacatttt gctctcaag 29
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
acgttggatg acagagactt gaagatgtct 30
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
acgttggatg tcagaggtga caggattg 28
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
acgttggatg tgggaggctg gtgtttatag 30
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
acgttggatg tgctggatct ggtattatc 29
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
acgttggatg gtactgacaa ggaccaaatc 30
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg ggcttctttt ggtagatact g 31
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<212> DNA
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acgttggatg ggtcaaattc tttcccaccg 30
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<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg cgctgtttgg agacacaatt 30
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acgttggatg tcaatattga gatagaatct 30
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acgttggatg aatttggtta ttacaagggc 30
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acgttggatg actcattgga acaactgccg 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg gtacgcaggt agactgtctc 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg taccttagga cttgccattg 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg atagcgcaaa cccagccttc 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg gtactacact gaattcaccc 30
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<212> DNA
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg tccaatccaa atgcggcatc 30
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acgttggatg cacaccattg cacattgcac 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg caggtattca agatacaaag 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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ggtatgtgga aaggttatg 19
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ttgctgctgc ttgacagat 19
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caatcctgtc acctctga 18
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ccacgattgc aatacaactt g 21
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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ggaccaaatc ttcctgta 18
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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gaaccaacag tgtaattttt c 21
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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ggctccagaa tataggcatg at 22
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agacttggga cagaaca 17
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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cccaatgcac aagaacaaa 19
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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gcctgccgtg tgaaccatgt gactt 25
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ccaggatgga gccg 14
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acgttggatg gatgcatctg aaccacaacg 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg actatcaaca agcaaagggc 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg gaaggtctgc tcctaattcc 30
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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acgttggatg gggttctatt gccagaattg 30
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acgttggatg gccaacgctc ttgaacattc 30
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acgttggatg ggtcattccc aggaatcttg 30
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acgttggatg tgctaatcac caagctgac 29
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acgttggatg taccaggcgg aaacctagt 29
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acgttggatg gcctctcttg ttcttgctcg 30
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acgttggatg ggtaagcgta aaactcatcc 30
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acgttggatg ttcattactc gtgaagagg 29
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acgttggatg ttggtgccac atgcattacg 30
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acgttggatg tcctcttcac ataatcgccc 30
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acgttggatg tacacgggac ccatagtag 29
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acgttggatg ctgccatcct ccctctataa 30
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acgttggatg caccccctca ccatcgggga a 31
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acgttggatg gatggttggt atggtttcag 30
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acgttggatg ttgccgattg agtgcttttg 30
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ggaccaaatc ttcctgta 18
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taaggtattc taccctgac 19
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<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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ctgctcctaa ttccagatct actt 24
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ctgctcatct ttattaccct tacc 24
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cccttgacga aacatcggag gga 23
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<400> 57
gtccgcaatc tacaacacag gc 22
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gcatgtggca ccaatgt 17
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cgcagagctg cttaaacgat aa 22
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cctgctatag ctccaaa 17
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gagagggaac tgctgca 17

Claims (20)

1.一种能适用于核酸质谱的、且可同时检测DNA/RNA的多重一步PCR试剂One-Step RT-PCR Kit，其中所述一步PCR试剂One-Step RT-PCR Kit中的酶为双酶体系，该双酶体系选自鼠白血病病毒来源的消除了RNaseH活性的M-MLV反转录酶，以及特定的且有效减少由引物错配引起的非特异扩增的热稳定Taq DNA聚合酶。
2.权利要求1所述的一步PCR试剂，其中与所述双酶体系匹配使用的PCR的反应试剂包括缓冲液和dNTP，其中缓冲液包括Mg2+、PCR稳定剂和增强剂，该增强剂包括200mM Tris-HCl(pH 8.4),500mM KCl。
3.权利要求1或2所述的一步PCR试剂，其中所述dNTP包括200uM dATP、200uM dCTP、200uM dGTP、200uM dTTP。
4.一种DNA/RNA核酸质谱检测产品，包括权利要求1-3所述的一步PCR试剂和用于单碱基延伸反应的试剂、用于质谱的基质试剂，其中所述双酶体系选自鼠白血病病毒来源的消除了RNaseH活性的M-MLV反转录酶，以及特定的且有效减少由引物错配引起的非特异扩增的热稳定TaqDNA聚合酶。
5.权利要求4所述的检测产品，其中与所述双酶体系匹配使用的PCR的反应试剂包括缓冲液和dNTP，其中缓冲液包括Mg2+、PCR稳定剂和增强剂，增强剂：包括200mM Tris-HCl(pH8.4),500mM KCl，所述dNTP包括200uM dATP、200uM dCTP、200uM dGTP、200uM dTTP。
6.权利要求4或5所述的检测产品，其中该检测产品是用于检测呼吸道病原体的检测产品，其包括用于反转和PCR扩增的一步PCR的反应试剂和用于单碱基延伸反应的试剂、纯化试剂以及用于质谱的基质试剂。
7.权利要求6所述的检测产品，其中所述核酸是从样品中提取纯化的核酸，或免提取纯化的核酸，从而将样品与反应试剂混合后直接进行PCR扩增。
8.权利要求4-7任一所述的检测产品，所述检测产品还包括：特异性PCR引物、用于PCR产物纯化的试剂，用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。
9.权利要求8所述的检测产品，其中该检测产品还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片等试剂。
10.权利要求8所述的检测产品，其中用于PCR产物纯化的试剂包括碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱，当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
11.权利要求4-10任一所述的检测产品，其中所述检测产品包括独立使用的检测试剂、检测基质和/或检测芯片、分析软件，以及包含所述检测试剂、检测基质和/或检测芯片、分析软件的检测试剂盒。
12.一种利用权利要求1-3的一步PCR试剂，或利用权利要求4-11的检测产品，进行多重DNA/RNA核酸质谱检测方法，包括：
(1)准备待测样本；
(2)一步PCR反应：将样本进行一步PCR反应，得到含扩增目标区域的PCR产物；
(3)PCR产物纯化：对步骤(2)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(4)单碱基延伸：使用特异延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(3)得到的纯化后PCR产物进行单碱基延伸；
(5)延伸产物纯化：对步骤(4)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(6)质谱仪检测：将步骤(5)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测，得到不同SNP位点延伸产物的核酸谱图；
(7)将得到的不同SNP位点延伸产物的核酸谱图，经过质谱仪配套软件比对标准图谱和分析后，确认SNP位点的碱基，从而判定该样本的基因型。
13.权利要求12的核酸质谱检测方法，当待测样本是提取纯化的DNA/RNA时，步骤(1)直接将待测样本加入一步PCR反应试剂中。
14.权利要求13的检测方法，当待测样本是咽拭子病毒保存液、鼻拭子病毒保存液等样品时，步骤(1)将待测样本加入商品化的样品处理剂中，进行样品预处理，无需纯化。
15.权利要求14的检测方法，其中步骤(1)将待测样本使用闪电核酸释放剂进行预处理，利用细胞内外盐离子浓度差可导致细胞膜胀破的原理来裂解细胞，释放核酸，且无需纯化。
16.权利要求15的方法，其中步骤(1)的步骤包括：
每20μL样本，加入5μL闪电核酸释放剂至一新的200μLEppendorf管，漩涡混合均匀后，将Eppendorf管置于金属浴或热盖PCR仪上95℃加热10min。取出Eppendorf管平衡至室温，12000rpm离心2min，吸取Eppendorf管内上清液至一干净的离心管内，待检。PCR扩增时，每25μL反应体系，加入1μL处理物上清液即可。
17.利用权利要求1-3的一步PCR试剂，或利用权利要求4-11的检测产品用于检测DNA/RNA的用途，其中所述用途是非疾病检测用途。
18.权利要求17的用途，其中所述用途是用于确定来自动植物、人、水源、食品、公共场所、居住或办公环境是否携带某些病原体(包括细菌、病毒、立克次氏体、真菌、结核分枝杆菌等，死菌或活菌等)，以便确定卫生防疫的检测结果。
19.权利要求17或18的用途，其中所述用途是确定人的血液、痰液、口咽拭子、鼻拭子等样本中携带病原体的虚拟SNP位点的基因分型，以便提供给药方案的参考意见。
20.权利要求17或18的用途，其中所述用途是确定个体的SNP位点是确定患者的药物靶点，以便筛选有效的药物；或所述用途是确定个体之间的亲缘关系，包括但不限于亲子鉴定、司法身份鉴定或法医学鉴定。
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