CN116218984A - 基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的核酸组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测19个抗抑郁症用药基因的基因多态性位点的核酸组合、试剂盒和使用方法。利用上述核酸组合、试剂盒及检测方法,可在一个反应体系内同步实现19个目的靶点的扩增检测,并且具有快速简便,操作简单,性能稳定且灵敏度高的优点,为抗抑郁症个体化用药提供了更为合理的用药指导。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体而言,涉及一种基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的核酸组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
抑郁症是一种常见的精神障碍,又称抑郁障碍。根据世界卫生组织统计数据显示,全球约有3.8%的人受到影响,成年人中有5%患有抑郁症,每年有超过70万人因抑郁症而自杀身亡。有报道称我国抑郁症患病率高达6.1%,折算人口数超过9000万人。
抑郁症目前主要已抗抑郁药治疗为主,但在抑郁症患者中,仅有30%~45%的患者在抗抑郁药物治疗下可以获得临床症状的缓解,另有10%的患者对任何种类的抗抑郁药物治疗无效,药物治疗出现巨大的个体化差异。近年来药物基因组学得到飞速发展,而药物基因组学就是针对基因与药物在不同人群个体内相互作用的差异性进行研究。多项研究发现,基因突变与药物反应密切相关,有研究证实抗抑郁药物反应的50%是由遗传因素决定的,尤其是药物代谢酶及药物作用靶点相关的基因等。
目前市场上存在多种针对基因多态性检测的技术,如高通量测序(NGS)、荧光定量PCR等。但这些技术在应用上均有一定不足,如高通量测序费用昂贵,耗时较长,荧光定量PCR通量较小,虽然时效快,但在应对多位点检测时存在明显劣势。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的核酸组合、试剂盒及检测方法。利用上述核酸组合、试剂盒及检测方法,可在一个反应体系内同步实现19个目的靶点的扩增检测,并且具有快速简便,操作简单,性能稳定且灵敏度高的优点,为抗抑郁症个体化用药提供了更为合理的用药指导。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明提供了一种基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的核酸组合,其包括用于检测19个基因多态性位点的扩增引物和延伸引物,上述扩增引物和延伸引物各自对应检测的基因名称和SNP位点如表1所示:
表1扩增引物和延伸引物与基因名称和SNP位点的对应关系表
针对检测的基因位点,本发明选取了覆盖目前一线抗抑郁症治疗的药物代谢与药物靶点基因上19个SNP位点进行抑郁症用药检测,包括CYP2D6基因的rs769258、rs1065852、rs5030865、rs3892097、rs16947、rs28371725和rs1135840位点,CYP2C19基因的rs4244285、rs4986893、rs12248560和rs121769205位点,FKBP5基因的rs4713916位点,HTR2A基因的rs7997012位点,COMT基因的rs4680、rs6269、rs4633、rs4818和rs13306278位点,GRIK4基因的rs1954787位点。上述19个位点覆盖了对抗抑郁症用药相关基因的常见变异位点。
在本发明中,扩增引物是用于多重PCR扩增,需要在一个反应管中同时扩增多个靶点,因此其中一个靶点的扩增势必会影响另一个靶点的扩增,所以要通过引物设计以及反应条件的优化来扩增效率,而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。本发明的发明人在经过创造性劳动后获得了上述扩增引物,其具有特异性好,扩增效率高的特点。
本发明中扩增引物的设计难点还包括:rs1065852位点位于CYP2D6基因上,该基因与CYP2D7基因高度同源,在引物设计上必须避免CYP2D7基因的扩增,否则会导致部分样本检测结果的错误。本发明检测CYP2D6基因上7个目的位点:rs1065852、rs1135840、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030865和rs769258,要同时保证7个位点检测结果的特异性,那么在引物设计上可发挥的空间有限。如rs16947,在位点周围280bp范围内,与CYP2D7基因仅有18个碱基的差异(图1),同源性高达93%。理论上Taq DNA聚合酶必须在引物3’末端碱基与模板完全互补情况下才能进行有效的聚合反应,因此,本发明选择在CYP2D6基因上选择3’末端碱基与CYP2D7不同的位置设计扩增引物(图1中箭头位置),同时避免其他引物的干扰,实现特异性扩增。
第二方面,本发明提供了一种基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的试剂盒,其包括上述核酸组合。
在一些实施例中,上述试剂盒包括多重PCR预混液;多重PCR预混液中包括上述扩增引物组。
在一些实施例中,多重PCR预混液中还含有:UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP。
现有飞行时间质谱技术需要开管操作,PCR扩增后的产物还要逐步进行消化、延伸、点样等实验操作,这些过程都容易产生扩增产物气溶胶,可能对环境、试剂等造成污染,出现假阳性检测结果。本发明针对这一问题,将多重PCR预混液中的dTTP替换为dUTP,使扩增产物含U碱基,同时在PCR过程中加入UNG酶,在样本扩增前将含U产物消化酶切,防止含U扩增产物形成气溶胶干扰正常检测。
但是,用dUTP替换dTTP后,碱基结合效率降低,导致多个位点的效率明显降低,如rs3892097位点,或因扩增延伸受抑制,导致检测失败,如rs1065852位点。针对这一问题,发明人通过改变延伸引物的设计,避免引物3’端出现连续的腺嘌呤,减少因腺嘌呤和尿嘧啶碱基配对效率降低而带来的影响。
在一些实施例中,多重PCR预混液中还含有Mg2+、PCR缓冲液和DNA聚合酶。
在一些实施例中,Mg2+以MgCl2的形式添加至多重PCR预混液中。
在一些实施例中,DNA聚合酶可以为TaqDNA聚合酶,还可以是其他聚合酶,本发明对DNA聚合酶的类型不作特别限定。
在一些实施例中,上述试剂盒中还包括iPLEX延伸预混液。
在一些实施例中,iPLEX延伸预混液中包括延伸引物组;
在一些实施例中,iPLEX延伸预混液中还包括iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合液和iPLEX酶。
在一些实施例中,上述试剂盒还包括SAP消化预混液,SAP消化预混液含有SAP缓冲液和SAP酶。
第三方面,本发明还提供了一种基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的方法,使用上述核酸组合或上述试剂盒进行检测。
在一些实施例中,上述检测方法包括先进行多重PCR;然后将得到的多重PCR产物进行单碱基延伸反应;多重PCR的PCR反应体系中含有上述扩增引物;单碱基延伸反应的延伸反应体系中含有上述延伸引物。
在一些实施例中,PCR反应体系中的每条扩增引物的浓度为0.1-0.15μM,更优选为:0.1μM。
在一些实施例中,PCR反应体系中含有UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP。
在一些实施例中,在PCR反应体系中,dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度比为:1.8-2.2:0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1,更优选为:2:1:1:1。
在一些实施例中,在PCR反应体系中,dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度为200μM:100μM:100μM:100μM。
在一些实施例中,PCR反应体系中,Mg2+浓度为2.5mM。
为了增加引物的扩增效率,本发明优化了在扩增过程中MgCl2的浓度,以及dUTP/dNTP Mix的比例浓度,最终使得19个位点的扩增效率和延伸效果达到最优。
在一些实施例中,多重PCR的反应程序为:37℃孵育10min;95℃预变性2min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸60s,45个循环;72℃延伸5min。
在一些实施例中,SAP酶消化的反应程序为:37℃保温40min;85℃保温5min。
在一些实施例中,单碱基延伸的反应程序为:95℃预变性30s;95℃变性5s,52℃退火5s,80℃延伸5s,共40个循环,每个循环中插入退火和延伸5个循环;最后72℃后延伸3min。
本发明具有以下有益效果:
本发明通过设计覆盖19个位点的多重PCR引物和单碱基延伸引物,结合基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱技术,能够简便、准确、高效地检测抗抑郁症药物基因上19个位点的SNP分型,各项性能指标均符合要求,保证检测结果准确可靠,满足临床需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为CYP2D6基因与CYP2D7基因序列比对结果;
图2为实施例2扩增检测rs3892097位点的质谱结果;
图3为实施例2扩增检测rs1065852位点的质谱结果;
图4为对比例1的PCR反应中加入dTTP扩增检测rs3892097位点的质谱结果;
图5为对比例1的PCR反应中加入dTTP扩增检测rs1065852位点的质谱结果;
图6为对比例2的PCR反应中加入dUTP扩增检测rs3892097位点的质谱结果;
图7为对比例2的PCR反应中加入dUTP扩增检测rs1065852位点的质谱结果;
图8为对比例3与实施例2的PCR反应中rs3892097位点的基因分型结果,左边为对比例3的基因分型结果,右边为实施例2的基因分型结果;
图9为对比例4中的检测结果:A为初筛质谱体系检测样本rs1065852位点结果;B为一代测序法检测样本rs1065852位点结果。
图10为实验例1中rs16947位点的测序结果;
图11为实验例1中rs1135840位点的测序结果;
图12为实验例1中rs5030865位点的测序结果;
图13为实验例1中rs1065852位点的测序结果;
图14为实验例1中rs28371725位点的测序结果;
图15为实验例1中rs3892097位点的测序结果;
图16为实验例1中rs769258位点的测序结果;
图17为实验例1中rs4244285位点的测序结果;
图18为实验例1中rs4986893位点的测序结果;
图19为实验例1中rs12248560位点的测序结果;
图20为实验例1中rs12769205位点的测序结果;
图21为实验例1中rs4713916位点的测序结果;
图22为实验例1中rs7997012位点的测序结果;
图23为实验例1中rs4680位点的测序结果;
图24为实验例1中rs6269位点的测序结果;
图25为实验例1中rs4633位点的测序结果;
图26为实验例1中rs4818位点的测序结果;
图27为实验例1中rs13306278位点的测序结果;
图28为实验例1中rs1954787位点的测序结果;
图29为实验例4中1065852位点的质谱结果;
图30为实验例4中rs1135840位点的质谱结果;
图31为实验例4中rs12248560位点的质谱结果;
图32为实验例4中rs12769205位点的质谱结果;
图33为实验例4中rs13306278位点的质谱结果;
图34为实验例4中rs16947位点的质谱结果;
图35为实验例4中rs1954787位点的质谱结果;
图36为实验例4中rs28371725位点的质谱结果;
图37为实验例4中rs3892097位点的质谱结果;
图38为实验例4中rs4244285位点的质谱结果;
图39为实验例4中rs4633位点的质谱结果;
图40为实验例4中rs4680位点的质谱结果;
图41为实验例4中rs4713916位点的质谱结果;
图42为实验例4中rs4818位点的质谱结果;
图43为实验例4中rs4986893位点的质谱结果;
图44为实验例4中rs5030865位点的质谱结果;
图45为实验例4中rs6269位点的质谱结果;
图46为实验例4中rs769258位点的质谱结果;
图47为实验例4中rs769258位点的质谱结果;
图48为实验例4中同源基因CYP2D7干扰测试中rs1065852位点的质谱结果;
图49为实验例4中同源基因CYP2D7干扰测试中rs1135840位点的质谱结果;
图50为实验例4中同源基因CYP2D7干扰测试中rs16947位点的质谱结果;
图51为实验例4中同源基因CYP2D7干扰测试中rs28371725位点的质谱结果;
图52为实验例4中同源基因CYP2D7干扰测试中rs3892097位点的质谱结果;
图53为实验例4中同源基因CYP2D7干扰测试中rs5030865位点的质谱结果;
图54为实验例4中同源基因CYP2D7干扰测试中rs769258位点的质谱结果;
图55为实验例4中CYP2D6基因rs1065852位点的基因分型结果;
图56为实验例4中CYP2D6基因rs1135840位点的基因分型结果;
图57为实验例4中CYP2D6基因rs16947位点的基因分型结果;
图58为实验例4中CYP2D6基因rs28371725位点的基因分型结果;
图59为实验例4中CYP2D6基因rs3892097位点的基因分型结果;
图60为实验例4中CYP2D6基因rs5030865位点的基因分型结果;
图61为实验例4中CYP2D6基因rs769258位点的基因分型结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的核酸组合,其包括用于检测19个基因多态性位点的扩增引物和延伸引物,各位点的扩增引物和延伸引物的核苷酸序列如表2所示:
表2各位点的扩增引物和延伸引物的核苷酸序列
本实施例提供的核酸组合可以通过常规的化学合成方式合成得到。
实施例2
本实施例提供了使用实施例1提供的核酸组合基于核酸质谱技术检测检测抗抑郁症用药基因的方法,包括如下步骤:
S1.标本采集与保存:按照医院常规采集EDTA抗凝外周血的方法进行样本采集。抗凝全血样本2-8℃保存≤30天,-20℃-5℃保存≤2年,冻融次数不超过6次。
S2.全血基因组DNA的提取:参考天根全血抽提试剂盒(DP348-02)提取说明书步骤,提取后DNA的吸光度OD260/280在1.7-2.0之间,样本浓度在2~100ng/μL之间,DNA样本质量符合上述要求后再进行下一步PCR反应。
S3.多重扩增引物和延伸引物的稀释:多重扩增引物干粉用超纯水溶解制备成100μM贮存液,混合使每一条扩增引物的终浓度为0.5μM;延伸引物的干粉用超纯水溶解制备成500μM的贮存液,混合配制后在质谱仪上调整至每一个引物峰高相对均一为止,即最低峰峰高大于最高峰峰高的二分之一。
S4.检测
①多重PCR扩增反应
表3配制多重PCR反应体系
上表的PCR反应体系中,扩增引物混合液中的每条引物浓度0.1μM;
在PCR反应体系中,dNTP混合液中包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP,其对应的浓度为100μM:100μM:100μM:200μM;对应的浓度比为:1:1:1:2。
多重PCR扩增的反应程序为:37℃孵育10min;95℃预变性2min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸60s,45个循环;72℃延伸5min。
②SAP酶消化
表4酶切反应体系
向多重PCR扩增反应后的5μL的反应产物中加入SAP mix 2μL,共7μL,进行如下反应:37℃保温40min;85℃保温5min。
③单碱基延伸反应
表5配制单碱基延伸反应体系
向经过消化反应的反应产物中加入单碱基延伸mix 2μL,共9μL,进行如下反应:95℃预变性30s;95℃变性5sec,52℃退火5sec,80℃延伸5sec,共40个循环,每个循环中插入退火和延伸5个循环;最后72℃后延伸3min。
本实施例使用的是带有芯片准备模块的全自动96孔模块系统(CPM96),在样本板的每一个孔里加入41uL超纯水,将其转移到核酸质谱仪的芯片准备模块,将一块芯片也放入对应模块,设置好程序,机器自动进行产物脱盐、点样芯片,和产物飞行检测步骤。飞行结束后,在机器自带的Typer软件分析数据,后导出基因分型数据。其中,rs3892097和rs1065852位点的质谱结果如图2和3所示。
实施例3
本实施例提供的基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的试剂盒,其包含多重PCR扩增、SAP消化、iPLEX延伸三管反应预混液,以及阳性对照和空白对照共5管组成,具体组成如表6所示。
表6试剂盒成分
本实施例提供的试剂盒采用预混液设计,可方便客户操作,样品提取DNA后可直接扩增,缩短了反应体系配制时间,提高工作效率。该预混液不只是将各组份进行简单的混合,还需调整各组分的配方,经过优化并验证之后,具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点,可最大限度的减少人为误差。
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于,不含UNG酶,dNTP混合液中包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP,dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度为1:1:1:1,MgCl2的浓度为:2.0mM,扩增引物是根据常规设计思路设计出的,未进行优化。其中,rs3892097和rs1065852位点的质谱结果如图4和图5所示。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于,dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度为1:1:1:1,MgCl2的浓度为:2.0mM,扩增引物是根据常规设计思路设计出的,未进行优化。其中,本对比例rs3892097和rs1065852位点的质谱结果如图6和图7所示。
将图4与图6对比后可以发现,用dUTP替换dTTP后,碱基结合效率降低,导致多个位点的效率明显降低;图5与图7对比可以发现,用dUTP替换dTTP后,扩增延伸受抑制,导致检测失败。
对比例3
本对比例与实施例2的区别在于,扩增引物是根据常规设计思路设计出的,未进行优化。rs3892097位点的基因分型结果如图8所示,其中,图8的左图为dUTP/dNTP Mix为进行优化的基因分型结果,图8的右图为本对比例的基因分型结果。
左图的体系中用dUTP替代了dTTP,A/U碱基之间配对结合效率降低,扩增效率不高,导致产物延伸效率低于0.6;右图是对dATP/dCTP/dGTP/dUTP的浓度和比例进行了比较和调整,从图中可以看出,靶点扩增效率提高,产物延伸效率提高至0.7以上。
为了体现引物设计优化后的效果,将本对比例对rs1065852位点的检测结果与实施例2对rs1065852位点的检测结果进行对比,如图9所示:优化前,质谱初筛体系检测结果为CC(图9-A),而一代测序结果为CT(图9-B),证明采用常规方法设计的引物,位点的检测结果会出现不一致的现象;优化后,质谱体系检测同一样本的rs1065852位点结果如图3所示,从图中可以看出,引物设计优化后rs1065852位点可以实现特异性扩增。
实验例1
准确性检测
选择100例全血样本,并可覆盖待测位点的所有基因型,分别用实施例1的核酸组合和参照实施例2的方法进行测试,与金标准Sanger测序法或者已上市荧光探针产品检测进行验证,验证结果与本方法100%符合。
以其中1例样本结果为例,质谱法检测的结果如下表7所示:
表7质谱法检测YZY-A0002样本结果
样本编号 | 检测位点 | 质谱检测结果 |
YZY-A0002 | rs16947 | C |
YZY-A0002 | rs1135840 | GC |
YZY-A0002 | rs5030865 | G |
YZY-A0002 | rs1065852 | CT |
YZY-A0002 | rs28371725 | G |
YZY-A0002 | rs3892097 | G |
YZY-A0002 | rs769258 | G |
YZY-A0002 | rs4244285 | G |
YZY-A0002 | rs4986893 | GA |
YZY-A0002 | rs12248560 | C |
YZY-A0002 | rs12769205 | A |
YZY-A0002 | rs4713916 | AG |
YZY-A0002 | rs7997012 | G |
YZY-A0002 | rs4680 | G |
YZY-A0002 | rs6269 | GA |
YZY-A0002 | rs4633 | C |
YZY-A0002 | rs4818 | CG |
YZY-A0002 | rs13306278 | C |
YZY-A0002 | rs1954787 | C |
将100例样本送至艾康健生物科技公司进行测序,其中一例样本的测序检测结果见表8。
表8测序结果
样本编号 | 检测位点 | 测序结果 | 测序图谱编号 |
YZY-A0002 | rs16947 | C | 图10 |
YZY-A0002 | rs1135840 | GC | 图11 |
YZY-A0002 | rs5030865 | G | 图12 |
YZY-A0002 | rs1065852 | CT | 图13 |
YZY-A0002 | rs28371725 | G | 图14 |
YZY-A0002 | rs3892097 | G | 图15 |
YZY-A0002 | rs769258 | G | 图16 |
YZY-A0002 | rs4244285 | G | 图17 |
YZY-A0002 | rs4986893 | GA | 图18 |
YZY-A0002 | rs12248560 | C | 图19 |
YZY-A0002 | rs12769205 | A | 图20 |
YZY-A0002 | rs4713916 | AG | 图21 |
YZY-A0002 | rs7997012 | G | 图22 |
YZY-A0002 | rs4680 | G | 图23 |
YZY-A0002 | rs6269 | AG | 图24 |
YZY-A0002 | rs4633 | C | 图25 |
YZY-A0002 | rs4818 | GC | 图26 |
YZY-A0002 | rs13306278 | C | 图27 |
YZY-A0002 | rs1954787 | C | 图28 |
结果分析:Sanger测序法检测结果与本项目核酸质谱检测结果完全一致。本发明的优势:一孔式扩增检测19个位点,而测序方法需要19个孔分别进行扩增反应,工作量和成本都远高于本方法。
实验例2
重复性检测
选取5份人类基因组DNA样本,设置浓度分别为10ng/μL,包含所有位点的杂合突变分型,重复10次检测,检测结果可检测出对应分型且一致率100%,结果见下表9:
表9 DNA样本浓度为10ng/μL重复10次检测
结果显示,DNA上样量为10ng/μL并进行10次重复检测,五个样本的19个位点10次重复均能检出正确分型,符合率100%。说明本试剂盒技术性能稳定,检测结果准确可信。
实验例3
灵敏度检测
选取五份人类基因组DNA样本,包含所有的位点的杂合突变分型,进行梯度稀释,起始DNA浓度分别设置为10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.2ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL,然后进行后续的PCR、消化、延伸和上机测试,五个样本的结果统计如表10所示:
表10不同DNA上样量分型结果
结果显示,在DNA上样量低至0.5ng/μL时,五个样本的19个位点均能检出正确分型,在上样量在≤0.2ng/μL时,个别位点未能检出。说明本试剂盒在上样量为低至0.5ng/μL的人类基因组DNA的情况下,可以将19个位点一次性全部检出,具有非常高的灵敏度,也适合复杂样本或稀有样本的研究。
实验例4
抗干扰性能检测
各位点检测效果:以1例样本(编号YZY-A0002)为例,本发明19个位点检测效果如图29-47所示。
图29-47结果显示,各位点检测分型清晰可辨,且在一孔内同时进行19个位点的扩增、消化、延伸反应,位点与位点之间不存在互相干扰。该体系内共有3组6个位点两两之间距离很近(rs4680与rs4818、rs1065852与rs769258、rs5030865与rs3892097),互为范围外SNP干扰,检测结果同时验证范围外SNP位点的干扰不影响检测结果。
同源基因CYP2D7干扰测试:通过检测人工合成的CYP2D7同源基因序列,测试本发明对同源基因序列的抗干扰能力,结果如图48-54所示。
检测结果显示,本发明不受同源基因的干扰,可特异的识别目的位点基因分型。
图55-61中也可以得出CYP2D6基因上这7个位点可特异识别不同的基因分型,具有良好的特异性。
值得说明的是,由于7个位点在CYP2D6基因上处于不同位置且间隔较远,当检测样本出现这7个位点无结果而其他基因位点检测结果正常时,则该样本为CYP2D6*5(即CYP2D6基因缺失)的概率极大,这对检测基因的大片段缺失具有重要的借鉴意义。
由于本身是多重PCR体系,大量样本的每个位点都可以准确检测,足以体现体系对其他位点的抗干扰能力。本发明检测基因中CYP2D6目的基因与CYP2D7基因序列高度同源,本发明通过优化体系可特异的检测目的基因CYP2D6上7个位点,并可有效避免CYP2D7基因的非特异干扰。
实验例5
产品性能分析-防污染能力验证
由于核酸质谱检测的灵敏度较高,0.5ng DNA即可正常检测,如果扩增产物在开管操作中一旦产生气溶胶,而气溶胶浓度远高于该检测限浓度,那么极易出现假阳性检测结果。而体系中加入dUTP和UNG酶,则可以减少中间产物污染对检测带来的影响。
选择一例样本的质谱检测产物,10倍梯度分别稀释104倍~1010倍,将产物用荧光法试剂进行定量检测,同时将各浓度产物进行质谱PCR扩增、消化、延伸和上机检测,两个样本的质谱结果统计见下表11。
荧光探针法定量结果表明,质谱产物浓度在1010~1013copies/μL范围内,各位点因扩增效率不同,产物浓度也不尽相同。而稀释后的质谱产物进行正常检测,不同的位点分别在稀释105~1010倍后不能检出,这表明UNG酶可降解各位点的产物量分别为105~108拷贝,本试剂盒共检测19个位点,提示本试剂盒可抗109拷贝产物气溶胶污染。
表11稀释后质谱产物检测结果
从上表中可以看出,扩增体系中加入dUTP和UNG酶后,对中间产物污染和转板撕膜污染有很强的抗干扰能力,UNG酶可以消除109拷贝以下产物气溶胶不干扰结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的核酸组合,其特征在于,其包括用于检测19个基因多态性位点的扩增引物和延伸引物,分别为:
CYP2D6基因的rs16947位点,其扩增引物为SEQ ID NO.1-2;延伸引物为SEQ ID NO.39;
CYP2D6基因的rs1135840位点,其扩增引物为SEQ ID NO.3-4;延伸引物为SEQ IDNO.40;
CYP2D6基因的rs5030865位点,其扩增引物为SEQ ID NO.5-6;延伸引物为SEQ IDNO.41;
CYP2D6基因的rs1065852位点,其扩增引物为SEQ ID NO.7-8;延伸引物为SEQ IDNO.42;
CYP2D6基因的rs28371725位点,其扩增引物为SEQ ID NO.9-10;延伸引物为SEQ IDNO.43;
CYP2D6基因的rs3892097位点,其扩增引物为SEQ ID NO.11-12;延伸引物为SEQ IDNO.44;
CYP2D6基因的rs769258位点,其扩增引物为SEQ ID NO.13-14;延伸引物为SEQ IDNO.45;
CYP2C19基因的rs4244285位点,其扩增引物为SEQ ID NO.15-16;延伸引物为SEQ IDNO.46;
CYP2C19基因的rs4986893位点,其扩增引物为SEQ ID NO.17-18;延伸引物为SEQ IDNO.47;
CYP2C19基因的rs12248560位点,其扩增引物为SEQ ID NO.19-20;延伸引物为SEQ IDNO.48;
CYP2C19基因的rs12769205位点,其扩增引物为SEQ ID NO.21-22;延伸引物为SEQ IDNO.49;
FKBP5基因的rs4713916位点,其扩增引物为SEQ ID NO.23-24;延伸引物为SEQ IDNO.50;
HTR2A基因的rs7997012位点,其扩增引物为SEQ ID NO.25-26;延伸引物为SEQ IDNO.51;
COMT基因的rs4680位点,其扩增引物为SEQ ID NO.27-28;延伸引物为SEQ ID NO.52;
COMT基因的rs6269位点,其扩增引物为SEQ ID NO.29-30;延伸引物为SEQ ID NO.53;
COMT基因的rs4633位点,其扩增引物为SEQ ID NO.31-32;延伸引物为SEQ ID NO.54;
COMT基因的rs4818位点,其扩增引物为SEQ ID NO.33-34;延伸引物为SEQ ID NO.55;
COMT基因的rs13306278位点,其扩增引物为SEQ ID NO.35-36;延伸引物为SEQ IDNO.56;
GRIK4基因的rs1954787位点,其扩增引物为SEQ ID NO.37-38;延伸引物为SEQ IDNO.57。
2.一种基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1所述的核酸组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括多重PCR预混液;
优选地,所述多重PCR预混液中包括所述扩增引物组;
优选地,所述多重PCR预混液中还含有:UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述多重PCR预混液中还含有Mg2+、PCR缓冲液和DNA聚合酶;
优选地,所述Mg2+以MgCl2的形式添加至所述多重PCR预混液中;
优选地,所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括iPLEX延伸预混液;
优选地,所述iPLEX延伸预混液中包括所述延伸引物;
优选地,所述iPLEX延伸预混液中还包括iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合液和iPLEX酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括SAP消化预混液,所述SAP消化预混液含有SAP缓冲液和SAP酶。
7.一种基于飞行时间核酸质谱技术检测抗抑郁症用药基因的方法,所述方法不以诊断为目的,其特征在于,使用权利要求1所述的核酸组合或权利要求2-6任一项所述的试剂盒进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述方法包括:进行多重PCR;将得到的多重PCR产物经过SAP酶消化后进行单碱基延伸反应;
所述多重PCR的PCR反应体系中含有所述扩增引物;所述单碱基延伸反应的延伸反应体系中含有所述延伸引物。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述PCR反应体系中,所述核酸组合中的每条扩增引物的浓度为0.1-0.15μM,更优选为:0.1μM;
优选地,所述PCR反应体系中含有UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP;
优选地,在所述PCR反应体系中,dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度比为:1.8-2.2:0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1,更优选为:2:1:1:1;
优选地,在所述PCR反应体系中,dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度为200μM:100μM:100μM:100μM;
优选地,所述PCR反应体系中,Mg2+浓度为2.5mM。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述多重PCR的反应程序为:37℃孵育10min;95℃预变性2min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸60s,45个循环;72℃延伸5min;
优选地,所述单碱基延伸的反应程序为:95℃预变性30s;95℃变性5s,52℃退火5s,80℃延伸5s,共40个循环,每个循环中插入退火和延伸5个循环;最后72℃后延伸3min。
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