CN106834478A

CN106834478A - 利用质谱进行叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传检测

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Publication number: CN106834478A
Application number: CN201710102172.3A
Authority: CN
Inventors: 张海燕; 杨宇凤; 马庆伟; 李清; 林燕
Original assignee: Beijing Yixin Bochuang Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Yixin Bochuang Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2017-06-13

Abstract

本发明公开了一种检测叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传检测相关基因多态性位点(SNP)的引物系统。基于该引物系统所制备的产品，能实现同时对叶酸遗传代谢能力和钙吸收相关基因多态位点进行检测。使用该产品，通过检测与叶酸遗传代谢能力相关基因多态位点，为指导备孕妇女和孕妇合理服用叶酸提供参考依据，同时对钙吸收相关基因多态位点的检测还可以指导孕妇在孕期科学合理的补充钙营养素。本发明能在一个反应体系内对不同基因上的5处基因多态位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，准确度和灵敏度提高。

Description

利用质谱进行叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传检测

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于确定叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传相关基因多态性位点(SNP)的检测方法及产品，具体而言是利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对叶酸遗传代谢能力的3个基因多态位点和和钙吸收遗传相关的2个基因多态位点进行检测的方法及相应的试剂盒。

背景技术

叶酸是B族维生素的一种，参与DNA、RNA、蛋白质等其他重要化合物的合成，在机体代谢过程中发挥重要的作用，常用于孕期营养补充，从而预防神经管缺陷等疾病。

我国患出生缺陷排在前5位的包括：先天性心脏病，神经管畸形，唇腭裂，唐氏综合症，多指(趾)。根据2003年的统计结果，我国先天性心脏病的发病人数达到11-16万人。根据2004年的统计结果，我国神经管畸形的发病发生率为9.44/万。此外，根据2003年的统计结果，唐氏综合症的发病率位18000人，

神经管畸形是指由于胚胎在母体内发育至第3-4周时，神经管未能闭合所造成的先天缺陷，可导致脊柱裂，脑膨出和无脑畸形。

先天性心脏病是器官形成期心血管系统发育导致的一种疾病。研究表明，HCY可影响胚胎早期心血管发育，补充叶酸能够明显缓解同型半胱氨酸对心血管的发育毒性，降低CHD的发病风险。

有研究认为,由于叶酸代谢相关基因的缺陷致叶酸的代谢障碍引起的甲基化导致染色体不分离,可能是发生唐氏综合征的危险因素。

叶酸缺乏引起HCY，从而引起唇腭裂，包括唇裂(俗称：兔唇)和腭裂(俗称：狼咽)。这种疾病与参与叶酸代谢的基因有很大关系，如果一个婴儿的哥哥或姐姐也有这种先天缺陷，那这个婴儿便比其他婴儿多30至40倍的可能出现这种缺陷。

高同型半胱氨酸血症与妊高征关系密切,可导致血管内皮细胞损伤,并可能是妊高征的发病因素之一。Hcy的轻中度升高可导致内皮细胞的抗凝功能下降,可以使内皮细胞合成减少,影响前列环素(PGI2)的合成,而PGI2有抑制血小板的粘附和聚集,增强血管扩张的作用。

孕妇体内叶酸缺乏是造成早产或流产的重要原因之一。叶酸缺乏引起的流产或早产，采用其它任何补救措施都难以避免。

大量的科学研究表明，叶酸摄入绝对或相对的缺乏，是引起高同型半胱氨酸血症的直接原因。引起叶酸缺乏的主要原因，遗传因素：机体叶酸利用能力的先天性不足，引起叶酸缺乏；摄入不足：膳食中叶酸不足或烹调加工损失；需要量增加：孕妇、乳母都处于特殊的生理状态，叶酸需要量增加，造成相对不足；其它不良因素：酗酒、服用某些药物(如抗惊厥类药物)等均可导致叶酸的缺乏。

亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。人类MTHFR基因位于染色体1p36.3，其中有多个与MTHFR活性相关的SNP位点，例如G1965A、A1515C、C894T、以及677C和1298A等。

MTHFR第1298位碱基A>C突变(rs1801131)，导致谷氨酰胺被丙氨酸取代，产生产生了三种基因型：野生型(A/A)，杂合突变型(A/C)和纯合突变型(C/C)，引起MTHFR活性下降，高半胱氨酸转化为蛋氨酸的能力下降，导致血浆中半胱氨酸(Hcy)升高。其中野生型，杂合突变型和纯合突变型三种基因型在中国人群中分布所占比例为66.8％，29.3％和3.9％。

MTHFR第677位碱基C>T突变(rs1801133)，导致编码MTHFR蛋白叶酸结合区域222位的丙氨酸被缬氨酸取代，产生了三种基因型：野生型(C/C)，杂合突变型(C/T)和纯合突变型(T/T)，导致MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸在体内积累。其中野生型，杂合突变型和纯合突变型三种基因型在中国人群中分布所占比例为33％，44％和23％。

甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶，是叶酸代谢的关键酶之一。主要突变型有十余种，其中A2756G在西方人群中较为常见，另外还有122M(A66G)、S175L、其它一些片段插入缺失和点突变，其中A66G是最主要和研究最多的突变。

MTRR基因第66位碱基A>G突变(rs1801394)，在氨基酸链残基22处蛋氨酸被异亮氨酸替代，可引起MTRR酶的活性降低，易导致同型半胱氨酸血症、神经管缺陷等疾病。上述基因位点变异，会显著影响机体的叶酸利用能力，进而引起孕妇发病风险和婴儿出生缺陷。其中野生型(A/A)，杂合突变型(A/G)和纯合突变型(G/G)三种基因型在中国人群中分布所占比例为58％，36％和6％。

机体叶酸利用能力的先天性不足，引起叶酸缺乏时，需要对补充适当的叶酸，以维持机体机内正常的生物代谢。我国推荐孕期补充量为400微克/天，可以将显著降低患儿的出生缺陷，如能够降低NTDs(41％-85％)，但是还有15％-59％却效果不明显，通过增加合适剂量的叶酸可以进一步降低NTDs。个性化补充叶酸，即让补充叶酸更具有针对性。专家建议：根据自己的遗传体质，在正确的时间补充合适剂量的叶酸。

对MTHFR基因、MTRR基因及其相关位点的检测，可以直接发现被检测者叶酸代谢方面的遗传缺陷(即叶酸的利用能力)，从而根据风险高低(相关代谢酶的活性程度)。如由发明人和中国疾病预防控制中心妇幼保健中心联合组织的孕期叶酸利用能力检测所提供的增补参考量：

表1：孕期叶酸利用能力检测所提供的增补参考量表

以上补充剂量指合成叶酸补充剂或强化剂的摄入量，不包括食物；对所有成年人包括孕妇和乳母，合成叶酸制剂的可耐受的最高摄入量(UL)设定为1000微克/天。因此800微克/天的叶酸制剂是安全的。

对叶酸的增补剂量并非越多越好。大量研究发现，过量补充叶酸会导致以下不良后果：导致体内锌缺乏。锌是多种酶的活化剂，因此，孕母过量补充会导致胎儿生长缓慢，出生体重过低。

钙是生物体必需的元素，在人体的各个生长时期都需要钙元素的参与。对人体而言，无论肌肉、神经、体液和骨骼中，都有用Ca2+结合的蛋白质。钙是人类骨、齿的主要无机成分，也是神经传递、肌肉收缩、血液凝结、激素释放和乳汁分泌等所必需的元素。钙约占人体质量的1.4％，参与新陈代谢，每天必须补充钙；人体中钙含量不足或过剩都会影响生长发育和健康。

当孕期妇女处于妊娠这一特殊时期，为满足胎儿生长发育的需要，以及维持母体自身血钙和骨密度，对钙的需求会增大。孕期妇女的钙营养状况将直接影响孕妇健康和胎儿的正常发育，会影响两代人的身心健康。因此指导孕妇在孕期科学合理的补充钙营养素，具有重要意义。

维生素D是促进钙吸收的重要因素，它的活性形式是1,25-二羟维生素D₃，而1,25-二羟维生素D₃必须通过维生素D受体蛋白介导，才能促进小肠细胞合成钙结合蛋白，促进钙的吸收，而维生素D受体是由VDR基因编码的，其表达量和活性均受到VDR基因的调控。VDR基因上的Bsm I和Taq I多态性与钙吸收相关。

研究表明，在低钙摄入的情况下，VDR基因风险型的个体钙吸收率显著低于VDR正常基因型的个体；而在高钙摄入的情况下，不同VDR基因型导致的钙吸收率差异不显著，因此对于因VDR基因多态性导致的钙吸收障碍，可采取高钙摄入的原则进行防治。

通过本项目可评估个体对维生素D的利用能力，筛查出具有钙吸收障碍的高危人群，针对高危人群强化钙营养素的补充，同时加强孕期钙营养状况的检测。

利用现代基因分型技术(荧光PCR,Sanger测序等)检测孕妇的叶酸代谢相关基因，根据基因分型结果对受检者叶酸利用能力进行分级，进而针对性的调整叶酸补充剂量。目前常用的检测技术中，测序需对多个位点逐一进行检测，操作复杂，费用较高。芯片法虽可检测多个位点，但操作过程繁琐，检测费用高。

中国实用新型专利ZL 201420084983和发明专利ZL201410067910、名称“单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及检测方法”公开一种利用多重PCR技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的方法，该方法能够准确测定MTHFR的C677T突变位点，从而有利于预测个体对叶酸的代谢能力，指导孕产妇和儿童补充适合剂量的叶酸补充剂等。但该技术只能检测单一突变位点，且仍然存在传统PCR扩增检测技术的缺陷。

中国发明专利CN201210021990.8，名称“骨质疏松症易感基因无创检测试剂盒”公开一种检测女性骨质疏松症的易感基因无创检测的试剂盒，该试剂盒包括检测IL-6基因G-174C，VDR基因上Bsm I、TaqI TNF-a基因上G-308A，OPG基因上Lys3Asn的5个单核苷酸多态性位点，来筛查出容易患骨质疏松症的女性高危人群。但该技术只能逐一检测单个突变位点，操作繁琐。

在应用检测MTHFR基因和/或MTRR基因的突变位点的新技术来中，质谱技术显示出其准确、高效的优势。其中，张孝平等(胰腺癌细胞DPYD、MTHFR基因单核苷酸多态性分析，《山东医药》2011年第45期；胃癌细胞DPYD、MTHFR基因单核苷酸多态性的检测，《江苏医药》2011年第17期)和陈宝安等(应用质谱技术检测结肠癌DPYD、MTHFR基因单核苷酸多态性，《癌变·畸变·突变》第24卷第2期)公开了利用MALDI-TOF质谱技术检测MTHFR基因的三个SNPs位点G1965A(rs2274976)、A1515C(rs1801131)及C894T(rs1801133)，结果发现该位点突变可能导致MTHFR活性改变，影响氟尿嘧啶类药物的体内代谢，且与氟尿嘧啶类药物的疗效及毒副反应相关。然而，以上技术均是联合检测DPYD基因(二氢嘧啶脱氢酶基因)和MTHFR基因的突变，通过预测临床预测氟嘧啶类药物的疗效及毒副反应，使肿瘤患者在选用最佳药物方案、剂量及最大限度地降低药物毒副反应方面受益。因此，研究人员根据上述技术的教导，易于想到通过质谱技术检测MTHFR的上述三个位点来确定肿瘤患者的最佳用药方案，而难以想到对该三个位点进行调整改变，以及难以想到用于指导叶酸服用人群进行合理摄入叶酸的用途。

作为最接近的技术，梁爽(叶酸代谢通路相关基因SNP与孕妇同型半胱氨酸代谢能力的相关性分析，复旦大学硕士论文，2012)公开了叶酸及同型半胱氨酸代谢能力与代谢通路相关SNPs组合有密切关系，选取了9种基因18个SNPs进行分型检测，包括MTHFR基因的rs1801133(即本发明的677C>T)、rs1801131(即本发明的1298A>C)和MTRR的rs1801394(即本发明的66A>G)。然而，该论文进一步研究发现：

(1)在预测叶酸代谢的初步模型中，提示“rs 3733890AG、rs 234713AG、rs3737965 CT对叶酸及同型半胱氨酸代谢有保护作用，rs l801131 CA(即(A1298C))、rsl801133 TT(即(C677T))对叶酸及同型半胱氨酸代谢有破坏作用”，其中并不涉及rs1801394位点(A66G)(参见中文摘要)；

(2)进一步研究了15个SNP与C677T的联合影响叶酸代谢的分析，结果(参见图7，第28页)表明“rs 1051266，BMHT上的rs3737890,CBS上的rs2851391及rs234713,TCN2上9606756的与叶酸及Hey浓度有统计学差异”，其中仍然不涉及rs1801394位点(A66G)。

(3)在涉及与本发明相同构思的多SNP位点联合与检测叶酸代谢能力的关联分析的实验中，对比文件1(参见表8，第30-32页)“分别将任意：3个SNPs,4个SNPs和5个SNP进行组合对叶酸与Hey的相关度进行预测，见表8。最后发现5个SNP的组合的预测效果比4个和3个SNPs的组合预测效果好，其中最好的预测模型如下：rs3733890 AG+rs234713 AG+sl801133 TT+rsl801131 CA+rs3737965 CT”，其中还是不涉及rs1801394位点(A66G)。

(4)该论文的第4章讨论和第5章总结部分(参见第34-41页)中，均论述了多种对于叶酸代谢相关的SNP位点，其中充分论述了可以通过质谱技术针对多位点关联的SNP来分析叶酸代谢能力，但还是不涉及rs1801394位点(A66G)。

此外，也有众多文献认为关于rs1801394位点(A66G)是不适于与其他位点联合来质谱分析叶酸代谢能力的研究。例如，曲红梅等(《卫生研究》第41卷第2期，2012年3月)分析了多种与叶酸具有关联性的SNP在NTD发生的关联研究结果，并明确指出(参见摘要，第3.2节)“母亲或患者有MTRR G66G基因型，仅仅当血浆维生素B12浓度较低时，会增加患NTDs的危险”，进一步研究发现，“NTDs儿和母亲MTRR66A＞G与NTDs之间没有统计学意义”、“最后结论MTRR不是NTDs发生的危险因素”、“该研究认为基因多态性在NTDs的发生中起了很小的作用”。

另外，在涉及孕妇骨质疏松症的无创检测研究中，中国发明专利CN201210021990.8，名称“骨质疏松症易感基因无创检测试剂盒”公开一种检测女性骨质疏松症的易感基因无创检测的试剂盒，该试剂盒包括检测IL-6基因G-174C，VDR基因上Bsm I、TaqI TNF-a基因上G-308A，OPG基因上Lys3Asn的5个单核苷酸多态性位点，来筛查出容易患骨质疏松症的女性高危人群。但该技术仍然属于传统的PCR扩增检测技术，且只能检测单个突变位点，操作繁琐。

综合所述，目前存在的技术问题是：缺乏一次能同时检测多个叶酸与钙吸收相关的基因多态位点的方法和产品，常见的检测技术，如测序、实时荧光定量PCR等，均需对位点逐一进行检测，当位点较多时操作复杂，费用较高。而现有的质谱检测技术，并没有完全公开同时针对以上多个位点的检测技术，同时这些技术仍然停留在肿瘤检测的相关方面。因此目前需要一种不同于以往的质谱检测技术，能在同一体系中针对同一个体的多个SNP进行检测，通过该技术的检测信息，为指导备孕妇女和孕妇合理服用叶酸和钙提供参考依据，从而填补我国在指导叶酸和钙服用人群进行合理摄入叶酸和钙的领域空白。

发明内容

本发明基础在于，发明人通过与中国疾病预防控制中心妇幼保健中心联合组织的检测结果(参见表1)，明确发现不同人群对于叶酸服用需要量存在差异。而孕期钙营养不足，则会对孕妇和胎儿产生许多不良影响。鉴于人体摄入过多叶酸存在的副作用以及不同个体对钙的吸收存在差异，结合现有研究中的缺陷以及技术误导，通过优化筛选SNP检测位点和相关检测产品，最终提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测叶酸和钙吸收相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其中：在多重PCR中同时扩增5个来自不同基因、且含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在5个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型。因此，本发明第一个目的是提供一种用于检测叶酸遗传代谢能力和钙吸收相关的SNP的引物组合物，其序列如表2所示。

表2

编号	序列(5'→3')	SNP位点	用途
				SEQ ID No：1	ACGTTGGATGCTATATGCTACACAGCAGGG	rs1801394	PCR引物
SEQ ID No：2	ACGTTGGATGGAAAATCCATGTACCACAGC	rs1801394	PCR引物
				SEQ ID No：3	ACGTTGGATGAAGTGATGCCCATGTCGGTG	rs1801133	PCR引物
SEQ ID No：4	ACGTTGGATGCACTTGAAGGAGAAGGTGTC	rs1801133	PCR引物
				SEQ ID No：5	ACGTTGGATGTCTCCCGAGAGGTAAAGAAC	rs1801131	PCR引物
SEQ ID No：6	ACGTTGGATGTCTACCTGAAGAGCAAGTCC	rs1801131	PCR引物
				SEQ ID No：7	ACGTTGGATGGAGGAACTAGATAAGCAGGG	rs1544410	PCR引物
SEQ ID No：8	ACGTTGGATGAACAGGAATGTTGAGCCCAG	rs1544410	PCR引物
				SEQ ID No：9	ACGTTGGATGAGCGGATGTACGTCTGCAGT	rs731236	PCR引物
SEQ ID No：10	ACGTTGGATGTCTATCCCCGTGCCCACAG	rs731236	PCR引物
				SEQ ID No：11	CACAGCTTGCTCACA	rs1801394	延伸引物
SEQ ID No：12	AGGTGTCTGCGGGAG	rs1801133	延伸引物
				SEQ ID No：13	GGAGCTGACCAGTGAAG	rs1801131	延伸引物
SEQ ID No：14	GgCTGAGTATTGGGAATG	rs1544410	延伸引物
				SEQ ID No：15	GTGCAGGACGCCGCGCTGAT	rs731236	延伸引物

其中，所述5个SNP位点分别是：MTHFR基因rs1801133位点(C677T),MTHFR基因rs1801131位点(A1298C)，MTRR基因rs1801394位点(A66G)，VDR基因rs1544410位点(BsmI)，VDR基因rs731236位点(Taq I)。

其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表3所示。

表3

在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'端加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，保护碱基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物一并进入质谱检测过程中，以避免干扰检测效果。另外，在一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以适量增加碱基序列(如上述保护碱基序列)。增加碱基序列的目的是当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物或两个延伸引物都增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，提高检测效果。而且，增加后的引物及产物分子量，一定不超出检测窗口。

例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-ACGTTGGATGCTATATGCTACACAGCAGGG-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

本发明第二个目的是提供了由上述引物组合物所制备的检测产品。其中，该产品选自检测试剂盒、检测试剂、检测芯片等。

在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：

(1)用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；

(2)用于PCR产物纯化的试剂；

(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。

在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。

在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

本发明第三个目的是使用上述引物组合物、产品或试剂盒来检测叶酸遗传代谢能力和钙吸收相关的基因多态位点的方法，包括如下步骤：

(1)多重PCR：使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，对3处与叶酸遗传代谢能力相关和2处与钙吸收相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含5处基因多态位点所在DNA区域的PCR产物；

(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

(3)单碱基延伸：使用5条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；

(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测；

其中，所述3个与叶酸遗传代谢能力相关的SNP分别是：MTHFR基因rs1801131位点(A1298C)，MTHFR基因rs1801133位点(C677T)，和MTRR基因rs1801394位点(A66G)。2个与钙吸收遗传相关的SNP分别是VDR基因rs1544410位点(Bsm I)，VDR基因rs731236位点(TaqI)。

在一个实施方案中，步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

本发明第四个目的是提供前述试剂盒在检测3个叶酸遗传代谢能力相关的和2个钙吸收相关的SNP的用途。

有益效果

本发明优点和效果如下：

1、敏感：本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测多态性SNP，因此它的检测灵敏度很高。

2、特异：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低。

3、简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染。

4.快速：速度快、高通量，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。

5、由于本发明涉及对多个基因的多种SNP位点的检测，可以分别得到具有不同SNP位点的检测结果，因此患者可以是单个SNP位点发生突变，也可以是多个SNP位点发生突变。实践中发现，PCR测序法或荧光定量PCR法，每增加一个检测SNP位点的反应，就要增加相应的费用和时间。相比之下，质谱法检测优势在于无论多少个待检位点，只要能在一个反应管内反应，则花费的试剂和时间是不变的，这也是本发明同时检测多个SNP位点突变的优势。

6、本发明克服了以往技术一次检测SNP位点过少的缺陷,成本低廉。

原理与定义

本发明提供了一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测与叶酸遗传代谢能力和钙吸收相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其原理在于：

在多重PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物从而能同时扩增多达5个SNP位点所在DNA片段。

在单碱基延伸步骤中，对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共5条，分别与5个SNP位点对应，并在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对(如某SNP位点处是A基因型，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸)。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。

在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在脱盐纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。

术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片、检测载体，以及检测试剂盒等。进一步而言，该产品还能作为辅助指导或参考指导患者合理服用叶酸的产品，其中所述患者是孕妇、产妇、待孕妇、哺乳女性、儿童等，但不包括与叶酸代谢相关的各种肿瘤或癌症(如结肠癌、胰腺癌、胃癌等)患者。应当指出的是，本发明涉及如何检测叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传相关的检测方法，并不涉及如何指导患者如何服用叶酸和钙的方法，使用本方案仅作为指导患者服用叶酸和钙的参考方法，而一些非遗传因素(如患者的饮食习惯)，甚至随机事件(如偶尔服用其他药物)，都有可能影响药效和用药剂量。另外，由于本发明是在已知的需要服用或已经补充叶酸和钙的患者中检测其相关SNP，并根据检测结果结合其他临床指标，判断服用量或对其进行回顾性研究，因此这种检测方法不属于疾病的诊断方法。而得知患者的SNP分型之后，仅仅只能大致预测患者需要调整叶酸和钙的服用剂量，而具体用药剂量需要根据该中间信息设计模型或进一步研究，才能得到准确的用药剂量。综合所述，本发明所涉及检测SNP的方法，其既不是疾病的诊断方法，所得到的中间信息也不能直接用于确定用药剂量，即不能直接为治疗过程所用，因此其也不属于治疗方法，应当视为与普通SNP检测方法相同。

术语“rs1801133”等，均是叶酸SNP位点在NCBI数据库的统一编号。术语“C677T”等则是位点的通俗叫法，表明MTHFR第677位碱基由C突变成T，“A1298C”表明MTHFR第1298位碱基由A突变成C，“A66G”MTRR基因第66位基因由A突变成G。

术语“保护碱基”，指在PCR引物的5'端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5'端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。

术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5'-P末端转换成5'-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。

术语“外切酶ExoI消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后残余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3'端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基)，根据碱基互补配对原则，由SNP位点处基因型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在SNP位点处连接一个ddNTP，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。

术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTTP是修饰后的分子量)。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸，将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。例如，某SNP位点若是A/G多态，对应的延伸引物长度为15个碱基(分子量4496.9Da)，当该SNP位点处是A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成16个碱基长、分子量4824Da的延伸产物，当该SNP位点处是G基因型，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成16个碱基长、分子量4744.1Da的延伸产物，两种产物之间存在79.9Da的分子量差异。即对该SNP位点的该实验方案，A基因型对应4824Da的质谱峰，G基因型对应4744.1Da的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对4496.9Da、4744.1Da、4824Da三处进行观察：若4496.9Da处出现质谱峰，则是有部分或全部延伸引物没有与ddNTP结合；不论4496.9Da处是否出现质谱峰，若4744.1Da与4824Da处出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，并与质谱峰的位置对应，如前所述，4824Da的质谱峰对应A基因型，4744.1Da的质谱峰对应G基因型；若4744.1Da与4824Da两处质谱峰均出现，则该SNP位点的基因型为杂合型；若4744.1Da与4824Da两处质谱峰均未出现，则实验失败。

术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解(亦称“消化”)dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA(在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。

术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的SNP位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，以及SNP位点的基因型，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个SNP位点的检测。

术语“SNP”基因型，指表示人基因组中单核苷酸多态性的类型。其中，在实际检查中，作为对照的用于检测的基因型既可来自于对照人基因组中，也可来自已克隆入质粒的载体工具，而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定而受到实际使用者的欢迎。

术语“SNP突变频率”，指SNP位点发生突变的概率。理论上，本发明能同时检测单个个体中同时存在5个SNP突变。但实践中研究者发现，不同SNP突变在个体中存在一定的突变频率。HapMap项目为国际组织对人基因组中SNP位点在不同人群中进行检测的项目，NCBI数据库中有各位点在不同人群中的详细频率信息，以该项目中HCB样本(中国汉裔样本)的数据来说明以下位点在中国人群中的分布频率。例如：

(1)rs1801133，MTHFR(C677T)基因，其中野生型(C/C)，杂合突变型(C/T)和纯合突变型(T/T)三种基因型在中国人群中分布所占比例为33％，44％和23％。

(2)rs1801131，MTHFR(A1298C)，其中野生型(A/A)，杂合突变型(A/C)和纯合突变型(C/C)三种基因型在中国人群中分布所占比例为53.7％，43.9％和2.4％。

(3)rs1801394，MTRR(A66G)，其中野生型(A/A)，杂合突变型(A/G)和纯合突变型(G/G)三种基因型在中国人群中分布所占比例为58％，36％和6％。

(4)rs1544410，VDR基因Bsm I，其中野生型(C/C)，杂合突变型(C/T)和纯合突变型(T/T)三种基因型在中国人群中分布所占比例为87.8％，12.2％和0％。

(5)rs731236，VDR基因Taq I，其中野生型(A/A)，杂合突变型(A/G)和纯合突变型(G/G)三种基因型在中国人群中分布所占比例为87.8％，12.2％和0％。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？searchType＝ adhoc_search&type＝rs&rs＝rs1801133

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？rs＝1801131

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？searchType＝ adhoc_search&type＝rs&rs＝rs1801394

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？rs＝1544410

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？rs＝731236

应当指出的是，鉴于以上核酸质谱的特殊性，例如，其需先通过PCR反应扩增出含SNP位点的片段，然后通过延伸引物延伸出SNP位点的碱基；各SNP的PCR反应、延伸反应间无明显干扰；各SNP的延伸引物、产物间分子量要有足够大的差异以便实现区分等，因此，并非所有的已知SNP均可以用来进行核酸质谱的检测，也并不是所有针对SNP位点设计的引物均可用以进行多重PCR反应和多重单碱基延伸反应。例如，Cláudia M.B等人(Optimizationof a multiplex minisequencing protocol for population studies and medicalgenetics,Genet.Mol.Res 4(2005)115-125)指出，在进行多重PCR反应前需首先对单重PCR的反应效果进行验证，如果单重PCR扩增效率低则需要放弃，另外，若PCR产物长度偏长，多重PCR效果会比较差，也需要放弃。Nissum M等人(High-throughput genetic screeningusing matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,PsychiatrGenets 12(2002)109-117)也报道了通过MALDI–TOF MS高通量检测SNP的过程中，发现只能获得90％的准确率，其中在标准实验条件下，竟然有5％的情况不能实施PCR扩增过程，而在单碱基延伸过程中，由于自身引物自身配对、引物二聚体的形成以及扩增产物过低等因素，也导致有5％的情况难以实现单碱基延伸过程，因此必须进一步优化核酸质谱实验条件(如扩增引物、实验参数等)，否则将影响MALDI–TOF MS在核酸质谱检测SNP的应用。例如，本发明在针对AC61位点进行核酸质谱检测中，发现实际生产中的准确率仅为75％，这与利用传统PCR测序技术通过检测该位点从而获得A2奶牛分型准确率97％形成强烈对比。因此，对于已知的AC61位点，在本发明的核酸质谱检测过程中，仅仅作为辅助分型的用途。

此外，在核酸质谱检测过程中，多重扩增过程的干扰作用，对于最终获得的延伸产物也存在影响。Sascha Sauer等人(Typing of single nucleotide polymorphisms byMALDI mass spectrometry:Principles and diagnostic applications，ClinicaChimica Acta 363(2006)95–105)和Heyi Yang等人(Multiplex single-nucleotidepolymorphism genotyping by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，Analytical Biochemistry 314(2003)54–62)在利用MALDI质谱技术研究核酸质谱检测过程中提出，所设计的多重引物应具有相近的熔解温度(Tm值)并彼此间的相互作用力较弱。如果引物之间的相互作用力过于强烈(ΔG的最小值为-10kcal/mol)，那么必须放弃该理论设计的引物而重新进行设计；当同一反应体系中存在多重反应引物，那么多重扩增的规模主要受限于引物之间的相互作用程度，从而影响核酸质谱检测过程；此外，为了准确区分不同碱基之间的差异，特别是腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(4种碱基中这二者分子量之间差值最小，为9Da)，要求的寡核苷酸长度一般不超过40个碱基，实际应用中，质谱检测窗口的分子量范围一般为4000～9000Da，即要求所涉及的延伸引物和产物的分子量尽量分布在4000～9000范围之内。同时，要避免各延伸引物及其延伸产物之间的叠合。由此可见，并非所有已知的SNP均可应用于核酸质谱尤其是多重核酸质谱的检测，其实际效果会受到多种实验因素的影响，因此需要通过实验来验证SNP的可行性以及筛选不同引物的组合。

附图说明

图1为实施例四中，对F1样本5个位点的检测结果。图2为实施例四中，对F2样本5个位点的检测结果。

图3为实施例四中，对F3样本5个位点的检测结果。图4为实施例四中，对F4样本5个位点的检测结果。

图5为实施例四中，对F5样本5个位点的检测结果。图6为实施例四中，对F6样本5个位点的检测结果。

图7为实施例四中，对F7样本5个位点的检测结果。图8为实施例四中，对F8样本5个位点的检测结果。

图9为实施例四中，对F9样本5个位点的检测结果。图10为实施例四中，对F10样本5个位点的检测结果。图11为实施例四中，对F1样本A1298C位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、突变型(G)延伸产物、野生型(T)延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为TT纯合。图12为实施例四中，对F1样本A66G位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、突变型(G)延伸产物、野生型(A)延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为AA纯合。图13为实施例四中，对F1样本BsmⅠ位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型(C)延伸产物、突变型(T)延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为CC纯合。图14为实施例四中，对F1样本C677T位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型(G)延伸产物、突变型(A)延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为AA纯合。

图15为实施例四中，对F1样本TaqⅠ位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、突变型(G)延伸产物、野生型(A)延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本AA纯合。

图16为对5个位点均为野生型的质粒N1-N5的检测结果，其中：峰1(4824)表示A66G位点野生型(A)，峰2(4936.2)表示C677T位点野生型(G)，峰3(5555.7)表示A1298C位点野生型(T)，峰4(5881.8)表示BsmⅠ位点野生型(C)，峰5(6486.1)表示TaqⅠ位点野生型(A)。

图17为对5个位点均为突变型的质粒P1-P5的检测结果，其中：峰1(4744.1)表示A66G位点突变型(G)，峰2(5016.1)表示C677T位点突变型(A)，峰3(5531.6)表示A1298C位点突变型(G)，峰4(5961.7)表示BsmⅠ位点突变型(T)，峰5(6406.2)表示TaqⅠ位点突变型(G)。

图18为对照实施例一中，对F3样本A1298C位点的测序结果，显示为T纯合。

图19为对照实施例一中，对F3样本A66G位点的测序结果，显示为GA杂合。

图20为对照实施例一中，对F3样本BsmⅠ位点的测序结果，显示为C纯合。

图21为对照实施例一中，对F3样本C677T位点的测序结果，显示为A纯合。

图22为对照实施例一中，对F3样本TaqⅠ位点的测序结果，显示为A纯合。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一：引物设计及合成。

针对叶酸相关的SNP分别是MTHFR基因rs1801131位点(A1298C)，MTHFR基因rs1801133位点(C677T)和MTRR基因rs1801394位点(A66G)，针对钙吸收相关的SNP分别是VDR基因rs1544410位点(Bsm I)，VDR基因rs731236位点(Taq I)，设计对应特异性PCR引物核心序列(SEQ ID No：1至SEQ ID No：10)和特异性延伸引物核心序列(SEQ ID No：11至SEQID No：15)。

其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR引物的5'端可以在核心序列(SEQ ID No：1至SEQ ID No：10)的基础上增加一定数目的碱基，常见如10bp的tag(ACGTTGGATG)，以使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。

相关引物在上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。

以下检测过程参照北京毅新博创生物科技有限公司的《MTHFR、MTRR、VDR基因检测试剂盒(微阵列芯片-飞行时间质谱法)说明书》(以下简称“说明书”)进行操作。

实施例二：样本DNA提取。

收集临床患者，共10例。其中，样本采集、DNA提取等按照说明书要求，采集人静脉血，并以EDTA抗凝管收集。按照说明书要求，采集的血液在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过一个月，并可采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输，建议尽量采用新鲜血液进行基因组DNA提取。由于本试剂盒不提供人基因组DNA提取试剂，因此采用商业化的核酸提取试剂盒(如：天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型))，从每位患者的200ul全血中提取人基因组DNA，以NanoDrop 2000(Thermo公司)定量，并标化至30ng/ul(分别为F1-F10)。其中，该试剂盒推荐对浓度为30ng/ul的人基因组DNA进行检测，但对比实验表明，本试剂盒对浓度低至5ng/ul的人基因组DNA也能检测出阳性结果。按照说明书要求，提取后的人基因组DNA，在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过一个月，-80℃可长期保存，应避免反复冻融，并置于冰盒中进行运输。

实施例三：生物实验。

使用ABI 9700型PCR仪，按说明书对3个与叶酸遗传代谢基因相关的基因多态位点和2个与钙吸收相关的基因多态位点进行检验。

试剂盒中用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分如表4：

表4.试剂盒组成

序号	组分名称	主要成分	包装规格
				1	反应液I		270μL/管×1管
2	酶I	PCR酶、UNG酶	22μL/管×1管
				3	扩增引物	PCR引物	100μL/管×1管
4	反应液II		170μL/管×1管
				5	酶II	SAP酶	30μL/管×1管
6	反应液III		100μL/管×1管
				7	酶III	延伸酶	4μL/管×1管
8	延伸引物	延伸引物	100μL/管×1管
				9	阳性质控品	—	50μL/管×1管
10	阴性质控品	—	50μL/管×1管

按说明书，具体操作方法如下：

1.PCR扩增

1.1在PCR配液区，按照待检样本数，准备对应数量的PCR反应管/孔，并标记样本编号。建议在每次PCR反应中，阳性质控品、阴性质控品共同进行分析。

1.2从试剂盒中取出PCR反应所需的各组分，室温融化后振荡混匀，瞬时离心后使用。

1.3根据样本数目，按下表5的比例取出各组分，置于一个离心管中混匀后，向每个PCR反应管/孔中加入4μL。建议适当放大配制体积，避免因移液器吸头残留等因素造成最后不够分装的现象。

表5 PCR反应体系

1.4在PCR扩增区内向每个已加入PCR混合物的PCR管/孔中加入1μL待测样本，混匀后瞬时离心。此时每份PCR反应体系总体积为5μL。

1.5将加入PCR混合物、待测样本的PCR管/孔置于PCR扩增仪内，按下表6的程序进行PCR扩增反应。

表6 PCR反应热循环程序

2.SAP酶消化

2.1从试剂盒中取出SAP反应所需的各组分，室温融化后振荡混匀，瞬时离心后使用。

2.2在PCR配液区，根据样本数目，按下表7的比例取出各组分，置于一个离心管中混匀后，向每个PCR反应产物中加入2μLSAP混合物。建议适当放大配制体积，避免因移液器吸头残留等因素造成最后不够分装的现象。

表7 SAP酶消化反应体系

组分名称	单反应体积
		反应液II	1.7μL
酶II	0.3μL
		合计	2.0μL

2.3将加入SAP混合物的PCR管/孔置于PCR扩增仪内，按下表8的程序进行反应。

表8 SAP酶消化反应程序

温度(℃)	时间(分)	循环数
			37	40	1
85	5	1
			4	Hold

3.单碱基延伸

3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表9的比例取出延伸反应各组分，置于一个离心管中混匀后，向每管SAP酶消化产物中加入2μL，混匀后瞬时离心，此时每管内液体体积为9μL。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大配制体积。

表9延伸反应体系

3.2将装有延伸混合物、SAP酶消化产物的PCR管/孔置于PCR扩增仪内，执行下表10程序。

表10延伸反应程序

4.纯化

延伸反应完毕后，在PCR扩增区向每PCR管/孔延伸产物中加入41μL纯水和15mg树脂，颠倒混匀30分钟，13000rpm离心10min。

5.点样

将纯化后的产物点样至靶片。

实施例四：上机检测及结果判读。

使用北京毅新博创生物科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。

另外，分别设置以上位点的野生型对照N1-N5、突变型对照P1-P5。其中，野生型对照N1-N5、突变型对照P1-P5分别来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的野生型对照质粒N1-N5和突变型对照质粒P1-P5，为在商品化质粒pMD18-T Vector(Takara公司)的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法，用引物和正常人DNA进行PCR后，将PCR产物插入pMD18-T Vector，即构建野生型质粒N1-N5，再分别定点突变，即构建3个突变型质粒P1-P5。所述质粒N1-N5和P1-P5可长期保存于-20℃甘油中，用时活化并提取质粒DNA。

如前述表3所示，5条延伸引物及它们在5个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)：

判断标准：

(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；

(2)若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型；

(3)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。

质谱结果如图1-17所示，以前述表3所示各位点延伸引物及延伸产物的分子量检查样本F1-F10的质谱结果(图1-10)，确定各SNP位点的基因型，结果如表11所示：

表11样本F1-F10各SNP位点基因型

即在10例患者中，共检测出A1298C位点GT杂合型3例，A66G位点GA杂合型5例，BmsI位点CT杂合型1例，C677T位点GA杂合型3例，AA纯合型4例，Taq I位点GA杂合型2例。

对照实施例一、PCR测序验证

一、根据实施例1，使用以下如表12所示引物，对各位点进行测序：

表12各位点测序引物

位点编号1-5	正向引物(5'→3')	反向引物(5'→3')
			A1298C	GGTCTCCCAACTTACCCTTCT	TCCCTCTAGCCAATCCCT
A66G	GCTTGTCTACAGGGTTGC	GGCGGTCCTTCATCAG
			Bms I	GCGGAAGAGGTCAAGGG	CCAGGTGGGACTGAAGAA
C677T	TCACCTGGATGGGAAAG	TGTGGGAGTTTGGAGCA
			Taq I	AAAGCCCGCAGGAAAGG	GGACGCTGAGGGATGGA

二、样本DNA来源

为使不同实验之间产生的数据具有可比性，测序验证采用实施例二中从10例患者体内采集的静脉血中提取的人基因组DNA(F1-F10)。

三、测序鉴定

1、PCR反应体系为20μl

反应组分	加样体积/份(20μL)
			4
2×Multiplex PCR MasterMix	10
		PCR引物(25μM)	4
DNA模板	2
		总量	20

2、反应条件：

3、PCR产物纯化和测序

(1)向装有PCR产物的96孔板中加入50微升洗涤缓冲液，混匀。

(2)将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。

(3)向纯化板中再次加入50微升的洗涤缓冲液，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。

(4)将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20微升的去离子水，静置15分钟。

(5)再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

(6)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

(7)测序反应体系为5μl，各种试剂加入量如下：PCR产物3-10ng，BigDyev3.1 0.25μl，5*BigDye buffer 0.875μl，引物1.6pmol；

(8)样品放于PCR仪上做如下反应：

步骤：95℃，5分；

95℃，10秒；60℃，4分；重复30个循环；

4℃保持直到准备纯化。

(9)在每个孔中加入20μl 80％乙醇，4,000rpm离心30min；

(10)将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率1000rpm；

(11)在每孔中加入30μl 70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；

(12)重复第11步的操作2次；

(13)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

(14)加人5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

(15)测序仪前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样；

(16)使用ABI3730xl型遗传分析仪进行序列测定。

四、结果

对F1-F10样本，使用上表所述的引物，分别对A1298C、A66G、Bms I、C677T、Taq I(分别编号序列1-5)进行测序，共计50次测序。根据测序的附图18-22，最终测序结果如表13所示：

表13各位点测序结果汇总

经过比较，表11的结果与表13完全一致，说明本发明检测方法的准确性。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京毅新博创生物科技有限公司

<120> 利用质谱进行叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传检测

<130> 2017

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

acgttggatg ctatatgcta cacagcaggg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

acgttggatg gaaaatccat gtaccacagc 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

acgttggatg aagtgatgcc catgtcggtg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

acgttggatg cacttgaagg agaaggtgtc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

acgttggatg tctcccgaga ggtaaagaac 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

acgttggatg tctacctgaa gagcaagtcc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

acgttggatg gaggaactag ataagcaggg 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

acgttggatg aacaggaatg ttgagcccag 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 9

acgttggatg agcggatgta cgtctgcagt 30

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

acgttggatg tctatccccg tgcccacag 29

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 11

cacagcttgc tcaca 15

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 12

aggtgtctgc gggag 15

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 13

ggagctgacc agtgaag 17

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 14

ggctgagtat tgggaatg 18

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 15

gtgcaggacg ccgcgctgat 20

Claims

1.一种用于检测叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传相关的SNP的引物组合物，其序列为：

。

2.权利要求1的引物组合物，其中PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护5-15个碱基序列，优选为10bp的tag：ACGTTGGATG。

3.权利要求1的引物组合物，其中延伸引物5'端可增加作为接头的碱基序列，其中优选为1-15个碱基，更优选1-3个碱基。

4.由权利要求1至3的引物组合物所制备的用于检测叶酸遗传代谢能力和钙吸收相关基因多态位点的检测产品。

5.权利要求4的检测产品，其中产品为检测试剂盒，包括：

(2)用于PCR产物纯化的试剂；

6.权利要求5的检测产品，其中试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，干血片DNA提取试剂等试剂。

7.权利要求5的检测产品，其中用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。

8.权利要求7的产品，其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

9.使用权利要求1-3的引物组合物，或权利要求4-8的产品来检测叶酸遗传代谢能力和钙吸收相关基因多态位点的方法，包括：

(1)多重PCR：使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，对5处与叶酸遗传代谢能力和钙吸收相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含5处基因多态位点所在DNA区域的PCR产物；

(3)单碱基延伸：使用3条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；

其中，所述3个与叶酸遗传代谢能力相关的SNP分别是：MTHFR基因rs1801133位点(C677T)，MTHFR基因rs1801131位点(A1298C)，和MTRR基因rs1801394位点(A66G)，2个与钙吸收遗传相关的SNP分别是VDR基因rs1544410位点(Bsm I)，VDR基因rs731236位点(TaqI)。

10.权利要求4-9所述的试剂盒在检测3个叶酸遗传代谢能力相关的SNP和2个钙吸收遗传检测相关的SNP的用途。