CN105925674B - 一种用于检测奶牛四种遗传病的核酸质谱的检测产品及应用 - Google Patents
一种用于检测奶牛四种遗传病的核酸质谱的检测产品及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可以同时检测奶牛是否具有脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的引物系统。基于该引物系统所制备的产品,能实现同时对奶牛CVM、BLAD、DUMPS、CN四种遗传病基因相关的4处多态性位点进行检测。此外,本发明还公开了能够同时联合检测以上遗传病和奶牛A2基因型的检测方法及其检测产品,该联合检测的结果可用于指导健康奶牛的筛选、育种等。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域,涉及一种用于检测奶牛脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病相关的基因突变的核酸质谱的制备方法及应用。具体而言,即利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术,对奶牛的SLC35A3基因4号外显子第559位、CD18基因第二外显子第55位、UMPS基因第5个外显子上的密码子405位、ASS基因第5外显子的第86个氨基酸进行检测,确定某奶牛在该四个位点处是否存在突变,涉及筛选无此四种遗传病的奶牛的筛选方法。
背景技术
荷斯坦奶牛是当前世界各国广泛使用的奶牛品种,用于生产大量鲜乳供应我们日常食物的需求,经高度选育与良好的饲养管理,生产性能不断提高,在人类生活中发挥着越来越重要的作用。
随着人工授精技术和胚胎移植技术的发展,有潜力的优良公牛被用于制作大量冷冻精液,供给众多母牛配种使用,其优良遗传性能迅速地传播至世界各地。然而,奶牛间的近交现象也不断增加,若追溯全世界荷斯坦奶牛的系谱,其亲缘大都密集地来自几个特定的公牛家族。此外,具有遗传缺陷的公牛携带者不会表现任何病症,一旦其冻精被大规模使用,其隐性有害基因则会在牛群中快速传播,给奶牛业造成巨大经济损失。在我国,进口检验检疫的重点在于防止动物传染病和寄生虫病的传入,对遗传病的危害尚缺乏足够的重视,因此,大量进口的种牛、胚胎、冷冻精液等大大增加了遗传缺陷在我国快速传播的风险。所以,急需建立全面、完善的检测、防控体系。
牛遗传病主要由遗传物种变异(如基因突变、染色体畸变)引起的身体或生理缺陷,可由亲代传递给后代。人工授精技术在奶牛育种中的广泛应用,使得遗传病传播的危险性大大增加。然而,目前我国大部分地区畜牧部门和养殖户对于奶牛遗传病的管控管理并不清晰,人们对于遗传病的认识不够,因遗传病导致的奶牛健康问题不断出现,对奶牛业的经济效益造成恶行影响。此外,带病奶牛制品还会对人类的身体健康产生危害。因此,在奶牛遗传育种过程中有效地预防奶牛遗传病的扩散对奶牛业的健康发展至关重要。
奶牛遗传病中由常染色体单基因控制的情况较多。其中,完全显性突变引起的遗传缺陷易发现、易淘汰,而隐性有害基因只有在纯合时发病,杂合时却不易发现。隐性遗传病的传播扩散与近交密切相关,使得隐性有害基因的纯合率大大增加。隐性遗传病的遗传机理在于,由于等位基因(Aa)的显隐性关系,杂合子并不会表现发病,但如果两个表型正常的携带者(Aa)进行交配,产生表型正常与缺陷纯合后代的比例为3:1,后代基因型AA、Aa、aa个体的比例为1:2:1,也就是50%的个体为携带者,如果在胚胎时期隐性纯合个体(aa)发生流产或出生时即死亡,那么其后代携带者的比例为2/3,也就是67%的个体为携带者。因此,在奶牛遗传育种过程中检测并淘汰表型正常的携带者对控制隐性遗传病的扩散尤为重要。
脊椎畸形综合症(Complex Vertebral Malformation,CVM)是荷斯坦牛的一种由常染色体单基因控制的隐性遗传病,最早由丹麦科学家于1999年发现。最初,丹麦科学家发现荷斯坦牛群中存在体型较小、脊椎畸形、两前腿筋腱变短、无法直立行走、颈短、心脏畸形等各式各样病变的新生犊牛。另外,CVM对奶牛的繁殖性状也有很大影响,导致母牛的不返情率提高,产犊间隔大大延长,流产比例上升,并直接影响产奶量,导致母牛非计划性淘汰,最终造成严重的经济损失。Thomsen B等人报道了(Genome Res,2006,16(1):97–105)该遗传病的产生是由于奶牛第3号染色体(BTA3)上的SLC35A3基因外显子4的第559位的单碱基发生突变(G/T)所致;该基因编码尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白,该突变导致其第180位的氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸,从而影响其正常的生理功能。其中,研究者通过与CVM基因座的连锁分析,确定并公开了可用于鉴定CVM的疾病基因的连锁标记-12个小随体,即微卫星(SSR)标记。
白细胞粘附缺陷症(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency,BLAD)也是发生在荷斯坦牛中的一种常见遗传性免疫缺陷病,为常染色体单基因隐性遗传病。该病是一种牛的造血系统的遗传性疾病,以严重的重复性感染、缺少脓液形成、损伤愈合延迟和白细胞增多症为特症,实质是白细胞粘附及相关的功能包括吞噬和趋化作用的缺陷。患病牛的常见症状表现为口腔粘膜、牙龈和舌粘膜溃疡,牙龈萎缩,病程长者前臼齿脱落;粘膜和肠道等软组织发生重复性感染,泛发性淋巴样增生;易感染肺炎、持续性嗜中性粒细胞数目增多、生长发育受阻、胃肠粘膜溃疡、慢性腹泻,最终导致早期死亡。其致病机理是一种与白细胞粘附有关的细胞表面糖蛋白——β2整合素(CD18)表达缺陷,CD18基因编码区的第383位的碱基由A突变为G(A383G),导致第128位的天门冬氨酸被甘氨酸所取代,致使白细胞表面的整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病。牛的CD18基因已经被定位在1号染色体上。
牛尿苷酸合酶缺乏症(Deficiency of Uridine Monophos Phate Synthase,DUMPS),也称单谱病,是荷斯坦牛群中一种常染色体单基因隐性遗传病。患该病的牛的主要症状为血液中瓜氨酸含量很高,尿素循环受阻引起高氨血症,从而导致胚胎死亡,即使犊牛能顺利出生,但在出生一周内死亡,或母牛怀孕约40d左右即流产。DUMPS的遗传学基础是奶牛1号染色体(BTA1)上的UMPS基因C-末端405处的密码子存在着一个点突变(C405T),原编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子的TGA,从而导致突变基因的转录产物最终翻译成一段C-末端缺失76个氨基酸催化亚基的短蛋白,造成乳清酸转化为鸟苷酸的催化功能丧失,不能合成DNA、RNA所需的嘧啶核苷酸,从而导致胚胎在妊娠40~60d时死亡,死亡率100%。
瓜氨酸血症(Citrullinemia,CN)又称精氨酸合成酶缺失症(BovineArgininosuccinate Synthetase Deficiency),是一种引起荷斯坦牛尿循环代谢紊乱的常染色体单基因隐性遗传缺陷病。发病个体由于缺乏尿素代谢过程中催化瓜氨酸生成精氨酸琥珀酸的关键酶-精氨酸琥珀酸合成酶,而导致瓜氨酸不能转变为精氨酸琥珀酸,引起机体内尿代谢紊乱。这一代谢紊乱的发生使体内代谢生成的瓜氨酸前体-氨无法转变为尿素,而无法排出体外,从而在组织或血液中积累大量对机体有害的氨,最终导致犊牛在出生一周内死亡。该病最早于1986年在澳大利亚的荷斯坦牛群中发现。引发机体病变的遗传学基础是奶牛第11号染色体(BTA11)上的编码精氨酸合成酶的ASS基因的第5外显子第86个氨基酸发生单碱基突变(C→T),第86位氨基酸突变为终止密码子,从而使ASS功能丧失。
目前,常用的检测奶牛常染色体单基因单碱基多态性遗传病的分子诊断方法有:
(1)PCR-SSCP聚合酶链式反应—单链构象多态性(polymerase chain reactions-single stranded conformation polymorphism),是一种基于PCR的单链构象多态性分析技术。即相同长度的单链DNA,如果碱基序列不同,形成的构象就不同。虽然从理论上讲,该技术可以检测任何位点上的碱基变异,但在实际应用中会遇到相当比例的假阴性结果。原因在于,该技术受DNA结构(碱基组成和排列顺序)、电泳凝胶的成分和电泳条件(如温度、缓冲液的尝试等)等诸多因素的影响,在具体操作时要想得到清晰可靠、可重复的结果,需要对各种条件进行严格控制。该方法的另一弊端在于并不能确定突变类型和具体位置。
(2)PCR-RLFP聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chainreactions–restriction fragment length polymorphism),是在PCR技术基础上发展起来的。该技术需要用特异设计的PCR引物扩增目标DNA,扩增产物再用特异性内切酶消化成不同大小的片段,通过凝胶电泳进行分辨。由于该方法是通过在突变点处设计酶切位点,PCR扩增后通过酶切PCR产物判断是否含有突变点,该方法引入错配碱基后,PCR的扩增效率会受到影响,且存在假阳性的可能。另外,PCR-RLFP需要使用内切酶,又增加了研究成本,从而限制了该技术的广泛应用。
(3)PCR-PIRA聚合酶链式反应-引物诱导限制性分析法(polymerase chainreaction-primer introduced restriction analysis),也称创造酶切位点法(CreatedRestrictionSite PCR,CRS-PCR)。该方法主要应用引物错配技术结合单碱基突变位点而配合形成一个酶切位点,使之成为可用PCR-RFLP方法分析的突变位点,是对单碱基突变位点进行基因型鉴定的有效而简捷的手段。这一基因型检测方法的关键在于CRS引物的设计,需要考虑多态性位点邻近序列的情况、扩增片段大小和错配碱基的选择等诸多因素,导致引物选择余地较小,扩增片段长度宜短不宜长,错配的类型和数量需慎重选择,否则会严重影响PCR扩增效率等。此外,由于该方法在PCR反应后不能直接判定被检测个体的基因型,需要通过酶切反应才能进一步区分致病基因和正常基因,延长了操作时间,提高了检测成本。另外,不同等位基因间片段的长度差异只有大约一个引物的长度(一般为20bp~25bp),且酶切后的片段电泳条带较淡,给基因型的判读带来很大不便。
(4)AS-PCR等位基因特异性PCR检测法(Allele-Specific PCR),其基本原理是根据SNP位点设计特异引物,其中一条引物(特异)的3’末端与SNP位点碱基互补(或相同),另一条引物(普通)按常规方法设计,从而使得特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而检测SNP。虽然该方法操作简便,成本低,可直接对突变位点进行检测,但有时即使引物的3'末端的碱基与模板的碱基不互补,延伸仍然可以进行,容易造成结果的误判。此外,该方法设计的上下游引物碱基数相差较大,致使退火温度相差较大,在实验条件要求严格。
(5)测序法:无论是Sanger测序还是焦磷酸测序均可以直接测出DNA序列中的所有突变位点的碱基替代情况。随着测序自动化程度的提高和测序成本的不断降低,直接测序技术越来越多地用于SNP的检测和基因分型,但该方法需要昂贵的仪器和较长的操作步骤,目前仍是一种费用较高的方法。
此外,还有变性高效液相色谱(DHPLC)、高分辨率熔解曲线(High-resolutionmelting,HRM)等技术用于奶牛单碱基突变性疾病检测中,但因仪器要求较高、材料成本较大,这些方法未能得到广泛应用。
中国专利申请201510569964、发明名称“一种筛查荷斯坦奶牛白细胞粘附缺陷病携带者的分子检测方法”和中国专利申请201510571292、发明名称“一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法”分别公开了一种鉴定荷斯坦牛是否携带BLAD、或CVM的竞争性等位基因特异性荧光定量PCR成套引物。该发明利用KASP技术,通过设计一组针对BLAD突变位点的引物,进行反应,经过约1.5小时后通过配套的软件进行简单识别分析,即可准确获得所有待测样品的基因型,从而实现筛查BLAD携带者的目的。然而,该方法需要合成荧光探针和淬灭探针,每次仅能检测一个位点,成本高。此外,该方法基于荧光信号进行结果判读,准确率并不高。
中国专利申请201310708022、发明名称“一种牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物及其试剂盒和应用”公开了一种应用于牛瓜氨酸血症有害基因检测的方法,具体如下:提取牛血液中的全组DNA作为模板,进行巢式PCR(Nested PCR)扩增,所得PCR产物进行测序,根据测序结果可直接了解突变位点的碱基变化,确保了结果的准确性,满足快速、精准等特点的检测技术的需求。然而,巢式PCR一次仅能检测一个位点,且第二次PCR扩增引起交叉污染的几率较大,同时,采用直接测序法进行基因分型,通量低、成本高,难以适应中国大规模的种畜筛查。
中国专利申请201310697676、发明名称“引起DUMPS相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法”和中国专利申请201310699024、发明名称“引起CVM相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法”分别公开了一种通过荧光定量PCR检测牛DUMPS或CVM有害基因相关的SNP的检测引物组,包括检测引物、针对SNP突变的探针以及针对野生型的探针。本发明的方法简单、快速、准确,并且通过本发明的方法可以进一步开发检测试剂盒。然而,该方法需要设计合成荧光探针,且每次仅能检测一个位点,通量低,成本较高。此外,基于荧光探针法,易造成假阳性。
综上所述,目前检测奶牛单碱基多态性遗传病的分子诊断方法普遍存在的技术问题主要有两个方面:一方面,检测位点通量低,如CRS-PCR、测序等,一次只能对单一SNP位点进行检测,当位点较多时操作复杂,费用较高;另一方面,检测样本通量低,如AS-PCR,PCR-SSCP等常规检测法并不适合对大规模批量样本的检测等。
随着人们对单核苷酸多态性(SNP)的深入研究,国内外对牛遗传缺陷病的研究技术也在不断推陈出新。其中,飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱,检测本质为物质的分子量,不涉及任何荧光染料,结果准确,成本低,而且灵敏度高,低至pmol级物质均能被检测到。因此,样本用量少,且操作简单,快速,通量高且灵活等优势,使其在核酸检测领域显示出巨大的生命力。
然而,所述质谱技术目前主要集中在临床医学研究中,对于农业生产中涉及的牲畜疾病少有研究,国内尚未有应用飞行时间质谱技术对奶牛遗传病检测的报道。此外,鉴于传统分子生物学检测农业牲畜遗传病的技术已经被广泛接受,因此人们对于使用飞行时间质谱技术来检测奶牛遗传病的技术有待时间的检验。然而,目前奶牛的遗传病检测技术中,均针对单一遗传病的检测,缺乏对于多种常见遗传病的高效检测技术。因此,本发明第一方面目的在于针对以上遗传病,需要建立一种快速、简单、灵敏、准确、通量灵活的检测技术。
此外,在现代奶牛科学育种的研究中,除了需要检测和排除患有上述遗传病的奶牛资源外,提高奶牛奶制品的质量也是奶牛育种的研究方向。其中,筛选A2型奶牛对于中国从传统乳业向现代乳业转型具有重大意义。已有研究证明,牛奶中β-酪蛋白(β-CN)的编码基因CSN2全长8.5kb,共发现A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G、H1、H2和I 12种基因型,其两个主要的变异型,称为A1和A2,例如αs2酪蛋白的外显子17-18位的AC61位点,8101位点。比较而言,人乳中的β-酪蛋白与牛奶中的A2型β-酪蛋白结构更为相似,人β-酪蛋白同样不会产生BCM-7,而BCM-7能穿过胃肠壁进入血液循环,并通过阿片受体影响全身和细胞活动。此外,BCM-7和其他β-酪蛋白衍生物为阿片受体的强效外源性激动剂—外啡肽,其中与μ受体的亲合力最大。因此,BCM-7可能影响多个器官/系统的活动,尤其消化系统和免疫细胞。此外,BCM-7也可能与婴幼儿的各种疾病有关,如Ⅰ型糖尿病和呼吸功能障碍,消化功能疾病,促使产生肛瘘,免疫功能疾病,并影响中枢神经系统活动。
因此,基于与母乳更为接近、同样不产生BCM-7的A2型β-酪蛋白制成的配方奶因其不含A1型β-酪蛋白,更有利于促进婴幼儿的生长发育。筛选专产A2型β-酪蛋白的奶牛进行挤奶并用于生产只含A2型β-酪蛋白的高端优质配方奶对于改善目前的国产奶粉品质具有重要作用。
现今,西方的奶牛中只有约30%的奶牛为纯正的A2奶牛,由其所产的牛奶只含100%纯净A2型β-酪蛋白。如果我国能掌握A2β-酪蛋白的奶源的鉴定技术,根据我国庞大的奶牛牲畜资源,从中筛选出纯产A2型奶的奶牛,从而发展中国特色的A2奶制品加工产业,对于提升中国的乳业行业发展水平具有不可估量的作用。
综上所述,如何筛选和建立A2奶牛种畜资源成为当前的首要任务。目前国内尚无有关检测编码A2β-酪蛋白基因方法及研究,并且现有国际上相关检测技术仍然停留在传统PCR相关测序技术。因此,考虑到我国乳业产业的转型和升级,我们一方面需要加强建立基于飞行时间质谱技术对奶牛多种遗传病进行检测的方法之外,另一方面还要根据中国国情需要建立检测奶牛中β-酪蛋白的方法,同时筛选出只编码A2型β-酪蛋白而不编码A1型β-酪蛋白的奶牛,继而可以利用只编码A2型β-酪蛋白奶牛产的牛奶生产纯的A2型β-酪蛋白型的奶粉或鲜奶。
所以,本发明的第二方面目的在于建立基于飞行时间质谱技术对奶牛多种遗传病以及联合检测A2型奶牛的筛选方法,从而科学地指导我国奶牛育种,促进我国奶牛业健康稳定的发展。
发明内容
本发明的原理在于:提供了一种联合PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术,同时对奶牛脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病同时进行检测的方案。考虑到当同一反应体系中存在多重反应引物,那么多重扩增的规模主要受限于引物之间的相互作用程度,从而影响核酸质谱检测过程。因此,本发明通过优化和选用使用针对上述四种遗传病相关基因的特殊引物,同时进行PCR多重扩增,然后对经过纯化的PCR产物进行单碱基延伸,特异性的延伸引物延伸一个核苷酸,所延伸的核苷酸类型与上述四种遗传病的野生型或突变型相对应;以质谱技术对单碱基延伸产生的延伸引物和延伸产物组成的待检混合物进行检测,通过质谱峰确定待检混合物中各物质的分子量,并与预先计算的延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对,从而确定待检混合物是否包含指定的碱基类型,进而确定样本的基因型。在以上优化多重反应体系的基础上,本发明进而研究并获得能够与上述四种遗传病进行同时检测和筛选A2型奶牛的检测系统,通过确定β-酪蛋白的基因型,从而最终实现遗传病和A2型奶牛的联合检测。
因此,本发明的第一个目的是提供一种同时检测奶牛脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的引物系统或引物组,其序列如表1所示。
表1四种遗传病的引物序列
编号 | 序列(5’→3’) | 针对疾病(基因) | 用途 |
SEQ ID No:1 | AAGTAAACCCCAGCAAAGCC | CVM(SLC35A3) | PCR引物 |
SEQ ID No:2 | GCTGGCTCACAATTTGTAGG | CVM(SLC35A3) | PCR引物 |
SEQ ID No:3 | TTGACGTTGACGAGGTCATC | BLAD(CD18) | PCR引物 |
SEQ ID No:4 | TTCAATGTGACCTTCCGGAG | BLAD(CD18) | PCR引物 |
SEQ ID No:5 | GGTGCAAATGGCTGAAGAAC | DUMPS(UMPS) | PCR引物 |
SEQ ID No:6 | ACTCCTGGAGTCAAGTGAAG | DUMPS(UMPS) | PCR引物 |
SEQ ID No:7 | ATCCAGTCCAGCGCACTGTA | CN(ASS) | PCR引物 |
SEQ ID No:8 | ACATACTTGGCTCCTTCTCG | CN(ASS) | PCR引物 |
SEQ ID No:9 | TTGTAGGTCTCATGGCA | CVM(SLC35A3) | 延伸引物 |
SEQ ID No:10 | TCCATCAGGTAGTACAGG | BLAD(CD18) | 延伸引物 |
SEQ ID No:11 | CTGGTTTCATGCTTACTC | DUMPS(UMPS) | 延伸引物 |
SEQ ID No:12 | GCACTGTACGAGGAC | CN(ASS) | 延伸引物 |
其中,所述的与脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病相关的基因位点分别是:SLC35A3基因4号外显子第559位(G>T)、CD18基因第二外显子第55位(A>G)、UMPS基因第5个外显子上的密码子405位(C>T)、ASS基因第5外显子的第86个氨基酸(C>T)。本发明中,脊椎畸形综合症(CVM)和白细胞粘附缺陷症(BLAD)两种遗传病检测时所选择位点位于反义链,即分别为C>A和T>C。其中,所涉及的延伸引物及延伸产物的分子量如表2所示。
表2四种遗传病延伸引物信息
注:基因型1为野生型,基因型2为突变型。
在一个实施方案中,上述PCR扩增引物序列为核心序列,其在5’端可包括保护碱基序列,优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中,保护碱基序列选自在5’端加入10bp的tag(ACGTTGGATG),例如,在PCR引物SEQ ID No:1的5’端加入10bp的tag(ACGTTGGATG)后即为SEQ ID No:13:
5’-ACGTTGGATGAAGTAAACCCCAGCAAAGCC-3’。在另一个具体实施方案中,延伸引物的5’端也可以增加作为接头的碱基序列,例如,在延伸引物SEQ ID No:10的5’端加入1bp的接头t,为与原始序列区分,接头用小写字母表示,则增加接头后的序列为为SEQ ID No:14:5’-tTCCATCAGGTAGTACAGG-3’。
本发明第二个目的是提供由上述引物系统所制备的用于确定奶牛是否具有脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的检测产品。
在一个实施方案中,该产品为检测试剂盒,包括:
(1)用于PCR反应的试剂,包括:特异性PCR引物,耐高温的DNA聚合酶,dNTPs,PCR反应缓冲液;
(2)用于PCR产物纯化的试剂;
(3)用于单碱基延伸反应的试剂,包括:延伸引物,耐高温的单碱基延伸酶,ddNTPs,延伸反应缓冲液。
在一个具体实施方案中,该试剂盒还可包括:阴性质控品,阳性质控品,纯化用树脂,点样及质谱检测用靶片,外切酶等试剂。
在另一个具体实施方案中,用于PCR产物纯化的试剂:碱性磷酸酶,或碱性磷酸酶和外切酶Exo I,或电泳凝胶回收试剂,或PCR产物纯化柱。其中,当包括碱性磷酸酶和外切酶Exo I的纯化试剂时,所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
本发明的第三个目的是利用上述引物系统、检测产品或试剂盒,来检测奶牛是否具有脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)的方法,其特征在于,它至少包括以下步骤:
(1)PCR反应:使用上述特异性的针对包含所选择基因多态位点片段的PCR扩增引物,在一个反应体系内,通过多重PCR同时扩增含有不同多态位点的序列,得到含扩增目标区域的PCR产物;
(2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化,以减少对后续反应的干扰;
(3)单碱基延伸:使用针对所选择基因多态位点的特异延伸引物,在一个反应体系中,对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行单碱基延伸,延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个碱基;该碱基与SNP位点处的基因型互补配对;
(4)延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化,以获得高纯的延伸产物,避免盐离子等杂质对后续检测的影响;
(5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上,放入质谱仪进行检测,得到不同SNP位点延伸产物的核酸谱图;
(6)将得到的不同SNP位点延伸产物的核酸谱图,经过质谱仪配套软件分析后,确认SNP位点的碱基,从而判定该样本的基因型。
其中,所述与脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病相关的基因位点分别是:SLC35A3基因4号外显子第559位(G>T)、CD18基因第二外显子第55位(A>G)、UMPS基因第5个外显子上的密码子405位(C>T)、ASS基因第5外显子的第86个氨基酸(C>T)。本发明中,脊椎畸形综合症(CVM)和白细胞粘附缺陷症(BLAD)两种遗传病检测时所选择位点位于反义链,即分别为C>A和T>C。
在一个实施方案中,步骤(1)所用的PCR扩增引物和步骤(3)所用的延伸引物选自但不局限于表1所示序列;步骤(2)的纯化过程可以选择碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoⅠ消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中,当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoⅠ消化进行纯化后,进行高温酶灭活处理。
本发明第四个目的是提供通过上述引物组或检测产品,用于制备奶牛筛选、繁育中进行联合检测的产品。
在一个实施方案中,所述联合检测包括检测奶牛的β-酪蛋白基因、遗传性疾病(包括脊椎畸形综合症CVM、白细胞粘附缺陷症BLAD、尿甘酸合酶缺乏症DUMPS、瓜氨酸血症CN)相关基因等。
在另一个实施方案中,所述联合检测的产品包括用于检测上述任意两种或多种或全部性状的检测产品。在一个具体实施方案中,该联合检测的产品包括用于通过核酸质谱方法来检测所述症状的扩增引物、延伸引物及其相关试剂。在另一具体实施方案中,所述联合检测包括检测奶牛的β-酪蛋白基因和遗传性疾病(包括脊椎畸形综合症CVM、白细胞粘附缺陷症BLAD、尿甘酸合酶缺乏症DUMPS、瓜氨酸血症CN)相关基因的分型,或A2基因与以上任意一种或多种遗传病的组合。
在一个具体实施方案中,上述联合检测产品中用于核酸质谱检测奶牛是否具有β-酪蛋白A2/A1基因的引物组,其序列如下表所示。
编号 | 序列(5’→3’) | 针对位点 | 用途 |
SEQ ID No:21 | TAAAATCCACCCCTTTGCCC | CSN2(8101) | PCR引物 |
SEQ ID No:22 | AGAGGAGGGATGTTTTGTGG | CSN2(8101) | PCR引物 |
SEQ ID No:23 | TTGTGGGAGGCTGTTA | CSN2(8101) | 延伸引物 |
在一个实施方案中,所述引物组如下表所示。
在上述实施方案中,其中,延伸引物及延伸产物的分子量如下表所示。
在一个实施方案中,上述引物组仅包括SEQ ID No:21-23或SEQ ID No:24-26的组合。
在另一个实施方案中,上述PCR扩增引物序列为核心序列,其在5’端可包括保护碱基序列,优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中,保护碱基序列选自在5’端加入10bp的tag(ACGTTGGATG),例如,在PCR引物SEQ ID No:21的5’端加入10bp的tag(ACGTTGGATG)后即为:
5’-ACGTTGGATGTAAAATCCACCCCTTTGCCC-3’。在另一个具体实施方案中,延伸引物的5’端也可以增加作为接头的碱基序列。
本发明的第五个目的是提供通过上述任一目的引物组或检测产品,来繁育健康奶牛以及形成健康奶牛群的方法,至少包括:
(1)根据上述任一方法确定奶牛在脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病相关基因多态位点为野生型还是突变型;
(2)选择在上述四种遗传病相关基因多态位点处均为野生型的奶牛,形成健康奶牛群。
在一个实施方案中,所述检测还包括检测奶牛的β-酪蛋白基因分型。
在另一个实施方案中,所述联合检测的产品包括用于检测上述任意两种或多种或全部性状的检测产品。在一个具体实施方案中,该联合检测的产品包括用于通过核酸质谱方法来检测所述症状的扩增引物、延伸引物及其相关试剂。在另一具体实施方案中,所述联合检测包括检测奶牛的β-酪蛋白A2基因和遗传性疾病(包括脊椎畸形综合症CVM、白细胞粘附缺陷症BLAD、尿甘酸合酶缺乏症DUMPS、瓜氨酸血症CN)相关基因的分型,或A2基因与以上任意一种或多种遗传病基因的组合。
本发明的第六个目的是提供从按照本发明的方法检测来自奶牛的精液或胚胎,该精液或胚胎优选地用于人工繁殖技术生产后代。
在上述所有实施方案中,尽管该方法可用于确定其他奶牛品种是否具有脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病,以及同时确定奶牛是否为A2型奶牛,但本发明的奶牛优选为中国荷斯坦奶牛。
在上述所有实施方案中,受试奶牛的DNA可以从含有有核细胞的任何组织中得到,该组织优选为该奶牛的血液、精液、毛发或奶。
技术效果
1.敏感:本发明综合了PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体,既可通过PCR技术放大检测模板,又可通过质谱技术检测微量样本。因此,这种多技术结合的方法远远优于单独使用PCR检测SNP,该方法具有相当高的检测灵敏度。
2.特异:单碱基延伸又称为“微测序”,使用特异性探针对DNA分子进行识别,具有测序技术的准确性高、特异性高、假阳性低等特点;特别的,不同于测序技术延伸数百个碱基,该技术仅延伸单个碱基,出错概率更低。
3.简便安全:操作简单、安全、自动化程度高、防污染。
4.快速:速度快、通量高,可在5-6小时内完成数百个样本的检测。
5.检测结果准确且稳定,抗干扰能力强:本发明是使用质谱图谱进行奶牛脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病以及A2型基因的相关基因位点多态性的鉴定,质谱技术具有极强的分辨率和灵敏度,最高分辨率达到9Da,且通过计算机程序判读,人为干扰因素小。相反,传统PCR扩增后凝胶电泳检测,其各自扩增成分的电泳凝胶条带如果区分度过低,将导致结果难以分辨。
6.本发明首次突破了国外技术封锁,填补了国内A2奶产业的联合检测其他疾病的空白,对于我国乳业产业的转型和升级具有重要的促进和支撑作用。
7.本发明将提高我国检验检疫系统的检疫把关能力,防止国外不合格的奶牛或产品进入国内,从而保证我国奶牛的健康水平以及育种安全和行业的健康发展。
原理与定义
本发明提供了一种联合PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术,检测奶牛是否具有脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的检测方案。另外,本发明还提供了同时检测以上遗传病和A2型基因的联合检测方案。其原理在于:使用特异性PCR引物,对待测模板进行扩增,得到含待检SNP位点的PCR产物;PCR产物经过纯化处理后,进行单碱基延伸,在延伸引物后延伸一个核苷酸,该核苷酸与模板互补配对(如模板为核苷酸A,将在对应的延伸引物上延伸T);在单碱基延伸步骤中,采用ddNTP代替dNTP,因此,在延伸一个碱基后,延伸引物将终止延伸;在质谱检测过程中,单碱基延伸产物脱盐纯化后,点至含基质的靶片上,并在真空环境中被激光激发,通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与其分子量呈负相关,即分子量越大,飞行时间越慢,到达检测器的时间越晚。
术语“PCR扩增”,指在引物和聚合酶的作用下,对于特定的目的片段进行扩增反应,以便进行相应的检测,例如酶切鉴定、测序鉴定等。在本发明中,由于需要考虑到质谱检测的区分度和检测窗口等限制条件,因此,扩增长度不同于普通PCR扩增检测过程,本发明中用于质谱检测的扩增产物长度一般在100-200bp左右。而通常这种扩增产物长度,是难以直接进行酶切鉴定或测序鉴定的。由此可见,本发明的PCR扩增是与常规检测所涉及的PCR扩增是不完全相同的。
术语“保护碱基”,指在PCR引物的5’端额外增加的碱基。保护碱基的序列使得PCR引物的分子量增大,可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口,以避免干扰检测效果。此外,延伸引物的5’端也可以适量增加碱基序列,但其作用并非如同PCR引物的保护碱基,使其超出检测窗口,而是适当调整延伸引物的分子量,使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如,当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时,通过给其中一个延伸引物增加碱基,改变引物及其产物的分子量,与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距,以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清,从而提高检测效果。因此,增加碱基后的延伸引物及产物的分子量,一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。
术语“碱性磷酸酶消化”,其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP,其原理是使dNTP的5’-P末端转换成5’-OH末端,从而失去与引物结合使引物延伸的能力,避免了对下一步单碱基延伸的影响。
术语“外切酶Exo I消化”,其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间的3,5-磷酸二酯键,使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后剩余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除,并不会在检测窗口中出现,因此在使用该外切酶时,所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
术语“单碱基延伸”,又被称之为微测序(mini sequence),指在体系中加入延伸引物和ddNTP,ddNTP与延伸引物的3’连接形成延伸产物,即引物延伸了一个碱基。ddNTP与普通dNTP不同的是,在脱氧核糖的3’位置缺少了一个羟基,不能与后续的ddNTP形成磷酸二酯键,因而,延伸引物仅可连接一个ddNTP,故而称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似,测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物,测序引物连接dNTP后将继续延伸,只有连接ddNTP后方可终止延伸,因此,测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物;单碱基延伸体系中只加入ddNTP,延伸引物只能连接一个ddNTP,并终止延伸。因此,单碱基延伸反应产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。
术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸,本技术方案共采用四种,它们之间存在分子量差异,如,ddCTP、ddATP、ddGTP和ddTTP的分子量分别是247.2Da、271.2Da、287.2Da和327.1Da,其中,ddTTP为修饰后的分子量。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸时,将形成分子量差异。可以通过质谱检测,分辨出这种差异(质谱检测核酸的最小灵敏度约为9Da)。例如,某SNP位点若为G/A多态,对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量为6153Da),当该SNP位点是G基因型时,延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸,形成23个碱基长、分子量为6400.2Da的延伸产物;当该SNP位点处为A基因型,延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸,形成23个碱基长、分子量为6480.1Da的延伸产物,两种产物间存在80.1Da的分子量差异。即对该SNP位点而言,使用此6153Da的延伸引物,G基因型将对应6400.2Da的质谱峰,A基因型将对应6480.1Da的质谱峰。在实际检测过程中,使用者可通过软件对6153Da、6400.2Da、6480.1Da三处进行观察:若6153Da处出现质谱峰,则表明有部分或全部延伸引物未与ddNTP结合;不论6153Da处是否有质谱峰,若6400.2Da与6480.1Da处仅出现一处质谱峰,则该SNP位点的基因型为纯合型,其基因型与质谱峰的位置对应。如前所述,6400.2Da的质谱峰对应G基因型,6480.1Da的质谱峰对应A基因型;若6400.2Da与6480.1Da两处均出现质谱峰,则该SNP位点的基因型为杂合型;若6400.2Da与6480.1Da两处均未出现质谱峰,则实验失败。
术语“纯化”,指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式:一是分离杂质并丢弃,二是使杂质失去活性。其中,切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离介质,并回收相对较纯的PCR产物,属于第一种纯化方式,该方式一般耗时较长、操作复杂,尤其是样本量大时,更难以提高批量处理能力;碱性磷酸酶的作用是降解(亦称消化)dNTP,使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应,从而不干扰后续反应,属于第二种纯化方式。应当指出的是,单独的外切酶ExoⅠ不起纯化作用,当它与碱性磷酸酶混合使用时,其作用是预先将单链DNA(在反应完成的PCR产物体系中,主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP,再由碱性磷酸酶令dNTP继续降解。由于PCR引物被降解,不会进入最后的质谱检测步骤,因此,如果计划纯化步骤中增加外切酶ExoⅠ处理,则无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外,在单碱基延伸步骤之前,由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温灭活,其不降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等,因此对后续实验不会产生影响。
术语“检测窗口”,指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围,通常涉及引物的设计参考范围。为避免不同延伸引物与产物间由于分子量接近而存在干扰,从而可在一个相对较宽的检测窗口,如4000-9000Da,实现对多种物质的同时检测。
术语“SNP”基因型,表示物种基因组中单核苷酸多态性的类型。其中,在实际检查中,作为对照的用于检测的基因型既可来自于对于物种的基因组中,也可来自克隆入质粒的载体工具,而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定、易得而受到实际使用者的欢迎。
术语“检测产品”,指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品,包括:检测试剂、检测芯片(如基因芯片、液体芯片等)、检测载体,以及检测试剂盒等。
术语“SLC35A3”,指位于奶牛3号染色体上的SLC35A3基因4号外显子的第559位的一个碱基突变(G>T),该突变导致其第180位的氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸,致使奶牛患有脊椎畸形综合症(Complex Vertebral Malformation,CVM)。
术语“CD18”,指位于奶牛1号染色体上的β2整合素(CD18)基因2号外显子第55位的一个碱基突变(A>G),导致第128位的天门冬氨酸被甘氨酸所取代,致使奶牛患有白细胞粘附缺陷症(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency,BLAD)。
术语“UMPS”,指位于奶牛1号染色体上的UMPS基因第5个外显子上的密码子405位的一个碱基突变(C>T),导致原编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子的TGA,致使奶牛患有牛尿苷酸合酶缺乏症(Deficiency of Uridine Monophos Phate Synthase,DUMPS)。
术语“ASS”,指位于奶牛11号染色体上的编码精氨酸合成酶的ASS基因的第5外显子第86个氨基酸发生单碱基突变(C>T),使第86位氨基酸突变为终止密码子,致使奶牛患有瓜氨酸血症(Citrullinemia,CN)。
术语“CSN2(8101)”,指位于CSN2基因(β-酪蛋白基因)的8101位的一个SNP,该SNP位于6号染色体,其67位氨基酸发生变异,导致CSN2基因型的差异。CSN2基因的NCBI登陆号为281099。
术语“A2(AC61)”,指位于αs2酪蛋白(CSN1S2基因)的外显子17-18位的一个SNP,其同样位于6号染色体上(参见中国专利申请03817455.3)。该基因的NCBI登陆号为282209。
应当指出的是,鉴于以上核酸质谱的特殊性,例如,其需先通过PCR反应扩增出含SNP位点的片段,然后通过延伸引物延伸出SNP位点的碱基;各SNP的PCR反应、延伸反应间无明显干扰;各SNP的延伸引物、产物间分子量要有足够大的差异以便实现区分等,因此,并非所有的已知SNP均可以用来进行核酸质谱的检测,也并不是所有针对SNP位点设计的引物均可用以进行多重PCR反应和多重单碱基延伸反应。例如,Cláudia M.B等人(Optimizationof a multiplex minisequencing protocol for population studies and medicalgenetics,Genet.Mol.Res 4(2005)115-125)指出,在进行多重PCR反应前需首先对单重PCR的反应效果进行验证,如果单重PCR扩增效率低则需要放弃;另外,若PCR产物长度偏长,多重PCR效果会比较差,也需要放弃。Nissum M等人(High-throughput genetic screeningusing matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,PsychiatrGenets 12(2002)109-117)也报道了通过MALDI–TOF MS高通量检测SNP的过程中,发现只能获得90%的准确率,其中,在标准实验条件下,竟然有5%的情况不能实施PCR扩增过程,而在单碱基延伸过程中,由于自身引物自身配对、引物二聚体的形成以及扩增产物量过低等因素,也导致有5%的情况难以实现单碱基延伸过程。因此,必须进一步优化核酸质谱实验条件(如扩增引物、实验参数等),否则将影响MALDI–TOF MS在核酸质谱检测SNP中的应用。例如,本发明在针对AC61位点进行核酸质谱检测中,发现实际生产中的准确率仅为75%,这与利用传统PCR测序技术通过检测该位点从而获得A2奶牛分型准确率97%形成强烈对比。因此,对于已知的AC61位点,在本发明的核酸质谱检测过程中,仅仅作为辅助分型的用途。
此外,在核酸质谱检测过程中,多重扩增过程的干扰作用,对于最终获得的延伸产物也存在影响。Sascha Sauer等人(Typing of single nucleotide polymorphisms byMALDI mass spectrometry:Principles and diagnostic applications,ClinicaChimica Acta 363(2006)95–105)和Heyi Yang等人(Multiplex single-nucleotidepolymorphism genotyping by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,Analytical Biochemistry 314(2003)54–62)在利用MALDI质谱技术研究核酸质谱检测过程中提出,所设计的多重引物应具有相近的熔解温度(Tm值)并彼此间的相互作用力较弱。如果引物之间的相互作用力过于强烈(ΔG的最小值为-10kcal/mol),那么必须放弃该理论设计的引物而重新进行设计;当同一反应体系中存在多重反应引物,那么多重扩增的规模主要受限于引物之间的相互作用程度,从而影响核酸质谱检测过程;此外,为了准确区分不同碱基之间的差异,特别是腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(4种碱基中这二者分子量之间差值最小,为9Da),要求的寡核苷酸长度一般不超过40个碱基,实际应用中,质谱检测窗口的分子量范围一般为4000~9000Da,即要求所涉及的延伸引物和产物的分子量尽量分布在4000~9000Da范围之内。同时,要避免各延伸引物及其延伸产物之间的叠合。由此可见,并非所有已知的SNP均可应用于核酸质谱尤其是多重核酸质谱的检测,其实际效果会受到多种实验因素的影响,因此需要通过实验来验证SNP检测的可行性以及筛选不同的引物组合。
附图说明
图1为实施例四中对奶牛样本A1的检测结果,显示该样本的4种待检基因均为野生型。
图2为实施例四中对奶牛样本A2的检测结果,显示该样本的4种待检基因均为野生型。
图3为实施例四中对奶牛样本A3的检测结果,显示该样本的4种待检基因均为野生型。
图4为实施例四中对奶牛样本A4的检测结果,显示该样本的4种待检基因均为野生型。
图5为实施例四中对奶牛样本A5的检测结果,显示该样本的SLC35A3基因为突变型(A),为CVM病症患者。
图6为实施例四中对奶牛样本A6的检测结果,显示该样本的CD18基因为突变型(C),为BLAD病症患者。
图7为实施例四中对奶牛样本A7的检测结果,显示该样本的UMPS基因为突变型(T),为DUMPS病症患者。
图8为实施例四中对奶牛样本A8的检测结果,显示该样本的ASS基因为突变型(T),为CN病症患者。
图9为4种遗传病基因相关的4个位点均为野生型的质粒B1-B4的检测结果。从左至右12条虚线分别是ASS基因的延伸引物、ASS基因的野生型(C)延伸产物、ASS基因的突变型(T)延伸产物、SLC35A3基因的延伸引物、UMPS基因的延伸引物、SLC35A3基因的野生型(C)延伸产物、SLC35A3基因的突变型(A)延伸产物、UMPS基因的突变型(T)延伸产物、UMPS基因的野生型(C)延伸产物、CD18基因的延伸引物、CD18基因的突变型(C)延伸产物、CD18基因的野生型(T)延伸产物的理论峰值。
图10为4种遗传病相关基因相关的4个位点均为突变型的质粒C1-C4的检测结果。
图11为实施例五中对奶牛样本N19的检测结果,显示该样本的SLC35A3基因为杂合突变型(CA),为CVM病症的携带者。
图12为实施例五中对奶牛样本N66的检测结果,显示该样本的CD18基因为杂合突变型(TC),为BLAD病症的携带者。
图13为实施例五中对奶牛样本N76的检测结果,显示该样本的UMPS基因为杂合突变型(CT),为DUMPS病症的携带者。
图14为实施例五中对奶牛样本N93的检测结果,显示该样本的ASS基因为杂合突变型(CT),为CN病症的携带者。
图15为对照实施例一中对奶牛样本N19的SLC35A3基因位点的测序结果,显示为CA杂合。
图16为对照实施例一中对奶牛样本N19的CD18基因位点的测序结果,显示为T纯合。
图17为对照实施例一中对奶牛样本N19的UMPS基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图18为对照实施例一中对奶牛样本N19的ASS基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图19为对照实施例一中对奶牛样本N66的SLC35A3基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图20为对照实施例一中对奶牛样本N66的CD18基因位点的测序结果,显示为TC杂合。
图21为对照实施例一中对奶牛样本N66的UMPS基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图22为对照实施例一中对奶牛样本N66的ASS基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图23为对照实施例一中对奶牛样本N76的SLC35A3基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图24为对照实施例一中对奶牛样本N76的CD18基因位点的测序结果,显示为T纯合。
图25为对照实施例一中对奶牛样本N76的UMPS基因位点的测序结果,显示为CT杂合。
图26为对照实施例一中对奶牛样本N76的ASS基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图27为对照实施例一中对奶牛样本N93的SLC35A3基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图28为对照实施例一中对奶牛样本N93的CD18基因位点的测序结果,显示为T纯合。
图29为对照实施例一中对奶牛样本N93的UMPS基因位点的测序结果,显示为C纯合。
图30为对照实施例一中对奶牛样本N93的ASS基因位点的测序结果,显示为CT杂合。
图31为实施例六中对奶牛样本N1的4种遗传病相关基因位点及β-酪蛋白CSN2基因位点的联合检测结果,显示该样本的4种遗传病待检基因均为野生型,β-酪蛋白基因CSN2为C纯合,即A2型。
图32为实施例六中对奶牛样本N19的4种遗传病相关基因位点及β-酪蛋白CSN2基因位点的联合检测结果,显示该样本的SLC35A3基因为杂合突变型(CA),即CVM病症的携带者,β-酪蛋白基因CSN2为A纯合,即A1型。
图33为实施例六中对奶牛样本N23的4种遗传病相关基因位点及β-酪蛋白CSN2基因位点的联合检测结果,显示该样本的SLC35A3基因为杂合突变型(CA),即CVM携带者,β-酪蛋白基因CSN2为C纯合,即A2型。
图34为实施例六中对奶牛样本N66的4种遗传病相关基因位点及β-酪蛋白CSN2基因位点的联合检测结果,显示该样本的CD18基因为杂合突变型(TC),即BLAD病症的携带者,β-酪蛋白基因CSN2为CA杂合,即A1A2型。
图35为实施例六中对奶牛样本N76的4种遗传病相关基因位点及β-酪蛋白CSN2基因位点的联合检测结果,显示该样本的UMPS基因为杂合突变型(CT),即DUMPS病症的携带者,β-酪蛋白基因CSN2为A纯合,即A1型。
图36为实施例六中对奶牛样本N93的4种遗传病相关基因位点及β-酪蛋白CSN2基因位点的联合检测结果,显示该样本的ASS基因为杂合突变型(CT),即CN病症的携带者,β-酪蛋白基因CSN2为A纯合,即A1型。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一:引物设计及合成
针对奶牛脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病相关的基因位点,设计特异性PCR引物核心序列(SEQID No:1至SEQ ID No:8)和特异性延伸引物核心序列(SEQ ID No:9至SEQ ID No:12),如下表所示:
编号 | 序列(5’→3’) | 针对疾病(基因) | 用途 |
SEQ ID No:1 | AAGTAAACCCCAGCAAAGCC | CVM(SLC35A3) | PCR引物 |
SEQ ID No:2 | GCTGGCTCACAATTTGTAGG | CVM(SLC35A3) | PCR引物 |
SEQ ID No:3 | TTGACGTTGACGAGGTCATC | BLAD(CD18) | PCR引物 |
SEQ ID No:4 | TTCAATGTGACCTTCCGGAG | BLAD(CD18) | PCR引物 |
SEQ ID No:5 | GGTGCAAATGGCTGAAGAAC | DUMPS(UMPS) | PCR引物 |
SEQ ID No:6 | ACTCCTGGAGTCAAGTGAAG | DUMPS(UMPS) | PCR引物 |
SEQ ID No:7 | ATCCAGTCCAGCGCACTGTA | CN(ASS) | PCR引物 |
SEQ ID No:8 | ACATACTTGGCTCCTTCTCG | CN(ASS) | PCR引物 |
SEQ ID No:9 | TTGTAGGTCTCATGGCA | CVM(SLC35A3) | 延伸引物 |
SEQ ID No:10 | TCCATCAGGTAGTACAGG | BLAD(CD18) | 延伸引物 |
SEQ ID No:11 | CTGGTTTCATGCTTACTC | DUMPS(UMPS) | 延伸引物 |
SEQ ID No:12 | GCACTGTACGAGGAC | CN(ASS) | 延伸引物 |
其中,编号为SEQ ID No:9~12的延伸引物及其延伸产物的分子量见下表所示:
本发明中,CVM、BLAD、DUMPS、CN的检测位点分别为:SLC35A3基因4号外显子第559位G>T(反义链,C>A)、CD18基因第二外显子第55位A>G(反义链,T>C)、UMPS基因第5个外显子上的密码子405位C>T、ASS基因第5外显子的第86个氨基酸C>T。
其中,为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果,每条PCR引物的5'端可以在核心序列(SEQ ID No:1,SEQ ID No:2)的基础上增加一定数目的碱基,常见如10bp的tag(ACGTTGGATG),增大PCR引物的分子量,从而超出质谱仪检测窗口。
相关引物均由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。
实施例二:样本DNA提取
采用商业化的核酸提取试剂盒(如QIAGEN公司的DNeasy Blood and Tissue kit)进行提取,提取后的基因组DNA,在2-8℃保存不应超过一周,-20℃保存不应超过两年,-80℃可长期保存,应避免反复冻融,并置于冰盒中进行运输。
(一)样本为奶牛精液,其DNA提取步骤如下:
(1)洁净1.5mL离心管中加入1支冻精,用消毒小剪剪去一端,然后再剪另一端,加入500μL生理盐水,涡旋混匀,12,000rpm离心1min,去上清;
(2)重复步骤(1),12,000rpm离心2min;
(3)向管中加入400μL含DTT的牛冻精裂解液,再加入100μL 20%的SDS,涡旋混匀,使底部沉淀完全溶解,加入10μL蛋白酶K后颠倒混匀;
(4)将混合样品放置在56℃分子杂交炉中消化20-22h;
(5)向消化好的样品中加入300μL饱和食盐水,颠倒2-3min,4℃放置10min;
(6)4℃,12,000rpm离心10min,将上清转移到新的2mL离心管中;
(7)加入1mL预冷的无水乙醇,颠倒1-2min,12,000rpm离心2min,去上清;
(8)向离心管中加入500μL 75%的乙醇,颠倒混匀,12,000rpm离心2min,去上清;
(9)重复步骤(7),开盖放置5min,挥发乙醇;
(10)向离心管中加入适量的pH8.0的ddH2O,溶解沉淀;
(11)浓度测定及电泳检测,-20℃保存。
(二)样本为奶牛血液,其DNA提取步骤如下:
(1)取全血200μL放入洁净1.5mL离心管中,加入500μL Lysis Buffer 1,10μL蛋白酶K,充分混匀(涡旋),于56℃放置30min(期间颠倒混匀3-4次);
(2)离心,吸上清到新管;
(3)于上清中加入850μL Binding Buffer 2和150μL磁珠(磁珠使用前要充分悬浮),充分混匀(轻微涡旋),室温放置5min;
(4)将离心管置于磁力架上1min,使管内磁珠被吸附,用移液器移走管内液体;
(5)在离心管中加入200μL Wash Buffer 3,颠倒混匀数次(也可轻微涡旋),将磁珠团打散即可,置于磁力架吸附磁珠1min,然后移走管内液体;
(6)在离心管中加入200μL Wash Buffer 4,颠倒混匀数次(也可轻微涡旋),将磁珠团打散即可,置于磁力架吸附磁珠1min,然后移走管内液体;
(7)在离心管中加入200μL Wash Buffer 5,颠倒混匀数次(也可轻微涡旋),将磁珠团打散即可,置于磁力架吸附磁珠1min,然后移走管内液体;
(8)在离心管中加入200μL Wash Buffer 6,颠倒混匀数次(也可轻微涡旋),将磁珠团打散即可,置于磁力架吸附磁珠1min,然后移走管内液体;
(9)将留有磁珠的离心管开盖、于56℃放置10min,充分干燥(注:在加入洗脱液之前,磁珠必须充分干燥);
(10)加入70μL Elution Buffer 7(可根据实验要求决定洗脱体积),使用移液器吹打,使磁珠重新悬浮,室温放置10min;
(11)将离心管置于磁力架上1min,使磁珠吸附,将DNA转移至新的1.5mL离心管中,经过浓度测定及电泳检测后,-20℃保存备用。
(三)样本为DNA,则经质检合格后,-20℃保存备用。
实施例三:生物学实验
在本实施例中,用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分见表3:
表3PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸组分表
使用ABI 9700型PCR仪进行检验。操作按照说明书进行,具体方法如下:
1.PCR扩增
1.1在PCR配液区,按照待检样品数准备200μL PCR反应管,并在管上标记样本编号;
1.2从试剂盒中取出PCR混合物、PCR酶,使其自然解冻,涡旋振荡使其充分混匀,瞬时离心至管底;
1.3根据样本数目,按下表的比例取出PCR混合液和PCR酶,置于一个离心管中混匀,按每PCR反应管加入16μL混合物进行分装。由于分装过程中,移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数,建议适当放大混合物的配制体积。如,有10份待测样品时,可按10.5至11份样品配制混合物;
组分名称 | 单反应体积(μL) |
PCR混合物 | 15 |
PCR酶 | 1 |
合计 | 16 |
1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入4μL待测样品,使每份PCR反应体系总体积为20μL。其中,阴性对照为超纯水,空白对照为不加模板;
1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中,按下表的程序进行PCR扩增反应。
2.SAP酶消化
PCR反应结束后,依次取5μL PCR产物至新管,每管加入SAP酶混合物1μL,然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中,执行下表程序。
温度(℃) | 时间(min) | 循环数 |
37 | 45 | 1 |
85 | 15 | 1 |
3.单碱基延伸
3.1在PCR配液区,根据样本数目,按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混合物,置于一个离心管中混匀。由于分装过程中,移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数,建议适当放大混合物的配制体积。例如,有10份PCR产物时,可按10.5至11份样品配制混合物;
组分名称 | 单反应体积(μL) |
延伸引物混合液 | 1 |
延伸酶混合物 | 1 |
合计 | 2 |
3.2在PCR扩增区,按每管PCR产物加入2μL延伸混合物进行分装;
3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中,按下表的程序进行延伸反应。
4.纯化
在PCR扩增区向每管延伸产物中加入16μL纯水,6mg树脂,颠倒混匀30min。
5.点样
使用微量移液器,吸取1μL纯化产物,点样至含基质靶片上。
实施例四:上机检测及结果判读
使用毅新兴业(北京)科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。
分别设置以上位点的野生型对照B1-B4、突变型对照C1-C4。其中,野生型对照B1-B4、突变型对照C1-C4分别来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的野生型对照质粒B1-B4和突变型对照质粒C1-C4,为在商品化质粒pMD18-T Vector(Takara公司)的基础上,根据《分子克隆》记载的常规方法,用引物和健康奶牛DNA进行PCR后,将PCR产物插入pMD18-T Vector,即构建野生型质粒B1-B4,再分别定点突变,即构建4个突变型质粒C1-C4。所述质粒B1-B4和C1-C4可长期保存于-20℃甘油中,用时活化并提取质粒DNA。
如前述表2所示,4条延伸引物及它们在4个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量,这些分子量对应各自的质谱峰,若在某分子量处出现质谱峰,则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)。
判断标准:
(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现,无论延伸引物对应的质谱峰是否存在,均判断为实验失败;
(2)若野生型和突变型对应的质谱峰仅出现一个,则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型;
(3)若野生型和突变型对应的质谱峰均出现,则判断为杂合型。
质谱结果如图1-10所示,其中,图1-8为A1-A8样本的质谱图,其中图9为4种遗传病相关的4个SNP位点均为野生型的质粒B1-B4的质谱图,图10为4种遗传病相关的4个SNP位点均为突变型的质粒C1-C4的质谱图。根据前述表2中的延伸引物及延伸产物的分子量检查样本A1-A8的质谱结果(图1-8),确定SNP位点的基因型,结果如表4所示:
表4样本分型结果
其中,A1至A4为健康奶牛提取DNA,检测结果中4种遗传病相关SNP均为野生型,符合预期。A5至A8为通过临床诊断患病样本,其中,A5样本来源的奶牛脊柱弯曲畸形、腿部畸形、妊娠死胎,证实为脊椎畸形综合症(CVM)隐性遗传基因纯合奶牛,本发明中的检测结果与临床结论一致;A6样本来源的奶牛出生体重低、生长缓慢、存在严重的反复性感染、伤口愈合缓慢、白细胞增多且无繁殖能力,证实为白细胞粘附缺陷症(BLAD)隐性纯合奶牛,本发明中的检测结果与临床结论一致;A7和A8样本均来自出生后1周死亡的犊牛,其血液中瓜氨酸蓄积,经验证分别为尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)和瓜氨酸血症(CN)基因纯合牛,本发明中的检测结果与临床结论一致。
实施例五:奶牛样本盲检
根据本发明的方法,依照实施例一、二、三中所描述的操作步骤,对102例4种遗传病基因携带情况未知的奶牛样本进行盲检。根据实施例四中描述的判定标准对该102例样本进行结果分析,得到表5及图11-14。其中,筛选出脊椎畸形综合症(CVM)携带者9例(质谱峰图以样本N19的结果为例)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)携带者1例、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)携带者1例、瓜氨酸血症(CN)携带者1例,未发现患病牛。
表5盲检样本分型结果
对照实施例一
一、根据实施例一,使用如下引物,对4种遗传病相关的4个基因位点进行扩增和测序:
基因 | 正向引物(5’→3’) | 反向引物(5’→3’) |
SLC35A3 | CTTACCAAGTTGAATGTT | AGGAATGGAAATGGTTGC |
CD18 | AATGCGGCCCGACTCGGTGAT | GGCGTCCTGCATCCTATC |
UMPS | TGTTGATTACATTCCATTC | AAAGCAGCATTTTAGAGG |
ASS | GTTAGCTGCGTCTGCCTTAG | CACATACTTGGCTCCTTCTCG |
二、样本来源
为使不同实验之间产生的数据具有可比性,测序验证时选择实施例五中检测结果为携带者的样本,即编号为N19、N23、N29、N37、N44、N48、N54、N60、N66、N76、N83、N93,共12例样本。
三、测序鉴定
1.PCR反应体系为25μL,具体配方如下所示:
反应体系 | 加样量(μL) |
10×PCR Buffer | 2.5 |
2.5mM dNTP | 3.0 |
Primers(10μmol/L) | 1.0 |
Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 1.0 |
模板DNA(30ng/μL) | 1.0 |
ddH2O | 16.5 |
2.反应条件
使用ABI公司9700PCR热循环仪进行PCR反应。
反应程序为:95℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸40s,共35个循环,最后72℃延伸10min,15℃保存。
3.PCR产物纯化和测序
用试剂盒(OMEGA D2500-01)回收PCR扩增目的条带,定量后进行测序。
测序反应体系为:2μL Mix(Bigdye 3.1,5X sequencing buffer,H2O),2μL纯化后的PCR产物,1μL测序引物(5μmol/L);使用ABI 9700PCR扩增仪进行测序反应。
循环条件为:
96℃2min→(95℃10s→50℃5s→60℃4min)×30cycles→终止反应
测序反应产物用试剂盒(OMEGA 1320-01)进行纯化,然后上ABI 3730遗传分析仪进行序列测定。
4.结果分析
将测序得到的序列,在NCBI上进行BLAST,确定所扩增序列确实为目的序列后,用SeqMan进行比对,确定所测样本4种遗传病基因的基因型,如表6和图15-30所示。其中,CVM携带者样本共计9例,测序结果一致,在此仅以样本N19的测序图谱为例,其余未显示。
表6奶牛样本测序分型结果
经过比较,表6与质谱检验结果表5完全一致,证明本发明方法的准确性。
实施例六:奶牛β-酪蛋白基因与4种遗传病基因联合检测
针对奶牛β-酪蛋白A2/A1蛋白基因的SNP位点(CSN2(8101)),设计特异性PCR引物核心序列和特异性延伸引物核心序列,如下表所示:
编号 | 序列(5’→3’) | 针对位点 | 用途 |
SEQ ID No:21 | TAAAATCCACCCCTTTGCCC | CSN2(8101) | PCR引物 |
SEQ ID No:22 | AGAGGAGGGATGTTTTGTGG | CSN2(8101) | PCR引物 |
SEQ ID No:23 | TTGTGGGAGGCTGTTA | CSN2(8101) | 延伸引物 |
其中,编号为SEQ ID No:23的延伸引物及其延伸产物的分子量见下表:
其中,为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果,每条PCR引物的5'端可以在核心序列(SEQ ID No:21-22)的基础上增加一定数目的碱基,常见如10bp的tag(ACGTTGGATG),以使PCR引物的分子量增大,从而超出质谱仪检测窗口。相关引物均由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。
如上述延伸引物及其延伸产物的分子量表,CSN2(8101)位点编号为SEQ ID No:23的延伸引物及其在2个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量(其中,分子量为A碱基时代表A1型β-酪蛋白,为C碱基代表A2型β-酪蛋白)。这些分子量对应各自的质谱峰,若在某分子量处出现质谱峰,则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)。具体判断标准如下:
(1)若A1型和A2型对应的质谱峰均未出现,无论延伸引物对应的质谱峰是否存在,均判断为实验失败;
(2)若A1型和A2型对应的质谱峰仅出现一个,则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型;
(3)若A1型和A2型对应的质谱峰均出现,则判断为杂合型。
根据本发明的联合检测方法,结合实施例一,根据实施例二、三中所描述的操作步骤,对实施例五中检测出的2例脊椎畸形综合症(CVM)携带者N19和N23、1例白细胞粘附缺陷症(BLAD)携带者N66、1例尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)携带者N76、1例瓜氨酸血症(CN)携带者N93和1例健康奶牛N1样本进行β-酪蛋白基因与4种遗传病联合检测。根据实施例四中描述的判定标准和β-酪蛋白A2/A1蛋白基因CSN2(8101)位点的的判定标准对6例样本进行结果分析,得到表7及图31-36。
表7奶牛β-酪蛋白基因与4种遗传病联合检测分型结果
样本编号 | CVM | BLAD | DUMPS | CN | CSN2(8101) |
N1 | C | T | C | C | C |
N19 | CA | T | C | C | A |
N23 | CA | T | C | C | C |
N66 | C | TC | C | C | CA |
N76 | C | T | CT | C | A |
N93 | C | T | C | CT | A |
如图31-36以及表7所示,本发明的联合检测的引物系统,质谱区分度好,多重扩增过程的干扰效果不明显,各延伸引物及其延伸产物之间具有最低程度的叠合,能够有效地同时实现β-酪蛋白基因与4种遗传病的联合检测。
Claims (13)
1.一种用于核酸质谱法检测奶牛的脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的引物组,所述引物组的序列如下:
其中,PCR引物序列为核心扩增序列,在PCR引物序列的5’端还增加保护碱基tag序列:5’-ACGTTGGATG-3’。
2.权利要求1所述的引物组,其中延伸引物及延伸产物的分子量如下:
3.权利要求1所述的引物组,其中在上述延伸引物的5’端还增加作为接头的碱基序列。
4.由权利要求3所述的引物组所制备的用于确定奶牛的脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的检测产品。
5.权利要求4所述的检测产品,其中产品为检测试剂盒,包括:
(1)用于PCR的反应试剂,包括:权利要求1-4任一项所述的PCR引物,耐高温的DNA聚合酶,dNTPs,PCR反应缓冲液;
(2)用于PCR产物纯化的试剂;
(3)用于单碱基延伸反应的试剂,包括:权利要求1-4任一项所述的延伸引物,耐高温的单碱基延伸酶,ddNTPs,延伸反应缓冲液。
6.权利要求5所述的检测产品,其中试剂盒包括:阴性质控品,阳性质控品,纯化用树脂,点样及质谱检测用的靶片,外切酶,动物基因组DNA提取试剂。
7.权利要求5所述的检测产品,其中用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶,或碱性磷酸酶和外切酶Exo I,或电泳凝胶回收试剂,或PCR产物纯化柱。
8.利用权利要求1-3任一项所述的引物组,或权利要求4-7任一项所述的检测产品来繁育健康奶牛以及成健康奶牛群的方法,包括:
(1)根据权利要求1-3任一项所述的引物组,或权利要求4-7任一项所述的检测产品,确定奶牛在脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病相关基因多态位点为野生型或突变型;
(2)选择在上述四种遗传病相关基因多态位点处为野生型的奶牛,形成奶牛群。
9.一种用于奶牛筛选、繁育的联合检测产品,其特征在于,所述联合检测产品是通过权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求4-7任一项所述的检测产品制备的,所述联合检测产品可同时检测奶牛的β-酪蛋白基因分型、脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿甘酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN),或包括β-酪蛋白基因分型与以上遗传病中的任意一种或多种组合;其中用于β-酪蛋白基因分型的引物组的序列如下所示:
10.权利要求9所述的联合检测产品,其中所述用于β-酪蛋白基因分型的引物组的序列如SEQ ID NO:21-23或SEQ ID NO:24-26所示。
11.权利要求9所述的联合检测产品,其中延伸引物及延伸产物的分子量如下所示:
12.权利要求1-3任一项所述的引物组,权利要求4-7任一项所述的检测产品,权利要求8所述的方法,或权利要求9-11任一项所述的联合检测产品,其中所述奶牛为中国荷斯坦奶牛。
13.权利要求1-3任一项所述的引物组,权利要求4-7任一项所述的检测产品,权利要求8所述的方法,或权利要求9-11任一项所述的联合检测产品,其中检测的样本为奶牛的DNA,所述奶牛的DNA来自血液、精液、毛发或奶。
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Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107058582A (zh) * | 2017-06-06 | 2017-08-18 | 北京奶牛中心 | 基于KASP检测β‑酪蛋白基因型的方法 |
CN107287292B (zh) * | 2017-06-07 | 2019-11-26 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 同时检测奶牛β-酪蛋白不同变体型的一组专用引物及其试剂盒 |
CN107099607B (zh) * | 2017-06-12 | 2020-03-17 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一套同时检测93种牛遗传缺陷基因和致死单倍型的引物组合及试剂盒 |
CN107653316B (zh) * | 2017-10-24 | 2021-06-01 | 中北大学 | 用于检测奶牛三种隐性遗传缺陷病的引物对及其应用 |
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CN109337972A (zh) * | 2018-11-24 | 2019-02-15 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 焦磷酸测序技术检测荷斯坦奶牛尿苷酸合酶缺乏症的方法 |
CN109385479A (zh) * | 2018-12-30 | 2019-02-26 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 检测疏嘌呤类药物相关基因snp的试剂盒和方法 |
CN111077213A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-28 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 鉴定和育种a2型产奶牲畜的方法及其生产a2型奶的方法 |
CN112557493B (zh) * | 2019-12-31 | 2022-09-30 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 质谱检测乳制品中A1和A2型β-酪蛋白的标准特征多肽组 |
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CN115792048A (zh) * | 2022-07-22 | 2023-03-14 | 无锡市食品安全检验检测中心 | 质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101003841A (zh) * | 2007-01-17 | 2007-07-25 | 中国农业大学 | 筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒 |
CN102002526A (zh) * | 2010-11-16 | 2011-04-06 | 中国农业大学 | 用于检测牛slc35a3基因v180f突变的引物和探针 |
CN105087571A (zh) * | 2015-09-09 | 2015-11-25 | 中国农业大学 | 一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1925741B (zh) * | 2002-05-24 | 2010-11-10 | A2有限公司 | 动物基因分型方法 |
CN101984077B (zh) * | 2010-11-25 | 2012-08-15 | 中国农业大学 | 用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定snp标记组合及检测方法 |
CN104232632A (zh) * | 2014-09-16 | 2014-12-24 | 中国农业大学 | 一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN101003841A (zh) * | 2007-01-17 | 2007-07-25 | 中国农业大学 | 筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒 |
CN102002526A (zh) * | 2010-11-16 | 2011-04-06 | 中国农业大学 | 用于检测牛slc35a3基因v180f突变的引物和探针 |
CN105087571A (zh) * | 2015-09-09 | 2015-11-25 | 中国农业大学 | 一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
A novel method for rapid and reliable detection of complex vertebral malformation and bovine leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle;Yi Zhang等;《Journal of Animal Science and Biotechnology》;20120723;第3卷(第24期);第130-135页 * |
Screening for bovine leukocyte adhesion deficiency, deficiency of uridine monophosphate synthase, complex vertebral malformation, bovine citrullinaemia, and factor XI deficiency in Holstein cows reared in Turkey;Hasan Meydan等;《Acta Veterinaria Scandinavica》;20101007;第52卷;第56页 * |
天津地区荷斯坦公牛CVM、DUMPS和CN遗传缺陷检测;梁若冰等;《中国奶牛》;20140131;第11-15页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105861671A (zh) | 2016-08-17 |
CN105925674A (zh) | 2016-09-07 |
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