CN112662789B - 与中国南方荷斯坦奶牛初产日龄相关的snp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及两个与中国南方荷斯坦奶牛初产日龄相关的SNP标记及其应用，第一SNP标记rs42737928位点位于中国南方荷斯坦奶牛基因组第3号染色体113301213bp处，碱基为C或G，第一SNP标记的GG基因型个体的初产日龄显著小于GC基因型个体；第二SNP标记rs43703011位点位于中国南方荷斯坦奶牛基因组第6号染色体85451298bp处，碱基为G或T，第二SNP标记的GG和TT基因型个体的初产日龄均极显著小于GT基因型个体。本发明应用两个SNP分子标记对中国南方地区荷斯坦奶牛进行联合选育，大大增加了对初产日龄性状选择的准确性，可以让有利于提前奶牛初产日龄的优势等位基因和基因型在奶牛群体内快速扩散，缩短世代间隔，降低育种成本，加快高繁殖力奶牛的育种进程和推动我国奶牛行业的可持续发展。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及两个与中国南方荷斯坦奶牛初产日龄相关的SNP标记及其应用。
背景技术
我国南方地区人口多、奶类消费需求高，在奶业发展方面具备很大的市场潜力。但是由于自然条件及农业产业结构等因素制约，南方奶源自给率严重不足。基于当代基因组科学的分子育种技术为加快南方荷斯坦奶牛群体的遗传选择进展、促进我国南方地区奶业整体效益的提升、缓解地区奶制品供需不平衡的矛盾提供了重要实现途径，而其中一个重要前提是首先获得影响重要性状的有效遗传素材。
过去多年来，国内外育种工作者关于奶牛经济性状的分子选育工作主要集中于产奶性状，由于产奶性状与繁殖性状之间存在负相关，对产奶性状的高强度选育导致繁殖性能急剧下降，奶牛配种、繁殖疾病治疗以及牛只淘汰等生产成本不断增加。同时繁殖性能的下滑也给牛群健康带来负面影响，繁殖障碍和繁殖疾病等繁殖问题已经成为全球范围内牛只淘汰的主要因素。然而，我国荷斯坦奶牛的分子选育工作集中在北方地区，对于高热高湿的南方地区而言借鉴参考作用有限。因此，加大对繁殖性状的选择育种，对于我国南方地区荷斯坦奶牛的育种工作非常重要。奶牛繁殖性状较多，其中初产日龄为奶牛首次产犊日期与出生日期之间的间隔天数，可以同时反映母牛个体的性成熟早晚以及其受孕能力，已有大量的研究表明初产日龄显著影响305d泌乳量、利用年限、产犊间隔、体重、体尺等其他重要经济性状，初产日龄已成为重要的育种和生产指标之一。
近年来，国内外围绕初产日龄这一性状从遗传角度进行了部分研究，也发现了部分有价值的结果。刘澳星等(2015)以北京地区2172头母牛性状的育种值作为表型值进行全基因组关联分析，发现7号染色体(20.42-21.52Mb)区域内多个单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位点以及KLHL4、TRAM1、TRAM2、ZNF438、MATK等繁殖障碍疾病相关基因可以作为影响初产日龄性状的重要候选基因和区域。Zhou等(2019)采用150K牛基因芯片设计新疆褐牛资源群体，对奶牛的产奶性状以及初产日龄等繁殖性状进行了全基因组关联分析，新发现的标记HD1600006691与初产日龄显著相关。进一步分析发现该标记位于EPRS基因上，EPRS基因可作为影响初产日龄的重要候选基因(卢鑫等，2019)。这些候选基因以及SNP均是基于中国北方地区的试验群体，基于遗传资源的差异性，能否作为南方地区荷斯坦奶牛初产日龄性状的候选基因以及有效标记有待于进一步研究。
2017年Hutchison等利用13947041头出生于1997-2015年间的美国荷斯坦牛对初产日龄进行研究，发现美国荷斯坦牛的平均初产日龄为735±81.9d。李欣研究发现宁夏地区荷斯坦牛群的平均初产日龄为778.23d。刘澳星等研究发现北京地区荷斯坦牛群的初产日龄为803.17±51.91d。刘登英等报道指出上海荷斯坦牛群体的平均初产日龄为763.21±57.64d。湖北武汉地区荷斯坦牛群体的平均初产日龄为754.95±60.65d，与上述各研究相比，武汉地区荷斯坦牛平均初产日龄小于北京以及宁夏地区，与上海地区接近，但是比美国荷斯坦牛初产日龄高出19.95d。研究表明，武汉地区荷斯坦牛初产日龄在正常范围之内，且具有进一步选择以提前初产日龄的空间。毛永江等报道指出中国荷斯坦牛适宜初配年龄为420d，若加上妊娠时间280d，则武汉地区荷斯坦牛比适宜初产日龄高出54d，进一步说明本群体中荷斯坦牛初产日龄有较大的提升空间。
发明内容
本发明实施例提供两种与中国南方荷斯坦奶牛初产日龄相关的SNP标记及其应用，以解决中国南方地区荷斯坦奶牛初产日龄长的问题。
第一方面，本发明提供了与中国南方荷斯坦奶牛初产日龄相关的SNP标记，为第一SNP标记或第二SNP标记；第一SNP标记位于中国南方荷斯坦奶牛基因组第3号染色体第113301213bp处，碱基为C或G，第一SNP标记的GG基因型个体的初产日龄显著小于GC基因型个体；第二SNP标记位于中国南方荷斯坦奶牛基因组第6号染色体第85451298bp处，碱基为G或T，第二SNP标记的GG和TT基因型个体的初产日龄显著小于GT基因型个体。
第二方面，本发明提供了用于检测上述SNP标记的引物对，为以下引物对中的至少一种：
第一SNP标记的引物对：
正向引物：5’-ATGCTGCAGAATCCAGGGTGT-3’，如SEQ ID NO：1所示；
反向引物：5’-TCTGCATCCCTAAAAATGGGTCTGT-3’，如SEQ ID NO：2所示；
第二SNP标记的引物对：
正向引物：5’-CCATAGCCTCCTTCACTTTGGAGA-3’，如SEQ ID NO：3所示；
反向引物：5’-CAGGATGAACTCCAGGATAAAATCCA-3’；如SEQ ID NO：4所示。
第三方面，本发明提供了用于检测上述SNP标记的试剂盒，该试剂盒含有上述引物对，还含有以下单碱基延伸引物中的至少一种：
第一SNP标记的单碱基延伸引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATG GAGGGCTGAAGCTAG-3’，如SEQ ID NO：5所示；
第二SNP标记的单碱基延伸引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGT TTTGTGGGAGGCTGTTA-3’，如SEQ ID NO：6所示。
第四方面，本发明还提供了上述SNP标记、上述引物对、上述试剂盒在辅助鉴定中国南方荷斯坦奶牛繁殖性状中的用途。
第五方面，本发明提供了一种选育中国南方荷斯坦奶牛的方法，该方法通过对待测中国南方荷斯坦奶牛进行上述SNP标记的检测，评估待测中国南方荷斯坦奶牛的性状，选育初产日龄较早的优势品种。
该方法具体包括以下步骤：
提取待测中国南方荷斯坦奶牛的基因组DNA；
以待测中国南方荷斯坦奶牛的基因组DNA为模板，利用上述引物对进行多重PCR扩增反应；
利用上述单碱基延伸引物对PCR扩增产物进行单碱基延伸反应，延伸产物测序，确定第一SNP标记和第二SNP标记基因型，选择第一SNP标记含有等位基因G或第二SNP标记含有等位基因G的个体作为亲本之一，通过杂交育种的方法培育初产日龄较早的优势后代群体。
优选地，选择至少符合以下条件中的一种的个体作为初产日龄较早的优势个体：第一SNP标记为GG基因型、第二SNP标记为GG基因型。更优选地，选择第一SNP标记为GG基因型、第二SNP标记为GG基因型的个体作为初产日龄较早的优势个体。优选地，中国南方荷斯坦奶牛为武汉地区荷斯坦奶牛。
本发明提供的技术方案带来的有益效果包括：
1.本发明提供了与奶牛初产日龄显著相关的两个SNP标记，第一SNP标记所在的rs42737928位点位于UGT1A1基因上，第二SNP标记所在的rs43703011位点位于CSN2基因上，这两个位点的检出为中国南方地区荷斯坦奶牛初产日龄性状的标记辅助选择提供了科学依据，同时也丰富了奶牛育种的分子标记遗传资源库。
2.由于奶牛初产日龄对牛奶乳脂率、乳蛋白率以及生产寿命都有显著影响，并且随着初产日龄减小产奶性状得到改善。本发明通过联合rs42737928位点和rs43703011位点进行标记辅助选择，可以让繁殖性状表现优异的优势等位基因和基因型在奶牛群体内快速扩散，进而不断提升奶牛群体的繁殖水平，为中国南方地区荷斯坦奶牛繁殖性状以及产奶性状等重要经济性状的平衡育种奠定基础。
3.本发明采用两个SNP标记对中国南方地区荷斯坦奶牛进行联合选育，大大增加了对初产日龄性状选择的准确性。同时，通过标记辅助技术进行初产日龄性状的早期选择，可以加快改善中国南方地区荷斯坦牛群的繁殖性能，增加奶牛养殖场的生产效益，也有利于降低饲养管理成本，有助于培育更加高效优质的奶牛。
附图说明
图1～图3为rs42737928位点分型结果图；
图4～图6为rs43703011位点分型结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明通过现代分子生物学技术以及统计学的方法，寻找到两个与降低初产日龄密切相关的SNP分子标记，第一SNP标记位于UGT1A1基因上，第二SNP标记位于CSN2基因上。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(uridine 5’-diphospho-glucuronos-yltransferase1-1，UGT1A1)作为体内Ⅱ相生物反应酶的重要成员之一，可促进胆红素、脂溶性维生素、雌激素、伊立替康等内源性化合物和外源性药物的葡萄糖磷酸化，通过增加底物极性，使其更容易从体内代谢清除。有研究指出UGT1A1基因多态性与人类乳腺癌以及婴儿期高非结合性胆红素血症发病等疾病相关。β-酪蛋白重组(Recombinant Casein Beta,CSN2)基因是β-酪蛋白的编码基因，β-酪蛋白是人体氨基酸的重要来源，占总乳蛋白的30％，能促进矿物质在人体内的消化及吸收，在一定程度上反映泌乳能力，同时也能够作为有效评估牛乳品质的指标之一。中国南方荷斯坦奶牛CSN2基因存在多态性，而且已被证实与乳蛋白率和脂蛋白比存在显著关联，与日产奶量存在极显著关联。Marete等(2018)报道CSN2基因上rs43703011位点与法国奶牛乳蛋白量以及乳蛋白率相关，UGT1A1基因上存在突变位点rs42737927且与法国奶牛产奶量、乳蛋白量以及乳蛋白率相关。关于UGT1A1基因上突变位点rs42737928对奶牛生产性状的影响尚没有报道，并且这些SNP标记是否与奶牛的初产日龄性状紧密相关尚不清楚。
本发明获得的两个SNP标记的相关信息如表1所示。
表1用于进行关联分析的SNP标记信息
注：用“所处染色体号：在染色体上的位置”的形式对SNP所处的位置进行标注。
实施例1：与繁殖性状密切相关的SNP标记的获取与鉴定1.1实验群体与表型数据
收集湖北武汉地区某规模化奶牛场2015-2019年785头中国南方荷斯坦奶牛的首次产犊日龄记录。每头个体采用尾静脉采血，EDTA抗凝，-20℃保存备用。
1.2血液基因组DNA提取
采用TIANamp Blood DNAKit血液基因组DNA提取试剂盒提取血液DNA，具体步骤如下：
(1)取200μL奶牛全血于1.5mL无RNA酶EP管中，再加入200μL缓冲液GB和20μLProteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液变清亮(如溶液未彻底变清亮，延长裂解时间至溶液清亮为止)。
(2)清亮溶液室温放置2-5min后加入350μL缓冲液BD，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
(3)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CG2中(吸附柱CG2放入收集管中)，12000rpm(～13400g)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。
(4)向吸附柱CG2中加入500μL缓冲液GDB，12000rpm(～13400g)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。
(5)向吸附柱CG2中加入600μL漂洗液PWB(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400g)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。
(6)重复操作步骤(5)。
(7)将吸附柱CG2以12000rpm(～13400g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CG2置于室温放置2min，使吸附材料中残余的漂洗液完全挥发。
(8)将吸附柱CG2转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm(～13400g)离心2min，将溶液收集到离心管中，得到奶牛血液基因组DNA样本。1.3Snapshot法单核苷酸多态性(SNP)分型
奶牛血液基因组DNA样本经质量检查以及浓度测算后，将样本稀释到工作浓度5-10ng/μL，采用Snapshot进行相关位点的分型。主要步骤为：
(1)引物设计
根据NCBI提供的参考序列，用Primer3.0在线软件设计PCR扩增引物。
引物序列信息如下：
rs42737928位点的正向引物：
5’-ATGCTGCAGAATCCAGGGTGT-3’；
rs42737928位点的反向引物：
5’-TCTGCATCCCTAAAAATGGGTCTGT-3’；
扩增片段长度：115bp(如SEQ ID NO：7所示)：
rs43703011位点的正向引物：
5’-CCATAGCCTCCTTCACTTTGGAGA-3’；
rs43703011位点的反向引物：
5’-CAGGATGAACTCCAGGATAAAATCCA-3’；
扩增片段长度：184bp(如SEQ ID NO：8所示)：
(2)多重PCR扩增
PCR反应体系(20μL)包含1×GC-I缓冲液(购于Takara公司)，3.0mM Mg2+，0.3mMdNTP，1U热启动Taq酶(购于Qiagen公司)，1μL样本DNA和1μL PCR引物。多重PCR引物中rs42737928引物对的浓度为1μM，rs43703011引物对的浓度为1μM。
反应程序：①95℃2min；②依次进行94℃20s、65℃40s(-0.5℃/循环)、72℃1.5min，三步共11个循环；③依次进行94℃20s，59℃30s，72℃1.5min，三步共24个循环；④72℃2min。
(3)PCR产物纯化
在10μLPCR产物中加入5U虾碱性磷酸酶(SAP，购于Promega公司)和2UExonuclease I酶(购于Epicentre公司)，先37℃温浴1h，再75℃灭活15min。
(4)SNaPshot单碱基延伸反应
纯化后的PCR产物用ABI公司的SnapshotMultiplex kit进行单碱基延伸反应，得到延伸产物。其中：
rs42737928位点的单碱基延伸引物(rs42737928SF)为：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATGGAGGGCTGAAGCTAG-3’；
rs43703011位点的单碱基延伸引物(rs43703011SF)为：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTA-3’。
延伸反应体系(10μL)包括5μL SnapshotMultiplex Kit(购于ABI公司)、2μL纯化的多重PCR产物、1μL延伸引物混合物(各条延伸引物的浓度为：rs42737928SF 0.8μM；rs43703011SF 1.6μM)、2μL超纯水。
反应程序：①96℃1min；②96℃10s、55℃5s、60℃30s，三步共28个循环。
(5)延伸产物纯化
向10μL步骤(4)得到的延伸产物中加入1U虾碱性磷酸酶，先37℃温浴1h，再75℃灭活15min。
(6)延伸产物测序
取0.5μL经步骤(5)纯化后的延伸产物，与0.5μL Liz120 size standard和9μLHi-Di混匀，95℃变性5min后上ABI3730XL测序仪，获得的原始数据用美国应用生物系统公司开发的微卫星序列分析软件GeneMapper4.1来分析。
实施例2：统计分析
用Excel计算每个位点的基因型频率和等位基因频率，利用卡方检验分析每个位点的哈代-温伯格平衡情况。用SAS在线程序(https://welcome.oda.sas.com/)GLM过程检验基因型对初产日龄表型值的影响，模型如下：Y＝μ+G+e，其中Y为个体性状表型值，μ为群体均值，G为基因型的固定效应，e为随机误差效应。用DUNCAN法对不同基因型的个体性状表型值进行多重比较。
2.1初产日龄性状的统计分析结果
785头中国南方荷斯坦奶牛初产日龄均值为754.95d，标准差为60.65d，最大值为1153d，最小值为652d。
2.2基因组DNA检测和SNP分型
奶牛血液DNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带明亮，无蛋白污染。采用NanoDrop2000核酸浓度仪测定，95％以上样本质量浓度大于10ng/μL，浓度和纯度可以满足Snapshot分型实验要求。
利用Excel对2个SNP标记的等位基因频率和基因型频率进行分析，并进行哈代-温伯格平衡检验。基因分型结果显示，rs42737928位点以及rs43703011位点均处于哈代一温伯格平衡状态(P>0.05)，具体结果见表2。
表2SNP标记的基因型频率和基因频率
2.3SNP标记与初产日龄性状的关联分析
本发明采用SAS软件分析了UGT1A1基因上rs42737928位点以及CSN2基因上rs43703011位点的不同基因型对初产日龄性状的影响(表3)。结果显示：rs42737928位点和rs43703011位点对初产日龄的效应均达到显著水平(P<0.05)。多重比较结果表明：rs42737928位点的GG基因型个体初产日龄显著小于GC基因型个体(P<0.05)，平均减幅度分别为2.11％；rs43703011位点GG基因型和TT基因型个体初产日龄均极显著小于GT基因型个体(P<0.01)，平均减幅度分别为2.26％(GG基因型)和1.55％(TT基因型)。
表3SNP标记与初产日龄关联分析(最小二乘均值±标准误)
注：不同小写字母表示同一位点同一性状的不同基因型相比，差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一位点同一性状的不同基因型相比，差异极显著(P<0.01)，下同。
本发明分析了UGT1A1基因上rs42737928位点以及CSN2基因上rs43703011位点的不同基因型对初产日龄性状的影响，结果提示UGT1A1基因以及CSN2基因可以作为影响中国南方地区荷斯坦奶牛初产日龄性状的重要候选基因，可以利用UGT1A1基因上rs42737928位点以及CSN2基因上rs43703011位点对奶牛群体的初产日龄性状进行标记辅助选择。在生产实践中，可以通过选择第一SNP标记含有等位基因G和/或第二SNP标记含有等位基因G的个体作为亲本之一，通过杂交育种的方法使两个位点的优势等位基因在群体中快速扩散，加快初产日龄较早的新品种培育进程。也可以通过选择rs42737928位点为GG基因型和rs43703011位点为GG基因型的个体作为最优势个体，用于中国南方地区荷斯坦奶牛初产日龄性状的育种。
本发明不仅可以提高选种的准确性，而且还可以根据基因型对奶牛实施早期选择，比传统的表型选择更加经济可靠，最终通过将这些SNP标记应用于奶牛的辅助选择达到延长母牛使用寿命和提高生产效益的目的。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 武汉市农业科学院
<120> 与中国南方荷斯坦奶牛初产日龄相关的SNP标记及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgcaga atccagggtg t 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctgcatccc taaaaatggg tctgt 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatagcctc cttcactttg gaga 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggatgaac tccaggataa aatcca 26
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttagg atggagggct gaagctag 58
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttg atgttttgtg ggaggctgtt 60
a 61
<210> 7
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgctgcaga atccagggtg tggactgctc aggatggagg gctgaagcta ggccccggaa 60
ccttccgaga tgtcccccag tgggagtggg acagacccat ttttagggat gcaga 115
<210> 8
<211> 184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccatagcctc cttcactttg gagactccca ttacttcagg ctgaaggaaa ggcggcacca 60
ccacaggggt ttgagtaaga ggagggatgt tttgtgggag gctgttaggg atgggcccag 120
ggaagggata gactagagac tgtgtctggg caaaggggtg gattttatcc tggagttcat 180
cctg 184
Claims (6)
1.与武汉地区荷斯坦奶牛初产日龄相关的SNP标记在辅助鉴定武汉地区荷斯坦奶牛初产日龄中的用途，其特征在于：所述SNP标记为第一SNP标记和第二SNP标记；
第一SNP标记为rs42737928，位于武汉地区荷斯坦奶牛基因组第3号染色体第113301213bp处，碱基为C或G，第一SNP标记的GG基因型个体的初产日龄小于GC基因型个体；
第二SNP标记为rs43703011，位于武汉地区荷斯坦奶牛基因组第6号染色体第85451298bp处，碱基为G或T，第二SNP标记的GG和TT基因型个体的初产日龄小于GT基因型个体。
2.用于检测SNP标记的引物对和单碱基延伸引物在辅助鉴定武汉地区荷斯坦奶牛初产日龄中的用途，其特征在于：
所述SNP标记为第一SNP标记和第二SNP标记；
第一SNP标记为rs42737928，位于武汉地区荷斯坦奶牛基因组第3号染色体第113301213bp处，碱基为C或G，第一SNP标记的GG基因型个体的初产日龄小于GC基因型个体；
第二SNP标记为rs43703011，位于武汉地区荷斯坦奶牛基因组第6号染色体第85451298bp处，碱基为G或T，第二SNP标记的GG和TT基因型个体的初产日龄小于GT基因型个体；
所述引物对为第一SNP标记的引物对和第二SNP标记的引物对：
第一SNP标记的引物对：
正向引物:5’-ATGCTGCAGAATCCAGGGTGT-3’，
反向引物:5’-TCTGCATCCCTAAAAATGGGTCTGT-3’；
第二SNP标记的引物对：
正向引物:5’-CCATAGCCTCCTTCACTTTGGAGA-3’，
反向引物:5’-CAGGATGAACTCCAGGATAAAATCCA-3’；
所述单碱基延伸引物为第一SNP标记的单碱基延伸引物和第二SNP标记的单碱基延伸引物：
第一SNP标记的单碱基延伸引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATGGAGGGCTGAAGCTAG-3’；
第二SNP标记的单碱基延伸引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTA-3’。
3.用于检测SNP标记的试剂盒在辅助鉴定武汉地区荷斯坦奶牛初产日龄中的用途，其特征在于：所述试剂盒包括引物对和单碱基延伸引物；
所述SNP标记为第一SNP标记和第二SNP标记：
第一SNP标记为rs42737928，位于武汉地区荷斯坦奶牛基因组第3号染色体第113301213bp处，碱基为C或G，第一SNP标记的GG基因型个体的初产日龄小于GC基因型个体；
第二SNP标记为rs43703011，位于武汉地区荷斯坦奶牛基因组第6号染色体第85451298bp处，碱基为G或T，第二SNP标记的GG和TT基因型个体的初产日龄小于GT基因型个体；
所述引物对为第一SNP标记的引物对和第二SNP标记的引物对：
第一SNP标记的引物对：
正向引物:5’-ATGCTGCAGAATCCAGGGTGT-3’，
反向引物:5’-TCTGCATCCCTAAAAATGGGTCTGT-3’；
第二SNP标记的引物对：
正向引物:5’-CCATAGCCTCCTTCACTTTGGAGA-3’，
反向引物:5’-CAGGATGAACTCCAGGATAAAATCCA-3’；
所述单碱基延伸引物为第一SNP标记的单碱基延伸引物和第二SNP标记的单碱基延伸引物：
第一SNP标记的单碱基延伸引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATGGAGGGCTGAAGCTAG-3’；
第二SNP标记的单碱基延伸引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTA-3’。
4.一种选育武汉地区荷斯坦奶牛的方法，其特征在于：通过对待测武汉地区荷斯坦奶牛进行SNP标记的检测，所述SNP标记为第一SNP标记和第二SNP标记；评估所述待测武汉地区荷斯坦奶牛的初产日龄，选择至少符合以下条件中的一种的个体作为初产日龄较早的优势个体：第一SNP标记为GG基因型、第二SNP标记为GG基因型，利用优势个体开展育种工作；
第一SNP标记为rs42737928，位于武汉地区荷斯坦奶牛基因组第3号染色体第113301213bp处，碱基为C或G，第一SNP标记的GG基因型个体的初产日龄小于GC基因型个体；
第二SNP标记为rs43703011，位于武汉地区荷斯坦奶牛基因组第6号染色体第85451298bp处，碱基为G或T，第二SNP标记的GG和TT基因型个体的初产日龄小于GT基因型个体。
5.根据权利要求4所述的选育武汉地区荷斯坦奶牛的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测武汉地区荷斯坦奶牛的基因组DNA；
以待测武汉地区荷斯坦奶牛的基因组DNA为模板，利用引物对进行多重PCR扩增反应；
利用单碱基延伸引物对PCR扩增产物进行单碱基延伸反应，延伸产物测序，确定第一SNP标记和第二SNP标记基因型，选择目标基因型的个体用于培育提前初产日龄的优势品种；
所述引物对为第一SNP标记的引物对和第二SNP标记的引物对：
第一SNP标记的引物对：
正向引物:5’-ATGCTGCAGAATCCAGGGTGT-3’，
反向引物:5’-TCTGCATCCCTAAAAATGGGTCTGT-3’；
第二SNP标记的引物对：
正向引物:5’-CCATAGCCTCCTTCACTTTGGAGA-3’，
反向引物:5’-CAGGATGAACTCCAGGATAAAATCCA-3’；
所述单碱基延伸引物为第一SNP标记的单碱基延伸引物和第二SNP标记的单碱基延伸引物：
第一SNP标记的单碱基延伸引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATGGAGGGCTGAAGCTAG-3’；
第二SNP标记的单碱基延伸引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTA-3’。
6.根据权利要求5所述的选育武汉地区荷斯坦奶牛的方法，其特征在于：选择第一SNP标记为GG基因型、且第二SNP标记为GG基因型的个体作为初产日龄较早的优势个体。
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| GR01 | Patent grant | ||
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