CN101003841A - 筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒。该试剂盒包括PCR－SSCP分析试剂，所述PCR－SSCP分析试剂包括扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸的5′侧41－200bp和3′侧45－328bp的PCR引物。本发明的筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒，使用方法简便、快速、灵敏，检测结果可靠、稳定、准确；用其筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者，不需要特殊的仪器，适合实验室检测的需要。

Description

筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒。

背景技术

荷斯坦奶牛是提供人类乳品的重要家畜品种，经高度的选育与良好的饲养管理，生产大量鲜乳供应我们食物的需求。由于遗传育种与人工授精技术的卓越成果，有潜力的优良公牛被用于制作大量冷冻精液，供给很多母牛配种使用，其优良遗传性能可以迅速地传播至世界各地。如果追溯全世界荷斯坦奶牛的系谱，其亲缘大都密集地来自几个特定的公牛家族。然而，人工授精技术的应用使得遗传缺陷的传播也更加快速，影响层面也更加宽广。

遗传缺陷指会藉由亲代传给子代的缺陷，是由特定基因所引起的生化功能丧失或不正常的表型。体细胞遗传缺陷可分为显性遗传缺陷与隐性遗传缺陷两种。遗传缺陷若是显性且外发于身体畸型或残缺，一般会比较容易被察觉，但是大部分的遗传缺陷却都是隐性的。若是隐性遗传缺陷，则杂合型个体虽带有一个异常等位基因，外表却看不出来。必需带有二个隐性致病基因(aa)的个体才会发生异常的遗传缺陷(这里以a表示致病基因，A表示正常基因)。杂合型公牛(Aa)虽然只带有一个a，但其却是a基因携带者。这种Aa杂合型公牛常会有健壮外观，女儿牛表现优良，导致a基因在子代、孙代、曾孙代…逐渐传递，经过多代的人工授精，a基因携带者在群体中所占比例就大大提高，从而导致带有二个隐性致病基因(aa)的个体涌现，给奶牛业带来损失。

脊椎畸形综合征(Complex Vertebral Malformation，CVM)是荷斯坦奶牛的一种常染色体单基因控制的隐性遗传疾病，最早由丹麦科学家Agerholm报道。随后在美国、荷兰、英国、日本等国家的荷斯坦奶牛中也相继发现。CVM的主要症状为流产、早产和死胎。患病犊牛体型较小、体重偏轻，颈部较短，颈部和/或胸部脊椎骨或肋骨出现各式各样的病变，同时四肢关节僵直、呈现对称的向后方翻转弯曲。另外，CVM对母牛的繁殖性状也有很大的影响，母牛的不返情率提高，产犊间隔大大延长，流产比例增加。

丹麦科学家通过对CVM患病犊牛系谱分析发现，几乎所有患病犊牛都可以追溯到一个共同祖先，Carlin-M Ivanhoe Bell。该公牛是世界著名的优秀种公牛，在全世界范围内使用时间长达二十几年之久，留下了大量的优秀种公牛后代，同时也导致该病具有分布广、频率高的特点(Thomsen B，Horn P，Panitz F，etal.A missensemutation in the bovine SLC35A3 gene，encoding a UDP-N-acetylglucosaminetransporter，causes complex vertebral malformation[J].2006，GenomeResearch，16(1)：97-105)。CVM的分子遗传学基础是由位于奶牛第3号染色体(BTA3)上的SLC35A3基因外显子4的第559位的单碱基突变(G/T)所致，该基因编码尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白(UDP-N-acetylglucosamine transporter)，负责把尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖从细胞质中转运到高尔基体中，点突变导致尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白的第180位的氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸，从而影响了其正常功能，导致CVM(Thomsen B，Horn P，Panitz F，etal.Amissense mutation in the bovine SLC35A3 gene，encoding aUDP-N-acetylglucosamine transporter，causes complex vertebralmalformation[J].2006，Genome Research，16(1)：97-105)。目前丹麦、美国、加拿大等奶牛业发达国家都已经建立了完善的荷斯坦公牛CVM监测体系，所有公牛的CVM检测结果都要进行标识和公布，并记录在其系谱内，CV(carrier of CVM)表示CVM携带者，TV(tested free of CVM)表示非携带者。

参照美国荷斯坦奶牛协会发布的一些奶业发达国家荷斯坦公牛CVM的分子检测结果，结合我国公牛系谱记录，分析发现我国许多优秀种公牛祖先中存在CVM携带者，把这些个体称为可疑携带者，到目前共推测发现240头(马春生.中国荷斯坦牛CVM现状和对策的研究.中国乳业科技大会论文集，2004)。

由于CVM导致一半以上的母牛流产都发生在受孕后100-260天，这段时间是母牛的产奶高峰期，流产导致奶牛产奶量难以达到高峰期，造成母牛非计划性淘汰，因此带来严重的经济损失。但是，仅仅根据系谱分析无法准确定位奶牛个体是否为CVM携带者，而只是群体水平上的推断。必须结合分子检测能够彻底排除CVM可疑携带者。

日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法被称为单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。在随后的研究中，作者又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。其基本过程是：①PCR扩增靶DNA；②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④最后通过银染显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒。

本发明所提供的筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒，包括PCR-SSCP分析试剂，所述PCR-SSCP分析试剂包括扩增SLC35A3基因外显子4的第559位(即GenBank Accession Number AY160683的自5′端第9871位)脱氧核糖核苷酸的5′侧41-200bp和3′侧45-328bp的PCR引物。

只要能通过PCR扩增得到SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸的5′侧41-200bp和3′侧45-328bp的PCR产物的核苷酸序列对均可作为本发明的PCR-SSCP分析试剂。如核苷酸序列分别为agctctcctctgtaatcc和catacgcaaagagtgcatgg、扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸的5′侧200 bp和3′侧328 bp(即自GenBank Accession Number AY160683的5′端第9671位至10199位脱氧核糖核苷酸)的PCR引物；核苷酸序列分别为agctctcctctgtaatcc和tctcaaagtaaaccccag、扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸的5′侧200 bp和3′侧48 bp(即自GenBank Accession Number AY160683的5′端第9671位至9919位脱氧核糖核苷酸)的PCR引物；核苷酸序列分别为agg aacttt cagctg gctcac和caaagtaaaccccagcaaagc、扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸的5′侧41bp和3′侧45bp(即自GenBank Accession Number AY160683的5′端第9830位至9926位脱氧核糖核苷酸)的PCR引物。

所述PCR引物优选为扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸5′侧200bp和3′侧48bp核苷酸序列的PCR引物，如核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2的一对PCR引物。

所述PCR-SSCP分析试剂除上述引物外，其它试剂均可为PCR-SSCP分析的现有试剂。

所述PCR-SSCP分析试剂还包括用于进行PCR反应的DNA聚合酶，PCR缓冲液，dATP，dGTP，dCTP，dTTP等PCR扩增试剂。这些PCR扩增试剂均可为现有的常规试剂。

所述PCR-SSCP分析试剂还包括DNA上样缓冲液，交联度为1∶30、丙烯酰胺的质量浓度为10-14％的聚丙烯酰胺凝胶液，银染试剂等SSCP分析所用的试剂。这些SSCP分析所用的试剂均可为现有的SSCP分析中涉及的试剂。如SSCP DNA上样缓冲液可为98％去离子甲酰胺、2％甘油、0.01mol/ml EDTA、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青。进行SSCP分析时，PCR扩增产物在该SSCP DNA上样缓冲液中进行热变性。

所述SSCP分析所用的试剂还包括N，N，N’，N’-四甲基二乙胺(TEMED)，电极缓冲液。

所述交联度为凝胶溶液中N，N’-亚甲基双丙烯酰胺占丙烯酰胺和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺总量的质量百分数。

用本发明的试剂盒筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者时，可以待测荷斯坦奶牛的基因组DNA为模板，利用扩增SLC35A3基因外显子4的第559位的单碱基突变的5′侧41-200bp和3′侧45-328bp的PCR引物(如核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2的一对PCR引物)进行PCR扩增，然后按照下述方法进行SSCP分析：将PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；然后将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后通过银染分析结果。通过得到的单链构象多态性来区分脊椎畸形综合征携带者和非脊椎畸形综合征携带者。例如，利用核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2的一对PCR引物进行PCR-SSCP分析，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中，如待测荷斯坦奶牛得到四条带，则该待测荷斯坦奶牛为脊椎畸形综合征携带者；如待测荷斯坦奶牛得到两条带，则该待测荷斯坦奶牛为非脊椎畸形综合征携带者。

本发明的筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒，使用方法简便、快速、灵敏，检测结果可靠、稳定、准确；用其筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者，不需要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要。

附图说明

图1为部分荷斯坦公牛SLC35A3基因PCR产物凝胶电泳图

图2为部分公牛个体PCR-SSCP结果

图3A为AA基因型个体的序列分析结果

图3B为AB基因型个体的序列分析结果

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、利用筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒筛查部分中国荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者

一、筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒

该筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒，包括PCR反应试剂，聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂和银染试剂。它们的具体组成如下：

1、PCR反应试剂：

Taq DNA聚合酶(2.5U/uL)、10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)、dNTPs(4×2.5mM)均购自天根生化科技(北京)有限公司，它们的商品目录号分别为ET101-02、CD111-02；引物浓度25umol/L。其中，正向引物的序列为：AGC TCT CCT CTG TAA TCC(序列1)，反向引物的序列为：TCT CAA AGT AAA CCC CAG(序列2)。

50×TAE：Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)100mL，加水充分溶解，定容至1L；

溴化乙啶贮存液：1g溶于100mL蒸馏水中。

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂：

该聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂由14％非变性聚丙烯酰胺凝胶、SSCP DNA上样缓冲液和银染试剂组成。

(1)14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(30mL)：30％PAGE 14mL、10×TBE 3mL、50％甘油3mL、10％过硫酸胺200uL、TEMED(N，N，N’，N’-四甲基二乙胺)20uL、双蒸水3mL；

30％PAGE(丙烯酰胺∶N，N’-亚甲双丙烯酰胺＝29∶1)储存液：称取290g丙烯酰胺、10g N、N’-亚甲双丙烯酰胺，灭菌双蒸水定容至1L，置棕色瓶中4℃保存；

10％过硫酸胺：1g过硫酸胺，灭菌双蒸水定容至10mL，4℃避光保存；

50％甘油(体积浓度)：甘油50mL与50mL灭菌双蒸水混匀，室温保存；

10×TBE：Tris碱108g、硼酸55g、0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)100mL，加水充分溶解，定容至1L；

(2)SSCP DNA上样缓冲液(100mL)：98％去离子甲酰胺、2％甘油、0.01mol/mlEDTA、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青。

(3)银染试剂：

20％AgNO₃溶液：AgNO₃20g，加灭菌双蒸水定容至100mL，棕色瓶常温保存；

3.6％NaOH溶液：NaOH3.6g，加灭菌双蒸水定容至100mL，常温保存；

1％柠檬酸钠溶液：柠檬酸钠1g，灭菌双蒸水溶解，定容至100mL，室温存放；

染色液(200mL)：氨水2ml、3.6％NaOH溶液4.2mL、20％AgNO₃溶液3.6mL，加蒸馏水至200mL；

显色液(200mL)：1％柠檬酸钠溶液1mL、甲醛100uL，加蒸馏水至200mL。

二、利用步骤一的试剂盒筛查部分中国荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者

1、可疑公牛精液

根据奶牛发达国家公布荷斯坦公牛CVM检测结果，结合系谱筛选可疑公牛名单，自北京奶牛中心、天津奶牛发展中心、河北省畜牧良种工作站，共采集68头中国荷斯坦公牛冷冻精液。

2、精液DNA的提取

按照如下文献第27页描述的DNA提取方法提取精液的基因组DNA：陈慧勇.利用中国荷斯坦定位BTA6上影响产奶性状的QTLs[D].北京：中国农业大学，2005。

3、引物和PCR扩增

根据GenBank数据库中奶牛SLC35A3的基因序列(GenBank Accession NumberAY160683)，在其外显子4的第559位(即GenBank Accession Number AY160683的自5′端第9871位)的点突变两侧设计引物，正向引物的序列为：AGC TCT CCT CTGTAA TCC(序列1)，反向引物的序列为：TCT CAA AGT AAA CCC CAG(序列2)。该引物由奥科生物公司合成。

PCR扩增反应总体系为25μL，其中精液的基因组200ng，两个引物的终浓度均为1pmol/L，四种dNTP的浓度均为0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶2U，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2.5mL。扩增条件为先94℃预变性5min；然后94℃30s，59℃30s，72℃30min，共35个循环；最后72℃延伸7min。将PCR扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。

对68头CVM可疑中国荷斯坦奶公牛SLC35A3基因的PCR扩增均得到一条清晰的249 bp的DNA片段，部分个体的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1。图1中，泳道M：pBR322AluI marker；泳道2-5：PCR产物；泳道-：阴性对照(PCR反应体系中不加模板DNA)。该68头CVM可疑荷斯坦奶公牛的阴性对照无扩增产物，继续SSCP分析。

4、SSCP检测

取3μLPCR扩增产物与7μL上样缓冲液混合均匀，98℃变性10min，立即冰浴10min后上样，进行丙烯酰胺的质量浓度为14％、交联度为1∶30的PAGE，10V/cm电压，4℃，电泳16h左右。

银染参考《分子克隆实验指南》第三版，具体方法如下：

将凝胶取下，放入托盘中，加70％乙醇，摇床上轻摇固定15-30min；蒸馏水洗胶3遍，每次1-2min；加200ml染色液染色30-40min；蒸馏水洗胶3遍，每次1-2min，洗去多余的染色液；加200ml显色液显色约10-30min，条带清晰时，弃显色液。用蒸馏水洗胶，保鲜膜封好，拍照，4℃保存。

该68头CVM可疑荷斯坦奶公牛的PCR-SSCP结果共发现两种带型，对应两种基因型，将得到两条带的基因型命名为AA，得到四条带的基因型命名为AB，部分个体的SSCP电泳结果如图2。图2中，泳道1、3、6、8：AA基因型；泳道2、4、5、7：AB基因型；泳道9：阴性对照(PCR反应体系中不加模板DNA)。

PCR-SSCP结果表明，该68头CVM可疑荷斯坦奶公牛中，有10头的基因型为AB，58头的基因型为AA。

5、序列分析

将该68头CVM可疑荷斯坦奶公牛的249bp PCR产物进行序列分析。测序采用PCR产物直接测序方法，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。结果表明该249bpPCR产物是自GenBank Accession Number AY160683的5′端第9671位至9919位脱氧核糖核苷酸；表明所有AA基因型个体(58头)的SLC35A3的外显子4的第559位(即GenBank Accession Number AY160683的自5′端第9871位)碱基为G，基因型为纯合，即非CVM携带者(TV)；所有AB基因型个体(10头)的SLC35A3的外显子4的第559位(即GenBank Accession Number AY160683的自5′端第9871位)位碱基同时含有G和T，为杂合基因型，即CVM基因携带者(CV)，序列分析结果如图3A和图3B。图3A和图3B中，箭头所示为点突变碱基，AA型个体为G碱基，AB型个体为杂合G/T。

该测序结果与PCR-SSCP结果一致，说明PCR-SSCP结果准确。该68头CVM可疑携带者中，共有10头CVM基因携带者(基因型为AB)，58头非CVM基因携带者(基因型为AA)。CVM基因携带者个体占检测个体总数的15％。

对所有公牛个体重复进行PCR-SSCP分析，两次实验结果完全一致，证明本研究所建立的CVM检测方法稳定，结果可靠。

根据系谱分析推测的240头中国荷斯坦公牛可疑携带者中，按照传递概率计算潜在携带者48头，比例高达20％。这些公牛都属各地方应用广泛公牛，女儿数在奶牛群中可达500头以上，造成了潜在的不可忽略的隐患，即CVM基因在牛群中基因频率大大提高，因此需要采用准确、快速、简便的检测方法，对中国荷斯坦奶牛群进行一次普查，对携带者个体进行标识，与国际接轨奶牛育种，逐步淘汰CVM基因。

序列表

<160>2

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

agctctcctc tgtaatcc

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

 tctcaaagta aaccccag

Claims (10)

1、一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的试剂盒，包括PCR-SSCP分析试剂，所述PCR-SSCP分析试剂包括扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸的5′侧41-200bp和3′侧45-328bp的PCR引物。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR-SSCP分析试剂包括扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸5′侧200bp和3′侧48bp核苷酸序列的PCR引物。

3、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述一对PCR引物的核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2。

4、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR-SSCP分析试剂还包括扩增87-529bp PCR产物所需的DNA聚合酶、PCR缓冲液、dATP、dGTP、dCTP、dTTP。

5、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR-SSCP分析试剂还包括SSCP DNA上样缓冲液，交联度为1∶30、丙烯酰胺的质量浓度浓度为10-14％的聚丙烯酰胺凝胶液，银染试剂。

6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶液的丙烯酰胺的质量浓度为14％、交联度为1∶30。

7、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR-SSCP分析试剂还包括溴化乙锭，N，N，N’，N’-四甲基二乙胺。

8、筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的PCR引物，是扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸的5′侧41-200bp和3′侧45-328bp的PCR引物。

9、根据权利要求8所述的PCR引物，其特征在于：所述PCR引物是扩增SLC35A3基因外显子4的第559位脱氧核糖核苷酸的5′侧200bp和3′侧48bp核苷酸序列的PCR引物。

10、根据权利要求9所述的PCR引物，其特征在于：所述PCR引物的核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2。

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