CN112746116B - 凡纳滨对虾雌性dna标签序列和引物及其在性别鉴定中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种凡纳滨对虾雌性个体DNA的标签序列LvSDP，该序列在雌雄个体具有明显的PCR扩增差异，根据该序列，本发明设计了一种新型简便的对凡纳滨对虾的遗传性别进行鉴定的方法，利用引物(LvSDPF:ACGTAAGCCAAGAGAGGGAA和LvSDPR:TCAAGATGGCTGGCTTTGTTG)对凡纳滨对虾的DNA进行PCR扩增，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行分析，在雌性个体中能够扩增出470bp的单一条带，而在雄性个体中无扩增产物，即可实现对其性别的快速鉴定。本发明提供的对虾的遗传性别鉴定方法操作简便，准确率高，在凡纳滨对虾的性别控制和全雌苗种培育中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于水产动物性别控制研究领域，具体涉及一种凡纳滨对虾雌性DNA标签序列及其在性别鉴定中的应用。
背景技术
凡纳滨对虾是我国乃至世界养殖产量最高的对虾品种，在我国的养殖年产量达150万吨，世界养殖年产量近400万吨。养殖产业的发展离不开种业的创新，培育生长速度快的品种是遗传育种的首要目标。对虾雌雄个体在性成熟后生长差异显著，雌性显著大于雄性，因此培育和筛选全雌苗种对于提高养殖产量具有重要意义。
凡纳滨对虾的性别决定方式为ZW/ZZ型，雌性个体为ZW杂合型，雄性个体为ZZ纯合型。全雌或者高雌性比例苗种获得的一种方式是早期筛选，即在幼虾时期仅筛选出雌性个体进行养殖，从而提高雌性个体比例和提高养殖产量；另外一种方式是通过生殖和遗传操作方式培育出假雄个体(ZW)，将假雄个体与雌性个体(ZW)进行交配后筛选超雌个体(WW)，之后将超雌个体与雄性个体(ZZ)交配生产全雌个体(ZW)。
不管是通过早期筛选技术还是生殖遗传操作技术，首先需要建立快速准确的遗传性别鉴定方法。前期研究已经鉴定到了凡纳滨对虾雌雄差异的SNP位点(Yang Yu,XiaojunZhang,Jianbo Yuan,Quanchao Wang,Shihao Li,Hao Huang,Fuhua Li,JianhaiXiang.Identification of sex-determining loci in Pacific white shrimpLitopeneaus vannamei using linkage and association analysis.MarineBiotechnology,2017,19(3):277–286)，并根据此SNP位点建立了遗传鉴定的方法(李富花，于洋，张晓军，相建海。一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA探针序列及获取方法，专利号：ZL 201510245304.9)。由于SNP位点的分型需要测序、HRM等SNP分型仪器，因此操作较为复杂，且对实验条件的要求较高。
本发明在前期研究的基础上，发掘了一段雌雄差异的序列，该序列在雌雄个体中PCR扩增的产物具有明显的差异。根据此差异序列，本发明建立了一种新型简便的凡纳滨对虾遗传性别鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种凡纳滨对虾雌性DNA标签序列及其在性别鉴定中的应用，将促进凡纳滨对虾遗传性别筛选和性别控制研究。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种凡纳滨对虾雌性个体DNA的标签序列，具有LvSDP所示的序列，该序列在雌雄个体的DNA中具有明显的差异，具体表现为：(1)按照该序列的1bp-1296bp所在位置范围内设计引物使用Taq酶进行PCR扩增时，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行分析，仅在雌性个体中能够扩增出条带，雄性个体无条带；(2)该序列的1531bp-1539bp序列为雌性特有，其他序列雌雄均存在。
本发明根据上述雌雄差异序列建立了一种适用于凡纳滨对虾的新型简便的遗传性别鉴定的方法：
(1)取凡纳滨对虾幼虾的附肢，之后将幼虾单独放到一个烧杯或者其他容器中单独养殖，并做好标记。
(2)对所取的每个附肢进行DNA提取，之后使用如下体系对每个个体的DNA进行PCR扩增：12.5μl 10×Golden polymerase Buffer(天根生化科技(北京)有限公司),0.5μlLvSDPF:ACGTAAGCCAAGAGAGGGAA，0.5μl LvSDPR:TCAAGATGGCTGGCTTTGTTG，0.25μl Goldenpolymerase(天根生化科技(北京)有限公司),2μl DNA模板，9.75μl超纯水。扩增程序为：94℃5分钟，之后94℃30秒，60℃30秒,72℃30秒，共计35个循环，最后72℃延伸10分钟。
(3)对扩增的PCR产物使用琼脂糖电泳进行检测，如果在扩增片段大小为470bp位置出现单一条带，则判别该个体为雌性；如果没有扩增条带，则该个体为雄性。
通过本发明凡纳滨对虾雌雄差异序列LvSDP设计的其他引物及其在性别鉴定中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的凡纳滨对虾雌雄差异序列及其在性别鉴定标记中的应用，操作简单，鉴定的准确率高。相较于SNP位点的差异，此序列差异更为明显，便于实现便捷快速的检测，便于育种现场的应用。
凡纳滨对虾雌性个体在性成熟后的体重显著大于雄性，培育全雌苗种对于提高养殖产量具有重要意义。本发明方法不需要昂贵的实验仪器和特殊的实验场地，便于在现场实现大量个体的快速检测。本发明提供的对虾的遗传性别鉴定方法操作简便，准确率高，在凡纳滨对虾的性别控制和全雌苗种培育中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：凡纳滨对虾雌雄个体遗传性别鉴定结果。在所有雌性个体中均扩增出470bp的目的条带，在雄性个体中无明显扩增条带。图片中自左向右泳道1-16分别为“厄瓜多尔”雄性1号个体、“厄瓜多尔”雄性2号个体、“墨西哥”雄性1号个体、“墨西哥”雄性2号个体、“海大集团”雄性1号个体、“海大集团”雄性2号个体、“科海1号”雄性1号个体、“海壬1号”雄性个体、“厄瓜多尔”雌性1号个体、“厄瓜多尔”雌性2号个体、“墨西哥”雌性1号个体、“墨西哥”雌性2号个体、“海大集团”雌性1号个体、“海大集团”雌性2号个体、“科海1号”雌性1号个体、“海壬1号”雌性个体。
具体实施方式
实施例1：一种凡纳滨对虾雌性DNA标签序列及其在性别鉴定中的应用
(1)不同来源的雌雄个体
从市场上收集多种不同来源的种质材料，具体包括：凡纳滨对虾“海壬1号”新品种雌雄个体各32尾，凡纳滨对虾“科海1号”新品种雌雄个体各16尾，厄瓜多尔不同来源的种质材料雌雄各32尾，墨西哥种质材料雌雄各8尾，广东海大集团种质材料雌雄各8尾。上述不同来源的种质材料雌雄各96尾，每种种质材料的个体均分别取附肢用酒精浸泡后进行DNA提取。
(2)样本DNA提取
使用基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)分别提取上述192个个体组织DNA(作为DNA模板)，具体操作步骤参考试剂盒说明书，每个个体的DNA使用核酸浓度测定仪Nanodrop1000测定浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
(3)LvSDP序列的获得
使用扩增LvSDP的引物对LvSDPF1：ATATCCTAGCTGGCATGTAGAGC和LvSDPR:TCAAGATGGCTGGCTTTGTTG分别扩增雌雄个体，PCR扩增体系如下：12.5μl 10×Goldenpolymerase Buffer(天根生化科技(北京)有限公司),0.5μl LvSDPF，0.5μl LvSDPR，0.25μl Golden polymerase(天根生化科技(北京)有限公司),2μl DNA模板，9.75μl双蒸水。PCR扩增程序为：94℃5分钟，之后94℃30秒，60℃30秒,72℃30秒共计35个循环，最后72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示仅在雌性个体中能够扩增出条带，所有雄性个体中均无条带。将雌性个体的条带经过连接转化后测序，获得雌性特异性序列LvSDP。
序列表
SEQ ID No.1的信息
(a)序列特征
*长度：1549碱基对
*类型：核苷酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：核酸
序列描述：SEQ ID No.1
>LvSDP
ATATCCTAGCTGGCATGTAGAGCGGGTTAAACACAACCTTTCCTCGAGGTCCAGCGTCGCCACAGTTAGCGGGTAATCCAGGGTAAGCACACAGACACAATAGAGGCAATCCCCGTACAGGTTTATTCAGAAAGGGTTTATACACAGTCGGACCACGAGACTGTGGCATCAATTATTTCAACAAACTTAATTACAATCATTTATGAATAGATTATTGAACAAACGTGAAAAACAGCAAACAATGATAAATAGAATAGGCAGAGAAATCCAAAAATGTACGCAAAAAACATAAAAATAAGAAAAATAGTGCACTAAAAGCACTGTTAACAAAATAGAAGAGTATCTTCGAACATTAAAATAACCATCAGAAGTAAGTAAAAATATACAACAGTAAATGTGGTTATTCGGGTCTCGAATAACCACATTAATTCATATAAAGAATAATAAAGCAGGTGACGTGGCAGGCCGTAAGTATAAAAGAAACATATTCAAAAGTCCATAAAATAAGTAACCAAGATAAAAATAAAACTTTATAATTATTAAATTTGAATTAAAGTATTTTTAAAATTCATTAAATCCACAAATAACTTAAAATAAACGAAGTTCTAAAATACGTCGGGGGGGAGTTATTATGAAAATAGCTTATCCTTGAAAGCCATGAAAGTAAAATAATAAATCAAAGTAAAATAATAAATATATAAAATTGAAATATGTTTAGGACCTCATCTACTTTTTAAAAAGGAGATTTCACACTTAAAATACGGGCCACCTGGCTTCTTCGGTCACTCAGTGGTTCGAAGGATTCGGAGCACCAGGAGGAAACTCGAAACAATTGTTTTAAAACCGTTTTACTTATACATTTAATATATAGAAAGAACAGCTTGGCAGTAATAATATGTGGCCGTGTTGTCTGCGTGGCGAGAACCATCCCCAGCGTGTTAGAGCGCCGCCTGCTGGATTACCTAAGGTTCGGGACCAAGGATTGAGGGTGTCAAGGGGGCAGGTAGGGAAATAGGGTGGAGGATAGGGTAGGTACAAGGACGTAAGATTAAGAAAAAGAACGGAAAGGAGAGAAATAAACGTAAGCCAAGAGAGGGAAATGAAAGAAATAAGTAAAAGATTACCAAAAGAAAGGGAAAATAGTAGAAAATGAGGGAGAAATTAGTATGTGAGAAAAGTAATTGAAGAGAATAGATCTCAAAGTAAAAGAGGAATGAAGGCATATGATCGTAATAAATGAAAAAGGAAGGAGCGAGAGAGGAGGAAAACCTGGAACAGAAAGCAAGATAGCATAACGAAGAACAGGAAAAGTAGAAAACGAGGAGATTAGGAAAGAGGAGAAAGGATAGAAAAGAAAAGAGGAAAGCAGGATAGATAAGAGTTAACGAAAGAAACCGTGGGGGAAGCCTAAGAGAAACAAGGGTAAGGAGGAGAATAAGGGAGGGAGAAGGCAAGGGGCGTGGTGCAGGATGGAGGAGGGCCCCCGGGGGAGTGGAGTCGGAGACCTCACAATATTCTTGCCGATGTTCAACAAAGCCAGCCATCTTGA
(4)LvSDP雌雄扩增差异分析。
将LvSDP序列与基因组组装数据比对(http://www.shrimpbase.net/vannamei.html)，发现该序列比对上基因组参考序列LVANscaffold_1034，其中在LvSDP序列的1294-1394bp预测为重复序列，由于重复序列较难进行测序，因此分别在重复序列两侧设计引物，在1bp-1293bp范围内设计引物F1：ATATCCTAGCTGGCATGTAGAGC和R1：GTCCCGAACCTTAGGTAATCCAG，以及F2：TAATCCAGGGTAAGCACACAGAC和R2：CCCCGACGTATTTTAGAACTTCG，使用Taq酶PCR扩增所有个体后(扩增体系和程序同步骤(3))后，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行分析，发现仅在雌性个体中有条带，雄性个体中无条带。
根据基因组参考序列设计引物扩增和测序的1395bp-1549bp序列，经测序后发现所有的雄性个体均不含有1531bp-1539bp的序列，即雄性个体中缺少LvSDP序列中的1531bp-1539bp的序列，而LvSDP序列中的其他序列雌雄均存在。
(5)一种简易性别鉴定方法
使用本发明所筛选的性别鉴定引物对LvSDPF:ACGTAAGCCAAGAGAGGGAA、LvSDPR:TCAAGATGGCTGGCTTTGTTG对步骤(2)所提取的DNA分别进行PCR扩增，扩增体系如下：12.5μl10×Golden polymerase Buffer(天根生化科技(北京)有限公司),0.5μl LvSDPF，0.5μlLvSDPR，0.25μl Golden polymerase(天根生化科技(北京)有限公司),2μl DNA模板，9.75μl双蒸水。扩增程序为：94℃5分钟，之后94℃30秒，60℃30秒,72℃30秒共计35个循环，最后72℃延伸10分钟。
上述PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果显示在96个雌性个体的电泳结果中均扩增出470bp的条带，而在96个雄性个体的电泳结果中均无扩增条带，其中部分个体的电泳结果如图1所示，通过本发明建立的分子遗传鉴定的结果与性别表型完全一致，针对不同来源种质材料的遗传性别鉴定的准确率为100％。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 凡纳滨对虾雌性DNA标签序列和引物及其在性别鉴定中应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1549
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atatcctagc tggcatgtag agcgggttaa acacaacctt tcctcgaggt ccagcgtcgc 60
cacagttagc gggtaatcca gggtaagcac acagacacaa tagaggcaat ccccgtacag 120
gtttattcag aaagggttta tacacagtcg gaccacgaga ctgtggcatc aattatttca 180
acaaacttaa ttacaatcat ttatgaatag attattgaac aaacgtgaaa aacagcaaac 240
aatgataaat agaataggca gagaaatcca aaaatgtacg caaaaaacat aaaaataaga 300
aaaatagtgc actaaaagca ctgttaacaa aatagaagag tatcttcgaa cattaaaata 360
accatcagaa gtaagtaaaa atatacaaca gtaaatgtgg ttattcgggt ctcgaataac 420
cacattaatt catataaaga ataataaagc aggtgacgtg gcaggccgta agtataaaag 480
aaacatattc aaaagtccat aaaataagta accaagataa aaataaaact ttataattat 540
taaatttgaa ttaaagtatt tttaaaattc attaaatcca caaataactt aaaataaacg 600
aagttctaaa atacgtcggg ggggagttat tatgaaaata gcttatcctt gaaagccatg 660
aaagtaaaat aataaatcaa agtaaaataa taaatatata aaattgaaat atgtttagga 720
cctcatctac tttttaaaaa ggagatttca cacttaaaat acgggccacc tggcttcttc 780
ggtcactcag tggttcgaag gattcggagc accaggagga aactcgaaac aattgtttta 840
aaaccgtttt acttatacat ttaatatata gaaagaacag cttggcagta ataatatgtg 900
gccgtgttgt ctgcgtggcg agaaccatcc ccagcgtgtt agagcgccgc ctgctggatt 960
acctaaggtt cgggaccaag gattgagggt gtcaaggggg caggtaggga aatagggtgg 1020
aggatagggt aggtacaagg acgtaagatt aagaaaaaga acggaaagga gagaaataaa 1080
cgtaagccaa gagagggaaa tgaaagaaat aagtaaaaga ttaccaaaag aaagggaaaa 1140
tagtagaaaa tgagggagaa attagtatgt gagaaaagta attgaagaga atagatctca 1200
aagtaaaaga ggaatgaagg catatgatcg taataaatga aaaaggaagg agcgagagag 1260
gaggaaaacc tggaacagaa agcaagatag cataacgaag aacaggaaaa gtagaaaacg 1320
aggagattag gaaagaggag aaaggataga aaagaaaaga ggaaagcagg atagataaga 1380
gttaacgaaa gaaaccgtgg gggaagccta agagaaacaa gggtaaggag gagaataagg 1440
gagggagaag gcaaggggcg tggtgcagga tggaggaggg cccccggggg agtggagtcg 1500
gagacctcac aatattcttg ccgatgttca acaaagccag ccatcttga 1549
Claims (2)
1.一种凡纳滨对虾雌性DNA标签序列在凡纳滨对虾遗传性别鉴定中的应用，其特征在于：所述凡纳滨对虾雌性DNA标签序列为SEQ ID No .1所示，使用正向引物LvSDPF:ACGTAAGCCAAGAGAGGGAA，反向引物LvSDPR: TCAAGATGGCTGGCTTTGTTG，使用非高保真Taq酶通过PCR扩增凡纳滨对虾DNA，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行分析，如果在470bp位置出现单一条带，则该个体为雌性，如果在470bp位置处没有条带，则为雄性。
2.根据权利要求1所述的遗传性别鉴定的应用，其具体过程为：
（1）取凡纳滨对虾的附肢和/或肌肉，并做好标记；
（2）对所取的附肢和/或肌肉进行DNA提取，获得DNA模板，之后使用如下体系对每个个体的DNA进行PCR扩增：12.5 μl 10×PCR扩增 缓冲液, 0.5 μl 正向引物LvSDPF，0.5 μl反向引物LvSDPR，0.25 μl 普通Taq酶, 2 μl DNA模板，9.75μl 超纯水；扩增程序为：94℃ 5分钟，之后94℃ 30 秒，60℃ 30 秒, 72℃ 30秒，共计35个循环，最后72℃延伸10分钟；
（3）对扩增的PCR产物使用琼脂糖电泳进行检测，如果在扩增片段大小为470bp位置出现单一条带，则判别该个体为雌性；如果没有扩增条带，则该个体为雄性。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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