CN113981108B - 团头鲂遗传性别鉴定的分子标记及其应用 - Google Patents

团头鲂遗传性别鉴定的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种团头鲂遗传性别鉴定的分子标记及其应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明所得标记为显性标记，操作简便，成本低，实验周期短，可应用于团头鲂规模化雌雄鉴定，获得雄性率数据。

Description

团头鲂遗传性别鉴定的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及水产动物繁殖育种技术领域，具体涉及一种团头鲂遗传性别鉴定的分子标记及其应用。
背景技术
团头鲂，又名武昌鱼，其分布于长江中下游，是我国主要的淡水养殖鱼类之一。自从1955年，团头鲂被易伯鲁研究员命名之后，研究者们开始围绕团头鲂进行了各个方面的研究。1991年，开展了团头鲂染色体G带的研究，随后，也开展了团头鲂、人工四倍体团头鲂、杂交鲂的核型研究。对团头鲂的核型进行了鉴定后发现团头鲂的核型公式为2n＝18m+26sm+4st。然而，未能发现可用于区分性别的性染色体。因此，团头鲂的性别决定机制是XX-XY、ZZ-ZW仍然是一个需要去解决的问题。
2012年，在团头鲂分布较广的3个地理区域(鄱阳湖、淤泥湖、梁子湖)进行了采样，试图通过AFLP(Amplified fragment length polymorphism)分子标记技术来鉴别团头鲂的性别。然而，所得到的3个标记均未能100％鉴别团头鲂的性别。此后，2017年，再次尝试通过RAD-seq技术构建团头鲂遗传连锁图谱。通过分析用于测序的个体包括2个亲本和187个子代，共鉴定了42784SNPs，其中14648高可行度的SNPs被用于构建雌性遗传图谱和雄性遗传图谱。不幸运的是，同样未能找到可用于鉴别团头鲂性别的分子标记。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种团头鲂遗传性别鉴定的分子标记及其应用，本发明基于重测序技术鉴定出团头鲂雄性特异性片段，可有效用于团头鲂遗传性别的鉴别，其具有低成本且高效的特点，经检测，该筛选及鉴定方法能有效鉴别团头鲂遗传性别，该方法操作简便，实验步骤少、成本低，能广泛应用在生产实践中。
为实现上述目的，本发明所设计一种团头鲂遗传性别鉴定的分子标记node96，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种团头鲂雄性特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种获得权利要求1所述分子标记的引物对，所述引物对node96-F/R为：
正向引物node96-F：5’-TGTCATGATGCTTCAGGGGG-’3；
反向引物node96-R：5’-AGTGCTACAGAATTACCTGCA-’3。
本发明还提供了一种权利要求1所述分子标记node96在团头鲂性别鉴定中的应用。
本发明还提供了一种权利要求3所述引物对node96-F/R在团头鲂性别鉴定中的应用。
本发明还提供了一种鉴定团头鲂雌雄性别的方法，包括以下步骤：
1)提取待鉴定团头鲂样品的DNA；
2)以待鉴定团头鲂样品的DNA为模板，并以下引物对进行PCR，其中，所述引物对node96-F/R为：
正向引物node96-F：5’-TGTCATGATGCTTCAGGGGG-’3；
反向引物node96-R：5’-AGTGCTACAGAATTACCTGCA-’3；
3)检测PCR产物：
PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测：
若电泳条带中含有306bp的条带时，该待鉴定团头鲂为雄性团头鲂；
或，若电泳条带中没有条带时，该待鉴定团头鲂为雌性团头鲂。
本发明团头鲂雄性特异性片段开发和筛选采用以下步骤：
(1)挑选团头鲂雌雄个体，通过解剖观察生理性别后，选取10尾雌性团头鲂、10尾雄性团头鲂，剪取各个体尾鳍作为待测样本；
(2)采用常规醋酸铵法提取DNA样本，使用Thermo NanoDrop 2000分光光度计和1.2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，选取质量合格的雌雄团头鲂DNA样本；将10个雌团头鲂和10雄团头鲂DNA样品分别构建重测序文库；使用华大BGI测序仪进行测序并获得测序数据；
(3)以雌性团头鲂三代测序基因组为参考序列，将所有的团头鲂个体测序数据比对到参考基因组上，获得未比对上的片段。随后，将雌性未比对上的片段进行组装，构建新的参考序列。将雄性未比对上的片段比对到上述的参考序列上，获得最终的未能比对上的片段。最后，根据这些片段进行序列组装，获得雄性特异性片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
基于上述雄性特异性片段筛选团头鲂遗传性别鉴定的分子标记的标注如下：
1)选取团头鲂雄性特异性DNA序列，利用Primer3Web选取标记准确性最高的引物作为遗传性别标记的引物；
2)利用步骤1)中设计的引物进行PCR扩增；
3)采用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，选出符合要求的引物，筛选标准如下：
目标区域，雄性团头鲂PCR产物中出现明亮条带，且片段大小一致；
目标区域，雌性团头鲂PCR产物中无条带；
S4、性别分子标记判别率计算：
通过对初步筛选的雌雄分子标记进行扩大群体验证，计算各个标记判别的准确性；其具体步骤如下：
1)以上述雄性特异性片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)设计引物对node96-F/R：
正向引物node96-F：5’-TGTCATGATGCTTCAGGGGG-’3；
反向引物node96-R：5’-AGTGCTACAGAATTACCTGCA-’3；
2)以含有上述特异性片段的雄性团头鲂的基因组为模板，进行PCR，PCR扩增具体为：
PCR扩增体系为10μL，各组分为：PreMix PCR buffer，5μL；引物(SEQ ID:1/2)各0.5μL；DNA模板，0.5μL；灭菌水，3.5μL；
PCR扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min。冷却至4℃；
得到PCR产物，测序，得到分子标记node96，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，用于鉴定团头鲂的遗传性别。
本发明的有益效果：
(1)本发明所得标记为显性标记，操作简便，成本低，实验周期短，可应用于团头鲂规模化雌雄鉴定，获得雄性率数据。
(2)本发明为团头鲂性别分子标记的开发做了大量的实验验证。预期可以应用于不同的团头鲂群体。能准确获得团头鲂基因性别，填补团头鲂性别分子标记空缺，为目前唯一的一种基于DNA序列能有效鉴别团头鲂遗传性别的分子标记。
(3)本发明的一对分子标记引物，基于团头鲂雄性特异性的DNA分子片段，在PCR扩增过程中，引物具有特异性强、扩增效率高等特点，PCR产物只需琼脂糖凝胶电泳检测便可直观的进行区分，具有简便、快速、高效、准确和低成本的特点。
附图说明
图1为准确性最高的引物扩增团头鲂雌雄DNA样本电泳图
图中，从左至右，依次为DL2000 DNA Plus Marker；为31尾雄性团头鲂PCR产物；30尾雌性团头鲂PCR产物；最右侧为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
鉴定团头鲂雌雄性别的方法，包括以下步骤：
1)团头鲂的选择：在华中农业大学水产学院实验教学基地养殖的“华海1号”(品种登记号：GS-01-001-2016)挑选团头鲂成鱼61只，按外部形态进行性别分类，分为雄鱼31只、雌鱼30只；
2)采样：对每尾团头鲂的尾鳍组织进行取样。使用消毒后的剪刀沿尾鳍外缘剪取少量尾鳍，并将其放入PBS中进行清洗，之后放入装有纯酒精的2ml EP管中进行脱水，在管壁上标记编号及雌雄信息，将样品带回实验室，在﹣80℃冰箱中进行保存；
3)提取团头鲂DNA：将EP管中的鳍条取出，通过挤压，用滤纸吸干酒精，采用经典的酚氯仿法来提取其DNA，通过检测其DNA纯度及琼脂糖凝胶电泳，取合格的DNA样本进行后续的分析；
4)PCR扩增体系为10μL，各组分为：PreMix PCR buffer(Takara,RR901A)，5μL；Forwad primer,0.5μL；Reverse primer,0.5μL；DNA模板，0.5μL；灭菌水，3.5μL。PCR扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min。冷却至4℃，选取标记准确性最高的引物作为遗传性别标记的引物对node96-F/R为：
正向引物node96-F：5’-TGTCATGATGCTTCAGGGGG-’3；
反向引物node96-R：5’-AGTGCTACAGAATTACCTGCA-’3；
5)采用引物对node96-F/R对团头鲂雄31个个体，雌30个个体进行检测，结果雄性可以扩增出一条306bp的条带，而雌鱼不能(见图1)。
图1可以看出：雄性团头鲂存在条带，雌性团头鲂未能扩增出条带。分子标记判别率达到100％。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 团头鲂遗传性别鉴定的分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 306
<212> DNA
<213> 团头鲂(Megalobrama amblycephala)
<400> 1
tgtcatgatg cttcaggggg tctggagctt aaatcagaca tgaatgatgt ggacgagcag 60
atcacccatc atctgaccgg cgagaacgat gacgaaacac ctgccgctgg gacaaggtga 120
catacttcta ttacagctct gctaagcatc ataacacatt aatgagaaac aagttatcat 180
tcaaatatta atacattgat taaaagttat aacatataaa ataaaaagtt aggctcaatt 240
ataacatcta atcttgacat ttttattatt ttgctgcaat taatttgcag gtaattctgt 300
agcact 306
<210> 2
<211> 1520
<212> DNA
<213> 团头鲂(Megalobrama amblycephala)
<400> 2
acagtaattt ttaaacaata gttgggttaa ataaaactac ccagcacgtt gggcaaacat 60
ttaacccaac cgctgggtta aaacaaccca atcgctgggt ttgtccattt tcaacccaac 120
atgggttgtt tttaacccag cattttttag agtgtagtaa gaaaagcatt tctgactatg 180
taaaatggta atttcaacaa atcaattctt gatatcaata attgaatttg aatgacagca 240
tatggtgtaa tttcactagt gaaaatacag atatcaagtg ttctacatcc gaacgccagc 300
tcattattag ccgaagcttg tcacatgagc agctcaacgc agattgagat gccattcatt 360
cattcattct gttctgactg tcctgtaata ctgacctttc tcaaatctga tatgtcatga 420
tgcttcaggg ggtctggagc ttaaatcaga catgaatgat gtggacgagc agatcaccca 480
tcatctgacc ggcgagaacg atgacgaaac acctgccgct gggacaaggt gacatacttc 540
tattacagct ctgctaagca tcataacaca ttaatgagaa acaagttatc attcaaatat 600
taatacattg attaaaagtt ataacatata aaataaaaag ttaggctcaa ttataacatc 660
taatcttgac atttttatta ttttgctgca attaatttgc aggtaattct gtagcactaa 720
caatattaac accctaaacc cttaatgaaa tttcaaaaaa caaacaacaa ctttttttaa 780
agatttcatt ttatgtttcg tctaaagttt ctatatacgg aaaaaaagga ctattgtttt 840
gtcaagcttc aacgtttttc agggcaagga gggaaccctg atacaagatg tgtcaaacag 900
agcttttaag cctatagctg tcgatattaa tagaaaccaa tcatattaag tagattagat 960
ctatgcatgt cattgttgtt gcacatgcat gtctgtatta cttttcattg ttaaaattga 1020
gatttgtgca tcataataag catatatgtt gtgaaaaaaa ttataattca tgagttgttc 1080
acagtgactg ttcacaaatc actgagcatg tgaaattagt ttaggttctc tagtaacgtg 1140
aagataatgt gtagcaacag ctccacacag tggtctaata atgtggttta aatgttagaa 1200
aaagaaatgc atttaagtca tcttgttata acaaaagtgg acatttctgt agaatgaccc 1260
aaatatgaca gcgcgcatca gcgcatacga gcaactaagt atctcttcag taaacagacg 1320
agcaaactgc agcaaaagaa actgaaagta agtcgtagat gctcaaaaca caatcatctt 1380
cattaaagta atgagactag actaaatgat cttaccattg atgtcgtcgc tctctcctat 1440
tgcggtcttt gattttgaaa ttttctgatg atcaataaaa tgcagctcgt atttgctgct 1500
ttcagtgaca tgaactacat 1520
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 3
tgtcatgatg cttcaggggg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 4
agtgctacag aattacctgc a 21

Claims (4)

1.一种团头鲂遗传性别鉴定的分子标记node96，其特征在于：所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种团头鲂雄性特异性片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种引物对node96-F/R在团头鲂性别鉴定中的应用，其特征在于：所述引物对node96-F/R为：
正向引物node96-F：5’-TGTCATGATGCTTCAGGGGG -3’；
反向引物node96-R：5’-AGTGCTACAGAATTACCTGCA -3’。
4.一种鉴定团头鲂雌雄性别的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）提取待鉴定团头鲂样品的DNA；
2）以待鉴定团头鲂样品的DNA为模板，并以下引物对进行PCR，其中，所述引物对为：
正向引物F：5’-TGTCATGATGCTTCAGGGGG -3’；
反向引物R：5’-AGTGCTACAGAATTACCTGCA -3’；
3）检测PCR产物：
PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测：
若电泳条带中含有306bp的条带时，该待鉴定团头鲂为雄性团头鲂；
或，若电泳条带中没有条带时，该待鉴定团头鲂为雌性团头鲂。
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Sex-specific markers developed by next_generation sequencing confirmed an XX/XY sex determination system in bighead carp (Hypophthalmichehys nobilis) and silver carp (Hypophthalmichthys molitrix);HaiyangLiu et al.;《Dna Research》;20180105;第25卷(第3期);第3.5节 *

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