CN117757951B - 团头鲂遗传性别特异分子标记、检测引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，公开了团头鲂遗传性别特异分子标记、检测引物及应用。本发明基于高通量测序技术及雌雄基因组差减比较分析成功筛选到3个团头鲂雄性特异DNA片段，所述的3个特异性DNA片段分别为SEQ ID NO.1~3所示。针对3个特异性片段中任意一个，设计引物利用常规PCR扩增和普通琼脂糖电泳能够准确快速鉴定出团头鲂的遗传性别。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点，能够在团头鲂早期发育阶段确定个体性别，进而控制后备亲鱼群体的性比，降低养殖和维护成本，加快团头鲂性控育种进程，进一步推动团头鲂遗传改良与种质保护工作。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及团头鲂遗传性别特异分子标记、检测引物及应用。
背景技术
团头鲂(Megalobrama amblycephala)隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲂属(Megalobrama)，又称武昌鱼，自然分布于我国长江中下游及其附属水体，是我国特有的重要淡水养殖品种。然而在长期养殖过程中，由于缺乏对种质资源的保护，导致团头鲂养殖群体先后出现了个体大小不均、生长速度减慢、性成熟提早等不良趋势，阻碍了团头鲂养殖业的进一步扩大。此外，随着团头鲂“浦江1号”、“华海1号”、“浦江2号”新品种和无肌间刺团头鲂新种质的出现，育种单位和企业在向市场销售新品种或新种质的时候面临产业自主权保护问题。目前解决这一问题最为理想的措施是通过性别控制技术制备具有优势性状的单性种群，以解决对自然资源造成的基因污染、养殖群体规格不均、非必要养殖成本偏高、新品种或新种质产业自主权的保护等产业问题。但在团头鲂性腺发育成熟之前，很难从外部形态上区分其雌鱼和雄鱼，胚胎和幼体阶段雌雄鱼形态上几乎没有区别。若能开发出能准确鉴别团头鲂性别的特异性标记，将能在其性腺成熟之前鉴定养殖群体的遗传性别，进行单性化养殖，有效杜绝种群内部过度杂交，促进其种质资源的保护；帮助养殖户在早期进行遗传性别的快速鉴定，随时掌控后备亲鱼群体的性比，进一步调控亲本培育数量，从而有效降低养殖和维护成本，提高整体经济效益；加快团头鲂性控育种进程，进一步推动团头鲂遗传改良与种质保护工作。
随着高通量测序技术的快速发展和基因组资源的积累，越来越多经济鱼类的性别标记已被发现，如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、斑鳢(Channa maculata)、金钱鱼(Scatophagus argus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、大刺鳅(Mastacembelusarmatus)。在团头鲂性别特异分子标记筛选方面，目前仅有授权公告号为CN 113981108 B的发明专利公开了用于团头鲂早期性别鉴定的1个雄性特异DNA分子标记，但在实践中发现该标记具有不稳定性。本发明基于高通量测序技术和雌雄基因组差减比较分析，鉴定出团头鲂3个雄性特异性分子标记，并将3个标记成功应用于团头鲂雌雄性别的快速鉴定，3个标记的组合使用可以提高鉴定准确率。
发明内容
本发明的目的在于提供团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记，所述的分子标记为DNA片段，本发明提供的DNA片段无论单独使用或者组合使用，对团头鲂的性别鉴定均能达到100％的准确率。
本发明的另一个目的在于提供了上述DNA分子标记的检测引物。
本发明最后一个目的在于提供了上述分子标记或其检测引物在团头鲂性别鉴定中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
本发明基于团头鲂群体高通量测序及雌雄基因组差减比较分析，鉴定出3个雄性特异的DNA片段，分别为SEQ ID NO.1～3所示，该片段可以单独或者两两、三个组合作为团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记。
本发明的保护范围包括：
一种团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记，所述的分子标记为DNA片段，为SEQID NO.1所示。
一种团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记组合，所述的分子标记组合为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
一种团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记组合，所述的分子标记组合为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。
一种团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记组合，所述的分子标记组合为SEQ IDNO.1、和SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
检测上述分子标记或分子标记组合的引物，也为本发明的保护内容，常规的PCR检测引物，均能实现上述检测。
以上所述的引物，优选的，检测SEQ ID NO.1所示多核苷酸的引物为：
195-2-F：5’-GACGTCCATATGTTCAGCCA-3’
195-2-R：5’-CAAGTCAGAATTGATTACAATAAAT-3’；
检测SEQ ID NO.2所示多核苷酸的引物为：
321-1-F：5’-ATCAGTAAATATGCAGAGCGAGA-3’
321-1-R：5’-AGTTTCTGTCAAGTCCTCGCA-3’；
检测SEQ ID NO.3所示多核苷酸的引物为：
488-1-F：5’-AAGCAAATGCTGAAATGTTGTATA-3’
488-1-R：5’-TAAAAAGTTTAAGTTTTGGCCTG-3’。
上述分子标记或分子标记引物在鉴定团头鲂性别中的应用。
上述分子标记或分子标记引物在制备团头鲂性别鉴定试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明主要通过团头鲂群体高通量测序及雌雄基因组差减比较分析获得团头鲂的遗传性别鉴定分子标记，并设计有对应引物组，能够以样本基因组DNA为模板，仅通过PCR和琼脂糖凝胶电泳就能鉴定团头鲂遗传性别，耗费时间短，对鱼体伤害小，方便快捷且准确率更高，尤其适合对大样本进行快速性别鉴定。本发明为团头鲂性别决定基因的进一步挖掘提供基础数据，同时为团头鲂性控育种奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例3中SEQ ID NO.1所示序列的上下游引物195-2-F/R对团头鲂雌雄各32尾样本的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明实施例3中SEQ ID NO.2所示序列的上下游引物321-1-F/R对团头鲂雌雄各32尾样本的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明实施例3中SEQ ID NO.3所示序列的上下游引物488-1-F/R对团头鲂雌雄各32尾样本的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
现结合附图与实施例对本发明的团头鲂特异性分子标记及遗传性别鉴定方法进行清晰且完整地描述。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂；未详尽说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
实施例1：
团头鲂雄性特异DNA片段的获取
(1)团头鲂群体高通量测序。随机选取性成熟后的淤泥湖群体、鄱阳湖群体、梁子湖群体、“华海1号”群体、“浦江1号”群体以及“浦江2号”群体共257尾，通过解剖观察性腺确定有115条雌性和142条雄性。分别剪取每个个体尾鳍提取基因组DNA并进行全基因组高通量测序和数据质控，获得团头鲂257个个体的clean data。
(2)雌雄基因组差减比较筛选候选Y染色体特异片段。使用bwa软件将115条雌鱼和142条雄鱼的clean data分别比对团头鲂雌性参考基因组，提取未比对上参考基因组的序列；挑选10个高深度雄性样本使用spades组装，得到262853序列；随机挑选20雌性样本混池与组装结果双向比对去除比对上的序列，剩下163710序列；随机挑选20雄性样本，与过滤结果比对；选取所有样本都比对上的序列，剩下45条；去除长度较短的序列(小于150bp)，最终筛选得到7条候选Y染色体特异片段。
(3)将115条雌鱼和142条雄鱼测序数据分别与(2)中获得的7个候选Y染色体片段进行比对，进一步筛选得到与115条雌鱼均未比对上而只在雄鱼中比对上的3个候选片段。针对3个候选片段序列设计相应的引物并进行群体验证其有效性，最终获得3个雄性特异DNA片段，分别命名为S1、S2和S3，对应的多核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示，因此，这三条筛选出的DNA片段，作为团头鲂性别鉴定的DNA分子标记。
实施例2：
团头鲂雄性特异DNA片段的使用方法：
(1)针对实施例1中筛选得到的3条DNA分子标记分别设计的引物如下：
检测S1片段的引物为：
195-2-F：5’-GACGTCCATATGTTCAGCCA-3’
195-2-R：5’-CAAGTCAGAATTGATTACAATAAAT-3’；
检测S2片段的引物为：
321-1-F：5’-ATCAGTAAATATGCAGAGCGAGA-3’
321-1-R：5’-AGTTTCTGTCAAGTCCTCGCA-3’；
检测S3片段的引物为：
488-1-F：5’-AAGCAAATGCTGAAATGTTGTATA-3’
488-1-R：5’-TAAAAAGTTTAAGTTTTGGCCTG-3’。
(2)提取待测团头鲂基因组DNA作为模板，利用上述引物组中至少一对进行PCR扩增。PCR扩增体系：2×Hieff PCR Master mix，5μL；上下游引物，各0.5μL；模板DNA，0.5μL；ddH2O，3.5μL。PCR扩增程序：94℃持续5min；94℃持续30s，56℃持续30s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续5min；冷却至4℃。
(3)将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。若扩增出单一明亮特异性条带则为雄性个体；若扩增无条带则为雌性个体。
上述DNA分子标记可单独使用，也可两两或者三三组合使用，均可对团头鲂的性别进行鉴定，准确率为100％。
实施例3：
雄性特异DNA片段在团头鲂性别鉴定中应用
(1)基因组DNA提取
通过解剖观察性腺进行性别鉴定，随机选取团头鲂群体雌鱼和雄鱼各32尾，分别剪取尾部鳍条，采用醋酸铵法提取样本基因组DNA，使用Nanodrop2000分光光度计检测DNA质量及浓度，采用1％琼脂糖凝胶电泳进一步检测DNA质量后于-20℃保存备用。
(2)PCR扩增
将步骤(1)提取的团头鲂基因组DNA样品稀释到100ng/μL，并以稀释后的基因组DNA为模板，利用实施例2所述引物组分别进行PCR扩增，扩增体系及扩增程序均如实施例2中所述。
(3)电泳结果分析
将步骤(2)得到的PCR扩增产物采用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。电泳结果显示：引物195-2-F/R在32尾雌鱼DNA样品中均不能扩增出条带(图1)，在32尾雄鱼中均能扩出173bp的条带；引物321-1-F/R在32尾雌鱼DNA样品中均不能扩增出条带(图2)，在32尾雄鱼中均能扩出275bp的条带；引物488-1-F/R在32尾雌鱼DNA样品中均不能扩增出条带(图3)，在32尾雄鱼中均能扩出436bp的条带。本次实验结果与采样时性别鉴定结果一致，表明分三个分子标记单独使用或者组合使用均可用于鉴定团头鲂的性别。
上述实施例提供了对本发明的详细说明，但是本发明的实施方式不局限于上述实施例。凡在不脱离本发明宗旨前提下作出的任何变化，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (8)
1. 一种团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记，所述的分子标记为DNA片段，为SEQID NO.1所示。
2. 一种团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记组合，所述的分子标记组合为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
3. 一种团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记组合，所述的分子标记组合为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。
4. 一种团头鲂遗传性别鉴定的特异性分子标记组合，所述的分子标记组合为SEQ IDNO.1、和SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
5. 检测权利要求1所述分子标记的引物在鉴定团头鲂性别或制备团头鲂性别鉴定试剂盒中的应用，所述的引物为195-2-F：5’-GACGTCCATATGTTCAGCCA-3’ 和195-2-R：5’-CAAGTCAGAATTGATTACAATAAAT-3’。
6. 检测权利要求2所述分子标记的引物组合在鉴定团头鲂性别或制备团头鲂性别鉴定试剂盒中的应用，所述的引物为195-2-F：5’-GACGTCCATATGTTCAGCCA-3’ 、195-2-R：5’-CAAGTCAGAATTGATTACAATAAAT-3’、 321-1-F：5’-ATCAGTAAATATGCAGAGCGAGA-3’ 和321-1-R：5’-AGTTTCTGTCAAGTCCTCGCA-3’。
7. 检测权利要求3所述分子标记的引物组合在鉴定团头鲂性别或制备团头鲂性别鉴定试剂盒中的应用，所述的引物为195-2-F：5’-GACGTCCATATGTTCAGCCA-3’ 、195-2-R：5’-CAAGTCAGAATTGATTACAATAAAT-3’、 488-1-F：5’-AAGCAAATGCTGAAATGTTGTATA-3’ 和488-1-R：5’-TAAAAAGTTTAAGTTTTGGCCTG-3’ 。
8. 检测权利要求4所述分子标记的引物组合在鉴定团头鲂性别或制备团头鲂性别鉴定试剂盒中的应用，所述的引物为195-2-F：5’-GACGTCCATATGTTCAGCCA-3’ 、195-2-R：5’-CAAGTCAGAATTGATTACAATAAAT-3’、 321-1-F：5’-ATCAGTAAATATGCAGAGCGAGA-3’ 和321-1-R：5’-AGTTTCTGTCAAGTCCTCGCA-3’、 488-1-F：5’-AAGCAAATGCTGAAATGTTGTATA-3’ 和488-1-R：5’-TAAAAAGTTTAAGTTTTGGCCTG-3’。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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