CN111996261A - 罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗氏沼虾性别分子标记引物，所述引物包括引物对1，所述引物对1包括Contig‑1上游引物和Contig‑1下游引物，其中Contig‑1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig‑1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该引物能在分子水平上鉴别雌雄性罗氏沼虾。本发明还公开了一种快速鉴定罗氏沼虾性别试剂盒及方法，该方法试剂盒和方法耗时短，检测结果准确。本发明最后公开了上述引物、试剂盒以及方法在罗氏沼虾全雌性或全雄性育种方面的应用。

Description

罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用

技术领域

本发明属于虾类性别鉴定技术，具体涉及罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用。

背景技术

随着现代生物学技术的应用，已通过限制位点相关DNA(restriction siteassociated DNA，RAD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)和微卫星(microsatellite，SSR)等方法，开发出多种水产生物的性别特异标记，如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)等，但是这些分子标记开发方法工作量大，耗费时间长，准确率较低。目前，通过高通量测序，然后比较雌雄性基因组差异的方法，为性别分子标记开发提供了一种新的高效手段，现已成功开发出乌鳢及大黄鱼性别特异分子标记。

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)，属于节肢动物门、甲壳纲、长臂虾科、沼虾属。生长在淡水或咸淡水中，分布于印度洋、太平洋热带及亚热带地区。其个体大，食性广，肉质鲜嫩，营养价值高，是世界上养殖产量较高的虾类品种之一。很多甲壳纲的物种表现出雌雄生长速度不一致的特点，罗氏沼虾的雄性比雌性的生长速度要快，在重量上也超过雌性。生产上将罗氏沼虾雌雄混养，雌虾在投苗2-3个月后，因为性成熟开始抱卵就不再长肉；而雄虾因为交配消耗掉营养，在生长速度和个体规格上也受到了限制。罗氏沼虾雌雄混养的形式制约了其生长，是总体产量低的主要原因。单一性别养殖方式是一种更高效的养殖方式，可以减少雌雄混养之间的能量消耗，也减少人力的分选的投入，可以获得大规格的商品虾，提高养殖的经济效益，是养殖业发展的趋势。因此，罗氏沼虾单一性别养殖方式的开展将提高其产量与品质，具有巨大的经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种罗氏沼虾性别分子标记引物，该引物能在分子水平上鉴别雌雄性罗氏沼虾。

本发明第二目的在于提供一种快速鉴定罗氏沼虾性别的方法，该方法耗时短，检测结果准确。

罗氏沼虾的性别由染色体决定，雌性为异型染色体(ZW)，雄性为同型染色体(ZZ)。尽管以往的染色体核型分析并没有发现明显的性染色体，但本申请发明人通过对雌雄基因组测序分析，发现雌性基因组有许多特异DNA片段。迄今为止，国内外尚无能够成功鉴定罗氏沼虾遗传性别的分子标记的报道，因此，开发一种准确鉴定遗传性别的分子标记在罗氏沼虾单性育种中具有极大的生产应用价值。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种罗氏沼虾雌性分子标记引物，所述引物为引物对1，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

具体的，各引物从5’-3’的核苷酸序列如下：

Contig-1上游引物：5’-gctgctttgaagtttgctgcatg-3’；

Contig-1下游引物：5’-tggttggtcagattgactctgta-3’。

本发明还提供了一种用于罗氏沼虾性别鉴定的试剂盒，该试剂盒包括上述罗氏沼虾雌性分子标记引物。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种利用上述罗氏沼虾性别分子标记引物进行罗氏沼虾性别鉴定的方法，包括以下步骤：

(1)设计引物对1；

(2)制备罗氏沼虾DNA样品；

(3)以步骤(2)中的DNA样品为模板，采用步骤(1)设计的引物对1进行PCR扩增，扩增反应结束后，进行电泳检测，若电泳结果在378bp位置处显示具有特异性DNA特异性条带，此时所检测的罗氏沼虾DNA样品为雌性罗氏沼虾，若电泳结果在378bp位置处显示不具有特异性条带，此时所检测的罗氏沼虾DNA样品为雄性罗氏沼虾。

优选的，步骤(2)中罗氏沼虾DNA样品制备采用柱式离心法提取获得。

优选的，步骤(3)中采用引物对1进行PCR扩增时，PCR反应体系包含罗氏沼虾DNA样品50ng，Contig-1上游引物和Contig-1下游引物各0.8μL，2×Taq MasterMix 10μL，加水补足反应体系，总共20μL。

优选的，步骤(3)中采用引物对进行PCR扩增时，PCR反应程序是：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。

优选的，步骤(3)中进行电泳检测时，采用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。

由于上述罗氏沼虾雌性分子标记引物可以在378bp位置处显示具有特异性DNA特异性条带，进而对罗氏沼虾雌性进行识别，因此，可以将上述罗氏沼虾雌性分子标记引物、上述试剂盒以及上述方法在罗氏沼虾全雌性或全雄性育种方面进行应用。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明基于雌雄罗氏沼虾的基因组高通量测序数据，利用基因组组装和比对等分析方法，快速、准确的筛选出罗氏沼虾雌雄性别分子标记，首次设计了鉴别罗氏沼虾性别的雌性分子标记引物，该引物可对罗氏沼虾的性别进行快速准确地鉴定；

(2)本发明方法建立了一种利用罗氏沼虾性别分子标记引物进行罗氏沼虾性别鉴定的方法，利用一对特异性引物对，完成一个PCR反应就可以鉴别罗氏沼虾性别，相较于传统通过测交实验来判别亲本的性别，耗时短，效率高，节约资源。

附图说明

图1为实施例1中雌性特有候选片段长度分布情况示意图；

图2为实施例1中W染色体候选片段获取示意图；

图3为实施例1中W染色体特有片段长度分布情况示意图；

图4为实施例1中仅在雌性样本中检测到扩增片段，在雄性样本中未检测到扩增片段的1对引物的PCR产物电泳图

图5为实施例2中引物Contig-1F/R的雌雄个体(48尾)检测PCR产物电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1

本实施例提供的罗氏沼虾雌性别分子标记引物，引物包括引物对1，引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

具体的，该引物从5’-3’的核苷酸序列如下：

Contig-1上游引物：5’-gctgctttgaagtttgctgcatg-3’；

Contig-1下游引物：5’-tggttggtcagattgactctgta-3’。

本实施例中上述罗氏沼虾雌雄性别分子标记引物通过以下方式获得，其步骤包括：

一、测序文库构建及重测序

1.罗氏沼虾DNA样品制备：

繁殖期间剪取罗氏沼虾雌性3尾和雄性26尾个体肌肉，依次按雌性F1-F3、雄性M1-M26编号，采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品，并用1％琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(NanoDrop2000)进行质量和浓度检测，达到高通量测序的要求。

2.测序文库构建和高通量测序：

选取高质量雌性F1-F3、雄性M1-M3 DNA样品，分别构建350-500bp片段测序文库，利用Illumina Hiseq X Ten平台进行双末端(Pair-End)PE150测序，分别获得雌、雄基因组序列。

从M4-M26共23份DNA样品中，取等量混匀成雄性DNA混合池，构建350-500bp片段测序文库，利用Illumina Hiseq X Ten平台进行双末端PE150测序，获得雌虾DNA混合池序列。

二、W染色体特异DNA片段的富集

1.雌性基因组组装：

运用SOAPdenovo v2.04-r240(https://github.com/aquaskyline/SOAPdenovo2)中aln方法对雌虾F1测序reads进行基因组组装，共获得雌虾2148419scaffolds，总大小1920143175bp，其中N50＝39688bp。

2.雌性候选DNA片段获得：

用雄性M1-M3测序reads和雌性F1-F3测序reads采用bwav0.7.17-r1188(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件的aln方法进行比对到雌性基因组，过滤掉雌性测序reads不能双端比对上的reads，挑选出雌性测序reads都能比对上，但是雄性测序reads比对不上的区域，这些区域就是雌性特异的DNA片段(图1和图2)。

3.雌性特异DNA片段的富集：

以雌性基因组作为reference，雄性DNA混合池测序reads为query，采用bwav0.7.17-r1188(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件的aln方法进行序列比对，找出没有任何reads覆盖到的雌性特异DNA片段。有26条DNA片段没有任何一条雄性DNA混合池的read能比对得上，这些雌性DNA片段的长度主要分布于300-600bp，占总数的66.7％；长度≧300bp的Contig占总数的100％。这26条Contig中包含来自W染色体的特异DNA片段(图3)。

三、W染色体分子标记的筛选

1.引物设计与合成：

基于上述26条雌性Contig序列，设计26条Contig序列，采用Primer5软件(软件使用参照Primer PREMIER Version5.0 for Windows and Power Macintosh)设计PCR引物，引物按Contig-xxF/R编号(xx代表Contig号码)，如Contig-1的引物编号为Contig-1F/R(F代表上游引物，R代表下游引物，下同)。

2.W染色体分子标记的筛选及确认：

选择上述26对引物对雌雄各4尾个体进行PCR检测，PCR扩增反应总体系20μL，包括康为世纪2×Taq MasterMix 10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，模板DNA 50ng。

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，1对引物仅在雌性个体中获得扩增条带，在雄性个体中均未检测到扩增片段(图4)，这对引物位是Contig-1F/R，代表它们对应的Contig是Contig-1；其余引物对，则在雌雄个体的扩增产物中存在非特异性杂带和无法准确判断的弥散条带，难以严格区分雌雄性别。

该引物Contig-1的是上下游引物从5’-3’的核苷酸序列如下：

Contig-1上游引物：5’-gctgctttgaagtttgctgcatg-3’；

Contig-1下游引物：5’-tggttggtcagattgactctgta-3’。

因此，可以进一步在该罗氏沼虾性别分子标记引物中加入常规的试剂制成试剂盒，用于罗氏沼虾性别的快速鉴定。

实施例2

本实施例提供的利用实施例1中的罗氏沼虾性别分子标记引物进行罗氏沼虾性别鉴定的方法，包括下述步骤：

(1)设计上述罗氏沼虾雌性分子标记引物，具体过程参照实施例1；

(2)罗氏沼虾DNA样品制备：

从广东省佛山市三水白金水产种苗有限公司获得目测已性成熟的罗氏沼虾，经解剖得到雌、雄性别罗氏沼虾各24尾。分别剪取尾鳍，同样采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品。

(3)PCR扩增验证：

采用引物Contig-1F/R对上述雌、雄各24个罗氏沼虾DNA样品进行PCR验证。

PCR扩增反应总体系20μL，包括康为世纪2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，模板DNA 50ng。

PCR反应程序为：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。

PCR反应结束后，产物经质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳。

电泳结果表明：引物Contig-1F/R在24尾雌虾DNA样品中均能扩增出条带，此时，采用引物Contig-1F/R出特异性条带的分子大小是378bp。在24尾雄虾DNA样品中均不能扩增出条带(图5：Contig-1F/R扩增结果图)。表明分子标记Contig-1F/R可用于鉴定罗氏沼虾的性别鉴定。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

序列表

<110> 湖南银鱼农业科技有限公司

中山大学

<120> 罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctgctttga agtttgctgc atg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggttggtca gattgactct gta 23

Claims (8)

1.一种罗氏沼虾性别分子标记引物，所述引物包括引物对1，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种罗氏沼虾性别鉴定试剂盒，其特征是包括权利要求1中的罗氏沼虾性别分子标记引物。

3.一种利用权利要求1所述引物进行罗氏沼虾性别鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)设计引物对1；

(2)制备罗氏沼虾DNA样品；

(3)以步骤(2)中的DNA样品为模板，采用步骤(1)设计的引物对1进行PCR扩增，扩增反应结束后，进行电泳检测，若电泳结果在378bp位置处显示具有特异性DNA特异性条带，此时所检测的罗氏沼虾DNA样品为雌性罗氏沼虾，若电泳结果在378bp位置处显示不具有特异性条带，此时所检测的罗氏沼虾DNA样品为雄性罗氏沼虾。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤(2)中罗氏沼虾DNA样品制备采用柱式离心法提取获得。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤(3)中采用引物对1进行PCR扩增时，PCR反应体系包含罗氏沼虾DNA样品50ng，Contig-1上游引物和Contig-1下游引物各0.8μL，2×Taq MasterMix 10μL，加水补足反应体系，总共20μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤(3)中采用引物对进行PCR扩增时，PCR反应程序是：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤(3)中进行电泳检测时，采用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。

8.权利要求1所述罗氏沼虾雌性分子标记引物、权利要求2中所述试剂盒以及权利要求3中所述方法在罗氏沼虾全雌性或全雄性育种方面的应用。

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