CN114836543A - 斑鳢雌性分子标记引物及其应用、鉴别斑鳢性别的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于斑鳢性别鉴定技术领域，具体涉及斑鳢雌性分子标记引物及其应用和鉴别斑鳢性别的方法。本发明提供的斑鳢雌性分子标记引物，包括引物对BLX1和/或引物对BLX2。本发明提供的引物对能特异性鉴别斑鳢性别，配合雄性分子标记可对斑鳢超雄鱼YY型和正常雌雄鱼XX型或XY型进行快速准确地鉴定，能够提高斑鳢鱼全雄性或全雌性育种效率。

Description

斑鳢雌性分子标记引物及其应用、鉴别斑鳢性别的方法
技术领域
本发明属于斑鳢性别鉴定技术领域，具体涉及斑鳢雌性分子标记引物及其应用、鉴别斑鳢性别的方法。
背景技术
斑鳢(Channa maculata)属鳢科、鳢属鱼类，为淡水底层鱼类，多栖息于沿岸水草和淤泥底质浅水区。斑鳢是典型的肉食性鱼类，幼鱼主要以桡足类、一些鱼类仔鱼和水生昆虫幼虫等为食，成鱼则以各种小型杂鱼为食，包括鲤鱼和鲮鱼等，人工饲养可以投喂配合饲料，在土塘或者水泥池等进行高密度养殖。斑鳢肉质白嫩、肉味鲜美、肉感爽口、营养丰富，经济价值高。
研究表明乌鳢和斑鳢均属于XY性别决定型，要规模化生产出全雄斑鳢或全雄斑乌杂交鳢商品苗种，需要构建斑鳢YY繁育系，大量生产YY雄性。而构建斑鳢YY繁育系，需要解决两个关键步骤，第一步是在雌性化诱导子代中将XY生理雌性个体从XX生理雌性中筛选出来，第二步则需要从XY生理雌性与XY雄性后代中将YY雄鱼从XX雌性和XY雄性中筛选出来。尽管此前有雄性Y分子标记开发成功，能够解决第一步面临的问题，筛选出XY生理雌性个体。但在第二步中Y标记无法区分正常XY雄性和YY超雄鱼，而用传统测交的方法既耗时又费力，不适合大规模筛选YY超雄鱼，需要开发稳定可靠的雌性X分子标记筛选，从而筛选其中的YY超雄鱼。迄今为止，国内外虽有能够成功鉴定斑鳢遗传性别的分子标记的报道，但是主要是单核苷酸多态性标记，实际使用比较困难。因此，开发一种简便且能准确鉴定斑鳢是否含X染色体基因的遗传性别的分子标记，在斑鳢全雄育种中具有极大的生产应用价值
发明内容
本发明的目的在于提供斑鳢雌性分子标记引物及其应用、鉴别斑鳢性别的方法，在分子水平上鉴别斑鳢性别，筛选出斑鳢YY繁育系超雄鱼，提高检测结果的准确性，提高斑鳢鱼全雄性育种效率。
本发明提供了一种斑鳢雌性分子标记引物，包括引物对BLX1和/或引物对BLX2；
所述引物对BLX1包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物Contig-1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物Contig-1-R；
所述引物对BLX2包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物Contig-2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物Contig-2-R。
本发明还提供了上述的引物在斑鳢全雄性或全雌性育种中的应用。
本发明还提供了上述的引物在斑鳢性别鉴定中的应用。
本发明还提供了一种斑鳢性别鉴定的方法，包括如下步骤：
利用上述的引物对待测斑鳢的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行检测；
当能够扩增出DNA片段时，检测的斑鳢为雌性XX型或者正常雄性XY型；
当不能扩增出DNA片段时，检测的斑鳢为超雄鱼YY型。
优选的，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：斑鳢的基因组DNA 20～50ng，10μM的上游引物和下游引物各0.8μL，2×Taq Plus MasterMix II 10μL和余量的ddH2O。
优选的，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸5min。
优选的，利用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳对所述PCR扩增产物进行检测。
优选的，当利用引物对BLX1检测PCR扩增时，所述扩增片段的长度为243bp；当利用引物对BLX2检测PCR扩增时，所述扩增片段的长度为628bp。
优选的，采用柱式离心法提取所述待测斑鳢的基因组DNA。
本发明提供了一种斑鳢雌性分子标记引物，包括引物对BLX1和/或引物对BLX2。本发明基于雌雄斑鳢的基因组高通量测序数据设计12对引物，最终筛选出2条特异性鉴别斑鳢性别的雌性分子标记引物对BLX1和引物对BLX2，可对斑鳢超雄鱼YY型和正常雌雄鱼XX型或XY型进行快速准确地鉴定。
本发明利用上述斑鳢雌性分子标记引物中的任意一对引物，只需完成一个简单的PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳，即可鉴别斑鳢超雄鱼YY型和正常雌雄鱼XX型或XY型，耗时短，效率高，节约资源，有效提高了斑鳢鱼全雄性或全雌性育种效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中X染色体特有片段长度分布情况示意图；
图2-1和图2-2为实施例1中在正常雌雄个体XX型和XY型样本中检测到扩增片段，在超雄个体YY型样本中未检测到相应扩增片段的12对引物对的PCR产物电泳图；
图3为实施例2中引物对BLX1的雌性个体XX型、和雄性个体XY型和超雄鱼个体YY型(共48尾，平均每种类型16尾)检测PCR产物电泳图；
图4为实施例2中引物对BLX2的雌性个体XX型、和雄性个体XY型和超雄鱼个体YY型(共48尾，平均每种类型16尾)检测PCR产物电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种斑鳢雌性分子标记引物，包括引物对BLX1和/或引物对BLX2；
所述引物对BLX1包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物Contig-1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物Contig-1-R；
所述引物对BLX2包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物Contig-2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物Contig-2-R。
本发明各引物的碱基序列，从5’-3’依次如下：
Contig-1-F：GCCAAACAGTGTAATAGGTTAG；
Contig-1-R：TATGGTCTCTTCTGACATTGG；
Contig-2-F：AAGGATAAAACAATGGGTACAC；
Contig-2-R：TTGTGCTGACATTGCCTCAG。
本发明所述引物可对斑鳢的X基因进行扩增，其中引物Contig-1的扩增片段的大小为243bp；引物Contig-2的扩增片段的大小为628bp。本发明所述引物对针对斑鳢性别，当为正常雌雄鱼XX型或XY型时，能特异性地扩增单一、明亮，符合预期大小的扩增条带，通过琼脂糖凝胶电泳结果呈现阳性，当不能特异性地扩增单一、明亮，符合预期大小的扩增条带时，检测的斑鳢为超雄鱼YY型。本发明所述引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
本发明所述斑鳢雌性分子标记的筛选和查找方法，优选包括利用基因组组装、比对和深度分析等方法，采用Primer5软件(软件使用参照Primer PREMIER Version5.0 forWindows and PowerMacintosh)设计12对PCR引物，并对每对引物的检测效果进行分析，最终发现设计的多对引物中，只有上述2个引物对能够实现在分子水平上鉴别斑鳢超雄鱼YY型和正常雌性XX型或正常雄性XY型的目的。
本发明还提供了上述引物对在斑鳢全雄性育种和/或斑鳢性别鉴定中的应用。
本发明还提供了一种斑鳢性别鉴定的方法，包括如下步骤：
利用上述引物对待测斑鳢的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行检测；
当能够扩增出DNA片段时，检测的斑鳢为雌性XX型或者正常雄性XY型；
当不能扩增出DNA片段时，检测的斑鳢为超雄鱼YY型。
本发明对所述基因组DNA的提取方法并没有特殊限定，实施例中优选采用柱式离心法提取所述待测斑鳢的基因组DNA，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明对所述柱式离心法的具体操作过程没有严格要求，采用本领域熟知的步骤或试剂提取即可，如利用天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组提取试剂盒，参照说明书操作步骤制备DNA样品。
得斑鳢基因组DNA后，本发明利用上述引物对斑鳢基因组DNA进行PCR扩增。本发明所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括：斑鳢的基因组DNA 50ng，10μM的上游引物和下游引物各0.8μL，2×Taq Plus MasterMix II 10μL和余量的ddH2O。本发明所述PCR扩增的程序优选为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸5min。本发明所述PCR扩增的反应体系中优选使用引物对BLX1和引物对BLX2中的一种。
得PCR扩增产物后，本发明优选利用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳对所述PCR扩增产物进行检测。本发明对琼脂糖凝胶电泳的操作步骤不做严格要求，常规操作即可。本发明根据检测结果区分斑鳢超雄鱼YY型和正常雌雄鱼XX型或XY型，当利用引物对BLX1进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果在243bp处存在单一、明亮扩增条带时，斑鳢为正常雌雄鱼XX型或XY型，不存在条带则为斑鳢超雄鱼YY型；当利用引物对BLX2进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果在628bp处存在单一、明亮扩增条带时，斑鳢为正常雌雄鱼XX型或XY型，不存在条带则为斑鳢超雄鱼YY型。
本发明提供的鉴定方法耗时短，只需完成一个简单的PCR扩反应和琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴别斑鳢超雄鱼YY型和正常雌雄鱼XX型或XY型，并且鉴定结果准确，节约资源，有效提高了斑鳢鱼全雄性或全雌性育种效率。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)测序文库构建及重测序
1.斑鳢DNA样品制备：
繁殖期间剪取斑鳢雌性31尾(依次标记为F1-F31)和雄性3尾(依次标记为M1-M3)个体尾鳍，采用常规柱式离心法(海洋动物组织基因组提取试剂盒，天根生化科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品，并用1％琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(NanoDrop2000)进行质量和浓度检测，达到高通量测序的要求。
2.测序文库构建和高通量测序：
取雌鱼F1-F3、雄鱼M1-M3 DNA样品，分别构建350-500bp片段测序文库，利用Illumina Hiseq X Ten平台进行双末端(Pair-End)PE150测序，分别获得雌、雄基因组测序clean data：60,506,228,100bp和65,442,598,200bp。
从其余28份雌鱼(F4-F31)DNA样品中，各取等量DNA混匀成雌鱼DNA混合池，构建350-500bp片段测序文库，利用Illumina Hiseq X Ten平台进行PE150双末端测序，获得雌鱼DNA混合池测序clean data：30,925,893,000bp。
文库构建步骤具体参考Novogene NGS DNA Library Prep Kit说明书，测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
(二)X染色体特异DNA片段的富集
1.包括雌鱼基因组组装：
运用SOAPdenovo v2.04-r240(https://github.com/aquaskyline/SOAPdenovo2)中all方法对雌鱼F3测序reads进行基因组组装，共获得雌鱼541,932scaffolds，总大小667,573,559bp，其中N50＝57,259bp。
2.雌鱼候选DNA片段获得：
用雌鱼F1-F3测序reads和雄鱼M1-M3测序reads采用bwa v0.7.17-r1188(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件的aln方法进行比对到雌鱼基因组，过滤掉雌鱼测序reads不能双端比对上的reads，挑选出雌鱼测序reads都能比对上，但是雄鱼测序reads比对不上的区域，这些区域就是雌鱼特异的DNA片段，具体如表1所示。
表1雌鱼特有候选片段信息表
雌性特异序列 序列数量 全长(nt) 最大长度(nt) 最小长度(nt) 平均长度(nt)
雌性 20 16715 3549 301 796
3.雌性特异DNA片段的富集：
以雌性基因组作为reference，雄鱼DNA混合池测序reads为query，采用bwav0.7.17-r1188(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件的aln方法进行序列比对，找出没有任何reads覆盖到的雌鱼特异DNA片段。有23条长度≧300bp的DNA片段没有任何一条雄鱼DNA混合池的read能比对得上，这些雌鱼DNA片段的长度主要分布于300-1000bp，占总数的74.21％。这23条Contig中包含来自X染色体的特异DNA片段，检测到的23条DNA片段的长度分布图如图1所示，由图1可以看出，12条DNA片段长度在300～500bp，6条DNA片段长度在501～1000bp，3条DNA片段长度在1001～1500bp，1条DNA片段长度在1501～2500bp，1条DNA片段长度在2501～3500bp。
(三)X染色体分子标记的筛选
1.引物设计与合成：
基于上述高通量测序数据，采用Primer5软件(软件使用参照Primer PREMIERVersion5.0 forWindows and Power Macintosh)设计12对PCR引物，引物按Contig-xxF/R编号(xx代表Contig号码)，如Contig-1的引物编号为Contig-1F/R(F代表上游引物，R代表下游引物，下同)，具体序列如下表2，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
表2检测引物对
Figure BDA0003609140020000061
Figure BDA0003609140020000071
2.X染色体分子标记的筛选及确认：
选择表2中12对引物对正常雌鱼XX型、正常雄鱼XY型和超雄鱼YY型各4尾个体进行PCR检测。
PCR扩增反应总体系20μL，包括2×Taq Plus MasterMix II(南京诺唯赞生物科技有限公司)10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，模板DNA 50ng。
PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳结果如图2-1和图2-2，其中BLX1～10依次代表表2中编号为1～12的引物对；数字1～4为重复，5～8为重复，9～12为重复。根据图2-1和图2-2可以看出，利用12对引物在正常雌XX型、正常雄性XY型和超雄鱼YY型各4个体中进行PCR扩增，最终只有2对引物对(即BLX1和BLX2)在正常雌性个体XX型和正常雄鱼个体XY型中有特异扩增条带，在超雄鱼个体YY型中均未检测到特异扩增片段，说明2条Contig，即Contig-1和Contig-2是X染色体特异片段，是斑鳢的雌性分子标记。
实施例2
利用实施例1筛选出的引物对Contig-1-F/R或引物对Contig-2-F/R进行斑鳢超雄鱼个体YY型鉴定的方法，包括下述步骤：
(1)斑鳢DNA样品制备：
从广东省佛山市三水白金水产种苗有限公司获得目测已性成熟的斑鳢，经解剖得到正常雌XX型、正常雄性XY型斑鳢和通过测交得到确定是超雄鱼YY型斑鳢各16尾分别剪取尾鳍，同样采用常规柱式离心法(海洋动物组织基因组提取试剂盒，天根生化科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品。
(2)PCR扩增验证：
采用引物Contig-1-F/R和Contig-2-F/R对分别对上述正常雌XX型、正常雄性XY型和超雄鱼YY型各16个斑鳢DNA样品进行PCR验证。
PCR扩增反应总体系20μL，包括康为世纪2×Taq Plus MasterMix II(南京诺唯赞生物科技有限公司)10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，模板DNA 50ng。
PCR反应程序为：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；再72℃终延伸5min。
PCR反应结束后，产物经质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图3和图4所示，其中图3为利用引物对Contig-1-F/R的检测结果，图4为利用引物对Contig-2-F/R的检测结果。
根据图3和图4可以看出，利用引物对Contig-1-F/R或引物对Contig-2-F/R在16尾正常雌XX型、16尾正常雄性XY型DNA样品中均能扩增出条带，采用引物Contig-1F/R扩增出雌性特异性条带的分子大小是243bp；采用引物Contig-2F/R扩增出雄性特异性条带的分子大小是628bp。引物对Contig-1-F/R或引物对Contig-2-F/R在16尾超雄鱼YY型DNA样品中均不能扩增出雌性特异的条带，本发明分子标记引物对Contig-1-F/R和Contig-2-F/R可用于鉴定斑鳢超雄鱼YY型个体。
实施例3
利用实施例1筛选出的引物对Contig-1-F/R或引物对Contig-2-F/R进行斑鳢全雄性育种，包括以下步骤：
将XY伪雌鱼养殖到性成熟，在繁殖季节与正常XY雄鱼进行交配，获得的后代中包含正常雌鱼XX型、正常雄鱼XY型和超雄鱼YY型。持续喂养两个月，养殖期间采用自然光照，培育水温为26～28℃，饱食投喂。
采用实施例2中的方法对伪雌鱼斑鳢的后代进行筛选，得到遗传型为YY的鱼，即超雄鱼，具体过程参照实施例2。
(3)将得到的YY超雄鱼养殖到性成熟之后，与XX雌鱼进行交配得到全雄鱼子代。
本发明提供的引物对Contig-1-F/R和Contig-2-F/R分别能特异性鉴别斑鳢性别，可对斑鳢超雄鱼YY型和正常雌雄鱼XX型或XY型进行快速准确地鉴定，有效提高了斑鳢鱼全雄性或全雌性育种效率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 广东梁氏水产种业有限公司
<120> 斑鳢雌性分子标记引物及其应用、鉴别斑鳢性别的方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccaaacagt gtaataggtt ag 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatggtctct tctgacattg g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggataaaa caatgggtac ac 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<400> 8
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 10
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<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgtgtagtcg ataatgctat cgt 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgatgctag tcgattctag ctcg 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atcgtagtcg ttgatcgtta ta 22
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgtagtcgt agcgtaatgc gtatt 25
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgatgtgcg attcgtagtc gtag 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgtgattcc aagtcgtgtg ca 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgtaatgcg tagtcaattg a 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctgtatgtca gtgaccagtg ac 22
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgtaggata ctagtcgatg cgt 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgatctagt ctgctgccaa ccg 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctgtatcgta gctgctgact gatg 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgtatcgtg acggtagctg aatc 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgtagtcgt agccttgccg tatg 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgtgatctag tcggcttagt cgtc 24

Claims (9)

1.一种斑鳢雌性分子标记引物，其特征在于，包括引物对BLX1和/或引物对BLX2；
所述引物对BLX1包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物Contig-1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物Contig-1-R；
所述引物对BLX2包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物Contig-2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物Contig-2-R。
2.权利要求1所述的引物在斑鳢全雄性或全雌性育种中的应用。
3.权利要求1所述的引物在斑鳢性别鉴定中的应用。
4.一种斑鳢性别鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用权利要求1所述的引物对待测斑鳢的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行检测；
当能够扩增出DNA片段时，检测的斑鳢为雌性XX型或者正常雄性XY型；
当不能扩增出DNA片段时，检测的斑鳢为超雄鱼YY型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：斑鳢的基因组DNA20～50ng，10μM的上游引物和下游引物各0.8μL，2×TaqPlus MasterMixII 10μL和余量的ddH2O。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸5min。
7.根据权利4所述的方法，其特征在于，利用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳对所述PCR扩增产物进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当利用引物对BLX1检测PCR扩增时，所述扩增片段的长度为243bp；当利用引物对BLX2检测PCR扩增时，所述扩增片段的长度为628bp。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用柱式离心法提取所述待测斑鳢的基因组DNA。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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