CN108611405B - 一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 - Google Patents
一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法,首先筛选出16对SSR引物,通过优化组合选出12对组成3个多重PCR组;然后在一个PCR反应体系中加入同属一组但浓度不同的4对SSR特异性引物对,采用不同的反应体系同时对同一个DNA模板的不同区域扩增出多个目的片段;通过电泳抽样检测后送生物公司在测序仪上进行分型,并获取样本相应位点的基因型;最终用于分析亲本和子代的亲子关系。本发明涉及的微卫星标记的扩增体系,节约DNA样本,实验效率高,可在翘嘴鲌的亲子鉴定、种群遗传多样性和遗传结构的评估方面进行推广。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定技术,具体涉及一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法,利用多重PCR对翘嘴鲌进行SSR分析的方法,适合在翘嘴鲌选育和养殖过程中进行种质鉴定和系谱管理。
背景技术
翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)是鲌亚科中体型最大的一种鱼类,隶属于鲤科(Cyprinida)、鲌亚科(Culterinae)、鲌属(Culter),广泛分布于中国各大水系。太湖中出产的翘嘴鲌被誉为“太湖三白”之一,其肉白而细嫩,味美而不腥。此外,翘嘴鲌在淡水水域生态系统中处于食物链的顶端,对维持生态系统的稳定具有重要作用。
分子标记是种质资源鉴定、家系选育和放流效果评估等研究和应用中一个重要技术手段。在家系选育中,了解整个家系遗传多样性,子代与亲代的对应关系以及子代与子代的关系,可以指导亲本选留,从而避免近亲繁殖,对于预防种质衰退具有重要作用。
微卫星DNA是真核生物基因组中短的串联重复序列。由于微卫星位点数量多,在基因组中均匀分布,共显性遗传且易于检测,微卫星DNA得到了广泛的应用。翘嘴鲌的微卫星已用来解决遗传多样性、遗传结构等问题。但是,上述遗传学实验均需要采用多个微卫星位点,研究者需要花费大量的时间和实验成本。更重要的是,要消耗较多的DNA样本。故发明一种对样本量要求少、成本低、高效的微卫星实验体系对于翘嘴鲌的育种研究来说具有重要的意义。
目前,其它物种的微卫星遗传学研究中采用多重PCR以解决上述问题。微卫星多重PCR指在一个PCR体系中加入多对微卫星特异性引物,对同一个模板的不同区域进行同时扩增的PCR技术。微卫星多重PCR可以同时扩增多个目的片段,能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率的目的。微卫星多重PCR的核心内容在于如何设计和优化引物组合,使得引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠。尽管微卫星多重PCR技术已在其他物种中广泛得到应用,但是迄今为止,翘嘴鲌微卫星多重PCR体系仍末建立起来。
发明内容
本发明的目的在于提供一套高效的翘嘴鲌微卫星位点的四重PCR体系的检测方法,该方法选用有效的微卫星引物,可靠、高效,能对翘嘴鲌进行亲子鉴定,还能用于家系管理和增殖放流效果评估。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的:一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法,首先筛选出16对SSR引物,通过优化组合选出12对组成3个多重PCR组;然后在一个PCR反应体系中加入同属一组但浓度不同的4对SSR特异性引物对,采用不同的反应体系同时对同一个DNA模板的不同区域扩增出多个目的片段;通过电泳抽样检测后送生物公司在测序仪上进行分型,并获取样本相应位点的基因型;最终用于分析亲本和子代的亲子关系。
具体地,本发明技术方案包括以下步骤:
(1) 翘嘴鲌样本DNA提取
取翘嘴鲌个体的鳍条,采取酚—氯仿法提取基因组DNA,将获得的DNA测定浓度后稀释至约50ng/μl。
(2) 翘嘴鲌多态性微卫星序列的筛选
根据NCBI上收录翘嘴鲌序列利用Primer Premier 6.0软件设计及现有文献记载的翘嘴鲌引物序列,并确保目的片段长度存在较大差异(100-500bp),引物序列送生物公司合成。用步骤(1)获得的基因组DNA为模板,对合成的引物用翘嘴鲌个体进行PCR扩增,利用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出16对扩增效果较好的引物,所述引物包括正向引物、反向引物。
(3)多重PCR体系的摸索和确定
进行多重PCR扩增:对步骤(2) 中筛选得到的引物按照扩增后的PCR产物按照120-180bp、200-260bp、280-340bp、360-420bp四个不同区间进行初步分组;首先两两组合,选出扩增清晰的组合,再依次进行3个和4个位点的多重PCR体系的摸索和构建。依据2.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果,然后不断优化各组内引物的浓度配比,确保扩增条带清楚并不重叠。最终,确定了基于12个微卫星位点的3,重新将每对引物的上游引物的5’端进行荧光修饰(HEX或6-FAM)。
4)获取翘嘴鲌样本的基因型数据
基于步骤(3)构建的多重PCR体系,对所有步骤(1)获得的DNA样进行扩增,并抽取适量扩增产物(4μl)在2.5%琼脂糖凝胶上电泳检测,检测合格后,送至生物公司采用ABI3720XL进行毛细管电泳检测,并利用GeneMapper 4.0对结果进行分析,从而获得亲本和子代各位点的基因型数据。
步骤(2)和步骤(3)中的扩增体系为:2× Multiplex PCR Mix 12.5μl,上下游引物的工作浓度为l0mmol/L,具体的使用量见表(1),50ng基因组DNA,补加灭菌超纯水至体系为25μl。
步骤(2)和步骤(3)中的扩增的条件为:95℃总变性10分钟,95℃变性30秒,退火温度(表1)退火30秒,72℃延伸30秒,共35个循环,最后72℃总延伸5分钟。
表1 翘嘴鲌3个4重PCR体系的引物信息
通过实施上述技术方案,本发明的有益效果是:本发明翘嘴鲌微卫星位点的4重PCR体系检测方法简单,与翘嘴鲌常规的单位点的微卫星PCR体系相比,可以有效节约DNA样本、PCR扩增试剂和毛细管分型费等,并减少了实验所需要的时间,有效提高实验效率。
如果采用单对引物逐一进行扩增,单个体系为25 μl,1个样本进行这12对引物的检测需要进行12次PCR,需要600ng的DNA,150 μl的Multiplex PCR Mix.但要是采用本发明的方法,1个样本只需进行4次PCR,需要200ng的DNA,50 μl的Multiplex PCR Mix。
本发明涉及的微卫星标记的扩增体系,节约DNA样本,实验效率高,可在翘嘴鲌的亲子鉴定、种群遗传多样性和遗传结构的评估方面进行推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案,但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1:
(1)选取性腺成熟好的3龄翘嘴鲌进行人工催产,建立12个全同胞单对交配家系;收集各个家系的全部亲本个体(共24个)和部分子代个体(每个家系20个水花,合计480个);
(2)取翘嘴鲌个体的鳍条,采取酚—氯仿法提取基因组DNA,将获得的DNA测定浓度后稀释至约50ng/μl;
(3)翘嘴鲌多态性微卫星序列的筛选
根据NCBI上收录翘嘴鲌序列利用Primer Premier 6.0软件设计及现有文献记载的翘嘴鲌引物序列,并确保目的片段长度存在较大差异(100-500bp),引物序列送生物公司合成。用步骤(1)获得的基因组DNA为模板,对合成的引物用翘嘴鲌个体进行PCR扩增,利用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出16对扩增效果较好的引物,所述引物包括正向引物、反向引物。
(4)多重PCR体系的摸索和确定
进行多重PCR扩增:对步骤(3) 中筛选得到的引物按照扩增后的PCR产物按照120-180bp、200-260bp、280-340bp、360-420bp四个不同区间进行初步分组;首先两两组合,选出扩增清晰的组合,再依次进行3个和4个位点的多重PCR体系的摸索和构建。依据2.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果,然后不断优化各组内引物的浓度配比,确保扩增条带清楚并不重叠。最终,确定了基于12个微卫星位点的3个4重PCR体系,重新将每对引物的上游引物的5’端进行荧光修饰(HEX或6-FAM)。
(5)获取翘嘴鲌样本的基因型数据
基于步骤(4)构建的多重PCR体系,对所有步骤(2)获得的DNA样进行扩增,并抽取适量扩增产物(4μl)在2.5%琼脂糖凝胶上电泳检测,检测合格后,送至生物公司采用ABI3720XL进行毛细管电泳检测,并利用GeneMapper 4.0对结果进行分析,从而获得亲本和子代各位点的基因型数据。
步骤(3)和步骤(4)中的扩增体系为:2× Multiplex PCR Mix 12.5μl,上下游引物的工作浓度为l0mmol/L,具体的使用量见表(1),50ng基因组DNA,补加灭菌超纯水至体系为25μl。
步骤(3)和步骤(4)中的扩增的条件为:95℃总变性10分钟,95℃变性30秒,退火温度(表1)退火30秒,72℃延伸30秒,共35个循环,最后72℃总延伸5分钟。
(6)使用前述的3种引物组合方式进行多重PCR扩增,多重PCR的扩增体系为:2×Multiplex PCR Mix 12.5μl,上下游引物的工作浓度为l0mmol/L,具体的使用量见表(1),20ng基因组DNA,补加灭菌超纯水至体系为25μl;扩增的条件为:95℃总变性10分钟,95℃变性30秒,退火温度(表1)退火30秒,72℃延伸30秒,共35个循环,最后72℃总延伸5分钟。
(7)PCR扩增产物经适当稀释后,与分子量内标混合,在ABI 3130测序仪上进行毛细管电泳分析;
(8)使用Genemapper v4.0软件分析电泳结果,得到每个个体微卫星标记的基因型数据;混合12个全同胞家系的480个子代个体的基因烈数据,以检验微卫星多重PCR在亲子鉴定中的效率;使用Cervus 3.0软件对亲本和子代个体进行亲缘关系分析,计算每个子代最可能的父母本个体;根据分析结果,将置信度最高的雄性和雌性个体确认为子代个体亲本。
结果显示,在全部的24个亲本和480个子代中,在95%置信水平下,运用该发明所述的3组4重PCR(12个位点)即可达到100%的亲子鉴定成功率。
实施例2 :
(1)在湖州养殖场采集32个养殖个体;
(2)使用苯酚氯仿法提取每个样本的DNA,将获得的DNA测定浓度后稀释至约50ng/μl;
(3)根据前述筛选的12种引物序列以及修饰方法合成引物,方法同实施例1;
(4)使用前述的3种引物组合方式进行多重PCR扩增,多重PCR的扩增体系和扩增条件同实施例1;
(5)PCR扩增产物经适当稀释后,与分子量内标混合,在ABI 3130测序仪上进行毛细管电泳分析;
(6)使用Genemapper v4.0软件分析电泳结果,得到32个个体微卫星标记的基因型数据。进行分析如表2:
表2 12个微卫星位点在湖州养殖群体32个样本中的遗传参数检测
注:Na为等位基因数目;Ho为观测杂合度;He为期望杂合度;PIC为多态信息含量;HWE为哈迪-温伯格平衡。
Claims (3)
1.一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法,包括以下步骤:
(1)翘嘴鲌样本DNA提取
取翘嘴鲌个体的鳍条,采取酚—氯仿法提取基因组DNA,将获得的DNA测定浓度后稀释至约50ng/μl;
(2)翘嘴鲌多态性微卫星序列的筛选
用步骤(1)获得的基因组DNA为模板,根据Primer Premier 6.0软件设计微卫星位点引物,合成引物,并通过对翘嘴鲌个体进行PCR扩增,筛选出16对引物,所述引物包括正向引物、反向引物;
(3)对微卫星位点多重PCR扩增效果摸索、确定
进行多重PCR扩增:对步骤(2) 中筛选得到的16对引物按照扩增后的PCR产物按照120-180bp、200-260bp、280-340bp、360-420bp四个不同区间进行初步分组;首先两两组合,选出扩增清晰的组合,再依次进行3个和4个位点的多重PCR体系的构建;最终获得由12个微卫星位点组成的3组4重 PCR体系,将每个位点上游引物的5'端进行荧光修饰,然后,对所有亲本和子代DNA样本进行多重PCR扩增;所述的3组4重PCR体系的引物信息如下所示:
第一组引物信息:
Cal018位点的引物为:上游引物:ATGAACACAACTTACC(5'-3')、下游引物CAAGGACAAGGATTATG(5'-3');
Cal029位点的引物为:上游引物:TACTGAGTGAGAAACCTTTCC(5'-3')、下游引物:AACTACCAATGCCTGATTCC(5'-3');
Cal006位点的引物为:上游引物:GCGTATTCCTCTCCTGATTC(5'-3')、下游引物AGATGTCGTGGTTAGTTTCA(5'-3');
Cal019位点的引物为:上游引物:GTATAACACAGAATGACACAGG(5'-3')、下游引物:TTCACGCACTTCAAACACT(5'-3');
第二组引物信息:
Cal050位点的引物为:上游引物:AAGTAGAGCGAGCAGAGA(5'-3')、下游引物GAGAGCATTCAGGAAGCA(5'-3');
Cal053位点的引物为:上游引物:CCATATCCAGCACTCTAACA(5'-3')、下游引物TCATCAACTCTCACACTCTC(5'-3');
Cal049位点的引物为:上游引物:TGTGTCGTGATGGAGGAG(5'-3')、下游引物GCGGTGTTCTGCTTCTTC(5'-3');
Cal054位点的引物为:上游引物:TGGCACAACAACACAGAC(5'-3')、下游引物AGACCTCCTCCTCTTCTC(5'-3');
第三组引物信息:
Cal052位点的引物为:上游引物:ACCTGTCCACCTCAATCA(5'-3')、下游引物GAATCTGCCGTTCTCACTA(5'-3');
Cal046位点的引物为:上游引物:TTGGACTGAGAGAAGGAAAT(5'-3')、下游引物AAGAGACTGAACATTGAAGC(5'-3');
Cal017位点的引物为:上游引物:ACCGCAACATTACAAAGAC(5'-3')、下游引物GCATAGTGACATCATAGCAT(5'-3');
Cal001位点的引物为:上游引物:CCTGCTATTGTTTCTTTCATCC(5'-3')、下游引物TTCCATATCCTCTCATCCTTCA(5'-3');
4)获取翘嘴鲌样本的基因型数据。
2.根据权利要求1所述一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法,其特征在于,步骤(2)和步骤(3)中的扩增体系为:2× Multiplex PCR Mix 12.5μl,上下游引物的工作浓度为l0mmol/L,50ng基因组DNA,补加灭菌超纯水至体系为25μl,Cal018位点的引物使用量为0.8μl,Cal029位点的引物用量为0.4μl,Cal006位点的引物使用量为0.8μl,Cal019位点的引物使用量为0.4μl,Cal050位点的引物使用量为0.6μl,Cal053位点的引物使用量为0.5μl,Cal049位点的引物使用量为0.3μl,Cal054位点的引物使用量为0.5μl,Cal052位点的引物使用量为0.8μl,Cal046位点的引物使用量为1.0μl,Cal017位点的引物使用量为0.5μl,Cal001位点的引物使用量为0.5μl。
3.根据权利要求1所述一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法,其特征在于,步骤(2)和步骤(3)中的扩增的条件为:95℃总变性10分钟,95℃变性30秒,退火温度下退火30秒,72℃延伸30秒,共35个循环,最后72℃延伸5分钟。
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