KR101796306B1 - 말전복 탐지용 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 말전복 탐지 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말전복을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커, 상기 마커를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 및 상기 말전복 특이적 마커를 이용하여 말전복을 탐지하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 통하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 경제적인 방법으로 말전복을 탐지할 수 있다.

Description

말전복 탐지용 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 말전복 탐지 방법 {Mircrosatellite marker for detecting Haliotis gigantean and method of detecting Haliotis gigantean using the same}

본 발명은 말전복을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커, 상기 마커를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 및 상기 말전복 특이적 마커를 이용하여 말전복을 탐지하는 방법에 관한 것이다.

우리나라의 전복 양식생산량은 중국에 이어 세계 2위로 국내 전복 생산량 및 생산금액, 수출실적은 매년 증가하고 있는 추세이며 전복 먹이인 양질의 다시마와 미역을 대량 공급하는데 유리한 환경이 조성되어있다. 또한, 최근 전 세계적으로 잠재적 시장가치가 큰 양식 산업으로 각광받고 있고, 국내 전복양식 현장에서는 성장성, 내병성에 대한 한계에 직면하여 우량 전복 육종에 대한 수요는 날로 커지고 있다.

주요국의 관련 연구를 살펴보면, 미국의 전복 교잡 연구팀은 H. rufescens, H. sorenseni, H. corrugata의 종간 교잡 또는 역 교배 육종 기술을 이용하여 패각 형질의 개발 예를 보고하고 있고, 중국은 고급 종으로서 참 전복 (H. discus hannai, 일본 이와테산) 과 둥근 전복 (H. discus discus, 중국 대련산 ) 의 교잡종 (hybrid) 인 大連1호 (Dalian No.1) 를 중국과학원해양연구소에서 개발 보급하여 국가 신품종 및 우량 종 승인위원회에서 승인, 국가농업부에서 신품종 인증서를 발급하여 교잡 신품종으로서 확대 보급하여 양식 확산 중이다. 또한, 일본은 Cosmo해양목장주식회사에서 참 전복보다 성장이 빠르고, 환경 적응 능력이 뛰어나 사육이 용이한 참 전복과 말전복의 교잡종을 양식 전용 품종으로 판매하고 있다. 호주 또한 GSW (Great Southern Waters Pty Ltd.)와 호주연방과학산업연구기구 (CSIRO)와 공동으로 blacklip abalone과 greenlip abalone의 교잡종 (Jade Tiger Abalone, JTA)을 선발 육종 프로그램을 통해 개발하여 수준 높은 연구가 진행되고 있다.

이와 같이 유전자원 수집/관리 및 종자 대량생산 시스템 개발을 목표로 좋은 형질의 전복들의 유전자원을 확보 및 특성을 분석하여 좋은 형질을 보유한 교잡종의 개발이 요구되는 실정이다.

우리나라에 서식하는 대표적인 전복은 둥근 전복(까막전복, Haliotis discus discus), 왕 전복(Haliotis madaka), 말전복(Haliotis gigantea), 북방전복(참 전복, Haliotis discus hannai)의 4종으로서, 패각의 형태와 크기, 생식주기, 서식환경 등으로 구별된다.

"말전복(Haliotis gigantea)"은 복족강 원시복족목 전복과에 속하는 전복 중 대표적인 종류이며, 각장 25㎝에 달하는 것도 있을 정도로 전복 중 가장 대형이다. 주로 한국과 일본에 분포하며, 전복류 중에서 가장 깊은 50m 수심에서도 발견되고 산란기는 9월부터 1월까지이다. 패각은 타원형 또는 반달모양이고, 두껍고 단단하며, 등쪽이 둥글게 부풀어 올라와 있거나 편평하여 납작한 것도 있다. 체층이 특히 발달하여 패각의 거의 대부분을 차지하고 나층은 낮고 작으며, 성체에서는 거의 달아 없어져 차체층 일부만 남아 있다. 체층의 나선맥은 25줄 내외의 융기선으로 되어 있고, 성장맥은 가늘고 균일하게 분포되어 있으며, 성장에 따라 몇 개의 층을 이룬다. 공열은 왕전복의 것보다 많고 앞쪽 4개만이 뚫려 있다. 공열의 좌측 경사면은 둥글게 팽윤되어 있고 강한 나선맥이 없이 평평하다. 패각의 표면은 적갈색, 각구의 내면은 강한 진주색 광택을 낸다. 각구의 내순은 넓으나 폭이 비교적 일정하고 외순은 두껍고 나선맥에 따라 약간의 굴곡을 보인다. 왕전복과 비슷하여 혼동하기 쉬우나 공열이 가늘고 낮으며 좌측 경사면이 낮아 구별된다. 맛이 좋아 인기가 많으며 영양소를 풍부하게 함유하고 있어 약용으로도 널리 사용되며, 육질은 부드러워 명포제품(明鮑製品)에 적합하다.

그러나 양식장의 환경 악화, 밀식으로 인한 대량 폐사 발생, 종묘 열성화 등의 문제가 발생하면서 전복의 안정적인 생산을 도모하고자 속성장, 내병성의 우량 전복 품종을 개발하기 위해, 상기 4종의 전복을 간편한 방법으로 정확하게 구분해 낼 수 있는 분자 생물학적 마커의 개발이 요구되고 있다.

이러한 분자 생물학적 마커의 예로는, 지노믹 DNA (Genomic DNA, gDNA) 중에서 반복 DNA는 카피(copy) 수가 적거나 많은 두 종류로 나누어지며, 대부분은 고도의 반복적인 DNA가 대부분을 차지한다. 이러한 DNA상의 염기들의 구조와 유전체 상에서의 분포도를 분석한 결과, 이러한 부위들의 양말단 부위(flanking region) 들은 개체마다 동일한 DNA 구조로 잘 보존되어 있다는 것이 밝혀지면서 이들 염기 서열을 DNA 마커(marker)로 사용할 수 있으며, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 잘 보존된 영역의 염기서열에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 특정 영역을 증폭시킴으로써 다형성을 구별할 수 있다.

또 다른 반복 염기 서열로는 tandem repeated sequence motif가 있다. 이들 염기 서열은 새틀라이트(satellite) DNA 보다 카피(copy) 수가 적어 미니새틀라이트(minisatellites) 라고도 불리는데 반복 단위가 10 내지 50bp 정도이다. 그리고 마이크로새틀라이트(microsatellite: 미소부수체)는 핵심 염기서열이 반복된다는 점에서 미니새틀라이트(minisatellites)와 비슷하다. 그러나, 전형적인 미니새틀라이트(minisatellites)의 핵심 염기서열이 10개 이상의 염기서열 길이를 가지는 반면, 마이크로새틀라이트에서 핵심 염기서열은 대개 2 내지 4 bp 길이로 훨씬 적은점에서 차이가 있다.

단순 서열 반복체 (SSRs: simple sequence repeats)로도 불리는 마이크로새틀라이트 마커에 대한 연구는 1980년대 인간 게놈 연구에서부터 비롯되었다. 인간의 게놈에는 10만개 이상의 마이크로새틀라이트가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 높은 다형성을 나타내므로 혈액형, 동위효소 및 단백질 다형에 비해 비교할 수 없을 만큼 높은 식별력과 정보력을 갖는다. 따라서, 마이크로새틀라이트 마커들은 개인 식별이나 친자 확인 등 법의학적 활용은 물론, 염색체 지도 작성 및 질병 관련 유전자들의 탐색에 매우 유용하게 활용되고 있다.

1992년에 Jean Weissenbach 등은 2개 염기서열 반복을 포함한 814개의 마이크로새틀라이트를 기초로 전체 인간게놈의 연관지도를 만들었다. 마이크로새틀라이트를 포함하는 DNA를 구분할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 디자인하여 분석한 결과 PCR 산물은 한 유전좌에서 하나의 마이크로새틀라이트 내의 반복 수에 따라 각각 다르며 개인에 따라서도 다르게 나타났다. 따라서 마이크로새틀라이트는 고도로 변이(polymorphic)된 것을 알게 되었다. 이러한 점에서 마이크로새틀라이트는 연관지도와 물리적 지도를 위한 마커로 매우 이상적이다.

이러한 마이크로새틀라이트 마커는 인간의 경우뿐 아니라, 식물 또는 동물의 유전 육종이나 질병 및 분자생물학적 연구에 매우 유용한 것으로도 확인되는바, 이를 이용하여 상기 4종의 전복을 간편한 방법으로 정확하게 구분해 낼 수 있는 분자 생물학적 마커의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커를 이용한 다른 전복 품종으로부터 말전복 품종을 정확하면서도 간편하고 신속하게 구별할 수 있는 유전자 증폭방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 구체적으로, 둥근전복 내병성 유전자를 포함한 BAC library를 참조하여 MS마커 후보 서열 탐색, 둥근전복을 대상으로 마커 유용성 검증, 북방전복, 왕전복, 말전복을 대상으로 마커 유용성 검증, 대립유전자가 100 내지 300bp 정도이고 대립유전자 형태(allele type)가 낮은 MS 마커 6개 선별, 둥근전복, 북방전복, 왕전복 및 말전복에 적용, 종마다의 대립유전자의 빈도 비교 분석(Peak scan)으로 분석하여, 둥근전복, 북방전복 및 왕전복으로부터 말전복을 정확하고도 손쉽게 탐지해낼 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 말전복을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 염기서열을 포함하는 말전복 탐지용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커가 포함된 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 말전복 탐지용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로새틀라이트 마커 및/또는 프라이머 세트를 이용하여 말전복을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 말전복을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커 염기서열을 포함하는 말전복 탐지용 마커, 상기 마커를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 및 상기 말전복 특이적 마커를 이용하여 말전복을 탐지하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 하나의 양태로서, 본 발명은 말전복 탐지용 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커에 관한 것이다.

상기 마이크로새틀라이트 마커는 말전복 탐지용 마커일 수 있다.

상기 말전복 탐지용 마커는 말전복을 특이적으로 탐지, 예를 들어, 둥근전복, 북방전복 및 왕전복과 말전복을 구별되게 탐지할 수 있는 유전자 또는 이의 단편을 포함하는 것일 수 있다.

상기 말전복 탐지용 마커는 서열번호 13 내지 23으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 마커 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 15의 염기서열 또는 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 말전복 탐지용 마커는 마커 염기서열의 5'-말단에 태그(Tag) 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 태그 서열은 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 것을 수 있다. 상기 마커가 태그 서열을 포함하는 경우에는, 첫 번째 PCR 산물을 가지고 두 번째 PCR를 진행할 때 형광표지가 부착된 정방향 프라이머를 공통적으로 사용할 수 있다.

서열번호 13 내지 23의 염기서열을 하기 표 1 및 2에 나타내었으며, 태그 서열은 서열번호 24로 나타내었다. 또한, 하기 표의 크기의 경우 괄호 안에 숫자는 각각의 염기서열에 태그 서열이 추가로 연결된 경우의 크기를 나타내는 것이다.

MS 마커	서열 번호	대립 유전자	구조	염기서열	크기 (bp)
JH20	13	211	(AT)4	GCCAAGCAAGATGCCATAGTACTGCGGAAACAGGCATCTGTGTCAGTCAGCCTGTTCTTTCAATTTGTGCATCACTTTTATCTATTAAACCCTGA(ATATATAT)AATGGGGTTTAATGTTGCGTTCAAGATTGTAGCACTTATATAAGGATGTGTGTGTGGCTGCTTGTACTAGTCAGCACTAATGCCGA	189 (211)
	14	219	(AT)8	GCCAAGCAAGATGCCATAGTACTGCGGAAACAGGCATCTGTGTCAGTCAGCCTGTTCTTTCAATTTGTGCATCACTTTTATCTATTAAACCCTGA(ATATATATATATATAT)AATGGGGTTTAATGTTGCGTTCAAGATTGTAGCACTTATATAAGGATGTGTGTGTGGCTGCTTGTACTAGTCAGCACTAATGCCGA	197 (219)
	15	221	(AT)9	GCCAAGCAAGATGCCATAGTACTGCGGAGACAGGCATCTGTGTCAGTCAGCCTGTTCTTTCAATTTGTGCATTACTTTTATCTATTAAACCCTGA(ATATATATATATATATAT)AATGGGGTTTAATGTTGCGTTCAAGATTGTAGCACTTATATAAGGATGTGTGTGTGGCTGCTTGTACTAGTCAGCACTAATGCCGA	199 (221)
	16	223	(AT)10	GCCAAGCAAGATGCCATAGTACTGCGGAGACAGGCATCTGTGTCAGTCAGCCTGTTCTTTCAATTTGTGCATTACTTTTATCTATTAAACCCTGA(ATATATATATATATATATAT)AATGGGGTTTAATGTTGCGTTCAAGATTGTAGCACTTATATAAGGATGTGTGTGTGGCTGCTTGTACTAGTCAGCACTAATGCCGA	201 (223)
JH34	17	266	(AT)6	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGAGTTTTGTTTCAGACGCAAATTTCCATCTGAAAAGTGAACGTTGTGCGAGAATTTGTTTTATTTTTAACAGCTTTTCGGAAACTGTGTTAATAAAATACTGCCTAATATCTGAACAACAA(ATATATATATAT)GGATTTGTATATATATAACTTACACATTCGTTAGGAAAAATAGCTCGCCATAAATAAAGAAAATCGATTTTCATCTCTGACGCCGGCGTTC	244 (266)
	18	268	(AT)7	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGAGTTTTGTTTCAGACGCAAATTTCCATCTGAAAAGTGAACGTTGTGCGAGAATTTGTTTTATTTTTAACAGCTTTTCGGAAACTGTGTTAATAAAATACTGCCTAATATCTGAACAACAA(ATATATATATATAT)GGATTTGTATATATATAACTTACACATTCGTTAGGAAAAATAGCTCGCCATAAATAAAGAAAATCGATTTTCATCTCTGACGCCGGCGTTC	246 (268)

MS 마커	서열 번호	대립 유전자	구조	염기서열	크기 (bp)
JH34	19	270	(AT)8	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGAGTTTTGTTTCAGACGCAAATTTCCATCTGAAAAGTGAACGTTGTGCGAGAATTTGTTTTATTTTTAACAGCTTTTCGGAAACTGTGTTAATAAAATACTGCCTAATATCTGAACAACAA(ATATATATATATATAT)GGATTTGTATATATATAACTTACACATTCGTTAGGAAAAATAGCTCGCCATAAATAAAGAAAATCGATTTTCATCTCTGACGCCGGCGTTC	248 (270)
	20	272	(AT)9	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGAGTTTTGTTTCAGACGCAAATTTCCATCTGAAAAGTGAACGTTGTGCGAGAATTTGTTTTATTTTTAACAGCTTTTCGGAAACTGTGTTAATAAAATACTGCCTAATATCTGAACAACAA(ATATATATATATATATAT)GGATTTGTATATATATAACTTACACATTCGTTAGGAAAAATAGCTCGCCATAAATAAAGAAAATCGATTTTCATCTCTGACGCCGGCGTTC	250 (272)
	21	274	(AT)10	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGAGTTTTGTTTCAGACGCAAATTTCCATCTGAAAAGTGAACGTTGTGCGAGAATTTGTTTTATTTTTAACAGCTTTTCGGAAACTGTGTTAATAAAATACTGCCTAATATCTGAACAACAA(ATATATATATATATATATAT)GGATTTGTATATATATAACTTACACATTCGTTAGGAAAAATAGCTCGCCATAAATAAAGAAAATCGATTTTCATCTCTGACGCCGGCGTTC	252 (274)
	22	275	(AT)4	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGAGTTTTGTTTCAGACGCACATTTTCATCTGAAAAGTGAACGTTGTGCGAAAGTTTGTTTTATTTAACAGCTTTTCGGAAACTGTGTGCGAACAAAATATGCTGCCTCGTATCTGAACAACAA(ATATATAT)ACCAAATGGATTTGTATGCATATGTATAACTTACACATTCGTCAGGAAAAATAGCTCGCCATAAATAAAGGAAATCGAGTTTCATCTCTGACGCCGGCGTTC	253 (275)
	23	276	(AT)11	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGAGTTTTGTTTCAGACGCAAATTTCCATCTGAAAAGTGAACGTTGTGCGAGAATTTGTTTTATTTTTAACAGCTTTTCGGAAACTGTGTTAATAAAATACTGCCTAATATCTGAACAACAA(ATATATATATATATATATATAT)GGATTTGTATATATATAACTTACACATTCGTTAGGAAAAATAGCTCGCCATAAATAAAGAAAATCGATTTTCATCTCTGACGCCGGCGTTC	254 (276)
공통	24	-	-	GAGCTGTAAAACGACGGCCAGT	22

본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 말전복을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트(Mircrosatellite, MS) 마커를 포함하는 유전자 중합효소연쇄반응용(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머에 관한 것이다.

상기 프라이머는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 4의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 정방향 프라이머는 서열번호 25로 이루어진 태그 서열을 5'-말단에 추가로 포함하는 것일 수 있다. 정방향 프라이머가 상기 태그 서열을 추가로 포함하는 경우에는, 상기 정방향 프라이머를 통해 첫 번째 PCR을 수행하여 수득한 PCR 산물에 서열번호 24로 이루어진 염기서열의 부분을 공통적으로 포함되게 되며, 상기 PCR 산물을 가지고 두 번째 PCR를 진행할 때 서열번호 24에 대응하는 공통적인 염기서열을 갖는 정방향 프라이머를 사용할 수 있는 효과가 있다.

상기 두 번째 PCR을 진행할 때의 공통적인 염기서열을 갖는 정방향 프라이머는 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 두 번째 PCR을 진행할 때의 역방향 프라이머는 서열번호 4의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머 일 수 있다.

상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 말전복을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트(Mircrosatellite, MS) 마커를 포함하는 유전자 증폭용 프라이머 세트에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 프라이머 세트는,

서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 및 서열번호 4 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머;를 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는 중합효소연쇄반응용(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 세트일 수 있다.

예를 들어, 상기 프라이머 세트는,

서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;

서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;

서열번호 25의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및

서열번호 25의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;

으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하고 있는 것일 수 있다.

상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 상기 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 이들 모두는 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 태그 서열을 5'-말단에 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 프라이머는 마이크로새틀라이트 마커의 증폭산물의 유전자형을 분석할 수 있는 시그날을 제공하도록 적합하게 표지 될 수 있다.

상기 표지는 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 표지는 프라이머의 5'-말단 또는 3'-말단에 표지 된 것일 수 있며, 바람직하게는 5'-말단에 표지 된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 형광단은 플루오리신 (fluorescein, 예를 들어, 6-Carboxyfluorescein(FAM)), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), Cy3 및 Cy5 들 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정 등의 방법에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머는 형광단, 바람직하게는 플루오리신 (fluorescein), 더욱 바람직하게는 FAM(6-Carboxyfluorescein)으로 표지 된 것일 수 있다.

상기 프라미어들의 서열목록을 하기 표 3에 나타내었다.

서열 번호	명명	서열목록(5'->3')	Tm (℃)	산물 크기 (bp)	Repeat motif
3	JH20_F	GCCAAGCAAGATGCCATAGTACTGC	60.2	221-223	(AT)10
4	JH20_R	TCGGCATTAGTGCTGACTAGTACAAGC	60.1
5	JH34_F	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGA	61.0	275	(AT)11
6	JH34_R	GAACGCCGGCGTCAGAGATG	61.0
25	Tag	GAGCTGTAAAACGACGGCCAGT	-	-	-
26	TAG_F	FAM-GAGCTGTAAAACGACGGCCAGT	59.8	-	-

본 발명의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트는 말전복에서 특이적으로 나타나는 마이크로새틀라이트 마커가 포함된 유전자를 증폭하는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 말전복 탐지용 키트를 제공한다.

상기 키트는 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 증류수를 포함할 수 있으며, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액, 효소 등이 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 말전복을 탐지하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 말전복을 탐지하는 방법은,

전복류에서 추출한 시료에 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및

상기 PCR 산물이 서열번호 13 내지 23으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 마커 염기서열을 포함하는지를 분석하는 단계;

를 포함하는 것일 수 있다.

상기 중합효소연쇄 반응을 수행하는 단계는 서열번호 13 내지 23으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 마커 염기서열을 포함하는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커가 포함됨 유전자를 증폭하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 중합효소연쇄 반응을 수행하는 단계는,

전복류에서 추출한 시료를 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및

상기 PCR 산물이 서열번호 13 내지 23으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 마커 염기서열을 포함하는지를 분석하는 단계;

를 포함하는 것일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 중합효소연쇄 반응을 수행하는 단계는,

전복류에서 추출한 시료를 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 1차 PCR 산물을 얻는 단계;

서열번호 25의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 2차 PCR 산물을 얻는 단계; 및

상기 2차 PCR 산물을 분석하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머는 서열번호 25로 이루어진 태그 서열을 5'-말단에 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계는 통상의 중합효소연쇄반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR) 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응((Real time PCR)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 리얼타임 중합효소연쇄반응일 수 있다. 상기 컨벤셔널 중합효소연쇄반응은 특정 DNA를 증폭한 후에, 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 중합효소연쇄반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 있다. 상기 리얼타임 중합효소연쇄반응은 바람직하게는 SYBR Green I을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응일 수 있다.

상기 중합효소연쇄반응은 통상의 중합효소연쇄반응용 기기를 사용하여 실시할 수 있으며, 상기 중합효소연쇄반응용 기기는 바람직하게는 리얼타임 중합효소연쇄반응용 기기, 열 블록 중합효소연쇄반응(Thermal Block PCR)용 기기, 마이크로 중합효소연쇄반응(Micro PCR)용 기기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 리얼타임 중합효소연쇄반응용 기기일 수 있다.

상기 주형 DNA 즉, 시료 DNA의 추출은 통상의 DNA 추출법으로 수행할 수 있으며, 상기 DNA 추출법은 바람직하게 는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method), 열수추출법, 컬럼(Column) 추출법 또는 페놀/클로로포름 (Phenol/Chloroform) 추출법일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method)일 수 있다.

상기 증폭 산물을 분석하는 단계는 PCR 산물을 분석하여, 말전복 특이적 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커의 존재를 확인하는 것일 수 있다. 상기 분석을 위한 방법으로는 PCR 산물의 염기서열을 분석하거나, 또는 마이크로새틀라이트 마커의 반복 서열의 수에 따라 달라지는 증폭산물의 크기를 분석하여 유전자형을 분류함으로써 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에서는 증폭된 말전복 특이적 마이크로새틀라이트 마커를 포함하고 있는 유전자 단편을 분석하여 이의 유전자형을 결정한다. 예를 들어, 마이크로새틀라이트 마커의 반복 서열의 수에 따라 달라지는 증폭산물의 크기를 분석하여 다양한 유전자형을 분류하고, 분류된 유전자형의 통계 자료에 기초하여 둥근전복, 북방전복, 왕전복 및 말전복을 식별하여, 말전복을 탐지한다.

즉, 둥근전복, 북방전복, 왕전복 및 말전복에 고빈도로 나타나거나 특이적으로 나타나는 마이크로새틀라이트 마커의 유전자형에 대한 정보를 축적하고, 축적된 정보에 근거하여 식별하려는 시료로부터 얻는 유전자형을 기존 축적된 유전자형 정보와 비교함으로써 둥근전복, 북방전복, 왕전복 및 말전복의 품종을 높은 신뢰도로 식별하는 것이 가능하다.

본 명세서에서 용어 "마이크로새틀라이트(microsatellite)"는 2 내지 6개 정도의 염기서열이 반복되는 DNA 군 (repetitive DNA group)으로 게놈 내에 골고루 분포하고 매우 높은 다형성을 나타내는 비암호화 DNA 서열 (non-coding DNA sequence)을 의미한다. 마이크로새틀라이트 DNA는 특정 좌위에서 반복단위의 반복수에 따라 개체간의 다양성이 인정되는데, 반복수에 품종간 다형이 있는 경우에 인접영역에 설계한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)과 같은 유전자증폭 반응을 행하면, 증폭반응 산물 길이에 다형이 관찰되고, DNA 다형을 검출하는 것이 가능해진다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 명세서에서 용어 "프라이머 쌍"은 정방향 프라이머 1개와 역방향 프라이머 1개로 이루어진 것을 의미한다. 또한, "프라이머 세트"는 상기 프라이머 쌍을 1개 이상 포함하고 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드" 는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 마이크로새틀라이트 마커의 분석으로 식별 가능한 전복의 품종은 둥근전복, 북방전복, 왕전복 및 말전복을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 말전복을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커, 상기 마커를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 및 상기 말전복 특이적 마커를 이용하여 말전복을 탐지하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 MS 마커 검출용 프라이머 세트를 이용하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 경제적인 방법으로 말전복을 탐지할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 MS 마커 JH4의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 MS 마커 JH20의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 MS 마커 JH34의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 MS 마커 JH50의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 MS 마커 JH51의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 MS 마커 JH63의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. MS 마커 후보 선정 및 프라이머 제작

실험실에서 보유하고 있는 둥근전복 BAC 라이브러리에서 내병성 유전자를 포함하는 BAC 클론을 분석하고 이를 토대로 마이크로새틀라이트(microsatellite; 이하, MS)를 선별하였고 이를 증폭시키는 프라이머 쌍을 제작하였다. 프라이머 유효성은 PCR로 확인하였고, 둥근전복, 북방전복, 왕전복 및 말전복 모두에서 DNA 증폭이 확인되는 MS 마커 후보 중에서 대립유전자(allele)가 100 내지 300 bp 정도로 짧은 6개를 선정하였다. 대립유전자가 짧은 마커를 선택한 이유는 대립유전자의 길이가 길어짐으로 인한 시퀀싱의 오버랩핑(overlapping)을 최소화하기 위해서이다.

그 다음, 상기 선정된 MS 마커 후보를 포함하고 있는 전복 유전자를 증폭시키는 프라이머(primer)를 설계하였다. 상기 프라이머 중 정방향 프라이머에는 22개 염기로 구성된 인위적인 태그 서열(서열번호 25)을 전복 유전자 앞쪽(5'-말단)에 추가로 포함하도록 하였다. 태그 서열을 추가로 포함하도록 한 이유는 첫 번째 PCR 산물을 가지고 두 번째 PCR를 진행할 때 형광표지가 부착된 정방향 프라이머를 공통적으로 사용하기 위함이다.

두 번째 PCR용 공통의 정방향 프라이머에는 증폭된 마이크로새틀라이트 단편의 검출 및 유전자형 분석을 용이하게 하기 위해서 5'말단에 FAM (6-carboxyfluorescein)로 수식(modification)하고 태그 서열이 오도록 하였다. 프라이머 합성은 IDT(미국)에 의뢰하여 제작하였다.

상기 프라미어들의 서열목록을 하기 표 4에 나타내었다.

MS 마커	서열 번호	명명	서열목록(5'->3')	Tm	Repeats motif	예상 산물 크기 (bp)
JH4	1	JH4_F	ATTGTTTGAAGCCACAAGTAGGGCTG	59.7	(AC)8	140 (162)
	2	JH4_R	CAGGGCTATACTAAAACTGTACCCAATTGGA	59.5
JH20	3	JH20_F	GCCAAGCAAGATGCCATAGTACTGC	60.2	(AT)10	199 (221)
	4	JH20_R	TCGGCATTAGTGCTGACTAGTACAAGC	60.1
JH34	5	JH34_F	CACTAGGGTGCTATGTGGCCGA	61.0	(AT)11	253 (275)
	6	JH34_R	GAACGCCGGCGTCAGAGATG	61.0
JH50	7	JH50_F	GACACGCATTCTATTGCAATTGCAACATGA	60.1	(AAC)10	166 (188)
	8	JH50_R	CATTTGTGCCAACTGCATGAGAGCA	60.4
JH51	9	JH51_F	ACAGATTGCCTGAAAGATATGTTCCGCTT	60.2	(AT)10	203 (225)
	10	JH51_R	GCGGATTCATGCAGTTTGCACATC	59.4
JH63	11	JH63_F	CATGGCTTCTAACTGAGCAAGTGTCTATCAC	60.2	(GAT)10	226 (248)
	12	JH63_R	ACTCAACCCAAAAATGTACGAGAATCCGT	60.0
공통	25	Tag	GAGCTGTAAAACGACGGCCAGT	-	-	-
공통	26	TAG_F	FAM-GAGCTGTAAAACGACGGCCAGT	59.8	-	-

실시예 2. PCR을 통한 MS 마커의 증폭

둥근전복 10마리, 북방전복 10마리, 왕전복 10마리, 말전복 9마리를 3세부 제주해양수산연구원의 도움으로 수집하여, 총 39마리의 gDNA를 분리한 뒤, 상기 실시예 1의 설계한 각각의 프라이머 쌍으로 PCR을 수행하였다.

구체적으로, 첫 번째 PCR은 각각의 시료를 gDNA(50 ng/㎕) 2 ㎕, 10X reaction buffer 5 ㎕, dNTP(each 2.5mM) 5 ㎕, tag-forward primer 2.5 ㎕, reverse primer 2.5 ㎕, Extaq polymerase 0.25 ㎕, reaction water 32.75 ㎕을 혼합하였고 94 에서 5분간 반응시킨 뒤, 94 에서 30초, 58 에서 30초, 72 에서 30초간 총 35회 걸쳐 서열을 증폭시키고 마지막으로 72 에서 1분간 안정화시켜 PCR를 마무리하여, 총 40개의 첫 번째 PCR 산물을 수득하였다. PCR 산물은 PCR purification으로 정제하여 두 번째 PCR에 사용하였다.

두 번째 PCR은 각각의 시료를 첫 번째 PCR 산물 1 ㎕, 10X reaction buffer 5 ㎕, dNTP(each 2.5mM) 5 ㎕, FAM-tag primer 1.5 ㎕, reverse primer 1.5 ㎕, Extaq polymerase 0.25 ㎕, reaction water 35.75 ㎕을 혼합하였고 94 에서 5분간 반응시킨 뒤, 94 에서 30초, 58 에서 30초, 72 에서 30초간 총 35회 걸쳐 서열을 증폭시키고 마지막으로 72 에서 1분간 안정화시켜 PCR를 마무리하여, 총 40개의 두 번째 PCR 산물을 수득하였다

증폭된 DNA는 10 ㎕의 반응액에 2 ㎕의 6X Gel loading buffer (BIOMEDIC 사)를 첨가한 뒤, EtBr(Ethidium Bromide)가 첨가된 1.5％ 아가로스(agarose) 젤에서전기영동을 통해 밴드를 확인하여, PCR 증폭 산물을 확인하였다.

실시예 3. PCR에 의해 증폭된 MS 마커의 유전자형 분석

상기 실시예 2에서 얻은 두 번째 PCR 증폭 산물은 마크로젠(한국)에 보내 Fragment Anlaysis Service (Genescan Service, http://www.macrogen.com/kor/business/seq_Microsatelite%20Analysis.html)를 의뢰하였다. 결과파일(.FSA 포맷)을 받아 Peak Scanner Software 2 (version 2, Applied Biosystems)로 마커와 개체마다의 대립유전자 유형을 분석하고 엑셀로 정리하였다. GenAIEx 6.5(Genetic Analysis in Excel)로 대립유전자의 분포와 빈도를 분석하였다.

분석한 결과는 각각 하기 표 5 내지 10 및 도 1 내지 5에 나타내었다. 구체적으로, 표 5 및 도 1은 JH4의 대립유전자 빈도, 표 6 및 도 2는 JH20의 대립유전자 빈도, 표 7 및 도 3은 JH34의 대립유전자 빈도, 표 8 및 도 4는 JH50의 대립유전자 빈도, 표 9 및 도 5는 JH51의 대립유전자 빈도, 표 10 및 도 6은 JH63의 대립유전자 빈도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

대립유전자	둥근전복	북방전복	왕전복	말전복
154	-	0.050	-	-
156	-	-	0.050	-
158	0.100	-	-	-
160	0.900	0.950	0.950	0.444
162	-	-	-	0.167
164	-	-	-	0.056
170	-	-	-	0.056
172	-	-	-	0.278
합	1.000	1.000	1.000	1.000

상기 표 5는 JH4 분석결과를 나타낸 표이다. 표 5에서 볼 수 있듯이, 둥근전복에서는 160 대립유전자가 0.9의 빈도를 보였으며 북방전복과 왕전복에서는 0.950의 빈도를, 말전복에서는 0.444의 빈도를 보였다. 결과적으로, 4개의 전복 종마다 나타나는 대립유전자의 형태는 다르나, 그 빈도수가 0.5를 넘지 못해 종을 구분하는 용도에 사용하기에는 적합하지 않음을 확인하였다.

대립유전자	둥근전복	북방전복	왕전복	말전복
211	0.111	0.200	0.100	-
219	0.889	0.800	0.900	-
221	-	-	-	0.875
223	-	-	-	0.125
합	1.000	1.000	1.000	1.000

상기 표 6은 JH20 분석결과를 나타낸 표이다. 표 6에서 볼 수 있듯이, 둥근전복에서는 219 대립유전자가 0.889의 빈도를 보였으며, 북방전복과 왕전복에서는 각각 0.800, 0.900의 빈도를, 말전복에서는 나타나지 않았다. 결과적으로, 둥근전복, 북방전복, 왕전복에서 나타나는 대립유전자의 형태는 211과 219, 이 두 가지 형태이나 말전복에서는 대립유전자 221가 빈도 0.875로, 223는 0.125의 빈도로 나타났다. 따라서, JH20를 MS 마커로 사용할 경우 말전복을 구분할 수 있음을 확인하였다.

대립유전자	둥근전복	북방전복	왕전복	말전복
266	0.400	0.650	-	-
268	0.050	0.050	-	-
270	0.100	0.200	0.250	-
272	0.250	0.100	0.450	-
274	0.100	-	0.300	-
275	-	-	-	1.000
276	0.100	-	-	-
합	1.000	1.000	1.000	1.000

상기 표 7은 JH34 분석결과를 나타낸 표이다. 표 7에서 볼 수 있듯이, 둥근전복에서는 275를 제외한 대립유전자가 골고루 분포되어있으나, 북방전복에서는 266, 264, 270, 272 대립유전자, 왕전복은 270, 272, 274 대립유전자를 확인할 수 있었다. 말전복인 경우 다른 전복 종과는 달리 275 대립유전자가 1.0의 빈도로 나타났다. 결과적으로, 말전복을 구분하는 마커로 JH34를 이용할 수 있음을 확인하였다.

대립유전자	둥근전복	북방전복	왕전복	말전복
170	0.250	0.600	0.050	0.556
173	0.700	0.350	0.500	0.111
178	-	-	-	0.222
184	-	-	-	0.056
187	-	-	-	0.056
194	-	-	0.100	-
197	0.050	0.050	0.200	-
203	-	-	0.150	-
합	1.000	1.000	1.000	1.000

상기 표 8은 JH50 분석결과를 나타낸 표이다. 표 8에서 볼 수 있듯이, 둥근전복에서는 173 대립유전가 0.7의 빈도로, 북방전복에서는 170 대립유전자가 0.6의 빈도로, 왕전복에서는 173 대립유전자가 0.5 빈도로, 말전복에서는 170 대립유전자가 0.556 빈도로 나타났다. 결과적으로, 말전복의 경우 다른 전복 종에서 나타나지 않는 대립유전자가 있으나 그 빈도가 0.5보다 작아 말전복을 탐지하는 마커로서의 유효성이 없음을 확인하였다.

대립유전자	둥근전복	북방전복	왕전복	말전복
209	0.050	-	-	-
215	0.550	0.550	0.100	-
217	-	0.100	-	-
219	0.400	0.250	0.600	1.000
227	-	0.050	-	-
229	-	0.050	0.300	-
합	1.000	1.000	1.000	1.000

상기 표 9는 JH51 분석결과를 나타낸 표이다. 표 9에서 볼 수 있듯이, 둥근전복과 북방전복에서는 215 대립유전자가 0.550의 빈도로, 왕전복에서는 219 대립유전자가 0.6 빈도로, 말전복에서는 219 대립유전자가 1.000 빈도로 나타났다. 또한, 둥근전복, 왕전복, 북방전복의 경우 여러 형태의 대립유전자가 확인되었으나 말전복에서는 219 대립유전자만을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 말전복의 대립유전자가 다른 전복 종에서 나타나기 때문에 말전복을 구분하기 어렵고 다른 3종의 전복도 JH31로는 구별하기에 어려움이 있음을 확인하였다.

대립유전자	둥근전복	북방전복	왕전복	말전복
237	0.100	-	0.200	0.167
241	-	-	0.050	0.167
244	0.100	0.350	0.050	-
247	0.200	0.500	-	0.167
250	0.100	-	0.150	-
253	0.150	-	-	-
256	0.050	-	0.200	0.250
259	0.100	-	0.200	-
262	-	0.050	-	-
265	0.100	0.100	0.150	0.083
268	0.100	-	-	-
271	-	-	-	0.167
합	1.000	1.000	1.000	1.000

상기 표 10은 JH63 분석결과를 나타낸 표이다. 표 11에서 볼 수 있듯이, 둥근전복은 여러 형태의 대립유전자로 분산된 빈도를 보여주었다. 북방전복의 경우 247 대립유전자가 0.5의 빈도를 보여주었으며, 왕전복 및 말전복의 대립유전자도 둥근전복과 비슷하게 여려 형태로 분산되어 있음을 확인할 수 있다. 결과적으로, JH63으로 4개의 전복을 구별하기 어려울 것임을 확인하였다.

분석 결과

둥근전복, 왕전복, 북방전복의 3종류 전복과 말전복을 확실히 구별할 수 있는 MS 마커로 JH20과 JH34를 활용할 수 있음을 확인하였다.

<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Mircrosatellite marker for detecting Haliotis gigantean and method of detecting Haliotis gigantean using the same <130> DPP20151835KR <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH4_F <400> 1 attgtttgaa gccacaagta gggctg 26 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH4_R <400> 2 cagggctata ctaaaactgt acccaattgg a 31 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH20_F <400> 3 gccaagcaag atgccatagt actgc 25 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH20_R <400> 4 tcggcattag tgctgactag tacaagc 27 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH34_F <400> 5 cactagggtg ctatgtggcc ga 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH34_R <400> 6 gaacgccggc gtcagagatg 20 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JH50_F <400> 7 gacacgcatt 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Claims (16)

1. 서열번호 15, 16 및 22로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하는 마이크로새틀라이트(MS) 마커로서,
   상기 마커는 핵심 반복 모티프(core repeat motif)로 (AT)를 포함하며,
   둥근전복, 북방전복 및 왕전복으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과 구별하여 말전복만을 선택적으로 탐지하는, 말전복 탐지용 마커.
2. 제1항에 있어서, 상기 마커 염기서열은 5'-말단에 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 태그 서열을 추가로 포함하는 것인, 말전복 탐지용 마커.
3. 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 또는
   서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 중합효소연쇄반응용(Polymerase chain reaction, PCR) 프라이머 세트로서,
   상기 프라이머 세트는 핵심 반복 모티프(core repeat motif)로 (AT)를 포함하는 마이크로새틀라이트(MS)마커 증폭용 프라이머 세트.
4. 제3항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것인, 프라이머 세트.
5. 삭제
6. 제3항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 이들 모두는, 상기 프라이머의 5'-말단에 연결된, 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 태그 서열을 추가로 포함하는 것인, 프라이머 세트.
7. 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하며, 상기 프라이머 세트는 핵심 반복 모티프(core repeat motif)로 (AT)를 포함하는 마이크로새틀라이트(MS)마커 증폭용이며, 둥근전복, 북방전복 및 왕전복으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과 구별하여 말전복만을 선택적으로 탐지하는, 말전복 탐지용 키트.
8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 말전복 탐지 마이크로새틀라이트 (Mircrosatellite, MS) 마커가 포함된 유전자 증폭용이며, 상기 MS마커가 서열번호 15, 16 및 22로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하는 것인, 말전복 탐지용 키트.
9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 완충용액, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 것인, 말전복 탐지용 키트.
10. 제3항 또는 제4항에 따른 프라이머 세트를 이용하여, 전복류에서 추출한 시료에 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및
    상기 PCR 산물의 분석 단계를 포함하며,
    둥근전복, 북방전복 및 왕전복으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과 구별하여 말전복만을 선택적으로 탐지하는, 말전복 탐지 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 PCR 산물의 분석 단계는,
    상기 PCR 산물이, 핵심 반복 모티프(core repeat motif)로 (AT)를 포함하는 서열번로 15, 16 및 22로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 말전복 탐지용 마커 염기서열을 포함하는지를 분석하는 것인, 말전복 탐지 방법.
12. 삭제
13. 삭제
14. 제11항에 있어서, 상기 말전복 탐지용 마커 염기서열은, 그 5'-말단에 연결된 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 태그 서열을 추가로 포함하는 것인, 말전복 탐지 방법.
15. 삭제
16. 제10항에 있어서, 상기 PCR 산물을 분석하는 단계는, PCR 산물의 염기서열을 분석하거나 또는 PCR 산물의 크기를 분석하여 PCR 산물의 유전자형을 분석하는 것인, 말전복 탐지 방법.

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