KR102039309B1 - 재래닭 개체 식별용 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재래닭의 개체식별을 위한 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체식별 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 MCW0145, LEI0094, MCW0127, MCW0029, GCT0016, ADL0317, MCW0104, MCW0330, ADL0293로 이루어지는 초위성체 마커 제1세트 및 MCW0029, ADL0317, MCW0264, MCW0123, ADL0304, LEI0074, MCW0087, ADL0292 및 MCW0228로 이루어지는 초위성체 마커 제2세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 초위성체 마커 세트를 이용하여 멀리플렉스 PCR로 증폭하는 단계 및 상기 증폭된 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 재래닭의 개체 식별방법에 대한 것이다.
본 발명에 따르면 종래 기술에서 사용된 것보다 높은 개체 식별력을 가진 초위성체 마커들로 인해, 더욱 정확한 개체 식별 결과를 제공할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 16종의 초위성체 마커들은 동일개체 출현확률이 무작위 교배집단에서는 1.79×10-21, 반형매 교배집단에서는 6.76×10-16, 전형매 교배집단에서는 5.70×10-8으로, 국내에서 사육되는 재래닭에 대하여 동일개체 출현 가능성이 없어 재래닭의 개체 식별에 유용하게 사용될 수 있다. 이에 따라, 재래닭의 유통과정에서 부정행위를 방지하는 수단으로 활용될 수 있으며, 재래닭에 대한 소비자의 신뢰도를 상승시켜 생산 농가의 소득 증대에 도움을 줄 수 있다.
본 발명에 따르면 종래 기술에서 사용된 것보다 높은 개체 식별력을 가진 초위성체 마커들로 인해, 더욱 정확한 개체 식별 결과를 제공할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 16종의 초위성체 마커들은 동일개체 출현확률이 무작위 교배집단에서는 1.79×10-21, 반형매 교배집단에서는 6.76×10-16, 전형매 교배집단에서는 5.70×10-8으로, 국내에서 사육되는 재래닭에 대하여 동일개체 출현 가능성이 없어 재래닭의 개체 식별에 유용하게 사용될 수 있다. 이에 따라, 재래닭의 유통과정에서 부정행위를 방지하는 수단으로 활용될 수 있으며, 재래닭에 대한 소비자의 신뢰도를 상승시켜 생산 농가의 소득 증대에 도움을 줄 수 있다.
Description
본 발명은 재래닭의 개체 식별을 위한 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 높은 수준의 검정력을 확보하면서 더욱 정확한 개체 식별이 가능한 초위성체 마커들의 조합을 형성하고, 이를 이용하여 재래닭의 개체를 식별하는 방법에 대한 것이다.
가금육은 우리나라 전체 육류 생산량의 20% 이상을 차지하고 있을 정도로 농가의 소득 및 농촌 경제에 중요한 역할을 담당하고 있다. 그 중에서 가장 높은 비율을 차지하는 닭의 경우 닭고기 소비시장의 대부분이 축산 선진국(미국, 영국, 프랑스, 독일, 덴마크 등)으로부터 수입한 수입닭이 차지하고 있으며, 국내 재래닭의 경우는 닭고기 소비시장의 10% 내외로서 상당히 낮은 비율을 차지하고 있는 실정이다.
소, 돼지의 경우 생산이력제 사업이 추진되어 국내종과 수입종의 구분으로 신뢰성을 확보해 나가고 있는 반면, 재래닭의 경우 보존 및 개발이 많이 이루어져 있지 않은 상태에 있고 그 명칭이나 구분이 명확하지 않아 국내종으로서의 신뢰성 확보가 시급하다.
따라서, 앞으로 개발될 재래닭의 종자의 경우 유전자형을 이용한 개체식별 방법을 확립하여 고급육을 브랜드육으로 발전시키고, 재래닭의 신뢰성을 증가시키기 위한 유전자 감식 기법의 활용이 필요하다. 그러나, 닭의 유전자 상에서 개체 식별이 가능한 도메인(domain)은 닭의 품종에 따라 다양하게 나타나기 때문에, 닭의 개체 식별을 위해서는 닭의 특이적인 유전양상에 근거한 표지 유전자를 선정하고, 이들을 활용한 유전자 감식기법을 설정하는 것이 중요하다.
한편, 국내에서 닭 유전자의 보존 측면과 품종 간 유전적 다양성 연구와 친자 확인용으로 개발된 유전자 표지(초위성체 마커: Microsatellite Marker)를 활용한 유전자 감식 기법이 사용되고 있긴 하지만, 아직 그 유용성 및 정확도가 떨어질 뿐만 아니라 상대적으로 검사 비용이 비싸고 분석 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 정확하고 신속하며 경제적으로 개체 식별이 가능한 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법을 제공하는 데 있다.
이에 본 발명은 바람직한 제1구현예로서, MCW0145, LEI0094, MCW0127, MCW0029, GCT0016, ADL0317, MCW0104, MCW0330, ADL0293로 이루어지는 초위성체 마커 제1세트 및 MCW0029, ADL0317, MCW0264, MCW0123, ADL0304, LEI0074, MCW0087, ADL0292 및 MCW0228로 이루어지는 초위성체 마커 제2세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 초위성체 마커 세트를 이용하는 재래닭의 개체 식별 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 바람직한 제2구현예로서, 상기 각 초위성체 마커에 특이적인 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30, 서열번호 31 및 32의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 재래닭 개체 식별용 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
본 발명은 바람직한 제3구현예로서, 상기 초위성체 마커 제1세트에 특이적인 서열번호 1 및 2, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 17 및 18, 서열번호 21 및 22, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 재래닭 개체 식별용 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 바람직한 제4구현예로서, 상기 초위성체 마커 제2세트에 특이적인 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 19 및 20, 서열번호 23 및 24, 서열번호 29 및 30, 서열번호 31 및 32의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 재래닭 개체 식별용 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 바람직한 제5구현예로서, 상기의 재래닭 개체 식별용 프라이머 세트 중 어느 하나의 프라이머 세트를 포함하는 재래닭 개체 식별용 키트를 제공한다.
본 발명은 바람직한 제6구현예로서, (S1) 식별하고자 하는 재래닭 개체에서 핵산 시료를 얻는 단계; (S2) 상기 (S1) 단계의 핵산 시료를 상기의 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR로 증폭하는 단계; 및 (S3) 상기 (S2) 단계의 증폭된 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 재래닭의 개체 식별 방법을 제공한다.
상기 구현예에 의한 재래닭의 개체 식별 방법에서, 상기 각 초위성체 마커는 대립유전자 수가 6~20개이고, 평균 기대이형접합율은 80% 보다 높게 나타나며, 유전자의 크기는 80bp~300bp인 것일 수 있다.
또한, 상기 (S2) 단계에서 멀티플렉스 PCR 증폭은 95℃에서 10분간 반응하고, 95℃에서 30초, 54~56℃에서 25~35초 및 72℃에서 30초간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 25~35회 반복하고, 72℃에서 15분간 반응시키는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 재래닭의 개체 식별 방법은 종래 기술에서 사용된 것보다 높은 개체 식별력을 가진 초위성체 마커들의 조합을 이용하고 있어, 보다 정확한 식별 결과를 신속하면서도 경제적으로 제공할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 16종의 초위성체 마커들은 동일개체 출현확률이 무작위 교배집단에서는 1.79×10-21, 반형매 교배집단에서는 6.76×10-16, 전형매 교배집단에서는 5.70×10-8으로, 국내에서 사육되는 재래닭에 대하여 동일개체 출현 가능성이 없어 재래닭의 개체 식별에 유용하게 사용될 수 있다.
이에 따라, 재래닭의 유통과정에서 부정행위를 방지하는 수단으로 활용될 수 있으며, 재래닭에 대한 소비자의 신뢰도를 상승시켜 생산 농가의 소득 증대에 도움을 줄 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 초위성체 마커 제1세트에 특이적인 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 초위성체 마커 제2세트에 특이적인 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 초위성체 마커 제2세트에 특이적인 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 정확하고 신속하며 경제적으로 개체 식별이 가능한 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법을 제공하고자 한다.
이를 위하여 본 발명은 MCW0145, LEI0094, MCW0127, MCW0029, GCT0016, ADL0317, MCW0104, MCW0330, ADL0293로 이루어지는 초위성체 마커 제1세트 및 MCW0029, ADL0317, MCW0264, MCW0123, ADL0304, LEI0074, MCW0087, ADL0292 및 MCW0228로 이루어지는 초위성체 마커 제2세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 초위성체 마커 세트를 이용하는 재래닭의 개체 식별 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "초위성체(microsatellite)"는 2 내지 6개의 염기서열이 반복되는 구조를 가지는 STR(short tandem repeat)을 의미한다. 이러한 초위성체는 대부분의 진핵생물 게놈에 골고루 분포되어 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 non-coding DNA에 주로 존재한다.
본 발명에서 용어, "초위성체 마커"는 상기 초위성체 반복 단위의 반복수에 변이가 존재하여 발생하는 다형성을 의미한다.
이와 같은 초위성체 마커는, 개체 또는 종에 따라 초위성체 반복 단위의 반복수가 다양할 수 있으므로, 초위성체가 반복되는 부분의 양쪽 염기쌍 중에 유전자상에서 독특한 서열을 프라이머 서열로 디자인하고 PCR 증폭을 수행한 다음, 수득하는 산물의 크기를 비교하여 개체 또는 종을 식별할 수 있다.
본 발명에서는 이형접합률 및 PCR 증폭 산물의 크기를 모두 고려하여, 동일 개체 출현 가능성 없이 재래닭의 개체 식별을 가져올 수 있는 초위성체 마커 세트를 규명하였다. 이러한 본 발명의 초위성체 마커 세트는 MCW0145, LEI0094, MCW0127, MCW0029, GCT0016, ADL0317, MCW0104, MCW0330, ADL0293로 이루어지는 초위성체 마커 제1세트 및 MCW0029, ADL0317, MCW0264, MCW0123, ADL0304, LEI0074, MCW0087, ADL0292 및 MCW0228로 이루어지는 초위성체 마커 제2세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 초위성체 마커 세트를 포함하며, 상기 초위성체에 대한 정보는 미국 국립 생물정보센터(NCBI) 데이터 베이스(www.NCBI.nlm.nih.gov) 등에서 그 정보를 얻을 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 초위성체 마커 세트는 신품종 개발의 수집모본과 교배계군을 대상으로 고려하여 조합한 것이므로 향후 국내 유통되는 재래닭의 개체 식별에 유용하다.
본 발명에서 용어, "프라이머 (primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 MCW0145에 대한 프라이머쌍은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍, MCW0264에 대한 프라이머쌍은 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머쌍, MCW0087에 대한 프라이머쌍은 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머 쌍, MCW0127에 대한 프라이머쌍은 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍, LEI0094에 대한 프라이머쌍은 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머 쌍, ADL0317에 대한 프라이머쌍은 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머 쌍 및 MCW0029에 대한 프라이머쌍은 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머 쌍, ADL0292에 대한 프라이머쌍은 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머 쌍, GCT0016에 대한 프라이머쌍은 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머 쌍, MCW0228에 대한 프라이머쌍은 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머쌍, MCW0104에 대한 프라이머쌍은 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머 쌍, MCW0123에 대한 프라이머쌍은 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머 쌍, MCW0330에 대한 프라이머쌍은 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머 쌍, ADL0293에 대한 프라이머쌍은 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머 쌍 및 ADL0304에 대한 프라이머쌍은 서열번호 29의 정방향 프라이머 및 서열번호 30의 역방향 프라이머 쌍, LEI0074에 대한 프라이머쌍은 서열번호 31의 정방향 프라이머 및 서열번호 32의 역방향 프라이머 쌍인 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 초위성체 마커에 특이적으로 결합하여 증폭 산물을 생산할 수 있는 프라이머라면 본 발명의 범주에 모두 포함된다.
본 발명에서 용어, "PCR(polymerase chain reaction)"은 DNA의 원하는 부분을 복제 및 증폭시키는 분자생물학적 기술이다. 구체적으로, PCR은 일련의 세 개의 단계를 포함한다. PCR의 첫 번째 단계는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 것으로, 두 가닥의 DNA를 가열함으로써 분리시킬 수 있다. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 된다. PCR의 두 번째 단계는 결합(Annealing)으로, 이 단계에서 초위성체 마커에 대한 프라이머들이 주형 DNA에 결합을 하게 된다. 결합(Annealing) 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데 만약 온도를 너무 높게 하면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진다. 또 만약 온도를 너무 낮게 하면 프라이머가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있어, 사용하는 프라이머들의 종류 등에 따라 온도는 적절히 조절되어야 한다. PCR의 세 번째 단계는 신장(Extension) 단계이다. 이 단계에서 주형에 프라이머가 결합한 경우에는 열에 강한 DNA 중합효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다.
본 발명과 같이 수개의 초위성체 마커에 대하여 분석을 수행하는 경우에는 멀티플렉스 PCR을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함시키는 데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 멀티플레스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 쌍을 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 억제 (inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 쌍 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.
이와 같은 PCR 수행 후에는, PCR 증폭 산물은 SDS-PAGE나 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)과 같은, PCR 증폭 산물의 크기에 따른 분류가 가능한 기법으로 개체 식별을 할 수 있다.
구체적으로, 전기영동법 등으로 PCR 증폭 산물을 크기별로 분류하여 이의 크기 결정을 통하여 각 대립유전자에 얼마나 많은 반복단위가 포함되어 있는지 알 수 있다. 따라서, 상기와 같은 유전자형 데이터와 검증한 재래닭의 데이터를 기록하는 데이터 베이스를 별도로 구축하거나 규명된 정보를 이용하여, 이러한 정보와 실험을 통해 확인된 자료를 서로 비교하여 개체를 식별할 수 있다.
특히, 본 발명의 16개의 초위성체 마커를 이용할 경우, 동일 개체 출현 확률이 무작위 교배집단에서는 1.79×10-21, 반형매 교배집단에서 6.76×10-16, 전형매 교배집단에서 5.70×10-8로 나타난 결과에 비추어, 16개의 초위성체 마커에 대하여 PCR 반응을 수행한 다음, 16개의 초위성체 마커에 대한 정보를 모두 종합하는 경우 높은 정확도로 개체를 식별할 수 있다.
하기 본 발명의 실시예에서는, 이형접합률, 증폭산물의 크기를 고려하여, 재래닭 개체식별에 효과적으로 사용할 수 있는 두 세트의 초위성체 마커의 조합을 규명하였고, 이러한 각각의 초위성체 마커 조합에 대한 프라이머 쌍을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였을 때, 상기 초위성체 마커들을 효과적으로 증폭시킬 뿐 아니라 보다 정확하고 신속하며 경제적인 식별이 가능함을 나타내었다.
또한, 상기 본 발명에 따른 16종의 초위성체 마커들은 동일 개체 출현 확률이 무작위 교배집단에서는 1.79×10-21, 반형매 교배집단에서 6.76×10-16, 전형매 교배집단에서 5.70×10-8로 나타난 결과로부터, 국내에서 사육 유통되고 있는 재래닭의 두수를 고려하여도 동일개체 출현 가능성이 없는 것으로 판단되었다.
본 발명은 또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 재래닭 개체 식별용 키트를 제공한다.
상기 재래닭 개체 식별용 키트는, 초위성체 PCR 키트 형태일 수 있으며, 바람직하게는 멀티플렉스 PCR 키트이다.
상기 PCR 키트는 상기 초위성체 마커들을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 프라이머 쌍들로 구성되는 프라이머 세트, DNA 중합효소, 중합효소 반응을 도와주는 버퍼, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 3차 증류수(Distilled-water), 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 구체예로서, 분석하고자 하는 재래닭 개체로부터 분리한 핵산 시료와 MCW0145, LEI0094, MCW0127, MCW0029, GCT0016, ADL0317, MCW0104, MCW0330, ADL0293로 이루어지는 초위성체 마커 제1세트 및 MCW0029, ADL0317, MCW0264, MCW0123, ADL0304, LEI0074, MCW0087, ADL0292 및 MCW0228로 이루어지는 초위성체 마커 제2세트로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 초위성체 마커 세트 각각에 특이적인 프라이머 쌍들로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 단계를 포함하는 재래닭의 개체 식별 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "핵산 시료"는 본 발명의 초위성체 마커를 증폭할 수 있는, 재래닭의 DNA와 같은 시료를 의미한다. 상기 핵산 시료는 재래닭의 모근, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 샘플로부터 얻은 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 재래닭 개체 식별 방법은 상기와 같은 재래닭 개체로부터 유래한 주형 DNA에 본 발명의 16종의 초위성체 마커에 특이적인 프라이머쌍들을 포함하는 프라이머 세트를 혼합한 다음, multiplex PCR 증폭하여 수행할 수 있다. 그리고, 상기 증폭된 산물을 이용하여 유전자형을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 개체 식별 방법에서의 상기 multiplex PCR은, 상기 16종의 초위성체 마커에 특이적인 프라이머쌍들을 포함하는 프라이머 세트를 한꺼번에 이용하여 1회 수행할 수도 있고, 상기 제1세트 및 제2세트의 초위성체 마커에 특이적인 프라이머쌍들을 포함하는 프라이머 세트들에 대하여 각각 수행함으로써 총 2회 수행할 수도 있다.
상기 개체 식별 방법에서 multiplex PCR을 1회 수행하는 경우, 더욱 정확하게 개체를 식별하는 효과가 있다.
또한, 상기 개체 식별 방법에서 multiplex PCR을 2회 수행하는 경우, 더욱 경제적이고 신속하게 개체를 식별할 수 있게 된다. 상기에서 제1세트의 초위성체 마커 및 제2세트의 초위성체 마커는 MCW0029 마커 및 ADL0317 마커가 동시에 존재하도록 구성되어 있다. 이와 같이, 두 개의 마커가 동시에 존재하는 마커 세트들을 이용하여 개체 식별을 위한 분석을 하는 경우, 그 분석 결과가 동일한 샘플(또는 개체)로부터 얻은 결과인지를 쉽게 알 수 있는 효과가 있다. 상기 두 개의 세트에 동시에 존재하는 마커들로 인해 각각의 분석 결과에서 동일한 값들이 발견되기 때문이다.
본 발명의 다른 방법은 상기와 같은 재래닭 개체로부터 유래한 주형 DNA에 본 발명의 상기 초위성체 마커 제1세트 또는 초위성체 마커 제2세트에 특이적인 프라이머쌍들을 포함하는 프라이머 세트를 혼합한 다음, multiplex PCR 로 증폭하여 수행할 수 있다. 그리고, 상기 증폭된 산물을 이용하여 유전자형을 결정함으로써 더욱 경제적이고 신속한 식별 결과를 얻을 수 있다.
여기서, PCR 증폭 과정은 변성, 결합 및 신장 단계가 반복되면서 특정 부위를 증폭시키게 된다. 이때, 본 발명의 방법에서는 멀티플렉스 PCR 기법으로 수행하는 것이 보다 바람직하며, 이 경우, 단일 튜브에 여러 프라이머 쌍이 포함되므로 결합 온도를 최적화할 필요가 있다.
이와 같은 PCR 과정을 수행한 후에는, 전기영동 등의 방법을 이용하여 증폭된 산물의 크기를 분석하고, 분석된 증폭 산물의 크기 등을 바탕으로 대립유전자를 결정하여 개체 식별을 할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다.
[실시예]
실시예
1:
재래닭의
개체식별을 위한
초위성체
마커
선발
재래닭 개체 식별에 효과적으로 사용될 수 있는 초위성체 마커를 선발하기 위해, Seo 등(2013, Discrimination of Korean native chicken lines using fifteen selected microsatellite markers)에 의해 보고된 닭의 크로모좀 전 영역에 위치한 닭 다형성 분석용 초위성체 마커 150종을 검토하였다. 상기 150종의 마커를 토대로 하여 대립유전자의 크기, 다형지수, 형광물질의 색상 등을 고려하였고, 최종적으로 개체 식별 및 생산이력 시스템 활용에 유용한 16종의 초위성체 마커를 선발하였다. 상기 선발된 초위성체 마커의 대립유전자의 수는 6개부터 20개까지 평균 12.56개였고, 이형접합률은 평균 80% 이상으로서 높은 개체 식별의 정확도를 가지고 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 멀티플렉스 PCR을 더욱 용이하게 하기 위하여 상기 선발된 16종의 초위성체 마커를 한 세트당 9개씩 2세트가 되도록 구성하였으며, 상기 각 세트에는 MCW0029 및 ADL0317 마커가 교차로 들어가도록 하였다. 상기 두 세트의 마커 조합을 하기 표 1에 구체적으로 나타내었다.
| 제1세트 | 제2세트 |
| MCW0145 | MCW0264 |
| LEI0094 | MCW0123 |
| MCW0127 | ADL0304 |
| MCW0029 | MCW0029 |
| GCT0016 | LEI0074 |
| ADL0317 | ADL0317 |
| MCW0104 | MCW0087 |
| MCW0330 | ADL0292 |
| ADL0293 | MCW0228 |
상기와 같이, MCW0029 및 ADL0317 마커가 교차로 들어가도록 구성한 마커 세트들을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 하고 이로 인한 각각의 개체 식별 분석 결과를 비교하는 경우, 그 분석 결과가 동일한 샘플(또는 개체)로부터 얻은 결과인지를 쉽게 알 수 있는 효과가 있다. 상기 두 개의 세트에 동시에 존재하는 두 개의 마커들로 인해 두 분석 결과로부터 동일한 값들이 발견되기 때문이다.
실시예
2: 공시 재료 및
DNA
시료
한협의 실용계 8계통 국내 가금종자와 국립축산과학원 가금과에서 보존하고 있는 토종닭 순계 12집단, 오골계를 포함한 재래닭 2품종 6계통과 토착화 3품종 6계통의 가금 종자의 익하정맥에서 채혈하였으며, 총 469수를 공시재료로 사용하였다.
상기 채혈한 혈액 샘플은 SSC 버퍼로 처리하여 혈구를 분리하였으며, 각 20㎕의 혈구샘플은 Genomic DNA isolation kit from blood(Genetbio, Korea)를 이용하여 제조사가 권장하는 방법에 따라 Genomic DNA를 추출하여 -20℃에서 보관하였다.
실시예
3:
초위성체
마커에
특이적인 유전자 증폭
프라이머
제작
실시예 1을 통해 선발된 두 세트의 초위성체 마커에 특이적인 프라이머는 써모피셔사이언티픽사에 의뢰하여 주문 제작하였다. 각 프라이머 중 정방향 프라이머 끝에 FAM, NED, VIC, PET으로 이루어진 표지 형광물질을 부착하였으며, 각각의 서열번호, 마커 명칭, 염색체 위치, 염기서열, 증폭산물의 크기(Product size) 및 부착된 형광물질(Dye) 등을 하기 표 2에 나타내었다.
| 서열 번호 |
마커 | 염색체 | 프라이머 F: 정방향(5'~3') R: 역방향(3'~5') |
증폭산물 크기 |
형광 물질 |
|
| 1 | MCW0145 | 1 | F | ACTTTATTCTCCAAATTTGGCT | 178~214 | FAM |
| 2 | R | AAACACAATGGCAACGGAAAC | ||||
| 3 | MCW0264 | 2 | F | CTTACTTTTCACGACAGAAGC | 225~243 | FAM |
| 4 | R | AGACTGAGTCACACTCGTAAG | ||||
| 5 | MCW0087 | 2 | F | ATTTCTGCAGCCAACTTGGAG | 265~289 | NED |
| 6 | R | CTCAGGCAGTTCTCAAGAACA | ||||
| 7 | MCW0127 | 3 | F | GAGTTCAGCAGGAATGGGATG | 226~274 | VIC |
| 8 | R | TGCAATAAGAGAAGGTAAGGTC | ||||
| 9 | LEI0094 | 4 | F | GATCTCACCAGTATGAGCTGC | 232~282 | FAM |
| 10 | R | TCTCACACTGTAACACAGTGC | ||||
| 11 | ADL0317 | 4 | F | AGTTGGTTTCAGCCATCCAT | 178~204 | NED |
| 12 | R | CCCAGAGCACACTGTCACTG | ||||
| 13 | MCW0029 | 5 | F | GTGGACACCCATTTGTACCCTATG | 131~187 | VIC |
| 14 | R | CATGCAATTCAGGACCGTGCA | ||||
| 15 | ADL0292 | 5 | F | CCAAATCAGGCAAAACTTCT | 110~140 | PET |
| 16 | R | AAATGGCCTAAGGATGAGGA | ||||
| 17 | GCT0016 | 9 | F | TCCAAGGTTCTCCAGTTC | 108~168 | NED |
| 18 | R | GGCATAAGGATAGCAACAG | ||||
| 19 | MCW0228 | 10 | F | GATCTCTGCATTACAAGCATG | 220~248 | PET |
| 20 | R | TTGCTGACCTGCTCATGCAAG | ||||
| 21 | MCW0104 | 13 | F | TAGCACAACTCAAGCTGTGAG | 192~232 | PET |
| 22 | R | AGACTTGCACAGCTGTGTACC | ||||
| 23 | MCW0123 | 14 | F | CCACTAGAAAAGAACATCCTC | 80~90 | FAM |
| 24 | R | GGCTGATGTAAGAAGGGATGA | ||||
| 25 | MCW0330 | 17 | F | TGGACCTCATCAGTCTGACAG | 252~286 | PET |
| 26 | R | AATGTTCTCATAGAGTTCCTGC | ||||
| 27 | ADL0293 | 17 | F | GTAATCTAGAAACCCCATCT | 107~127 | PET |
| 28 | R | ACATACCGCAGTCTTTGTTC | ||||
| 29 | ADL0304 | 18 | F | GGGGAGGAACTCTGGAAATG | 138~162 | FAM |
| 30 | R | CCTCATGCTTCGTGCTTTTT | ||||
| 31 | LEI0074 | 26 | F | GACCTGGTCCTGACATGGGTG | 132~244 | VIC |
| 32 | R | GTTTGCTGATTAGCCATCGCG | ||||
실시예
4: 멀티플렉스
PCR
증폭
상기 실시예 2에서 수집된 DNA 시료를 주형으로 하고, 실시예 3을 통해 제작된 16쌍, 총 2세트의 프라이머를 사용하여 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 다음과 같은 조건으로 각각 수행하였다.
멀티플렉스 PCR 반응액은 주형 DNA 5ng, 각각의 프라이머(10pmole)는 형광물질의 감도를 고려하여 0.2 - 0.7㎕, 2.5 mM의 dNTP 1.5㎕, 10 X Maxima Hot Start Taq buffer, 25mM MgCl2 1.8㎕, 그리고 250 U의 Hot Start Taq DNA 중합효소(GENETBIO, Korea) 0.6㎕의 조성에 증류수를 채워 총 15㎕가 되도록 하였다. 상기 PCR 반응액의 조성을 하기 표 3에 나타내었다.
상기 반응액은 95에서 10분간 pre-denaturation 후 95에서 30초간 denaturation, 55에서 30초간 annealing, 72에서 30초간 extension을 30회 반복한 후 15분간 72에서 final-extension을 수행하여 총 2종의 증폭산물을 확보하였다. 상기 PCR 반응 수행 조건을 하기 표 4에 나타내었다.
| PCR 반응액 조성 | 부피 |
| Genomic DNA | 5ng |
| 프라이머 조합(9마커) | 각 0.2~0.7㎕ |
| Taq polymerase(250U) | 0.6㎕ |
| 10×Buffer | 1.8㎕ |
| dNTP | 1.5㎕ |
| 증류수 | Up to 15㎕ |
| 단계 | 온도(℃) | 시간 | 횟수 |
| Pre-denaturation | 95 | 10분 | 1 |
| Denaturation | 95 | 30초 | 30 |
| Annealing | 55 | 30초 | |
| Extension | 72 | 30초 | |
| Final extension | 72 | 15분 | 1 |
| Hold | 4 | ∞ |
상기 멀티플렉스 PCR로 증폭된 산물들은 결과에 따라 Hi-DiTMformamide와 GeneScanTM-500LIZTMsizestandard로 희석하고, Genetic Analyzer 3130xl 자동 염기서열 분석장치(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 크기 및 형광물질별로 분류되도록 전기영동을 실시하여 Fragment analysis를 수행하였다. 상기 초위성체 마커 제1세트에 특이적인 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 결과를 도 1에 나타내었고, 초위성체 마커 제2세트에 특이적인 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 도 1 및 도 2를 살펴보면, 두 개의 마커 세트에 동시에 존재하는 두 개의 마커들로 인해 동일한 값의 피크들이 나타나는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 상기 도 1 및 도 2의 각각의 사진이 동일한 샘플을 이용하여 분석된 것임을 나타내는 것이다.
초위성체 마커 종류별 대립유전자형의 정확한 크기 및 대립유전자 수 등은 GeneMapper ver 4.1(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 결정하였다.
실시예
5:
초위성체
마커의
다형지수
분석
실시예 4에서 확인된 각 마커의 대립유전자를 이용하여, 전체 집단에 대한 집단의 관측이형접합율(observed heterozygosity, Hobs), 기대이형접합율(expected heterozygosity, Hexp), 다형성정보지수(Polymorphism information content, PIC)를 Cervus 3.0 program(version 3.0.3 The University of Edinburgh)을 이용하여 계산하였다(Marshall et al(1998) Mol. Ecol. 7:639-655).
그 결과 각 초위성체 마커의 다형지수는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
| 초위성체 마커 | 대립유전자수 | 대립유전자 크기 범위 | HObs | HExp | PIC |
| MCW0264 | 9 | 225-243 | 0.567 | 0.827 | 0.806 |
| ADL0292 | 11 | 110-138 | 0.561 | 0.751 | 0.714 |
| LEI0074 | 13 | 222-244 | 0.537 | 0.846 | 0.826 |
| MCW0123 | 6 | 80-90 | 0.451 | 0.729 | 0.683 |
| ADL0304 | 9 | 138-162 | 0.508 | 0.788 | 0.757 |
| MCW0145 | 11 | 190-214 | 0.677 | 0.838 | 0.817 |
| LEI0094 | 18 | 246-282 | 0.609 | 0.843 | 0.825 |
| MCW0029 | 15 | 139-187 | 0.677 | 0.859 | 0.845 |
| MCW0127 | 20 | 226-272 | 0.594 | 0.859 | 0.843 |
| MCW0228 | 12 | 220-246 | 0.573 | 0.796 | 0.769 |
| MCW0087 | 15 | 265-289 | 0.565 | 0.878 | 0.865 |
| GCT0016 | 12 | 108-168 | 0.359 | 0.812 | 0.788 |
| ADL0317 | 11 | 178-204 | 0.612 | 0.831 | 0.811 |
| ADL0293 | 10 | 107-127 | 0.499 | 0.779 | 0.746 |
| MCW0104 | 17 | 192233 | 0.629 | 0.881 | 0.869 |
| MCW0330 | 12 | 254-286 | 0.481 | 0.746 | 0.715 |
| 평균 | 12.56 | - | 0.556 | 0.816 | 0.792 |
HObs: 관측이형접합율(Observed Heterozygosity value)
HExp: 기대이형접합율(Expected Heterozygosity value)
PCI: 다형정보량(Polymorphic Information content)
전체집단을 대상으로 16종의 초위성체 마커를 분석한 결과, 6개(ADL0268)부터 20개(MCW0127)까지 평균 12.56개의 대립유전자가 확인되었다. 또한, 본 발명의 초위성체 마커는 기대이형접합율(Hexp)값과 다형성정보지수(PIC)의 값이 각각 평균 0.816, 0.792로 상당히 높게 나타나 개체식별 마커로써의 우수성을 증명하였다. 참고로, 초위성체 마커의 다형성 정도를 판단하는 기준인 기대이형접합율(Hexp)값이 0.6 이상이고, 다형성정보지수(PIC)의 값이 0.5 이상인 마커는 높은 다형성을 나타내는 것이라고 보고된 바 있다(Botstein, D., et al., 1980).
실시예
6: 통계 분석
본 연구에서 2개의 다중증폭조합을 이용하여 국내 재래닭의 동일개체 출현빈도를 API-CALC ver 1.0(Ayres and Overall, 2004) 프로그램을 통해 산출한 값을 하기 표 6에 제시하였다. 무작위 교배집단(Random)으로 가정하였을 경우 동일개체 출현빈도(Probability of identity; PI)는 16개의 마커를 사용하였을 때, 1.79×10-21 빈도로 출현하는 것을 확인할 수 있었으며, 반형매 교배집단(Half-sib)과 전형매 교배집단(sib)으로 가정했을 경우에는 6.76×10-16, 5.70×10- 08으로 각각 확인되었다.
즉, 모든 집단에서 0에 수렴하는 동일 개체 출현빈도를 나타내기 때문에 개체식별률이 매우 높아 국내 재래닭의 개체식별 및 친지확인을 위한 마커로서 본 발명에 따른 16종의 초위성체 마커가 충분히 활용 가능할 것으로 판단된다.
| 마커의 개수 | PI | PIHalf - sibs | PIsibs |
| 1 | 2.38 × 10-02 | 7.00× 10-02 | 3.11× 10-01 |
| 2 | 5.90× 10-04 | 5.01× 10-03 | 9.94× 10-02 |
| 3 | 1.99× 10-05 | 4.46× 10-04 | 3.42× 10-02 |
| 4 | 6.49× 10-07 | 3.90 × 10-05 | 1.14 × 10-02 |
| 5 | 2.62 × 10-08 | 3.68 × 10-06 | 3.77 × 10-03 |
| 6 | 1.00 × 10-09 | 3.43 × 10-07 | 1.22 × 10-03 |
| 7 | 4.37 × 10-11 | 3.47 × 10-08 | 4.20 × 10-04 |
| 8 | 2.04 × 10-12 | 3.71 × 10-09 | 1.45 × 10-04 |
| 9 | 1.04 × 10-13 | 4.22 × 10-10 | 5.18 × 10-05 |
| 10 | 5.27 × 10-15 | 4.64 × 10-11 | 1.72 × 10-05 |
| 11 | 3.08 × 10-16 | 5.70 × 10-12 | 6.06 × 10-06 |
| 12 | 2.24 × 10-17 | 8.09 × 10-13 | 2.29 × 10-06 |
| 13 | 1.80 × 10-18 | 1.22 × 10-13 | 8.83 × 10-07 |
| 14 | 1.66 × 10-19 | 2.05 × 10-14 | 3.49 × 10-07 |
| 15 | 1.54 × 10-20 | 3.52 × 10-15 | 1.38 × 10-07 |
| 16 | 1.79 × 10-21 | 6.76 × 10-16 | 5.70 × 10-08 |
상기에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하며, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.
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And Method For Identification Using The Same
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCW0145_F
<400> 1
actttattct ccaaatttgg ct 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCW0145_R
<400> 2
aaacacaatg gcaacggaaa c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCW0264_F
<400> 3
cttacttttc acgacagaag c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCW0264_R
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agactgagtc acactcgtaa g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCW0087_F
<400> 5
atttctgcag ccaacttgga g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCW0087_R
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ctcaggcagt tctcaagaac a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCW0127_F
<400> 7
gagttcagca ggaatgggat g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> MCW0127_R
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tgcaataaga gaaggtaagg tc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> LEI0094_F
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gatctcacca gtatgagctg c 21
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ADL0317_F
<400> 11
agttggtttc agccatccat 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ADL0317_R
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cccagagcac actgtcactg 20
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> MCW0029_F
<400> 13
gtggacaccc atttgtaccc tatg 24
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<223> MCW0029_R
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catgcaattc aggaccgtgc a 21
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<212> DNA
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ccaaatcagg caaaacttct 20
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<212> DNA
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aaatggccta aggatgagga 20
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> GCT0016_F
<400> 17
tccaaggttc tccagttc 18
<210> 18
<211> 19
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<400> 18
ggcataagga tagcaacag 19
<210> 19
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ttgctgacct gctcatgcaa g 21
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tagcacaact caagctgtga g 21
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<211> 21
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agacttgcac agctgtgtac c 21
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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ccactagaaa agaacatcct c 21
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ggctgatgta agaagggatg a 21
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tggacctcat cagtctgaca g 21
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aatgttctca tagagttcct gc 22
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acataccgca gtctttgttc 20
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<211> 20
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<211> 21
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<223> LEI0074_R
<400> 32
gtttgctgat tagccatcgc g 21
Claims (9)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- (S1) 식별하고자 하는 재래닭 개체에서 핵산 시료를 얻는 단계;
(S2) 상기 (S1) 단계의 핵산 시료를 서열번호 1 및 2, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 17 및 18, 서열번호 21 및 22, 서열번호 25 및 26, 및 서열번호 27 및 28의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 프라이머 제1세트; 및 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 19 및 20, 서열번호 23 및 24, 서열번호 29 및 30, 및 서열번호 31 및 32의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 프라이머 제2세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR로 증폭하는 단계; 및
(S3) 상기 (S2) 단계의 증폭된 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 재래닭의 개체 식별 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제6항에 있어서,
상기 (S2) 단계에서 멀티플렉스 PCR 증폭은 95℃에서 10분간 반응하고, 95℃에서 30초, 54~56℃에서 25~35초 및 72℃에서 30초간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 25~35회 반복하고, 72℃에서 15분간 반응시키는 것을 특징으로 하는 재래닭의 개체 식별 방법.
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