KR102064039B1 - 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 위한 미세위성 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 붉바리 각 개체의 유전자형을 분석하기 위한 미세위성마커 및 이를 이용한 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 방법에 대한 것으로, 구체적으로 10개의 붉바리 미세위성마커(microsatellite marker) 및 이를 증폭하기 위한 각각의 프라이머 쌍 세트이며, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 증폭하여 비교 분석하는 방법으로 개체 식별 및 친자 확인을 하는 방법을 포함한다. 본 발명의 상기 미세위성 마커는 붉바리의 친어 집단에 대한 개체 식별 및 친자 확인을 위하여 매우 효율성이 높은 마커를 제공할 수 있으며, 개체 식별 및 친자 확인에 효과적으로 사용가능하다.

Description

붉바리 개체 식별 및 친자 확인 위한 미세위성 마커 {Method for identification and parentage using marker in Ephinephelus akaara}

본 발명은 붉바리 각 개체의 유전자형을 분석하기 위한 미세위성마커 및 이를 이용한 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 방법에 대한 것으로, 구체적으로 10개의 붉바리 미세위성마커(microsatellite marker) 및 이를 증폭하기 위한 각각의 프라이머 쌍 세트이며, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 증폭하여 비교 분석하는 방법으로 개체 식별 및 친자 확인을 하는 방법을 포함한다.

붉바리(Ephinephelus akaara)는 농어목 바리과의 바닷물고기이며, 온수성 어류로 연안의 암초지대에 서식하며 연안 정착성으로 바위구멍이나 바위틈새에 숨어 있다. 산란기는 6~8월이며, 우리나라에서는 주로 제주대 일대에서 포획된다. 흰살 생선으로 살이 담백하고 깨끗하며 씹는 맛이 좋아 바리과 어류 중에서 고급종으로 취급되나 그 수가 매우 적은 것으로 알려져 있다.

붉바리가 가지는 식용 자원으로서의 가치에 비해 포획량이 적은 문제가 있어, 양식에 대한 의존성이 높다. 따라서, 붉바리의 양식 생산성을 향상시키기 위하여, 성장률, 질병 저항성, 기형 발생률 및 생존률 등이 높은 우량 종자를 개발하고, 대량생산 체제를 구축해야 하는 요구가 계속적으로 존재하는 실정이다. 우량 종자에 대한 판별은 붉바리의 유전적 조성과 밀접하게 관련되며, 우리나라에서 포획 또는 양식되는 붉바리 집단의 유전자형 분석을 바탕으로 이루어질 수 있을 것이다.

그러나, 현재 붉바리 우량 종자에 대한 판정은 생체에 대한 육안 확인 방법 외에는 방법이 없으며, 회나 요리를 위해 원형이 변질된 이후에는 육안판독이 불가능하다. 한편, DNA 판독 기술은 생체, 사후 절개된 조직이나 조리된 음식물 내에서도 원료 종의 판독이 가능한 것으로 보고되어, 동물성 원료 종의 동정을 위해 DNA 정보에 기반한 PCR 기법을 응용한 연구들이 보고된 바 있으나, 현재, 붉바리 개체식별 및 친자 확인을 위한 유전자 진단법은 보고되어 있지 않다.

미세위성 마커(microsatellite)는 게놈 내 DNA 염기 서열 중에서 2~5개의 염기가 특징적으로 반복되는 부위로, 반복 정도에 따라 다양한 대립유전자가 존재하며, 멘델의 유전법칙에 따라 부모에서 자손으로 유전되므로 염색체 지도 작성의 표지로 이용되거나(Maria RM et al., Aquaculture 220:203-218, 2003), 집단 및 개체의 유전적 특성을 규정짓거나(Sekino M & Hara M, Mar Biotechnol 3:572-589, 2001), 친자확인(Hara M & Sekino M, Aquaculture 217:107-114, 2003)등의 유전자형 분석에 많이 이용된다. 이들 미세위성마커 특정 부위는 이를 포함하는 위, 아래쪽 염기서열의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭이 가능하다.

이에 본 발명자들은 10개의 붉바리 미세위성마커를 분석할 수 있는 플라이머의 조합 및 최적의 PCR 조건을 확립함으로써, 붉바리의 미세위성마커 대립 유전자형을 이용한 붉바리 집단의 유전학적 분석, 개체 식별 및 친자 확인이 가능한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0069898호 대한민국 공개특허 제10-2016-0110594호

본 발명의 목적은, DNA 다형성을 갖는 미세위성마커에 대하여, 이를 분석할 수 있는 프라이머 쌍 조합의 개발 및 다중 증폭 반응을 통한 분석의 조건을 확립하여, 붉바리의 개체 식별 및 친자 확인 등 유전학적 개체 인식이 가능하게 하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 서열번호 1 내지 10의 붉바리 개체 식별 및 친자 확인용 미세위성 마커를 제공한다.

또한 상기 서열번호 1 내지 10의 미세위성 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍으로서, 서열번호 1의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 2의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 3의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 4의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 5의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 6의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 7의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 8의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 25 및 26를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 9의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 27 및 28를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 10의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 29 및 30을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 쌍 세트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 1)감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 추출하는 단계, 2) 상기 DNA 시료를 증폭하는 단계 및 3) 상기 증폭된 산물의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는 붉바리의 개체 식별 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 1) 감별하고자 하는 붉바리와 부모 세대 붉바리의 DNA 시료를 추출하는 단계, 2) 상기 감별하고자 하는 부분 및 부모 세대 붉바리 시료를 증폭하는 단계 및 3) 상기 증폭된 산물의 밴드 패턴을 비교 분석하는 단계를 포함하는 붉바리의 친자 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 붉바리 각 개체의 유전자형을 분석하기 위한 미세위성마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및, 이를 이용한 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 방법에 대한 것으로, 구체적으로 서열번호 1 내지 10의 붉바리 미세위성마커(microsatellite marker)에 대한 각각이 프라이머 쌍을 이용한 개체식별 및 친자확인 방법에 관한 것이다. 상기 미세위성 마커는 붉바리의 친어 집단에 대한 개체 식별 및 친자 확인을 위하여 매우 효율성이 높은 마커를 제공할 수 있다.

도 1은 본원 발명의 프라이머 쌍 세트를 이용하여 실제 붉바리의 DNA 서열을 주형으로 증폭(PCR)한 결과이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 쌍 세트를 이용하여 붉바리 26 개체의 미세위성 마커 유전자형을 결정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 결정된 유전자형을 이용하여, CERVUS program을 이용하여 동일성검사(identity test)와 친자확인시험(parentage test)를 수행한 결과로서, Bbr05M(친어 수컷)과 Bbr03F(친어 암컷)에서 생산된 F1과 F2의 가계도를 도시한 것이다.

본 발명은 개체 식별 및 친자 확인을 위한 붉바리 DNA 상에 존재하는 서열번호 1 내지 10의 미세위성마커에 대한 것이다.

미세위성 (microsatellite, MS) DNA 마커는 핵 DNA 상에 존재하는 DNA 절편으로 2에서 10개 정도의 염기가 반복단위(repeat unit)를 형성한다. 반복단위는 DNA 서열 내에서 반복 수 변이를 나타내게 되며, 유전자형이 달라진다. 미세위성 마커의 다형성은 같은 종 내에서도 여러 가지 유전자형을 나타내어 개체추적이나 친자확인을 위한 유전자 마커로 활용되고 있다. 한우의 동일성검사체계가 생산이력추적에 이용되고 있으며, 사람의 Y 염색체상에 존재하는 짧은 직렬 반복(short tandem repeat, STR) 마커는 부-자 확인을 위한 마커로 활용되기도 한다

상기 미세위성 마커를 선정하기 위하여, 본 발명자들은 붉바리의 유전체 서열을 붉바리 유전체 서열을 차세대 염기서열 분석법을 통해 결정하였고, 그 결과, 결정된 서열에서 직렬 반복을 나타내는 미세위성 마커 중, 유전자형이 3가지 이상으로 구분되는 미세위성 마커를 선발하였다. 선발된 마커들 중에서 붉바리 친어집단에서 높은 다형성의 빈도와 대립인자 분포를 나타내는 10개를 최종적으로 선발하였다. 선발된 마커는 BBr_2nt_02 (서열번호 1), BBr_2nt_12 (서열번호 2), BBr_2nt_15 (서열번호 3), BBr_2nt_16 (서열번호 4), BBr_2nt_24 (서열번호 5), BBr_2nt_26 (서열번호 6), BBr_2nt_30 (서열번호 7), BBr_2nt_31 (서열번호 8), BBr_2nt_32 (서열번호 9), 및 BBr_2nt_34 (서열번호 10)로 명명하였다.

상기 방식으로 선발된 미세위성 마커 10종은 다형정보량(polymorphic information content, PIC)이 0.7 이상으로 매우 높고, 관찰 이형접합 빈도(observed heterozygosity, HObs)와 기대 이형접합 빈도(expected heterozygosity, HExp)가 모두 0.5 이상인 다형성이 높은 것을 실제로 확인하였다. 이러한 결과로서 본 발명에서 선발된 붉바리 미세위성 미커는 전체적으로 개체 식별 또는 친자 확인을 위한 효율성이 매우 크다는 점을 알 수 있다.

또한 본 발명자들은 상기 붉바리 미세위성 마커를 증폭할 수 있는 서열번호 11 내지 30의 프라이머 쌍을 고안하였다. 이들은 각각 서열번호 1 내지 10의 미세위성 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍으로서, 서열번호 1의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 2의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 3의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 4의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 5의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 6의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 7의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 8의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 25 및 26를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 9의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 27 및 28를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 10의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 29 및 30을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍이다.

본 발명은 상기 고안된 프라이머쌍을 포함하며, 상기 서열번호 1 내지 10의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물을 제공한다. 즉, 붉바리의 개체 식별을 위하여, 상기 고안된 프라이머 쌍들을 이용하여 붉바리 개체로부터 분리한 DNA에서 상기 미세위성마커 부위가 증폭되는지 여부를 확인하는 방식으로 붉바리의 개체식별 및 친자 확인이 가능하다.

따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 2의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 3의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 4의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 5의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 6의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 7의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 8의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 25 및 26를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 9의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 27 및 28를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 10의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 29 및 30을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는, 서열번호 1 내지 10으로 기재되는 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물을 제공한다.

상기 프라이머쌍은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 형광물질로 표지될 수 있다. 상기 형광물질은 이에 한정되는 것은 아니나, FAM, HEX, NED, ROX 및 JOE를 포함할 수 있고, 바람직하게는 FAM, HEX, NED 일 수 있다. 상기 조성물에서 형광물질을 여러 가지로 사용하고 상기 조성물을 이용한 증폭 산물의 크기를 다르게 조합함으로써 서열번호 1 내지 10으로 기재되는 붉바리 미세위성마커 각각이 특이적으로 증폭되었는지 확인할 수 있다.

본 발명은, 1)감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 추출하는 단계, 2) 상기 1 단계의 시료를 상기 조성물을 이용하여 증폭하는 단계; 및 3) 단계 2의 증폭 산물의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는 붉바리의 개체 식별 방법을 제공한다.

상기 1) 단계에서 증폭 반응은 다중증폭 중합효소 연쇄반응 프로그램에 따라 수행될 수 있다. PCR 반응은 초기변성, 변성, 어닐링 및 신장 반응의 싸이클을 35 내지 45회 반복, 최종 신장 및 쿨링의 프로그램에 따라 이루어질 수 있다. 본 발명의 PCR 반응은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 Mastercycler Gradient (Eppendorf, 독일) 또는 이와 유사한 thermal cycle PCR system을 이용한다.

또한 본 발명은, 1) 감별하고자 하는 붉바리와 상기 어류의 부모 세대 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계; 2)상기 1단계의 DNA 시료를 상기 조성물을 이용하여 각각 증폭하는 단계; 3)상기 2단계의 증폭 산물의 밴드 패턴을 각각 분석하는 단계 및 4)상기 3단계의 부모 세대 붉바리의 밴드 패턴과 감별하고자 하는 붉바리의 밴드 패턴을 비교하는 단계를 포함하는 친자확인 방법을 제공한다.

본 발명의 넙치 미세위성마커는 멘델 법칙에 의해 자손에게 유전됨으로 자손의 유전자형과 부모 집단의 유전자형을 비교하여 친자 확인이 가능할 수 있다. 이에 본 발명의 바람직한 실시예에서는 부모 세대 및 자손 세대 넙치를 대상으로 본 발명의 조성물을 이용하여 다중증폭 중합효소 연쇄반응을 수행하였고, 증폭 산물의 밴드 패턴을 분석함으로써 자손 세대의 부모 확인을 수행하였다. 본 발명의 일 실시예에서, 친자 확인은 CERVUS program을 이용하여 동일성검사(identity test)와 친자확인시험(parentage test)를 수행하였으며, 이로부터 개체 식별 및 친자 여부를 확인하는 가계도를 설정할 수 있었다.

상기 설명한 본 발명에 의한 서열번호 1 내지 8의 마커 조합 및 다중 증폭 반응조건이 붉바리 유전자형 프로파일 분석에 의한 개체 식별 및 친자확인에 매우 경제적이고 효율적으로 사용될 수 있고, 특정 어미 집단에 의해 생산된 자손들의 친자 확인이 가능함에 따라 우수한 넙치 품종의 개발, 브랜드화 및 보호를 위한 생산자 확인 및 추적시스템의 구축 등에 활용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 어류의 개체 식별 및/또는 친자 확인용 키트를 제공한다.

상기 키트는 증폭반응 요소로서 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, 아울러, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 개체 식별 및/또는 친자 확인용 키트는 더 나아가 PCR 결과를 확인하는데 필요한 6-FAM, HEX, NED, ROX 또는 JOE 등의 형광물질, 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 조성물과의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 붉바리 게놈 DNA 추출

붉바리 전체 DNA 추출은 꼬리지느러미를 절취하여 이용하였다. 지느러미 조직은 가로 0.5cm×세로0.5cm 정도로 자른 후 1.6ml microcentrifuge tube에 놓고 실험실로 옮겼다. 꼬리지느러미에서의 DNA 분리는 DNeasy Blood/Tissue kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 분리하였다. 분리한 DNA sms TE(10 mM Tris-Cl; pH 8.0, 1 mM EDTA) 완충용액에 용해하여 냉장 보관하였으며, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위한 주형으로 이용하였다.

< 실시예 2> 프라이머 제작

1. 미세위성 마커 선정

붉바리(Epinephelus akaara) 5 마리의 전체 유전체 서열을 차세대염기서열분석법(next generation sequencing, NGS)으로 결정하였고, 결정된 서열에서 직렬 반복을 나타내는 미세위성 마커 중 유전자형이 3가지 이상으로 구분되는 미세위성 마커들을 선발하였다. 선발된 마커들 중에서 붉바리 친어집단에서 높은 다형성의 빈도와 대립인자 분포를 나타내는 10개의 미세위성 마커를 개체식별 및 친자확인을 위한 유전자 마커 체계로 최종 선발하였다.

NGS를 통해 결정된 유전체 서열 상에서 미세위성 10 종의 반복 단위와 개체별 유전자형

	Repeat unit	No. of genotypes	Individual ID
			0615	0616	0617	0618	0619
BBr _ 2nt _02	ct	3	30	26	26	28	28
BBr _ 2nt _12	tg	3	28	32	34	32	34
BBr _ 2nt _15	ta	3	20	18	28	18	18
BBr _ 2nt _16	ca	3	32	32	42	26	42
BBr _ 2nt _24	ac	4	42	40	32	42	44
BBr _ 2nt _26	ca	4	46	50	46	34	48
BBr _ 2nt _30	tg	4	22	38	36	36	37
BBr _ 2nt _31	ac	4	46	44	42	42	26
BBr _ 2nt _32	ac	4	52	36	48	40	48
Bbr _ 2nt _34	ga	5	50	44	40	32	42

상기 방법으로 선발된 미세위성 마커 10종은 다형정보량(polymorphic information content, PIC)이 0.7 이상으로 매우 높고, 관찰 이형접합 빈도(observed heterozygosity, HObs)와 기대 이형접합 빈도(expected heterozygosity, HExp)가 모두 0.5 이상인 다형성이 높은 DNA 마커이다.

미세위성 마커 10종의 조합을 이용한 붉바리 집단 분석 결과

Locus	k	N	HObs	HExp	PIC	NE-1P	NE-2P	NE-PP	NE-I	NE-SI
BBr _ 2nt _02	13	26	0.846	0.847	0.812	0.493	0.325	0.146	0.047	0.347
BBr _ 2nt _12	6	25	0.640	0.818	0.775	0.565	0.387	0.204	0.066	0.366
BBr _ 2nt _15	10	26	0.692	0.740	0.704	0.647	0.458	0.247	0.097	0.411
BBr _ 2nt _16	9	26	0.808	0.824	0.781	0.550	0.375	0.193	0.063	0.362
BBr _ 2nt _24	10	26	0.885	0.865	0.831	0.466	0.301	0.131	0.040	0.336
BBr _ 2nt _26	9	26	0.615	0.787	0.748	0.594	0.411	0.214	0.076	0.383
BBr _ 2nt _30	12	26	0.885	0.863	0.831	0.461	0.297	0.124	0.039	0.337
BBr _ 2nt _31	11	26	0.885	0.859	0.826	0.471	0.305	0.131	0.041	0.339
BBr _ 2nt _32	12	26	0.885	0.878	0.846	0.435	0.276	0.113	0.034	0.328
Bbr _ 2nt _34	8	26	0.500	0.784	0.735	0.617	0.439	0.252	0.087	0.387

붉바리 26 마리 집단에서 평가된 미세위성 마커 10종 조합의 정보력

Statistic content	Measured value
Number of individuals	26
Number of loci	10
Mean number of alleles per locus	10
Mean proportion of individuals typed	0.9962
Mean expected heterozygosity	0.8264
Mean polymorphic information content (PIC)	0.7889
Combined non-exclusion probability (first parent) (NE-1P)	0.00159773
Combined non-exclusion probability (second parent) (NE-2P)	0.00002937
Combined non-exclusion probability (parent pair) (NE-PP)	0.00000002
Combined non-exclusion probability (identity) (NE-I)	2.83×10 -13
Combined non-exclusion probability (sib identity) (NE-SI)	0.0000352

상기 표 3에서 보듯이, 26개체의 붉바리 집단에 대한 평가 결과, 총 10개의 유전자좌위에서 평균 대립유전자의 수는 10.0개였으며, 평균 HExp는 0.8264, 평균 PIC는 0.7889로 높은 수준을 나타내었다. 선발된 10종의 미세위성 마커를 이용한 친자확인에 있어, 양친을 모른 상태에서 제1부모에 대한 부권부정률(NE-1P)은 0.001597 수준이나, 편친에 대한 정보가 있을 때 2번째 부모에 대한 부권부정률(NE-2P)과 양친을 전부 알고 있을 때의 부권부정률(NE-PP)은 모두 국제동물유전학회 (International Society of Animal Genetics)의 권고 수준인 0.0005보다 낮은 수준을 나타내었다. 동일개체출현률(NE-I)과 형매 내 동일개체출현률 역시(NE-SI) 역시 낮은 수준을 나타내었다. 전체적으로 개체식별이나 친자확인을 위해 매우 효율성이 높은 마커 체계로 판단된다.

2. 프라이머 제작

10 종의 미세위성 마커를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)로 증폭하기 위하여 각각의 마커에 대한 프라이머(정방향 F, 역방향 R)를 고안하였다. 고안된 서열은 하기 표와 같다.

10종 미세위성 마커의 분석을 위해 고안한 프라이머 서열

Locus	Forward primer sequence	Reverse primer sequence
BBr _ 2nt _02	CTCCCTCCCTTTCTCCATTC	CGACCGTCTGAGGTCTAAGG
BBr _ 2nt _12	CACCGCCATCAAACTAGACA	GTGTCGCTAATGTGGGGACT
BBr _ 2nt _15	CCTGTGAGCTCTGTCCCTGT	TTGAATTTCTGGGGCAGTTC
BBr _ 2nt _16	GGCTAAAAGAGGGGTGGAGT	CCATGCCAAAGGCAAAATTA
BBr _ 2nt _24	CAGACTGCCTCCACACTTGA	ACAGCCTCTGACCACAGCTT
BBr _ 2nt _26	TTTCAAATCCACCTGCCAAT	CAGCACTGGCAGAGAAAACA
BBr _ 2nt _30	TTACCCAGCTGTGCTGAATG	CACCAGTACTGACGCTCTGG
BBr _ 2nt _31	GCTGGATGAGCTTTCCTCTG	GTGAGCAGAGTCGGATGTGA
BBr _ 2nt _32	TGCTACTGCATCCACACAAA	AAGCGAGCAAACAAACACAG
Bbr _ 2nt _34	CTTGGAGGGATGAATCGAGA	ACAGAGTCTGCAGCATCCAA

< 실시예 3> 유전자형 분석

1. PCR 반응

실시예 1의 방법으로 붉바리 꼬리지느러미 조직으로부터 분리한 DNA를 주형 DNA로 이용하였고, 1 ㎕의 주형 DNA(50 ng/㎕), 1 ㎕의 10× 반응완충용액(GenetBio, 한국), 1 ㎕의 10 mM dNTP(GenetBio, 한국), 0.2 ㎕(5units/㎕)의 Taq DNA polymerase(GenetBio, 한국), 및 최종농도 0.1 μM의 각각의 좌위(locus)에 해당하는 Forward primer와 Reverse primer를 각각 1 ㎕ 넣고 혼합하여 최종 10 ㎕의 반응액을 만든다. 준비된 PCR 반응용액은, 95℃에서 10분간 변성하고, 95℃ 30초-58℃ 30초-72℃ 45분로 이어지는 연쇄반응을 35회 수행한 후 72℃에서 5분간 유지한다. PCR 반응은 Mastercycler Gradient (Eppendorf, 독일) 또는 이와 유사한 thermal cycle PCR system을 이용한다.

그 결과, 분석 대상이 된 모든 붉바리 개체의 PCR 분석 결과에서 본 발명의 마커가 동시에 증폭되었음을 확인할 수 있었다. (도 1)

2. 유전자형 분석

실시예 3-1의 방법으로 증폭한 PCR 반응 산물은 유전자형 분석을 위해 무작위로 TE 완충용액으로 10배 희석하여 그 중 1 ㎕와 크기 표준(size standard)인 GeneScan 400HD ROX(ABI, 미국) 0.2 ㎕, 그리고 HiDi formamide(ABI, 미국) 10 ㎕를 섞어 유전자형 분석기 (3100 genetic analyzer; ABI, 미국)로 분석 피크의 강도에 따라 유전자형을 분석하였다. 또한, 각각의 미세위성 마커 프라이머 중 순방향의 프라이머를 FAM, HEX, NED 등 3 가지 형광입자를 표지한 후 증폭한 유전자 산물을 DNA sequencer ABI 3130XL을 이용하여 전개하였다.

그 결과, 도 2에서 보듯이, 동시에 붉바리 10개 미세위성 마커의 유전자형을 얻을 수 있었다. 이 경우 각 피크들로 표시되는 미세위성 마커의 대립유전자들은 각기 달리 표지된 형광염료로 구분된다. 파란색으로 나타나는 피크는 6-FAM으로 형광표지 된 마커를 나타내며, 녹색은 HEX로 표지된 마커의 대립유전자의 위치이며, 검정색은 NED로 표지된 마커의 위치를 나타낸다.

또한, 상기 해당 해당 대립유전자의 크기를 주황색으로 나타나는 Genescan 400 HD ROX(ABI, 미국)와의 비교를 통하여 대립유전자들의 크기(bp)를 아래와 같이 측정할 수 있었다. 이는 상기 프라이머를 이용하여 붉바리 26 개체의 미세위성 마커 유전자형을 결정한 결과이다.

<실시예 4> 개체 식별 및 친자 확인

결정된 유전자형을 이용하여, CERVUS program을 이용하여 동일성검사(identity test)와 친자확인시험(parentage test)를 수행하였다. 동일성검사 결과에서는 동일한 개체가 출현하지 않았으며, 친자확인시험 결과를 바탕으로 작성한 Bbr05M(친어 수컷)과 Bbr03F(친어 암컷)에서 생산된 F1과 F2의 가계도는 도 3에 도시하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Jeju National University <120> Method for identification and parentage using marker in Ephinephelus akaara <130> PN1711-412 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 509 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 1 cttacctact cattgacgct ttctctgcaa cccccccacc accaccacca ccacctccac 60 ccccccatca acactcggct gttgacgtga gccgtgtaac aatcctccct gtttccatga 120 caaccacctg ctgctgtcct cccctcatct gtctctccct ccctcccttt ctccattccc 180 tctctctctc tctctctctc tctctctctc cccccttttc cccctctcag ttgtctccct 240 tctctccgca cactgttggt atttcaaggt caaagagggt cacagccaga tagtgagata 300 gagacagaga taggggtgga aagtggggaa aggagagcga taacaatgcg agagaagaca 360 cacagaggga ggctggagga caaaaaaatc ccccagacgt tgttattgtt agcaccttag 420 acctcagacg gtcgccttat tcaacctagc ttggctcgct gtcctccctg cacttatcat 480 aacctcgttt tgtgtcaacc ttgagccaa 509 <210> 2 <211> 543 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 2 ttcacaatga ttttcgacca tagtgtgccc ccttggatca ccaggagctg tatgctcagt 60 taaatgtgat ttatttagtg tggactggac tgattctcaa atgtcagctg aaacttaatg 120 ttacattttg ctccagttat gtctttttta tacatcagta gctcttacat ggacaaccct 180 catagctttt atctttcatc agcacaacct tttgtttccg ctggtttaac aatagtgcca 240 tgctgcagat taagcctaac tccaccgcca tcaaactaga caccattgtg tttgtgtgtt 300 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgcg cgccaggtta gaggggtgtg tataaagtgc 360 agtccccaca ttagcgacac cattcacaca gttttttatt atgtttggat ccaatgttga 420 tctgacaaag atttatgttg ggacaaaagt ttgctttctg gtattgtgtt tgctctatat 480 ttgttttgga gagaccgtgc acatgcagaa cttaaagagc ccagcgtttc agccccccct 540 ccc 543 <210> 3 <211> 620 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 3 tatttcttcc ttccatcttg tctgcacact tgtttcccag tgttcccaca tgctcagcca 60 tcagcactga aaactcacgt attttcctgc catcctgcac ttctctggaa tatgtatgtg 120 aatttatgca tttgttttgg acctgccaga aggaaagcag gtttccaaaa gcaaaaatct 180 gctctcaaca ccagctttct tacatttaca ctgaaataat taaagccaac ttgtgattca 240 agggcagtgt atattacaat gaaaccctgt gagctctgtc cctgtccacg gagtattctt 300 tatatatata tatatatata tgtacacaca aaacgcccac agacgcaatc accaagaact 360 gccccagaaa ttcaagcgaa ggttatagaa attctctttg tagtggcaaa caaaatatcc 420 ctgagctttg aaaatcaccc tgcattattt ccgcagcatc cttggtgctg ctctgtgttg 480 cttattcttt cacacagcaa atgcctctct tagtcacgtt aggcagcttc tccatcaagg 540 ctgttttaat tcttctccac accagtgagt ttttagctgc atttgattgt aaactgcacg 600 cagaaccaat acacacacaa 620 <210> 4 <211> 503 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 4 tttttaatat aattctgatt catttgtgaa tagactacag tggaattaac cgcagccctt 60 caaaacaaat cccctttatc caccctctgc ctccttctct ctctctgggg ctaaactgga 120 ctcggcctgg ctaaaagagg ggtggagtag tctaattcat cagaaacagg tcacacacac 180 acacacacac acacacacac acatgcctgg ctacgaaatc atttctgcaa ccacaaaatc 240 actttaatat attcccagtg ctacttttga atattaataa aatatcaatt attaattttg 300 cctttggcat ggcaagatat acaagtttta attagtgtac tgtactcttt cacaattaaa 360 aaaataattg atgtccatac atgcgggcat tttgctgtga tggtctttct tgttgttgtc 420 aacagaggag gcggtgagac ggtgcgggca ctctcgcttc ttcctcttgt ccgcagttca 480 gatgcacttc aggcctgagg cta 503 <210> 5 <211> 642 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 5 cattagctgt actgattgtc acttgcttgg tttgtagggg tgtgtgtgtg tgtgtggtgt 60 ggtgatgggg tcaggaaggg gagggggggc gcagagagag ggagagaggg ggacagagga 120 ggtagagaca gaaggaaaga gcaaggaaaa gagagaaaga aagcaagcgc tgtctcagtc 180 ccaagctgtg tgtgattaat gtgaagctcc tttctctatc gcctcctcta ttaccagtcc 240 cactctccca gactgcctcc acacttgacc gctcaagctg agccacacat gcgcacgcat 300 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acgagataca acaagcagca 360 gcaacaaaca aacaaaccaa gctgtggtca gaggctgtgg ccaagtgtcc ttgcatagac 420 agcacctttt agttcagcca ctgacccaat caaaaagcca ccacagctct tcagcacgct 480 atttcattca atggaggagc ccagcagcta tagcagtgaa tcccactgga tcactaagcc 540 ttgataggaa gacaacacta cacaaaaatg tttcagagtt gccaaatggc ccctaccaat 600 cttctgctgc caccaccacc tccaccagcg cctctgccaa aa 642 <210> 6 <211> 596 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 6 tctctctccc tctctctctc tccctctctc tctctcactc actcactcac tcactcactc 60 acacacacag aatcacacac acagagtcac aaattcacac attcaaacac acacaccggt 120 ccggatgctg aatacacact cccagtgcgg agcagttcag ctcagcatgt tgaaacagac 180 accaggctgc tctttgtttt aattattgta cggaagcttg tttcaaatcc acctgccaat 240 ctgtctctct cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaccct 300 ccaccctgcc actccctctc tgtattatct gcagataaaa cccttccagt gaggcgttgc 360 agatttcata tgaatgtgta aattccaatt aggattagct tgttttctct gccagtgctg 420 atagcggctt tagcatgtcg ctggaggaag tgtcggccta ctggaactca tgatagacaa 480 gctgatgagg ccagattagt tcctttcagc tgtgtgtgtt tgtgtgcggg tgtgtgtggg 540 tgatgctctt catagctgaa actaattagc aggttgtctc tgctgtggag gggacg 596 <210> 7 <211> 622 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 7 aatttctctt acattttctc taattttcta tctcgagaaa acttgagaga agccagcccc 60 agatgcacca atatttctct accatccaaa tctgccctta cccagctgtg ctgaatgatg 120 aatcccactt catcacaagt aacctattag catgggtaac accttgtaaa cactgtataa 180 cagcaggtgt tgtgctgtgt gcaaaaactc tggcacatac ccaagaattg gagtagtggc 240 accaaaacag gctgtaagaa gaagaagctc tgcagtagtg aaattatttt tgtttttttt 300 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgaaataaac ttaaacaacg ttaacatgtg agcttccaga 360 gcgtcagtac tggtgttaca ggcaagtcaa aaacacagca atggaaaaat atttgtgatg 420 ctgtaaatac tgcagcagtg gtggaggaag tattcagacc cttgacttaa tgaaaaagta 480 ctagaaccac actgcgaaaa tactctgtaa ctagtagaac cctgcattta atatattact 540 taagtaaaag catgtaagtg caatcaggaa attgtattta ggtattaaaa gtaaaggtag 600 tcaatgcgga aaaacttaaa ta 622 <210> 8 <211> 646 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 8 gttcagggct gcttcatgtc attctttctt gctcctctca gaggcaggta aagtaacaga 60 gggatctggg aggacacggc gggaacagtg ggctctgcct gggccagctg ctccctctgt 120 tggagctaaa gacactgtac tgtactggat acttagagta gcatcgctcg acataatggg 180 gttataatct agaattccct gaaaatgctg taaaatgaca actaatctag gtggcacagg 240 tgtggctgga tgagctttcc tctgtgtgat tgcactgtgc tgtgggttgc tcgctctttt 300 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacgctc atacaataaa 360 tcacatccga ctctgctcac caagcggccc agcctatccc ggggtcatct caaaatcacc 420 atttaatgtt taacggcaaa gctggctttg atatcagcgg cagataaagt ggaatttctt 480 gattgcctcg gtcaaagagg ctccgctcgc tgagaaaatg atttattgga cacggggaag 540 tcggtggaga tcaaaggaga cggacgagcc tccaactcac accgcgggcc gggagcaggc 600 tggggctcgt ccaatcactc gcaccagcgg ggcccctgtc actgct 646 <210> 9 <211> 652 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 9 acacttggct cagttttgga ccttagggat ttgggttgac aatccagata gcaacatttg 60 ggctaactgt gggccatgat cagcttactg tattaatgca taacatttac cacaatgctg 120 acatatgacc agcaggagtc ctggacttgg caactgtgtt tgtgtttata gcagaaaaaa 180 attcacaagt tgttttagac aggagactct gataaacagg ctgaacattc actgtggcag 240 gtattacctt taaaatccat ctgctactgc atccacacaa acaatacctt acatgagcta 300 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acaggcagtc 360 aggttcatat gtctgtagag ctgttagatg tttaagtttc atcaaacaca tgcaggttct 420 ctggttctgg ggccgctggc aaagagatta gcaaacacac acactgtgtt tgtttgctcg 480 cttatgagtt tgtcactgca acatacagta tagagcatgc tttcatttcc agtaaagtgg 540 caaacacacg ttagtgtgtg aatggcagct cacccagaac catcagcaca cacagagttt 600 ggcatcaacg aacccgacct cgcttatgtt cagcctggct ctgctcgact gg 652 <210> 10 <211> 650 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 10 attcacatgt gtgcatttgc aattttgaga gaggggcaca tgcaggggtc acgagagaaa 60 gagacaaccg tcaatttagt tcccctcgcc ttcatcaaac acataccctc ggccaaatgt 120 gcttgcattg gggcatttat gtttgcgagc ggtctgtata gataagcttc aaatttatgc 180 cagcaggagg aagataatga cctggtggat ttgtccttgg agggatgaat cgagaaactg 240 aggggaaagg gaggacgatg gcggagatgg gggagattat gcaggagatg gaatagcaag 300 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga ggtggtttaa 360 aagttagaaa tgctgaatgt catatgagtg ggagagggta cagagcataa aatcacacag 420 gaaggcactt gttaatgcaa cagttggatg ctgcagactc tgtagaatat tggtctgaca 480 ctgtgggcct cccctcagac aaaatcgaga ccatttggca aattgccaag agtaaaagta 540 tgccaaatta gctattagca gctctgatct gcactgtact cacggatgta cagacatcca 600 tgattggatt cctttgatac caaagaaaac ttaatgattc tcgggcaagt 650 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 11 ctccctccct ttctccattc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 12 cgaccgtctg aggtctaagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 13 caccgccatc aaactagaca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 14 gtgtcgctaa tgtggggact 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 15 cctgtgagct ctgtccctgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 16 ttgaatttct ggggcagttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 17 ggctaaaaga ggggtggagt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 18 ccatgccaaa ggcaaaatta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 19 cagactgcct ccacacttga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 20 acagcctctg accacagctt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 21 tttcaaatcc acctgccaat 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 22 cagcactggc agagaaaaca 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 23 ttacccagct gtgctgaatg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 24 caccagtact gacgctctgg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 25 gctggatgag ctttcctctg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 26 gtgagcagag tcggatgtga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 27 tgctactgca tccacacaaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 28 aagcgagcaa acaaacacag 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 29 cttggaggga tgaatcgaga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epinephelus akaara <400> 30 acagagtctg cagcatccaa 20

Claims (9)

1. 서열번호 1 내지 서열번호 10의 서열로 이루어진 미세위성 마커를 포함하는 붉바리 개체식별 또는 친자확인용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 미세위성 마커는 서열번호 1의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 2의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 3의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 4의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 5의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20으로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 6의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22으로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 7의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 8의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 25 및 26으로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 9의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 27 및 28로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 10의 붉바리 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 29 및 30으로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 쌍 그룹으로 증폭 가능한 것인 붉바리 개체식별 또는 친자확인용 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 1) 감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 추출하는 단계;
   2) 단계 1)의 DNA 시료를 제 2항의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및
   3) 단계 2)의 증폭 산물의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는 붉바리 개체 식별 방법.
7. 제 6항에 있어서, 단계 2)의 증폭 반응은 다중증폭 중합효소 연쇄반응 프로그램에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 1) 감별하고자 하는 어류와 상기 어류의 부모 세대 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계;
   2) 단계 1)의 DNA 시료를 제2항의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 증폭하는 단계;
   3) 단계 2)의 증폭 산물의 밴드 패턴을 각각 분석하는 단계; 및
   4) 단계 3)의 부모 세대 어류의 밴드 패턴과 감별하고자 하는 어류의 밴드 패턴을 비교하는 단계를 포함하는 친자 확인 방법.
9. 제 1항의 조성물을 포함하는 어류의 개체 식별 및/또는 친자 확인용 키트.
   

Images