KR20190135789A - 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 차세대시퀀싱(NGS) 기반으로 넙치 개체의 SSR 부위를 찾아내고 동시에 증폭할 수 있는 마커를 개발하여 해당 마커를 통해 유전형을 분석하고 넙치 친자관계 및 혈연 관계의 식별이 가능한 넙치 친자 및 혈연 관계 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법을 제공함으로써 개발한 마커의 부위는 변별력이 높고 증폭률이 우수한 마커로서, 해당 마커를 이용하여 유전자형을 분석할 시 친자확인을 위한 기초데이터 생산과 더불어, 보다 높은 친자감별이 가능한 효과가 있다.

Description

넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 {Genetic maker for parentage and thereof in Olive flounder}

본 발명은 넙치 친자관계 및 혈연관계를 과학적으로 빠르고 쉽게 알 수 있도록 넙치 개체의 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것으로, 차세대시퀀싱(NGS) 기반으로 넙치 개체의 SSR 부위를 찾아내고, 동시에 증폭할 수 있는 마커를 개발하여 해당 마커를 통해 유전형을 분석하고 넙치 친자관계의 식별이 가능한 유전자 마커 및 이를 이용한 친자관계 확인방법에 관한 것이다.

주요 양식종인 넙치(olive flounder, Paralichtys olivaceus)는 가자미목 넙치과에 속하는 저서성 어류이다. 체형은 납작하고 다른 어류와 상이한 특징은 두 눈이 한 쪽에 모여 있다는 점이다. 넙치의 이빨은 눈이 없는 바닥 쪽이 크고 더 발달해 있으며, 적으로부터 자신을 보호하기 위하여 몸체를 보호색으로 위장한다. 몸 빛깔은 눈이 있는 쪽은 흑갈색 바탕에 암갈색이나 유백색의 작은 둥근 반점이 흩어져 있고 눈이 없는 쪽은 백색이다. 몸길이는 약 45 cm로 눈이 있는 쪽은 황갈색바탕에 짙은 갈색을 띠고 눈이 없는 쪽은 흰색을 띄며 한국 토종 넙치(광어)는 순수한 육식성 어종이다.

또한, 광염성 어류로 우리나라 전 연안, 쿠릴열도, 사할린, 일본 및 발해, 황해, 중국해 연안에 분포한다. 서식온도는 10~27℃ 범위로 최적 사육수온은 21~24℃이다. 수온 10℃이하 및 27℃이상에서는 먹이를 거의 섭취하지 않는다.

우리나라에서 넙치 양식은 1980년대 중반부터 시작되었다. 국립수산과학원 어류육종연구센터 주변 수역에서 자연산 넙치를 채포한 후, 육상 수조에 수용 관리하여 인공종묘를 생산하고, 넙치 수정란을 일본에서 도입하여 많은 양의 넙치 종묘를 생산 및 공급하면서 널리 퍼지게 되었다.

이후, 넙치 양식은 육상 수조식 사육시스템에서 넙치 양식이 활성화되어 불과 20여년 만에 수십 배의 놀라운 생산 증가를 보였다. 최근 10년간(2007-2016년)의 연평균생산량과 연평균생산액이 각각 42,476톤/년과 4,551억 원/년으로 같은 기간 전국 대비 어류양식업 연평균생산량(85,710톤/년)의 49.6%, 연평균생산액(8,248억 원/년)의 55.2%를 차지하여 국내 해산양식업 중에서 비중이 가장 높다. 특히, 제주도 넙치양식업은 2016년도 생산량과 생산액이 각각 24,317톤과 2,604억 원으로 전국 대비 양식넙치 생산량의 62.7%, 생산액의 62.0%를 차지하는 중요한 기간산업이다.

양식 기술개발로 인한 급격한 생산량 증가에 따라, 저가 활어의 수입증가에 따른 가격하락 및 양식 종묘의 열성화 진행, 빈번한 어병발생 등으로 넙치양식업의 경영난이 가중화되고 있으며 이와 같은 현상은 지속적 성장기반의 한계를 보여준다. 그동안 과학적이지 못한 친어집단의 관리 및 유전학적 다양성 축소와 집단의 근친도 증가와 유전적 병목현상으로 인해, 성장 저하, 빈번한 질병 발생, 기형 등의 발생과 집단크기가 축소되고 있다. 따라서, 단순히 양성, 사료, 시설, 유통 등의 기술 개발로는 상기 문제점을 해결하기가 어렵기 때문에, 넙치 양식 산업 경쟁력 확보를 위해서는 육종기술에 의한 우량 양식품종 개발이 필요하다.

선발육종은 기존의 양식품종을 유전적으로 우수한 개체나 집단을 선발해 이들의 자손을 보다 우수한 품종으로 개량하는 것이다. 이는 기존 품종의 개량에만 국한되는 것이 아니라 실용가치가 높은 계통(line)이나 품종(breed)을 새롭게 개발해 산업화하는 것까지 포함한다.

선발 육종에 따른 유전적 개량량은 세대를 거듭할수록 누진적으로 커지게 되어 생산성을 지속적으로 제고시킬 수 있으며 넙치양식의 질적 표현형이 양식물의 가치와 생산비용에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 어류는 일회 산란수가 많고 표현형(phenotype)의 유전적 변이가 커서 선발육종에 의한 유전적 개량에 이점을 가지고 있어 체중, 체장 등 어류의 주요 계측형질들은 생산성 관련 형질로써 직접 선발에 이용되어 질 수 있다.

더욱이, FTA에 따른 양식업의 경쟁력 확보를 위한 우량 종묘 및 수산물의 경제적 부가가치를 높이는 것이 절실한 상황에서 현재 수산생물 육종기술 도입 및 활용은 매우 미비한 상태로 수산양식종의 지속적 개량 및 소득 증대를 위해서는 DNA 마커를 활용한 분자육종 기술방법 개발이 필요하다.

특히, 유전자 표지 (DNA marker)를 이용한 육종과 전통적인 선발육종을 접목해 지속적인 후대생산을 통해 경제형질을 개선현대의 육종프로그램은 고전적인 선발육종인 양적 유전학적 육종방법과 최근 발전하고 있는 생물정보학을 이용한 분자육종을 접목시켜 지금까지 생각하지 못하였던 우량형질의 선택을 가능하게 만들면서 양식업에 획기적인 변화를 일으키고 있다.

DNA 마커는 생물 종에 대한 유전적인 특성을 분석할 수 있는 기술로 유전자원 보존을 위한 평가 연구에 활용될 수 있다. 초기의 DNA 마커는 다수의 유전자좌를 용이하게 확인할 수 있는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), ISSR(inter-simple sequence repeat) 등의 우성 마커(dominant marker)가 주로 이용되었다.

그러나, RAPD와 ISSR의 경우 재현성이 떨어질 뿐만 아니라 우성 마커의 특성상 2배체에서 우성 동형 접합체와 이형 접합체 유전자형의 구분이 불가능한 단점이 있다. 반면 SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다.

SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다. SSR 마커는 다형성 정도가 높아서 유전적 다양성과 유연관계를 평가하는데 많이 이용되고 있으며 수산분야 역시 SSR 마커를 이용한 방류효과조사, 혼획률 조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 이용되고 있다.

국내 등록특허번호 제10-1754502호에는 마이크로새틀라이트 마커를 활용한 돼지의 개체식별 및 친자감별방법에 관하여 개시하고 있고, 국내 등록특허번호 제10-1198096호에는 개인식별 또는 친자확인용 키트에 관하여 개시하고 있으나 상기 선행문헌은 개체식별 또는 축산물의 친자 감별에 관한 것이고, 본 발명의 넙치 친자관계 및 혈연관계의 감별이 가능한 마커 및 프라이머세트에 관한 구성은 개시하지 않아 차이를 보인다.

국내 등록특허번호 제10-1754502호에는 분석하고자 하는 돼지의 핵산 시료를 S0655, 387A12F, KVL9834, KVL9833, DGS1, DGS2, DGS3, DGS6, DGS9, DGS101, DGS102, DGS13, DGS14, DGS16, DGS17, DGS18, DGS22, DGS23의 18개로 이루어진 군으로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 1 내지 서열번호 36로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 제1 단계, 상기 제1 단계에서의 PCR에 대해 유전자형 분석을 수행하는 제2 단계, F-통계량 추정법에 의한 F-통계량을 추정 프로그램을 사용하여 다형성 지수인 이형접합률, 다형정보지수 및 배재력을 18종의 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 계산하는 제3 단계를 포함하고, 이를 통해 분석을 원하는 돼지의 개체 출현확률 및 친가감별확률을 계산하는 마이크로새틀라이트 마커를 활용한 돼지의 개체식별 및 친자감별방법에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1198096호에는 서열번호 1 내지 24로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 개인식별 또는 친자확인을 하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 개인식별 또는 친자확인 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 개인식별 또는 친자확인용 키트에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2009-0028894호에는 한우 개체의 식별을 위해 선발된 마이크로새틀라이트 마커 조합에 특이적인 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하는 PCR을 이용한 한우 개체의 식별방법에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2010-0138223호에는 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 마커를 증폭하는데 사용되는 프라이머쌍, 이를 포함하는 마이크로새틀라이트 DNA 마커 증폭용 키트, 및 이를 이용한 참치 품종의 식별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 증폭하고 이 증폭된 산물의 유전자형을 분석하면 참치를 새치와 기름치로부터 정확하면서도 간편하고 신속하게 식별할 수 있는 참치 품종을 식별하기 위한 마이크로새틀라이트 DNA마커 증폭용 프라이머쌍에 관하여 개시하고 있다.

본 발명의 목적은 개체 간의 변별력이 높은 SSR 부위를 선별하여 마커로 개발하고 동시에 여러 개 분석이 가능한 프라이머 조합의 개발 및 최적의 반응조건을 확립하는 것이다. 또한 해당 마커를 통해 넙치의 개체 식별 및 친자확인 등 확인이 가능케 하도록 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 마커번호 1로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 내지 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 2로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 내지 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 3으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 내지 14으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 4로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 내지 16으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 5로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 내지 18로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 6으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 내지 20으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 7로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 내지 22로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 8로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 내지 24로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 넙치 친자 및 혈연관계 식별용 마이크로새틀라이트(SSR; simple sequence repeat) 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일실시예에 따른 넙치 친자 및 혈연 관계 식별용 유전자 마커를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법은 분석하고자 하는 넙치에서 게놈 DNA를 분리하는 단계(가); 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 제1항의 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 통해 표적 서열을 증폭하는 단계(나); 및 상기 PCR증폭 산물을 분석하는 단계(다)를 포함하는 것일 수 있다.

상기 (나)단계의 멀티플렉스 PCR을 진행하기 위하여 각 마커 프라이머 정방향 올리고(forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지 형광물지로 표지(Label)하고 역방향 올리고(reverse primer)의 5’말단에 6개의 oligomer(GTTTCT)를 tailing하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 (다)단계는 PCR 증폭산물에 대해 자동염기서열 분석장치를 이용하여 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전자형분석 결과는 우수친어 교배지침, 집단 유전학적 분석, 가계선발, 방류효과조사, 근치방지, 열성화 방지, 친자 및 혈연관계 확인 등에 이용할 수 있다.

바람직하게는 상기 (다)단계는 마커를 기반으로 혈연관계를 파악하고자 하는 개체들의 유전자형을 분석결과 데이터를 입력하고, 상기 유전자형 분석결과의 데이터로부터 대립유전자빈도를 입력하며, 부모집단과 자식집단 사이의 대립유전자형의 일치여부를 비교하고 상기 대립유전자형의 일치되는 경우의 수에 따른 IBD공식을 설정하며, 상기 설정된 IBD공식에 혈연관계에 대한 경우의 수에 따른 IBD상수를 적용하여 혈연관계지수(likelihood ratio)를 추출하는 단계와, 상기 혈연관계지수값을 혈연관계확률 식에 적용하여 가장 높은 수치의 확률결과를 확인하여 혈연관계를 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 또 다른 실시예로서 제1항의 조성물을 포함하는 넙친 친자 및 혈연관계 식별용 키트를 제공하는 것일 수 있다.

본 발명의 차세대 시퀀싱을 기반으로 개발한 마커의 부위는 변별력이 높고 증폭률이 우수한 마커를 최종적으로 선별하였으며 해당 마커를 이용하여 유전자형을 분석할 시 친자확인을 위한 기초데이터를 생산이 가능하였다. 동시에 8개의 마커 증폭할 수 있는 multiplex PCR set를 개발함으로써 빠르고 신속하게 분석이 가능하며, 정확하고 과학적인 친자확인 프로그램을 통한 분석 시 친자확인이 가능한 효과가 있다.

도 1은 마커별 대립유전자 크기 범위 및 형광염료 표지를 나타낸다.
도 2는 넙치의 유전자형 분석결과로 각 피크들은 마커의 대립유전자를 나타낸다.
도 3은 넙치의 유전자형 분석결과로 각 피크들은 마커의 대립유전자를 나타낸다.
도 4는 부모집단의 유전자형 분석결과를 나타낸다.
도 5는 자식집단의 유전자형 분석결과를 나타낸다.
도 6은 자식과 부모사이의 관계확인을 위해 누적유전형빈도(allele frequency)를 이용한 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 분석한 결과이다.

본 발명의 용어, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.

본 발명의 SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분을 지칭한다.

본 발명에서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함시키는 데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

멀티플레스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 쌍을 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 억제 (inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머 들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머 마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용 시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 쌍 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.

본 발명에서 "프라이머(Primer)"는 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 여기에 정의된 프라이머들이라는 용어는 DNA의 합성을 준비할 수 있는 DNA 가닥들을 말한다. DNA 중합효소(polymerase)는 프라이머 없이 처음부터 DNA를 합성할 수 없다. DNA 중합효소는 오직 상보적인 가닥이 조립되는 뉴클레오티드들의 순서를 지시하기 위한 주형으로서 사용되는 반응에서 존재하는 DNA 가닥을 연장할 수 있다. 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일가닥이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형된 뉴클레오타이드 또는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱"은 많은 양의 리드들(reads), 전형적으로 동시에 몇 백보다 많은 수천 또는 수많은 서열 리드들의 순서를 발생시킬 수 있는 시퀀싱 기술이다. 차세대 시퀀싱은 고식적 생거 또는 모세관 시퀀싱(capillary sequencing)으로부터 구별되고 그리고 분명하다. 전형적으로, 서열화된 산물들은 전형적으로 대략 600~30 염기쌍 사이에서, 상대적으로 짧은 리드들을 가진다. 상기 기술들은 전형적으로 추가적으로 광범위하고 그리고 정교한 데이터 저장 및 리드 조립(read assembly) 등을 위한 데이터처리 작업 흐름을 구성한다.

분석 대상종의 염기서열 정보가 충분히 밝혀진 경우에는 SSR 정보를 직접 탐색하여 마커를 개발할 수 있으나, 염기서열 정보가 불충분한 경우 새로운 영역을 개발해야만 한다. 이를 개발하기 위해 최근에는 NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)를 이용하여 마커 개발 대상종으로부터 대량의 염기서열 정보를 분석하고, SSR 영역을 직접 탐색함으로써 SSR 마커를 개발하는 방법이 이용하고 있다. 초기의 대규모 시퀀싱의 경우, 고비용으로 시간도 오래 걸렸으나 기술의 발전으로 더욱 빠르고 저렴하게 분석되어 많은 종의 유전자를 밝히는데 이용되고 있으며 SSR 마커가 개발되지 않은 수산종에 대하여 NGS를 이용한 염기서열 확보와 microsatellite 마커 개발의 당위성이 높아지고 있다.

본 발명에서는 NGS를 이용하여 넙치의 염기서열을 밝혀내고 넙치의 SSR 부위를 이용한 친자확인용 마커를 개발하고자 하였다.

NGS 기술은 2000년대 초반에 완성된 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)의 영향으로 저비용, 고속, 대용량 염기서열 확정 기술이 요구됨에 따라 2006년과 2007년에 각각 일루미나(Ilumina)와 로슈(Roche) 사에서 NGS 기술을 이용한 제품들이 시장에 출시되면서 각광을 받기 시작하였다. 마이크로 또는 나노기술을 이용하여 시료의 길이를 줄이고, 수백만 개의 시료 단편들을 병렬로 분석할 수 있는 장점을 가지고 있다. NGS 기술의 기본원 리는 DNA 서열에 대한 증폭을 하고 서열 확정 과정에서 형광을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기서열의 순서를 밝혀내는 것이다. PCR 증폭 방식에 따라서 일루미나 사의 기종들은 고체-상 증폭(solidphase amplification)을 사용하는데 반해 로슈(Roche, 454) 사와 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 사의 기종들은 에멀전 PCR(emulsion PCR, emPCR) 방식으로 제작되었다.

또한, NGS 기술에는 다양한 회사의 플랫폼들이 존재한다. 본 발명에서 사용한 NGS 장비는 일루미나 사에서 개발된 MiSeq이다. MiSeq은 소형 NGS 장비로 특징은 기존 대용량 시퀀서인 HiSeq의 기법인 DNA 서열을 다른 회사들 (로슈, AB)에서 나온 플랫폼처럼 용액 안에서 증폭시키는 것이 아니라 판 위에 고정시킨 후에 판 위에서 구부러지면서 서열이 증폭되어 서열 집단을 형성하는 것이 특징이다. 그렇게 형성된 클러스터라는 집단은 집단 별로시퀀싱이 이루어져 각 판독물(reads)의 염기서열 정보로 전환되고 분석과정에 넘어간다.

MiSeq 장비는 HiSeq의 방법을 유지하면서 소형화에 성공하여, 장비 크기와 가격을 줄이고 작업을 더 빠르고 간편하게 만들었다는 점이다. MiSeq은 2 x 150 bp에서 최대 24시간 이내 3.7-4.6 Gb의 생체 정보 데이터를 생산할 수 있다.

통상적인 수산분야에서의 유전자형 분석 결과를 이용한 정확한 친자관계 및 전형매관계(Full-sib) 확인방법은 해외에서 개발된 집단간 유전적 거리 비교분석법을 이용하고 있거나 친자확인의 경우는 유전형비교를 육안으로만 확인하는 경우가 있다. 이는 개체에 대한 동일 여부를 확인 (Identification)하기 위해서는 이용이 가능할 것이지만 통계적인 분석법을 요하는 혈연관계나 친자관계 확인에서는 오류의 가능성이 매우 높으며, 거짓음성(False negative), 거짓양성(False positive)의 확률이 높다고 말할 수 있다.

이에 상기 혈연관계를 결정하는 단계는 여러 개체들 사이에 나타나는 누적되는 대립유전형 빈도(allele frequency)를 이용하여 1:1 비교(matching) 및 우도비(Likelihood ratio) 산정 결과를 이용하여 개체간의 각각의 유전자좌(locus)에 대한 대립유전형(allele)을 비교하여 일치하거나 불일치하는 경우 그에 대한 특정 값과 누적대립유전형 빈도 값을 부여하고 혈연관계지수를 산출함으로써 기존의 방법보다 보다 정확하게 혈연관계를 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 첨부한 도면과 함께 상세히 설명하면 다음과 같다.

<실험예 1> 넙치 게놈 DNA를 추출

넙치 꼬리 지느러미 조직 일부를 절취하여 게놈 DNA를 추출하고 차세대 시퀀싱 분석(NGS; next generation sequencing)을 실시하기 위해서, High quality DNA를 추출하였다. 추출은 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법 또는 Wizard®Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 이용하여 수행하였다.

<실험예 2> DNA library 제작

DNA library 제작은 Quality 높은 Raw data를 생산하기 위하여 Library QC(Quality control) test를 실시하였으며 Agilent 사의 2100 BioAnalyzer를 사용하여 확인하였다. Library QC를 통과하는 농도 기준인 Total volume이 10ug일 때 최소 5nM 이상 되도록 하였으며 Library QC가 통과 후 de novo assembly를 진행하였다.

Illumina sequencer 인 Hiseq4000을 이용하여 넙치의 NGS raw data를 생산하였으며 총 데이터 생산량은 genome size의 15배 이상인 15Gb이상 생산하였다. 생산 된 Total base reads를 확인 한 후 Q20에 해당하는 data를 filter하여 정렬하였다.

<실험예 3> 프라이머 제작

3-1 SSR 영역 marker design

Q-score는 염기를 호출할 때 발생할 수 있는 오류 가능성에 대한 대수적인 수치라 볼 수 있으며 Q20은 염기 100개를 불러올 때 1개의 염기를 잘못 불러올 확률로 99%의 정확성을 나타낼 확률이다.

선정된 OF_MS01 내지 OF_MS08 마커의 특성

좌위	마커번호	Repeat motif	Repeat size(bp)
OF_MS01	1	(CA)10	20
OF_MS02	2	(GT)12	24
OF_MS03	3	(GT)12	24
OF_MS04	4	(CA)13	26
OF_MS05	5	(GT)20	40
OF_MS06	6	(CA)13	26
OF_MS07	7	(CA)9	18
OF_MS08	8	(AC)13	26

생산된 data는 Q20이 90%이상인 reads만 남기고 필터링을 실시하고 De novo assembly 후 SSR region만 선별하며 Primer3(version 0.4.0) program을 이용하며 해당 지역의 marker를 design하였다. 동시 증폭을 위해서 Annealing temperature은 58~60℃로 맞추며 GC contents은 40~60%, product size는 100~300bp 마커를 디자인하였다. 표 1은 선정된 OF_MS01 내지 OF_MS08 마커의 특성을 나타낸다.

3-2. 프라이머 제작

하기의 표 2는 상기 실험예 3-1의 방법으로 선정된 마커번호 1 내지 8로 표시되는 마커 DNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍을 서열번호 9 내지 24로 나타내었다. 도 1은 마커별 대립유전자 크기 범위 및 형광염료 표지를 나타낸다.

프라이머 쌍의 특성

Marker Name	서열번호	Sequence (5' to 3')	5' Dye	Fragment size(bp)
OF_MS01_F	9	GTCACGGTCCATCCAGAAAC	FAM	66~102
OF_MS01_R	10	GTTTCTGAAGTGTGCGTCAAGAGAAGG
OF_MS02_F	11	ACTCACTCCACATCCTCCATCACTC	FAM	180~222
OF_MS02_R	12	GTTTCTTGACCGAGCGAATAAAGACAGCTTA
OF_MS03_F	13	TTTATTTTTGGACTCAAGCAGCGAA	VIC	162~248
OF_MS03_R	14	GTTTCTTCAGATTCTCCTCTGTGATGCCTG
OF_MS04_F	15	CGCTTGTTCTTATGGGAAGGAGACT	NED	97~121
OF_MS04_R	16	GTTTCTTCCTTTGCAGAACATACATTAGTCACA
OF_MS05_F	17	CGCTCCTTTCCTTTGTCTCG	NED	252~290
OF_MS05_R	18	GTTTCTACCATGATTCTCCTTTCCTC
OF_MS06_F	19	TGATCGCTTTACATAGGGCTGTGTT	VIC	109~125
OF_MS06_R	20	GTTTCTCAGCATATCTGCTCCTGACCTGAAT
OF_MS07_F	21	AGCTCAACAGGAATCTCTC	PET	141~179
OF_MS07_R	22	GTTTCTCTGGTATGGTAAAAACTCA
OF_MS08_F	23	CGGCCTAAACCTGGACATCCTCTCTA	PET	213~273
OF_MS08_R	24	GTTTCTCGGGACAACGGAGGTTTGACTGAC

유전자 마커의 동시 증폭을 위해 정방향 올리고(forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지 형광물질을 부착하여 증폭물의 크기가 서로 중복될 경우 형광물질 색으로 구분할 수 있도록 다른 색의 형광물질로 표지 시켰으며, 또한 역방향 올리고(reverse primer)의 5’말단에 6개의 oligomer(GTTTCT)를 tailing하여 background noise를 최소화 시켜 분석을 용이하도록 하였다.

하기의 표 3은 개발 마커를 이용한 넙치 집단의 유전학적 분석결과를 나타낸다. 제작된 마커의 경우2bp씩 9번~20번 반복하는 부위를 중심으로 제작하였으며 8마커에 대한 식별력은 5.424x10^-11로 높은 값을 나타내었다.

또한 마커를 이용한 유전적 다양성 분석 결과 각 마커의 대립유전자수는 12~23으로 높게 나타났으며 다형성지수 또한 0.644~0.856으로 높게 나타났다. 이는 여러 넙치 집단을 이용한 분석으로서 유전적 다양성 결과에 대한 정확성이 높은 것으로 사료된다.

개발 마커를 이용한 넙치 집단의 유전학적 분석

유전자좌 (Locus)	대립유전자수(k)	분석미수(N)	이형접합률 관찰치(Hobs)	이형접합률 기대치(Hexp)	다형성지수 (PIC)
OF_MS01	23	535	0.834	0.869	0.856
OF_MS02	13	535	0.811	0.816	0.794
OF_MS03	15	527	0.689	0.822	0.803
OF_MS04	14	535	0.895	0.822	0.8
OF_MS05	17	534	0.803	0.872	0.859
OF_MS06	12	535	0.692	0.697	0.644
OF_MS07	18	531	0.667	0.813	0.797
OF_MS08	16	529	0.783	0.812	0.789

<실험예 4> 유전자형 분석

4-1 다중증폭 중합효소연쇄반응 (Multiplex PCR)

서열번호 9내지 24의 프라이머 쌍이 포함된 Multiplex PCR set을 이용하여 PCR을 실시하였다. 동시 증폭(multiplexPCR)의 경우 annealing temperature에 따른 영향 및 시약 농도의 영향을 많이 받게 된다.

PCR 시약의 조성으로는 하나의 샘플 당 DNA template의 경우 1ul(100ng/ul), 10X buffer 1.5ul, dNTP(2mM) 1.5ul, Hot-taq polymerase(5U/ul) 0.3ul를 혼합하였으며, dye가 포함된 Forward primer의 경우 OF_MS01_F는 0.1ul, OF_MS02_F는 0.15ul, OF_MS03_F은 0.1ul, OF_MS04_F는 0.15ul, OF_MS05_F는 0.1ul, OF_MS06_F는 0.12ul, OF_MS07_F는 0.15ul, OF_MS08_F는 0.15ul을 넣고, 동일량의 Reverse primer를 함께 섞은 후 primer mixture를 만들어서 혼합하였다.

총량이 20ul가 되도록 증류수(distilled water)를 넣어주었다. PCR 조건은 touch-down PCR 방식으로 온도를 낮춰주며 annealing temperature에 따른 영향을 최소화하였다. 95℃에서 10분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 첫번째 단계로 94℃에서 1분; 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 5 싸이클로 반복 수행하고, 두번째 단계로 94℃에서 1분; 57℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 5 싸이클, 세번째로 94℃에서 1분; 56℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 25 싸이클로 반복 수행하였다. 마지막으로 65℃에서 30분 간 final extension을 시켜 준 후 8℃로 마무리하였다.

4-2 유전자형 분석(Genotyping analysis)

상기 실험예 4-1의 방법으로 수득한 증폭이 완료된 PCR 산물은 30X dilution 시킨 후, 증폭산물 1㎕와 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 및 Hi-Di Formaide (Applied Biosystems, USA) 혼합물을 1:9로 희석하여 분석을 위한 시료로 사용하였다.

이 시료는 자동염기서열 분석장치인 3730xl DNA Analyzer(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동 하였다. 각 마커에 대한 표준 allele ladder를 제작하여 GeneMapper version 4.0(ThermoFisher Scientific, USA)등 분석프로그램을 이용하여 모든 개체를 scoring하고 크기와 표식자의 종류별로 분류하여 자료를 취합하고 분석하였다.

도 2 내지 3은 넙치의 유전자형 분석결과로 각 피크들은 마커의 대립유전자를 나타낸다. 해당 마커를 이용할 시 동시에 넙치의 8개의 SSR 부위 유전자형을 얻을 수 있다. 각 마커 별로 중첩되는 부위의 마커는 표지된 형광염료로 구분될 수 있다. 푸른색으로 나타나는 피크는 FAM으로 형광표지된 OF_MS01, OF_MS02이며, 초록색으로 나타나는 피크는 VIC으로 형광표지된 OF_MS03, OF_MS06이다.

노란색으로 나타나는 피크는 NED로 형광표지된 OF_MS04, OF_MS05이며, 붉은색으로 나타나는 피크는 PET으로 형광표지 된 OF_MS07, OF_MS08에 대한 것이며 size standard를 이용하여 각 대립유전자들의 크기(bp)를 알 수 있었다.

<실험예 5> 개체별 유전자형 분석

5-1 부모집단(OF0) 유전자형 분석

본 발명에서는 부모집단을 OF0로 지칭한다. 교배에 참여한 OF0은 총 21미로 암컷 11미, 수컷 10미이며 해당 개체들은 교배 전 꼬리지느러미를 채취 후 상기 실험예 1 내지 4에 따른 방법으로 유전자형 분석을 실시하였다. 부모집단은 OF0로 명명하며 1번 개체의 경우 OF0_1, 2번 개체의 경우 OF0_2로 Labeling 하였다. 도 4는 부모집단의 유전자형 분석결과를 나타낸다.

5-2 자식집단(OF1) 유전자형 분석

본 발명에서는 자식집단을 OF1으로 지칭한다. OF1은 상기 OF0 그룹에 의해 생산된 종자 450미를 무작위로 채취한 것으로, 상기 실험예 1 내지 4에 따른 방법으로 단기보관용 DNA extraction 방법대로 DNA를 추출 후 유전형 분석을 실시하였고, 상기 OF0와 동일하게 동시증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 PCR 후 유전자형 분석을 실시하였다. 도 5는 자식집단의 유전자형 분석(Genotyping) 결과를 나타낸다.

<실험예 6> 친자 및 혈연관계 식별

친자 및 혈연관계 확인 친자확인 분석(parentage analysis) 및 혈연관계 분석을 위한 방법은 가축이나 어류에서 친자 확인법은 주로 최대가능도방법(maximum likelihood)을 사용하게 되며, 이는 여러 유전형을 통해 통계적으로 분석하는 방법이다. 친자확인의 경우 통상적으로 사용되고 있는 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 분석하였다.

도 6은 자식과 부모사이의 관계 확인을 위해 누적유전형빈도(allele frequency)를 이용한 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 분석한 결과이다. Pair loci mismatching 및 Trio loci mismatching이 ’인 값을 선별하거나 LOD Score 가 3이상인 것으로 친자관계를 확인하였다.

자손 OF1 친자확인 결과

	분석(%)
분석 마리수	450
유전형 분석 수	450(100%)
가계확인 수	450(100%)

상기 표 4는 친자확인 결과를 나타낸다. 개발된 유전자 마커에 대한 SSR 부위의 반복 수는 멘델 법칙에 의해 자손에게 유전되며, 부모 집단의 유전자형과 비교하여 친자 확인이 가능하다. OF0 개체 암컷 11미, 수컷 10미와 생산된 자손 OF1 개체 450미를 유전형 분석한 결과 450미 모두 분석이 가능하였고 집단교배에 의해 생산되는 양식환경에서 친자확인법을 통해 부모개체를 정확히 판별할 수 있었다. 따라서 본 발명에서 개발된 유전자 마커를 이용하여 혼획률 조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 활용이 가능하다.

본 발명의 유전자좌에서 산출된 혈연관계지수 값을 계산하여 친자관계 및 혈연관계를 판정하는 방법은 통계적 정확성 및 신뢰성이 매우 높은 효과가 있다.

기존의 넙치 양식산업은 과학적이지 못한 친어집단의 관리 및 유전학적 다양성 축소로 집단의 근친도 증가와 유전적 병목현상으로 성장 저하, 빈번한 질병 발생, 기형 등의 외적 표현으로 나타나게 되어 집단크기가 축소되고 있으므로 단순히 양성, 사료, 시설, 유통 등의 기술 개발로는 상기 문제점을 해결하기가 어려웠다. 이에 본 발명의 넙치 친자관계 및 혈연관계 유전자 마커와 이를 이용한 식별방법은 높은 계통(line)이나 품종(breed)을 새롭게 개발할 수 있도록 기본 데이터베이스를 제공하는 데 기여함으로 산업상 이용가능성이 있다.

<110> BluGen Korea <120> Genetic maker for parentage and thereof in Olive flounder <130> p18-017 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS01 <400> 1 cacacacaca cacacacaca 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS02 <400> 2 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgt 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS03 <400> 3 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgt 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS04 <400> 4 cacacacaca cacacacaca cacaca 26 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS05 <400> 5 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 40 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS06 <400> 6 cacacacaca cacacacaca cacaca 26 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS07 <400> 7 cacacacaca cacacaca 18 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS08 <400> 8 acacacacac acacacacac acacac 26 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS01 forward primer <400> 9 gtcacggtcc atccagaaac 20 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS01 reverse primer <400> 10 gtttctgaag tgtgcgtcaa gagaagg 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS02 forward primer <400> 11 actcactcca catcctccat cactc 25 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS02 reverse primer <400> 12 gtttcttgac cgagcgaata aagacagctt a 31 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS02 forward primer <400> 13 tttatttttg gactcaagca gcgaa 25 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS03 reverse primer <400> 14 gtttcttcag attctcctct gtgatgcctg 30 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS04 forward primer <400> 15 cgcttgttct tatgggaagg agact 25 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS04 reverse primer <400> 16 gtttcttcct ttgcagaaca tacattagtc aca 33 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS05 forward primer <400> 17 cgctcctttc ctttgtctcg 20 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS05 reverse primer <400> 18 gtttctacca tgattctcct ttcctc 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS06 forward primer <400> 19 tgatcgcttt acatagggct gtgtt 25 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS06 reverse primer <400> 20 gtttctcagc atatctgctc ctgacctgaa t 31 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS07 reverse primer <400> 21 agctcaacag gaatctctc 19 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS07 reverse primer <400> 22 gtttctctgg tatggtaaaa actca 25 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS08 forward primer <400> 23 cggcctaaac ctggacatcc tctcta 26 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OF_MS08 reverse primer <400> 24 gtttctcggg acaacggagg tttgactgac 30

Claims (4)

1. 마커번호 1로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 내지 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
   마커번호 2로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 내지 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
   마커번호 3으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 내지 14으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
   마커번호 4로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 내지 16으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
   마커번호 5로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 내지 18로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
   마커번호 6으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 내지 20으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
   마커번호 7로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 내지 22로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
   마커번호 8로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 내지 24로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 넙치 친자 및 혈연관계 식별용 마이크로새틀라이트(SSR; simple sequence repeat) 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물
   
2. 분석하고자 하는 넙치에서 게놈 DNA를 분리하는 단계(가);
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 제1항의 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 통해 표적 서열을 증폭하는 단계(나); 및
   상기 PCR증폭 산물을 분석하는 단계(다)를 포함하는 넙치 친자 및 혈연 관계 식별용 유전자 마커를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법
   
3. 제2항에 있어서, 상기 (나)단계의 멀티플렉스 PCR을 진행하기 위하여 각 마커 프라이머 정방향 올리고(forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지 형광물지로 표지(Label)하고 역방향 올리고(reverse primer)의 5’말단에 6개의 oligomer(GTTTCT)를 tailing하는 단계를 포함하고,
   (다)단계는 PCR 증폭산물에 대해 자동염기서열 분석장치를 이용하여 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 넙치 친자 및 혈연관계 식별용 유전자 마커를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법
   
4. 제1항의 조성물을 포함하는 넙치 친자 및 혈연관계 식별용 유전자 마커를 이용한 친자 및 혈연관계 식별용 키트

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