CN113774152B - 一种基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定的引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定引物，包括针对花鲈基因的8个微卫星位点Lm16‑281、Lm16‑189、Lm3‑111、Lm3‑129、F3、Lm16‑245、Lm2‑1091和Lm16‑267设计的8对微卫星标记荧光引物。本发明还公开了基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定方法，提取亲本和子代的花鲈基因组DNA，与微卫星标记荧光引物进行多重PCR反应，然后进行基因分型，根据等位基因值计算子代个体与候选亲本的似然率对数值从而判断亲子关系，提高了基因型数据的准确性，为种质鉴定、家系遗传管理和增殖放流效果评估提供新的技术手段。

Description

一种基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定的引物及方法
技术领域
本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定，具体涉及一种基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定的引物及方法。
背景技术
花鲈(Lateolabrax maculatus)，俗称海鲈，隶属鲈形目、鮨科、花鲈属，为东北亚特有种，广泛分布在中国、韩国及日本沿海，属广温、广盐性海水鱼类。随着花鲈规模化养殖的形成，中国的花鲈产量逐年提高，年产量已达18万吨，年出口量约3万吨。花鲈已成为中国重要的海水养殖鱼类之一，具有很高的经济价值。
微卫星(Microstatelites)又名简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，是基因组内以2-6bp为重复单位组成的串联重复序列。串联重复序列两侧的侧翼序列具有保守型，可在此设计引物，检测微卫星的多态性。微卫星遵循孟德尔遗传规律，具有数量多，共显性、多态性丰富、易于检测等特点，被广泛用于动植物的群体遗传多样性分析，亲子鉴定和遗传连锁图谱构建等方面。带荧光的微卫星标记结合多重PCR，可以一次性完成检测，具有操作简单，省时高效等特点。
发明内容
本发明的目的之一在于提供基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定引物。
因此，本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定引物组，包括以下任一对微卫星标记荧光引物：
Lm16-281位点：
Lm16-281 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，Lm16-281 R的核苷酸序列如SEQID NO.10所示；
Lm16-189位点：
Lm16-189 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，Lm16-189 R的核苷酸序列如SEQID NO.12所示；
Lm3-111位点：
Lm3-111 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，Lm3-111 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示；
Lm3-129位点：
Lm3-129 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，Lm3-129 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示；
F3位点：
F3 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，F3 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
Lm16-245位点：
Lm16-245 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，Lm16-245 R的核苷酸序列如SEQID NO.20所示；
Lm2-1091位点：
Lm2-1091 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，Lm2-1091 R的核苷酸序列如SEQID NO.22所示；
Lm16-267位点：
Lm16-267 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，Lm16-267 R的核苷酸序列如SEQID NO.24所示。
上述8对微卫星标记引物的核心序列重复单元、引物序列、产物大小和每对正向引物5’荧光标记如下(表1)：
表1花鲈亲子鉴定所用微卫星标记荧光引物信息
Figure GDA0004246864150000021
Figure GDA0004246864150000031
本发明目的之二在于提供基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定的试剂盒。具体地，所属试剂盒包含上述微卫星标记引物组。进一步地所述试剂盒还包括PCR扩增所需的试剂。
本发明目的之三是提供基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定方法。该方法有助于快速、准确对花鲈进行亲子鉴定。基于该方法，可以用于花鲈个体识别，进行遗传选育，防止花鲈近亲繁殖和种质资源衰退。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定方法，包括以下步骤：
(1)花鲈基因组DNA提取：采集花鲈亲本和子代的组织样品，分别提取基因组DNA；
(2)合成上述的8对微卫星标记荧光引物；
(3)多重PCR反应扩增：分别取步骤(1)获取的亲本和子代的花鲈基因组DNA和步骤(2)合成的8对特异性微卫星标记荧光引物进行多重PCR反应
(4)基因分型：通过自动测序仪(ABI 3730XL)对步骤(3)的多重PCR反应产物进行毛细管电泳基因分型，利用GeneMarker v1.91软件读取等位基因值；
(5)亲子关系判定：使用Cervus v3.0软件计算子代个体与候选亲本的似然率对数值(LOD)，指派最可能亲本，确定亲子关系。
所述组织样品包括花鲈的鳍条、肌肉或其他组织样品。
步骤(5)中，LOD<0，子代个体和候选亲本不存在亲子关系；LOD＝0，子代个体和候选亲本亲子关系不确定；LOD>0子代个体和候选亲本存在亲子关系，LOD值越大，可靠性越高。
步骤(3)中，多重PCR反应程序：95℃预变性10min，95℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共34个循环，72℃终延伸5min，4℃保存。
步骤(3)中，多重PCR反应体系如下(表2)：
表2花鲈亲子鉴定多重PCR反应体系
Figure GDA0004246864150000041
本发明的具有以下优点及有益效果：
(1)本发明提供的微卫星标记荧光引物对花鲈基因的8个微卫星位点Lm16-281、Lm16-189、Lm3-111、Lm3-129、F3、Lm16-245、Lm2-1091和Lm16-267具有良好的特异性，能够准确有效地进行标记。
(2)本发明提供的鉴定方法，可以一次检测8个微卫星位点，且引物可以重复利用，相对于简单的单位点检测，更简单、快捷、高效、成本低。
(3)本发明提供的方法利用微卫星标记、多重PCR和毛细管电泳技术的结合对花鲈进行基因分型，等位基因大小判读更加准确，提高了基因型数据的准确性。
(4)本发明为种质鉴定、家系遗传管理和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。
附图说明
图1为花鲈家系1母本(1M)多重PCR反应产物毛细管电泳图；
图2为花鲈家系1父本(1F)多重PCR反应产物毛细管电泳图；
图3为花鲈家系1子代个体(1-37)多重PCR反应产物毛细管电泳图；
图4为花鲈家系3母本(3M)多重PCR反应产物毛细管电泳图；
图5为花鲈家系3父本(3F)多重PCR反应产物毛细管电泳图；
图6为花鲈家系3子代个体(3-33)多重PCR反应产物毛细管电泳图。
具体实施方法
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
(1)选取性腺成熟好的花鲈亲鱼进行人工催产，建立2个全同胞单对交配家系(1号家系和3号家系)。收集1号家系母本和父本个体(编号：1M和1F)和98个子代个体(编号：1-1～1-98)、3号家系母本和父本个体(编号3M和3F)和76个子代个体(编号：3-1～3-76)以及随机选取的208尾野生花鲈个体(编号：ND1、ND2、BH1、BH2、BH3、BH4、CD1、CD2、CD3、CD4、QD1、QD2、QD3、SH1、SH2、SH3、ZH1、ZH2、ZH3～ZH195，用于计算微卫星位点遗传多样性参数和作为干扰亲本)，共386个个体。
(2)采集上述所有花鲈个体的的鳍条、肌肉或其他组织样品，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取所有个体基因组DNA，统一稀释至50ng/μL备用。
(3)合成表1的8对特异性微卫星荧光引物。
(4)取步骤(2)获取的花鲈基因组DNA和步骤(3)合成的8对特异性微卫星荧光引物，分别对上述所有个体进行多重PCR扩增。
利用多重PCR反应程序：95℃预变性10min，95℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共34个循环，72℃终延伸5min，4℃保存。多重PCR反应体系如下(表2)：
表2花鲈亲子鉴定多重PCR反应体系
Figure GDA0004246864150000051
Figure GDA0004246864150000061
(5)多重PCR扩增产物经在自动测序仪(ABI 3730XL)上进行毛细管电泳自动分型。
(6)使用GeneMarker v1.91软件分析电泳结果，得到每个个体微卫星标记的基因型数据，(共386个个体，表3为部分个体基因型)。
表3花鲈亲子鉴定部分个体基因型
Figure GDA0004246864150000062
Figure GDA0004246864150000071
Figure GDA0004246864150000081
Figure GDA0004246864150000091
Figure GDA0004246864150000101
(7)利用步骤(6)获取的花鲈个体基因型数据，使用Cervus v3.0软件计算8个微卫星位点遗传多样性参数，结果见表4。8个微卫星位点第一亲本累计排除概率(CE-1P)＝0.9721、第二亲本累计排除概率(CE-2P)＝0.9974、亲本对累计排除概率(CE-PP)＝0.9999。
表4花鲈8个微卫星位点遗传多样性参数
Figure GDA0004246864150000102
注：NS：表示不显著偏离哈迪温伯格平衡(P>0.05)；*：表示显著偏离哈迪温伯格平衡(P<0.05)。
(8)使用Cervus v3.0软件，计算子代个体与候选亲本个体的似然率对数值(LOD)，指派最可能亲本，确定亲子关系。结果显示(表5)，2个家系174尾子代个体被均指派到正确的候选母本，但有4尾子代个体(1-2、1-45、1-71和1-95)的候选母本LOD<0(表示与指派的候选亲本无亲子关系)，候选母本鉴定准确率97.70％；2个家系174尾子代个体均被指派到正确的候选父本，所有子代个体的候选父本LOD>0，候选父本鉴定准确率尾100.00％；2个家系174尾子代个体均被指派到正确的亲本对，所有子代个体的亲本对LOD>0亲本对鉴定准确率100.00％。以上分析结果表明，本方法用于花鲈亲子鉴定是可行的。
表5亲子鉴定结果
Figure GDA0004246864150000111
/>
Figure GDA0004246864150000121
/>
Figure GDA0004246864150000131
/>
Figure GDA0004246864150000141
注：*表示置信度水平为95％；+表示置信度水平为80％。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定的引物及方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 310
<212> DNA
<213> 花鲈(Lateolabrax maculatus)
<400> 1
acgcacaaca ttcccagatt ttccatgaat tgccccaata atttaattat tttcttaatt 60
ccatgactcc agggtacctg gtagttaaat ttaggttata gagaaagcaa catgtcaaag 120
agggtcctca caagtataga ctacaagtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 180
gtgtgtgtgt gtgattgtca cagatggctg cagcagatac tatcacacta ctcaggcagc 240
tcagatacta attttagacc tgagcagaaa actcaccgga tgctcaatat ttccccaaaa 300
tactggaaag 310
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<212> DNA
<213> 花鲈(Lateolabrax maculatus)
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gtagttcctt cctgacacga ggtccaggcc tggtagctac tgttgttgtt gttgttgttg 120
ttgttgttgt atctgggacg acgtaacctg atggatgtta gaacagctga gactgacctt 180
agctggccca ccatcactga gggtccctgc agatcctgca ctctgtctgc tgggatgatt 240
tatggtctaa tacaatgtac ggtccctcgt atctgt 276
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tgtgtgtctc tgtgtgagtg tgagtgtgtg tgcaggaaac acactcaggt gagctctaac 120
ggctgcagca ccttgttagc tgcggctaac tgtggtgaaa gtgttgacag cccccccgtt 180
aaagagcagg agtccttcac gtttaacgac agcagagacg ctttaagttg tcagaaacgt 240
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<211> 24
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cagggcgctc caataagg 18
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 花鲈(Lateolabrax maculatus)
<400> 22
ttaagtgtgt atgaaatagg cggc 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 花鲈(Lateolabrax maculatus)
<400> 23
gactgttgat tcctctctga ctgt 24
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 花鲈(Lateolabrax maculatus)
<400> 24
gtgctttgta acttgtttgg ga 22

Claims (3)

1.一种基于微卫星标记的引物在制备花鲈亲子鉴定试剂盒中的应用，其特征是，所述引物为以下位点的8对微卫星标记荧光引物：
Lm16-281位点：
Lm16-281 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，Lm16-281 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；
Lm16-189位点：
Lm16-189 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，Lm16-189 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；
Lm3-111位点：
Lm3-111 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，Lm3-111 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示；
Lm3-129位点：
Lm3-129 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，Lm3-129 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示；
F3位点：
F3 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，F3 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
Lm16-245位点：
Lm16-245 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，Lm16-245 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示；
Lm2-1091位点：
Lm2-1091 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，
Lm2-1091 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
Lm16-267位点：
Lm16-267 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，Lm16-267 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.24所示。
2.基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)花鲈基因组DNA提取：采集花鲈亲本和子代的组织样品，分别提取基因组DNA；
(2)合成权利要求1所述的8对微卫星标记荧光引物；
(3)多重PCR反应扩增：分别取所述步骤(1)获取的亲本和子代的花鲈基因组DNA和步骤(2)合成的所述8对微卫星标记荧光引物进行多重PCR反应；
(4)基因分型：通过自动测序仪对所述步骤(3)的多重PCR反应产物进行毛细管电泳基因分型，利用GeneMarker v1.91软件读取等位基因值；
(5)亲子关系判定：使用Cervus v3.0软件计算子代个体与候选亲本的似然率对数值LOD，确定亲子关系；其中，LOD<0，子代个体和亲本不存在亲子关系；LOD＝0，子代个体和亲本亲子关系不确定；LOD>0，子代个体和亲本存在亲子关系。
3.根据权利要求2所述的基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定方法，其特征是，所述步骤(3)中，多重PCR反应程序：95℃预变性10min，95℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共34个循环，72℃终延伸5min，4℃保存。
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