CN116426653A - 一种脊尾白虾遗传性别鉴定的dna标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋生物分子育种研究领域，具体涉及一种脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记及其应用。DNA标记为脊尾白虾中两个相邻的SNP标记，雄性个体均为T/T‑T/T基因型，雌性个体均为C/T‑C/T基因型。本发明提供的脊尾白虾的遗传性别鉴定方法在不同来源的种质中具有普适性，操作简便，准确率高，在脊尾白虾的性别控制和遗传育种研究中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物分子育种研究领域，具体涉及一种脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记及其应用。
背景技术
脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)隶属于甲壳动物亚门、软甲纲、十足目、游泳亚目、长臂虾科、长臂虾属，分布于浅海低盐水域。近年来，脊尾白虾的人工养殖发展迅速，目前全国养殖面积已超60余万亩，其中江苏、浙江是主要的养殖区域，全国养殖产量超过10万吨，已经成为我国重要的经济虾类。但随着养殖面积和产量不断提高，良种缺乏等问题也越发突出，产业迫切需要高产、抗病的良种。脊尾白虾的雌性个体的生长速度较雄性个体快，因此培育全雌的脊尾白虾良种对于提高养殖产量具有重要的意义。同时脊尾白虾由于体型小、受精卵大、繁殖周期短、可人工繁育等特点，目前正逐渐发展成为虾蟹类基础研究的模式生物，而性别作为遗传学研究的重要命题，揭示其性别决定机制，对于其他甲壳动物的性别研究也具有重要的意义。
性别标记的获得是开展性别决定研究和性别控制的基础，目前在凡纳滨对虾、中国明对虾、斑节对虾等虾类中已经获得了其性别遗传标记，雌雄个体遗传性别鉴定准确率可达100％(李富花，于洋，张晓军，相建海。一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA探针序列及获取方法，专利号：ZL 201510245304.9；李诗豪,李富花,相建海。一种鉴定中国明对虾遗传性别的DNA序列标签及其应用，专利号：ZL 2015109447852；黄智康,江世贵,周发林,黄建华,杨其彬,姜松,李运东,杨丽诗，基于InDel标记的斑节对虾早期性别鉴定方法的建立，南方水产科学,2020,16(3),113-118)。在脊尾白虾中，通过构建高密度遗传连锁图谱和连锁分析，鉴定了多个脊尾白虾的性别相关标记(Jianjian Lv，Xuan Lu,Xingbin Ti,PingLiu,Jitao Li,JianLi.QTL mapping and marker identification for sexdetermination in the ridgetail white prawn,Exopalaemon carinicauda,Genomics,112(6),5240-5247),但是最显著的标记在不同种群中的雄性个体的鉴定准确率为95.8％，雌性个体的鉴定准确率仅为88.5％。然而，开展脊尾白虾的性别控制和单性苗种的培育需要与性别完全连锁的标记(鉴定准确率为100％)，而目前仍缺乏与性别完全连锁的标记。
发明内容
为解决上述问题，本发明目的在于提供一种新型的脊尾白虾遗传性别的DNA标记及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记，DNA标记为脊尾白虾中两个相邻的SNP标记，雄性个体均为T/T-T/T基因型，雌性个体均为C/T-C/T基因型。
所述DNA标记为SEQ ID No.1所示的SEQEcSD碱基序列。
一种所述的脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记的应用，所述DNA标记在脊尾白虾遗传性别鉴定中的应用。
一种所述DNA标记扩增引物，引物对为EcSDF:TCACACAGAATGGATGCAACT和EcSDR:TCCATGGGTTTGATCAATCCCT。
一种脊尾白虾遗传性别鉴定试剂盒，含所述的引物对。
一种脊尾白虾遗传性别鉴定的方法，利用引物EcSDF:TCACACAGAATGGATGCAACT和EcSDR:TCCATGGGTTTGATCAATCCCT对待检测脊尾白虾的DNA进行PCR扩增，获得权利要求1所述的DNA标记；若标记的基因型为C/T-C/T基因型，则该个体为雌性，若标记的基因型为T/T-T/T基因型，则该个体是雄性。
具体为：
(1)取待检测脊尾白虾的附肢或肌肉，并使用荧光标记或眼柄环做好个体标记；
(2)提取取样个体的DNA，使用如下体系对每个个体的DNA进行PCR扩增：12.5μl 10×Golden polymerase Buffer,0.5μl EcSDF：TCACACAGAATGGATGCAACT，0.5μl EcSDR：TCCATGGGTTTGATCAATCCCT，0.25μl Golden polymerase,2μl DNA模板，9.75μl超纯水。扩增程序为：94℃5分钟，之后94℃30秒，60℃30秒,72℃30秒，共计35个循环，最后72℃延伸10分钟；
(3)对PCR产物使用EcSDR引物进行一代测序，测序结果使用Bioedit软件读取SNP位点的峰图信息，如果为C/T-C/T基因型，则该个体为雌性，如果为T/T-T/T基因型，则该个体是雄性。
本发明所具有的优点：
本发明提供的脊尾白虾的遗传性别鉴定方法在不同来源的种质中具有普适性，操作简便，准确率高，准确率为100％，解决了性别控制研究中与性别完全连锁标记缺乏的问题，进而其在脊尾白虾的性别控制和遗传育种研究中具有广阔的应用前景。
同时，利用本发明所提供的脊尾白虾遗传性别鉴定的标记具有鉴定准确率高、操作简单的优势，能够在个体发育早期性别未分化时实现雌雄性别的区分，对于揭示脊尾白虾发育早期性别决定机制和开展性别控制研究具有重要的意义，并且进一步将促进脊尾白虾性别决定基础研究和全雌苗种的培育。
附图说明
图1为本发明实施例提供的脊尾白虾性别遗传鉴定DNA标记在雌雄个体中的分型结果；其中，红色虚线框内为性别鉴定的2个SNP标记。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明的两个SNP标记完全连锁，因此通过任何1个标记进行脊尾白虾性别鉴定的结果是与两个SNP鉴定的结果一致，也属于本专利的保护范围。通过本发明脊尾白虾雌性别SNP标记序列设计的其他引物及其在性别鉴定中的应用，也属于本发明的保护范围。
实施例1：脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记的获得
(1)样品取样和重测序分析
分别在河北省黄骅市和江苏省启东市取脊尾白虾的雌雄个体，之后使用DNA提取试剂盒进行DNA提取，从河北种群中选择7个雌虾和10个雄虾，从江苏种群中选择6个雌虾和6个雄虾，总计13个雌虾和16个雄虾进行高通量测序文库构建和全基因组重测序，使用MGISEQ-T7测序仪进行高通量测序，每个样品的测序数据量大于60G。
(2)全基因组SNP发掘
将测序数据过滤后获得高质量的reads，使用BWA比对到脊尾白虾参考基因组，并使用GATK软件进行SNP分型，这些SNP位点进一步通过最小等位基因频率过滤(>0.05)和位点分型成功率过滤(>0.9)，获得高质量的SNP位点。
(3)性别相关SNP鉴定
利用获得高质量SNP位点，结合每个个体的表型信息，使用rMVP进行分析，使用的混合线性模型鉴定与性别紧密相关的SNP标记。
选择与性别相关性最高的34个SNP标记，在24个河北种群个体(12个雌虾、12个雄虾)和24个江苏种群个体(12个雌虾、12个雄虾)中进行SNP分型，并进行与性别的相关性分析，结果显示SEQ EcSD的序列中的2个SNP(即SEQ ID No.1所示)与性别的相关性最强，雄性个体均为T/T-T/T基因型，雌性个体均为C/T-C/T基因型，雌雄性别的鉴定准确率为100％。
SEQ ID No.1的信息
>SEQ EcSD
TCACACAGAATGGATGCAACTGTAAGGTCTTGAAGACCAGGAATATTA
CAATACAATACACGACATTGACAAAATATGGGAGGTACTGGTCACATA TTTTG[T/C][T/C]TAATATCTCCACACATCATAAGAATTAATAGTAATAAA AAGGATAAACCATGCTTAAAAATTAATAACAGGAGAGATAAAAAAAA ACAATATGTACAGAAACATATATAAAGGGATTGATCAAACCCATGGA
(a)序列特征
*长度：235碱基对
*类型：核苷酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：核酸
序列描述：SEQ EcSD
而后利用上述获得DNA标记建立了脊尾白虾性别鉴定技术，具体如下：
对于未知性别或早期无法判断性别的脊尾白虾个体，取其组织进行DNA提取，之后使用扩增引物EcSDF:TCACACAGAATGGATGCAACT和EcSDR:TCCATGGGTTTGATCAATCCCT扩增其DNA，使用一代测序获得脊尾白虾性别鉴定DNA标记的分型结果，如果为C/T-C/T基因型，则该个体为雌性，如果为T/T-T/T基因型，则该个体是雄性。
通过该方法实现了个体遗传性别的准确鉴定，为后续的性别控制和性别决定机制研究提供了有力工具。
实施例2：脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记的应用
(1)不同来源脊尾白虾野生群体的取样
脊尾白虾河北群体的种质来源于河北省沧州市黄骅市南排河镇，为海上捕捞的野生种质，根据第五步足间距离和雄性凸起的有无判断其雌雄性别，随机挑选雌虾35尾，雄虾35尾，总计70尾个体，剪取游泳足用于后续的DNA提取。脊尾白虾的江苏群体来源于江苏省南通市启东县，是人工养殖的野生苗种，同样随机挑选雌虾35尾，雄虾35尾，剪取游泳足用于后续的DNA提取。河北和江苏两个群体共计140尾。
(2)脊尾白虾不同种质样品的DNA提取
使用基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)分别提取上述脊尾白虾个体组织DNA，具体操作步骤参考试剂盒说明书，每个个体的DNA使用核酸浓度测定仪Nanodrop1000测定浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
(3)脊尾白虾性别鉴定SNP标记序列的扩增
使用扩增引物对EcSDF:TCACACAGAATGGATGCAACT和EcSDR:TCCATGGGTTTGATCAATCCCT分别扩增雌雄个体，PCR扩增体系如下：12.5μl 10×Goldenpolymerase Buffer,0.5μl EcSDF，0.5μl EcSDR，0.25μl Golden polymerase,2μl DNA模板，9.75μl超纯水；扩增程序为：94℃5分钟，之后94℃30秒，60℃30秒,72℃30秒，共计35个循环，最后72℃延伸10分钟；
(4)脊尾白虾性别鉴定SNP标记分型和雌雄个体差异
对扩增的PCR产物使用EcSDR引物进行一代测序，测序结果使用Bioedit软件读取测序峰图信息，如果测序峰图中两个SNP位置均为C和T双峰，则该个体的分型结果为C/T-C/T杂合基因型，如果两个SNP位置均为T单峰，则该该获得SNP的分型结果T/T-T/T纯合基因型(图1)。
分别统计河北和江苏两个群体中每个个体的基因型，并与其表型进行对应，结果显示，在河北群体中，雄性个体均为T/T-T/T纯合，雌性个体均为C/T-C/T杂合；在江苏群体中，雄性个体均为T/T-T/T纯合，雌性个体均为C/T-C/T杂合，因此根据该标记的基因型可以进行雌雄个体的准确区分。
Claims (7)
1.一种脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记，其特征在于：DNA标记为脊尾白虾中两个相邻的SNP标记，雄性个体均为T/T-T/T基因型，雌性个体均为C/T-C/T基因型。
2.按权利要求1所述的脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记，其特征在于：所述DNA标记为SEQ ID No.1所示的SEQEcSD碱基序列。
3.一种权利要求1所述的脊尾白虾遗传性别鉴定的DNA标记的应用，其特征在于：所述DNA标记在脊尾白虾遗传性别鉴定中的应用。
4.一种权利要求1所述DNA标记扩增引物，其特征在于：引物对为EcSDF:TCACACAGAATGGATGCAACT和EcSDR:TCCATGGGTTTGATCAATCCCT。
5.一种脊尾白虾遗传性别鉴定试剂盒，其特征在于：含权利要求4所述的引物对。
6.一种脊尾白虾遗传性别鉴定的方法，其特征在于：利用引物EcSDF:TCACACAGAATGGATGCAACT和EcSDR:TCCATGGGTTTGATCAATCCCT对待检测脊尾白虾的DNA进行PCR扩增，获得权利要求1所述的DNA标记；若标记的基因型为C/T-C/T基因型，则该个体为雌性，若标记的基因型为T/T-T/T基因型，则该个体是雄性。
7.按权利要求6所述的脊尾白虾遗传性别鉴定的方法，其特征在于：
(1)取待检测脊尾白虾的附肢或肌肉，并使用荧光标记或眼柄环做好个体标记；
(2)提取取样个体的DNA，使用如下体系对每个个体的DNA进行PCR扩增：12.5μl 10×Golden polymerase Buffer,0.5μl EcSDF：TCACACAGAATGGATGCAACT，0.5μl EcSDR：TCCATGGGTTTGATCAATCCCT，0.25μl Golden polymerase,2μl DNA模板，9.75μl超纯水；扩增程序为：94℃5分钟，之后94℃30秒，60℃30秒,72℃30秒，共计35个循环，最后72℃延伸10分钟；
(3)对PCR产物使用EcSDR引物进行一代测序，测序结果使用Bioedit软件读取SNP位点的峰图信息，如果为C/T-C/T基因型，则该个体为雌性，如果为T/T-T/T基因型，则该个体是雄性。
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