CN109055580B - 凡纳滨对虾c型清道夫受体内与生长相关分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产育种技术领域，具体涉及位于凡纳滨对虾的C型清道夫受体基因(LvSRC)上一个与生长相关的分子标记及其在凡纳滨对虾遗传育种中的应用。我们通过全基因组关联分析在基因组水平上定位到一批与对虾生长性状相关的标记，通过基因注释和候选基因关联分析方法进一步筛选出位于LvSRC基因编码区的一个单核苷酸多态性(SNP)标记(LvSRC‑211‑G/T)，该标记的基因型与对虾生长性状呈显著相关(P<10^‑6)。该标记位于LvSRC基因上211bp的位置，为G/T型突变，在该标记的GT基因型为明显的生长优势基因型。本发明所涉及的标记可以作为对虾育种的分子标记辅助对虾生长性状的遗传选育。

Description

凡纳滨对虾C型清道夫受体内与生长相关分子标记及应用

技术领域

本发明属于水产动物育种领域，具体涉及凡纳滨对虾C-型清道夫受体内一个与生长性状相关分子标记及其在生长性状育种中的应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，又称南美白对虾(white Pacificshrimp)，是世界最重要的水产养殖品种之一，占据了世界对虾总产量的76％，其养殖区域遍布世界各地。近十年，凡纳滨对虾的养殖产量逐年增加，由2004年的130万吨增长到2013年的330万吨。凡纳滨对虾同样也是我国对虾养殖的主导品种，该品种1988年从美国引进我国，自1999年开始在我国大规模养殖，至2013年年产量可达140万吨左右，占我国对虾养殖总产量的80％以上。

养殖产量的增长拉动了对凡纳滨对虾优良种质的需求。在对虾的遗传改良研究中，生长性状既是重要的衡量指标，同时也是最直接的育种目标。然而长期以来，对虾的遗传改良主要依赖于人工选择和基于数量遗传学的传统选育方法，而这些方法因选育周期长和选择准确性低等问题，而难以满足加快遗传改良进展的现实要求。相较于传统选育方法，分子标记辅助选育(Marker-assisted selection)技术因其具有选育间隔短、准确性和可靠性高等特点则可以加快遗传育种的进程。

分子标记辅助选育是将分子标记应用于动植物相关性状遗传改良过程中进行辅助选择的一种技术手段，其实质是利用与目的基因紧密连锁的分子标记对个体进行目标区域及全基因组筛选，获得期望的个体，从而提高选育效率和准确率。前期，研究人员通过QTL定位方法在对虾中定位到了一些与生长性状相关的QTL位点，如在日本对虾定位到了一个与生长性状相关的主效AFLP标记，之后通过图位克隆的方法找到一个与生长相关的基因ELOVL(Elongation of very long chain fatty acids-like)(Lyons RE,Dierens LM,TanSH,Preston NP,Li Y.Characterization of AFLP markers associated with growth inthe kuruma prawn,Marsupenaeus japonicus,and identification of a candidategene.Mar Biotechnol,2007,9:712-721)；在凡纳滨对虾QTL定位中，也发现了生长相关的QTL位点(Andriantahina F,Liu X,Huang H.Genetic map construction andquantitative trait locus(QTL)detection of growth-related traits inLitopenaeus vannamei for selective breeding applications.PLoS One,2013,8:e75206)，但是受制于较低的标记密度，并没有定位到与生长直接相关的基因或标记。

本发明是在全基因组范围内对SNPs标记进行分析，获得一个位于功能基因内与生长性状显著相关的分子标记，该标记可以用于指导凡纳滨对虾生长性状的辅助选育。

发明内容

本发明的目的是提供一种与凡纳滨对虾生长相关的分子标记，并用于指导对虾生长快品种的选育。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

位于凡纳滨对虾C型清道夫受体(LvSRC)基因内与生长相关的分子标记及其在生长性状育种中的应用，具有序列表中SEQIDLvSRC所示的核苷酸序列。

一种与凡纳滨对虾生长相关的分子标记，与对虾生长性状显著相关的分子标记位于SEQIDLvSRC序列的211bp位置，该标记为G/T型SNP标记。

一种用于检测上述分子标记的引物对，其序列特征如下：

LvSRCF：CCGTATTTGTTGAATGAGTGGG

LvSRCR：CTACCACTCCAACAGACGAAGG

该标记的应用上，因GT基因型个体的生长速度高于GG基因型，在对虾育种过程中，通过SNP分型方法将该标记分型后，选择GG型和TT型的个体进行交配产生的后代在生长方面具有优势，从而提高对虾养殖产量。

本发明所具有的优点：本方法提供的生长性状相关的分子标记能够从分子水平上对生长快个体进行选择，因不受外界环境及个体大小的限制，因而能够在早期对生长快个体进行选择，从而提高选择的效率和准确率。

本发明通过全基因组关联分析在基因组水平上定位到一批与对虾生长性状相关的标记，通过基因注释和候选基因关联分析方法进一步筛选出位于LvSRC基因编码区的一个单核苷酸多态性(SNP)标记(LvSRC-211-G/T)，该标记的基因型与对虾生长性状呈显著相关(P<10^-6)。该标记位于LvSRC基因上211bp的位置，为G/T型突变，在该标记的GT基因型为明显的生长优势基因型。本发明所涉及的标记可以作为对虾育种的分子标记辅助对虾生长性状的遗传选育。

附图说明

图1 LvSRC-211-G/T位点两种基因型在混养群体中体重箱线图(箱体中间线代表体重中值，箱体的上顶代表75％分位数，箱体下边缘代表25％分位数)。

具体实施方式

实施例1：凡纳滨对虾生长相关分子标记的获得

(1)凡纳滨对虾生长性状的全基因组关联分析(GWAS)：

用于GWAS分析的材料为一个由13个全同胞家系组成的混合群体。2015年7月，在海南广泰海洋育种公司(文昌，海南)通过定向交尾方式总计构建13个全同胞家系。每个家系孵化出幼体后分别转移至5m²的水池进行单独培育。期间，为减少养殖环境对不同家系的影响，尽量采用标准化的方式对各家系进行培育，使盐度、温度、幼体密度、饵料和充气等条件尽量保持一致。2015年9月，从13个家系中各随机挑取50尾对虾混合后转移至10m²的水池进行统一环境下的培养，组成混合群体。2015年11月中旬，随机抽取200尾虾，使用电子天平测量其体重，并进行性别的判定。

使用植物基因组提取试剂盒(天根，北京)提取所有材料DNA，之后采用2b-RAD的方法对所有个体进行全基因组SNP分型，利用获得的SNP分型数据使用GenABEL软件进行对虾体重的GWAS分析，定位生长性状相关标记(Aulchenko Y.S.,Ripke S.,Isaacs A.,vanDuijn C.M.GenABEL:an R package for genome-wide associationanalysis.Bioinformatics.23:1294-6(2007).)。

(2)生长相关分子标记获得

通过GWAS分析获得了一些与体重显著相关(P<0.01)的标记。通过对这些标记进行基因注释，发现其中的一个SNP位于LvSRC基因的编码区，该基因可以编码C型清道夫受体蛋白(Class C scavenger receptor,SRC)。以该基因(LvSRC)作为生长相关候选基因，在该基因编码区进行SNP详查，并采用一个独立群体对识别的非同义突变SNP进行候选位点的关联分析。分析结果显示SEQIDLvSRC序列的211bp位置的SNP位点与对虾体重呈极显著相关(P<1×10^-6)关系，该位点对体重表型变异的解释率可达13％，该标记的GT基因型为优势基因型。

SEQ ID NO.1的信息(SEQIDLvSRC序列)

(a)序列特征：

*长度：339碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA，特征名称Variation

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

SEQIDLvSRC序列：

CCGTATTTGTTGAATGAGTGGGCACGTCCCTTTAATCTATCTGTACAGAATTTACATTTATACAGAGTAATATCTACTTAATATCTACATAATATCTACCAAATATCTGCCTACCTGACGGGGAGGTTTTGGCTTCACTTTCAGTGACTGGTAATGTCTTGTTTTCCGTTCCCTCGGGCGTGGTCACTACGGCAGGGGTGGAGCTGGGCTNCGACGGTGGCACAGAAGCTGCTGTAGTCGTCTTGGCGGTGGTAGTGCCGCTCGTCGCAGGAGTGCTCTCAGAAACGATCGCAGGCGGCGTGGTTGTGGGCAAAGGTCCTTCGTCTGTTGGAGTGGTAG

N为G或T。

实施例2：一种凡纳滨对虾生长相关标记在育种中的应用。

(1)候选父母本LvSRC-211-G/T位点的分型

2016年6月，以海南广泰海洋育种公司(文昌，海南)的留种亲虾作为候选父母本，取每尾对虾的一对游泳足提取DNA后，利用如下引物对扩增每个个体的目标区域序列：

LvSRCF：CCGTATTTGTTGAATGAGTGGG

LvSRCR：CTACCACTCCAACAGACGAAGG

PCR扩增产物使用ABI3730xl测序仪进行一代测序，测序引物为LvSRCF引物，根据测序峰图对LvSRC-211-G/T进行分型，如果该位置仅有1个G碱基峰，则分型结果为GG型，若仅有一个T碱基峰，则分型结果为TT型，如果该位置既有G碱基峰又有T碱基峰，则分型结果为GT型。

(2)家系材料制备

根据上述分型结果，分别选取GG型个体和TT型个体作为亲本制备GG和TT型纯合型家系。此外，以GG型和TT型个体作为父母本进行定向交配制备GT型家系。每个家系孵化出幼体后分别转移至5m²的水池进行单独培育，待家系材料生长至1cm时，每个家系随机挑取50尾凡纳滨对虾放入10m²水池混养。养殖4个月后从混养群体中随机挑选322个个体进行体重测定。

(3)LvSRC-211-G/T标记辅助选择

对上述个体进行目标区域测序并进行基因分型。在上述材料中，检测到为GG型和GT型两种基因型个体，其中GT基因型的平均体重显著高于GG型(图1)。因此通过对LvSRC-211-G/T标记中的GT基因型进行选择，可以提高育种群体的生长速度。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 凡纳滨对虾C型清道夫受体内与生长相关分子标记及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 339

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

ccgtatttgt tgaatgagtg ggcacgtccc tttaatctat ctgtacagaa tttacattta 60

tacagagtaa tatctactta atatctacat aatatctacc aaatatctgc ctacctgacg 120

gggaggtttt ggcttcactt tcagtgactg gtaatgtctt gttttccgtt ccctcgggcg 180

tggtcactac ggcaggggtg gagctgggct ncgacggtgg cacagaagct gctgtagtcg 240

tcttggcggt ggtagtgccg ctcgtcgcag gagtgctctc agaaacgatc gcaggcggcg 300

tggttgtggg caaaggtcct tcgtctgttg gagtggtag 339

Claims (4)

1.凡纳滨对虾 C 型清道夫受体内与生长相关分子标记，其特征在于，为序列表中SEQID NO.1 所示的DNA序列，即为SEQIDLvSRC 序列，该序列的 211 bp 位置的N为G或T，该标记为G/T 型SNP 标记，命名为 LvSRC-211-G/T。

2.按照权利要求 1 所述的分子标记，其特征在于，该标记的优势基因型为 GT 杂合型。

3.一种权利要求 1或 2所述的分子标记在凡纳滨对虾生长性状育种或遗传育种中的应用。

4. 按照权利要求 3 所述的分子标记在生长性状育种中的应用，过程如下：

1）提取对虾留种亲本的 DNA；

2 ） 使用如下引物 LvSRCF 和 LvSRCR 扩增亲本 DNA 中含有LvSRC-211-G/T 位点的序列；

所述的对虾生长性状相关分子标记的引物对为：

LvSRCF：CCGTATTTGTTGAATGAGTGGG

LvSRCR：CTACCACTCCAACAGACGAAGG

3 ） 使用 LvSRCF 引物对扩增的片段进行测序，通过测序方法对LvSRC-211-G/T 位点进行 SNP 分型，若测序峰图中 SEQIDLvSRC 中第 211 个位置仅有 G 峰，则该个体基因型为 GG，若为 G 和 T 双峰，则该个体基因型为 G/T，若仅有 T 峰，则该个体基因型为 TT；4）根据分型结果设计交配策略，制备具有生长优势的 GT 基因型，辅助生长性状的生产，即选择GG 型和 TT 型的个体进行交配产生的后代在生长方面具有优势，从而提高对虾养殖产量。

Images