CN117344033B - 一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用。所述分子标记LvKDZ‑S3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其位于凡纳滨对虾基因组39号连锁群的164,995物理位置,多态位点为A/G。在凡纳滨对虾亲本促熟阶段或更早期可通过对虾须、游泳足等活体取样的方式提取基因组DNA,然后利用55K“黄海芯1号”凡纳滨对虾液相芯片检测LvKDZ‑S3位点的基因型;再根据分型结果制定亲虾留种、交配策略。所述分子标记LvKDZ‑S3可以从分子水平上对生长快速个体进行选择,不受生长阶段和个体大小的限制,且能够在早期进行选择,提高选择的准确率和效率,加快生长速度的选育进程。

Description

一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域,具体涉及一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用。
背景技术
凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)又称南美白对虾、白虾,隶属于节肢动物门(Arthropoda)、软甲纲(Malacostraca)、十足目(Decapoda)、枝鳃亚目(Dendrobranchiata)、对虾科(Penaeidae)、对虾属(Penaeus)。它是世界养殖虾类产量最高的三大种类之一,也是全球单一经济价值最高的海水养殖种类,全球产量超过630万吨,直接产值2000多亿元人民币。中国的凡纳滨对虾产业养殖总量牢牢占据世界第一的位置。根据《中国渔业统计年鉴》,2015年来,我国凡纳滨对虾年总产量在162.5~209.8万吨之间,产值超过800亿元,占世界总产量的30%以上,占我国对虾养殖量的70%以上。凡纳滨对虾的特点是生长快、适应性强,在人工控制的条件下,生长速度可达到0.3~0.5g/天,养殖周期3个月以内即可达到商品规格,因此生长速度一直是对虾遗传改良首先关注的极重要的经济性状。
以规模化家系选育和数量遗传学为基础的选择育种技术,已经广泛应用于凡纳滨对虾育种项目,以此选育出的快速生长品系,生长速度得到了明显改良。然而相比于畜牧物种和农作物,对虾选育仍存在选择进展慢、效率低等问题。其一方面重要原因是仅利用表型及系谱数据选育,选择的准确性和可靠性仍有待提高。而利用高通量基因组学信息,筛选出与生长显著关联的SNP位点,鉴定出关键基因及通路,开展分子标记辅助育种可有效提高选择的准确性和可靠性,进一步加快遗传改良的进程。
分子标记目前在遗传改良中主要应用于亲缘关系鉴定、群体遗传背景分析等场景,而其更直接高效的利用方法是筛查到与目的性状基因紧密连锁的标记,进一步对选育群体个体进行包含目标位点的基因组位点分型、根据等位基因/基因型选择优良个体。虽然目前已有利用全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)筛选出可能与凡纳滨对虾体重相关的SNP位点,但单位点GWAS分析方法未充分利用系谱信息及多位点分析模型,大都没有经过验证,可信度不高;且缺乏一种高通量低成本的快速位点检测分型方法,极大限制了生长相关位点的筛查和在育种中的实际应用。因此,筛选出有利于高效选育快速生长凡纳滨对虾的分子标记非常重要。
发明内容
本发明旨在提供一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用。所述分子标记LvKDZ-S3可通过高通量低成本的芯片检测方法快速检测,从而用于凡纳滨对虾快速生长性状的高效辅助选育。
为实现上述发明目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明提供了一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记,其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
进一步的,所述分子标记的多态位点为A/G,即所述分子标记的核苷酸序列的第101位碱基为A或者G。
进一步的,所述分子标记位于凡纳滨对虾基因组39号连锁群的164,995物理位置。
本发明还提供了一种筛选生长快速的凡纳滨对虾的方法,其包括以下步骤:
(1)提取待测的凡纳滨对虾的基因组DNA;
(2)检测凡纳滨对虾基因组DNA的39号连锁群的164,995物理位置的所述的分子标记是否具有多态性并检测基因型;
(3)根据基因型的分型结果,筛选出生长快速的凡纳滨对虾。
进一步的,所述生长快速的凡纳滨对虾的基因型为AA基因型。
进一步的,所述基因型的检测利用的是通过GenoBaits探针捕获技术的55K“黄海芯1号”凡纳滨对虾液相芯片。
本发明还提供了所述的分子标记在凡纳滨对虾快速生长性状的鉴定和筛选中的应用。
本发明还提供了所述的分子标记在凡纳滨对虾快速生长新品种/系的选育中的应用。
进一步的,所述凡纳滨对虾快速生长新品种/系为AA基因型。
进一步的,在选育过程中,提取凡纳滨对虾父本和母本的基因组DNA,检测所述分子标记LvKDZ-S1位点的基因型,根据分型结果:(1)保留均为AA基因型的父本和母本进行留种和传代;(2)若父本和母本并不均为AA基因型,则选择父本和母本分别为AA基因型与AG基因型进行交配;或者选择父本和母本均为AG基因型进行交配,并在交配后代中继续筛选出具有AA基因型的个体。
本发明与现有技术相比,具有以下优点:
1、本发明提供的凡纳滨对虾快速生长相关分子标记LvKDZ-S3可以从分子水平上对生长快速个体进行选择,不受生长阶段和个体大小的限制,且能够在早期进行选择,提高选择的准确率和效率,加快生长速度的选育进程。
2、本发明提供的分子标记LvKDZ-S3可使用高通量自动化的商品化液相芯片55K“黄海芯1号”检测,检测流程标准化、检测速度快,且成本远低于传统的重测序、简化基因组测序等技术方法,具有较高的实际应用价值。
附图说明
图1为LvKDZ-S3标记的FarmCPU分析曼哈顿图。
图2为LvKDZ-S3标记在不同基因型中个体体重箱型图。
图3为LvKDZ-S3标记在不同基因型中个体体重去回归育种值箱型图。
具体实施方式
实施例1:LvKDZ-S3标记的获得
(1)标记筛选群体构建与性状测试
本发明所用的家系材料来自中国水产科学研究院黄海水产研究所的凡纳滨对虾核心育种群体。使用人工定向交尾技术构建筛选一代全同胞家系62个。每个亲本产卵、孵化后每个家系的无节幼体置于单独的聚乙烯桶中进行幼体培育,过程中幼体密度经过多次标准化以保持密度一致。同时温度、换水量、投喂量等均按照标准化操作流程保持一致。当家系平均体重达到3 g时进行混养生长测试:每个家系随机选择159尾个体,使用(VisibleImplant Elastomer, VIE)荧光标记注射尾节、腹节的方式做特异性标记。测试池为直径4.5 m的圆形水泥池,底面积约为17 m2,水位高度0.5 m,水体体积约为9 m³。共分为2种测试密度、3个测试池测试:T1、T2池为两个平行测试池,每家系放入36尾对虾,测试密度为250尾/m³;T3池为高密度测试池,每家系放入87尾对虾,测试密度为600尾/m³。混养测试时间平均为61天。测试结束后将所有存活个体测量体重并保留样本,样本取肌肉组织切块后固定于95%乙醇中,-20℃存放。
(2)样品选择、芯片检测及质控
用于GWAS分析的个体来源于步骤(1)中测试、筛选群体选择的40个家系,每个家系选择15尾个体,从T1、T2、T3中各选5尾(雌雄各半),共600尾个体作为分析对象。将每个个体肌肉样品取0.1 g转移至石家庄博瑞迪生物技术有限公司的DNA样品固定管中裂解,并使用高通量DNA提取试剂盒自动化提取基因组DNA。之后利用GenoBaits探针捕获技术构建液相芯片“黄海芯1号”55K SNP标记的靶向测序文库。使用DNBSEQ-T7测序平台进行测序。使用PLINK进行质控,质控参数为“ --Geno 0.1 --MAF 0.05 --Mind 0.2 ”,删除次等位基因频率(MAF)< 0.05,或SNP缺失率 > 0.1标记,或样本缺失率 > 0.2的个体。对拟在位点筛选中使用的599尾个体的基因型结果进行质控,保留了596尾个体的46,099个SNP标记。利用NCBI上发布的凡纳滨对虾连锁基因图谱对所使用的55K SNP芯片标记位点进行定位,共有40,209个SNP标记定位至44个连锁群上用于后续分析。
(3)凡纳滨对虾生长性状的全基因组关联分析
为了剖分、校正不同测试池、测试密度、初始体重、性别等因素对个体体重值的影响,标记与性状的全基因组关联分析中体重表型修正为经过校正过的体重性状去回归育种值(DEBV),分析使用ASReml-W V 4.2软件,个体动物模型如下:
其中,表示第k尾个体的收获体重,μ表示总体均值,/>表示第i个测试池固定效应,/>表示第j个性别固定效应,/>表示拟合在第i个测试池与第j个性别交互固定效应内的第k尾个体的初始体重协变量,β为初始体重协变量的回归系数,/>表示第k尾个体的加性遗传效应(随机效应),/>,/>是加性遗传方差;/>表示第k尾个体的随机残差,/>,/>是残差方差;表型方差/>;/>
利用系谱信息构建,使用上述模型预测所有个体的EBV,进一步使用下述公式计算DEBV
其中,r表示个体EBV的预测准确性,表示EBV的标准误,/>是加性遗传方差,DEBV即为可利用的该个体体重的去回归育种值。
利用使用R包rMVP中FarmCPU方法进行多位点GWAS分析。固定效应模型如下:
其中,是第i尾个体的DEBV;/>是主成分分析的前三列主成分,代表相应的效应值;/>t个加入到模型的可能关联位点的基因型, 是相应的效应值;/>是第i尾个体第j个检测SNP标记的基因型;/>是相应的效应值;/>是残差向量,服从平均数为0、方差为/>的正态分布。
随机效应模型如下:
其中,是第i尾个体的DEBV, />是第i尾个体的总遗传效应,/>K是利用可能关联位点所构建的亲缘关系矩阵,/>是未知遗传方差;/>是残差向量,服从平均数为0、方差为/>的正态分布。
使用Bonferroni校正方法确定全基因组水平显著阈值。全基因组水平显著阈值设置为
(4)生长性状关联位点筛选
根据GWAS分析的P值,筛选出一个与个体体重去回归育种值显著关联的位点LvKDZ-S3,位于39号连锁群上的164,995位置,其SNP-ID为NW_020869061.1_164995,其在全基因组水平上与体重的显著性P值为1.69E-09。该标记的AA基因型为优势基因型,核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。FarmCPU分析的曼哈顿图如图1所示,即该序列的第101位碱基存在一个A/G等位基因突变。
实施例2:LvKDZ-S3标记与生长关联性的验证与应用
(1)验证群体的构建与性状测试
使用人工定向交尾技术构建验证一代全同胞家系74个。待验证群体个体生长至标记规格(3g)时,每个家系随机选择50尾进行荧光标记混养生长测试,测试池及水体体积如实施例1(1)。测试分为两个平行池T1-1和T1-2,每池每个家系放入25尾对虾,测试密度为205尾/m³。混养测试时间为57天,后将所有存活个体测量体重等性状后,样本取肌肉组织切块固定于95%乙醇中,-20℃存放。
(2)验证个体的选择
验证群体的740尾个体选择方法为:随机选择生长测试中39个家系,每家系随机挑选15~20尾大小个体共计740尾。利用实施例1步骤(2)中的方法构建液相芯片“黄海芯1号”55K SNP标记的靶向测序文库,使用DNBSEQ-T7测序平台进行测序,在每个个体中获得LvKDZ-S3位点的基因型。
(3)LvKDZ-S3标记的生长关联性验证
LvKDZ-S3位点在上述740尾个体中,检测到AA、AG、GG 3种基因型个体。根据不同基因型将个体分为3组,3种基因型个体数分别为374、285、58,其中GG纯合子最少。为从统计学上提高不同基因型个体的性状之间可比性,分别对AA、AG、GG基因型个体抽样58、116、58个,比较3组收获体重的均值以及体重去回归育种值的均值(如图2和图3所示)。单因素方差分析显示,平均体重以及体重去回归育种值均有显著性差异,P值分别为2E-16、7.91E-16(表1)。因此,上述方法筛查到的LvKDZ-S3标记,在验证群体中也表现出与生长的显著关联性。
表1 LvKDZ-S3标记不同基因型个体的体重及去回归育种值
本发明所获得的分子标记LvKDZ-S3可以用来辅助选择快速生长亲本,利用此标记中的AA基因型对亲本进行选择,可以提高育种群体的生长速度。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记,其特征在于,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述分子标记的多态位点为A/G,即所述分子标记的核苷酸序列的第101位碱基为A或者G。
2.根据权利要求1所述的分子标记,其特征在于,所述分子标记位于凡纳滨对虾基因组39号连锁群的164,995物理位置。
3.一种筛选生长快速的凡纳滨对虾的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取待测的凡纳滨对虾的基因组DNA;
(2)检测凡纳滨对虾基因组DNA的39号连锁群的164,995物理位置的权利要求1所述的分子标记是否具有多态性并检测基因型;
(3)根据基因型的分型结果,筛选出生长快速的凡纳滨对虾;所述生长快速的凡纳滨对虾的基因型为AA基因型。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中基因型的检测利用的是通过GenoBaits探针捕获技术的55K“黄海芯1号”凡纳滨对虾液相芯片。
5.分子标记在凡纳滨对虾快速生长性状的鉴定和筛选中的应用,其特征在于,所述分子标记为权利要求1-2任一项所述的分子标记。
6.分子标记在凡纳滨对虾快速生长新品种/系的选育中的应用,其特征在于,所述分子标记为权利要求1-2任一项所述的分子标记。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述凡纳滨对虾快速生长新品种/系为AA基因型。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,在选育过程中,提取凡纳滨对虾父本和母本的基因组DNA,检测所述分子标记的基因型,根据分型结果:(1)保留均为AA基因型的父本和母本进行留种和传代;(2)若父本和母本并不均为AA基因型,则选择父本和母本分别为AA基因型与AG基因型进行交配;或者选择父本和母本均为AG基因型进行交配,并在交配后代中继续筛选出具有AA基因型的个体。
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