CN114657264A - 一种胡子鲇性别特异性分子标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胡子鲇性别特异性分子标记引物，该引物为引物NP544，引物NP544包括正向引物NP544‑F和反向引物NP544‑R，碱基序列分别如SEQ ID NO：1所示和SEQ ID NO：2所示。还公开了用于胡子鲇性别鉴定的试剂盒和方法，及上述引物或试剂盒和方法在鉴定胡子鲇性别方面的应用。该引物特异性好，准确性高，对胡子鲇活体没有伤害，可一次性快速准确批量鉴定胡子鲇的性别，具有重要的科研和应用价值。

Description

一种胡子鲇性别特异性分子标记引物及其应用

技术领域

本发明属于胡子鲇性别鉴定技术，具体涉及一种胡子鲇性别特异性分子标记引物及其应用。

背景技术

胡子鲇(Clariasfuscus)，又称塘虱鱼，隶属鲇形目、胡子鲇科、胡子鲇属。该物种肉质细嫩，味道鲜美，经济价值高，是我国南方大面积养殖的淡水鱼类。胡子鲇具有特殊的附属呼吸器官，可适应极低溶氧环境，为广温性鲇科鱼类，具有抗病能力强、养殖简单、周期短、产量高、成本低和容易运输等特点，目前在广西、广东和福建等地形成规模化养殖产业，成为具有较好发展前途的淡水养殖品种。胡子鲇属雄性异配XX/XY性别决定类型，具有明显的雌雄生长差异，在同等养殖条件下，雄鱼生长速度远远高于同龄雌鱼。当养殖胡子鲇达到上市规格时，雌性胡子鲇正处于性腺发育阶段，腹部膨大，其性腺指数远高于雄性，导致雌鱼比同等规格的雄鱼价格低4元/公斤左右。因此，进行全雄胡子鲇品种研究可以大大节约养殖成本、提高商品鱼质量和经济效益。然而，胡子鲇雌雄个体在胚胎和幼鱼阶段无法通过形态学鉴定性别，这给开展胡子鲇性腺分化研究和单性苗种培育带来很大的困难，也极大地限制了该物种产业的发展。迄今为止，国内外尚无能够成功鉴定胡子鲇遗传性别的分子标记的报道。因此，开发一种准确鉴定遗传性别的分子标记在胡子鲇单性育种中具有极大的生产应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胡子鲇性别特异性分子标记引物及包括该引物的试剂盒。

本发明第二个目的在于提供一种胡子鲇性别鉴定方法。

本发明的最后一个目的在于提供上述引物或上述试剂盒或上述方法在胡子鲇性别鉴定方面的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种胡子鲇性别特异性分子标记引物，所述引物为引物NP544，所述引物NP544包括正向引物NP544-F和反向引物NP544-R，所述正向引物NP544-F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物NP544-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

具体的，引物NP544的核苷酸序列如下：

正向引物NP544-F：5’-cacacataagctggataaacggagaca-3’；

反向引物NP544-R：5’-ttaaacccaagcccttgccaacaa-3’。

本发明还提供了一种用于胡子鲇性别鉴定的试剂盒，该试剂盒包括上述胡子鲇特异性分子标记引物。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种胡子鲇性别鉴定方法，包括以下步骤：在雌雄个体的基因组DNA中采用PCR扩增出特异性片段，具体包括：合成上述引物，提取待测胡子鲇的基因组DNA，采用上述引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，采用毛细管电泳检测扩增产物，根据测序峰型结果鉴定雌雄个体，其中杂合峰型为雄性个体，纯合峰型为雌性个体。

在上述胡子鲇性别鉴定方法中：

优选的，PCR扩增时采用的PCR反应体系包含30ng/μL DNA模板1.0μL，2×Easy

PCR SuperMix 12.5μL，10mM正向引物NP544-F和反向引物NP544-R各0.5μL，ddH₂O 10.5μL，总共25μL。

优选的，PCR扩增时采用的PCR反应程序是：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环35次，72℃延伸10min。

本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的引物或试剂盒或性别鉴定方法在鉴定胡子鲇性别方面的应用。

因此，本发明胡子鲇性别特异性分子标记引物的成功开发，突破了胡子鲇遗传性别鉴定的技术瓶颈，为胡子鲇遗传性别控制提供了工具。该技术的应用能够实现孵化早期对胡子鲇苗种进行性别鉴定，提高培育效率、降低成本，促进胡子鲇性别决定、性别控制等研究工作的开展。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明设计的胡子鲇性别特异性分子标记引物，特异性好，准确度高，鉴定方法简单易行，鉴定成功率高，可达100％；

(2)本发明方法可一次性快速准确批量鉴定胡子鲇的遗传性别；

(3)本发明方法实现了对于胡子鲇苗种遗传性别的准确鉴定，突破了胡子鲇早期苗种无法鉴定性别的技术瓶颈；

(4)本发明引物、试剂盒和方法对于胡子鲇性别决定、性别控制具有重要的科研价值和实际应用价值。

附图说明

图1为实施例2中利用NP544引物对胡子鲇个体进行PCR扩增后的测序峰图，测序采用正向引物NP544-F，上：雄性个体杂合峰型；下：雌性个体纯合峰型；箭头所指碱基即为目标检测位点。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。除非特别说明，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。

实施例1

本实施例提供的胡子鲇特异性分子标记引物，所述引物为引物NP544，所述引物NP544包括正向引物NP544-F和反向引物NP544-R，所述正向引物NP544-F核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述反向引物NP544-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

具体的，引物NP544的核苷酸序列如下：

正向引物NP544-F：5’-cacacataagctggataaacggagaca-3’；

反向引物NP544-R：5’-ttaaacccaagcccttgccaacaa-3’。

采集胡子鲇1个全同胞家系，包含2个亲本和200个子代个体，解剖后鉴定生理学性别。利用高通量测序以胡子鲇基因组序列(NCBI登录号：PRJNA822706)为参考序列对亲本和子代进行标记开发，利用连锁分析定位性别性状位点，定位到单个区间，将区间内显著与性别连锁的SNP标记开发为性别特异性标记。

利用Primer6从胡子鲇基因组序列中性别决定区间内的部分序列(胡子鲇性别特异性分子标记)中设计引物，胡子鲇性别特异性分子标记序列如下：

其中方框表示正向引物，下划线表示反向引物(正向序列，反向互补后即NP544-R的碱基序列，方括号表示检测的目标变异，具体雄鱼如序列表SEQ ID NO：3和雌鱼序列如SEQ ID NO：4所示。

为了验证该引物的准确性，本实施例通过以下实施例2中的验证试验来进行进一步的说明，具体如下。

实施例2

本实施例提供的胡子鲇性别鉴定的方法，包括以下步骤：采用PCR扩增在雌雄个体的基因组DNA中扩增出特异性片段，具体包括：设计实施例1中的引物，按照实施例1中方法提取待测胡子鲇的基因组DNA，采用实施例1中的引物，以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，采用毛细管电泳(具体可采用ABI 3730XL基因测序仪，生工生物工程(上海)股份有限公司测序)检测扩增产物，根据测序峰型结果鉴定雌雄个体。

本实施例的实施对象是胡子鲇，取实验室繁殖的胡子鲇家系43尾雌性和43尾雄性，生理性别通过解剖鉴定，然后来验证该引物的可行性。

(1)DNA的提取

从胡子鲇活体上剪取约1平方厘米鳍条(该过程对于胡子鲇活体无实质性伤害，采样后胡子鲇个体重新放回后经观察可健康生长，下同)，保存于95％酒精，采样后胡子鲇个体重新放回。

利用市售DNA提取试剂盒或者常规酚仿法等提取组织DNA。

(2)胡子鲇性别特异性标记的扩增

以上述引物NP544的正向引物NP544-F(5’-cacacataagctggataaacggagaca-3’)和反向引物NP544-R(5’-ttaaacccaagcccttgccaacaa-3’)为扩增引物，以提取的胡子鲇DNA为模板，用Easy

DNA聚合酶进行PCR扩增。

PCR的反应体系为：30ng/μL DNA模板1.0μL，2×Easy

PCR SuperMix 12.5μL，10mM正向引物NP544-F和反向引物NP544-R各0.5μL，ddH₂O 10.5μL，总共25μL。

PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环35次，72℃延伸10min。

(3)性别特异性片段检测

将步骤(2)中的扩增产物利用正向引物NP544-F在ABI 3730XL基因测序仪上进行碱基检测。

图1是利用NP544-F引物对胡子鲇个体进行毛细管电泳检测的峰型例图，测序采用正向引物NP544-F，上：雄性个体杂合峰型；下：雌性个体纯合峰型，即杂合峰型为雄性个体，纯合峰型为雌性个体。

结果，43例雄鱼峰型跟图1中的杂合型一致；43例雌鱼峰型跟图1中的纯合型一致，测序结果与解剖实验结果高度一致，因此，采用本发明中的引物和方法，雌雄鉴定的准确率为100％。

因此，进一步的，可以将上述引物制成试剂盒或生物制剂，用于胡子鲇性别的鉴定中。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

序列表

<110> 广东海洋大学

广西壮族自治区水产引育种中心

<120> 一种胡子鲇性别特异性分子标记引物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacacataag ctggataaac ggagaca 27

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttaaacccaa gcccttgcca acaa 24

<210> 4

<211> 345

<212> DNA

<213> 胡子鲇(Clarias fuscus)

<400> 4

cacacataag ctggataaac ggagacataa atagcaacgt aaacatgaca atttatcttg 60

gatcaacacg tcaggtgaca aagcagcaaa ctaaaacaaa gcgtgatgtt atgcaaataa 120

accaaatttg atgaatagat ctgatcattt ccagcaggaa tgttcagaaa acaatataat 180

ttagagttgt tgtaatatac aatactctat tagatattta tttcaatgct tgccatcaag 240

ttattcatag atcatctttt aacttcaaca gaaataaaca cactgttttt cttgctcatg 300

tccttttccg gaattccagg cttgttggca agggcttggg tttaa 345

<210> 4

<211> 345

<212> DNA

<213> 胡子鲇(Clarias fuscus)

<400> 4

cacacataag ctggataaac ggagacataa atagcaacgt aaacatgaca atttatcttg 60

gatcaacacg tcaggtgaca aagcagcaaa ctaaaacaaa gcgtgatgtt atgcaaataa 120

accaaatttg atgaatagat ctgatcattt ccagcaggaa tgttcagaaa acaatataat 180

atagagttgt tgtaatatac aatactctat tagatattta tttcaatgct tgccatcaag 240

ttattcatag atcatctttt aacttcaaca gaaataaaca cactgttttt cttgctcatg 300

tccttttccg gaattccagg cttgttggca agggcttggg tttaa 345

Claims (6)

1.一种胡子鲇性别特异性分子标记引物，其特征是：所述引物为引物NP544，所述引物NP544包括正向引物NP544-F和反向引物NP544-R，所述正向引物NP544-F的碱基序列如SEQID NO：1所示，所述反向引物NP544-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于胡子鲇性别鉴定的试剂盒，其特征是：所述试剂盒包括权利要求1中的引物。

3.一种胡子鲇性别鉴定方法，其特征是：在雌雄个体的基因组DNA中采用PCR扩增出特异性片段，具体包括：合成权利要求1中的引物，提取待测胡子鲇的基因组DNA，采用权利要求1中的引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，采用毛细管电泳法检测扩增产物，根据测序峰型结果鉴定雌雄个体，其中杂合峰型为雄性个体，纯合峰型为雌性个体。

4.根据权利要求3所述的胡子鲇性别鉴定方法，其特征是：PCR扩增时采用的PCR反应体系为：30ng/μL DNA模板1.0μL，2×Taq MasterMix 12.5μL，10mM正向引物NP544-F和反向引物NP544-R各0.5μL，ddH₂O 10.5μL，总共25μL。

5.根据权利要求3所述的胡子鲇性别鉴定方法，其特征是：PCR扩增时采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环35次，72℃延伸10min。

6.权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒或权利要求3-5任一项所述的方法在胡子鲇性别鉴定方面的应用。

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