CN113249442B - 一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于贝类的表观遗传育种领域，具体地说，涉及一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法。构建用于筛查不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的牡蛎群体，随机选取部分稚贝分别在不同的海区环境养殖20‑120天后检测其不饱和脂肪酸含量，选择不饱和脂肪酸含量差异最大的两个环境的个体分别形成3‑6个平行组样品，采用多组学方法分析在两个环境间均存在甲基化和转录水平显著差异的候选基因，对获取的候选基因采用实时定量PCR和BSP方法进行候选甲基化调控基因验证，即获得牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因。本方法可高效筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因，可为牡蛎的表观遗传育种技术构建提供重要支持。

Description

一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法

技术领域

本发明属于贝类的表观遗传育种领域，具体地说，涉及一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法。

背景技术

牡蛎是世界上最重要的海水养殖贝类之一，我国牡蛎产量连续多年稳居世界首位，占同期世界产量的81％。牡蛎富含多种不饱和脂肪酸，是牡蛎品质的重要决定因素，且对人体健康具有重要作用，具有降低血中胆固醇和甘油三酯，改善血液微循环，提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力等作用。

牡蛎自然分布在潮间带和潮下带的浅水区，其复杂而剧烈的温度、盐度及干露等环境条件的变化，可对牡蛎的表型产生显著影响。目前牡蛎的不饱和脂肪酸含量的研究多采用基因组选择、GWAS和QTL等传统遗传学方法解析表型和基因型的遗传机制，但因牡蛎生活环境的变异性较大，表观遗传可能对牡蛎的表型产生显著影响，而传统基于遗传学方法的牡蛎育种忽略了这部分的作用，导致育种的准确率和效率偏低，无法实现牡蛎不饱和脂肪酸含量的精准育种。目前牡蛎的DNA甲基化等表观遗传机制对牡蛎不饱和脂肪酸含量的影响机制尚无报道，因此，亟需筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量等品质性状相关甲基化修饰基因的方法。

发明内容

本发明目的在于提供高一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法，将供筛选的牡蛎群体稚贝随机选取相同数目作为不同组别分别养殖在不同的海区环境下20-120天，而后对养殖期间存活率高于90％的组别检测其不饱和脂肪酸含量，对不饱和脂肪酸含量差异最大的两个环境组别的牡蛎个体分别进行全基因组甲基化测序和转录组测序，先筛查在两种组学中均显著差异的基因集，同时在转录组显著差异的基因中筛查已知的脂肪酸代谢通路相关的基因，并从中筛查存在甲基化差异位点的基因集，将以上两个基因集的基因用实时定量PCR和BSP方法，分别验证在基因表达具有显著差异并具有甲基化显著差异位点的基因，即为牡蛎不饱和脂肪酸含量相关的甲基化修饰基因。

所述甲基化测序和转录组测序后，在两种组学中将甲基化的显著差异基因集A和转录组的显著差异基因集B的交集作为基因集C，同时在转录组的显著差异基因集B中查找与脂肪酸代谢通路相关的基因集D，取D中存在甲基化差异位点的基因(即，用MethylKit软件对其进行甲基化差异位点的检测，若发现局部甲基化差异显著，则获得与不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰的候选基因)，获得基因集E；取C和E的并集为基因集F，采用实时定量PCR和BSP克隆测序法对基因集F进行基因表达量和甲基化水平分析，取基因表达差异显著，且存在甲基化显著差异位点的基因，即为牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因G。

所述供筛选的牡蛎群体稚贝为雌雄亲本数均大于30个，雌雄配子熟化后将雌配子混合，并均分为N份，N为雄性亲本数，在每份混合配子中分别加入一个雄性个体的精子，N份受精卵单独孵化到D型幼虫后进行等量混合为所需群体材料，直至培育至牡蛎稚贝壳高0.5-5cm，待用。

所述构建筛查不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的牡蛎群体采用解剖性腺和人工授精的方法。

所述不同的海区环境为不同海区的潮下带或潮间带的不同潮位。

所述牡蛎稚贝壳高0.5-5cm，海区环境可为不同海区的潮下带或潮间带的不同潮位。

所述选择两个环境个体的方法为在养殖期间存活率高于90％的环境中选择不饱和脂肪酸含量差异最显著的两个环境。

所述对养殖期间存活率高于90％的组别检测其不饱和脂肪酸含量，在不饱和脂肪酸含量差异大于10％的组别中选择差异最大的两个组别，每个组别随机分为3-6个平行组，并将两组别中的各平行组的牡蛎组织迅速放到液氮中，待用。

所述转录组的显著差异基因集的标准为，对转录组测序数据进行标准化处理，差异基因的判断标准为P小于0.05，且差异倍数大于2。

所述甲基化的显著差异基因集的标准为，获取样本基因组平铺窗口内的甲基化水平数据，将样本的甲基化数据进行区域整合，采用逻辑回归模型分析分组间的甲基化差异水平，鉴定为差异甲基化的标准为甲基化均值的差异大于10％且P小于0.05。

对所述候选基因集F中的基因，采用实时定量PCR和BSP克隆测序法对基因表达量和甲基化水平进行分析，基因表达为显著差异，且在该基因存在甲基化差异显著的位点，则获得与牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因集G。

一种所述方法的应用，利用上述方法获得与牡蛎不饱和脂肪酸含量的甲基化基因，利用其在调理牡蛎不饱和脂肪酸含量的应用。

本发明所具有的有益效果

本发明通过牡蛎在不同环境的不饱和脂肪酸含量性状分化特征，提出筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法，可为牡蛎的表观遗传育种技术构建提供重要支持，有望在短时间内显著提升牡蛎的品质和产业的经济效益。具体是：

本发明利用牡蛎可人工授精和养殖环境多态性高的特点，通过人工构建多亲本的大群体在多个环境进行存活率和不饱和脂肪酸含量的表型分析，可高效低成本获得用于表观遗传研究的材料，解决了表观遗传育种材料难以获得的问题；通过将全基因组甲基化测序和转录组测序相结合的方法，可高通量筛查表观遗传差异的候选基因，通过转录组数据捕获部分甲基化组学无显著差异的候选基因，并进一步进行BSP克隆测序，可准确定位甲基化修饰差异基因的位点，解决了牡蛎甲基化修饰位点的高通量筛查和准确定位难题；

与传统的育种方法相比，本方法可充分挖掘基于牡蛎表观遗传差异的表型可塑性，提高育种的效率和准确性，解决传统育种因忽略表观遗传效应而导致的育种准确率低的问题。总之，通过本方法可高效筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因，可为牡蛎的表观遗传育种技术构建提供重要支持，有望在短时间内显著提升牡蛎的品质和产业的经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的乙酰辅酶A去饱和酶基因在两个不饱和脂肪酸差异显著群体中的BSP_PCR图。

图2为本发明实施例2提供的转录组和甲基化组分析与不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因集图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明利用大群体在多环境中发现牡蛎在不同环境下不饱和脂肪酸存在显著差异的特性，将全基因组甲基化测序和转录组测序相结合，并对候选基因进行进一步的BSP克隆测序，可准确定位甲基化修饰差异基因的位点，而后进一步确定可知所获甲基化基因能够调理牡蛎不饱和脂肪酸含量。

本发明利用基因对环境的一种调节机制进而获得与现有传统遗传学的作用不相同的调控机制，可为牡蛎的表观遗传育种技术构建提供重要支持。

实施例1：

取性腺发育成熟的长牡蛎100只，将右壳移除后，用显微镜鉴定每个个体的性别，获得42只雌性和48只雄性，将雌雄配子分别解剖熟化，然后将雌配子混合，并均分为与雄性亲本数相同的份数，在每份混合配子中分别加入一个雄性个体的适量精子，每份受精卵单独孵化到D型幼虫后进行等量混合为所需群体。

将壳高0.5-5cm的稚贝均分为5份，使每组样品的遗传基础一致，分别放置在薛家岛码头潮间带的4个潮位和潮下带，具体为潮间带380cm(In380)，300cm(In300)，200cm(In200)，100cm(In100)和水面下1m的潮下带(Sub)。经2-3个月的自然生长期后统计各组的存活率，选取养殖期间存活率>95％的群体，通过采用气相色谱法检测每份群体的不饱和脂肪酸含量。

选择不饱和脂肪酸含量差异最大的两个群体为筛查不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的群体(In380和In200)，其不饱和脂肪酸含量如表1。用单因子方差分析发现In380和In200的C14:1、C15:1、C18:1、C18:2ω6c、C18:3ω3和C20:3ω3均差异显著(P＜0.05)。在In380和In200分别原位随机选取15-60只牡蛎的组织并迅速放到液氮中，将以每5只牡蛎的组织等量混匀作为一个检测样品，每组形成3个平行组样品。

表1两潮位长牡蛎脂肪酸含量及其各脂肪酸占总脂肪酸的比例

对群体In380和In200的共计6个样品分别采用全基因组甲基化测序和转录组测序，具体为利用DESeq Rpackage对转录组测序数据进行标准化处理，使用nbinomTest函数筛查差异基因，差异基因的判断标准为p<0.05，且差异倍数大于2，在转录组测序的差异基因集B中查找已报道的与脂肪酸代谢通路相关的基因集D；然后利用MethylKit软件对基因集D的基因进行甲基化差异位点的检测，具体为：首先获取样本基因组平铺窗口内的甲基化水平数据，将样本的甲基化数据进行区域整合，采用逻辑回归模型分析分组间的甲基化差异水平，鉴定为差异甲基化的标准为甲基化均值的差异>＝10％且p<0.05。由此可得到与不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰的候选基因2个，即乙酰辅酶A去饱和酶基因和脂肪酸合酶基因。

根据上述筛选候选基因的序列采用Primer Premier软件设计各自候选基因的特异性引物，采用实时定量PCR和BSP克隆测序法分析候选基因的表达量和甲基化水平。

上述得到与不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰的候选基因乙酰辅酶A去饱和酶基因和脂肪酸合酶基因的特异性引物分别为：

脂肪酸合酶基因引物为GTGTTTTTTGGGGAGAATTATT和AAAAATTATAAAACCCCTCACC；

乙酰辅酶A去饱和酶基因引物为TTAATAAGGAAGAAGTGTTGAGA和CAAAAATTTCACTTAACAAAAAA。

具体为提取组织的RNA，然后进行反转录获得cDNA，然后采用EF基因作为对照组进行实时定量PCR；BSP克隆测序首先采用苯酚氯仿法提取组织DNA，然后使用快速外延DNA亚硫酸氢盐试剂盒对DNA进行处理，根据所获得的DNA来进行BSP引物设计，通过PCR反应把目的片段进行扩增，经过扩增后U全部转化为T，最后再把PCR产物转入感受态细胞，涂布到培养皿，待单菌落长成后挑取进行菌落PCR后将菌液进行测序，就可以判断CpG位点是否发生甲基化。在实验中添加对照组(完全未甲基化的DNA)，同批次处理，以判断亚硫酸氢盐转化效率。若基因表达为显著差异，且在该基因存在甲基化差异显著的位点(鉴定为差异甲基化的标准为甲基化均值的差异>＝10％且p<0.05)，则获得与牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因(参见图1)。由上述实时定量PCR和BSP克隆测序法分析候选基因的表达量和甲基化水平的分析可见乙酰辅酶A去饱和酶基因和脂肪酸合酶基因为能够通过甲基化调控牡蛎不饱和脂肪酸含量的基因。

实施例2：

取外壳完整的牡蛎成贝在室内进行升温促熟，当性腺发育成熟时，随机选取120只牡蛎，分别将右壳移除，用显微镜鉴定每个个体的性别，获得48个雌性和72只雄性个体，将雌雄配子分别解剖熟化，然后将雌配子混合，并均分为72份，在每份混合配子中分别加入一个雄性个体的适量精子，每份受精卵单独孵化到D型幼虫后进行等量混合，采用常规牡蛎苗种生产流程培育幼虫，到附着变态后即获得所需的群体。

将壳高0.5-5cm的稚贝等分为4份，分别放置在薛家岛码头潮间带和潮下带各1个潮位、即墨海区和荣成海区。经2个月的自然生长期后统计各组的存活率，选取养殖期间存活率>95％的群体，并用气相色谱法检测其不饱和脂肪酸含量。选择荣成和胶南群体为筛查不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的群体。分别原位随机选取30只牡蛎的组织并迅速放到液氮中，将10只牡蛎的组织等量混匀为一个检测样品，每组形成3个平行组样品。

对两组的共计6个样品分别采用全基因组甲基化测序和转录组测序初步筛查差异基因，差异表达基因的筛查方法具体为利用DESeq Rpackage对测序数据进行标准化处理，使用nbinomTest函数筛查差异基因，差异表达基因的标准为p<0.05，且差异倍数大于2；差异甲基化基因的筛查方法为利用MethylKit软件对基因集D的基因进行甲基化差异位点的检测，具体为：首先获取样本基因组平铺窗口内的甲基化水平数据，将样本的甲基化数据进行区域整合，采用逻辑回归模型分析分组间的甲基化差异水平，鉴定为差异甲基化的标准为甲基化均值的差异>＝10％且p<0.05(参见图2)。

取两种方法差异基因的交集6个基因为候选基因，设计候选基因的特异性引物，采用实时定量PCR和BSP克隆测序法分析候选基因的表达量和甲基化水平，具体为提取组织的RNA，然后进行反转录获得CDNA，然后采用EF基因作为对照组进行实时定量PCR；BSP克隆测序首先采用苯酚氯仿法提取组织DNA，然后使用快速外延DNA亚硫酸氢盐试剂盒对DNA进行处理，根据所获得的DNA来进行BSP引物设计，通过PCR反应把目的片段进行扩增，经过扩增后U全部转化为T，最后再把PCR产物转入感受态细胞，涂布到培养皿，待单菌落长成后挑取进行菌落PCR后将菌液进行测序，就可以判断CpG位点是否发生甲基化。在实验中添加对照组(完全未甲基化的DNA)，同批次处理，以判断亚硫酸氢盐转化效率。若基因表达为显著差异，且在该基因存在甲基化差异显著的位点，则获得与牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因mucin-5AC基因。由上述实时定量PCR和BSP克隆测序法分析候选基因的表达量和甲基化水平的分析可见mucin-5AC基因为能够调控牡蛎不饱和脂肪酸含量的基因。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgttttttg gggagaatta tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaaattata aaacccctca cc 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaataagga agaagtgttg aga 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caaaaatttc acttaacaaa aaa 23

Claims (7)

1.一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法，其特征在于：将供筛选的牡蛎群体稚贝随机选取相同数目作为不同组别分别养殖在不同的海区环境下20-120天，而后对养殖期间存活率高于90%的组别检测其不饱和脂肪酸含量，对不饱和脂肪酸含量差异最大的两个环境组别的牡蛎个体分别进行全基因组甲基化测序和转录组测序，先筛查在两种组学中均显著差异的基因集，同时在转录组显著差异的基因中筛查已知的脂肪酸代谢通路相关的基因，并从中筛查存在甲基化差异位点的基因集，将以上两个基因集的基因用实时定量PCR和BSP方法，分别验证在基因表达具有显著差异并具有甲基化显著差异位点的基因，即为牡蛎不饱和脂肪酸含量相关的甲基化修饰基因；

所述甲基化测序和转录组测序后，在两种组学中将甲基化的显著差异基因集A和转录组的显著差异基因集B的交集作为基因集C，同时在转录组的显著差异基因集B中查找与脂肪酸代谢通路相关的基因集D，取D中存在甲基化差异位点的基因，获得基因集E；取C和E的并集为基因集F，采用实时定量PCR和BSP克隆测序法对基因集F中的基因进行基因表达量和甲基化水平分析，取基因表达差异显著，且存在甲基化差异显著的位点的基因，即为牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因G；

所述甲基化的显著差异基因集的标准为，获取样本基因组平铺窗口内的甲基化水平数据，将样本的甲基化数据进行区域整合，采用逻辑回归模型分析分组间的甲基化差异水平，鉴定为差异甲基化的标准为甲基化均值的差异大于10%且P小于0.05。

2.按权利要求1所述的筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法，其特征在于：所述供筛选的牡蛎群体稚贝为雌雄亲本数均>30个，雌雄配子熟化后将雌配子混合，并均分为N份，N为雄性亲本数，在每份混合配子中分别加入一个雄性个体的精子，N份受精卵单独孵化到D型幼虫后进行等量混合为所需群体材料，直至培育至牡蛎稚贝壳高0.5-5cm，待用。

3.按权利要求1所述的筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法，其特征在于：所述不同的海区环境为不同海区的潮下带或潮间带的不同潮位。

4.按权利要求1所述的筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法，其特征在于：所述对养殖期间存活率高于90%的组别检测其不饱和脂肪酸含量，在不饱和脂肪酸含量差异大于10%的组别中选择差异最大的两个组别，每个组别随机分为3-6个平行组，并将两组别中的各平行组的牡蛎组织迅速放到液氮中，待用。

5.按权利要求1所述的筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法，其特征在于：所述转录组的显著差异基因集的标准为，对转录组测序数据进行标准化处理，差异基因的判断标准为P小于0.05，且差异倍数大于2。

6.按权利要求1所述的筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法，其特征在于：对所述基因集F中的基因，采用实时定量PCR和BSP克隆测序法对基因表达量和甲基化水平分别进行分析，若基因表达为显著差异，且在该基因存在甲基化差异显著的位点，则获得与牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因集G。

7.一种权利要求1所述方法的应用，其特征在于：利用权利要求1的方法获得与牡蛎不饱和脂肪酸含量的甲基化基因，利用其进行调控牡蛎不饱和脂肪酸含量的应用。

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