CN105452444A - 用于水产养殖和动物饲料的甲基营养生物 - Google Patents

Abstract

公开了在甲基营养细菌宿主细胞中生产类胡萝卜素化合物的方法。这种宿主细胞可以是未修饰的甲基杆菌属，自发突变体，或转化的细胞，其中任一种表现出有利的特性，例如过度生产类胡萝卜素化合物，增加的碳通量，改善的生长，或产生另外的营养物，例如蛋白，维生素，抗氧化剂，或脂肪酸。也公开了用于水产养殖，或作为动物饲料，或作为人类营养补充物的含有来自这些细胞的经处理或未处理的生物质的饲料组合物，和所述饲料组合物的制备方法。

Description

用于水产养殖和动物饲料的甲基营养生物

优先权

本申请要求2013年8月8日提交的美国临时专利申请号61/863,701的优先权，其通过提述以其整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，其已经以ASCII表的形式电子提交并在此通过提述完整并入。所述ASCII拷贝，创建于2014年8月7日，命名为0114922-00003_SL.txt且大小为12,511字节。

背景

类胡萝卜素是一类普遍存在的且结构上多样化的天然色素，颜色范围从浅黄到橙色到红色。类胡萝卜素负责胡萝卜，西红柿，红辣椒，以及水仙花和金盏花花瓣，以及龙虾，鲑鱼和其它海洋生物的着色。类胡萝卜素由所有的光合生物，以及一些细菌和真菌产生。类胡萝卜素在光合作用，营养，以及防止光氧化损伤中具有作用。动物自身不能产生类胡萝卜素，但必须通过它们的饮食获得这些营养上重要的化合物。类胡萝卜素是40-碳(C₄₀)萜类化合物，其最终来自于异戊二烯生物合成途径，特别是来自异戊烯焦磷酸(IPP)，一种五碳结构单元。这一生物合成途径可以分为两个部分：上游异戊二烯途径，其导致IPP的形成，以及下游类胡萝卜素生物合成途径，负责将IPP转化为长链(例如，C₃₀和C₄₀)类胡萝卜素生成性化合物。

类胡萝卜素化合物，例如β-胡萝卜素，虾青素，和螺菌黄素(spirilloxanthin)，在工业上用作食物和饲料原料的成分，既发挥营养作用又常常增加产品对消费者的吸引力。类胡萝卜素，例如虾青素和角黄素(canthaxanthin)，常常添加到水产养殖饲料，用于向水产养殖生物的肉添加颜色的目的；它们的野生型同类具有有色的肉，其来自于食用甲壳纲动物或藻类中天然存在的或已经食用藻类的其它鱼中的类胡萝卜素。例如，虾青素广泛用于鲑鱼水产养殖中以产生野生鲑鱼中发现的橙色颜色。一些类胡萝卜素也是维生素A的前体。此外，一些类胡萝卜素具有抗氧化特性，并可能具有健康益处(见，例如Jyonouchi等，Nutr.Cancer16:93,1991；Giovannucci等，J.Natl.CancerInst.87:1767,1995；Miki,PureAppl.Chem63:141,1991；Chewetal.,AnticancerRes.19:1849,1999；Wang等，Antimicrob.AgentsChemother.44:2452,2000)。几种类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素，番茄红素，和叶黄素)目前作为营养增补剂出售。

一些类胡萝卜素已经在微生物中生产，例如，国际专利申请公开文本No.WO02/18617描述了使用代谢单碳底物的微生物生产类胡萝卜素化合物的方法。已经克隆了编码类胡萝卜素生物合成途径中的元件的基因，并在真菌，酵母和细菌中表达。例如，已经从遗传工程化的大肠杆菌和产朊假丝酵母(Candidautilis)产生了番茄红素(Farmer,W.R.等，(2001)Biotechnol.Prog.17:57-61；Wang,C.等，(2000)BiotechnolProg.16:922-926；Misawa,N.和H.Shimada(1998)J.Biotechnol.59:169-181；Shimada,H.等，(1998)Appl.Environm.Microbiol.64:2676-2680)。已经从重组大肠杆菌和产朊假丝酵母产生了玉米黄素(Albrecht,M.等，(1999).Biotechnol.Lett.21:791-795；Miura,Y.等，(1998)Appl.Environm.Microbiol.64:1226-1229)。已经从大肠杆菌和珐菲亚酵母(Pfaffiarhodozyma)产生了虾青素(见，例如，US5,466,599(通过提述并入))。已经从大肠杆菌，产朊假丝酵母和珐菲亚酵母产生了营养物β-胡萝卜素(Albrecht,M.等，(1999)Biotechnol.Lett.21:791-795；Miura,Y.等，(1998)Appl.Environm.Microbiol.64:1226-1229；US5,691,190(通过提述并入))。

已经在大肠杆菌中表达了来自草生欧文菌(Erwiniaherbicola)的编码香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate)合酶，番茄红素环化酶，和八氢番茄红素脱氢酶的基因(见，例如US5,545,816；US5,656,472；US5,530,189；和US5,530,188，其全部通过提述并入)。已经在大肠杆菌，运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达了来自噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)的编码这些类胡萝卜素产物如香叶基香叶基焦磷酸，八氢番茄红素，番茄红素，β-胡萝卜素，和玉米黄素-二葡糖苷的基因(US5,429,939)。已经重组表达了从黄杆菌属(Flavobacterium)获得的类胡萝卜素生物合成基因，包括crtE,crtB,crtl,crtY,和crtZ(见US6,124,113)。

虽然以上方法可以产生有用量的类胡萝卜素，对于改进的方法存在需要。对于从廉价的原料产生类胡萝卜素的有用产量并也产生一种或多种营养物(例如，脂质或蛋白)的方法尤其长期需要。接着所得的富含类胡萝卜素和营养物的微生物或植物生物质(biomass)可以加工为饲料用于水产养殖或农业，或用作人类的营养物来源。

存在一些利用单碳底物作为它们的唯一能量来源的微生物。单碳底物的例子包括甲烷，甲醇，甲酸，硫醇，和甲基化胺。这些生物称为甲基营养生物(methylotrophs)并在本文中也称为“C1代谢者”。少数甲基营养生物已经被成功地利用以产生工业规模的营养物。尽管单碳底物是有成本效益的能量源这一事实，对于甲基营养生物遗传学信息的缺乏和产生的操作中的困难限制了它们主要在天然产物的合成中的使用。

对于用于水产养殖中的低成本，完全营养物也存在需要。水产养殖是水生动物和植物在控制的环境中的繁殖，培养和销售。水产养殖业是目前全球增长最快的食品生产部门。全球水产养殖产生约6千万吨海鲜，年产值超过7百亿美元(USD)。目前，养鱼业产生约一半全球消耗的所有鱼，且由于在海洋和淡水环境中野生捕捉的鱼产量的下降，这一百分比目前还在增长。水产养殖中生产的种群包括：鲤鱼和其它鲤科鱼类；牡蛎；蛤蜊，鸟蛤(cockle)和赤贝(arkshell)；扇贝；基围虾和对虾；鲑鱼，鳟鱼(trouts)和胡瓜鱼；贻贝(mussels)；以及罗非鱼和其它慈鲷。

虽然某些物种(例如，罗非鱼)可以仅仅喂养素食，其它物种需要肉食。肉食鱼类的饲料通常包含来自于野生捕捉的小型中上层鱼类(主要是鳀鱼，竹荚鱼，蓝鳕鱼，毛鳞鱼，玉筋鱼和鲱鱼(anchovy,jackmackerel,bluewhiting,capelin,sandeelandmenhaden))的鱼肉和鱼油。依赖于其将要喂养的鱼的大小(例如，鱼苗，幼体，成体)，将这些鱼肉和/或鱼油加工为丸状或片状饲料。水产养殖饲料组合物的其它组分可以包括色素，植物蛋白，维生素，以及矿物质。

来自海洋捕捉的鱼的鱼油已经常规用作商业化鱼饲料中的唯一饲料脂肪来源，因为大量供应，低成本，以及高百分比的必需脂肪酸。这些“必需脂肪酸”是正常生长，健康，繁殖，以及其它功能所需的。实际上，所有的脊椎动物物种，包括鱼类，对于omega-6和omega-3多不饱和脂肪酸(“PUFAs”)具有饮食需要。二十碳五烯酸，或“EPA”(顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)是一种omega-3而二十二碳六烯酸，或“DHA”(顺4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，22:6omega-3)是两种必需PUFA。

约87％全球供应的鱼油作为脂质来源用于鱼饲料消耗。由于鱼油产量已经达到顶峰每年150万吨，快速增长的水产养殖业将很快超过作为鱼油供应的有限存量的海洋中上层鱼类(pelagicfish)。因此，找到并实施鱼油的可持续替代选择是至关重要的，其能够与持续增长的鱼类产品全球需求保持同步。

许多组织已经认识到上述关于鱼油可用性和水产养殖可持续性的限制。美国国家海洋和大气管理局以及农业部(美国)已经在替代饲料倡议(AlternativeFeedsInitiative)中合作以“……鉴定替代饲料成分，其将减少水产养殖饲料中含有的鱼肉和鱼油的量，而保持养殖海产品的重要的人体健康益处”。

美国专利申请公开号2007/0226814(通过提述并入)公开了含有至少一种从发酵微生物获得的生物质的鱼饲料，其中所述生物质含有相对于总脂肪酸含量至少20％的DHA。提到原生藻属(Stramenopiles)的微生物作为DHA的来源。

美国专利申请公开号2009/0202672(通过提述并入)公开了可以将十八碳四烯酸(“SDA”，18:4omega-3)水产养殖饲料。可以从转基因植物获得该脂肪酸。不幸的是，在鱼类中SDA不能有效地转化为DHA。

美国专利号7,932,077(通过提述并入)公开了重组工程化的解脂耶氏酵母可能是大多数动物饲料的有用添加物，包括水产养殖饲料，因为其提供必要的omega-3和/或omega-6PUFAs，并基于其独特的蛋白：脂质：碳水化合物构成，以及独特的复合碳水化合物概貌(包含约1：4：4.6比率的甘露聚糖：β-葡聚糖：几丁质)。

如果增长的水产养殖业要维持并甚至增加其对于全球鱼类供应的贡献，对于替代水产养殖饲料组合物存在需要，其：(i)通过使用来自非鱼衍生的来源代替鱼油和鱼肉减少野生鱼投入；和(ii)使用非化学合成的色素，或否则来自基于石油的原料的色素，以提供色素沉积。

发明简述

在某些实施方案中，本发明提供基本上含有一种或多种分离的甲基营养菌培养物的生物质，所述甲基营养菌培养物经遗传修饰或人工预选择以产生相对于对应的未修饰或未选择细菌升高水平的类胡萝卜素化合物。所述类胡萝卜素为，例如，β-胡萝卜素，番茄红素，紫菌红素乙，虾青素，或螺菌黄素。在某些实施方案中，所述细菌经遗传修饰使得产生从类胡萝卜素合成途径转移类异戊二烯化合物的酶的一个或多个基因被阻断或删除。在某些实施方案中，本发明提供细菌，其含有非致死型shc敲除，例如，包含非致死型shc敲除的扭脱甲基杆菌(M.extorquens)。在其它实施方案中，通过定向进化选择细菌，所述细菌作为表达“深粉红色(darkpink)”或“微红色(reddish)”色素的自发突变体。

在某些实施方案中，所述生物质可以是干燥的，或基本干燥的形式，例如，含有少于20％，10％，5％，2％的水分。在某些实施方案中，通过去除基本上所有的上清分离该培养物，例如通过过滤，沉淀，或离心。在某些实施方案中，将培养物收集到生物质中且生物质的进一步处理排除细菌裂解步骤，例如，通过使用去垢剂或超声。在某些实施方案中，处理的细菌细胞保持基本完整的细胞膜。在一些实施方案中，处理的生物质中相当一部分的细菌细胞(例如，多于80％，50％，30％，20％，10％或5％)可以维持活力。

本发明的生物质可以含有选自下组的细菌培养物：甲基单胞菌属(Methylomonas)，甲基细菌属(Methylobacter)，甲基球菌属(Methylococcus,)，甲基弯曲菌(Methylosinus)，Methylocyctis，甲基微菌属(Methylomicrobium)，甲烷单胞菌属(Methanomonas)，噬甲基菌属(Methylophilus)，甲基菌属(Methylobacillus)，甲基杆菌属(Methylobacterium)，生丝微菌属(Hyphomicrobium)，黄色杆菌属(Xanthobacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)，副球菌属(Paracoccus)，诺卡氏菌属(Nocardia)，节球菌属(Arthrobacter)，红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，假单胞菌属(Pseudomonas)，念珠菌属(Candida)，汉逊酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)，和红酵母属(Rhodotorula)。在某些优选实施方案中，所述细菌是扭脱甲基杆菌。在进一步的实施方案中，扭脱甲基杆菌的菌株选自下组：扭脱甲基杆菌AM1,扭脱甲基杆菌DM4,扭脱甲基杆菌CM4,扭脱甲基杆菌PA1,扭脱甲基杆菌BJ001(原名M.populi),耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)，M.nodulans，和甲基杆菌菌种4-46。

在进一步的方面，本发明提供饲料组合物，包含所述生物质。所述饲料组合物可以含有按重量计至少1％的所述生物质。在某些实施方案中，所述饲料组合物经优化用于鱼类，海鲜，人类，或其它动物的消耗。例如，所述饲料可以含有一种或多种EPA，DHA，牛磺酸，以及一种或多种必需/基本氨基酸。

在再一个方面，本发明提供生产鱼类或海鲜的方法，包括：养殖鱼类或海鲜，并向所述鱼类或海鲜提供饮食，其包括本发明的饲料。对于水产养殖，所述饲料对于具有粉红，微红，黄色，或橙色着色的肉的物种(养殖用于人类消耗)尤其有用。一个优势是，所述鱼类的养殖从而完全排除，或减少纯化的类胡萝卜素(其为了审美目的用于补充所述鱼类/海鲜饮食)的量，从而大量减少费用。相应的，本发明也提供鱼类或海鲜产品，其表现出肉中升高水平的类胡萝卜素色素，其中这种升高的水平归因于包括本发明的饲料组合物的饮食。在某些实施方案中，所述鱼肉含有比常规饮食的基本相同鱼类高的至少一种类胡萝卜素化合物水平。这种水平可以是高至少10％,15％,20％,25％,50％,80％,100％,200％,300％,400％,500％,1000％或更多。在外表上，这种产品将具有明显较深，更吸引人的色素沉积。在相关的进一步实施方案中，由于鱼类或海鲜消耗的较为健康的饮食，这种食物产品的特征还在于其不含有，或含有较少的人工引入的抗生素或抗炎症化合物。

附图简述

图1示出了几种示例性的类胡萝卜素化合物。

图2示出了pKB01的图谱：crtl-样基因的删除构建体，Mext_3011，描述于实施例7中。

图3示出了pKB03的图谱：crtCDF(Mext_2725-26,-28)簇的删除构建体，而保留crtE(Mext_2727)，描述于实施例7中。

图4示出了pKB02的图谱：crtF(Mext_2728)的删除构建体，描述于实施例7中。

图5示出了使用4种实验饮食的小嘴石鲈(smallmouthgrunt)生长，描述于实施例9中，其包括(1)标准的市售石鲈饮食，(2)所述标准饮食加上虾青素色素(～80PPM)，(3)含有5％的总颗粒饲料被KnipBio单细胞蛋白(KBM)代替的饮食，和(4)25％的鱼肉被KBM代替的饮食(～60PPM类胡萝卜素)。

图6示出了实施例9中描述的KBM饲料的氨基酸概貌分析。

发明详述

引言

一方面，本发明提供有颜色的甲基营养生物(例如，甲基杆菌属)，其能够产生一种或多种类胡萝卜素。在某些实施方案中，这些生物使用甲醇，甲烷，或另一种C1能量源。在某些实施方案中，这种C1能量源是所述生物的唯一能量源。在某些实施方案中，所述甲基营养生物是扭脱甲基杆菌。在某些实施方案中，所述扭脱甲基杆菌或其它甲基营养生物表现出改进的特性，例如改进的一种或多种类胡萝卜素产量，产生所需的类胡萝卜素谱，改进的每单位生物质的类胡萝卜素水平，或按细胞干重的百分比测量。在某些实施方案中，所述扭脱甲基杆菌或其它甲基营养生物能够产生特定的所需营养物，例如一种或多种蛋白，一种或多种脂质，碳水化合物，和一种或多种维生素。在某些实施方案中，产生的蛋白是对于水产养殖，农业，或人类的完全营养物。

本发明也提供工程化或培养这些甲基营养生物的方法，使用这些甲基营养生物来生产类胡萝卜素的方法，以及使用这些甲基营养生物中生产的类胡萝卜素制备含有类胡萝卜素的组合物例如食物或饲料添加剂或营养补充物的方法。特别地，本发明提供用于生产含有一种或多种产油(oleaginic)，产蛋白质和/或产类胡萝卜素性修饰的甲基营养生物的系统和方法，与缺乏所述修饰其它相同的生物相比，所述修饰增加或改变它们的脂质，蛋白质，或类胡萝卜素生产能力。一个优选的实施方案涉及产生一种或多种或所有必需氨基酸的生物，例如赖氨酸，缬氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，精氨酸，和牛磺酸。

本发明的一个方面关于水产养殖领域。更具体的，本发明关于水产养殖饲料组合物，其包含含有类胡萝卜素的微生物生物质和完全的蛋白质营养，也就是说，含有其所施用的动物健康生长所需的绝大多数或所有氨基酸。所述饲料组合物可以可选地含有比目前使用鱼油可得的更高的二十碳五烯酸比二十二碳六烯酸的omega-3多不饱和脂肪酸比率，以及进一步维生素或其它营养物。

详细描述

一类常见的单碳代谢者是甲烷氧化菌(methanotrophs)，其特征在于它们使用甲烷作为唯一碳源和能量源的能力。甲烷单加氧酶是一种甲烷代谢的关键步骤所需的酶。其产物是甲醇(见Murrell等，Arch.Microbiol.(2000),173(5-6),325-332)。这一反应在环境温度和压力下发生，与甲烷向甲醇的工业转化形成鲜明对比，其要求高温(几百摄氏度)和高压(见WO2000/007718(通过提述并入)和US5,750,821(通过提述并入))。这种在环境条件下转化甲烷的非凡能力，以及甲烷的丰度，使得甲烷的生物转化是有潜在价值的过程。同样合意的是能够代谢甲醇的甲基营养生物，甲醇自身是一种丰富并廉价的原料。对于多种应用，在室温下是液体的甲醇比甲烷更容易利用。

酮式类胡萝卜素(ketocarotenoid)虾青素(3,3'-二羟基-β,β-胡萝卜素-4,4'-二酮)最初被认为是一种氧化形式的β-胡萝卜素。接着发现虾青素在许多种类的海洋动物和藻类中普遍存在。少数动物具有生物合成体系来生产虾青素；它们中的大多数从其食物获得它。虾青素存在于植物界，主要在一些蓝藻，藻类和地衣物种中。

虾青素是一种强力的抗氧化剂，脂质过氧化作用的抑制物(见，例如Kurashige,M.等，(1990)Physiol.Chem.Phys.Med.NMR22:27)。也将化学预防作用归因于虾青素，例如显著减少诱导的鼠膀胱癌的发病率(见Tanaka,T.等，(1994)Carcinogenesis15:15)。虾青素也发挥免疫调节效果，尤其是提高抗体产生(见，Jyonouchi,H.(1993)Nutr.Cancer19:269)。虽然尚不完全，目前的图景是其似乎在癌症和肿瘤抑制，以及从免疫系统引发正免疫应答中扮演重要的角色。

许多甲基营养生物含有固有的类异戊二烯途径，其使得它们能够合成其它非内源性的类异戊二烯化合物。已知一些生物拥有类胡萝卜素生物合成基因以及上游异戊二烯途径，其产生类胡萝卜素生成性前体分子。类异戊二烯生物合成途径的某些方面在所有真菌，细菌，植物和动物界之间保守。这些包括对应以下酶的蛋白质或同源物：乙酰乙酰基-CoA硫解酶，HMG-CoA合酶，HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，IPP异构酶，FPP合酶，以及GGPP合酶。一些生物(特别是细菌)利用另一种类异戊二烯生物合成途径，有时候称为“不依赖于甲羟戊酸途径”。该途径由从丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成DOXP(1-脱氧-D-木酮糖(xyloglucose)-5-磷酸)起始。接着通过一系列生物合成步骤，DOXP被转化为IPP，其异构为DMAPP并接着通过GPP和FPP转化为GGPP。

尽管这些知识，对于生产特定的，有商业价值的类胡萝卜素的遗传工程化C1代谢者几乎没有先例。似乎这些生物用于生产较大规模的化学物的有用性被一些限制制约，所述限制包括甲烷氧化菌相对慢的生长速率，对于作为甲烷的替代底物的甲醇有限的耐受能力，遗传工程化的困难，对于甲烷氧化菌中存在的多个碳同化途径的作用理解不足，以及由于完全饱和底物例如甲烷的需氧量的潜在高成本。待解决的问题是如何提供一种有成本效益的方法用于微生物生产类胡萝卜素化合物，使用利用C1化合物作为它们的碳源和能量源的生物。

鲑鱼和对虾养殖将从本发明的申请中获益，因为类胡萝卜素色素沉积对于这些生物的价值的重要性(见，Shahidi,F.等，Science(1998)38(1):1-67)。最后，类胡萝卜素可应用于类固醇，芳香剂，调味剂，以及具有电子应用的化合物的合成。虾青素是最贵的商业化使用的类胡萝卜素化合物，价格在几千美元每千克。本公开提供了选择，修饰，和使用适合的C1代谢微生物用于高产量生产多种类胡萝卜素化合物的详细描述。

根据本发明，还可以通过修饰参与类异戊二烯生物合成的一种或多种蛋白的表达，或调节其活性在宿主生物中完成类胡萝卜素的生产。在某些实施方案中所述修饰包括去除在不同阶段转移中间物的替代途径。可以使用无标志物等位基因交换系统干净地去除编码这些酶的基因，例如基于cre-lox的系统(Marx,C.J.andLidstrom,M.E.BioTechniques(2002)33:1062-1067)，或两步法，“in-out”系统，例如基于含有sacB菌株的系统的阴性选择(Marx,C.J.BMCResearchNotes(2008)1:1)。许多这些基因通常在染色体上成簇，从而促进了它们的去除。例如，可以去除藿烷(hopanoid)生物合成路线上制造鲨烯(squalene)和藿烯(hopene)的一个或多个酶的基因或酶自身。这些基因和酶包括鲨烯合酶，由hpnC编码，脱氢鲨烯合酶，由hpnD编码，脱氢鲨烯还原酶，由hpnE编码，或鲨烯-藿烯合酶，由shc编码(也称为hpnF)(Bradley,A.S.等，OrganicGeochemistry(2010)41:1075-1081)。另一个可以去除的分支是还原的香叶基香叶基(geranylgeranylgroup)作为酯添加到细菌叶绿素(Addlesee,H.A.andHunter,C.N.JournalofBacteriology(1999)181:7248-7255)。这些反应通过香叶基香叶基细菌叶绿素合酶，由bchG编码，和香叶基香叶基-细菌叶绿素还原酶，由bchP编码完成。最后，对于另一种产物像是虾青素而不是合成螺菌黄素，去除这些途径分叉处下游的酶将是有利的。在这种情况下，应当去除番茄红素下游的酶。这些包括羟基链孢红素脱氢酶，由crtC编码，甲氧基链孢红素脱氢酶，由crtD编码，和羟基链孢红素甲基转移酶，由crtF编码。在某些实施方案中，增加番茄红素上游的内源性基因的表达将是有利的。这些包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，由dxs编码，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，由dxr编码，异戊烯二磷酸异构酶，由idi编码，法尼基(farnesyl)二磷酸合酶，由ispA编码，香叶基香叶基二磷酸合酶，由crtE编码，八氢番茄红素合酶，由crtB编码，和八氢番茄红素去饱和酶，由crtI编码。在某些实施方案中，这些修饰包括类异戊二烯生物合成多肽在宿主生物中的异源表达和/或一种或多种内源或异源类异戊二烯生物合成多肽的表达的修饰或修饰其活性。优选的类胡萝卜素包括虾青素和螺菌黄素。鉴于类异戊二烯生物合成多肽组分相当的保守，可以期待异源类异戊二烯生物合成蛋白将在显著相异的生物中发挥功能。为了优化在甲基营养宿主，例如扭脱甲基杆菌中的表达，可以密码子优化序列来匹配宿主生物中最经常使用的密码子。实际上，在许多情况下来自不同来源生物的蛋白将一起发挥功能(即在相同的时间)。在本发明的某些实施方案中，将多个不同的异源类异戊二烯生物合成多肽引入所述宿主细胞中。在某些实施方案中，该多个多肽仅包含来自相同来源生物的蛋白(即，相同生物的两种或多种序列，或来源于相同生物的序列)；在其它实施方案中，所述多个多肽包括独立地选自不同来源生物的多肽(即，至少两种不同生物的两种或多种序列，或来源于至少两种不同生物的序列)。在某些实施方案中，通过引入番茄红素环化酶，由crtY编码，β-胡萝卜素酮醇酶，由crtW编码，和β-胡萝卜素羟化酶，由crtZ编码将完成虾青素的生产。可以预料通过引入来自慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)菌种ORS278的CrtY(番茄红素环化酶)[GenBank序列ID:YP_001208335.1]或类似物；来自慢生根瘤菌属菌种ORS278的CrtW(β-胡萝卜素酮醇酶)[GenBank序列ID:YP_001208332.1]或类似物；以及来自短波单胞菌属(Brevundimonas)菌种SD212的CrtZ(β-胡萝卜素羟化酶)[GenBank序列ID:AB181388]或类似物，将提供所需的产物。

在某些实施方案中，为了提供饲料有益的特性，改变细胞材料中大分子的水平可能是有用的。这可以包括改变或变更组分，例如胞外多糖，聚-β-羟基丁酸耐储存聚合物，或纤维素。这些修饰可能将更多的碳通量转移到其他产物，例如类胡萝卜素，脂质，总蛋白质，或氨基酸或维生素的工程化生产。

在某些实施方案中，遗传修饰将利用自由复制质粒载体用于克隆。这些可以包括开发用于甲基杆菌属的小IncP载体。这些载体可以包括pCM62,pCM66,或pHC41用于克隆(Marx,C.J.andM.E.LidstromMicrobiology(2001)147:2065-2075；Chou,H.-H.etal.PLoSGenetics(2009)5:e1000652)。

在某些实施方案中，遗传修饰将利用自由复制的表达质粒例如pCM80,pCM160,pHC90,或pHC91(Marx,C.J.andM.E.LidstromMicrobiology(2001)147:2065-2075；Chou,H.-H.etal.PLoSGenetics(2009)5:e1000652)。

在某些实施方案中，遗传修饰将利用自由复制的表达质粒，其具有对诱导分子例如cumate或无水四环素的水平反应的能力。这些质粒包括pHC115，pLC290，pLC291(Chou,H.-H.等，PLoSGenetics(2009)5:e1000652；Chubiz,L.M.等，BMCResearchNotes(2013)6:183)。

在某些实施方案中，遗传修饰将利用可回收抗生素标志物系统，例如cre-lox系统。这可以包括使用开发用于扭脱甲基杆菌的pCM157，pCM158，pCM184，pCM351系列质粒(Marx,C.J.andM.E.LidstromBioTechniques(2002)33:1062-1067)。

在某些实施方案中，遗传修饰将利用转座子诱变。这可以包括mini-Tn5递送系统例如在扭脱甲基杆菌中证明(Marx,C.J.等，JournalofBacteriology(2003)185:669-673)的pCM639(D’Argenio,D.A.等，JournalofBacteriology(2001)183:1466-1471)。

在某些实施方案中，遗传修饰将利用直接引入染色体位点的表达系统。这可以包括开发用于扭脱甲基杆菌AM1的pCM168，pCM172，和pHC01质粒(Marx,C.J.andM.E.LidstromMicrobiology(2001)147:2065-2075；Lee,M.-C.等，Evolution(2009)63:2813-2830)。

在某些实施方案中，遗传修饰将利用基于sacB的系统用于非标记的等位基因交换，所述非标记的等位基因交换由于通过sacB表达提供的蔗糖敏感性所致。这可以包括最初使用扭脱甲基杆菌测试的pCM433载体(Marx,C.J.等，BMCResearchNotes(2008)1:1)。

在利用异源类异戊二烯生物合成多肽的本发明的某些实施方案中，所述来源生物包括作为非限制性例子的以下属的真菌：布拉霉属(Blakeslea)，假丝酵母属(Candida)，隐球酵母属(Cryptococcus)，小克银汉霉属(Cunninghamella)，油脂酵母属(Lipomyces)，被孢霉属(Mortierella)，毛霉属(Mucor)，须霉属(Phycomyces)，腐霉属(Pythium)，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，红酵母属(Rhodotorula)，毛孢子菌属(Trichosporon)，耶氏酵母属(Yarrowia)，曲霉属(Aspergillus)，葡萄孢属(Botrytis)，尾孢属(Cercospora)，镰刀菌属(Fusarium)(赤霉菌属(Gibberella))，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，脉孢属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))，柄锈菌属(Puccinia)，酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，小菌核属(Sclerotium)，木霉属(Trichoderms)，黑粉菌属(Ustilago)，以及法夫酵母属(Xanthophyllomyces)(Phaffia)。在某些实施方案中，所述来源生物是包括但不限于以下物种：新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)，水稻恶苗病菌(Fusariumfujikuroi)，乳酸克鲁维酵母(Kluyverimyceslactis)，粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)，和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。在某些实施方案中所述来源生物包括甲基杆菌属的细菌或优选物种例如扭脱甲基杆菌。

甲基杆菌属菌株为主要是植物相关微生物的相异属。在过去的五年中，已经发表了几种菌株的基因组测序，包括扭脱甲基杆菌AM1,扭脱甲基杆菌DM4,扭脱甲基杆菌CM4,扭脱甲基杆菌PA1,扭脱甲基杆菌BJ001(原名M.populi),耐辐射甲基杆菌，M.nodulans，和甲基杆菌菌种4-46(Vuileumier等，2009.PLoSOne；Marx等，2012.J.Bacteriology)。这些菌株提供了各种优势和劣势，范围从在不同底物上的不同生长速率，到基因组大小和可移动遗传元件含量的鲜明差异。扭脱甲基杆菌菌株-其中五株已经测序-具有能够借鉴关于扭脱甲基杆菌AM1(其已经作为所有甲基营养生物的主力)的大量知识的特别优势。然而，考虑到最近发现的关于现代AM1菌株的一系列问题(Carroll等，2014.BMCMicrobiology)，现在的一些努力集中于基因组精简的，更强劲生长的PA1菌株。这些菌株都共享大部分的基因组内容，且这些基因大体上98％氨基酸相同，或更高。然而，基因内容中存在差异，其可能对于某些性状至关重要(Vuilleumier等，2009.PLoSOne)。同样地，虽然给定的遗传操纵似乎在菌株之间起到相似作用，但也有偶尔发生的主要差异的先例。

因此，在一些实施方案中，修饰的细菌是甲基杆菌属的菌株，例如，扭脱甲基杆菌AM1,扭脱甲基杆菌DM4,扭脱甲基杆菌CM4,扭脱甲基杆菌PA1,扭脱甲基杆菌BJ001(原名M.populi),耐辐射甲基杆菌，M.nodulans，和甲基杆菌菌种4-46。

迄今为止，存在三种方法来产生甲基杆菌属的类胡萝卜素变体。第一种方法，可以敲除关键基因例如crtl，其消除所有的着色(VanDien等，2003.Applied&EnvironmentalMicrobiology)。第二种方法，可以去除分支的基因，所述分支转移生物合成远离类胡萝卜素，从而提高着色。这种方法的一个例子是删除shc，并从而产生藿烷类。最后，针对其它条件下生长所选择的进化的变体，例如在15mM甲醇上快速生长(Leeetal.,2009.Evolution)，可能偶然导致具有增加或改变的着色的菌株。

在某些实施方案中，本发明的甲基营养菌特征在于它们是经遗传修饰或人工预选择，以产生相对于对应的未修饰或未选择细菌升高水平的类胡萝卜素化合物。可以依据mg类胡萝卜素每克细胞干重来测定改进的类胡萝卜素生产，例如使用Lemuth等，2011中描述的方法(MicrobialCellFactories.10:29)。在某些实施方案中，细菌产生的至少一种类胡萝卜素化合物升高至少10％，15％，20％，25％，50％，80％，100％，200％，300％，400％，500％，1000％或更多。

生物也使用类异戊二烯生物合成途径产生非类胡萝卜素化合物，例如固醇，类固醇，和维生素，包括维生素E或维生素K。具有类异戊二烯生物合成途径中间物作为它们的底物，并将它们转移到非类胡萝卜素化合物的生物合成中的蛋白，是类胡萝卜素生物合成的间接抑制物，以为它们竞争类胡萝卜素途径所需的相同中间物。本发明通过使得能够降低这些竞争蛋白的水平或活性解决这一问题，允许增加的类胡萝卜素化合物生产。

除了类胡萝卜素和维生素，一些氨基酸和其它小代谢物在饲料来源中为限制水平。这些可以是氨基酸，特别是精氨酸，苏氨酸，缬氨酸，赖氨酸，和蛋氨酸的组。另一种感兴趣的分子是牛磺酸(2-氨基乙磺酸)。在某些实施方案中，对相关氨基酸和牛磺酸生物合成途径的定向遗传修饰增强关键基因的表达或去除旁侧通路和回收通路。在其它实施方案中，选择可以包含使用相关化合物的毒性类似物，例如乙硫氨基酪酸，以完成蛋氨酸过量生产(见Lawrence等，Genetics(1968)58:473-492)。仍在其他实施方案中，过量生产的实验进化可经由在代谢交互给料背景下的选择进行(Harcombe,W.R.Evolution(2010),64(7),2166-2172)。在其它实施方案中，通过使用定向工程化，使用类似物选择，以及在联合体(consortia)中选择获得的操纵将组合。

根据本发明产生的类胡萝卜素可以用于本发明提到的任意应用，包括它们的多方面生物学或营养特性(抗氧化，抗增殖等)和它们作为颜色范围从黄色到红色的色素的有用性。例如，根据本发明，类胡萝卜素可以用于药物(见，例如Bertram等，Nutr.Rev.1999,57:182；Singh等，Oncology1998,12:1643；Rock,Pharmacol.Ther.1997,75:185；Edge等，J.PhotochemPhotobiol1997,41:189；美国专利申请2004/0116514(通过提述并入)；美国专利申请2004/0259959(通过提述并入)),食物补充物(见，例如Koyama等，J.PhotochemPhotobiol1991,9:265；Bauemfeind,CarotenoidsascolorantsandvitaminAprecursors,AcademicPress,NY,1981；美国专利申请2004/0115309(通过提述并入)；美国专利申请2004/0234579(通过提述并入)),电光应用，动物饲料添加剂(见例如Krinski,PureAppl.Chem.1994,66:1003；Polazza等，Meth.Enzymol.1992,213:403),化妆品(作为抗氧化剂和/或化妆品，包括香水；见，例如美国专利申请2004/0127554(通过提述并入))等。根据本发明产生的类胡萝卜素也可以用作其它化合物(例如，类固醇)生产中的中间物。

例如，虾青素和/或其酯可能在许多药物应用和健康食品中有用，包括炎症性疾病，哮喘，特应性皮炎，过敏，多发性骨髓瘤，动脉硬化，心血管疾病，肝脏疾病，脑血管疾病，血栓形成，新生血管发生相关疾病，包括癌症，风湿，糖尿病视网膜病变；黄斑变性和脑病症，高血脂症，肾缺血，糖尿病，高血压，肿瘤的增殖和转移；以及代谢障碍。另外，类胡萝卜素和虾青素可能在疲劳的预防和治疗，用于炎症性疾病的肾病中改进肾脏功能，以及预防和治疗其它生活习惯相关的疾病中有用。更进一步，已经发现虾青素作为多种生物学过程的抑制物发挥作用，包括白介素抑制物，磷酸二酯酶抑制物，磷脂酶A2抑制物，环氧酶-2抑制物，基质金属蛋白酶抑制物，毛细血管内皮细胞增殖抑制物，脂氧合酶抑制物。见，例如日本公开号2006022121(JPApplNo.2005-301156)；日本公开号2006016408(JPApplNo.2005-301155)；日本公开号2006016409(JPApplNo.2005-301157)；日本公开号2006016407(JPApplNo.2005-301153)；日本公开号2006008717(JPApplNo.2005-301151)；日本公开号2006008716(JPApplNo.2005-301150)；日本公开号2006008720(JPApplNo.2005-301158)；日本公开号2006008719(JPApplNo.2005-301154)；日本公开号2006008718(JPApplNo.2005-301152)；日本公开号2006008713(JPApplNo.2005-301147)；日本公开号2006008715(JPApplNo.2005-301149)；日本公开号2006008714(JPApplNo.2005-301148)；和日本公开号2006008712(JPApplNo.2005-301146)。

应当理解，在本发明的一些实施方案中，通过如本文所述的操纵宿主细胞产生的类胡萝卜素被整合到所述宿主细胞背景下的最终产物中(例如，食物或饲料补充物，药物，化妆品，含染料商品，香水，营养食品等)。例如，可以冻干，冷冻干燥，冷冻或其它方式灭活宿主细胞，接着可以将完整细胞整合到最终产物中，或用作最终产物。也可以在整合到产物之前处理所述宿主细胞，以增加生物利用度(例如，通过裂解)。这种处理可以包括例如同质化(homogenization)的方法，具有或没有后续添加乙氧喹(ethoxyquin)或其它适合的还原剂以保护类胡萝卜素或其它营养化合物免除后续氧化。为了帮助类胡萝卜素的部分提取和生物利用度，可以在疏水物质的存在下处理所述宿主细胞，所述疏水物质可以整合或不整合到最终制剂中。这可以包含将细菌材料与鱼油或其它食用油混合，接着将它们联合添加到最终饲料。细胞材料可以作为解冻的“湿”细胞材料，或作为干燥的细菌“饼干”提供。可替换地或者另外，最终产物可以掺有从完整宿主细胞分离的仅一部分(例如，通过大小，可溶性分级)。例如，在本发明的一些实施方案中，可以从所述宿主细胞分离脂滴并整合到最终产物中或用作最终产物。在其它实施方案中，分离类胡萝卜素自身，或每种类胡萝卜素化合物并重新配制到最终产物中。

如上文所述，脂肪酸和葡萄糖苷酯是在自然界中发现的主要的类胡萝卜素酯，而可以合成另外的酯类(例如，具有有机酸或无机磷酸)以形成有用的产物形式。用于递送，也可以将类胡萝卜素酯配制为该酯形式的盐。见，例如美国公开号2005/0096477(通过提述并入)。

整合到给定产物中的类胡萝卜素的量可能根据所述产物，以及涉及的具体类胡萝卜素而显著变化。例如，量的范围可能从小于所述产物重量的0.01％，到大于1％，10％，20％，30％或更多；在一些情况下，所述类胡萝卜素可以构成100％的所述产物。相似的，添加到饲料中的细胞材料可以范围从小剂量，例如0.01％，到所述饲料的100％。在一些实施方案中，所述饲料含有至少1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，50％或更多的本发明的生物质。

在本发明的一些实施方案中，一种或多种产生的类胡萝卜素掺入到食物或饲料的组分中(例如，食物补充物)。根据本发明可以将类胡萝卜素整合到其中的食物产品类型没有具体限制，并包括饮料，例如茶，果汁和酒；零食，例如果冻和饼干；含有脂肪的食物和饮料，例如乳制品；加工食物产品，例如大米和软米(或粥)；婴儿配方奶粉；或等等。在一些实施方案中，将类胡萝卜素整合到可食用脂质体中可能是有用的，因为其可以促进掺入到某些含脂肪的食物产品中。

可以将根据本文产生的类胡萝卜素整合到其中的饲料的例子包括，例如，宠物食品，例如猫食，狗食等等，观赏鱼、养殖鱼类或甲壳类动物等的饲料，农场养殖的动物(包括家畜并进一步包括水产养殖的鱼类或甲壳类)的饲料。根据本发明产生的类胡萝卜素和/或其它热量或营养补充物也可以掺入到用于人类消耗的食物或维生素补充物中。根据本发明产生的类胡萝卜素掺入到其中的食物或饲料材料优选对于作为其预期的接收者的生物是可口的。该食物或饲料材料可以具有对于食物材料目前已知的任意物理特性(例如，固体，液体，柔软)。

在本发明的一些实施方案中，将一种或多种产生的类胡萝卜素掺入到化妆品产品中。这些化妆品产品的例子包括，例如，皮肤化妆品(例如，洗液，乳液，面霜等等)，口红，防日晒化妆品，彩妆化妆品，香水，以及其它日用产品(例如，牙膏，漱口剂，口臭预防剂，固体香皂，液体皂，香波，护发素)。

在一些实施方案中，将一种或多种产生的类胡萝卜素掺入到药物中。这些药物的例子包括，例如，多种类型的片剂，胶囊剂，饮用剂，锭剂，含漱剂等。在一些实施方案中，所述药物适合用于局部应用。制剂形式不作具体限制，并包括胶囊剂，油剂，颗粒剂，细粒剂(granulasubtilae)，散剂(pulveres)，片剂(tabellae)，丸剂，含片剂(trochisci)，或等等。油剂或油剂填充胶囊可以提供额外的优势，因为它们缺乏制造期间的成分分解，并且因为含有本发明的类胡萝卜素的脂滴可以容易的整合到基于油剂的制剂中。

可以根据本领域已经建立的技术制备根据本发明的药物，包括，例如，如美国药典中所描述的通用方案。

可以将根据本发明产生的类胡萝卜素掺入到任意含有色素的产品中，包括，例如织物和颜料。也可以将它们掺入到环境指示物，或仪器的产品中，例如生物传感器，用作检测试剂。

相应的，本发明进一步提供用于生产类胡萝卜素的方法，例如，但不限于，β-胡萝卜素，海胆酮，β-隐黄质，角黄素，金盏花红素，顺-金盏花黄素，金盏花黄素，虾青素，玉米黄素，螺菌黄素，以及产生螺菌黄素的中间物，例如番茄红素和紫菌红素乙，所述方法包括在营养培养基中培养细菌物种，所述培养基包括碳源，氮源，和无机物质，并从所述细菌细胞，从其分泌的囊泡，和/或生长培养基回收各种类胡萝卜素色素或类胡萝卜素色素的混合物。

用于使用本发明的微生物生产类胡萝卜素的培养基，例如，如下。其含有对于生产者微生物的生长必需的碳源，氮源和有机盐，以及，如果必要的话，所述生物的生长或兴旺的任意特殊需要物质(例如，维生素，氨基酸，核酸)。

所述碳源可以包括糖，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，海藻糖，甘露糖，甘露糖醇，和麦芽糖；有机酸，例如乙酸，富马酸，柠檬酸，丙酸，苹果酸，丙酮酸，丙二酸，和抗坏血酸；醇，例如乙醇，丙醇，丁醇，戊醇，己醇，异丁醇，和甘油；油或脂肪，例如大豆油，米糠油，橄榄油，玉米油，芝麻油，亚麻籽油等等。添加的所述碳源的量根据所述碳源的种类变化，并通常为1至100g，或2至50g每升培养基。

所述氮源可以包括硝酸钾，硝酸铵，氯化铵，硫酸铵，磷酸铵，氨，尿素等等，单独或组合。添加的所述氮源的量根据所述氮源的种类变化，并通常为0.1至30g，并优选1至10g每升培养基。

所述无机盐可以包括磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸氢二钠，硫酸镁，氯化镁，硫酸铁，硫酸亚铁，氯化铁，氯化亚铁，硫酸锰，氯化锰，硫酸锌，锌，氯化物，硫酸铜，氯化钙，碳酸钙，碳酸钠等等，单独或组合。无机盐的量根据所述无机盐的种类变化，通常为0.001至10g每升培养基。

作为特殊需要物质，维生素，核酸，酵母提取物，蛋白胨，肉类提取物，麦芽提取物，玉米浆(cornsteepliquor)，大豆粉，干酵母等，可以单独或组合使用。使用的特殊需要物质的量根据所述物质的种类变化，并通常范围在0.2g至200g，并优选3至100g每升培养基。

培养基的pH值通常调整至pH2至12，优选6至9。所述培养基可以进一步包含一种或多种缓冲剂以将所述培养物维持在期望的pH。典型的缓冲剂是本领域已知的并包括磷酸盐，碳酸盐，乙酸盐，PIPES，HEPES，和Tris缓冲液；本领域的普通技术人员可以容易的确定对于给定生物的最佳缓冲剂。对于甲基杆菌属，常规培养基(Lee,M.-C.等，Evolution(2009)63:2813-2830)是由以下项组成的磷酸盐缓冲培养基：1ml微量金属溶液(按以下顺序添加到1升去离子水：12.738g的EDTA二钠二水合盐,4.4g的ZnSO₄·7H₂O,1.466g的CaCl₂·2H₂O,1.012g的MnCl₂·4H₂O,0.22g的(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O,0.314g的CuSO₄·5H₂O,0.322g的CoCl₂·6H₂O,以及0.998g的FeSO₄·7H₂O；在每次添加后维持pH5.0)，100mL磷酸盐缓冲液(1L去离子水中25.3g的K₂HP0₄和22.5g的NaH₂P0₄)，100mL的硫酸盐溶液(5g的(NH₄)₂SO₄和0.98g的MgSO₄溶于1升去离子水)，以及799mL的去离子水。所有的组分分别热灭菌并接着汇集到一起。最近开发的一种用于扭脱甲基杆菌的替代培养基利用了有机缓冲液的优势并具有柠檬酸螯合的微量金属混合。在15至40℃进行培养，并优选20至35℃，通常持续1至20天，并优选1至4天，在通过摇动或通气/搅拌提供的有氧条件下。甲基杆菌属的通常实践为30℃。作为膜组分，可以在偏离最优的温度下，在变得营养物例如N或P限制的培养基中，通过暴露于光(可见光或紫外线)，或通过添加产生压力的试剂例如NaCl，产生较高滴度的类胡萝卜素。最终，可以从所述培养物中分离并纯化所述类胡萝卜素和其它产物营养物。

用于制备M-PIPES培养基的方案描述于Delaney等，2013.PLoSOne(8:e62957)的表S1中。USSN61/863,701的图2显示了对于扭脱甲基杆菌使用优化的示例性配方。

为了生成菌株例如甲基杆菌属的密集培养物，使用补料分批的方法可能是有利的。0.5-1％v/v(～120-240mM)的甲醇可以良好的耐受，因此可以重复使用该步骤添加大小。关键的是，培养期间甲醇上的pH下降，使得为了将pH维持在6.5左右碱例如KOH或NaOH的使用变得重要。可以通过物理搅拌来实现通气，例如叶轮，通过过滤空气或纯氧，或其组合的鼓泡。为了减少生产成本，可以将缓冲剂从磷酸盐或PIPES代替为碳酸盐缓冲介质。

典型地，通过常规方法例如离心或过滤将微生物细胞从培养物分离。可以整体分离所述细胞，或可以裂解以释放它们的内含物用于提取或进一步处理。所述细胞或培养基可以使用适合的溶剂进行萃取。作为萃取前的可选步骤，可以从培养基中回收装载类胡萝卜素的囊泡，例如，通过超速离心或过滤。

作为用于萃取的溶剂，可以使用类胡萝卜素可溶于其中的任意物质。例如，有机溶剂，例如使用丙酮，氯仿，二氯甲烷，己烷，环己烷，甲醇，乙醇，异丙醇，苯，二硫化碳，和二乙醚，并优选使用氯仿，二氯甲烷，丙酮，甲醇，乙醇或异丙醇。可以通过常规方法进行纯化，例如吸收，洗脱，溶解等等，单独或优选联合。

根据本发明，在培养的细胞和/或培养基中同时产生并存在β-胡萝卜素，海胆酮，β-隐黄素(β-cryptoxanthin)，角黄素(canthaxanthin)，金盏花红素，顺-金盏花黄素，金盏花黄素，虾青素，玉米黄素，螺菌黄素，以及产生螺菌黄素的中间物例如番茄红素和紫菌红素乙的一种或多种。

本发明的一个方面涉及用于产生类胡萝卜素化合物的方法，所述方法包括

(a)提供着色的甲基营养细菌宿主细胞，包含：

(i)适合水平的异戊烯焦磷酸用于生产所述类胡萝卜素化合物；和(ii)至少一种分离的核酸分子，其在适合的调控序列下编码类胡萝卜素生物合成途径中的酶；

(b)使步骤(a)的宿主细胞在适合的培养条件下与有效量的C1碳底物接触，借以生产所述类胡萝卜素化合物。

在某些实施方案中，所述类胡萝卜素化合物选自下组：非天然类胡萝卜素，花药黄质(antheraxanthin)，金盏花黄质(adonixanthin)，虾青素，角黄素，辣椒红素(capsorubrin)，β-隐黄素(β-cryptoxanthin)，α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，ε-胡萝卜素，海胆酮，γ-胡萝卜素，ζ-胡萝卜素，α-隐黄素，硅藻黄质(diatoxanthin)，7,8-二脱氢虾青素(7,8-didehydroastaxanthin)，墨角藻黄素(fucoxanthin)，岩藻黄质(fucoxanthinol)，异胡萝卜素(isorenieratene)，lactucaxanthin，叶黄素(lutein)，番茄红素(lycopene)，新黄素(neoxanthin)，链孢红素(neurosporene)，羟基链孢红素(hydroxyneurosporene)，多甲藻素(peridinin)，八氢番茄红素(phytoene)，紫菌红素乙(rhodopin)，紫菌红素乙葡萄糖苷(rhodopinglucoside)，管藻黄素(siphonaxanthin)，球形烯(spheroidene)，球状菌素(spheroidenone)，螺菌黄素(spirilloxanthin)，uriolide，uriolideacetate，紫黄质(violaxanthin)。玉米黄素-β-二葡糖苷，玉米黄素，以及任意上述类胡萝卜素化合物的生物合成生产中的中间物。

在某些实施方案中，所述类胡萝卜素化合物选自下组：β-胡萝卜素，番茄红素，紫菌红素乙，海胆酮，β-隐黄素，角黄素，金盏花红素，顺-金盏花黄素，金盏花黄素，虾青素，玉米黄素，螺菌黄素，以及任意上述类胡萝卜素化合物的生物合成生产中的中间物。

在某些实施方案中，所述类胡萝卜素化合物选自下组：β-胡萝卜素，番茄红素，紫菌红素乙，虾青素和螺菌黄素。

在某些实施方案中，所述类胡萝卜素化合物是螺菌黄素。

在某些实施方案中，所述C1碳底物选自下组：甲烷，甲醇，甲醛，甲酸，甲基胺，甲基化硫醇，和二氧化碳。

在某些实施方案中，所述C1碳底物选自下组：甲醇，甲醛，和甲基胺。

在某些实施方案中，所述C1碳底物是甲醇。

在某些实施方案中，所述宿主细胞选自下组：甲基单胞菌属，甲基细菌属，甲基球菌属，甲基弯曲菌，Methylocyctis，甲基微菌属，甲烷单胞菌属，噬甲基菌属，甲基菌属，甲基杆菌属，生丝微菌属，黄色杆菌属，芽孢杆菌属，副球菌属，诺卡氏菌属，节球菌属，红假单胞菌属，假单胞菌属，念珠菌属，汉逊酵母属，毕赤酵母属，球拟酵母属，和红酵母属。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是甲基杆菌属。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是扭脱甲基杆菌。

在某些实施方案中，所述宿主细胞包含功能性Embden-Meyerhof碳途径，所述途径包含编码焦磷酸依赖的磷酸果糖激酶的基因。

在某些实施方案中，所述宿主细胞含有至少一个编码果糖二磷酸醛缩酶的基因。

在某些实施方案中，所述宿主细胞含有功能性Entner-Douderoff碳途径。

在某些实施方案中，通过表达异源上类异戊二烯途径基因，提供适合水平的异戊烯焦磷酸。

在某些实施方案中，所述上类异戊二烯途径基因选自下组：D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(Dxs)，D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr)，2C-甲基-D-赤藓醇胞苷酰转移酶(IspD)，4-二磷脂酰胞苷酰-2-C-甲基赤藓醇激酶(IspE)，2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(IspF)，CTP合酶(PyrG)，LytB，和GcpE。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生非天然的类胡萝卜素化合物谱。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生适合用作营养补充物的氨基酸谱。

在某些实施方案中，所述氨基酸谱包含所有的必需氨基酸。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生牛磺酸。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生一种或多种维生素或抗氧化剂。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生一种或多种脂肪酸。

在某些实施方案中，所述一种或多种脂肪酸包括单不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸，一种或多种必需的omega-3脂肪酸。

在某些实施方案中，所述一种或多种必需的omega-3脂肪酸是EPA，DHA，或两者。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是自发突变体，其相对于非突变的细胞过表达一种或多种类胡萝卜素化合物。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码选自下组的类胡萝卜素生物合成酶：香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素去饱和酶，番茄红素环化酶，β-胡萝卜素羟化酶，玉米黄素葡萄糖基转移酶，β-胡萝卜素酮醇酶，β-胡萝卜素C-4加氧酶，β-胡萝卜素去饱和酶，球形烯单加氧酶，胡萝卜素水合酶，类胡萝卜素3,4-去饱和酶，1-OH-类胡萝卜素甲基化酶，法尼基二磷酸合成酶，和diapophytoene脱氢酶。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是包含至少一种编码选自下组的酶的基因的多个拷贝的转化细胞：D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(Dxs)，D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr)，2C-甲基-D-赤藓醇胞苷酰转移酶(IspD)，4-二磷脂酰胞苷酰-2-C-甲基赤藓醇激酶(IspE)，2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(IspF)，CTP合酶(PyrG)，LytB，GcpE，异戊烯二磷酸异构酶，法尼基二磷酸合酶，香叶基香叶基二磷酸合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素去饱和酶，番茄红素环化酶(CtrY)，β-胡萝卜素酮醇酶(CrtW)，和β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是包含至少一种编码选自下组的酶的基因的转化细胞：D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(Dxs)，D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr)，2C-甲基-D-赤藓醇胞苷酰转移酶(IspD)，4-二磷脂酰胞苷酰-2-C-甲基赤藓醇激酶(IspE)，2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(IspF)，CTP合酶(PyrG)，LytB，GcpE，异戊烯二磷酸异构酶，法尼基二磷酸合酶，香叶基香叶基二磷酸合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素去饱和酶，番茄红素环化酶(CtrY)，β-胡萝卜素酮醇酶(CrtW)，和β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)，其可操作地连接到强启动子。

在某些实施方案中，所述宿主细胞包含至少一种编码选自下组的酶的基因：番茄红素环化酶(CtrY)，β-胡萝卜素酮醇酶(CrtW)，和β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)。

在某些实施方案中，所述宿主细胞包含一种或多种以下基因：慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)菌种ORS278的CrtY(番茄红素环化酶)[GenBank序列ID:YP_001208335.1]，来自慢生根瘤菌属菌种ORS278的CrtW(β-胡萝卜素酮醇酶)[GenBank序列ID:YP_001208332.1]，以及来自短波单胞菌属(Brevundimonas)菌种SD212的CrtZ(β-胡萝卜素羟化酶)[GenBank序列ID:AB181388]。

在某些实施方案中，所述宿主细胞经修饰使得产生从类胡萝卜素合成途径转移类异戊二烯化合物的酶的一个或多个基因被阻断或删除。

在某些实施方案中，所述一种或多种被阻断或删除的基因选自下组：涉及藿烷类生物合成的基因，涉及产生除虾青素之外的类胡萝卜素的基因，和涉及产生除螺菌黄素之外的类胡萝卜素的基因。

在某些实施方案中，所述一种或多种被阻断或被删除的基因选自下组：hpnC，hpnD，hpnE，shc(hpnF)，bchG，bchP，crtC，crtD，和crtF。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是自发突变体，相对于对应的非突变体其生长速率增加。

在某些实施方案中，在选自下组的应激条件下培养所述宿主细胞：光耗竭，营养耗竭，氮耗竭，高盐，或抑制所述宿主细胞生长的化学物质，其中所述应激条件诱导基因表达的变化，导致增加的类胡萝卜素产生。

本发明的一个方面是着色的甲基营养宿主细胞，其产生类胡萝卜素化合物，包含：

(i)适合水平的异戊烯焦磷酸用于生产所述类胡萝卜素化合物；和(ii)至少一种分离的核酸分子，其在适合的调控序列下编码类胡萝卜素生物合成途径中的酶；其中所述宿主细胞产生类胡萝卜素化合物。

在某些实施方案中，所述类胡萝卜素化合物选自下组：非天然类胡萝卜素，花药黄质，金盏花黄质，虾青素，角黄素，辣椒红素，β-隐黄素，α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，ε-胡萝卜素，海胆酮，γ-胡萝卜素，ζ-胡萝卜素，α-隐黄素，硅藻黄质，7,8-二脱氢虾青素，墨角藻黄素，岩藻黄质，异胡萝卜素，lactucaxanthin，叶黄素，番茄红素，新黄素，链孢红素，羟基链孢红素，多甲藻素，八氢番茄红素，紫菌红素乙，紫菌红素乙葡萄糖苷，管藻黄素，球形烯，球状菌素，螺菌黄素，uriolide，uriolideacetate，紫黄质，玉米黄素-β-二葡糖苷，玉米黄素，以及任意上述类胡萝卜素化合物的生物合成生产中的中间物。

在某些实施方案中，所述类胡萝卜素化合物选自下组：β-胡萝卜素，番茄红素，紫菌红素乙，海胆酮，β-隐黄素，角黄素，金盏花红素，顺-金盏花黄素，金盏花黄素，虾青素，玉米黄素，螺菌黄素，以及任意上述类胡萝卜素化合物的生物合成生产中的中间物。

在某些实施方案中，所述类胡萝卜素化合物选自下组：β-胡萝卜素，番茄红素，紫菌红素乙，虾青素和螺菌黄素。

在某些实施方案中，所述类胡萝卜素化合物是螺菌黄素。

在某些实施方案中，所述宿主细胞能够使用选自下组的能量源C1碳底物：甲烷，甲醇，甲醛，甲酸，甲基胺，甲基化硫醇，和二氧化碳。

在某些实施方案中，所述C1碳底物选自下组：甲醇，甲醛，和甲基胺。

在某些实施方案中，所述C1碳底物是甲醇。

在某些实施方案中，所述宿主细胞选自下组：甲基单胞菌属，甲基细菌属，甲基球菌属，甲基弯曲菌，Methylocyctis，甲基微菌属，甲烷单胞菌属，噬甲基菌属，甲基菌属，甲基杆菌属，生丝微菌属，黄色杆菌属，芽孢杆菌属，副球菌属，诺卡氏菌属，节球菌属，红假单胞菌属，假单胞菌属，念珠菌属，汉逊酵母属，毕赤酵母属，球拟酵母属，和红酵母属。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是甲基杆菌属。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是扭脱甲基杆菌。

在某些实施方案中，所述宿主细胞包含功能性Embden-Meyerhof碳途径，所述途径包含编码焦磷酸依赖的磷酸果糖激酶的基因。

在某些实施方案中，所述宿主细胞含有至少一个编码果糖二磷酸醛缩酶的基因。

在某些实施方案中，所述宿主细胞含有功能性Entner-Douderoff碳途径。

在某些实施方案中，通过表达异源上类异戊二烯途径基因，提供适合水平的异戊烯焦磷酸。

在某些实施方案中，所述上类异戊二烯途径基因选自下组：D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(Dxs)，D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr)，2C-甲基-D-赤藓醇胞苷酰转移酶(IspD)，4-二磷脂酰胞苷酰-2-C-甲基赤藓醇激酶(IspE)，2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(IspF)，CTP合酶(PyrG)，LytB，和GcpE。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生非天然的类胡萝卜素化合物谱。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生适合用作营养补充物的氨基酸谱。

在某些实施方案中，所述氨基酸谱包含所有的必需氨基酸。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生牛磺酸。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生一种或多种维生素或抗氧化剂。

在某些实施方案中，所述宿主细胞产生一种或多种脂肪酸。

在某些实施方案中，所述一种或多种脂肪酸包括单不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸，一种或多种必需的omega-3脂肪酸。

在某些实施方案中，所述一种或多种必需的omega-3脂肪酸是EPA，DHA，或两者。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是自发突变体，其相对于非突变的细胞过表达一种或多种类胡萝卜素化合物。

在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码选自下组的类胡萝卜素生物合成酶：香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素去饱和酶，番茄红素环化酶，β-胡萝卜素羟化酶，玉米黄素葡萄糖基转移酶，β-胡萝卜素酮醇酶，β-胡萝卜素C-4加氧酶，β-胡萝卜素去饱和酶，球形烯单加氧酶，胡萝卜素水合酶，类胡萝卜素3,4-去饱和酶，1-OH-类胡萝卜素甲基化酶，法尼基二磷酸合酶，和diapophytoene脱氢酶。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是包含至少一种编码选自下组的酶的基因的多个拷贝的转化细胞：D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(Dxs)，D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr)，2C-甲基-D-赤藓醇胞苷酰转移酶(IspD)，4-二磷脂酰胞苷酰-2-C-甲基赤藓醇激酶(IspE)，2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(IspF)，CTP合酶(PyrG)，LytB，GcpE，异戊烯二磷酸异构酶，法尼基二磷酸合酶，香叶基香叶基二磷酸合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素去饱和酶，番茄红素环化酶(CtrY)，β-胡萝卜素酮醇酶(CrtW)，和β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是包含至少一种编码选自下组的酶的基因的转化细胞：D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(Dxs)，D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr)，2C-甲基-D-赤藓醇胞苷酰转移酶(IspD)，4-二磷脂酰胞苷酰-2-C-甲基赤藓醇激酶(IspE)，2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(IspF)，CTP合酶(PyrG)，LytB，GcpE，异戊烯二磷酸异构酶，法尼基二磷酸合酶，香叶基香叶基二磷酸合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素去饱和酶，番茄红素环化酶(CtrY)，β-胡萝卜素酮醇酶(CrtW)，和β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)，其可操作地连接到强启动子。

在某些实施方案中，所述宿主细胞包含至少一种编码选自下组的酶的基因：番茄红素环化酶(CtrY)，β-胡萝卜素酮醇酶(CrtW)，和β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)。

在某些实施方案中，所述宿主细胞包含一种或多种以下基因：慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)菌种ORS278的CrtY(番茄红素环化酶)[GenBank序列ID:YP_001208335.1]，来自慢生根瘤菌属菌种ORS278的CrtW(β-胡萝卜素酮醇酶)[GenBank序列ID:YP_001208332.1]，以及来自短波单胞菌属(Brevundimonas)菌种SD212的CrtZ(β-胡萝卜素羟化酶)[GenBank序列ID:AB181388]。

在某些实施方案中，所述宿主细胞经修饰使得产生从类胡萝卜素合成途径转移类异戊二烯化合物的酶的一个或多个基因被阻断或删除。

在某些实施方案中，所述一种或多种被阻断或删除的基因选自下组：涉及藿烷类生物合成的基因，涉及产生除虾青素之外的类胡萝卜素的基因，和涉及产生除螺菌黄素之外的类胡萝卜素的基因。

在某些实施方案中，所述一种或多种被阻断或被删除的基因选自下组：hpnC，hpnD，hpnE，shc(hpnF)，bchG，bchP，crtC，crtD，和crtF。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是自发突变体，相对于对应的非突变体其生长速率增加。

在某些实施方案中，在选自下组的应激条件下培养所述宿主细胞：光耗竭，营养耗竭，氮耗竭，高盐，或抑制所述宿主细胞生长的化学物质，其中所述应激条件诱导基因表达的变化，导致增加的类胡萝卜素产生。

在一个方面，本发明涉及饲料组合物，包含来自如上文所述的宿主细胞的生物质。

在某些实施方案中，所述组合物进一步包含蛋白质源，其包含所有的必需氨基酸。

在某些实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种维生素或抗氧化剂。

在某些实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种脂肪酸。

在某些实施方案中，所述一种或多种脂肪酸包含单不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸，一种或多种必需的omega-3脂肪酸。

在某些实施方案中，所述一种或多种必需的omega-3脂肪酸是EPA，DHA，或两者。

在某些实施方案中，所述生物质包含完整的细胞。

在某些实施方案中，所述生物质包含裂解的细胞。

在某些实施方案中，所述生物质经处理或部分处理。

在某些实施方案中，所述组合物用于水产养殖，包括水产养殖饲料生物例如磷虾，轮虫，或等等。

在某些实施方案中，所述组合物用于作为动物饲料用于农业。

在某些实施方案中，所述组合物用于观赏鱼类，虾，珊瑚，或其它爱好者水产养殖。

在某些实施方案中，所述组合物用于人类用途。

在某些实施方案中，所述人类用途是作为营养补充物。

在一个方面，本发明涉及制备如上文所述的饲料组合物的方法，所述方法包括：

(a)在适合的培养基中培养至少一种如上文所述的宿主细胞；

(b)浓缩所述培养基以提供生物质，

(c)可选地提供另外的饲料组分，和

(d)从所述生物质生产饲料组合物。

在某些实施方案中，步骤(b)包括离心。

在某些实施方案中，步骤(b)包括使所述生物质沉降。

在某些实施方案中，步骤(b)包括过滤。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之后使用化学试剂对生物质预处理以破坏所述生物质的细胞膜。

在某些实施方案中，所述化学试剂是表面活性剂或溶剂。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之后机械破坏所述生物质的细胞膜。

在本公开中，使用了一些术语和缩写。提供以下定义。

产类胡萝卜素/类胡萝卜素生成性修饰：术语“产类胡萝卜素/类胡萝卜素生成性修饰”用于本文，指代对宿主生物的修饰，其调整一种或多种如本文所述的类胡萝卜素的产生。例如，类胡萝卜素性修饰可能增加一种或多种类胡萝卜素的产生水平，和/或可能改变不同类胡萝卜素的相对产生水平。大体上，发明性类胡萝卜素性修饰可以是任意的化学，生理学，遗传，或其它修饰，与没有进行同样的修饰而其它相同的生物中产生的水平相比，其适当地改变由宿主生物产生的该生物中一种或多种类胡萝卜素的产生。然而，在大多数实施方案中，所述类胡萝卜素生成修饰将包括遗传修饰，通常导致一种或多种选择的类胡萝卜素的产生增加。在一些实施方案中，所述选择的类胡萝卜素是以下一种或多种：虾青素，β-胡萝卜素，角黄素，叶黄素，番茄红素，八氢番茄红素，玉米黄素，修饰的玉米黄素或虾青素(例如，糖苷，酯化玉米黄素或虾青素)，螺菌黄素，以及产生螺菌黄素的中间物例如番茄红素和紫菌红素乙。在某些实施方案中，所述类胡萝卜素是一种或多种叶黄素类(xanthophylls)，和/或其修饰(例如，糖苷，酯化叶黄素类)。在某些实施方案中，所述叶黄素选自下组：虾青素，叶黄素(lutein)，玉米黄素，番茄红素，螺菌黄素，以及产生螺菌黄素的中间物例如紫菌红素乙，以及其修饰。在某些实施方案中，所述类胡萝卜素是以下一种或多种：虾青素，β-胡萝卜素，角黄素，叶黄素，番茄红素，和玉米黄素和/或玉米黄素或虾青素的修饰。在某些实施方案中，所述类胡萝卜素是β-胡萝卜素。在某些实施方案中，选择的类胡萝卜素是虾青素。在一些实施方案中，选择的类胡萝卜素是螺菌黄素。在某些实施方案中，选择的类胡萝卜素是虾青素。在一些实施方案中，选择的类胡萝卜素是一种或多种中间物，其为螺菌黄素的前体，例如，番茄红素和紫菌红素乙。

类胡萝卜素：术语“类胡萝卜素”本领域理解为指代衍生于类异戊二烯途径中间物的一类结构上多样化的色素。类胡萝卜素生物合成中的约束步骤(commitmentstep)是从香叶基香叶基焦磷酸形成八氢番茄红素。类胡萝卜素可以是无环或环状的，并可以含有或不含有氧，因此术语类胡萝卜素包括胡萝卜素类和叶黄素类。一般来说，类胡萝卜素是碳氢化合物，具有形式上衍生于五碳化合物IPP的接合的多烯碳骨架，包括三萜烯(C₃₀diapocarotenoids)和四萜烯(C₄₀类胡萝卜素)以及它们的氧化衍生物和其它化合物，例如，长C₃₅，C₅₀，C₆₀，C₇₀，C₈₀或其它长度。许多类胡萝卜素具有强光吸收特性且长度范围可以超过C₂₀₀。C₃₀diapocarotenoids通常由六个类异戊二烯单元以这样的方式连接组成，即类异戊二烯单元的排列在该分子的中心处反转，使得两个中心甲基以1,6-位置关系而其它非末端甲基以1,5-位置关系。这些C₃₀类胡萝卜素可以形式上衍生于无环C₃₀H₄₂结构，具有接合双键的长中心链，通过：(i)氢化作用(ii)脱氢作用，(iii)环化，(iv)氧化，(v)酯化/糖基化，或这些过程的任意组合。C₄₀类胡萝卜素通常由八个类异戊二烯单元以这样的方式连接组成，即类异戊二烯单元的排列在该分子的中心处反转，使得两个中心甲基以1,6-位置关系而其它非末端甲基以1,5-位置关系。这些C₄₀类胡萝卜素可以形式上衍生于无环C₄₀H₅₆结构，具有接合双键的长中心链，通过：(i)氢化作用(ii)脱氢作用，(iii)环化，(iv)氧化，(v)酯化/糖基化，或这些过程的任意组合。C₄₀类胡萝卜素的种类还包括某些来自于碳骨架重排的化合物，或通过(形式)移除该结构的一部分。在自然界中已经鉴定了超过600种不同的类胡萝卜素。类胡萝卜素包括但不限于：花药黄质，金盏花红素，金盏花黄质，虾青素，角黄素，辣椒红素，β-隐黄素，α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，β,ψ-胡萝卜素，δ-胡萝卜素，ε-胡萝卜素，海胆酮，3-羟基海胆酮，3’-羟基海胆酮，γ-胡萝卜素，ψ-胡萝卜素，4-酮-γ-胡萝卜素，ζ-胡萝卜素，α-隐黄素，脱氧屈曲黄素(deoxyflexixanthin)，硅藻黄质，7,8-二脱氢虾青素，二脱氢番茄红素，墨角藻黄素，岩藻黄质，异胡萝卜素，β-异胡萝卜素，lactucaxanthin，叶黄素，番茄红素，myxobactone，新黄素，链孢红素，羟基链孢红素，多甲藻素，八氢番茄红素，紫菌红素乙，紫菌红素乙葡萄糖苷，4-酮-玉红黄素，管藻黄素，球形烯，球状菌素，螺菌黄素，红酵母烯(torulene)，4-酮-红酵母烯，3-羟基-4-酮-红酵母烯，uriolide，uriolideacetate，紫黄质，玉米黄素-β-二葡糖苷，玉米黄素，和C30类胡萝卜素。另外，类胡萝卜素化合物包括这些分子的衍生物，其可以包括羟基-，甲氧基-，氧代-，环氧-，羧基-，或醛基-功能基团。此外，包括的类胡萝卜素化合物包括酯(例如，葡萄糖苷酯，脂肪酸酯)和硫酸盐(酯)衍生物(例如，酯化的叶黄素类)。

类异戊二烯途径：所述“类异戊二烯途径”本领域理解为代谢途径，其产生或利用五碳代谢物异戊烯焦磷酸(IPP)。如本文所讨论的，两种不同的途径可以产生共同的类异戊二烯前体IPP-“甲羟戊酸途径”和“非甲羟戊酸途径”。术语“类异戊二烯途径”足够综合以包括这两种途径类型。从IPP生物合成类异戊二烯通过几个五碳异戊二烯亚单元的聚合反应发生。衍生于IPP的类异戊二烯代谢物在化学结构上变化很大，包括环化和无环分子。类异戊二烯代谢物包括，但不限于，单萜烯，倍半萜烯，二萜烯，甾醇类，和多萜醇例如类胡萝卜素。

产油修饰(Oleaginicmodification)：术语“产油修饰”，如用于本文，指代对宿主生物的修饰，其调整该宿主生物的期望产油性，如本文所述。在一些情况下，所述宿主生物将已经是产油的，因为其具有将脂质积累到至少其干细胞重的约20％的能力。尽管如此，按照本发明，可能需要向此类生物应用产油修饰，例如为了增加(或者，在一些情况下，可能为了减少)其总脂质积累，或为了调节一种或多种其积累的具体脂质的类型或量(例如，为了增加三酰甘油的相对积累)。在其它情况下，所述宿主生物可能是非产油的(尽管可能含有一些其它生物中用于积累脂质的酶促和调节组分)，并可能为了根据本发明变得产油而需要产油修饰。本发明也涵盖向非产油宿主菌株应用产油修饰，使得它们的产油增加，虽然即便在被修饰后，它们可能也没有如本文所定义的产油。大体上，所述产油修饰可以是任意化学，生理学，遗传，或其它修饰，与没有进行同样的修饰而其它相同的生物相比，其适当地改变宿主生物的产油性。然而，在大多数实施方案中，所述产油修饰将包括遗传修饰，通常导致一种或多种产油多肽的产生和/或活性增加。在某些实施方案中，所述产油修饰包括至少一种化学，生理学，遗传，或其它修饰；在其它实施方案中，所述产油修饰包含超过一种化学，生理学，遗传，或其它修饰。在某些方面当利用超过一个修饰的情况下，这些修饰可以包括化学，生理学，遗传，或其它修饰的任意组合(例如，一个或多个遗传修饰和化学或生理学修饰)。

术语“饲料预混物”指代处理成以丸或薄片形式的水产养殖饲料组合物前的水产养殖饲料组分粗制混合物，所述处理可选的在高温。

水产养殖饲料组合物用于“水产养殖产品”的生产，其中所述产品是可收获的水产养殖物种(例如，鱼类，甲壳类)，其通常售出用于人类消耗。例如，鲑鱼在水产养殖中密集生产并因此是水产养殖产品。水产养殖组合物也可以用作水产养殖饲料生物的饲料，例如小鱼，像是磷虾，轮虫，等等，其为较大水产养殖生物例如肉食性鱼类的食物来源。另外，本文所述的水产养殖组合物可以用作观赏鱼，虾，爱好者水产养殖等等的饲料，其不意图作为其它生物的食物。

术语“水产养殖肉产品”指代意图用于人类消耗的食物产品，包含至少一部分来自如上文所定义的水产养殖产品的肉。水产养殖肉产品可以是，例如，整条鱼或鱼的切片，其各自可以作为食物消耗。在一些实施方案中，这种产品可以称为鱼类或海鲜产品。

“二十碳五烯酸”(“EPA”)是顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸的通用名。该脂肪酸是一种20:5omega-3脂肪酸。除非另有说明，术语EPA用于本公开将指代该酸和该酸的衍生物(例如，甘油酯，酯，磷脂，酰胺，内酯，盐等等)。

“二十二碳六烯酸”(“DHA”)是顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸的通用名。其为一种22:6omega-3脂肪酸。除非另有说明，术语EPA用于本公开将指代该酸和该酸的衍生物(例如，甘油酯，酯，磷脂，酰胺，内酯，盐等等)。

如本文所使用的术语“生物质”指代微生物细胞材料。生物质可以天然产生，或可以从天然宿主或重组生产宿主的发酵产生。所述生物质可以以完整细胞，完整细胞裂解物，匀浆细胞，部分水解的细胞材料，和/或部分纯化的细胞材料的形式(例如，微生物产生的油)。

术语“经处理的生物质”指代已经经过另外处理例如干燥，巴斯德氏杀菌法，破坏等的生物质，其各自在下文详细讨论。

术语“C-1碳底物”指代任意含有碳的分子，其缺乏碳-碳键。例子是甲烷，甲醇，甲醛，甲酸，甲酸盐，甲基胺(例如，单-，二-和三-甲基胺)，甲基化硫醇，和二氧化碳。术语“C1代谢者”指代具有使用单碳底物作为唯一能量来源和生物质来源的微生物。C1代谢者通常为能够生长的甲基营养生物和/或甲烷营养生物。

术语“甲基营养生物”表示能够氧化不含有碳-碳键的有机物的生物。在所述甲基营养生物能够氧化CH₄的情况下，所述甲基营养生物也是甲烷营养生物。

术语“甲烷营养生物/甲烷氧化生物(methanotroph)”表示能够利用甲烷作为底物的原核生物。通过有氧降解途径发生甲烷到二氧化碳的完全氧化。本发明中有用的甲烷营养生物的典型例子包括但不限于甲基单胞菌属，甲基细菌属，甲基球菌属，和甲基弯曲菌属。

术语“高生长甲烷营养细菌菌株”指代能够使用甲烷作为其唯一碳源和能量源生长的细菌。

术语“类异戊二烯化合物”指代通过以下途径衍生的任意化合物：开始于异戊烯焦磷酸(IPP)并通过异戊二烯单元的头-至-尾缩合形成，所述异戊二烯单元长度可以是5，10，15，20，30或40个碳。这里术语“类异戊二烯色素”指代一类类异戊二烯化合物，其通常具有强光吸收特性。

术语“上异戊二烯途径/上游异戊二烯途径”指代与类异戊二烯生物合成相关的任意基因和基因产物(包括其同源物和突变体，不论天然发生或遗传工程化的)，包括dxs基因(编码1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶)，dxr基因(编码1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶)，“ispD”基因(编码2C-甲基-D-赤藓醇胞苷酰转移酶；也称为ygbP)，“ispE”基因(编码4-二磷脂酰胞苷酰-2-C-甲基赤藓醇激酶；也称为ychB)，“ispF”基因(编码2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶；也称为ygbB)，“pyrG”基因(编码CTP合酶)；涉及二甲基烯丙基二磷酸的形成的“lytB”基因；以及涉及异戊二烯途径中2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸合成的gcpE基因。术语“Dxs”指代由dxs基因编码的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶。

术语“Dxr”指代由dxr基因编码的1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶。

术语“YgbP”或“IspD”指代由ygbP或ispD基因编码的2C-甲基-D-赤藓醇胞苷酰转移酶。该基因的名字，ygbP或ispD，在本申请中可替换施用。该基因产物的名字，YgbP或IspD，在本申请中可替换施用。

术语“YchB”或“IspE”指代由ychB或ispE基因编码的4-二磷脂酰胞苷酰-2-C-甲基赤藓醇激酶。该基因的名字，ychB或ispE，在本申请中可替换施用。该基因产物的名字，YchB或IspE，在本申请中可替换施用。

术语“YgbB”或“IspF”指代由ygbB或ispF基因编码的2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶。该基因的名字，ygbB或ispF，在本申请中可替换施用。该基因产物的名字，YgbB或IspF，在本申请中可替换施用。

术语“PyrG”指代由pyrG基因编码的CTP合酶。

术语“IspA”指代由ipaA基因编码的作为异戊烯基转移酶家族一员的香叶基转移酶(Geranyltransferase)或法尼基二磷酸合酶。术语“LytB”指代在类异戊二烯途径中二甲基烯丙基-焦磷酸的形成中具有作用的蛋白，且其由lytB基因编码。

术语“GcpE”指代在类异戊二烯途径中2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸的形成中具有作用的蛋白(Altincicek等，J.Bacteriol.(2001),183(8),2411-2416；Camposetal.,FEBSLett.(2001),488(3),170-173)。

术语“下类胡萝卜素生物合成途径/下游类胡萝卜素生物合成途径”指代与类异戊二烯生物合成途径相关的任意以下基因和基因产物(包括其同源物和突变体，不论天然发生或遗传工程化的)，其参与八氢番茄红素的即时合成(其合成代表了对于类胡萝卜素生物合成独特的第一步)或后续反应。这些基因和基因产物包括“ispA”基因(编码香叶基转移酶或法尼基二磷酸合酶)，“ctrN”和“ctrN1”基因(编码diapophytoene脱氢酶)，“crtE”基因(编码香叶基香叶基焦磷酸合酶)，“crtX”基因(编码玉米黄素葡糖基转移酶)，“crtY”基因(编码番茄红素环化酶)，“crtl”基因(编码八氢番茄红素去饱和酶)，“crtB”基因(编码八氢番茄红素合酶)，“crtZ”基因(编码β-胡萝卜素羟化酶)，以及“crtO”基因(编码β-胡萝卜素酮醇酶)。另外，术语“类胡萝卜素生物合成酶”是一个包括性术语，指代本途径中任意和所有酶，包括CrtE，CrtX，CrtY，Crtl，CrtB，CrtZ，和CrtO。

术语“IspA”指代由ispA基因编码的蛋白，且其活性催化一系列3异戊烯转移酶反应，其中形成香叶基焦磷酸(GPP)，法尼基焦磷酸(FPP)，和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。

术语“CrtN1”或“CrtN，拷贝1”指代由crtN1基因编码的diapophytoene脱氢酶的拷贝1。术语“CrtN2”或“CrtN，拷贝2”指代由crtN2基因编码的diapophytoene脱氢酶(Crt)的拷贝2。

术语“CrtE”指代由crtE基因编码的香叶基香叶基焦磷酸合酶，其将反-反-法尼基二磷酸和异戊烯基二磷酸转化为焦磷酸和香叶基香叶基二磷酸。

术语“CrtX”指代由crtX基因编码的玉米黄素葡糖基转移酶，且其糖基化玉米黄素以产生玉米黄素-β-二葡糖苷。术语“CrtY”指代由crtY基因编码的番茄红素环化酶，其催化番茄红素转化为β-胡萝卜素。

术语“Crtl”指代由crtl基因编码的八氢番茄红素去饱和酶，且其通过引入四个双键，通过中间物六氢番茄红素，zeta-胡萝卜素和链孢红素，将八氢番茄红素转化为番茄红素。

术语“CrtB”指代由crtB基因编码的八氢番茄红素合酶，其催化从前八氢番茄红素二磷酸到八氢番茄红素的反应。术语“CrtZ”指代由crtZ基因编码的β-胡萝卜素羟化酶，其催化从β-胡萝卜素到玉米黄素的羟基化反应。

术语“CrtO”指代由crtO基因编码的β-胡萝卜素酮醇酶，其催化β-胡萝卜素通过作为中间物的海胆酮(一个酮基)转化为角黄素(两个酮基)。

术语“HpnD”指代推定的脱氢鲨烯合酶，其被认为使脱水的和标准的法尼基-PP基团化合以生成C₃₀分子脱氢鲨烯并由基因hpnD编码。

术语“HpnE”指代推定的脱氢鲨烯还原酶，其被认为还原脱氢鲨烯以生成C₃₀分子脱氢鲨烯并由基因hpnE编码。

术语“HpnC”指代鲨烯合酶，其使两个法尼基-PP基团化合以生成C₃₀分子鲨烯并由基因hpnC编码。

术语“SHC”指代鲨烯-藿烯(hopene)环化酶，其将线性鲨烯分子转化为五环分子藿烯并由基因shc编码(也称为hpnF)。在一些实施方案中，本发明的修饰的细菌含有shc敲除，例如，具有shc敲除的扭脱甲基杆菌，其导致类胡萝卜素产生的水平升高(见，例如，实施例7)。

术语“类胡萝卜素化合物”定义为一类碳氢化合物(胡萝卜素)和它们的氧化衍生物(叶黄素类)，由八个类异戊二烯单元以这样的方式连接组成，即类异戊二烯单元的排列在该分子的中心处反转，使得两个中心甲基以1,6-位置关系而其它非末端甲基以1,5-位置关系。所有的类胡萝卜素可以从形式上衍生于无环C₄₀H₅₆结构(以下式I)，具有接合双键的长中心链，通过：(i)氢化作用(ii)脱氢作用，(iii)环化，或(iv)氧化，或这些过程的任意组合。

本发明提供用参与类胡萝卜素化合物的生物合成的基因在微生物中的表达，所述微生物能够使用单碳底物作为唯一能量源。本文中这些微生物称为C1代谢者。宿主微生物可以是任意C1代谢者，其具有合成许多类胡萝卜素的前体异戊烯焦磷酸(IPP)能力。许多C1代谢微生物是本领域已知的，其能够使用各种单碳底物。在本发明中有用的单碳底物包括但不限于甲烷，甲醇，甲醛，甲酸，甲酸盐，甲基胺(例如，单-，二-和三-甲基胺)，甲基化硫醇，和二氧化碳。所有的C1代谢微生物通常归类为甲基营养生物。甲基营养生物可以定义为能够氧化不含有碳-碳键的有机化合物的任意生物。甲基营养生物的一个子集是甲烷营养生物，其具有氧化甲烷的独特能力。兼性甲基营养生物(facultativemethylotrophs)具有氧化不含有碳-碳键的有机化合物的能力，但可能也使用其它碳底物例如糖和复合糖用于能量和生物质。专性甲基营养生物(obligatemethylotrophs)是那些限于使用不含有碳-碳键的有机化合物用于产生能量的生物，而专性甲烷营养生物是那些具有氧化甲烷能力的专性甲基营养生物。

兼性甲基营养细菌存在于许多环境中，但大多数通常从土壤，垃圾填埋场和废物处理场所分离。许多兼性甲基营养生物是变形菌门(proteobacteria)的α，β，和γ亚组的成员(Hanson等，Microb.Growth01Compounds.,[Int.Symp.],7th(1993),285-302.Editor(s):Murrell,J.Collin；Kelly,DonP.Publisher:Intercept,Andover,UK；Madigan等，BrockBiologyofMicroorganisms,8thedition,PrenticeHall,UpperSaddleRiver,NJ(1997))。本发明中的兼性甲基营养细菌包括但不限于，噬甲基菌属，甲基菌属，甲基杆菌属，生丝微菌属，黄色杆菌属，芽孢杆菌属，副球菌属，诺卡氏菌属，节球菌属，红假单胞菌属，和假单胞菌属。优选的专性甲基营养生物包括，但不限于，甲基杆菌属，甲基单胞菌属，甲基细菌属，甲基球菌属，甲基弯曲菌属，Methylocyctis，甲基微菌属，和甲烷单胞菌属。

利用单碳底物的能力不限于细菌而也可以延伸至酵母和真菌。一些酵母属除了更复杂的材料外能够使用单碳底物作为能量源。本发明中有用的特定甲基营养酵母包括但不限于，念珠菌属，汉逊酵母属，毕赤酵母属，球拟酵母属，和红酵母属。

本发明中特别感兴趣的是高生长的兼性甲基营养生物，其具有积极有利的碳通量途径。例如，本申请人已经发现了甲基营养生物的特定菌株，其具有几个途径特征使得对于碳通量操纵和产生类胡萝卜素和另外的营养物特别有用。这种类型的菌株已经在本发明中作为宿主并是一种称为扭脱甲基杆菌的α-变形杆菌。

本发明的C1代谢微生物是普遍存在的，且许多已经被分离和表征。用于分离这些菌株的一般方案包括接种到密封的液体矿物盐培养基中，所述培养基含有甲烷或甲醇。必须注意制得的体积：气体比率且通常在25-55℃之间孵育培养物。通常，如果将其铺板或划线到固体培养基上当生长第一次可见时，可以从第一次富集分离各种不同的甲基营养细菌。用于分离甲基营养生物的方法是本领域普遍且公知的(见，例如ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA；Deshpande,MukundV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227(1992)；或Hanson,R.S.等，TheProkaryotes:ahandbookonhabitats,isolation,andidentificationofbacteria；Springer-Verlag:Berlin,NewYork,1981；Volume2,Chapter118)。

预期本教导将使得能够鉴定和分离表现出所需特征的生物。C1代谢者的一个方面是其整合活性Embden-Meyerhof通路，如通过焦磷酸依赖的磷酸果糖激酶的存在所指示的。存在的高生长菌株的另一个关键特征是其为兼性甲基营养生物，能够使用甲醇(或其它C1底物)作为唯一碳源；当然，为了最优生长，除了甲醇外，可以包括补充的其它含碳营养物，或其它C1营养物。用于分离甲烷营养生物的方法是本领域普遍并公知的。相似的，焦磷酸以来的磷酸果糖激酶已经在哺乳动物系统中得到了很好的表征，且测定方法已经得到了很好的开发(见，例如Schliselfeld等，Clin.Biochem.(1996),29(1),79-83；Clark等，J.Mol.Cell.Cardiol.(1980),12(10),1053-64)。当代微生物学家将能够使用这些技术来鉴定存在的高生长菌株。

范例

已经描述的本发明，将通过参考以下非限制性实施例进一步理解。

实施例1

甲基营养细菌的定向进化

定向进化能够产生所需性状的增强，例如选择高度着色的生物。在这里，该技术适于过度生产虾青素和一些必需氨基酸的扭脱甲基杆菌的选择/进化。根据本发明，类胡萝卜素生产的一条途径是简单地使培养物在所需的工业条件下进化，为了改进相关环境参数下的生长速率和/或存活。在进行的过程中，类胡萝卜素的可视性可以用于筛选要么在适应的过程中失去着色，或者偶然地变得更加高度着色的谱系。选择方案的例子是在只含有甲醇的基本培养基中系列转移(serialtransfer)。一旦将培养物铺板，可以注意到偶然的分离物具有“深粉红色”或“微红色”的集落形态。这一方法已经产生了各种具有色素沉积增加或改变的菌株，如Lee等的表1所记录的(2009.Evolution.63:2816-2830)。在基因组重测序时，可以揭示色素沉积的基础并与以下其它开发组合。通过在超过目前耐受的1％的甚至更高的浓度下培养，至5％，10％，或更高，选择/进化的应用也将导致增加的甲醇耐受。可以通过每48小时(1小时内)实施系列转移进行实验进化，通过将150μL转移到9.45mL的新鲜培养基中(1/64稀释，从而允许在达到稳定期之前生长六代)。这在每个循环结束时提供～2x10⁹(9.6mL)的群体规模。可以将群体维持在30℃，50mL烧瓶中，使用225rpm摇动。在将所述群体的1/64转移到新鲜培养基后每隔一段时间，可以将适当稀释的剩余培养物铺板以测试污染，接着将750μLDMSO添加到剩余液体中(～8％v/vDMSO终浓度)，并将该混合物的两个重复小瓶保存于-80℃。在铺板的时候可以检查集落的具有不同色素沉积的变体。USSN61/863,701中的图11是“火柴棒”图像，示出了扭脱甲基杆菌菌株中不同水平的类胡萝卜素：与对照(1)相比，接下来的三个菌株(2-4)表现出进化分离，而与其祖先(5)相比，(6)表现出藿烷类(hopanoid)缺陷型菌株。

也可以利用定向进化来选择可扩散分子，例如氨基酸的产生增加。

实施例2

使用可回收抗生素标志物系统对甲基营养细菌的定向遗传工程化

通过将要求给定营养物(例如蛋氨酸，或其它氨基酸)的大肠杆菌“饲养者”菌株与利用的甲基营养生物(例如扭脱甲基杆菌)组合，可以选择其氨基酸生产供给它们的伙伴并允许联合体(consortia)生长的菌株。为了使生产与该新基因型的生长优势相关，以空间结构化的方式进行这些实验是至关重要的，例如在含有琼脂或琼脂糖的培养皿上，其含有仅大肠杆菌可利用的食物来源(例如葡萄糖或乳糖)，但省略大肠杆菌突变体需要的营养物的添加。选择条件包括将两种菌株一起铺板，持续延长的时间周期(几天或几周)，接着洗涤组合的细胞材料，涡旋振荡，并将稀释物再铺板到和之前一样的新鲜培养基上。在一些情况下，将这种方法与毒性类似物组合可能是有益的，其将建立对生产增加以克服所述毒性类似物的抑制效果的直接选择。

定向遗传工程化可以用作增加类胡萝卜素，或其它所需分子产生的策略。涵盖了两种主要的方法。第一，将碳撤回至替代产品例如藿烷类、螺菌黄素，和将香叶基香叶基添加到细菌叶绿素的途径。可以生成等位基因置换构建体，其含有等位基因交换载体例如pCM433中待删除基因的上游和下游侧翼序列(Marx,C.J.BMCResearchNotes(2008)1:1)。通过使用三亲本杂交(triparentalmatings)可以将这种构建体引入，通过选择四环素抗性，接着通过选择蔗糖抗性解决(和反向筛选四环素敏感性；通过PCR或测序确认潜在阳性)。接着可以在该背景下进行下一种或多种基因的去除。主要的靶标为(都如上文所述)：1.)撤回法尼基二磷酸以产生藿烷类的基因(由hpnCDEF基因座集体编码)，2.)撤回番茄红素以制造螺菌黄素的那些基因(由crtD，crtE和crtF编码)，和3.)参与使用香叶基香叶基修饰细菌叶绿素的基因(由bchG和bchP编码)。这些去除可以单独或一起发生，或者可与其它改变组合。

一种待采用的技术将利用可回收抗生素标志物系统例如cre-lox系统。这将包括使用开发用于扭脱甲基杆菌的pCM157，pCM158，pCM184，pCM351系列质粒(Marx,C.J.andM.E.LidstromBioTechniques(2002)33:1062-1067)。见USSN61/863,701中的图4，其示出了甲基杆菌属和其它甲基营养生物中cre-lox标志物回收的基本原理。Marx和Lidstrom,2002.BioTechniques(33:1062-1067)的图3中示出了甲基杆菌属和其它细菌中cre-lox抗生素标志物回收的策略。Cre重组酶是一种来自P1噬菌体的位点特异性重组酶，其在体内催化侧接同向loxP识别位点的DNA区域的切除。这里所使用的系统由可移动等位基因交换载体，pCM184或pCM351组成，其具有loxP侧接的抗生素抗性基因盒，以及表达Cre重组酶的IncP质粒，pCM157或pCM158。通过产生两种系统发生上不同的革兰氏阴性细菌，扭脱甲基杆菌AM1(一种α-变形杆菌)和BurkholderiafungorumLB400(一种β-变形杆菌)的无标记突变菌株，我们证明了该系统的广泛应用性。

材料和方法

培养基和生长条件

扭脱甲基杆菌AM1菌株在基本盐培养基(minimalsaltsmedium)上生长，所述培养基含有以下水平的碳源，0.2％柠檬酸盐，0.5％(v/v)甲醇，0.25％(wt/v)甲胺，和0.4％(wt/v)琥珀酸盐。大肠杆菌菌株在LB培养基上生长。除非另有说明，按照以下终浓度添加抗生素：50μg/mL氨苄青霉素，10μg/mL氯霉素，50μg/mL(用于大肠杆菌和扭脱甲基杆菌AM1)或20μg/mL(用于B.fungorumLB400)卡那霉素，50μg/mL利福霉素，35μg/mL链霉素，和10μg/mL四环素。从Sigma获得化学物。从Difco获得营养琼脂和Bacto-琼脂。使用标准技术进行接合。

构建用于抗生素标志物回收的广宿主范围cre-lox系统

通过在可移动自杀质粒，pAYC61，的变体中插入loxP-结合的抗生素抗性基因盒，创建了两种等位基因交换载体，pCM184和pCM351(USSN61/863,701中的图5，其示出了对于甲基杆菌属和其它甲基营养细菌中cre-lox标志物回收有用的质粒。Marx和Lidstrom,2002.BioTechniques(33:1062-1067)中的图1和2说明了该质粒用于使得能够在甲基杆菌属和其它细菌中进行抗生素标志物的cre-lox回收)。将含有来自pUC4K的卡那霉素抗性基因盒的1.3kbHincII片段插入pLox1中，其已经使用XbaI切割并平端化(blunted)，以创建pCM161。为了引入方便的多克隆位点，使用以下引物对扩增pCM161的loxP-结合的卡那霉素基因盒，CM-ufkMCS,5′-TGACGTCTAGATCTGAATTCAGCTGTACAATTGGTACCATGGATGCATATGGCGGCCGCA-3′(SEQIDNO:1),和CM-dfkMCS,5′-GACTAGTGAGCTCACCGGTTAACACGCGTACGTAGGGCCCGCGGTATCGATAAGCTGGATCC-3′(SEQIDNO:2)。纯化所得的1.4kbPCR产物并克隆到pCR2.1((Invitrogen,Carlsbad,CA)中以创建pCM183。为了保留有用的克隆位点，使用EcoRI和SmaI切割pAYC61，使用T4DNA聚合酶平端化，并自连接以产生pCM182。最后，将来自pCM183含有loxP-侧接的卡那霉素基因盒的1.4kbAatII-SpeI片段连接到pCM182的AatII和XbaI位点之间，以创建pCM184(Genbank登记号AY093429)。也产生了赋予庆大霉素(gentamycin)抗性的版本，pCM351。从pLoxGen4使用CM-ufkMCS和CM-dfkMCS扩增loxP-侧接的庆大霉素抗性基因盒(由aaaC1编码)并克隆到pCR2.1中(Invitrogen,Carlsbad,CA)以产生pCM350。将来自pCM350的1.0kbAatII/SacI片段克隆到pCM184的AatII和SacI位点之间以产生pCM351(Genbank登记号AY093430)。

基于一对小的，可移动IncP质粒创建了两种广宿主范围cre表达载体，pCM157和pCM158(USSN61/863,701中的图5)。将来自pJW168的1.1kbXbaI-EcoRI片段克隆到pCM62的XbaI和EcoRI位点之间以产生赋予四环素抗性的cre表达质粒pCM157。通过将来自pJW168的相同XbaI-EcoRI片段克隆到pCM66的XbaI和EcoRI位点之间，产生了卡那霉素抗性版本，pCM158。这些质粒含有大肠杆菌lac启动子后的cre。在扭脱甲基杆菌AM1中，该质粒仅提高提供低的组成型(constitutive)活性。尽管有该低表达，但从接种到缺乏卡那霉素的平板上第一次传代获得的大多数细胞已经是卡那霉素敏感的(数据未示出)。

产生扭脱甲基杆菌AM1的Δfae突变体

使用pCM184生成了fae(编码甲醛活化酶)缺陷的扭脱甲基杆菌AM1突变体。通过PCR使用以下引物对扩增直接侧接fae的区域：CM-Dfae1,5′-CGGGTTTCGTGACCTGTTC-3′(SEQIDNO:3),和CM-Dfae2,5′-GTTATGCGGCCGCCATCTGCATGGAAGCCATCCTTGTTTGC-3′(SEQIDNO:4)；和CM-Dfae3,5′-GCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGCAGTCCTGGGCAGA-3′(SEQIDNO:5),和CM-Dfae4,5′-CGGGCATCGAGCGTTTCAC-3′(SEQIDNO:6)。将纯化的fae-上游和fae-下游PCR产物克隆到中pCR2.1以分别产生pCM195和pCM196。将来自pCM195的0.6kbEcoRI-NotI片段克隆到pCM184的EcoRI和NotI位点之间以产生pCM197。接着，将来自pCM196的0.6kbApaI-SacI片段连接到pCM197的ApaI和SacI位点之间以产生pCM198。

通过引入pCM198通过从大肠杆菌S17-1接合产生了扭脱甲基杆菌AM1的Δfae::kan突变体。在含有利福霉素的琥珀酸盐培养基上获得的卡那霉素抗性转化接合子(transconjugant)筛选四环素敏感性以鉴定潜在的空突变体(nullmutant)。至今，利用该系统我们已经产生了超过三十种不同的空突变体菌株，而双交换事件(double-crossoverevent)的频率从5％到80％变化(C.J.Marx和M.E.Lidstrom，未发表数据)。一个这种Δfae::kan突变体，CM198K.1，选择用于进一步的研究。使用辅助质粒pRK2073，通过将其接合到CM198K.1中引入质粒pCM157。为了纯度，将四环素抗性菌株划线，直到所得的菌株仅产生卡那霉素敏感型集落(通常仅两次转移)。接着，通过在缺乏四环素的培养基上两次连续转移，从该菌株固化(cure)pCM157以产生fae菌株CM198.1。使用野生型扭脱甲基杆菌AM1，CM198K.1，和CM198.1进行分析PCR确认等位基因交换，以及随后的卡那霉素基因盒删除(数据未示出)。在检查到的情况下，分析PCR产物的序列表明loxP位点之间的忠实重组(数据未示出)。

产生B.fungorumLB400的ΔflhA突变体

使用pCM184，如上文关于扭脱甲基杆菌AM1的描述，产生了flhA*(预测编码NAD-和谷胱甘肽-依赖的甲醛脱氢酶)缺陷的B.fungorumLB400突变体。通过PCR使用以下引物对扩增侧接flhA的区域：CM-BfflhAuf,5-GGTGACGGCATTGAAGCTG-3(SEQIDNO:7),和CM-BfflhAur,5-CATGCATCTTTGGTCTTCATCGTGAATG-3(SEQIDNO:8)；和CM-BfflhAdf,5-ACCGCGGTCGTGCTGTACTAATCC-3(SEQIDNO:9),和CM-BfflhAur,5-AGAGCTCGATACCGACCGATAGATCTC-3(SEQIDNO:10)。将flhA上游和下游的PCR产物克隆到pCR2.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)以分别产生pCM360和pCM361。将来自pCM361的0.6kbSacII-SacI下游片段克隆到pCM184的SacII和SacI位点之间以产生pCM362。接着，将来自pCM360的0.5kbEcoRI-NsiI上游片段克隆到pCM362的EcoRI和NsiI位点之间以产生pCM363。

通过接合引入pCM363产生了B.fungorumLB400的ΔflhA::kan突变体。在含有氯霉素(发现野生型B.fungorumLB400在低于10-20μg/mL时为天然抗性)的柠檬酸盐培养基上获得了卡那霉素抗性转化接合子。一种代表ΔflhA::kan突变体的四环素敏感菌株，CM363K.1，经选择用于进一步研究。如上文所述使用质粒pCM157以产生ΔflhA菌株CM363.1。使用野生型B.fungorumLB400,CM363K.1,和CM363.1进行了分析PCR用于确认(数据未示出)。

通过将野生型B.fungorumLB400在含有琥珀酸盐作为生长物质和不同浓度甲醛的固体培养基上的集落形成速率和程度与flhA突变体CM363K.1和CM363.1比较，确定了甲醛的最小抑制浓度(MIC)。刚好在添加熔化的琼脂之前向平板添加甲醛。因为不确定部分的甲醛将蒸发，报告的甲醛MIC为最大值。

结果和讨论

为了测试广宿主范围cre-lox抗生素标志物回收系统，在扭脱甲基杆菌AM1(一种α-变形杆菌)和B.fungorumLB400(一种β-变形杆菌)中产生了无标记突变体。分析PCR确认了每种删除的基因被kan替换，而随后的kan切除产生无标记删除(数据未示出)。扭脱甲基杆菌AM1的Δfae突变体在琥珀酸盐上与野生型相似生长，但在甲醇或含有琥珀酸盐和甲醇的培养基上不能生长。该突变表型与对fae::kan突变体以前的观察一致。CM198.1Δfae菌株可以作为方便的宿主用于要求变体Fae蛋白表达的结构-功能研究。

作为对这一广宿主范围抗生素标志物回收系统的第二证明，产生了B.fungorumLB400的ΔflhA突变体。在其它细菌中，flhA基因编码谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶。该酶参与大肠杆菌和脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)中的甲醛脱毒作用，并对于后者的甲基营养生长必要。发现ΔflhA菌株CM363.1在柠檬酸盐上生长期间在某种程度上对于甲醛的存在比野生型B.fungorumLB400更敏感，其MIC为0.1mM，相比之下野生型为0.2mM。这一发现表明，该谷胱甘肽依赖的途径在变形菌门的多个分支中参与甲醛脱毒作用。

总之，这一新的广宿主范围cre-lox抗生素标志物回收系统提供了在各种革兰氏阴性细菌中创建无标记突变体的可能性。利用具有针对整合的反选择的等位基因交换，以及固有不稳定的最小IncPCre表达质粒，排除了目标生物中对于成功的阴性选择的需要(其为一些先前开发的标志物回收系统的特征)。使用PCR生成侧翼序列用于基因置换允许容易的产生精确的删除突变体，以及根据需要在引物中引入起始或终止密码子进行截短。可以容易地开发该系统的变体，以允许构建染色体转录或翻译融合(T.Strovas,C.J.Marx,andM.E.Lidstrom，未发表数据)。标志物回收系统，例如此处描述的我们的系统提供胜过标准等位基因交换方法的实质性优势，由于其可以反复使用来使得能够产生含有多个基因修饰的无标记菌株的事实。我们实验室已经利用该系统来产生含有四种单独突变的扭脱甲基杆菌AM1菌株(C.J.Marx,L.Chistoserdova,andM.E.Lidstrom，未发表数据)。最后，由于不存在引入的抗生素抗性标志物，使用这些工具产生的工程化菌株对于环境释放更容易接受。

实施例3

使用等位基因交换载体对甲基营养细菌进行定向遗传工程化

多个遗传操作的另一种选项(其也避免了留下不需要的损伤痕迹)，是使用“进-出(in-out)”系统(USSN61/863,701中的图7示出了在甲基杆菌属和其它甲基营养生物中通过蔗糖反选择进行干净的等位基因交换的基本原理和对其有用的质粒。Marx,2008.BMCResearchNotes(1:1)的图1中说明了用于使得能够在甲基杆菌属和其它细菌中进行无抗生素等位基因交换的策略和质粒)。这些技术背后的基本思路是首先采用阳性选择，来选择由于克隆的区域和对应染色体位点之间重组的整个供体载体的单次交换整合，所述克隆的区域跨越所述载体中的所需突变。在第二步中，使用阴性选择来选择具有重组出载体序列的分离物。如果切除载体的第二次重组和向染色体引入该突变的第一次重组事件发生于引入的突变的同侧，原始的染色体基因座将恢复不变。然而，如果第二次重组事件发生于引入的突变的另一侧，这将导致原始等位基因的切除和保留新的突变。同样地，阴性选择产生具有两种所得的最终状态的集落，以及一些抗性但没有切除载体的假阳性百分比。只要所述假阳性不占主导地位，且引入的突变每一侧的重组率合理平衡，筛选适度收集的所得重组体将产生所需的无标记突变。

因此，用于产生无标记突变体的“进-出”等位基因交换载体必须能够被引入到受体生物中，不能营养复制(vegetativereplication)，并含有适合的标志物用于阳性和阴性选择。通常使用任意数量的抗生素抗性基因完成阳性选择，而对于阴性选择，通常存在相对较少的选择。最普遍使用的技术是使用链霉素(Sm)敏感性，其作为表达四环素(Tc)外排泵的多效效应(pleiotropiceffect)产生，或蔗糖敏感性，其由sacB编码的果聚糖蔗糖酶的表达造成。对于大多数革兰氏阴性细菌，在蔗糖的存在下，果聚糖蔗糖酶活性是致命的。该文献提供了一种基于sacB的容易的，广宿主范围的“进-出”系统，并经特别设计以允许在各种不同的细菌类群中容易的无标记等位基因交换。为了测试该系统，在扭脱甲基杆菌AM1中的三个不同基因座进行了等位基因交换。

结果和讨论

构建“进-出”等位基因交换载体pCM433

为了产生容易的系统用于在各种不同的细菌物种中进行无标志物等位基因交换，首先切除一种广宿主范围标志物回收载体pCM184的loxP侧接的卡那霉素(Km)抗性基因盒，并使用合成接头取代，所述合成接头向广泛的多克隆位点引入三个新的限制性位点。接着，引入来自pDS132含有sacB和cat(分别编码果聚糖蔗糖酶和氯霉素(Cm)乙酰转移酶)的片段，产生pCM433(USSN61/863,701中的图7)。可以注意到做出最初的尝试是为了利用通过表达pCM184上存在的Tc外排泵给予的潜在阴性选择(Sm敏感性)的优势。发现在含有tet的细胞中，Sm敏感性升高，但是该敏感性过于小而无法用于有效地阴性选择(Marx，未发表数据)。

扭脱甲基杆菌AM1中三个基因座处的等位基因交换

选择了扭脱甲基杆菌AM1中三个感兴趣的基因座以测试pCM433对于等位基因交换的效用。这些基因座是hprA(编码羟基丙酮酸还原酶，一种丝氨酸循环中用于将甲醛同化作用转化为生物质的关键酶)，mptG(编码β-呋喃核糖氨基苯5’-磷酸合酶，四氢甲烷蝶呤(tetrahydromethanopterin)合成的第一个专用酶,四氢甲烷蝶呤是用于该生物的甲醛氧化途径的C₁-载体分子)，和crtI(编码八氢番茄红素去饱和酶，一种对于类胡萝卜素生物合成必要的酶)。

在所有情况下，制造构建体以将等位基因从野生型(wt)转化为突变体，以及突变体到wt的相互转化。为了完成该这个，通过PCR扩增了原始的，wt等位基因以及删除(ΔhprA,ΔmptG)或插入等位基因(crtI⁵⁰²，通过将ISphoA/hah-Tc插入crtI中，接着通过Cre-介导的切除除了IS的132bp外的所有产生)，克隆到pCR2.1中，测序，接着引入pCM433中。接着，通过三亲本接合，将这些供体质粒每一个引入适合的目标菌株中，并铺板到Tc平板上(也含有Rif用于针对大肠杆菌的反选择)。以10^-6至10^-7的频率获得Tc^R接合子。在一些情况下，甚至是这些含有野生型和突变等位基因的单次交换重组体便显出表型。例如，来自pCM441(wtcrtI等位基因)插入白色CM502菌株或pCM44(缺陷型crtI⁵⁰²等位基因)插入粉红色CM501菌株的单次交换中间体的汇集各自含有两种颜色的Tc^R集落。同样地，分离了来自接合到每种背景中的一个粉红色和一个白色分离物(CM1263(白色)和CM1264(粉色)来自CM502，而CM1265(粉红色)和CM1266(白色)来自CM501)。清楚的观察到了pCM433插入这一位点的极性效应(polareffect)。与wt等位基因是否引入突变体不相关，或反之亦然，具有野生型等位基因上游，与基因的启动子接近(通过对菌株CM1264和CM1264的PCR分析确定)的菌株为粉红色、含有类胡萝卜素的集落，而具有pCM433的等位基因crtI⁵⁰²上游的菌株(CM1263和CM1266)为白色。

为了选择已经切除了载体的重组子，将Tc^R分离物的上清稀释并铺板到含有不同水平蔗糖(2.5,5,和10％w/v)的平板上。在所有的蔗糖水平，都以10^-4至10^-5的频率获得了蔗糖抗性集落。接着，筛选这些集落的Tc敏感性(指示预期的基于pCM433的构建体的删除)，以及预期的突变表型(对于ΔhprA和ΔmptG不能在甲醇上生长，对于crtI⁵⁰²为白色集落(相对于粉色))。通过PCR分析，使用位于重组发生处的等位基因区域外的引物确认了这些结果。在此处提供的情况下，扩增产物大小的差异足以区分使用的等位基因，但在后续研究中使用了经设计以区分单个核苷酸取代的引物(或测序)(ChouandMarx，未发表数据)。总体来说，此处在扭脱甲基杆菌AM1中产生的蔗糖^R，Tc^R菌株的假阳性率为26％(105/402)。然而，应当理解，对于不同的构建体/受体对，该频率范围从0％至78％变化。这似乎与每个基因座侧翼区域的重组率相关，如与通过其它机制产生蔗糖抗性的比率相比。对于三个基因座，野生型等位基因被突变等位基因取代，反之亦然。在后续工作中，已经利用该系统成功的进行了几十种等位基因交换，包括引入单核苷酸取代(Chou和Marx，未发表数据)。

此处描述的用于无标志物等位基因交换的广宿主范围载体具有几个特征，其极大地促进了它在多种系统中的使用。首先，与一些相似的质粒例如从其衍生较多的一些构建体的pDS132不同，pCM433依赖于pUC-衍生的ColE1复制子，如此它可以以高含量(1.5mL液体培养物中5-10μgDNA)维持在任意所需的大肠杆菌菌株中并易于纯化。第二，pCM433含有多接头，其含有远大于我们所知的可比工具的限制性位点数量，促进了克隆的DNA片段的引入。第三，pCM433上三种抗生素标志物的存在允许在它们适用的广范围的生物中使用。最后，pCM433保持了在通常存在于其它广宿主范围系统中的特征，例如IncPoriT的存在，其允许使用接合递送到受体菌株中。

材料和方法

培养基，生长条件，和遗传技术

扭脱甲基杆菌AM1菌株在30℃，具有“Hypho”基本盐培养基的琼脂平板上生长；大肠杆菌在37℃，Luria-Bertani琼脂上生长。按照以下浓度使用底物和抗生素：甲醇(125mM)，琥珀酸盐(15mM)，蔗糖(除非另有说明5％w/v)，50μg/mLAp(氨苄青霉素)，20μg/mLCm,50μg/mLKm,50μg/mLRif(利福霉素),35μg/mLSm,和10μg/mLTc。

通过将具有供体质粒的大肠杆菌菌株，扭脱甲基杆菌AM1受体菌株，以及具有辅助质粒pRK2073的大肠杆菌菌株混合，进行了三亲本接合。该混合物在容许(permissive)营养琼脂平板上在30℃生长过夜，接着将一些混合物(通过使用接种环划线或通过使用Hypho洗涤并再铺板)引入到选择培养基上，所述选择培养基含有适合的C源，用于针对大肠杆菌反选择的Rif，以及选择抗生素(Tc用于基于pCM433的供体；扭脱甲基杆菌AM1中Ap或Cm都不能有效地发挥作用，Marx，未发表)。通过将一接种环的给定菌株重悬于100μlHypho(约10⁹mL^-1)，并将50μl该悬液的10^-2稀释铺板到含有适合C源(一般为琥珀酸盐)和5％蔗糖的Hypho平板上完成蔗糖选择。测试所得的菌株的Tc敏感性，另外的预期表型(依赖于被交换的基因座和等位基因)，以及另外的，通过PCR分析确认了所有构建的菌株的染色体结构。使用ND-1000分光光度计(NanoDrop)确定了DNA浓度。

质粒的构建和菌株的产生

为了产生等位基因交换载体pCM433，使用NdeI和SacII切除pCM184的Km抗性基因盒，并将剩余的5.4kb载体骨架与合成的接头连接，所述接头经设计来将三个另外的，独特的克隆位点引入最终载体(PstI，XhoI，和NotI)。通过煮沸形成该接头，接着在室温慢慢地再次退火，两种寡聚物的混合物，CM-link1f(tatgctgcagctcgagcggccgc(SEQIDNO:47)和CM-link1r(ggccgctcgagctgcagca(SEQIDNO:48)，其设计为具有与NdeI和SacII互补的突出。接着，所得的质粒，pCM432，转化到damdcm大肠杆菌菌株C2925H中(ara-14leuB6fhuA31lacY1tsx78glnV44galK2galT22mcrAdcm-6hisG4rfbD1R(zgb210::Tn10)Tc^SendA1rspL136(Sm^R)dam13::Tn9(Cm^R)xylA-5mtl-1thi-1mcrB1hsdR2,NewEnglandBiolabs)，使得能够在除甲基化外的位点消化，并因此阻断MscI位点。接着纯化含有sacB和cat的pDS132的2.7kbXbaI-XmaI片段，使用Klenow酶平端化，并与MscI消化的pCM432载体连接以产生pCM433(见USSN61/863,701中的图7)。也得到了具有在相反方向的sacB-cat片段的构建体，pCM433r。

为了测试pCM433使得能够在扭脱甲基杆菌AM1染色体中三个不同基因座处进行无标记等位基因交换的能力，产生了一系列构建体和菌株。通过首先扩增来自CM501(野生型，Rif^R扭脱甲基杆菌AM1的分离物)包括mptGf的区域，或来自ΔmptG菌株CM508(CM253.1的分离物)的对应区域，产生了用于在mptG基因座处进行等位基因交换的供体构建体，其各自连接到pCR2.1(Invitrogen)中以分别产生pCM411和pCM424。测序这些PCR扩增的插入子(以及下文描述的克隆到pCR2.1中的所有其它等位基因)来确认扩增期间没有引入PCR错误。接着，将含有mptG区域的pCM411的2.1kbApaI-BamHI片段引入到已经使用ApaI和BglII消化的pCM433中，得到供体载体pCM436。相似的，将具有ΔhprA区域的pCM438的1.3kbSacI-XhoI片段克隆到pCM433的相同位点中以产生供体载体pCM439。这允许使用pCM436(含有野生型mptG等位基因)来逆转CM508中发现的损伤，而将pCM437(ΔmptG等位基因)引入CM501中来达到相反的目的，在单一步骤中产生删除。

相似的，通过首先扩增来自粉红色CM501菌株包括crtI(编码八氢番茄红素去饱和酶)的区域，或来自白色crtI::ISphoA/hah(例如，crtI⁵⁰²)菌株CM502(AM1-W的分离物)的对应区域，产生了用于在crtI基因座处进行等位基因交换的供体构建体。将这些片段连接到pCR2.1(Invitrogen)中以分别产生pCM417和pCM426。接着，将含有crtI区域的pCM411的1.6kbBamHI-NsiI片段引入到已经使用BglII和NsiI消化的pCM433中，得到供体载体pCM440。相似的，将具有crtI⁵⁰²区域的pCM426的1.7kbBamHI-NotI片段克隆到pCM433的BglII和NotI位点之间以产生供体载体pCM441。这允许使用pCM440(含有野生型crtI等位基因)来逆转CM502中发现的损伤，而将pCM441(crtI⁵⁰²等位基因)引入CM501中来达到相反的目的，产生插入等位基因。

最后，对于第三个等位基因，hprA，使用先前开发的cre-lox系统，首先产生了无抗生素抗性的删除菌株。与此处描述的使用pCM433的系统不同，产生ΔhprA菌株的过程复杂得多(并导致和留下loxP痕迹)。首先，分别扩增hprA上游和下游的区域，并克隆到pCR2.1(Invitrogen)中以分别产生pCM428和pCM429。接着使用BglII和NotI将上游区域从pCM428切除并连接到pCM184的相同位点以产生pCM430。将来自pCM429的0.6kbApaI-SacI片段克隆到该质粒的相同位点中以产生供体质粒pCM431。如先前所述，将该质粒引入野生型(粉红色)扭脱甲基杆菌AM1菌株，CM501，以及具有crtI⁵⁰²等位基因且另外同基因的白色菌株，CM502，分别产生分离hprA::kan的菌株CM1122和CM1123。将pCM157(表达Cre重组酶)引入这两种菌株中以催化kan基因盒的切除，并随后固化(cured)，最终产生下文使用的无抗生素抗性的ΔhprA菌株CM1203和CM1203。

通过首先扩增来自CM501菌株包括hprA的区域，或来自以上产生的ΔhprA菌株，CM1203的对应区域，产生了用于在hprA基因座处进行等位基因交换的供体构建体。将这些片段连接到pCR2.1(Invitrogen)中以分别产生pCM434和pCM438。将含有hprA区域的pCM434的2.2kbApaI-BamHI片段引入到已经使用ApaI和BglII消化的pCM433中，得到供体载体pCM434。相似的，将具有ΔhprA区域的pCM438的1.3kbSpeI-NsiI片段克隆到pCM433的XbaI和NsiI位点之间以产生供体载体pCM439。这允许使用pCM434(含有野生型hprA等位基因)来逆转CM1203中发现的损伤，而将pCM439(ΔhprA等位基因)引入CM501中来达到相反的目的，在单一步骤中产生删除。

实施例4

使用可回收抗生素标志物系统对甲基营养细菌的定向遗传工程化

在过去的几年里，已经显著扩展了可用于扭脱甲基杆菌AM1的遗传“工具包”。本发明中选择的用于遗传修饰的甲基杆菌属生物可以使用，例如用于克隆的小IncP载体进行工程化，包括pCM62(USSN61/863,701中的图3示出了对于甲基杆菌属和其它甲基营养生物中克隆有用的质粒。用于甲基杆菌属和其它细菌中克隆和表达的基本质粒示于Marx和Lidstrom,2001.Microbiology(147:2065-2075)的图2和图4中)，pCM66，或pHC41(Marx,C.J.和M.E.LidstromMicrobiology(2001)147:2065-2075；Chou,H.-H.etal.PLoSGenetics(2009)5:e1000652)。遗传修饰也将利用自由复制的表达质粒，例如pCM80(见USSN61/863,701中的图3)，pCM160，pHC90，或pHC91(Marx,C.J.和M.E.LidstromMicrobiology(2001)147:2065-2075；Chou,H.-H.等，PLoSGenetics(2009)5:e1000652)。其它质粒具有对诱导分子例如cumate或无水四环素的水平反应的能力。这些质粒包括pHC115，pLC290，pLC291(Chou,H.-H.等，PLoSGenetics(2009)5:e1000652；Chubiz,L.M.etal.BMCResearchNotes(2013)6:183)。在某些实施方案中，遗传修饰将利用直接引入到染色体基因座的表达系统。这些系统包括开发用于扭脱甲基杆菌AM1的pCM168，pCM172，和pHC01质粒(Marx,C.J.andM.E.LidstromMicrobiology(2001)147:2065-2075；Lee,M.-C.等，Evolution(2009)63:2813-2830)。

USSN61/863,701中的图6示出了对于来自扭脱甲基杆菌AM1的染色体基因座的插入表达有用的质粒。Marx和Lidstrom,2004.Microbiology(150:9-19)的图2描述了用于扭脱甲基杆菌中染色体克隆和表达的质粒。如Marx,C.J.等，Microbiology(2004),150:9-19中所述，已经开发了一种插入表达系统，其允许来自稳定的，无标记的染色体基因座的基因表达。已经使用该系统来更好的理解四氢叶酸(H₄F)途径在甲基营养生物中的作用。以前，不可能产生缺乏mtdA(编码NADP-依赖的亚甲基-H₄F/亚甲基四氢甲烷蝶呤脱氢酶)或fch(编码亚甲基-H₄F环化水解酶)的空突变体。从MethylobacteriumchloromethanicumCM4^T产生了无标记菌株，其表达类似的folD基因(编码双功能编码NADP-依赖的亚甲基-H₄F脱氢酶/亚甲基-H₄F环化水解酶)的类似物。在该菌株中，可以得到在多碳底物上正常生长但在对于C₁底物生长缺陷的空突变体。另外，也可以在野生型中产生mtdA和/或fch的空突变，通过使用甲酸盐补充琥珀酸盐培养基。这些菌株不能在C₁化合物上生长，但不是甲醇敏感的。这些方法已经证明mtdA和fch的显然必要性是由于对甲醛基-H₄F用于嘌呤和其它化合物的生物合成的需要所致，并提供了H₄F途径对于甲基营养必要的清楚遗传证据。

定向遗传工程化也可以用于增加产生番茄红素需要的生物合成途径的表达。可以通过克隆侧接这样的基因(或操纵子)上游的天然启动子的区域并使用中等强度到高强度的启动子来替代所述启动子来完成。这些包括驱使甲醇脱氢酶操纵子表达的强启动子(P_mxaF)，或根瘤菌噬菌体启动子(P_R)(Chubiz,L.M.等，BMCResearchNotes(2013)6:183)。如上文所述，这些基因包括产生异戊烯基二磷酸的dxs，dxr，和ispDEF，以及产生番茄红素的idi，ispA，crtE，crtB，和crtI。这些操作可以单独或一起进行，并可以与其它改变组合。

定向遗传工程化可以用于引入合成新的生物分子，例如虾青素所需要的新的酶促能力。这可以通过克隆必须基因的天然，密码子优化，或其他操作的版本来完成。可以将这些酶引入所需的宿主中，使用基于复制质粒的系统，例如pCM80，pCM160，pHC90，pHC91，pHC115，pLC290，或pLC291。或者，为了在不存在选择时稳定维持，可以使用上述系统将它们引入到染色体上，包括开发用于扭脱甲基杆菌的pCM168，pCM172，和pHC01。仅需要三种酶将番茄红素延伸为虾青素：番茄红素环化酶，由crtY编码；β-胡萝卜素酮醇酶，由crtW编码，和β-胡萝卜素羟化酶，由crtZ编码。可以从单个基因座表达这些酶，或融合到合成操纵子中。在一些实施方案中，crtY和crtW将源于紧密相关的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)菌种ORS278。在一些实施方案中，crtZ将源于同类的α-变形杆菌短波单胞菌菌种SD212。

为了作为鱼饲料原料，野生型扭脱甲基杆菌或可用的高色素菌株可以在甲醇上生长。在培养基中存在的其它营养物的限制内，分批补料方法中的甲醇水平可以最大化。甲醇的总添加到5-10％v/v是合意的。为了能够这样，可能需要以硫酸铵或氯化铵的形式添加额外的氮。考虑到甲醇生长较降低培养基pH的倾向，可以添加碱例如碳酸氢钠或氢氧化钠来将pH维持在接近初始的水平(通常为pH6.2至7)。可以通过分光光度法分析稀释物，确定培养物的最终光密度。

实施例5

用于甲基营养细菌的可诱导表达载体

至今为止，仅一种调节表达系统被证明在扭脱甲基杆菌中发挥功能。Choi和同事构建了一种利用cumate响应性转录抑制因子，CymR(其来自恶臭假单胞菌F1)和强P_mxaF启动子(其驱使扭脱甲基杆菌中甲醇脱氢酶的表达)的可诱导表达系统。该杂交系统经修饰利用来测试甲基杆菌属中不同甲醛氧化酶基因表达水平的适应度(fitness)结果。虽然发挥功能，该启动子-操纵子对极其“渗漏”，其中在非诱导条件下的基础表达水平相当高。该限制使得异源性基因表达极其困难，并阻碍了对条件性空表型的探索。

在这些先前发现的基础上，我们采用了另外的转录抑制因子，TetR，其来自转座子Tn10。作为DNA结合蛋白TetR家族(其中CymR也是一个成员)的功能性成员，TetR已经被广泛地研究，产生了许多关于配体结合，DNA结合动力学，以及操作子位点特异性的数据。在诱导物不存在时，TetR和CymR紧密结合它们相应的操纵子位点(见USSN61/863,701中的图8，示出了用于甲基杆菌属中的cumate和无水四环素调节的启动子系统。Chubiz等，2013.BMCResearchNotes(6:183)的图1中描述了用于甲基杆菌属中调节表达的质粒)，从而抑制由RNA聚合酶起始的转录。一旦配体结合，例如TetR的情况下四环素或无水四环素(一种高亲和力配体)，或cumate(p-苯甲酸异丙酯)与CymR结合，TetR和CymR对它们对应的操纵子位点的亲和力几乎被消除，允许转录起始继续。利用这些特点，大量研究已经修饰了现存的表达系统，使其以剂量依赖的方式作用。实际上，TetR和相关的转录抑制因子已经应用于细菌，古生菌，以及真核生物中的大量合成生物学应用中。

这里，我们描述了用于两种基于IncP的可诱导表达载体的构建，其用于扭脱甲基杆菌，以及可能许多具有轻微修饰的其它变形菌。这些载体的新颖性在于它们使用两种分别的转录抑制因子，TetR和CymR，以及来自根瘤菌噬菌体16-3的强启动子。通过表明i)诱导是剂量依赖的，ii)诱导是通过时间连续的，和iii)两种系统的调节范围都超过了对于扭脱甲基杆菌目前可用的那些系统，我们证明了这些载体的效用。总的来说，这些结果向研究扭脱甲基杆菌，以及可能许多其它变形菌的研究者提供了在传统和合成生物学应用中表达基因的两种可供选择的系统。

发现

启动子设计和基本原理

在选择适合启动子的过程期间，我们希望该启动子i)在扭脱甲基杆菌中足够活跃且ii)不受天然转录因子的调节。基于这两个标准，这种启动子的一种天然来源是来自噬菌体。许多噬菌体启动子具有广宿主范围并通常在它们的转录控制机制不存在下具有强的，组成型活性。然而，许多良好表征的大肠杆菌噬菌体来源的启动子例如λP_L，λP_R，T5P_N25，T7P_A1在扭脱甲基杆菌中弱活性或无活性。为了这一目的，我们寻找已经证明在α-变形杆菌中活跃的其它噬菌体启动子。基于这一标准，我们探索了使用来自根瘤菌(rhizobial)噬菌体16-3的控制区域的启动子(P_L和P_R)。已经在生理学和生物化学研究中广泛研究了噬菌体16-3，在其宿主，α-变形杆菌苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)中，以及大肠杆菌中，提示P_L和P_R可能在各种宿主中发挥功能。另外，已知与P_L和P_R相互作用的唯一转录调控子是16-3C抑制子。

在一组探索性实验中，我们发现P_R在扭脱甲基杆菌中活跃(数据未示出)。因为我们期望构建可诱导系统，我们将注意力集中在工程化P_R衍生物，其含有CymR和TetR调节子的操纵子位点(USSN61/863,701中的图8示出了用于甲基杆菌属中的cumate和无水四环素调节的启动子系统)。Chubiz等，2013.BMCResearchNotes(6:183)的图1中描述了用于甲基杆菌属中调节表达的质粒。发现得到的杂交启动子，P_R/cmtO和P_R/tetO，产生最广的调节范围而不影响PR启动子活性。有意思的是，我们发现在启动子的整个其它区域放置操纵子，特别是tetO，导致对启动子抑制或活性的丧失(数据未示出)。考虑到许多使用多个抑制子和活化操纵子位点来操纵的其它来自噬菌体的系统，这在某种程度上是令人吃惊的结果。总的来说，这些发现允许我们工程化两种具有相似的最大活性的可诱导启动子(USSN61/863,701中的图9示出了图7中示出的调节启动子系统的可滴定性(titratability))。Chubiz等，2013.BMCResearchNotes(6:183)的图2中示出了甲基杆菌属中添加诱导物时来自pLC290和pLC291的表达反应。

P_R/cmtO和P_R/tetO的活化是剂量依赖的

对于调节表达系统期望的特性是来自启动子的基因表达水平与诱导物的浓度成比例。为了探索P_R/cmtO和P_R/tetO的诱导范围，将启动子和它们对应的调控蛋白一同引入广宿主范围质粒上(IncP相容组)以创建表达载体pLC290和pLC291(USSN61/863,701中的图8)。由于先前的研究已经证明mCherry是扭脱甲基杆菌中基因表达的敏感性量度，我们决定使用mCherry荧光作为启动子活性的度量。我们将红色荧光蛋白变体mCherry放置到pLC290和pLC291中每一个启动子的控制下，将所得的载体(pJP18T和pJP22T)引入扭脱甲基杆菌中。为了诱导来自P_R/cmtO和P_R/tetO,的表达，我们向扭脱甲基杆菌培养物分别提供不同浓度的cumate(Q)和无水四环素(aTc)。

总的来说，发现两种启动子对Q和aTc的浓度是反应性的，这与先前扭脱甲基杆菌或其它生物中的研究一致。观察到P_R/cmtO启动子对范围为0.1至5μg/mL(0.6至30μM)的Q反应，而P_R/tetO启动子对0.1至25ng/mL(0.2nM至50nM)aTc反应。有意思的是，P_R/cmtO的诱导概貌在整个浓度范围以对数-线性的方式增加，而观察到P_R/tetO具有更凹形的概貌。在调节范围方面，观察到P_R/cmtO和P_R/tetO分别具有10倍和30倍诱导，其中两种启动子具有相同的最大绝对表达水平(USSN61/863,701中的图9)。重要的是，发现来自P_R/cmtO的基础表达水平比P_R/tetO的高约3倍。总的来说，这些数据提示虽然P_R/cmtO可能更可调，对于要求严格(tight)抑制的基因例如细胞毒性蛋白来说，P_R/tetO作为更好的表达系统。另外，我们发现在CymR和TetR配体特异性或启动子结合之间存在最小串扰，表明这些系统可以各自独立工作(pJP18T:4.6未诱导/4.2使用aTc；pJP22T:1.0未诱导/1.1使用Q；在琥珀酸盐中生长)。

将P_R/cmtO和P_R/tetO对基因表达水平和调控范围与先前报道的cumate可诱导P_mxaF启动子比较，我们发现在扭脱甲基杆菌中这些启动子达到了P_mxaF(已知的最强甲基杆菌属启动子)最大活性的33％并提供了更大程度的抑制。具体的，cumate可诱导P_mxaFmCherry表达载体，pHC115m，产生相对荧光值为15.6±1.5(未诱导)至157.1±3.7(诱导)。虽然该10倍调节范围与P_R/cmtO相似，来自P_R/cmtO的最小和最大表达都低3倍。通过比较，P_R/tetO，具有30倍调控范围，能够将表达抑制到比P_mxaF系统低8倍，而最大表达仅3倍差异。总的来说，这些结果证明P_R/cmtO和P_R/tetO两者都提供了超过先前开发的系统的改进。然而，我们确实注意到在需要高水平蛋白过表达的情况下，P_mxaF可能仍然是更好的启动子。重要的是，这些杂交启动子允许对细胞生理学的更多相关探索，因为它们的表达水平和范围很好的落在扭脱甲基杆菌中天然启动子之中或之上。

P_R/cmtO和P_R/tetO的最大活化是底物依赖的

许多使用宿主来源的启动子涉及的表达系统的问题是与天然转录因子相互作用的可能性。具体的，已知PmxaF启动子在生长于甲醇上的细胞(相对于生长在琥珀酸盐上的细胞)中更高度的活化。为了探索这一可能性，对于P_R/cmtO和P_R/tetO，我们在具有甲醇或琥珀酸盐作为唯一碳源的培养基中培养了含有pJP18T和pJP22T的扭脱甲基杆菌。我们发现与甲醇生长的细胞相比，琥珀酸盐生长的细胞拥有接近2倍增加的最大基因增加；实际上，在P_mxaF看到了相反的作用。我们怀疑这一最大表达的不一致可能是由于外部因素，例如甲醇和琥珀酸盐生长之间不同的质粒拷贝数量所致。先前报道的用于扭脱甲基杆菌中的XylE和β-半乳糖苷酶启动子探针载体，例如pCM130和pCM132(具有与pLC290和pLC291相同骨架的质粒)，在琥珀酸盐相对于甲醇生长期间，表现出背景活性2至3倍的增加。由于pCM130和pCM132在它们的报告基因上游没有启动子序列，仅有的可能变化可能存在于质粒拷贝数。将这些发现与我们的发现比较，在P_R/cmtO和P_R/tetO不含有宿主相关转录因子结合位点的情况下，我们看到了最大表达中相似倍数的变化，提示相似的机制可能影响这些表达系统。总的来说，这些数据提示单拷贝或染色体整合的系统用于以下情况，其中需要跨底物的统一表达。

P_R/cmtO和P_R/tetO的诱导是连续的

许多表达系统，特别是与代谢途径相关的那些系统的一个有问题的特征是，基因表达可能在整个细胞群体表现出表型异质性，例如开-关，开关样行为。为了探索这一可能性，我们将含有mCherry表达载体pJP18T和pJP22T的扭脱甲基杆菌菌株生长到对数生长中期，使用Q或aTc诱导培养物，并通过流式细胞术测量单个细胞荧光的时间过程。我们发现超过8小时的诱导，诱导的群体以均匀，连续的方式活化转录(USSN61/863,701中的图10示出了对于USSN61/863,701的图7中示出的每种调节启动子系统诱导时间过程期间的单峰表达)。Chubiz等，2013.BMCResearchNotes(6:183)的图3中示出了甲基杆菌中来自pLC290和pLC291的平滑的，无双峰的表达调节的时间过程。虽然我们确实观察到了剩余的未诱导细胞，我们怀疑这可能是由于通过我们的细胞固定方法引入的残渣或可能由于高代价的过表达细胞失去mCherry。这些数据证明了P_R/cmtO和P_R/tetO表达系统在研究要求均匀基因表达的细胞生理学中的效用。

使用P_R/tetO构建体的互补作用(Complementation)和条件性空表型

为了检验这些载体用于研究扭脱甲基杆菌生理学的效用，我们使用基于P_R/tetO的载体pLC291补充了编码甲醇代谢中关键酶的基因。由于使用mCherry报告基因我们观察到的严格诱导特性(USSN61/863,701中的图8)，我们选择使用P_R/tetO。在一碳代谢期间将甲酸吸收到生物质中需要ftfL的产物(甲酸-四氢叶酸连接酶)。ftfL的破坏导致甲醇负生长表型。通过使用P_R/tetO控制下的ftfL表达载体补充ftfL敲除，在aTc存在时，我们发现我们可以完全恢复甲醇上的生长。重要的是，在aTc不存在时，我们观察到我们可以产生ftfL的完全空表型。至今为止，没有用于扭脱甲基杆菌的表达系统能够产生条件性空表型(conditionalnullphenotype)。这些结果证明P_R/tetO研究扭脱甲基杆菌生理学和产生由aTc调节的条件性空突变的效用。

至今为止，在大肠杆菌和其它紧密相关的γ-变形杆菌之外仅存在少数用于其它细菌模型的表达系统。在努力扩展对于使用扭脱甲基杆菌，以及可能的其它变形杆菌工作的研究者可用的遗传工具包过程中，我们构建了一组两种可诱导表达载体，其利用CymR和TetR(cumate和四环素抑制子)与来自噬菌体16-3的强PR启动子缀合。发现pLC290和pLC291载体在扭脱甲基杆菌中在广范围的诱导物浓度范围提供均匀的，高水平的表达。重要的是，与仅有的用于扭脱甲基杆菌的可诱导系统比较，我们发现P_R/cmtO和P_R/tetO分别具有3和8倍的抑制增加。这提供了探索扭脱甲基杆菌细胞生理学能力显著的改善。此外，由于这些启动子彼此垂直地(orthogonally)操作，我们相信这些表达系统在单个菌株中将容易地协同作用，以允许在广范围的细菌中复杂的遗传工程化。由于这些原因，我们相信这些载体和启动子系统对于许多研究和工业环境中的细菌学社群(community)将是很有用的。

材料和方法

细菌菌株，培养基，以及生长条件

本工作中使用的所有细菌菌株都是大肠杆菌NEB10β(NewEnglandBiolabs)，大肠杆菌LC100(F^-rph-1ilvGattλ::[spcRlacI^QtetR])，扭脱甲基杆菌PA1菌株CM2730(ΔcelABCD)或扭脱甲基杆菌AM1的衍生物。除了大肠杆菌外，所有这些菌株的生长在修饰的’Hypho’基本培养基中进行，如Chou和同事所描述，具有5mM琥珀酸盐或20mM甲醇。大肠杆菌菌株在如Miller所述的Luria-Bertani培养液或营养培养液中培养。培养基使用50μg/mL卡那霉素，或100μg/mL氨苄青霉素补充，以选择所有质粒的存在。除非另有说明，分别以25ng/mL或5μg/mL从液体储液补充诱导物无水四环素(aTc)和cumate-KOH(Q)。在30℃使用Delaney和同事描述的自动化生长系统进行生长和基因表达实验。

质粒和菌株构建

首先构建了启动子设计并接着突变到pBluescript(SK-)(Stratagene)骨架中。合成的寡核苷酸CAACAACTTATACCATGGCCTACAAAAAGGCAAACAATGGTACTTGACGACTCATCACAA(SEQIDNO:11)和GTCCGTTCGTTACAATCTACAACTACAATTGTTGTGATGAGTCGTCAAGTACCATTG(SEQIDNO:12)含有编码来自根瘤菌噬菌体16-3的PR启动子的91nt区域。将该寡核苷酸退火以形成91bpdsDNA片段，接着使用引物ATAGGGCCCCAACAACTTATACCATGGCCTAC(SEQIDNO:13)和ATAGGTACCGTCCGTTCGTTACAATCTACAAC(SEQIDNO:14)进行PCR扩增以引入PspOMI和KpnI限制性位点。所得的片段使用PspOMI和KpnI消化并克隆到pBluescript(SK-)的对应位点中以形成pLC265。使用酶促反转PCR(EI-PCR)，使用引物ATACGTCTCATCCCTATCAGTGATAGAGAGTTGTAGATTGTAACGAACGGAC(SEQIDNO:15)，ATACGTCTCAGGGACGTCAAGTACCATTGTTTGCC(SEQIDNO:16)，ATACGTCTCAACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTGGTACCCAATTCGCCCTAG(SEQIDNO:17)，和ATACGTCTCATTGTTTACAATCTACAACTACAATTGTTGTG(SEQIDNO:18)将TetR和CymR操纵子位点(tetO和cmtO)引入到pLC265中PR的远端，接着通过BsmBI消化和连接以产生质粒pLC271(含PR/tetO)和pLC277(含PR/cmtO)。

后续的广宿主范围载体使用表达载体pHC115作为模板构建。从LC100使用含有NheI和PspOMI限制性位点的引物ATAGCTAGCAGGGAGAGACCCCGAATGATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTG(SEQIDNO:19)和ATAGGGCCCTTAAGACCCACTTTCACATTTAAG(SEQIDNO:20)PCR扩增编码Tn10tetR的DNA区域。将所得产物消化并连接到pHC115的NheI和PspOMI位点中，从而使用tetR替换cymR编码区以形成pLC261。从pHC115和pLC261，使用PspOMI和KpnI切除PmxaF区域并使用来自pLC277和pLC271的亚克隆PR/cmtO和PR/tetO片段替换。对于所得的质粒，从pHC01使用引物ACGCGAAATTCAAGCGCTAGGGCCAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCC(SEQIDNO:21)或ATGTGAAAGTGGGTCTTAAGGGCCAAGTTGG(SEQIDNO:22)(Chubiz等，BMCResearchNotes(2013),6:183)GTAACGCCAGGGTTTTCCC(SEQIDNO:23)和TGTAGGCCATGGTATAAGTTGTTGGGATGCAAAAACGAGGCTAGTTTACC(SEQIDNO:24)PCR扩增trrnB终止子并克隆到PspOMI位点中，使用Gibson和同事的方法，以减少转录通读到PR/cmtO和PR/tetO启动子区域。同样地，将更全面的多克隆位点引入KpnI和EcoRI位点中，使用退火的合成寡核苷酸GATAGGTACCTCTAGAAGATCTACGCGTACTAGTGCATGCGAGCTCACCGGTGATTCATAG(SEQIDNO:25)和CTATGAATTCACCGGTGAGCTCGCATGCACTAGTACGCGTAGATCTTCTAGAGGACCTATC(SEQIDNO:26)，以产生最终表达载体pLC290和pLC291。通过将含有来自pHC115m的mCherry的KpnI和EcoRI消化产物亚克隆到pLC290和pLC291中的对应位点中，分别创建mCherry表达载体pJP18T和pJP22T。载体pLC290(GenBank登录号KC296704)和pLC291(GenBank登录号KC296705)是公开可获的。

通过将Cre重组酶表达质粒pCM157转化到扭脱甲基杆菌AM1衍生物CM216K.1中产生菌株CM2336(ΔftfL::loxP)，产生无标记ftfL敲除。通过将基于pHC115的ftfL质粒(SMC未发表)的KpnI和EcoRI消化产物亚克隆到pLC291的对应位点中，产生ftfL补充载体，创建质粒pSC54。将该质粒，pSC54，通过三亲本杂交使用辅助质粒pRK2073引入CM2336中，以产生菌株CM4103(ΔftfL::loxP/pSC54)。通过将琥珀酸盐生长的CM4103接种到含有0μg/mL或20μg/mLaTc的甲醇基本培养基中，进行互补作用。

基于荧光的表达测定

如下进行测量mCherry蛋白表达水平的测定。对于剂量依赖的反应曲线，含有pJP18T或pJP22T的扭脱甲基杆菌菌株在10mL的Hypho-琥珀酸盐培养基中生长到饱和。接着将这些培养物以1：200稀释到新鲜培养基中，接着将630μL等分试样分配到干净的，平底，48孔微滴定板中(Costar)。培养物在板摇塔上(Caliper)以150rpm在30℃湿润的室内生长4小时。生长4小时后，添加含有Q或aTc的10μl新鲜培养基，以提供所需浓度的Q或aTc。使培养物继续生长另外24小时，接着使用TecanSafire2平板读数器完成荧光(激发587nm/发射610nm)和光密度(600nm)测量。报告的相对荧光值为：相对荧光(A.U.)＝RFU/OD₆₀₀*10^-3。

在与上文相似的条件下进行了动态表达测定，但有以下不同。在诱导后0，2，4，6，8，和24小时收集细胞(200μL培养物)。通过离心(6,000xg)沉淀培养物样品并重悬于等体积的冷Hypho培养基，所述培养基没有琥珀酸盐并使用100mg/mL链霉素补充来抑制mCherry翻译。在使用BDLSRII流式细胞仪完成荧光测量前，将固定的细胞保持在冰上。接着使用R中的BioConductorflowCore软件包分析流式细胞数据。报告的流式细胞术的荧光值为来自BDLSRII的原始值，且不与TecanSafire2的那些相关。

实施例6

生物质的收获；加工成饲料

可以通过以下方法收获富含营养物的生物质：1.)过滤，可以使用一系列减小孔径的滤器或切向流过滤，2.)连续离心，3.)沉降到发酵容器的底部，或4.)任意以上方法，或其它方法组合。可以通过添加澄清剂例如蛋清，明胶，鱼胶，相继添加kieselsol和壳聚糖，羧甲基纤维素，或其它试剂单独或组合，增强沉降。可以在烘箱中干燥材料之前和之后测定湿和干细胞块。可以通过比色测定估算总蛋白(Bradford,M.M.AnalyticalBiochemistry(1976)72:248-254；Lowry,O.H.等，J.BiologicalChemistry(1951)193:265-275)。可以在有机萃取后，分光光度计评估类胡萝卜素含量(TakaichiandShimadaMethodsEnzymol.(1992)213:374-385)。可以通过核磁共振或液相色谱-质谱进行进一步表征(Holtin,K.等，AnalBioanalChem(2009)395:1613-1622)。通过与标准比较，这可以建立类胡萝卜素存在的种类(identity)和重量百分比。可以通过生物测定确定维生素例如B-12(Berg,T.M.等，Appl.Environ.Microbiol.(1976)31:459-464)。可以酶促确定纤维素含量(Zhang,Y.H.等，MethodsMol.Biol.(2009)581:213-231)。可以通过流式细胞术或荧光分光光度法确定聚-β-羟基丁酸酯含量(Degelau,A.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.(1995)42:653-657)。可以通过衍生化量化并通过气相色谱-质谱分析游离氨基酸(J.O.等，J.Bacteriol(2004)186:1769-1784；Marx,C.J.等，PLoSBiology(2005)3:e16)。

一种制备细胞块的方法是通过在冷冻干燥机器中冷冻干燥，接着将干燥的细胞粉末重新添加到凝胶，颗粒，或片状形式的鱼食中。或者，可以将新鲜的(湿的)细胞材料添加到其它成分，接着通过干燥或加热制备。在其它方法中，可以通过匀浆，超声处理，酶处理，或单独或连同其它处理来破坏细胞材料，为了改变色素，其它营养物，和蛋白的生物可利用度。这将可能伴随着添加抗氧化剂。可以通过试错，或通过基于该饲料目的动物的预测，发现最优的制备方法。

测试着色的甲基营养生物作为富含类胡萝卜素的蛋白源用于水产养殖饲料的利用度的试验可以在不同阶段进行。作为可口性的简单第一步测试，可以将甲基杆菌添加到较小体积的凝胶鱼食。视喂食中的兴趣而定，可以相应地调整香味添加剂例如鱼类水解产物。作为第二阶段，可以在小的，快速生长的鱼类例如双锯鱼(Amphiprion)(即小丑鱼)中评估甲基杆菌细胞材料的营养价值和沉积色素的能力。使用组合设计，我们可以考虑六种初始处理。传统鱼食可以使用或不使用商业化虾青素的添加制备。可以将无色素甲基杆菌和高色素菌株(例如Lee,M.-C.等，Evolution(2009)63:2813-2830中)添加到不同水平，例如饲料总干重的5％和25％，添加到95％或75％的传统饲料中(into95％or75％traditionalfeed)。进一步的测试可以比较添加于其它技术例如处理的或未处理的大豆蛋白。从这里我们将可以评估鱼的活力，存活，增重和身体尺寸，鳞中的外部可见颜色，和肉中的色素沉积。后续试验可以使用同位素标记的生物质使用¹³C-甲醇或¹⁵N-铵，评估沉积速率和特异性。有两个标准用于确定这些试验的成功。首先，这些鱼是否与标准饲养的至少同样健康，或也许比使用基于大豆蛋白而不是甲基杆菌的相似替换更健康？第二，相对于天然对照，肉和鳞中是否存在相对于阴性对照可检测的色素沉积，以及该着色与阳性对照有多接近(或超过)？模型生物中的阳性结果作为较大的，商业相关物种的指标，将已经表明作为观赏鱼的色素装载饲料的效用，且如果该着色与虾青素看到的不同，可能表明螺菌黄素的特定效用。可以使用待利用的商业化物种，例如鲑鱼或虾进行的相似的饲养试验评估在水产养殖应用中的最终效果。如上文所述，重要的标准包括鱼的活力(vigor)，存活，增重，疾病的预防(例如，肠炎)，和身体尺寸，鳞中的外部可见颜色，和肉中的色素沉积。

实施例7

一般质粒构建

使用pPS04(Michener等，2014.J.Bacteriology.196:2101-2107)，一种衍生于pCM433(Marx2008)的卡那霉素抗性等位基因交换载体，在扭脱甲基杆菌PA1中产生了删除突变体。简单的说，PCR扩增侧接目标基因座的500+bp区域，并使用Gibson等温组件(Gibson2009)组装到pPS04中。与本研究相关的所有质粒列于表1中。

表1.相关质粒列表

构建pKB01以删除crtI-样基因座(Mext_3011)

为了删除Mext_3011(一种crtI-样基因)，使用以下寡核苷酸对扩增两个侧翼序列：上游，ATGGATGCATATGCTGCAGCTCGAGCGGCCGCGGCCCCCTTTGCCCTT(SEQIDNO:27)加上ATCCGGCACGGTTGACACTATGGCTGGGA(SEQIDNO:28)，和下游GCGCTGACGAAAATCCCAGCCATAGTGTCAACCGTGCCGGATGCCCGT(SEQIDNO:29)加上GGTTAACACGCGTACGTAGGGCCCGCGGCCGCGGGCGATGTTGGTGAA(SEQIDNO:30)。下划线序列表示设计来促进Gibson等温组装的重叠区域。所得质粒-pKB01-的图谱列于图2中。

构建pKB03以删除crtCDF(Mext_2725-26,-28)

删除crtCDF(Mext_2725-26,-28)同时保留crtE(Mext_2727)的构建体稍微复杂一些，要求使用以下引物对的3种PCR产物：crtCD的上游侧翼，ATGGATGCATATGCTGCAGCTCGAGCGGCCGCCCGATTGCCTGCCCCTAG(SEQIDNO:31)加上GGATCAACGGTGATGCGAGGCGGAGCGCATTTTCGGTGGCAGGCGCCTGAGCGAAGTCC(SEQIDNO:32)；编码CrtE的中心区域CTGCCACCGAAAATG(SEQIDNO:33)加上TTAGCGCCGCGGCAAGGCCGGTTCT(SEQIDNO:34)；以及crtF的下游侧翼，CGAGCGATGGCGTGAGAACCGGCCTTGCCGCGGCGCTAAGAGTGT(SEQIDNO:35)加上GGTTAACACGCGTACGTAGGGCCCGCGGCCGCCGAATCGCCGCTGACA(SEQIDNO:36)。所得质粒-pKB03-的图谱列于图4中。

构建pKB02用于ΔcrtF(Mext_2728)

在pKB03片段的Gibson组装期间，不经意地创建了删除crtF(Mext_2728)的构建体。在该构建体中，约129bp的伪PCR产物(来自Mext_1932)组装到如上文所述的pKB03中间和下游片段的上游。考虑到该上游片段不含有与目标基因座的同源性，该区域表现为“载体”而并在双交换重组中丢失，导致干净的删除，如通过PCR分析和Sanger测序所证实的。

菌株构建

使用三亲本杂交使用辅助质粒pRK2073(Figurski1979)将删除构建体引入扭脱甲基杆菌PA1中。在几种扭脱甲基杆菌PA1遗传背景中工程化突变体：“野生型”扭脱甲基杆菌PA1(Knief2010)；纤维素生物合成缺陷的Δcel突变体(Delaney2013)；以及缺乏纤维素生物合成和鲨烯-藿烯环化酶两者的双重ΔcelΔshc菌株。通过PCR分析和Sanger测序，使用来自该构建体的引物的组合，以及以下重组区域外设计的寡核苷酸确认了干净的基因组删除：pKB01，CTCCCCATCCTCGTGATC(SEQIDNO:37)和GAGGAAGGCGTCCGGGTC(SEQIDNO:38)；pKB02，GTGCCGGATGCCCG(SEQIDNO:39)T和CGCCGAAACCCGGATG(SEQIDNO:40)；pKB03，GCTCGCCACCAAGTTCG(SEQIDNO:41)和CGCCGAAACCCGGATG(SEQIDNO:42)。

本实施例中引用的参考文献

DelaneyNF,KaczmarekME,WardLM,SwansonPK,LeeM-C,etal.(2013)Developmentofanoptimizedmedium,strainandhigh-throughputculturingmethodsforMethylobacteriumextorquens.PLoSONE8:e62957.doi:10.1371/journal.pone.0062957。

FigurskiDH,HelinskiDR(1979)Replicationofanorigin-containingderivativeofplasmidRK2dependentonaplasmidfunctionprovidedintrans.PNatlAcadSciUsa76:1648–1652。

GibsonDG,YoungL,ChuangR-Y,VenterJC,HutchisonCA,etal.(2009)EnzymaticassemblyofDNAmoleculesuptoseveralhundredkilobases.NatMeth6:343–345.doi:10.1038/nmeth.1318。

KniefC,FrancesL,VorholtJA(2010)CompetitivenessofdiverseMethylobacteriumstrainsinthephyllosphereofArabidopsisthalianaandidentificationofrepresentativemodels,includingM.extorquensPA1.MicrobEcol60:440–452.doi:10.1007/s00248-010-9725-3。

MarxCJ(2008)Developmentofabroad-host-rangesacB-basedvectorforunmarkedallelicexchange.BMCResearchnotes1:1.doi:10.1186/1756-0500-1-1。

实施例8

CM3945的构建

从pCM433，一种基于sacB的自杀质粒构建了等位基因交换质粒。注释为鲨烯藿烯环化酶(shc)的基因组区域在参考的扭脱甲基杆菌PA1基因组中数字注释为Mext_1944。为了敲除该基因，将shc上游和下游序列的PCR产物连接到pCM433中以创建克隆载体pAB194。

引物对taccatggatgcatatgctgcagctcgagcCCGCGCCGCAGGAATTC(SEQIDNO:43)(正向)和CGCATCGTTCTCGCCTCGTTC(SEQIDNO:44)(反向)用于扩增shc基因座上游的区域。引物对gagacagtcgaacgaggcgagaacgatgcgGCAACCTGAAGCGGGGCAAC(SEQIDNO:45)(正向)和ggttaacacgcgtacgtagggcccgcggccGATTGAGACCCGCGGGTCATC(SEQIDNO:46)(反向)用于扩增shc基因座下游的区域。这些引物经设计以向pCM433骨架添加同源性。

使用NotI消化pCM433后，将所述上游和下游PCR产物通过Gibson组装连接到载体骨架中，产生克隆载体pAB194。

通过将pAB194杂交到受体菌株扭脱甲基杆菌PA1cel删除菌株(CM2730；Delaney等，2013)中产生CM3945。如Marx等，2008中所述进行等位基因交换。通过Sanger测序确认删除。

实施例9

石鲈试验

设计了实验用于小嘴石鲈(Haemulonchrysargyreum)在四种不同的实验饮食上的生长，来确定KnipBio’sSCP，或KBM，是否是用于模型鱼类的适合饲料成分。所述四种饮食由以下项组成(1)标准的市售石鲈饮食，(2)标准饮食加上虾青素色素(～80PPM)，(3)含有5％的总饲料团粒被KnipBio单细胞蛋白(KBM)替换的饮食，和(4)具有25％的鱼肉被KBM替换的饮食(～60PPM类胡萝卜素)。使用CM3945菌株产生KBM。鱼长度，重量，饲料转化率，以及肠道微生物所有的都进行了评估。每种条件以一式三份测试(12个水族箱)，其中每个箱中有约15条鱼，总共180条鱼。

图5示出了使用4种实验饮食(包括25％KBM内含物的饮食)的小嘴石鲈的生长。

在这一先导试验中，在34天的过程中使用所述四种实验饮食将小嘴石鲈喂养到饱。数据提示，具有类胡萝卜素的两种饮食(以大致相似的PPM水平)，相对于不具有色素的对照饮食，在相同的时间支持了最高的生长率(见图12)。观察到对于对照+色素和25％KBM内含物的石鲈生长分别为370％和391％。平均饲料转化率(FCR)范围从1.09-1.24。

从该数据得到的一个有趣的迹象是，KBM中的色素对于测试的鱼似乎是生物可接受的(bio-accessible)，这意味着当前用于色素提取的频繁处理(通常使用蓝藻和酵母)在该系统中不是必要的。这样的优势包括较低的处理成本以及抗氧化剂色素较长的活力，因为暴露于O2的损伤低得多同时保持完整。

在某种程度上，考虑到其天然组成和增强表达的潜力，KnipBio的单细胞蛋白(KBM)作为可行的替代蛋白用于动物饲料。在水产养殖和农业中，普遍使用植物蛋白(例如，大豆)。然而，这些植物蛋白来源缺乏必需氨基酸，像是赖氨酸，蛋氨酸以及其它氨基酸，这要求配合饲料以外源添加这些必需的营养物。如图6中所示，KBM作为一种原料成分在很大长度上与市售的基于大豆或鱼肉的最终饲料可比。扭脱甲基杆菌的遗传易处理性有助于对特定氨基酸或氨基酸组的进一步微调。对于使用植物蛋白的另一个考虑是通常关联了高达10％的碳水化合物。某些动物(例如，鲑鱼)对过量的糖不利反应并导致胃部炎症(肠炎)。KBM碳水化合物组成可以低一个数量级，从而最小化或大大避免这些效果。通常包括血粉或禽类副产品，作为我们用于动物饲料的蛋白的一部分，或与之组合。这一材料的一个明显缺陷是来自骨头的未消化的磷含量，其随后进入环境。KBM的组成中磷低5-10倍，这意味着可以同时使用更多的饲料而导致较低的环境足迹。

Claims (22)

1.一种基本上包含一种或多种分离的甲基营养细菌培养物的生物质，其中所述细菌遗传修饰或人工预选择为产生相对于对应的未修饰或未选择的细菌升高水平的类胡萝卜素化合物。

2.权利要求1的生物质，其中所述生物质为干燥或基本干燥的形式。

3.权利要求1的生物质，其中所述培养物的细菌选自下组：甲基单胞菌属(Methylomonas)，甲基细菌属(Methylobacter)，甲基球菌属(Methylococcus)，甲基弯曲菌(Methylosinus)，Methylocyctis，甲基微菌属(Methylomicrobium)，甲烷单胞菌属(Methanomonas)，噬甲基菌属(Methylophilus)，甲基菌属(Methylobacillus)，甲基杆菌属(Methylobacterium)，生丝微菌属(Hyphomicrobium)，黄色杆菌属(Xanthobacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)，副球菌属(Paracoccus)，诺卡氏菌属(Nocardia)，节球菌属(Arthrobacter)，红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，假单胞菌属(Pseudomonas)，念珠菌属(Candida)，汉逊酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)，和红酵母属(Rhodotorula)。

4.权利要求3的生物质，其中所述细菌是甲基杆菌属。

5.权利要求4的生物质，其中所述细菌是扭脱甲基杆菌(M.extorquens)。

6.权利要求5的生物质，其中扭脱甲基杆菌的菌株选自下组：扭脱甲基杆菌AM1，扭脱甲基杆菌DM4，扭脱甲基杆菌CM4，扭脱甲基杆菌PA1，扭脱甲基杆菌BJ001(原名M.populi)，耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)，M.nodulans，和甲基杆菌菌种4-46。

7.权利要求1的生物质，其中所述类胡萝卜素化合物选自下组：β-胡萝卜素，番茄红素，紫菌红素乙，虾青素，和螺菌黄素。

8.权利要求1的生物质，其中所述经遗传修饰的细菌被修饰使得产生从类胡萝卜素生物合成途径转移类异戊二烯化合物的酶的一个或多个基因被阻断或删除。

9.权利要求1的生物质，其中所述细菌包含非致死型shc敲除。

10.权利要求1的生物质，其中所述预选择的细菌是选择为表达“深粉红色(darkpink)”或“微红色(reddish)”色素的自发突变体。

11.一种饲料组合物，包含权利要求1的生物质。

12.权利要求11的饲料组合物，其中不使用细菌裂解获得所述生物质。

13.权利要求12的饲料组合物，其中通过过滤，沉降，或离心收集所述生物质。

14.权利要求11的饲料组合物，其中组合物含有按重量计至少1％的所述生物质。

15.权利要求11的饲料组合物，其中所述组合物优化为用于鱼类消耗。

16.权利要求15的方法，其中所述鱼类是养殖用于人类消耗的物种，其具有粉色，微红色，黄色，或橙色着色的肉。

17.权利要求15的饲料组合物，其中所述组合物包含下列的一种或多种：EPA，DHA，牛磺酸，和必需氨基酸。

18.一种制备生物质的方法，所述方法包括：

(a)在适合的培养基中培养甲基营养细菌，和

(b)收集权利要求1的生物质。

19.权利要求16的方法，其中通过过滤，沉降，或离心收集所述生物质。

20.一种扭脱甲基杆菌，包含非致死型shc敲除。

21.一种生产鱼类或海鲜的方法，所述方法包括：

(a)养殖鱼类或海鲜，和

(b)向所述鱼类或海鲜提供权利要求11的饲料组合物。

22.一种鱼类或海鲜产品，肉中表现出升高水平的类胡萝卜素色素，所述水平可归因于包含权利要求11的饲料的饮食。