CN114934124A - 一种选育具有快速生长潜力的大泷六线鱼的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种选育具有快速生长潜力的大泷六线鱼的方法，即通过SNP位点来进行快速生长的大泷六线鱼亲本的筛选。所检测的SNP位点位于序列为SEQ ID NO：1的核苷酸片段的第361位，其碱基为C或T。本发明确定大泷六线鱼的生长激素基因内含子的第361位存在与生长性状相关的SNP位点，基因型为CC纯合型个体的生长速率显著高于TT基因型和CT基因型个体。因此，生产中可优先选择该位点的基因型为CC型个体作为亲本或者进行规模养殖。

Description

一种选育具有快速生长潜力的大泷六线鱼的方法

技术领域

本发明属于鱼类遗传选育技术领域，具体提供一种选育具有快速生长潜力的大泷六线鱼的方法。

背景技术

大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)为六线鱼科六线鱼属的鱼类，是一种冷温性海洋鱼类，近海底层栖息，全年生活在沿岸及岛屿的岩礁附近，一般水深在50米以内，温度8～23℃，盐度16～32‰；为肉食性鱼类，摄食种类繁多。

在人工繁育技术突破之前，用于网箱养殖的大泷六线鱼苗种均来自野生苗种，产量不稳定并呈逐年减少趋势，难以满足大规模、高产量的养殖需求；另一方面，从自然界采捕野生苗种，本身就是对自然资源的掠夺和破坏，与渔业资源修复、生态保护等理念相悖。由于过度捕捞和环境变化，大泷六线鱼自然资源几近衰竭，因此人工育苗越来越引起养殖的广泛重视。

但目前大泷六线鱼的规模化人工繁育还存在问题，因为大泷六线鱼的生活习性决定了其适合海上网箱养殖，不适合工厂化养殖，因此目前大泷六线鱼的人工育苗多采用野生或海上网箱养殖的成鱼，但是无论将野生或是网箱养殖的成鱼转入车间促熟培育，都会导致其生活环境和条件发生巨大改变，易出现聚堆、受惊吓、不摄食等不适应的现象，导致鱼体受伤感染、烂鳍烂尾，降低了鱼体免疫水平，进而导致性腺退化，甚至大量死亡，大大制约了大泷六线鱼亲鱼培育的成功率。

分子标记辅助育种是快速获得理想家系、品系或品种的现代生物育种方法，分子标记育种已经应用到水产动物的遗传育种领域中，但在已在畜禽及水生动物中得以应用，与传统方法相比，提高了选育效率。但在大泷六线鱼育种领域中还缺少与生长性状相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种选育具有快速生长潜力的大泷六线鱼的方法，是通过SNP位点来进行快速生长的大泷六线鱼亲本的筛选。

本发明首先提供一种与大泷六线鱼生长性状相关的SNP位点，所述的 SNP位点位于序列为SEQ ID NO：1的核苷酸片段的第361位，其碱基为C 或T；

本发明提供的SNP位点可作为分子标记来选育具有快速生长潜力的大泷六线鱼个体。

本发明再一个方面还提供一种筛选具有快速生长潜力的大泷六线鱼个体的方法，是通过检测上述的SNP位点的基因型来进行筛选；

所述的方法，是通过引物对来扩增待检测的大泷六线鱼个体基因组 DNA，对扩增产物进行测序分析，确定待检测个体是否具有快速生长潜力；

所述的方法，其中所使用的引物对包含有：

上游引物:5′-CAATCACAGACAACCAGCGGGA-3′(SEQ ID NO：2)，

下游引物:5′-GGGTGCAGTTAGCTTCTGGAAG-3′(SEQ ID NO:3)；

所述的测序分析，是确定SNP位点的基因型，其中基因型为CC纯合型个体的生长速率显著高于TT基因型和CT基因型个体。

本发明确定大泷六线鱼的生长激素基因内含子的第361位存在与生长性状相关的SNP位点，基因型为CC纯合型个体的生长速率显著高于TT 基因型和CT基因型个体。因此，生产中可优先选择该位点的基因型为CC 型个体作为亲本或者进行规模养殖。

附图说明

图1：SNP标记的TT基因型、CC基因型和CT基因型测序峰图。

具体实施方式

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组DNA 上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性，通过确定SNP及基因型分型进行选种已在水产领域中得到广泛的应用。

本发明通过构建具有生长优势的大泷六线鱼家系，通过对家系成员与非家系成员的生长激素基因的序列比对，筛查出SNP位点，并分析位点基因型频率与大泷六线鱼生长性状的相关性。发现生长激素基因内含子的第 361位存在与生长性状相关的SNP位点，基因型为CC纯合型个体的生长速率显著高于TT基因型和CT基因型个体。因此，生产中可优先选择该位点基因型为CC型个体作为亲本或者进行规模养殖。

下面通过实施例和附图对本发明进行详细的说明。

实施例1：建立大泷六线鱼家系

在山东省海洋生物研究院中试基地建立具有生长优势的大泷六线鱼家系。选取野生大泷六线鱼作为亲本繁殖的同一批鱼苗中具有明显生长优势的个体作为亲本，在大泷六线鱼繁殖季节来建立家系。

其中鱼苗孵化参照常规的大泷六线鱼的受精孵化操作步骤，具体如下：

1)人工授精

将雌鱼成熟鱼卵收集放到铺有网片的平板上，其中网片选用硬质聚乙烯平网，网孔孔径0.5—1厘米；剪裁成30厘米×30厘米规格。将鱼卵摊开形成一层鱼卵，

在摊开鱼卵的同时，将雄鱼的精液挤入到装有海水的玻璃杯内激活，轻摇玻璃杯使精液混匀，将精液慢慢倒到单层鱼卵上，使精卵充分接触。

2)受精卵片固定

人工授精结束后，用海水冲洗受精卵片。将卵片夹在两层硬质聚乙烯平网之间，并固定好，防止卵片活动损伤受精卵。

3)受精卵孵化

将用硬质聚乙烯平网固定好的卵片放入到孵化网箱进行孵化，采用流水、连续充气、16℃水温恒温孵化的方式进行孵化。

孵化期间每天早8:30-10:00、晚15:00-16:30将受精卵从孵化池中取出并暴露在空气中，在空气中进行日光灯暖光源照射，其中光强为2000lux，光照时间为1.5小时，每隔15分钟进行一次水流刺激，刺激用水为16℃海水，反复刺激1.5小时后放回孵化池中继续孵化。

受精卵孵化后，初孵仔鱼集中在孵化网箱底部，待仔鱼上浮后，及时将仔鱼移出到培育池进行苗种培育，培育的苗种作为构建的家系的F1代。

将F1代的仔鱼培养至性成熟后，再次选择同样条件下生长速度快的个体作为亲本，来构建家系的F2代；同时选择相对生长速率低的个体作为亲本来构建对照家系。

当大泷六线鱼鱼苗生长至全长为10-12cm时，从构建的F2家系和对照家系中选取100尾鱼苗，采用荧光颜料标记不同家系的鱼苗，标记后的鱼苗混养在同一水体中进行养殖。在养殖8个月后收集各家系鱼苗进行全长和体重测量。每个家系的鱼苗采样5尾进行测量，计算各个家系体重的平均值，结果表明F2家系的平均体重(193±5.2)明显大于对照家系(145 ±3.5)。

使用ABI3730测序仪对F2家系的个体和对照家系个体的纯生长激素基因进行Sanger测序分析，发现序列为SEQ ID NO：1的序列的第361位碱基处存在SNP位点，为C和T，有CC、CT和TT三种基因型(图1)。

CAATCACAGACAACCAGCGGGAATTCACTAGTGATTCAACCAGC GGGGAGCCGTTTATTGCTTGTACAAAAACACAATCTTCATACAACAAG TTCAACAAACTCCTGACATCAGAATCTCTTAATCGTTACTTTATACTTCTCTTCACGCTACTGTTCACCAATCAGGTTCGAGCACGTGTTAATCCCA CGTGTTTTGTTCTGGTCAAGATGACATTTTGGCTGGCAATTGGTTTTTG GCAAGTCACATCCTGTTTACACAATGAAGCTTCCTGACCTGTCAGGCA GGCCCAATCTCTAGGGTCCCTGTGTATTATTCCTAATACTGTATCATGAC AGTTATATTAGACTTGTTTTCAGATGCCATTCAGATGCTTGCTCTAGCT TCCACAGCTGGGTCTATAACTATTGTGGACGTGCAAAACGATGCTAAC ACCACAAAAATTGTCCGTAAGGGAAAACCTTCAAACATCACACTTATC AAATCCGAAGGACAAGTAGTACCAGTGGCAACGACCAAGGATAAAAT CTTTGTTGGCAGCGAAAAAACATCATTACAATTTCATCACGTTATATAG TCATAAGGTCACGTATCACGATTGGCCGAGATACATGTGACGTGGCTT GGCAGAGCCATGTACGGCGTGTGTGTGTATCGGTATTGTTGTGTGTATC GGTGCATCTTAGCACTGAAAAATTATTTCCTGCAGTTGTTAAATCTGGA TATTAAAGTTACCCTGTGGAATTCTTTGTACATTTACACGTATTCATTTG GCAGACTCTTTTAACATTACATTCATAATGTTTAATGTATACCATAAAGA CTGAGCAATCCCACTCACTAAATATTATAATGAGTCAGTAATAGTCCAC AGCCAGCCCTTCACATAAGTTCTTCCAGAAGCTAACTGCACCC(SEQ ID NO:1)。

在F2家系中，CC型占绝对优势，而TT基因型最少；而在对照品系中，以CT基因型为主。

结果表明生长激素基因内含子的第361位存在与生长性状相关的SNP 位点，基因型为CC纯合型个体的生长速率显著高于CT基因型和TT基因型的个体。

实施例2：筛选具有生长潜力的大泷六线鱼亲本

在迷上岛海洋科技(长岛)有限责任公司的养殖厂对获得的野生大泷六线鱼受精卵孵化后的鱼苗进行养殖30天后，剪取尾鳍部分鳍条提取基因组 DNA作为模板，使用包含有：

上游引物:5′-CAATCACAGACAACCAGCGGGA-3′(SEQ ID NO：2)、

下游引物:5′-GGGTGCAGTTAGCTTCTGGAAG-3′(SEQ ID NO：3)；

的引物对检测核苷酸序列为SEQ ID NO:1的片段的第361位的基因型；并记载对应的个体的体重(g)和体长(cm)。

1)数据的采集与基因组DNA的提取：

随机选取50个大泷六线鱼个体，对选取的个体的体重、体长进行测量和记录，并剪取鳍条用于基因组DNA的提取，提取的DNA用作模型进行 PCR扩增。

采用常规酚仿法抽提大泷六线鱼鳍条中的基因组DNA。取待检测的鱼苗的尾鳍组织100mg于1.5ml的离心管中，剪碎；向已剪碎尾鳍的离心管中加入500μL DNA提取液；加蛋白酶K(20mg/ml)5μL，轻轻混匀，放入 55℃水浴中消化2小时；将溶液冷却至室温，加等体积苯酚，抽提10分钟， 12000rpm离心10分钟；取上清加入一新的1.5ml离心管中，加等体积酚，仿抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；取上清加入一新的1.5ml离心管中，加等体积氯仿抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；取上清加入一新的离心管中，加2倍体积无水乙醇，12000rpm离心5分钟；弃掉乙醇溶液，用70％乙醇洗沉淀2次，5000rpm离心5分钟；弃掉乙醇，室温放置10分钟，用100μL TE溶解沉淀DNA。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，DNA 溶液于-4℃或-20℃保存备用。

2)使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的引物对进行PCR反应及测序，反应体系为25μl，具体组成如下：10×buffer 2.5μl，dNTPs 2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，基因组DNA 1μl，Taq酶0.25μl，ddH₂O补足至25μl。

PCR反应程序如下：98℃，30s；98℃10s，65℃30s，72℃45s，30 个循环；72℃3min。扩增产物使用1.5％琼脂糖电泳检验。

3)目的片段的TA克隆。PCR产物使用柱式胶回收试剂盒回收目的片段，再与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆，接种于200μl的LB液体培养基中，200rpm振荡培养过夜，送生工生物工程(上海)有限公司进行Sanger测序。

4)对SNP位点的基因型与大泷六线鱼体重、体长的性状表型值进行分析，确定SNP位点不同基因型与生长性状的关联性(表1)。

表1：大泷六线鱼SNP基因型与生长性状信息表

由表1可知，基因型为CC纯合型个体的体重、体长和体全长显著高于 TT和CT基因型个体生长性状的表型值。

综上结果表明，通过使用本发明的SNP引物和方法筛选的大泷六线鱼 CC基因型个体，其生长速度显著高于同家系TT和CT型个体，对大泷六线鱼的遗传选育提供有效的分子标记。

序列表

<110> 迷上岛海洋科技（长岛)有限责任公司 山东省海洋科学研究院（青岛国家海洋科学研究中心）

<120> 一种选育具有快速生长潜力的大泷六线鱼的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caatcacaga caaccagcgg gaattcacta gtgattcaac cagcggggag ccgtttattg 60

cttgtacaaa aacacaatct tcatacaaca agttcaacaa actcctgaca tcagaatctc 120

ttaatcgtta ctttatactt ctcttcacgc tactgttcac caatcaggtt cgagcacgtg 180

ttaatcccac gtgttttgtt ctggtcaaga tgacattttg gctggcaatt ggtttttggc 240

aagtcacatc ctgtttacac aatgaagctt cctgacctgt caggcaggcc caatctctag 300

ggtccctgtg tattattcct aatactgtat catgacagtt atattagact tgttttcaga 360

tgccattcag atgcttgctc tagcttccac agctgggtct ataactattg tggacgtgca 420

aaacgatgct aacaccacaa aaattgtccg taagggaaaa ccttcaaaca tcacacttat 480

caaatccgaa ggacaagtag taccagtggc aacgaccaag gataaaatct ttgttggcag 540

cgaaaaaaca tcattacaat ttcatcacgt tatatagtca taaggtcacg tatcacgatt 600

ggccgagata catgtgacgt ggcttggcag agccatgtac ggcgtgtgtg tgtatcggta 660

ttgttgtgtg tatcggtgca tcttagcact gaaaaattat ttcctgcagt tgttaaatct 720

ggatattaaa gttaccctgt ggaattcttt gtacatttac acgtattcat ttggcagact 780

cttttaacat tacattcata atgtttaatg tataccataa agactgagca atcccactca 840

ctaaatatta taatgagtca gtaatagtcc acagccagcc cttcacataa gttcttccag 900

aagctaactg caccc 915

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatcacaga caaccagcgg ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggtgcagtt agcttctgga ag 22

Claims (7)

1.一种与大泷六线鱼生长相关的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点位于序列为SEQID NO：1的核苷酸片段的第361位，其碱基为C或T。

2.检测权利要求1所述的SNP位点的试剂在选育具有快速生长潜力的大泷六线鱼个体中的应用。

3.一种筛选具有快速生长潜力的大泷六线鱼个体的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测权利要求1所述的SNP位点的基因型来进行筛选。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是通过引物对来扩增待检测的大泷六线鱼个体基因组DNA，对扩增产物进行测序分析，确定待检测个体是否具有快速生长潜力。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ IDNO：2，下游引物的序列为SEQ ID NO：3。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的测序分析，是确定SNP位点的基因型。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的基因型，是选择基因型为CC的纯合型个体。

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