CN111549030A - 一种鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，属于水产生物育种技术领域。本发明的分子育种方法是基于基因编辑的技术手段，获得靶向突变鲫鱼mstn基因的F0代，通过传代获得mstn缺失且肌间刺骨化面积增加的突变体鲫鱼。在本发明中，首次提出了利用基因编辑技术来获得肌间刺骨化面积增加的鲫鱼的亲本方法。该方法有助于生产上大规模培育出肌间刺粗大而且可遗传的野生鲫鱼，非转基因方法，可应用于人工养殖，克服生产上因肌间刺细小难以加工的难点，不用担心转基因食品对人们的影响，且方便人们食用鲫鱼时更容易发现肌间刺，易于生产上推广。

Description

一种鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法
技术领域
本发明属于水产生物育种技术领域，具体涉及一种鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法。
背景技术
利用基因编辑是鱼类性状选育的重要技术手段，通过基因编辑可以靶向编辑目的基因从而获得具有优良性状的新品种，对水产业培育出养殖性能优良的品种有着重要的意义。目前，国内很多研究者开展了通过基因编辑技术研究养殖鱼类的体色、抗病、性腺发育等分子育种工作，这对培育优良品种具有积极作用。
肌间刺(intermuscular bone,IB)即为肌间骨，是一种仅存在于低等真骨鱼类的膜性硬骨，位于脊椎骨两侧肌间隔中。根据肌间刺在鱼体中附着位置将其分为髓弓小骨(附着于轴上肌肌间隔中)，脉弓小骨(附着于轴下肌肌间隔中)，椎体小骨(附着与椎体上)。目前，已有国家发明专利“异育银鲫新品系优化选育育苗方法”(专利号：ZL201010140103.X)利用兴国红鲤精子作为异源精子刺激银鲫卵子雌核发育生殖产生的全雌性后代，获得的异育银鲫新品系肌间刺减少；国家发明专利“一种生长快及少肌间刺的杂交鲂鲌的构建方法”(专利号CN201710788633)利用三角鲂为母本与翘嘴鲌父本进行远缘杂交，获得的杂种表现出生长快、形态优、肌间刺少且形态简单等优良性状。但是通过传统育种方法获得的品种对减少肌间刺数量效果一般。肌肉生长抑制素mstn(myostatin)是一类在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白，是肌肉生长的负调控因子。目前国内外尚未有文献报道mstn基因会影响鱼类肌间刺的骨化面积。
鲫鱼是我国的常见经济鱼类,其营养价值高、味道鲜美，一直深受我国消费者所青睐。我国鲫鱼的养殖规模不断壮大，其年总产量现已超过200万吨，产量稳步持续增长，在淡水养殖中占据十分重要的地位。增加鲫鱼肌间刺面积，使人们在吃鲫鱼时，更容易剔除肌间刺。降低被肌间刺卡住的风险，从而更喜欢吃鲫鱼，进而有望提高鲫鱼的消费量。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于采用CRISPR/Cas9的基因编辑方法突变鲫鱼的mstn基因，从而改变肌间刺大小，获得肌间刺骨化面积变大的鲫鱼的方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，步骤如下：
(1)克隆鲫鱼mstn基因核苷酸序列；
(2)采用基因敲除方法构建鲫鱼mstn基因的缺失突变体品系；
(3)筛选肌间刺粗大个体：选取经过基因敲除后比同龄野生种肌肉肥大的鲫鱼进行杂交，收集受精卵，孵化培育后获得稳定遗传的纯合突变体，检测肌间刺变化并筛选肌间刺粗大个体。
在上述方案的基础上，所述步骤1)中克隆的mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1
Figure BDA0002507662280000021
Figure BDA0002507662280000031
在上述方案的基础上，所述步骤1)中克隆mstn基因核苷酸序列的引物对为：
F:5’-CACAGGTTTTAATTTCTCTAAGTG-3’(SEQ ID NO:2)；
R:5’-GTTCATATACATGTACTAACCGTGG-3’(SEQ ID NO:3)。
在上述方案的基础上，步骤(2)所述的基因敲除方法为TALEN法或crispr/cas9法。
在上述方案的基础上，所述步骤(2)采用CRISPR/Cas9基因敲除方法构建鲫鱼mstn基因的缺失突变体品系的方法，具体为：
①在鲫鱼mstn基因序列的外显子区域设计靶点，将设计的靶点体外转录合成sgRNA，并与Cas9 mRNA按比例混合，配成用于基因编辑注射的药物；
②取性腺发育成熟的鲫鱼，注射绒促性素HCG，过夜后进行人工授精，待胚胎吸水膨胀后开始注射①中的基因编辑注射药物，注射时将药物准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nL；
③注射完成后随机抽取三组注射12h后的鲫鱼胚胎，每组三颗，用剪刀剪碎胚胎，提取基因组DNA，用荧光毛细管电泳法检测敲除效率；
④将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA，进行荧光STR检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，将有效突变的鲫鱼饲养至成年。
在上述方案的基础上，所述步骤①中基因编辑注射的药物含Cas9 mRNA终浓度300ng/μL，sgRNA终浓度50ng/μL。
在上述方案的基础上，所述步骤①设计靶点序列为以下序列中的至少一条：
exon1-target1:5’-GGATGCGGTTCAGTGGGTCA-3’(SEQ ID NO:4)、
exon1-target2:5’-GGTGGGTCATGGAGATATAA-3’(SEQ ID NO:5)、
exon1-target3:5’-GGGGCTGTGGAAGGCTGCTG-3’(SEQ ID NO:6)、
exon1-target4:5’-GGCGGCTGTGGAAGGCTGCT-3’(SEQ ID NO:7)、
exon1-target5:5’-GGAGCCTTCCACAGCCGCGG-3’(SEQ ID NO:8)、
exon1-target6:5’-GGACTGCTCGCTTTCCTCCG-3’(SEQ ID NO:9)、
exon1-target7:5’-GGGTTGTCTGAACTCACATG-3’(SEQ ID NO:10)、
exon1-target8:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:11)、
exon2-target1:5’-GGTCGTAAGAGCGCAGCTGT-3’(SEQ ID NO:12)、
exon2-target2:5’-GGGGGTTCATCTGAGACCCG-3’(SEQ ID NO:13)、
exon2-target3:5’-GGCGGTGGTCGCTTCTTCCG-3’(SEQ ID NO:14)、
exon2-target4:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’(SEQ ID NO:15)、
exon2-target5:5’-GGGCTGACGCCCGTCGCGGA-3’(SEQ ID NO:16)、
exon2-target6:5’-GGGCCTTCCTCCGTCCGCGA-3’(SEQ ID NO:17)。
在上述方案的基础上，所述步骤③中检测所用引物为：
T1:5’-CACAGGTTTTAATTTCTCTAAGTG-3’(SEQ ID NO:18)；
T2:5’-GTCATACGCGTTTATCTCAATG-3’(SEQ ID NO:19)。
在上述方案的基础上，步骤②所述的注射绒促性素HCG的注射用量为：雌鱼每公斤注射2000U，雄鱼每公斤注射1000U。
在上述方案的基础上，所述步骤(3)中检测肌间刺变化的方法为鱼类硬骨染色和体外分离肌间刺，其中硬骨染色采用茜素红染色法。
本发明的有益效果是：
相较于现有的通过雌核发育等传统育种方法减少肌间刺数量，本发明通过基因编辑技术定向编辑鲫鱼myostatin基因，获得肌间刺骨化面积增加并且生长速度更快、稳定遗传的突变体鲫鱼，可以解决生产上因肌间刺细小难以发现从而剔除的缺点，通过基因敲除方法，可以获得大量可稳定遗传的突变体鲫鱼，更受大众欢迎。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
1、克隆鲫鱼mstn基因核苷酸部分序列
4-5月份取发育相对较成熟的野生型鲫鱼雌雄各10条，实验室环境下饲养至性腺成熟，养殖缸长×高(2m×1m)，养殖过程中投喂通威的浮性饲料。
野生鲫鱼mstn序列的获得：在基因数据库NCBI中下载鱼类mstn核苷酸序列，并进行同源比对，选取相对保守区域设计PCR扩增引物，引物序列为：
F:5’-CACAGGTTTTAATTTCTCTAAGTG-3’
R:5’-GTTCATATACATGTACTAACCGTGG-3’
以野生鲫鱼cDNA为模板，进行mstn序列的扩增，获得鲫鱼mstn的编码区部分序列如SEQ ID NO:1所示。
构建鲫鱼mstn缺失突变体：采用crispr/cas9系统进行基因编辑
2、目的基因靶点选择及体外RNA转录
(1)鲫鱼mstn序列有三个外显子：exon1、exon2、exon3，在第一外显子上设计8个靶点，序列为：
exon1-target1:5’-GGATGCGGTTCAGTGGGTCA-3’(SEQ ID NO:4)、
exon1-target2:5’-GGTGGGTCATGGAGATATAA-3’(SEQ ID NO:5)、
exon1-target3:5’-GGGGCTGTGGAAGGCTGCTG-3’(SEQ ID NO:6)、
exon1-target4:5’-GGCGGCTGTGGAAGGCTGCT-3’(SEQ ID NO:7)、
exon1-target5:5’-GGAGCCTTCCACAGCCGCGG-3’(SEQ ID NO:8)、
exon1-target6:5’-GGACTGCTCGCTTTCCTCCG-3’(SEQ ID NO:9)、
exon1-target7:5’-GGGTTGTCTGAACTCACATG-3’(SEQ ID NO:10)、
exon1-target8:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:11)；
在第二外显子设计6个靶点，序列为：
exon2-target1:5’-GGTCGTAAGAGCGCAGCTGT-3’(SEQ ID NO:12)、
exon2-target2:5’-GGGGGTTCATCTGAGACCCG-3’(SEQ ID NO:13)、
exon2-target3:5’-GGCGGTGGTCGCTTCTTCCG-3’(SEQ ID NO:14)、
exon2-target4:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’(SEQ ID NO:15)、
exon2-target5:5’-GGGCTGACGCCCGTCGCGGA-3’(SEQ ID NO:16)、
exon2-target6:5’-GGGCCTTCCTCCGTCCGCGA-3’(SEQ ID NO:17)。
以设计的14个靶点为模板进行体外sgRNA的合成，通过凝胶电泳成像检测体外合成的sgRNA质量。
(2)cas9 mRNA体外转录：用XbaI酶切PT3TS-nCas9质粒，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶回收。用Ambion mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit进行转录，转录后回收获得cas9 mRNA。
3、鲫鱼人工授精及靶基因编辑
通过混合Cas9 mRNA和sgRNA来制备基因编辑注射的药物，并使得Cas9mRNA终浓度300ng/μL，sgRNA终浓度50ng/μL。
为了更高效获得编辑成功的胚胎，将所有靶点的sgRNA混合到一管中，终浓度分别为50ng/μL，得到预混液，统一注射胚胎。
取性腺发育相对成熟的野生型鲫鱼亲鱼，在实验室培育到性腺发育到一定程度后，采用激素促进鱼类性腺成熟。所用的雌鱼需腹部膨大、柔软；所用的雄鱼，用手轻轻挤压雄鱼生殖孔能流出少量精液。
对鲫鱼注射绒促性素HCG，注射用量为：雌鱼每公斤注射2000U，雄鱼每公斤注射1000U。过夜后进行人工授精，为方便药物显微注射，布卵至一次性塑料培养皿中，待胚胎吸水膨胀后开始注射，注射时将药物准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nL。
4、目标基因突变体的筛选及纯合突变体的获得
随机抽取三组注射过的鲫鱼胚胎(注射12h后)，每组三颗，用剪刀剪碎胚胎，提取基因组DNA。
设计注射后检测引物，序列为：
T1:5’-CACAGGTTTTAATTTCTCTAAGTG-3’
T2:5’-GTCATACGCGTTTATCTCAATG-3’
用荧光毛细管电泳法检测敲除效率。将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA，进行荧光STR检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，有效突变的鲫鱼至少收集20尾，饲养至成年。
5、肌间刺粗大个体的筛选
由于鲫鱼缺失mstn基因后会导致肌肉肥大，此时选取经过基因敲除后比同龄野生种肌肉肥大的鲫鱼进行杂交，收集受精卵，待胚胎发育至孵化期后，随机提取10颗胚胎的基因组DNA，进行STR验证，分子克隆确定基因编辑数目非3n的基因型。将F1代饲养至体长约1cm长左右，随机挑选100条个体分别剪取部分尾巴，提取基因组DNA，进行STR检测和分子克隆验证，直至获得有效突变且稳定遗传的纯合突变体F1，饲养至成年，验证肌间刺变化，采用活体CT扫描，挑选出肌间刺粗大的个体，可用于稳定传代。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一种鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3594
<212> DNA
<213> 鲫鱼(Carassius auratus)
<400> 1
cacaggtttt aatttctcta agtgtattaa ttgcatatgg ttcagtgggt catggagata 60
taacggcgca ccagcagcct tccacagccg cggaggaaag cgagcagtgc tccacatgtg 120
agttcagaca acacagcaag ctgatgagac tgcatgccat caagtcccaa attcttagca 180
agctccgact caaacaggct ccaaacatca gccgggacgt ggtcaagcag ctgttaccca 240
aagcaccgcc tttgcagcaa ctactggatc agtacgatgt tctgggggat gacagtaagg 300
atggagctgt ggaagaagat gatgaacata tcaccacaga gaccattatg accatggcca 360
ccgagcgtaa ggatcgtcta tttaaaaaga ttcgttcaag tagatgtaca ctcttaacaa 420
tggacgaaaa aatagagtag ctacttggag ggaccctttg cgcagtcttt acgtccacgc 480
cgtttgcact cacaaaacgt ctattgtgca ttaaatgcag ttaatgcaga gaattctcgt 540
ttactgattt taaaggcttt gtgttgctcc tttatcagcc ttgttaaccg attttacgca 600
ctctgaacat ggaagcgctg caaagcgcac cagcgtcgct cacaagaaaa tgttttcacc 660
tttactgcac gtgacatcta caaactgtag ttgaaactgg gcaatatttt taagtaaaaa 720
aactgtatta tggtatagat ataatgtgtg tatgtgatcc attagttatt atacatgcat 780
aaatgttgcc atccgaaatg ccgtttgtag cctatatagc atcatgtatg tatatatata 840
tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatacacata cagtcaatca 900
aattgtttac atacaaatgt ctgctttatg tctttaatgt attcaatttt gtgggcgtag 960
tcaacgttat ttctttaaaa cttcattttt ataaatatat cattgcgcca cttcatgaac 1020
cgctataaca aaaaaaaaaa aattcagtga aaaccagcag accacgtata atcgctattt 1080
ttcttctttt ttcagctgac cccatcgttc aagtagatcg gaaaccgacg tgttgttttt 1140
tctccttcag tccgaagatc caagcgaacc ggatcgtaag agcgcagctg tgggttcatc 1200
tgagacccgc ggaagaagcg accaccgtct tcttacagat atcacggctg acgcccgtcg 1260
cggacggagg aaggcacata cgaatacgat ctttgaagat cgatgtgaac gcaggagtga 1320
tgtcttggca gagtatagac gtaaaacagg tgctgacggt gtggttaaga caaccgggga 1380
ccaactgggg cattgagata aacgcgtatg acgcgaaggg aaacgacttg gccgtcacct 1440
cagctgagcc tggagaagat ggactggtga gttcaatgcg tttttcgtct catatatcca 1500
cttttagacc gctttgccaa cagtaattgt tgtgaatgac tgttgagaaa ttatttagat 1560
ggttttattt acaaactact ttgttttaaa taaataatga tatctcaaaa atgtaaaatg 1620
catatttctt gcatgataag tgcatgggtc tgagcaccca gcaacgctac atcgatgttg 1680
tcccgaatgt ttttgggaat caaaaagatt cgtcgattcg agaacgaatg actctttcga 1740
acggttattt ttagtgaatt aatctgactc actgaatctc cggttacttt cgtcatattt 1800
aataagaaac tttaatttat taataaggta tcattaataa gatatcatta ataagataag 1860
attaataatc ggtttaataa gaaaaaatgg ttaacccctc atgaaactta aatgagatta 1920
tcttcaatta gaacttgtgg aagtcagtgt tattaaatga atttaaaaag tttattcttt 1980
attttagtat ttccatttaa tatacatacc ataaaatgtg tgtgaaaagt tattaaaaac 2040
gcaaaaatat gtcatttttg tctgtacatt ggttctgatg atatcagaaa tgatctcatg 2100
atttgctggg gcagtaactg caataagaat tgaaaactcg ttaatggcac cattaagcaa 2160
cgaatcatta tgtggaactg gaatcattaa atctattccc ttgcctaatc atatctgtac 2220
tggctagctg tagcattcat taatggctgg acagagctac ttcacggtca agaccaggcg 2280
ttggcaagcg ccgtcagata ggaaagtctc aacagtaaac tgaaacactg gctcttggtt 2340
tctttcgttc ccagctcccc ttcatggagg tgaaaatctc ggagggccca aagcgaatcc 2400
ggagggactc tgggctggac tgcgatgaga attcgtcaga gtctcgatgc tgcaggtacc 2460
ctctcactgt ggacttcgag gacttcggct gggactggat tattgctccg aaacgctata 2520
aggcgaatta ctgttcggga gaatgcgact acatgcacct gcagaaatat ccccacaccc 2580
atctggtgaa caaggccaat ccacgaggga ctgccgggcc ctgctgcacc cccaccaaga 2640
tgtctcccat caacatgctt tacttcaacg gcaaagagca gatcatctac ggcaagatcc 2700
cctcaatggt agtagaccgc tgtggctgct cgtgaaccag tgcccagcca ggactcgatc 2760
cgtctcacag acccggacat ctgatcacac catccaccct ccattatcag tgctttccgc 2820
aagacactgt gcaatagaag gacgctcact cactctctgg gcaccgcttc atttgactat 2880
gtttttttgt cattttcctc taaatcagta tctctgccac aggagtccaa cgttacgtgg 2940
atgtactaaa ggaacgtcat atactggctg gacttgggaa tggacacttt tgaaatggac 3000
gacattctct gctttatttc atgttttcac cttgtcagaa tactctcatt aggatacaca 3060
tgtattatgc agccactcca aaatacagtc atttaggtct ttgctgtaac agctgagctt 3120
gtttaagaag agtatccaag agaaacagag agggactctt gaacactgaa cagagcttga 3180
atacagttat ctgacgcaaa cttccacata cactgcaata aacacaccga tcaaattggt 3240
aatcgtagct ttcgtccact actcatctgt caaacagccc tacacacttg aagtattatt 3300
gagatcgaca ttaggggaca gaaggacttg aagcaaaggc actgtgaagg cggtccacac 3360
atcgaaatgt gttcgagaca gagacgtcgg aactgtaaga atgaatgtta atatcacgct 3420
aacactctgt cttcaaacca cacagtttgc actatggcag accaatagaa agaattggtt 3480
gctaaaaatg ttgtaaaaac tgattttgat atatttgcta attgtattgt atacttgcca 3540
ttgtttccat taacagttgc cttttttaac cacggttagt acatgtatat gaac 3594
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 2
cacaggtttt aatttctcta agtg 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 3
gttcatatac atgtactaac cgtgg 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 4
ggatgcggtt cagtgggtca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 5
ggtgggtcat ggagatataa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 6
ggggctgtgg aaggctgctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 7
ggcggctgtg gaaggctgct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 8
ggagccttcc acagccgcgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 9
ggactgctcg ctttcctccg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 10
gggttgtctg aactcacatg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 11
ggttctgggg gatgacagta 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 12
ggtcgtaaga gcgcagctgt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 13
gggggttcat ctgagacccg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 14
ggcggtggtc gcttcttccg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 15
ggatatctgt aagaagacgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 16
gggctgacgc ccgtcgcgga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 17
gggccttcct ccgtccgcga 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 18
cacaggtttt aatttctcta agtg 24
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Carassius auratus)
<400> 19
gtcatacgcg tttatctcaa tg 22

Claims (10)

1.一种鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，步骤如下：
(1)克隆鲫鱼mstn基因核苷酸序列；
(2)采用基因敲除方法构建鲫鱼mstn基因的缺失突变体品系；
(3)筛选肌间刺粗大个体：选取经过基因敲除后比同龄野生种肌肉肥大的鲫鱼进行杂交，收集受精卵，孵化培育后获得稳定遗传的纯合突变体，检测肌间刺变化并筛选肌间刺粗大个体。
2.根据权利要求1所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤1)中克隆的mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤1)中克隆mstn基因核苷酸序列的引物对为：
F:5’-CACAGGTTTTAATTTCTCTAAGTG-3’；
R:5’-GTTCATATACATGTACTAACCGTGG-3’。
4.根据权利要求1所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，步骤(2)所述的基因敲除方法为TALEN法或crispr/cas9法。
5.根据权利要求4所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因敲除方法构建鲫鱼mstn基因的缺失突变体品系的方法，具体为：
①在鲫鱼mstn基因序列的外显子区域设计靶点，将设计的靶点体外转录合成sgRNA，并与Cas9 mRNA按比例混合，配成用于基因编辑注射的药物；
②取性腺发育成熟的鲫鱼，注射绒促性素HCG，过夜后进行人工授精，待胚胎吸水膨胀后开始注射①中的基因编辑注射药物，注射时将药物准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nL；
③注射完成后随机抽取三组注射12h后的鲫鱼胚胎，每组三颗，用剪刀剪碎胚胎，提取基因组DNA，用荧光毛细管电泳法检测敲除效率；
④将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA，进行荧光STR检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，将有效突变的鲫鱼饲养至成年。
6.根据权利要求5所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤①中基因编辑注射的药物含Cas9 mRNA终浓度300ng/μL，sgRNA终浓度50ng/μL。
7.根据权利要求5所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤①设计靶点序列为以下序列中的至少一条：
exon1-target1:5’-GGATATGGTTCAGTGGGTCA-3’、
exon1-target2:5’-GGTGGGTCATGGAGATATAA-3’、
exon1-target3:5’-GGGGCTGTGGAAGGCTGCTG-3’、
exon1-target4:5’-GGCGGCTGTGGAAGGCTGCT-3’、
exon1-target5:5’-GGAGCCTTCCACAGCCGCGG-3’、
exon1-target6:5’-GGACTGCTCGCTTTCCTCCG-3’、
exon1-target7:5’-GGGTTGTCTGAACTCACATG-3’、
exon1-target8:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’、
exon2-target1:5’-GGTCGTAAGAGCGCAGCTGT-3’、
exon2-target2:5’-GGGGGTTCATCTGAGACCCG-3’、
exon2-target3:5’-GGCGGTGGTCGCTTCTTCCG-3’、
exon2-target4:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’、
exon2-target5:5’-GGGCTGACGCCCGTCGCGGA-3’、
exon2-target6:5’GGGCCTTCCTCCGTCCGCGA-3’。
8.根据权利要求5所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤③中检测所用引物为：
T1:5’-CACAGGTTTTAATTTCTCTAAGTG-3’；
T2:5’-GTCATACGCGTTTATCTCAATG-3’。
9.根据权利要求5所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于：步骤②所述的注射绒促性素HCG的注射用量为：雌鱼每公斤注射2000U，雄鱼每公斤注射1000U。
10.根据权利要求1～9任一项所述鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于：所述步骤(3)中检测肌间刺变化的方法为鱼类硬骨染色和体外分离肌间刺，其中硬骨染色采用茜素红染色法。
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