CN111500581A

CN111500581A - 一种鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法

Info

Publication number: CN111500581A
Application number: CN202010451275.2A
Authority: CN
Inventors: 鲍宝龙; 车金远
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明公开了一种鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，属于水产生物育种技术领域。本发明的分子育种方法是基于基因编辑的技术手段，获得靶向突变鲢鱼和鳙鱼mstn基因的F0代，通过传代获得mstn缺失且肌间刺骨化面积增加的突变体个体。在本发明中，首次提出了利用基因编辑技术来获得肌间刺骨化面积增加的鲢鱼和鳙鱼的亲本方法。该方法有助于生产上大规模培育出肌间刺粗大而且可遗传的野生鲢鱼和鳙鱼，区别于转基因方法，可应用于人工养殖，克服生产上因肌间刺细小难以加工的难点，不用担心转基因食品对人们的影响，且方便人们食用鲢鱼和鳙鱼时更容易发现肌间刺，易于生产上推广。

Description

一种鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法

技术领域

本发明属于水产生物育种技术领域，具体涉及一种鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法。

背景技术

鲢鱼、鳙鱼，属于四大家鱼，在养殖过程中具有生长周期短、成活率高等特点，是我国重要的淡水养殖鱼类。利用基因编辑是鱼类性状选育的重要技术手段，通过基因编辑技术可以靶向编辑特定基因从而获得具有优良性状的新品种，对水产业培育出养殖性能优良的品种有着重要的意义。目前，国内很多研究者开展了通过基因编辑技术研究养殖鱼类的体色、抗病、性腺发育等分子育种工作，这对培育优良品种具有积极作用。

肌间刺(intermuscular bone,IB)即为肌间骨，位于脊椎骨两侧肌间隔中。肌间刺不同于脊椎骨，分散在肌间隔中，对鱼肉的加工及食用造成较大困难。目前，已有国家发明专利“一种分离脆肉草鱼鱼背肉和鱼脊骨肉的方法“(专利号：CN201110206703.6)”利用解剖将草鱼肌间刺与鱼背肉分离，但也会损失很多鱼肉；国家发明专利“异育银鲫新品系优化选育育苗方法”(专利号：ZL201010140103.X)利用兴国红鲤精子作为异源精子刺激银鲫卵子雌核发育生殖产生的全雌性后代，获得的异育银鲫新品系肌间刺减少；国家发明专利“一种生长快及少肌间刺的杂交鲂鲌的构建方法”(专利号CN201710788633)利用三角鲂为母本与翘嘴鲌父本进行远缘杂交，获得的杂种表现出生长快、形态优、肌间刺少且形态简单等优良性状。但是通过传统育种方法获得的品种对减少肌间刺数量效果一般。肌肉生长抑制素mstn(myostatin)是一类在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白，是肌肉生长的负调控因子。目前国内外尚未有文献报道mstn基因会影响鱼类肌间刺的骨化面积。

鲢鱼和鳙鱼是我国的常见淡水经济鱼类,其肉质鲜嫩，营养丰富,一直深受我国消费者所青睐。我国鲢鱼和鳙鱼的养殖规模不断壮大，鲢鱼年总产量现已超过300万吨，鳙鱼年产量超过200万吨，产量稳步持续增长，是我国重要的淡水养殖良种。但是鲢鳙鱼肌间刺数量很多，影响食品加工和人们食用。从基因层面改良鲢鳙鱼的形状，增加鲢鱼和鳙鱼肌间刺面积，使人们在食用或加工鲢鱼和鳙鱼时，更容易剔除肌间刺。降低被肌间刺卡主的风险，从而更喜欢吃鲢鱼和鳙鱼，进而有望提高鲢鱼和鳙鱼的消费量。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于采用CRISPR/Cas9的基因编辑方法突变鲢鱼和鳙鱼的mstn基因，从而改变肌间刺大小，获得肌间刺骨化面积变大的鲢鱼和鳙鱼的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，步骤如下：

(1)克隆鲢鱼和鳙鱼mstn基因核苷酸序列；

(2)采用基因敲除方法构建鲢鱼和鳙鱼mstn基因的缺失突变体品系；

(3)筛选肌间刺粗大个体：选取经过基因敲除后比同龄野生种肌肉肥大的鲢鱼和鳙鱼分别进行杂交，收集受精卵，孵化培育后获得稳定遗传的纯合突变体，检测肌间刺变化并筛选肌间刺粗大个体。

在上述方案的基础上，所述步骤1)中克隆的鲢鱼mstn基因核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，克隆的鳙鱼mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1鲢鱼mstn基因核苷酸序列

SEQ ID NO:2鳙鱼mstn基因核苷酸序列

在上述方案的基础上，所述步骤1)中克隆鲢鱼mstn基因核苷酸序列的引物对为：

F:5’-GATGGGTAAAGCAGCCTTC-3’(SEQ ID NO:3)；

R:5’-AGCAGAGAATGTCGTCCATTTC-3’(SEQ ID NO:4)；

所述步骤1)中克隆鳙鱼mstn基因核苷酸序列的引物对为：

F:5’-GTATTAATTGCATGTGGTCCAG-3’(SEQ ID NO:5)；

R:5’-CTCTTTGCCGTTGAAGTAAAG-3’(SEQ ID NO:6)。

在上述方案的基础上，步骤(2)所述的基因敲除方法为TALEN法或crispr/cas9法。

在上述方案的基础上，采用CRISPR/Cas9基因敲除方法构建鲢鱼和鳙鱼mstn基因的缺失突变体品系的方法，具体为：

①在鲢鱼和鳙鱼mstn基因序列的外显子区域设计靶点，将设计的靶点体外转录合成sgRNA，并与Cas9 mRNA按比例混合，配成用于基因编辑注射的药物；

②取性腺发育成熟的鲢鱼和鳙鱼，注射促黄体生成素释放激素类似物LRH-A，过夜后进行人工授精，待胚胎吸水膨胀后开始注射①中的基因编辑注射药物，注射时将药物准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nL；

③注射完成后随机抽取三组注射12h后的鲢鱼和鳙鱼胚胎，每组三颗，用剪刀剪碎胚胎，提取基因组DNA，用荧光毛细管电泳法检测敲除效率；

④将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA，进行荧光STR检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，将有效突变的鲢鱼和鳙鱼饲养至成年。

在上述方案的基础上，所述步骤①中基因编辑注射的药物含Cas9 mRNA终浓度300ng/μL，sgRNA终浓度50ng/μL。

在上述方案的基础上，所述步骤①设计的鲢鱼mstn基因敲除靶点序列为以下序列中的至少一条：

在第一外显子上设计4个靶点，序列为：

exon1-target1:5’-GGCTTCCTCCGTGGCTGTGA-3’(SEQ ID NO:7)；

exon1-target2:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:8)；

exon1-target3:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’(SEQ ID NO:9)；

exon1-target4:5’-GGATCAGTACGATGTTCTGG-3’(SEQ ID NO:10)；

在第二外显子上设计4个靶点，序列为：

exon2-target1:5’-GGACAACCGGAGACCAACTG-3’(SEQ ID NO:11)；

exon2-target2:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’(SEQ ID NO:12)；

exon2-target3:5’-GGGTCTTCCTCCGTCCGTAA-3’(SEQ ID NO:13)；

exon2-target4:5’-GGGCTGATGCCCGTTACGGA-3’(SEQ ID NO:14)；

所述步骤①设计的鳙鱼mstn基因敲除靶点序列为以下序列中的至少一条：

在第一外显子上设计6个靶点，序列为：

exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:15)；

exon1-target2:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’(SEQ ID NO:16)；

exon1-target3:5’-GGATCAGTACGATGTTCTGG-3’(SEQ ID NO:17)；

exon1-target4:5’-GGTCATGATGGTCTCTGTGG-3’(SEQ ID NO:18)；

exon1-target5:5’-GGCCATGGCCACAGAGCGTA-3’(SEQ ID NO:19)；

exon1-target6:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’(SEQ ID NO:20)；

在第二外显子上设计4个靶点，序列为：

exon2-target1:5’-GGGTCTTCCTCCGTCCGTAA-3’(SEQ ID NO:21)；

exon2-target2:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’(SEQ ID NO:22)；

exon2-target3:5’-GGGCTGATGCCCGTTACGGA-3’(SEQ ID NO:23)；

exon2-target4:5’-GGTTATCTCGATGCCCCAGT-3’(SEQ ID NO:24)。

在上述方案的基础上，所述步骤③中鲢鱼检测所用引物为：

T1:5’-GAGCAGTGTTCCACATGTGAG-3’(SEQ ID NO:25)；

T2:5’-GGTGACGGCCAAGTCATTTC-3’(SEQ ID NO:26)；

所述步骤③中鳙鱼检测所用引物为：

T1:5’-GTATTAATTGCATGTGGTCCAG-3’(SEQ ID NO:27)；

T2:5’-CATACGCGTTTATCTCGATG-3’(SEQ ID NO:28)。

在上述方案的基础上，步骤②所述的注射促黄体生成素释放激素类似物LRH-A的注射剂量为10μg/kg。

在上述方案的基础上，所述步骤(3)中检测肌间刺变化的方法为鱼类硬骨染色和体外分离肌间刺，其中硬骨染色采用茜素红染色法。

本发明的有益效果是：

在本发明中，相较于现有的通过雌核发育等传统育种方法减少肌间刺数量，本发明通过基因编辑技术定向编辑鲢鱼和鳙鱼mstn基因，获得肌间刺骨化面积增加并且生长速度更快、稳定遗传的突变体鲢鱼和鳙鱼，可以解决生产上因肌间刺细小难以发现从而剔除的缺点，通过基因敲除方法，可以获得大量可稳定遗传的突变体鲢鱼和鳙鱼，更受大众欢迎。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

(1)鲢鱼mstn基因核苷酸部分序列克隆

在基因数据库NCBI中下载与鲢鱼亲缘关系较近的几种鱼类mstn核苷酸序列，并进行同源比对，选取相对保守区域设计PCR扩增引物，引物序列为：

鲢鱼mstn：

F:5’-GATGGGTAAAGCAGCCTTC-3’(SEQ ID NO:3)

R:5’-AGCAGAGAATGTCGTCCATTTC-3’(SEQ ID NO:4)

以鲢鱼cDNA为模板，进行mstn序列的扩增，获得鲢鱼mstn的编码区部分序列，如SEQ ID NO:1所示。

(2)鲢鱼mstn基因的缺失突变体品系的构建

采用基因敲除方法获得鲢鱼mstn基因缺失突变体品系，以crispr/cas9构建缺失品系方法为例，具体步骤如下：

(i)鲢鱼mstn基因敲除靶点选择

鲢鱼mstn序列有三个外显子：exon1、exon2、exon3。为了更高效的进行基因编辑和长片段的碱基缺失，在第一外显子上设计4个靶点，序列为:

exon1-target1:5’-GGCTTCCTCCGTGGCTGTGA-3’(SEQ ID NO:7)；

exon1-target2:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:8)；

exon1-target3:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’(SEQ ID NO:9)；

exon1-target4:5’-GGATCAGTACGATGTTCTGG-3’(SEQ ID NO:10)；

在第二外显子设4个靶点，序列为：

exon2-target1:5’-GGACAACCGGAGACCAACTG-3’(SEQ ID NO:11)；

exon2-target2:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’(SEQ ID NO:12)；

exon2-target3:5’-GGGTCTTCCTCCGTCCGTAA-3’(SEQ ID NO:13)；

exon2-target4:5’-GGGCTGATGCCCGTTACGGA-3’(SEQ ID NO:14)。

(ii)鲢鱼靶基因编辑

a、采用crispr/cas9系统进行编辑：

将第一外显子和第二外显子共8个靶点分别体外转录成sgRNA，分别与Cas9mRNA按比例共同混合至一管，配成用于基因编辑注射的药物，含：Cas9 mRNA终浓度300ng/μl，sgRNA终浓度50ng/μl。

b、5-6月份捕捞性腺发育成熟的鲢鱼亲本，亲本选择4龄、体重3kg以上的体格健壮、游泳活泼、无损伤的亲本，雌雄比1:1，注射促黄体生成素释放激素类似物LRH-A,注射剂量10ug/kg，过夜后进行人工授精。为方便显微注射，布卵至一次性塑料培养皿中，待胚胎吸水膨胀后开始注射，注射时将药物准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nl。

(iii)目标基因突变体的筛选及纯合突变体的获得

分别随机抽取三组注射过的鲢鱼胚胎和未注射的野生胚胎(注射12h后)，每组三颗，用剪刀剪碎胚胎，碱裂解法提取基因组DNA。

利用荧光毛细管电泳法检测敲除效率。将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA,进行荧光STR检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，有效突变的鲢鱼至少收集20尾，饲养至成年。

所述检测引物为：

T1:5’-GAGCAGTGTTCCACATGTGAG-3’(SEQ ID NO:25)

T2:5’-GGTGACGGCCAAGTCATTTC-3’(SEQ ID NO:26)

(iv)肌间刺粗大个体的筛选

由于鲢鱼缺失mstn基因后会导致肌肉肥大，此时我们选取比同龄野生种体型肥大的鲢鱼和鳙鱼进行自交，收集受精卵，发育至孵化期后，随机提取10颗胚胎的基因组DNA，进行STR验证,获得可稳定遗传的纯合突变体F1。将F1代饲养至体长约1cm长左右，随机挑选100条个体分别剪取部分尾巴，提取基因组DNA,进行STR检测和分子克隆验证，直至获得有效突变且稳定遗传的纯合突变体F1，饲养至成年，验证肌间刺变化，采用活体CT扫描，挑选出肌间刺粗大的个体，可用于稳定传代。

所述检测肌间刺变化的方法为鱼类硬骨染色和体外分离肌间刺，硬骨染色采用茜素红染色法。

实施例2

(1)鳙鱼mstn基因核苷酸序列克隆

在基因数据库NCBI中下载与鳙鱼亲缘关系较近的鱼类mstn核苷酸序列，并进行同源比对，选取相对保守区域设计PCR扩增引物，以野生鳙鱼cDNA为模板，进行mstn序列的扩增，获得鳙鱼mstn的编码区部分序列，如SEQ ID NO:2所示。

扩增引物为：

F:5’-GTATTAATTGCATGTGGTCCAG-3’(SEQ ID NO:5)

R:5’-CTCTTTGCCGTTGAAGTAAAG-3’(SEQ ID NO:6)

(2)鳙鱼mstn基因的缺失突变体品系的构建

采用基因敲除方法获得鳙鱼mstn基因缺失突变体品系，以crispr/cas9构建缺失品系方法为例，具体步骤如下：

(i)鳙鱼mstn靶基因的选择

鳙鱼mstn序列有三个外显子，为了更高效的进行基因编辑和长片段的碱基缺失，在第一外显子上设计6个靶点，序列为：

exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:15)；

exon1-target2:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’(SEQ ID NO:16)；

exon1-target3:5’-GGATCAGTACGATGTTCTGG-3’(SEQ ID NO:17)；

exon1-target4:5’-GGTCATGATGGTCTCTGTGG-3’(SEQ ID NO:18)；

exon1-target5:5’-GGCCATGGCCACAGAGCGTA-3’(SEQ ID NO:19)；

exon1-target6:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’(SEQ ID NO:20)；

在第二外显子设计4个靶点，序列为：

exon2-target1:5’-GGGTCTTCCTCCGTCCGTAA-3’(SEQ ID NO:21)；

exon2-target2:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’(SEQ ID NO:22)；

exon2-target3:5’-GGGCTGATGCCCGTTACGGA-3’(SEQ ID NO:23)；

exon2-target4:5’-GGTTATCTCGATGCCCCAGT-3’(SEQ ID NO:24)。

(ii)、鳙鱼靶基因编辑

a、采用crispr/cas9系统进行编辑：

将设计的4个靶点，分别体外转录成sgRNA，分别与Cas9 mRNA按比例共同混合至一管，配成用于基因编辑注射的药物，含：Cas9 mRNA终浓度300ng/μl，sgRNA终浓度50ng/μl。

b、5-6月份获得性腺发育成熟的鳙鱼鱼亲本，亲本选择4龄、体重3kg以上的体格健壮、游泳活泼、无损伤的亲本，雌雄比1:1，注射促黄体生成素释放激素类似物LRH-A,注射剂量10ug/kg，过夜后进行人工授精。为方便显微注射，布卵至一次性塑料培养皿中，待胚胎吸水膨胀后开始注射，注射时将药物准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nl。

(iii)目标基因突变体的筛选及纯合突变体的获得

分别随机抽取三组注射过的鳙鱼胚胎和未注射的野生胚胎(注射12h后)，每组三颗，用剪刀剪碎胚胎，碱裂解法提取基因组DNA。

利用荧光毛细管电泳法检测敲除效率。将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA,进行荧光STR检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，有效突变的鳙鱼至少收集20尾，饲养至成年。

所述检测引物为：

T1:5’-GTATTAATTGCATGTGGTCCAG-3’(SEQ ID NO:27)

T2:5’-CATACGCGTTTATCTCGATG-3’(SEQ ID NO:28)

(iv)肌间刺粗大个体的筛选

由于鳙鱼缺失mstn基因后会导致肌肉肥大，此时我们选取比同龄野生种肌肉肥大的鲢鱼和鳙鱼进行自交，收集受精卵，发育至孵化期后，随机提取10颗胚胎的基因组DNA，进行STR验证,获得稳定遗传的纯合突变体F1至少20条，饲养至成年，通过CT扫描对鱼体进行活体扫描，检测肌间刺变化。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 一种鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2967

<212> DNA

<213> 鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 1

gatgggtaaa gcagccttca cagccacgga ggaagcgagc agtgttccac atgtgagttt 60

agacaacaca gcaagctgat gagactgcat gccatcaagt cccaaattct tagcaaactc 120

cgactcaaac aggctccaaa catcagccgg gacgtggtca agcagctgtt acccaaagca 180

ccgcctttgc aacaacttct ggatcagtac gatgttctgg gggatgacag taaggatgga 240

gctgtggaag aggatgatga acatgccacc acagaaacca tcatgaccat ggccacagag 300

cgtaaggatt gtctatttca aagattcatt catgtaaatg tatcctctta acaatggaca 360

aagaatatgt ctacttggag agacccttta cgcagtcttt gtgcccaagc cagttgcacc 420

cacaaggcag ctattgggca taaaatgcac agttaagatg tataaagacg attcctgttt 480

ttttttaggc tttgtgcccc tctttttttc tcagccttgc taaagcaatt ttacgcacgc 540

tgaacatgga agcgcggcaa aagcgcacca gcgtcggtcg gaagaaaatg ttttcacctt 600

taccacacgt gataggctat aaactgtagt ttaaatcggt tcatatctta gccaatcttt 660

aggttaaaat gtgtagccta ttatgtgtaa tgccttttat atgtagtgtc taaatataga 720

cattatatct gtagccgatc cattcgtttt taaaggcttc tgcaatgccg tatatgtata 780

tgacttgcat gtctttttca tttttaaaat aactacgtgc gtcatttcat ggacctcttt 840

aaaaggctaa taaaactgtc actgaaaacc agtagatccc gtataatcac tctgatttac 900

tttctcttct ttgtttttca gctgacccca tcgttcaagt agatcggaaa ccgaagtgtt 960

gttttttctc cttcagtccg aaaatccaag cgaaccgaat cgtaagagcg cagctctggg 1020

ttcatctgag accggcggaa gaagcgacca ccgtcttctt acagatatca cggctgatgc 1080

ccgttacgga cggaggaaga cacatacgaa tacgatccct gaagatcgat gtgaacgcag 1140

gtgttacgtc ttggcagagt atagacgtaa agcaggtgct ctcggtgtgg ttaagacaac 1200

cggagaccaa ctggggcatc gagataaacg cgtatgacgc gaagggaaat gacttggccg 1260

tcacctcagc tgaggctgga gaggatggac tggtgagttg agctgttgtg ttactaaatg 1320

tgcgtttttt acacaataca accgctttta gacagagctc tgccagcaga aatcgacaat 1380

atcaagaaat gatatggtct agttatacaa cattttgtca cccaaaaatt tgtgcacatt 1440

ttaattaatt gcatgtttcg gagcgcgcaa caccacaaca gaatttagag ctcgaaacat 1500

tcgggacccg atacctgaac gaatgattct ttcaatccgg ttcttttgag tgaatcaaaa 1560

gcgaacagcg cgaccactgt aattcggttt tagaactaac gattcttttg acctagttct 1620

tgtaatgaat caacaacatt caccacctta gtaaaacagt ccgattcccg aaccagtgac 1680

tcttattggc cggttctttt tcgtgaaaaa cacttatgaa tcaatcgaaa cgcttacaga 1740

attaaactca aaactcaaag aatcgcaagt tactttcgcc atatctgact cgaaacaaac 1800

tgaaaaaaat tatgttaagg ctcctgaaac ttaaatcaga gtagtagtta gtggttattc 1860

acatgacaac ttgtgttgta atcagtggta cattataaaa ataatgtttt agtattttta 1920

acataaatat aatgcaaagt gtgagaatag tcattaaaaa agcaaaaatt gtattgcctg 1980

tatttctgta ggcctatatt ggttctgctg aaatctaaaa tgatctgatg atttgctggg 2040

ggcagtaaat gtaatataaa ttgaatgaat ttcttttttc ttttttttct gttttactag 2100

aagaatcctt aatggcgcca ttaaggaatg ggaattgtta agtggaatcg taatcataat 2160

cattaaattc acatctgttt tggctagctg tagcattcgt taatggttgg acaaagcaat 2220

tttgaggtca catgagagtt gttgatagcc cattgatatt aaagtaccaa gagtaaactg 2280

aagcactggt tctttgggtt ctttctttca cagctcccct ttatggaggt gaaaatctca 2340

gagggcccaa agcgaatccg gagggactct ggactggact gcgatgagaa ttcctcagag 2400

tctcgatgct gcagataccc tctcactgtg gacttcgagg actttggctg ggactggatt 2460

attgctccga aacgctataa ggcgaattac tgttcgggag aatgcgacta catgcacctg 2520

cagaagtatc cccacaccca tctggtgaac aaggccaatc cgcgaggcac cgccgggccc 2580

tgctgcaccc ccaccaagat gtctcccatc aacatgcttt acttcaacgg caaagagcag 2640

atcatctacg gcaagatccc ctcaatggta gtagaccgct gtggctgctc gtgaaccagt 2700

gcccagacag gacttgatcc gtctcaaaga cccggacatc tgatcacacc acccaccatc 2760

cattatcagt gctttccgca agacactgtg caatagaagg acgctcactc actctctggg 2820

cactgcttca tttgactatg ttttttgtca ttttcctcta aatcagtatc tctgccacag 2880

gagtccaatg tcacaaggat atattaaagg aatgtctact ggctggactt gggaatggac 2940

actattgaaa tggacgacat tctctgc 2967

<210> 2

<211> 2666

<212> DNA

<213> 鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 2

gtattaattg catgtggtcc agtgggtaat ggagatataa cggcgcacca gcagccttcc 60

acagccacgg aggaaagcga gcagtgttcc acatgtgagt ttagacaaca cagcaagctg 120

atgagactgc atgccatcaa gtcccaaatt cttagcaaac tccgactcaa acaggctcga 180

aacatcagcc gggacgtggt caagcagctg ttacccaaag caccgccttt gcaacaactt 240

ctggatcagt acgatgttct gggggatgac agtaaggatg gagctatgga agaggatgat 300

gaacatgcca ccacagagac catcatgacc atggccacag agcgtaagga ttgtctattt 360

caaagattca ttcatgtaaa tgtatcctct taacaatgga caaagaatat gtctacttgg 420

agagaccctt tacgcagtct ttgtgcccaa gccagttgca cccacaaggc agctactggg 480

cataaaatgc acagttaaga tgtataaaga cgattcctgt ttttttgagg ctttgtgccc 540

ctcttttttt tctcagcctt gctaaagcaa ttttacgcac gctgaacatg gaagcgcggc 600

aaaagcgcac cagcgtcggt cggaagaaaa tgttttcacc tttaccacac gtgataggct 660

ataaactgta gtttaaattg gttcatatct tagccaatct tcaggttaaa atgtgtagcc 720

tattatgtgt aatgcctttt atatgtagtg tctaaatata gatattatat ctgtagccga 780

tccattcgtt tttaaaggct tctgcaatgc cgtaaagtat atgacttgca tgtctttttc 840

acttttaaaa taactacgtg cgtcatttca tggacctctt taataggcta ataaaactgt 900

cactgaaaac cagtagatcc cgtataatca ctttgattta ctttctcttc tttgtttttc 960

agctgacccc atcgttcaag tagatcggaa accgaagtgt tgttttttct ccttcagtcc 1020

gaaaatccaa gcgaaccgaa tcgtaaaagc gcagctctgg gttcatctga gaccggcgga 1080

agaagcgacc accgtcttct tacagatatc acggctgatg cccgttacgg acggaggaag 1140

acacatacga atacgatccc tgaagatcga tgtgaacgca ggtgtcacgt cttggcagag 1200

tatagacgta aagcaggtgc tctcggtgtg gttaaaacaa ccggagacca actggggcat 1260

cgagataaac gcgtatgacg cgaagggaaa cgacttggcc atcacctcag ctgaggctgg 1320

agaggatgga ctggtgagtt gagctgttgt gttaccaaat gtgcgttttt tacacaatac 1380

aaccgctttt agacagagct ctgccagcag aaatcgacaa tatcaagaaa tgatatggtc 1440

tagttataca aaattctgtc tcccaaaaat ttgtgcacat tttcattaat tgcatgtttc 1500

ggagcgcgca acacaacaga gtttagagct cgaaacattc gggacccgat acctgaacga 1560

atgattcttt caatccggtt cttttgagtg aatcaaaagc gaacagcgcg accactgtaa 1620

ttcggtttta gaactaacga ttcttttgac ctagttcttg taatgaatca acagcattca 1680

ccaccttagt agtacagtcc gattcccgaa ccagtgactc ttattggccg gttctttttc 1740

gtgaaaaaca cttatgaatc aatcgaaacg cttacagaat taaactgact caaagaatcg 1800

caagttactt tcgccatatc tgactcgaaa caaactgaaa aaaattatgt taaggctcct 1860

gaaacttaaa tcagagtagt agttagtggt tattcacatg acaacttgtc ttgtaatcag 1920

tggtacatta taaaaataat gtcttagtat ttttaacata aatataatgc aaagtgtgag 1980

aatagtcatt aaaaaagcag aaattgtatt gcctgtattt ctgtaggcct atattggttc 2040

tgctgaaatc tgaaatgatc tgatgatttg ctgggggcag taaatgcaat atgaattgaa 2100

tgaatttctt ttttttcctg ttttactaga agaatcctta atggcgccat taaggaatgg 2160

gaattgttaa gtggaatcgt aaccagaatc attaaattca catctgtttt ggctagctgt 2220

agcattcgtt aatggttgga caaagcaatt ttgaggtcac atgagagttg ttgatagccc 2280

atagatatga aagtaccaag agtaagctga agcactggtt ctttgggttc tttctctcac 2340

agctcccctt tatggaggtg aaaatctcag agggcccaaa gcgaatccgg agggactctg 2400

gactggactg cgatgagaat tcctcagagt ctcgatgctg cagataccct ctcactgtgg 2460

acttcgagga cttcggctgg gactggatta ttgctccgaa acgctataag gcgaattact 2520

gttcgggaga atgcgactac atgcacctgc agaagtatcc ccacacccat ctggtgaaca 2580

aggccaatcc gcgaggcacc gccgggccct gctgcacccc caccaagatg tctcccatca 2640

acatgcttta cttcaacggc aaagag 2666

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 3

gatgggtaaa gcagccttc 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 4

agcagagaat gtcgtccatt tc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 5

gtattaattg catgtggtcc ag 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 6

ctctttgccg ttgaagtaaa g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 7

ggcttcctcc gtggctgtga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 8

ggttctgggg gatgacagta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 9

gggatcagta cgatgttctg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 10

ggatcagtac gatgttctgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 11

ggacaaccgg agaccaactg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 12

ggatatctgt aagaagacgg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 13

gggtcttcct ccgtccgtaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 14

gggctgatgc ccgttacgga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 15

ggttctgggg gatgacagta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 16

gggatcagta cgatgttctg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 17

ggatcagtac gatgttctgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 18

ggtcatgatg gtctctgtgg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 19

ggccatggcc acagagcgta 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 20

ggagccttcc acagccacgg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 21

gggtcttcct ccgtccgtaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 22

ggatatctgt aagaagacgg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 23

gggctgatgc ccgttacgga 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 24

ggttatctcg atgccccagt 20

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 25

gagcagtgtt ccacatgtga g 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 26

ggtgacggcc aagtcatttc 20

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 27

gtattaattg catgtggtcc ag 22

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Hypophthalmichthys nobilis)

<400> 28

catacgcgtt tatctcgatg 20

Claims

1.一种鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，步骤如下：

(1)克隆鲢鱼和鳙鱼mstn基因核苷酸序列；

2.根据权利要求1所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤1)中克隆的鲢鱼mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，克隆的鳙鱼mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤1)中克隆鲢鱼mstn基因核苷酸序列的引物对为：

F:5’-GATGGGTAAAGCAGCCTTC-3’

R:5’-AGCAGAGAATGTCGTCCATTTC-3’；

所述步骤1)中克隆鳙鱼mstn基因核苷酸序列的引物对为：

F:5’-GTATTAATTGCATGTGGTCCAG-3’

R:5’-CTCTTTGCCGTTGAAGTAAAG-3’。

4.根据权利要求1所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，步骤(2)所述的基因敲除方法为TALEN法或crispr/cas9法。

5.根据权利要求4所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因敲除方法构建鲢鱼和鳙鱼mstn基因的缺失突变体品系的方法，具体为：

6.根据权利要求5所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤①中基因编辑注射的药物含Cas9 mRNA终浓度300ng/μL，sgRNA终浓度50ng/μL。

7.根据权利要求5所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤①设计的鲢鱼mstn基因敲除靶点序列为以下序列中的至少一条：

exon1-target1:5’-GGCTTCCTCCGTGGCTGTGA-3’；

exon1-target2:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’；

exon1-target3:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’；

exon1-target4:5’-GGATCAGTACGATGTTCTGG-3’；

exon2-target1:5’-GGACAACCGGAGACCAACTG-3’；

exon2-target2:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’；

exon2-target3:5’-GGGTCTTCCTCCGTCCGTAA-3’；

exon2-target4:5’-GGGCTGATGCCCGTTACGGA-3’；

exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’；

exon1-target2:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’；

exon1-target3:5’-GGATCAGTACGATGTTCTGG-3’；

exon1-target4:5’-GGTCATGATGGTCTCTGTGG-3’；

exon1-target5:5’-GGCCATGGCCACAGAGCGTA-3’；

exon1-target6:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’；

exon2-target1:5’-GGGTCTTCCTCCGTCCGTAA-3’；

exon2-target2:5’-GGATATCTGTAAGAAGACGG-3’；

exon2-target3:5’-GGGCTGATGCCCGTTACGGA-3’；

exon2-target4:5’-GGTTATCTCGATGCCCCAGT-3’。

8.根据权利要求5所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤③中鲢鱼检测所用引物为：

T1:5’-GAGCAGTGTTCCACATGTGAG-3’；

T2:5’-GGTGACGGCCAAGTCATTTC-3’；

所述步骤③中鳙鱼检测所用引物为：

T1:5’-GTATTAATTGCATGTGGTCCAG-3’；

T2:5’-CATACGCGTTTATCTCGATG-3’。

9.根据权利要求5所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于：步骤②所述的注射促黄体生成素释放激素类似物LRH-A的注射剂量为10μg/kg。

10.根据权利要求1～9任一项所述鲢鱼和鳙鱼肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于：所述步骤(3)中检测肌间刺变化的方法为鱼类硬骨染色和体外分离肌间刺，其中硬骨染色采用茜素红染色法。