KR102301324B1 - 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 - Google Patents

Abstract

마이크로새틀라이트 마커 PlYo15, PlYo69, PlYo144, PlYo184, PlYo83, PlYo185, PlYo14, PlYo182의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제1세트와; 마이크로새틀라이트 마커 PlYo32, PlYo51, PlYo70, PlYo152, PlYo27, PlYo169, PlYo41, PlYo57의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제2세트;를 포함하여 문치가자미(Limanda yokohamae) 친자를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공함으로써, 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 문치가자미의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사 등에 적용할 수 있는 효과가 있다.

Description

문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 {Genetic marker for parentage and thereof in Limanda yokohamae}

본 발명은 문치가자미에 대한 선발, 교배지침, 유전적다양성 및 혈연 관계를 과학적으로 빠르고 쉽게 알 수 있도록 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 NGS(Next-Generation Sequencing)를 수행하여 대량의 염기서열정보를 확보하고 microsatellite region(초위성체 부위)를 발굴하여 시간과 비용절감이 가능한 동시 증폭 마커(multiplex PCR set)를 제공함으로써 문치가자미에 대한 정확한 유전형분석으로 방류효과조사, 선발육종, 교배지침 등 전반적인 분자유전학적 연구를 과학적이고 체계적으로 수행 가능한 문치가자미(Limanda yokohamae) 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관한 것이다.

가자미과에 속하는 문치가자미는 우리나라, 일본, 대만, 중국 등지에 분포하며 동일 속의 4종과 달리 우리나라 남, 서해안에서만 서식한다. 우리나라 서해안에서는 북위 37ㅀ를 경계로 하계 및 동계 분포가 뚜렷하게 구분되는 계절 회유성 어종으로 수컷과 암컷 각각 체장 약 30cm와 50cm까지 성장한다.일반적으로 가자미는 넙치와 같은 목이지만, 넙치와는 눈의 기울어진 방향이 반대쪽이다. 넙치와 가자미를 구분하는 방법으로는 넙치와 가자미가 사람이 얼굴을 마주보는 방향에서 어안이 왼쪽으로 쏠리면 넙치이고 오른쪽으로 올리면 가자미로 구분할 수 있다.

문치가자미는 많은 가자미와 어류와 마찬가지로 낚시, 자망, 새우조망 등에 의해 어획되며 회, 구이 등의 식재료로 전국의 위판장, 어시장에서 연중 높은 가격으로 거래될 만큼 상업적 가치가 높은 수산자원이다. 통상적인 가자미과 어류 중 많은 종들은 고급 식재료로써 이용가치가 높아 인공수정, 치어방류 등을 통하여 자원관리를 하고 있지만 무치가자미는 아직까지 효율적인 자원관리가 이루어지지 못하는 실정이다. 이에 산업 경재력 확보를 위해서는 육종기술에 의한 우량 양식품종 개발이 필요하다.

선발육종은 기존의 양식품종을 유전적으로 우수한 개체나 집단을 선발해 이들의 자손을 보다 우수한 품종으로 개량하는 것이다. 이는 기존 품종의 개량에만 국한되는 것이 아니라 실용가치가 높은 계통이나 품종을 새롭게 개발해 산업화하는 것까지 포함된다. 선발 육종에 따른 유전적 개량량은 세대를 거듭할수록 누진적으로 커지게 되어 생산성을 지속적으로 제고시킬 수 있으며 넙치양식의 질적 표현형이 양식물의 가치와 생산비용에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 어류는 일회 산란수가 많고 표현형(phenotype)의 유전적 변이가 커서 선발육종에 의한 유전적 개량에 이점을 가지고 있어 체중, 체장 등 어류의 주요 계측형질들은 생산성 관련 형질로써 직접 선발에 이용되어 질 수 있다.

더욱이, FTA에 따른 양식업의 경쟁력 확보를 위한 우량 종묘 및 수산물의 경제적 부가가치를 높이는 것이 절실한 상황에서 현재 수산생물 육종기술 도입 및 활용은 매우 미비한 상태로 수산양식종의 지속적 개량 및 소득 증대를 위해서는 DNA 마커를 활용한 분자육종 기술방법 개발이 필요하다.

유전자 표지자(genetic marker)는 DNA서열로 생물에서 염색체의 알려진 위치를 확인 할 수 있는 수단으로 생물 종에 대한 유전적인 특성을 분석할 수 있는 기술로 유전자원 보존을 위한 평가 연구에 활용될 수 있다. 유전자 표지자는 유전자 좌위에 있는 돌연변이나 변형에 의해 일어난 다양성을 보여줄 수 있다. 유전자 표지자는 짧은 DNA서열로, 예를 들어 하나의 염기의 변화로 생긴 단일 염기 다형성(SNP), RFLP(제한효소 절편길이 다형성; Restriction fragment length polymorphism) , SSLP (단순 염기서열 길이 다형성; Simple sequence length polymorphism), AFLP(유전자 증폭산물 길이 다형성; Amplified fragment length polymorphism), RAPD(DNA 다형성 무작위 증폭; Random amplification of polymorphic DNA) VNTR(가변수 직렬반복; Variable number tandem repeat) SSR(단순 서열 반복; Simple sequence repeat) 같은 것들이 있다.

SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 1~6 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다. 이에 유전체상의 빈번한 분포, 높은 변별력 및 검출이 간편하여 유전적 다양성과 유연관계를 평가하고 집단유전학, 친자확인 및 개체식별에 있어 유용한 DNA마커로서 많이 이용되고 있으며 수산분야 역시 SSR 마커를 이용한 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 이용되고 있다.

일반적으로 사람 및 동물에서처럼 많은 유전체 연구가 진행된 경우는 데이터베이스상에서 SSR 정보를 확인 및 선발을 통해 마커 개발이 가능하나 수산분야에서는 현재 많은 유전체분석 연구가 진행되지 않아 직접 대량의 염기서열 데이터 정보를 확보하고 목적에 맞는 마커를 발굴해 나아가야 한다.

최근에는 수산전문기관에서 각 수산 종에 대한 NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)분석 뿐만 아니라 다른 여러 유전체분석 방법을 이용하여 목적에 맞는 마커 발굴 및 개발을 진행하고 있다. 우선적으로는 확보되는 전장유전체염기서열을 이용하여 SSR 영역을 탐색하고 변별력, 효율성, 정확성 등을 검증함으로써 SSR 마커를 개발하고 있는 추세이다. 또한 많은 종에 대한 판별 및 집단, 계통분석, 친자확인 등에 과학적인 조사 방법으로 이용이되고 있어 마커 개발의 당위성이 높아지고 있다.

이에 국내 공개특허공보 제10-2019-0135789호에는 넙치 개체의 SSR부위를 찾아내고 동시에 증폭할 수 있는 마커를 개발하여 넙치친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법을 제공하고 있으나, 상기 목표어종은 넙치로서 본 발명과는 차이가 있어 본 발명은 NGS를 이용하여 문치가자미의 염기서열을 밝혀내고 SSR 부위를 이용한 친자확인, 집단구조분석, 선발, 가계분석 등에 대한 마커를 제공하고자 한다.

국내 공개특허공보 제10-2019-0135789호에는 차세대시퀀싱(NGS) 기반으로 넙치 개체의 SSR 부위를 찾아내고 동시에 증폭할 수 있는 마커를 개발하여 해당 마커를 통해 유전형을 분석하고 넙치 친자관계 및 혈연 관계의 식별이 가능한 넙치 친자 및 혈연 관계 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법을 제공함으로써 개발한 마커의 부위는 변별력이높고 증폭률이 우수한 마커로서, 해당 마커를 이용하여 유전자형을 분석할 시 친자확인을 위한 기초데이터 생산과 더불어, 보다 높은 친자감별이 가능한 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법을 제공하고자 한다. 국내 등록특허번호 제10-1211068호에는 어류에서 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을, 서열번호 7 내지 서열번호 77 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 어류가 속하는 종을 판별하는 단계;를 포함하는 대한민국 남해 어류의 종 판별 방법과 이에 따른 어류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ＤＮＡ 칩 및 키트에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1418139호에는 Figα는 넙치의 암컷에서 특이적으로만 발현되며, Scp3 유전자는 넙치의 수컷에서만 특이적으로 발현되는 것으로 확인됨에 따라 Figα 또는 Scp3 유전자를 넙치 성 판별용 마커유전자로 사용할 경우, 외부형태학적인 성 판별이 불가능한 넙치의 암수 구별을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있는 넙치 성 판별용 조성물 및 성 판별 방법에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-2000878호에는 HRM-PCR용 마커로 실시간연쇄중합효소반응인 real-time PCR을 기반으로 증폭하여 3~4 시간 안에 쉽고 빠르게 암수 구별에 대한 결과를 도출할 수 있으며 매우 소량의 DNA만 으로도 결과확인이 가능한 효과가 있는 넙치 암수판별용 마커 및 이를 이용한 넙치 암수판별용 마커 및 HRM-PCR 분석방법에 관하여 개시하고 있다.

본 발명은 문치가자미의 집단간의 유전적 차이와 분자생물학적 유연관계를 분석하여 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 문치가자미의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사 등에 적용할 수 있는 문치가자미(Limanda yokohamae) 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 문치가자미(Limanda yokohamae) 친자를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물은 마이크로새틀라이트 마커 PlYo15, PlYo69, PlYo144, PlYo184, PlYo83, PlYo185, PlYo14, PlYo182의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제1세트와; 마이크로새틀라이트 마커 PlYo32, PlYo51, PlYo70, PlYo152, PlYo27, PlYo169, PlYo41, PlYo57의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제2세트를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따른 문치가자미(Limanda yokohamae) 친자 식별용 프라이머 세트는 PlYo15, PlYo69, PlYo144, PlYo184, PlYo83, PlYo185, PlYo14, PlYo182의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍과 PlYo32, PlYo51, PlYo70, PlYo152, PlYo27, PlYo169, PlYo41, PlYo57의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 문치가자미(Limanda yokohamae) 친자 식별용 프라이머 세트를 이용한 문치가자미(Limanda yokohamae) 친자 확인방법을 제공하는 것일 수 있다.

8개의 마커를 1set로 구성하여 총 2set를 동시에 증폭할 수 있는 multiplex PCR set를 개발함으로써 빠르고 신속하게 분석이 가능하고 식별력, 증폭효율, 안정성, 마커의 다양성이 우수하며 친자확인을 위한 식별력은 1.14 x 10-14으로 매우 높아 다양성이 확보된 문치가자미의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사 등에 적용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 문치가자미 multiplex PCR set 조합을 나타낸다.
도 2 는 마커별 대립유전자 빈도를 비교한 그래프를 나타낸다.
도 3은 마커별 대립유전자 빈도를 비교한 그래프를 나타낸다.
도 4는 마커 식별력을 위한 계산식을 나타낸다.
도 5는 문치가자미 부모개체 유전자형 분석결과를 나타낸다.
도 6은 문치가자미 자식개체 유전자형 분석결과를 나타낸다.
도 7은 문치가자미 친자확인 유전형 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 Log likelihood ratio (친자지수) 를 이용한 정규분포를 나타낸다.
도 9는 False positive & False negative에 대한 분석 결과를 나타낸다.

본 발명의 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.

본 발명의 Simple sequence repeats (SSR)로도 불리는 microsatellite는 non-coding 부위에 존재하는 1-6 bp의 단순 염기서열이 반복되는 부분으로 유전체상의 빈번한 분포, 높은 변별력 및 검출이 간편한 마커로써 집단유전학, 유연관계 분석, 친자확인 및 개체식별에 있어 유용한 DNA 마커를 지칭한다.

본 발명에서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함시키는 데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

멀티플레스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 쌍을 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 억제 (inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머 들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머 마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용 시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 쌍 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.

본 발명에서 "프라이머(Primer)"는 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 여기에 정의된 프라이머들이라는 용어는 DNA의 합성을 준비할 수 있는 DNA 가닥들을 말한다. DNA 중합효소(polymerase)는 프라이머 없이 처음부터 DNA를 합성할 수 없다. DNA 중합효소는 오직 상보적인 가닥이 조립되는 뉴클레오티드들의 순서를 지시하기 위한 주형으로서 사용되는 반응에서 존재하는 DNA 가닥을 연장할 수 있다. 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일가닥이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형된 뉴클레오타이드 또는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱"은 많은 양의 리드들(reads), 전형적으로 동시에 몇 백보다 많은 수천 또는 수많은 서열 리드들의 순서를 발생시킬 수 있는 시퀀싱 기술이다. 차세대 시퀀싱은 고식적 생거 또는 모세관 시퀀싱(capillary sequencing)으로부터 구별되고 그리고 분명하다. 전형적으로, 서열화된 산물들은 전형적으로 대략 600~30 염기쌍 사이에서, 상대적으로 짧은 리드들을 가진다. 상기 기술들은 전형적으로 추가적으로 광범위하고 그리고 정교한 데이터 저장 및 리드 조립(read assembly) 등을 위한 데이터처리 작업 흐름을 구성한다.

분석 대상종의 염기서열 정보가 충분히 밝혀진 경우에는 SSR 정보를 직접 탐색하여 마커를 개발할 수 있으나, 염기서열 정보가 불충분한 경우 새로운 영역을 개발해야만 한다. 이를 개발하기 위해 최근에는 NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)를 이용하여 마커 개발 대상종으로부터 대량의 염기서열 정보를 분석하고, SSR 영역을 직접 탐색함으로써 SSR 마커를 개발하는 방법이 이용하고 있다. 초기의 대규모 시퀀싱의 경우, 고비용으로 시간도 오래 걸렸으나 기술의 발전으로 더욱 빠르고 저렴하게 분석되어 많은 종의 유전자를 밝히는 데 이용되고 있으며 SSR 마커가 개발되지 않은 수산종에 대하여 NGS를 이용한 염기서열 확보와 microsatellite마커 개발의 당위성이 높아지고 있다

본 발명은 NGS를 이용하여 문치가자미의 염기서열을 밝혀내고 SSR 부위를 이용한 친자확인, 집단구조분석, 선발, 가계분석 등에 적용할 수 있는 마커를 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 선발된 16개의 동시다중증폭마커세트(Multiplex PCR set)는 식별력, 증폭효율, 안정성, 마커의 다양성이 우수하며 친자확인을 위한 식별력은 1.14 x 10-14으로 매우 높다. 또한 8개의 마커를 1set로 구성하여 총 2set를 동시에 증폭할 수 있는 multiplex PCR set로써, 보다 빠르고 신속하게 분석이 가능한 효과가 있다. 이하, 본 발명을 첨부한 도면과 함께 실험예로서 상세히 설명하면 다음과 같다.

<실험예 1> 문치 가자미 DNA 추출

문치 가자미 게놈 DNA를 추출하고 차세대염기서열분석법( NGS; next generation sequencing)을 실시하기 위해서 High quality DNA를 추출하였다. 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법 또는 Wizard　Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 이용하여 수행하였다.

차세대염기서열분석법(NGS; Next-Generation Sequencing) 수행 시 정확한 데이터 생산을 위해 High quality DNA 추출을 진행하였다. High quality DNA를 추출하기 위해서는 샘플 수령 후 다음 날 즉시 채취된 조직의 약 1 cm² 내외로 절단하고 멸균 3차 증류수로 세정 후 Promega사의 Wiazard DNA 추출키트를 이용하여 진행하였다.

<실험예 2> DNA Library 제작

DNA library 제작은 Quality 높은 Raw data를 생산하기 위하여 Library QC(Quality control) test를 실시하였으며 Agilent 사의 2100 BioAnalyzer를 사용하여 확인하였다.

Library QC를 통과하는 농도 기준인 Total volume이 10ug일 때 최소 5nM 이상 되도록 하였으며 Library QC가 통과 후 de novo assembly를 진행하였다. Illumina sequencer 인 Hiseq4000을 이용하여 넙치의 NGS raw data를 생산하였으며 총 데이터 생산량은 genome size의 15배 이상인 15Gb이상 생산하였다. 생산 된 Total base reads를 확인 한 후 Q20에 해당하는 data를 filter 하여 정렬하였다.

<실험예 3> 가자미 친자식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 선발

3-1 SSR 영역 마커 제작

Q-score는 염기를 호출할 때 발생할 수 있는 오류 가능성에 대한 대수적인 수치라 볼 수 있으며 Q20은 염기 100개를 불러올 때 1개의 염기를 잘 못 불러올 확률로 99%의 정확성을 나타낼 확률이다. 생산된 data는 Q20이 90%이상인 reads만 남기고 필터링을 실시하고 De novo assembly 후 SSR region만 선별하며 Primer3(version 0.4.0) program을 이용하며 해당 지역의 marker를 design하였다. 동시 증폭을 위해서 Annealing temperature은 58~60℃로 맞추며 GC contents은 40~60%, product size는 100~350bp 마커를 디자인하였다.

최종 선발되는 마커는 모든 분석을 마친 후에 되므로 사이즈별 구간을 나누어 random 하게 형광 Dye를 부착하였다. labeled primer는 정방향 올리고 (forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지의 형광물질을 부착하고 증폭물의 크기가 서로 중복될 경우 형광물질 색으로 구분할 수 있도록 다른 색의 형광물질로 표지시켰다. 또한, PCR 조합은 각 마커 간에 사이즈가 오버랩 되지 않으며 형광 dye가 겹치지 않도록 임의조합을 구성하고 진행하였다.

3-2 마커 특이적 프라이머 제작

상기 3-1에 따라 문치가자미에 대해 개발된 동시 증폭(Multiplex) 유전자 마커 정보는 다음과 같다. 하기의 표 1은 문치가자미 SSR marker set-A 정보를 나타내고 표 2는 문치가자미 SSR marker set-B 정보를 나타낸다. 도 1은 문치가자미 multiplex PCR set 조합을 나타낸다.

문치가자미 SSR marker set-A 정보

Dye	서열번호	Name	Sequence(5' to 3')	Repeat Motif	Size range
FAM	1	PlYo15_F	AAGGGCTATAGAAATGCAGTCC	AGA	143~233
	2	PlYo15_R	GAGTGGCAACCAACGTCAAC
	3	PlYo69_F	CCAGTTCAGATGGTGGCAGT	GAA	254~323
	4	PlYo69_R	TGCTGCACACAGGAGGATTT
VIC	5	PlYo144_F	TTTAAGGGCTGTGACCCTTC	ATAG	185~209
	6	PlYo144_R	TCAATGGTGGAGATCTGCTG
	7	PlYo184_F	TCGAGGTCACAAGCTTGTCC	AGAA	294~370
	8	PlYo184_R	GAATGTATCCTCAGAGAGTCACAGG
NED	9	PlYo83_F	AGAAAAGTGGTGAGGCAGCA	AGG	148~184
	10	PlYo83_R	ACAGACGGCACGAAATACAGAA
	11	PlYo185_F	AGTGTGCGGACATTCACTGA	TATC	294~378
	12	PlYo185_R	TGCACTGTGTGGTTGCCTAT
PET	13	PlYo14_F	GAGATCTACAGCTGGTAAGATTGTGTG	CTT	135~174
	14	PlYo14_R	TGGCAGCTTGACCAACTGAT
	15	PlYo182_F	CCTTCAAATATCAGACAATCTTAGCC	ATGG	311~331
	16	PlYo182_R	GCTGTGAGAGCTGTGACAGT

문치가자미 SSR marker set-B 정보

Dye	서열번호	Name	Sequence(5' to 3')	Repeat Motif	Size range
FAM	17	PlYo32_F	GGCTCTTGCGTGATATGTCC	TGT	89~107
	18	PlYo32_R	TGGTCAAAGTGCTACAGCAACT
	19	PlYo51_F	TGAAGGGCCTTTGACGTCTC	GCA	192~258
	20	PlYo51_R	AGCCCAAAGGTGTTCTCTGG
VIC	21	PlYo70_F	ACAGGAACTCGAGCTTCTCC	TCC	146~173
	22	PlYo70_R	CCTCTCAGACGCTACAGACTAA
	23	PlYo152_F	CTCTGGACTCGTGGTTTCCA	CAGA	208~260
	24	PlYo152_R	TTCATTGGTACCAGGCATGA
NED	25	PlYo27_F	TCAAACATCCACAGTGAGGCCT	GAT	128~194
	26	PlYo27_R	GAGTGCAGGGGAGGACATTT
	27	PlYo169_F	CAAGCTACTGGATGATCTGAATTTCC	TATC	284~352
	28	PlYo169_R	GCAGCTTTCATGCACCCAAA
PET	29	PlYo41_F	CGTTGGTTGACTTGCAGGTG	CAG	177~189
	30	PlYo41_R	CCGTCTGACTTCTTGGTGCT
	31	PlYo57_F	CCCAGTGGTCGAACAGAATTATTTGAG	TGT	224~254
	32	PlYo57_R	TTTACAACCCGGAGTCGTCC

<실시예 4> 동시증폭 중합효소 연쇄반응 (Multiplex PCR 증폭)

16개의 marker를 포함한 Multiplex PCR 2set을 이용하여 유전형분석을 실시하였다. 동시 증폭(multiplexPCR)의 경우 annealing temperature에 따른 영향 및 시약 농도의 영향을 많이 받게 된다.

PCR 시약의 조성으로는 하나의 샘플 당 DNA template의 경우 1ul(100ng/ul), 10X buffer 1.5ul, dNTP(10mM) 1.5ul, Hot-taq polymerase(2.5U/ul) 0.6ul를 혼합하였으며, 형광이 표지된 마커의 A 세트의 경우 PlYo15는 0.15ul, PlYo69는 0.35ul, PlYo144은 0.2ul, PlYo184는 0.4ul, PlYo83는 0.1ul PlYo185는 0.35ul, PlYo14는 0.15ul, PlYo182는 0.25ul로 구성되었으며 B세트의 경우는 PlYo32는 0.15ul, PlYo51는 0.3ul, PlYo152은 0.25ul, PlYo70은 0.1ul, PlYo27은 0.1ul PlYo169는 0.3ul, PlYo57는 0.2ul, PlYo41는 0.12ul로 구성하여 primer mixture로 만들어 사용하였다.

총량이 15ul가 되도록 증류수(distilled water)를 넣어주었다. PCR 조건은 touch-down PCR 방식으로 온도를 낮춰주며 annealing temperature에 따른 영향을 최소화하였다. 95℃에서 10분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 첫번째 단계로 94℃에서 1분; 58℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 5 싸이클로 반복 수행하고, 두번째 단계로 94℃에서 1분; 57℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 5 싸이클, 세번째로 94℃에서 1분; 56℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 25 싸이클로 반복 수행하였다. 마지막으로 65℃에서 5분 간 최종신장반응을 시켜 준 후 8℃로 마무리하였다.

<실시예 5> 유전자형 분석 (Genotyping analysis)

상기 실시예 4의 방법으로 수득한 증폭이 완료된 PCR 산물은 30X dilution 시킨 후, 증폭산물 1㎕와 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 및 Hi-Di Formaide (Applied Biosystems, USA) 혼합물을 1:9로 희석하여 분석을 위한 시료로 사용하였다.

상기 시료는 자동염기서열 분석장치인 3730xl DNA Analyzer(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동하였다. 각 마커에 대한 표준 allele ladder를 제작하여 GeneMapper version 4.0(ThermoFisher Scientific, USA)등 분석프로그램을 이용하여 모든 개체를 scoring하고 크기와 표식자의 종류별로 분류하여 자료를 취합하고 분석하였다.

도 2 내지 도 3은 마커별 대립유전자 빈도를 비교한 그래프를 나타낸다. 각 마커 별로 사이즈가 오버랩되는 부위의 마커는 표지된 형광염료 색 차이로 구분될 수 있으며 파란색으로 나타나는 피크는 FAM, 초록색으로 나타나는 피크는 VIC, 노란색으로 나타나는 피크는 NED, 붉은색으로 나타나는 피크는 PET이며 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 를 이용하여 각 마커에 대한 증폭 사이즈(bp)를 알 수 있었다. 각 마커에 대한 빈도를 확인한 결과 전체적으로 안정적인 빈도분포가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 마커에 대한 다형성정보지수 및 유전적 다양성 분석

개발된 문치가자미의 multiplex PCR set를 이용하여 총 100개체의 유전적 다양성 및 집단유전학적 분석을 실시하였다. 대립유전자의 수는 평균 14.13개로 높게 나타났다. 대립유전자 수 보정치(allele richness)를 적용하여 분석한 결과도 평균 14.11개로 대립유전자의 수(K)와 유사하게 나타나 증폭효율성면에서도 매우 우수한 것을 알 수 있다. 다형성정보지수(PIC)는 부모로부터 자손에 전달되는 대립유전자를 구별해 낼 수 있는 확률로 다시 말하면 부, 모, 자손의 유전자형을 가지고 측정하는 것으로 개체식별의 측면에서 보았을 때 다양성의 측도라고 할 수 있다. 개발된 16개의 마커에 대한 값은 평균 0.762로 매우 식별력이 높은 마커라는 것이 확인되었다.

<실험예 7> 친자확인 분석 및 혈연관계 분석위한 마커 식별력 검증

친자확인 분석(parentage analysis) 및 혈연관계 분석을 위한 마커 식별력 검증하기 위해 가축이나 어류에서 친자확인법은 주로 maximum likelihood 방법을 사용하게 되며, 이는 여러 유전형을 통해 통계적으로 분석하는 방법이다. 여기서 중요한 것은 사용되는 마커가 높은 식별력을 가지는 정확한 마커를 사용해야하며 식별력 계산은 다음 계산식으로 실시하였다.

<식별력 계산 공식>

하기의 표 3은 마커별 식별력을 계산한 값을 나타낸다. 문치가자미 100개체 분석 결과에 대한 2개의 multiplex PCR set의 exclusion power를 계산 및 분석하였다. 마커 전체의 exclusion power는 1.438X10^-14으로 높은 변별력을 나타내었으며, 이는 99.99999999 이상의 신뢰수준이 높다는 것을 말한다.

그러나 추가 개체에 대한 분석이 이루어질 경우 큰 범위는 아니지만 어느 정도의 오차는 생길 가능성이 있지만 전체적으로 각 마커들이 특정 유전형에 편중된 것이 아닌 것으로 보아 마커의 식별력은 우수한 것으로 사료된다.

따라서 이후에는 본 개발 마커를 이용하여 재포획률 조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 사용 가능한 마커로 나타났으며 이후 실제 친자개체를 이용한 마커 set 실 검증 및 통계적 기준인 LOD Score(log of likelihood ratio, 관계지수 로그 값)를 산정하여 실제 판정기준이 필요할 것으로 사료된다.

마커별 식별력 계산 값

Maker	Power of each marker
PIYo_14(Tri)	0.2033
PIYo_144(Te)	0.3064
PIYo_15(Tri)	0.2435
PIYo_182(Te)	0.5936
PIYo_184(Te)	0.1243
PIYo_185(Te)	0.1513
PIYo_69(Tri)	0.0659
PIYo_83(Tri)	0.2103
PIYo_152(Te)	0.4560
PIYo_169(Te)	0.2009
PIYo_27(Tri)	0.1246
PIYo_32(Tri)	0.3862
PIYo_41(Tri)	0.3216
PIYo_51(Tri)	0.1097
PIYo_57(Tri)	0.1423
PIYo_70(Tri)	0.3604
Exclusion Power	1.873E-0011

<실험예 8> 개발된 16마커를 이용한 친자확인 분석(parentage analysis)

8-1. 친자확인 정확성 확인을 위한 문치가자미 부모-자식 샘플 분석

8-1-1. 부모개체(PIYO_P)

도 5는 문치가자미 부모개체 유전자형 분석결과를 나타낸다. 부모집단은 PIYO_P로 명명하며 1번개체의 경우 PIYO_P_001로 명명하고 상기의 개발된 16개 마커에 대한 친자관계검정 정확도를 분석하기 위해 부모집단 27미에 대한 유전자형 분석을 실시하였다. 분석 방법은 상기에 개발된 16개의 동시증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 유전자형 분석을 진행하였다.

8-1-2. 자식개체(PIYO_J)

도 6은 문치가자미 자식개체 유전자형 분석결과를 나타낸다. 부모 PIYO_P 집단의 개체 간 교배를 통해 생산된 종자 183미를 무작위로 채취하여 상기의 개발된 16개 마커에 대한 친자관계검정 정확도를 분석하기 위해 유전자형 분석을 실시하였다. 분석 방법은 상기에 개발된 16개의 동시증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 유전자형 분석을 진행하였다.

8-2. 친자확인 분석 및 통계적 분석

일반적으로 parentage analysis (=친자확인)은 통계분석 및 친자확인을 통해 방류 종자 생산에 참여한 어미와 시료간의 친자확인을 통해 혼획률을 산정하는 것이다. 통상적으로 친자확인 분석에서 사용되는 통계적인 친자확인 방법은 휴먼에러를 허용하여 통계적으로 접근하는 Maximum likelihood ratio (Log of likelihood ratio)방법과 1개의 allele 에서라도 상이한 경우 친자관계에서 제외하는 exclusion 방법을 사용한다.

Exclusion 방법의 경우는 사람의 재난, 재해, 법의학적 증거자료 등으로서 이용이 대부분 되고 있기 때문에 false positive 혹은 negative 가 있어서는 안 되기 때문이며 통상적으로는 16개에 대한 분석 및 대조가 이루어진다.

Maximum Log of likelihood ratio를 이용하는 방법은 allele의 matching에 있어서 일부 휴먼에러 및 돌연변이로 인한 에러를 허용하고 통계적인 신뢰도 결과를 바탕으로 분석하는 것으로, 가축, 식물, 수산생물 등 에서는 법적자료, 이산가족 확인 등과 같은 강력한 증거자료로 이용되기보다는 선발 육종, 방류효과조사, 개체선발, 세대생산 등을 위한 통계적인 평가 도구로서 사용되기 때문에 수산생물에서 주로 사용된다.

수산생물의 특성상(변온동물) 사람보다는 많은 variation과 돌연변이들이 존재하기 때문에 누적대립유전자빈도(allele frequency) 및 확률을 이용하여 통계적인 친자확인을 하는 것이 적절하다. Maximum Likelihood 방법은 통계적인 처리를 통하여 (대부분 LOD score = loge T/P, T= transmission probability, P= frequency of offspring genotypes in the population) 가장 높은 통계적 확률을 가진 부모에게로 친자확인이 된다.

이것은 많은 데이터를 분석해야 하는 자연집단의 경우에 유리하며 약간의 genotyping error와 mutation 가능성도 수용 가능하기 때문에 수산생물의 자연집단의 친자확인 등 분석에는 더 강력한 방법이 된다. 특히 부모 또는 offspring의 수가 많은 경우 친자확인에 더 좋은 방법이 된다.

본 발명에서는 통상적으로 사용되고 있는 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 수치를 도출하였으며 어미에 대한 유전정보 및 자식 개체에 대해 친자확인(parentage analysis)을 진행 시 친자관계가 성립되는 개체에 대한 likelihood ratio를 산정하고 성립되지 않는 개체들에 대한 simulation을 통한 likelihood ratio 결과 값을 비교 분석, 정규분포, false-positive & negative에 대한 threshold를 설정하였으며 본 발명에 따른 마커를 이용하여 친자관계 확인 시 mismatch 허용 기준과 threshold 기준을 이용한 기준 값도 동시에 설정하였다.

결론적으로는 mismatch를 무작정 허용하는 것은 과학적인 근거와 설명을 하기에는 부족하기 때문에 상기 두 가지 방법을 유기적으로 이용하여 결과 확인 및 검증을 시행하였다. 또한 추가적으로는 수산분야에서는 정확한 통계적 기준이 없으므로 아래의 그림과 같이 통계적인 기준 값 적용을 위해 친자 개체 및 친자개체가 아닌 likelihood ratio 값에 대한 정규분포를 작성하여 False positive & False negative를 최소화하는 threshold 값을 확립하였다.

도 7은 문치가자미 친자확인 유전형 분석 결과를 나타내고 하기의 표 4는 문치가자미 종자 173미, 부모 27미에 대한 실제 친자검출 정확도 결과를 나타낸다. 개발된 유전자 마커에 대한 SSR 부위의 반복 수는 멘델 법칙에 의해 자손에게 유전되며, 부모 집단의 유전자형과 비교하여 친자 확인이 가능하다. 부모 27개체와 종자 173개체에 대한 친자확인 결과 mismatch '1'을 기준으로 하였을 때 모두 친자확인이 가능하였으며 이 173개 중 1개체만이 1개의 mismatch가 나타났다.

문치 가자미 부모에 대한 실제 친자검출 정확도 결과

	분석(%)	분석 적용 기준
분석 마리수	173(100%)	부모, 자식개체 200미 분석
유전형 분석 수	173(100%)	마커16개 중 12개 이상 분석
가계확인 수	173(100%)	종자 173미 MISMATCH 1미만

도 8은 통계적인 결과 값인 Log likelihood ratio 값에 대한 정규분포를 나타낸다. 도 8에 도시된 바와 같이, 친자확인 개체와 친자가 아닌 그룹에 대한 정규분포 통계분석을 실시 한 결과 오버랩되는 값이 1%미만으로 나타났으며 이는 향후 방류효과조사 및 선발육종 등에서 친자확인을 위한 마커로서의 높은 정확도(99%이상)로 이용이 가능하다는 것을 나타낸다.

도 9는 False positive & False negative에 대한 분석 결과를 나타낸다. 도 9에 도시된 바와 같이, 친자확인그룹 및 친자가 아닌 그룹에 대한 위양성(False positive) & 위음성(False negative)에 대한 값을 도출하였으며 log 값이 '0'일 경우 위양성 에러율 0.5%이며 위음성 에러율의 경우 0.01% 미만으로 낮게 나타났으며 이는 정확도 및 신뢰도가99% 이상이라는 의미이다. 따라서 본 발명에 따른 16개의 마커를 이용하여 향후 방류효과조사에서 99% 이상의 정확도로 친자를 확인할 수 있어 정확하고 신뢰성이 높은 결과를 도출 가능할 것으로 사료된다.

본 발명에 따른 문치가자미 친자 식별 마커 및 친자 식별방법은 문치가자미의 집단, 계통분석, 친자 확인 등에 적용하여 높은 계통이나 품종을 새롭게 개발할 수 있도록 기본 데이터 베이스를 제공함으로써, 고부가 가치의 문치가자미 생산에 기여함으로 산업상 이용가능성이 있다.

<110> Gyeongsangbuk-do <120> Genetic marker for parentage and thereof in Limanda yokohamae <130> p19-0711014 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo15_forward primer <400> 1 aagggctata gaaatgcagt cc 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo15_reverse primer <400> 2 gagtggcaac caacgtcaac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo69_forward primer <400> 3 ccagttcaga tggtggcagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo69_reverse primer <400> 4 tgctgcacac aggaggattt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo144_forward primer <400> 5 tttaagggct gtgacccttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo144_reverse primer <400> 6 tcaatggtgg agatctgctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo184_forward primer <400> 7 tcgaggtcac aagcttgtcc 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo184_reverse primer <400> 8 gaatgtatcc tcagagagtc acagg 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo83_forward primer <400> 9 agaaaagtgg tgaggcagca 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo83_reverse primer <400> 10 acagacggca cgaaatacag aa 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo185_forward primer <400> 11 agtgtgcgga cattcactga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo185_reverse primer <400> 12 tgcactgtgt ggttgcctat 20 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo14_forward primer <400> 13 gagatctaca gctggtaaga ttgtgtg 27 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo14_reverse primer <400> 14 tggcagcttg accaactgat 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo182_forward primer <400> 15 ccttcaaata tcagacaatc ttagcc 26 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo182_reverse primer <400> 16 gctgtgagag ctgtgacagt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo32_forward primer <400> 17 ggctcttgcg tgatatgtcc 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo32_reverse primer <400> 18 tggtcaaagt gctacagcaa ct 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo51_forward primer <400> 19 tgaagggcct ttgacgtctc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo51_reverse primer <400> 20 agcccaaagg tgttctctgg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo70_forward primer <400> 21 acaggaactc gagcttctcc 20 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo70_reverse primer <400> 22 cctctcagac gctacagact aa 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo152_forward primer <400> 23 ctctggactc gtggtttcca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo152_reverse primer <400> 24 ttcattggta ccaggcatga 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo27_forward primer <400> 25 tcaaacatcc acagtgaggc ct 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo27_reverse primer <400> 26 gagtgcaggg gaggacattt 20 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo169_forward primer <400> 27 caagctactg gatgatctga atttcc 26 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo169_reverse primer <400> 28 gcagctttca tgcacccaaa 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo41_forward primer <400> 29 cgttggttga cttgcaggtg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo41_reverse primer <400> 30 ccgtctgact tcttggtgct 20 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo57_forward primer <400> 31 cccagtggtc gaacagaatt atttgag 27 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlYo57_reverse primer <400> 32 tttacaaccc ggagtcgtcc 20

Claims (3)

1. PlYo15, PlYo69, PlYo144, PlYo184, PlYo83, PlYo185, PlYo14, PlYo182의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍과;
   PlYo32, PlYo51, PlYo70, PlYo152, PlYo27, PlYo169, PlYo41, PlYo57의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용한 문치가자미(Limanda yokohamae) 친자 확인방법.
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